Trabalho Completo

PAULA BARJONA DO NASCIMENTO COUTINHO
INFLUÊNCIA DO TIPO DE TRATAMENTO - PÓS E PRÉ/PÓS-INDUÇÃO
TUMORAL – SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE SARCOMA 180 UTILIZANDO
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS DE Pleurotus djamor
JOINVILLE - SC
2012
PAULA BARJONA DO NASCIMENTO COUTINHO
INFLUÊNCIA DO TIPO DE TRATAMENTO - PÓS E PRÉ/PÓS-INDUÇÃO
TUMORAL – SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE SARCOMA 180 UTILIZANDO
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS DE Pleurotus djamor
Dissertação apresentada como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre no Programa
de Pós-Graduação em Saúde e Meio
Ambiente, na Universidade da Região de
Joinville - UNIVILLE. Área de concentração:
Biotecnologia.
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Aparecida
Furlan
Co-orientador: Prof. Dr. Mauro de Souza Leite
Pinho
JOINVILLE - SC
2012
2
TERMO DE APROVAÇÃO
“Influência do Tipo de Tratamento - Pós e Pré/Pós-Indução Tumoral – Sobre o
Desenvolvimento de Sarcoma 180 Utilizando Substâncias Bioativas de Pleurotus djamor”
por
Paula Barjona do Nascimento Coutinho
Dissertação julgada para a obtenção do título de Mestre em Saúde e Meio Ambiente, área de
concentração Biotecnologia e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em
Saúde e Meio Ambiente.
__________________________________
Profa. Dra. Sandra Aparecida Furlan
Orientadora (UNIVILLE)
__________________________________
Prof. Dr. Gilmar Sidnei Erzinger
Coordenador do Programa de Mestrado em Saúde e Meio Ambiente
Banca Examinadora:
__________________________________
Profa. Dra. Sandra Aparecida Furlan
Orientadora (UNIVILLE)
__________________________________
Prof. Dr. Mauro de Souza Leite Pinho
Coorientador (UNIVILLE)
__________________________________
Prof.
(UNIVILLE)
__________________________________
Prof.
Joinville, ____ de ________ de 2012.
3
Dedico este trabalho à minha vó, minha mãe e
minha irmã. Exemplos de mulheres fortes, que
me inspiram a vencer os desafios que encontro
no meu caminho.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, em primeiro lugar, fonte de luz e paz interior que me faz seguir em frente, vencendo
cada obstáculo.
À professora Sandra Aparecida Furlan, pela orientação deste trabalho e pelo exemplo de
competência e dedicação.
Às professoras Márcia L. Lange Silveira, minha mentora nas bancadas laboratoriais, e
Mariane Bonatti Chaves, pelo auxílio sempre muito prestativo nos cultivos em biorreator.
Às técnicas dos laboratórios de pesquisa Leslie, Fernanda e Endi, que sempre muito
prestativamente me ajudaram ao longo do trabalho.
Ao estagiário de iniciação científica Thierry Waltrich Augusto, que me auxiliou em vários
testes laboratoriais.
A todo corpo docente do programa de mestrado em saúde e meio ambiente da Univille, que
contribuiu para minha formação.
Ao Sebastian Strauch, biólogo que mais admiro por seu amor à pesquisa, que me inspira com
seu exemplo de dedicação e competência.
À minha chefe Elza Cristina Giostri, que compreendeu a necessidade de algumas ausências ao
meu emprego e sempre facilitou para que eu conciliasse os horários.
Especialmente à minha família, que é a base de tudo na minha vida.
5
RESUMO
O câncer é responsável por quase 17% dos óbitos ocorridos por causa conhecida no Brasil,
sendo considerada a segunda causa de morte na população. As terapias disponíveis de
combate ao câncer causam danos ou enfraquecem as defesas imunológicas do paciente, que
também podem ter sido danificadas pelo câncer em si. Diante disso, busca-se o
desenvolvimento de terapias menos agressivas, que causem menos efeitos colaterais e
diminuam o sofrimento típico de um paciente com câncer. A busca por novos tratamentos
revelou a atividade antineoplásica de diversos fungos da classe dos basidiomicetos, dentre
eles os fungos do gênero Pleurotus. A atividade antitumoral, em quase todos os cogumelos, é
atribuída a polissacarídeos constituintes da parede celular. Muitos trabalhos reportados na
literatura validaram a atividade de substâncias bioativas de fungos do gênero Pleurotus após a
indução tumoral. No entanto, poucos trabalhos objetivaram investigar a possível ação
preventiva dessas substâncias sobre o desenvolvimento das neoplasias. Este trabalho teve,
portanto, como objetivo avaliar a atividade antitumoral de substâncias bioativas presentes na
biomassa deslipidificada do basidiomiceto Pleurotus djamor contra Sarcoma 180, em
camundongos albinos swiss machos, por meio de testes pós e pré/pós-indução tumoral. O
tratamento pós-indução tumoral foi iniciado 24 horas após o implante tumoral e conduzido
durante 10 dias, enquanto que o tratamento pré/pós-indução tumoral foi iniciado 10 dias antes
da indução tumoral e mantido por 10 dias após a implantação do tumor. A administração da
substância teste foi realizada por via intraperitoneal nas doses de 10, 30 e 50 mg kg-1 e a
avaliação do desenvolvimento tumoral foi realizada 21 dias após a indução do tumor pela
determinação do volume e da massa tumoral. Os resultados mostraram uma inibição tumoral
média de 83,3% e 70% para os testes pré/pós- indução e pós-indução, respectivamente. A
sobrevida dos animais tratados com 10 mg kg-1 da substância teste aumentou em 90%. O
ensaio MTT revelou citotoxidade na dose de 16 mg mL-1.
Palavras-chave: Pleurotus djamor, substâncias bioativas, câncer, tratamento preventivo,
Sarcoma 180.
6
ABSTRACT
Cancer is responsible for about 17% of the known causes of death in Brazil and is the second
leading cause of death by desease in the country. Anticancer therapies very often cause
damage and weaken the immunological resistance of patients that may also have been
affected by the cancer itself. Therefore, the development of less aggressive therapies, which
cause fewer side effects and diminish the typical suffering of cancer patients is being sought.
The search for new thereapies revealed the antitumor activity of several basidiomycete
mushrooms, including fungus of the genus Pleurotus. Antitumor activity in most mushrooms
is exerted by polisaccharides present in the cell wall. Many works reported in literature have
validated the activity of bioactive substances of fungi of the genus Pleurotus after tumor
induction. Few studies aimed at investigating the possible preventive action of these
substances against the development of tumors. Therefore, the aim of this work was to evaluate
the antitumor activity of bioactive substances present in the delipidified mycelium of the
mushroom Pleurotus djamor against Sarcoma 180 inoculated in albin swiss mice using
protocols of post-inoculation treatment and pre/post-inoculation treatment. Post-treatment,
started 24h after tumor inoculation and was maintained for 10 days, while pre/post- treatment
started 10 days before tumor inoculation and was maintained for 10 days after tumor
inoculation. The substance was administered intraperitoneally at doses of 10, 30 and 50 mg
kg-1. Tumor inhibition was evaluated 21 days after inoculation by measuring tumor weight
and volume. The results showed an average inhibition of 83.3% and 70% for the pre/posttreatment test and for the post-treatment test, respectively. The survival of animals, treated
with 10 mg kg-1 of the test substance has increased by 90%. The MTT assay revealed
cytotoxicity at the dose of 16 mg mL-1.
Key words: Pleurotus djamor, bioactive substances, cancer, preventive treatment, Sarcoma
180.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ciclo reprodutivo de um basidiomiceto..............................................................
Figura 2 Diagrama
do
processo
de
produção
da
18
biomassa
deslipidificada.....................................................................................................
55
Figura 3 Delineamento experimental para o tratamento antitumoral................................
61
Figura 4 Delineamento experimental do teste taxa de sobrevida......................................
64
Figura 5 (A) massas (g), (B) volumes (cm3) e (C) percentuais de inibição (%) do
Sarcoma 180 (S 180) após o tratamento pré/pós-indução tumoral dos animais
com 10, 30 e 50 mg kg-1 da biomassa deslipidificada, obtida de Pleurotus
djamor.................................................................................................................
67
Figura 6 (A) volumes (cm3), (B) massas (g) e (C) percentuais de inibição (%) do
Sarcoma 180 (S 180) após o tratamento pós-indução tumoral dos animais
com 10, 30 e 50 mg kg-1 da biomassa deslipidificada, obtida de Pleurotus
djamor.................................................................................................................
70
Figura 7 Comparação entre os testes pré/pós-indução tumoral e pós-indução tumoral
para cada dose avaliada.......................................................................................
73
Figura 8 Viabilidade celular (%) de células de Sarcoma 180 tratadas com biomassa
deslipidificada de P. djamor...............................................................................
81
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Fonte, tipo e bioatividade de alguns polissacarídeos macrofúngicos...............
20
Tabela 2
Efeitos medicinais de Pleurotus spp.................................................................
26
Percentuais de inibição (%) do Sarcoma 180 por substâncias obtidas de
Tabela 3
diferentes espécies de Pleurotus adiministradas após indução tumoral...........
36
Tabela 4
Diferenciação entre tumores benignos e malignos...........................................
39
Tabela 5
Classificação dos tumores segundo sua origem tecidual..................................
40
9
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 12
1 OBJETIVOS.................................................................................................................... 14
1.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 14
1.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 15
2.1 Fungos ................................................................................................................................ 15
2.1.1 Generalidades sobre Fungos ............................................................................................ 15
2.1.2 Os Basidiomicetos ........................................................................................................... 17
2.1.2.1 Generalidades ............................................................................................................... 17
2.1.2.2 Atividades Biológicas de Basidiomicetos .................................................................... 19
2.1.2.3 Atividade Antitumoral de Basidiomicetos ................................................................... 22
2.1.3 Fungos do Gênero Pleurotus ........................................................................................... 24
2.1.3.1 Atividade antitumoral de Pleurotus spp. ...................................................................... 27
2.2 Protocolos de Tratamentos a Base de Substâncias Fúngicas Bioativas.............................. 32
2.2.1 Pré-Tratamento ................................................................................................................ 32
2.2.2 Pré/Pós-Tratamento ......................................................................................................... 34
2.2.3 Pós-Tratamento ................................................................................................................ 35
2.3 Neoplasias ........................................................................................................................... 38
2.3.1 Classificação e Nomenclatura ......................................................................................... 38
2.3.2 Carcinogênese.................................................................................................................. 40
2.3.3 Incidência do Câncer Humano ........................................................................................ 43
10
2.3.4 Sarcomas .......................................................................................................................... 46
2.3.5 Tratamentos ..................................................................................................................... 47
2.3.5.1 Cirurgia ......................................................................................................................... 47
2.3.5.2 Quimioterapia ............................................................................................................... 48
2.3.5.3 Radioterapia .................................................................................................................. 49
2.3.5.4 Tratamentos Complementares ...................................................................................... 51
3 METODOLOGIA ............................................................................................................. 55
3.1 Obtenção da Biomassa Deslipidificada .............................................................................. 55
3.1.1 Microrganismo e Manutenção ......................................................................................... 56
3.1.2 Preparo do Inóculo .......................................................................................................... 56
3.1.3 Produção de Biomassa ..................................................................................................... 57
3.1.4 Separação da Biomassa ................................................................................................... 58
3.1.5 Dose de Tratamento ......................................................................................................... 58
3.2. Avaliação In Vivo da Biomassa Deslipidificada................................................................ 58
3.2.1 Animais e Manutenção .................................................................................................... 59
3.2.2 Tumor e Manutenção ....................................................................................................... 59
3.2.3 Indução Tumoral.............................................................................................................. 59
3.2.4 Delineamento Experimental do Tratamento Antitumoral ............................................... 60
3.2.5 Testes Dose x Resposta ................................................................................................... 61
3.2.6 Avaliação do Desenvolvimento Tumoral ........................................................................ 62
3.2.7 Avaliação do Tempo de Sobrevida.................................................................................. 63
3.2.8 Teste de Citotoxicidade ................................................................................................... 65
3.2.9 Análise Estatística ........................................................................................................... 66
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................... 67
11
4.1 Avaliação da Atividade Antitumoral .................................................................................. 67
4.1.2 Teste Pré/Pós-Indução Tumoral ...................................................................................... 67
4.1.3 Teste Pós-Indução Tumoral ............................................................................................. 69
4.1.4 Comparação Entre os Testes Pós e Pré/Pós-Indução Tumoral ........................................ 72
4.2 Teste de Sobrevida.............................................................................................................. 78
4.3 Teste de Citotoxicidade ...................................................................................................... 81
CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................................. 84
PERSPECTIVAS FUTURAS.................................................................................................. 85
REFERÊNCIAS................................................................................................................... 86
ANEXO .......................................................................................................................... 100
12
INTRODUÇÃO
Em 2009, neoplasias malignas eram responsáveis por quase 17% dos óbitos ocorridos
por causa conhecida no Brasil, sendo considerada a segunda causa de morte na população. Em
2010 estimou-se ocorrência de 489.270 casos novos de câncer no país, estimativa também
válida para o ano de 2011 (INCA, 2012a, web). Para o ano de 2012 o Instituto Nacional do
Câncer aponta a ocorrência de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer no país,
número também válido para 2013 (INCA, 2012b, web).
O envelhecimento da população é uma das causas que influencia o aumento no
número de casos de câncer (JEMAL et al., 2011). Outros fatores como sexo, lugar de
residência, etnia (COATES e MCCREDDIE, 1998) e fatores ambientais, tais como físicos
(raio ultravioleta, radiação ionizante), químicos (aflatoxinas) e biológicos (vírus), além de
culturais (alimentação, estresse, tabagismo) e hereditários, podem também contribuir para o
aparecimento de diversas neoplasias (COTRAN, KUMAR e COLLINS, 2000).
Tanto a radioterapia como a quimioterapia, que juntamente com a cirurgia são as
terapias mais convencionais de tratamento do câncer (BONASSA, 2001), invariavelmente
causam danos ou enfraquecem as defesas imunológicas do paciente, que também podem ter
sido danificadas pelo câncer em si (SMITH, ROWAN e SULLIVAN, 2003).
Nesse contexto, torna-se de extrema importância a busca por terapias menos
agressivas, que causem menos efeitos colaterais e diminuam o sofrimento típico de um
paciente com câncer.
A partir dessas observações, vem-se desenvolvendo um novo conceito na terapia
contra o câncer, a de que é possível modificar a resposta do hospedeiro às células
13
cancerígenas (SMITH, ROWAN e SULLIVAN, 2003) pela utilização de compostos, que
possam alterar ou aumentar os processos que ocorrem naturalmente no corpo. Tais compostos
são chamados modificadores de resposta biológica (BRMs) e atuam melhorando a atividade
do sistema imunológico, aumentando os mecanismos naturais de defesa do organismo
(GOLDSBY, KINDT e KUBY, 2000).
Estudos da literatura vêm revelando que vários autores atribuem a atividade
antitumoral exercida por polissacarídeos fúngicos à ativação do sistema imune do hospedeiro
(BOHN e BEMILLER, 1995; WASSER e WEIS, 1999; WASSER, 2002) e diversos estudos
têm sido conduzidos com o intuito de comprovar a atividade antineoplásica de diversos
fungos da classe dos basidiomicetos (KIHO et al., 2010; SOARES et al., 2011; TANAKA et
al., 2011; ISHII et al., 2011). Dentre estes, vários fungos do gênero Pleurotus já tiveram sua
atividade antitumoral comprovada (JUNG et al., 2011; ZAHNG et al., 2011; FACCHINI,
2011; ASSIS, 2011).
Inúmeros trabalhos buscaram comprovar a atividade antitumoral das substâncias
bioativas de fungos do gênero Pleurotus após a indução tumoral (ZHANG et al., 1994;
ZHANG et al., 2004; WANG et al., 2005; SARANGI et al., 2006; TAO, ZHANG e
CHEUNG, 2006; WOLFF et al. 2008; DE BARBA, 2010).
No entanto, poucos autores objetivaram investigar a possível ação preventiva dessas
substâncias sobre o desenvolvimento tumoral (SHAMTSYAN et al., 2004; BOBEK,
GALBAVY e OZDIN, 1998; NOSÁL’OVÁ et al., 2001).
Diante do exposto, o presente trabalho busca avaliar a atividade antitumoral de
substâncias bioativas presentes da biomassa deslipidificada do basidiomiceto Pleurotus
djamor em testes pós e pré/pós-indução tumoral, a fim de investigar a possível ação
preventiva dessas substâncias sobre o desenvolvimento de Sarcoma 180 in vivo.
14
1 OBJETIVOS
1.1 Objetivo Geral
Investigar in vivo a ação preventiva de substâncias bioativas presentes na biomassa
deslipidificada de Pleurotus djamor sobre o desenvolvimento de Sarcoma 180 (S180).
1.2 Objetivos Específicos
Os objetivos específicos são:
•
Investigar in vivo o efeito de diferentes concentrações de biomassa
deslipidificada de Pleurotus djamor sobre o desenvolvimento de Sarcoma 180
por meio de testes pós e pré/pós-indução tumoral;
•
Avaliar o efeito da administração intraperitoneal da biomassa deslipidificada
de Pleurotus djamor sobre a taxa de sobrevida dos animais portadores de
Sarcoma 180;
•
Avaliar in vitro o efeito citotóxico das substâncias presentes da biomassa
deslipidificada de Pleurotus djamor.
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Fungos
2.1.1 Generalidades sobre Fungos
Os fungos são seres eucarióticos e constituem um grupo de organismos heterotróficos
em que não ocorre clorofila (RAVEN, EVERT e EICHHORN, 2007; ESPOSITO e
AZEVEDO, 2004). Podem apresentar-se sob a forma levuriforme (unicelular), ou constituir
hifas (filamentos). O conjunto de hifas, ramificadas ou não, denomina-se micélio (ESPOSITO
e AZEVEDO, 2004).
Os fungos são responsáveis pela produção de importantes ácidos orgânicos, como o
ácido cítrico, pela produção de fármacos, como alguns antibióticos, pela produção de enzimas
de interesse industrial de elevado valor econômico, pelo controle biológico de pragas, pelo
controle de inúmeras moléstias que atacam plantas cultivadas, e pela produção de etanol,
dentre outros. Eles ainda têm destaque na produção de bebidas fermentadas como cervejas e
vinhos, queijos dos mais diversos tipos e muitos outros alimentos (ESPOSITO e AZEVEDO,
2004).
Para a obtenção de nutrientes eles agem como sapróbios, como parasitas ou como
simbiontes mutualistas (PUTZKE e PUTZKE, 1998; MIMS, PLAYFAIR e ROITT, 1999;
RAVEN, EVERT e EICHHORN, 2007), absorvendo pequenas moléculas, que são liberadas
16
após secreção de enzimas sobre a fonte de nutrientes (MIMS, PLAYFAIR e ROITT, 1999;
RAVEN, EVERT e EICHHORN, 2007).
Os fungos são seres cosmopolitas (RAVEN, EVERT e EICHHORN, 2007)
ecologicamente importantes, pois, no solo, participam da ciclagem dos nutrientes. Além do
solo são também encontrados na água, em vegetais, em animais, no homem e em detritos
(TRABULSI e TOLEDO, 1996).
Os micologistas dividem o reino Fungi em três principais grupos: os fungos limosos,
os fungos inferiores flagelados e os fungos terrestres (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996).
De acordo com o autor, a classificação dos fungos baseia-se primariamente nos seguintes
critérios:
•
Características dos esporos sexuais e corpos frutíferos presentes durante os
estágios sexuais dos seus ciclos de vida;
•
Natureza dos seus ciclos de vida;
•
Características morfológicas de seu micélio vegetativo ou de suas células.
Entretanto, muitos fungos produzem esporos sexuais e basidiomas somente sob certas
condições ambientais. Aqueles que possuem todos os estágios sexuais conhecidos são
denominados fungos perfeitos e, os que não possuem, fungos imperfeitos. Estes são então
colocados arbitrariamente em uma classe especial denominada Deuteromycetes. Quando seus
ciclos sexuais são descobertos posteriormente, são então reclassificados entre as outras classes
e recebem novos nomes (PELCZAR, CHAN e KRIEG, 1996).
A classificação proposta por Alexopoulos, Mims e Blackwell (1996), bem como a de
Raven, Evert e Eichhorn (2007) agrupa no reino fungi os filos Chytridiomycota, Zygomycota,
17
Ascomycota e Basidiomycota.
Em 1995 a classificação proposta por Hawksworth et al. (1995) dividiu o filo
basidiomycota em 3 classes: Basidiomycetes, Teliomycetes e Ustomycetes, sendo esta também
a classificação aceita por Alexopoulos, Mims e Blackwell (1996) e Raven, Evert e Eichhorn
(2007).
2.1.2 Os Basidiomicetos
2.1.2.1 Generalidades
Basidiomicetos são caracterizados, em parte, pela produção de basidiósporos (esporos
sexuais) em um basídio (célula onde ocorre cariogamia e meiose) (RAVEN, EVERT e
EICHHORN, 2007; HERNÁNDEZ et al., 2008).
Segundo Raven, Evert e Eichhorn (2007) o micélio da maioria dos basidiomicetos
passa por uma fase monocariótica (micélio primário), originada logo assim que o basidiósporo
germina, e uma fase dicariótica (micélio secundário), formada pela fusão das hifas
monocarióticas originadas de linhagens diferentes conforme demonstrado na Figura 1. Em
grande parte das espécies o micélio secundário se divide por meio da formação de ansas ou
fíbulas. O micélio terciário, dicariótico, é o que forma o basidioma, estrutura que contém os
basídios, de onde bilhões de basidiósporos são liberados. O micélio dos basidiomicetos é
sempre septado e os septos são perfurados.
18
Micélio
secundário
(n+n)
Plasmogamia
Basidiocarpo
(n+n)
Basídio inicial
(cariogamia
2n)
Basídio
(meiose)
Basidiósporo
(n)
Figura 1 – Ciclo reprodutivo de um basidiomiceto
Fonte: Hood (2006)
São conhecidas cerca de 23.000 espécies de fungos basidiomicetos (HOOD, 2006) e,
dentre estas estão diversas espécies de cogumelos comestíveis (RAVEN, EVERT e
EICHHORN, 2007).
Os cogumelos são muito apreciados como alimento em diversos países, não somente
devido ao seu paladar, mas também por terem elevado valor nutritivo e baixo valor calórico.
São fontes de ácidos graxos essenciais, sais minerais e proteínas (FURLANI e GODOY,
2005; TAKAHASHI e CARVALHO, 2010).
Furlani e Godoy (2005) conduziram um trabalho que relatou o valor nutricional de
cogumelos comestíveis. O estudo demonstrou que os cogumelos em questão mostraram ser
19
alimentos com características nutricionais excelentes, com alto teor de proteínas e fibras
alimentares, além do baixo teor de lipídeos e fonte considerável de fósforo.
Os cogumelos comerciais Agaricus bisporus (champignon), Lentinus edodes (shiitakii)
e Pleurotus spp (ostra) são os mais comuns (WEBSTER e WEBER, 2007; HERNÁNDEZ et
al., 2008). No entanto, muitos cogumelos selvagens, tais como Fistulina hepatica, Sparassis
crispa, Albatrellus sp., Grifola frondosa, Hericium erinaceum e Laetiporus sulphureus, dentre
vários outros, também são comestíveis (HERNÁNDEZ et al., 2008).
Além da grande importância na indústria alimentícia, atualmente destacam- se também
os produtos derivados de cogumelos com aplicações farmacológicas. Eles se apresentam, em
sua maioria, na forma de extratos ou pó, derivados tanto do micélio cultivado como do corpo
frutífero (BADALYAN, 2001).
2.1.2.2 Atividades Biológicas de Basidiomicetos
Muitos, se não todos os basidiomicetos contém polissacarídeos biologicamente ativos
em seus corpos frutíferos, micélio cultivado e caldo de cultura (WASSER, 2011).
A atividade biológica de basidiomicetos foi confirmada por Lucas pela primeira vez
em 1957, através do isolamento de uma substância de Boletus edulis, que apresentou efeito
significativo na inibição contra células tumorais de Sarcoma 180 (ZHANG et al., 2007) e,
desde então, diversos estudos têm sido conduzidos, buscando-se a confirmação de efeitos
medicinais de polissacarídeos encontrados em várias espécies de basidiomicetos como mostra
a Tabela 1.
20
A atividade antitumoral, em quase todos os cogumelos, é atribuída a polissacarídeos
(GUNDE-CIMERMAN, 1999). No entanto, como pode ser observado na Tabela 1, além da
atividade antitumoral, destacam-se dentre as propriedades medicinais dos fungos
basidiomicetos, a atividade hipoglicêmica, antifúngica, antiviral, modulatória do sistema
imunológico, antioxidante, anticolesterolêmica, cardiovascular, antiviral, antibacteriana,
antiparasitária, antifúngica, desintoxicante, hepatoprotetora, antidiabética, entre outras
(SMITH, ROWAN e SULLIVAN, 2002; WASSER, 2011).
Tabela 1 - Fonte, tipo e bioatividade de alguns polissacarídeos macrofúngicos
Fonte fúngica
Pleurotus tuberregium
Ganoderma
lucidum
Auricularia
auricula
Schizophillum
commune
Referências
Zhang, Cheung e
Zhang, 2001;
Zhang, Chiu,
Cheung, e Ooi,
2006; Zhang,
Zhang e Cheung,
2003
Miyazaki e
Nishijima, 1981;
Mizuno, 1997
Fonte do
polissacarídeo
Esclerotia,
micélio
Tipo
Principal atividade
β-d-glucana
Hepato-protetora,
anti-câncer de seio
Corpo de
frutificação, caldo
de cultivo
Heteroglucana,
mannoglucana,
glicopeptídeo
Hiperglicemia,
imunomodulatória,
antitumoral,
antioxidativa,
anti-decrepitude
Ukai et al., 1983;
Ukai et al., 1982
Corpo de
frutificação
Glucana
Hiperglicemia,
imunomodulatória,
antitumoral,
antiinflamatória,
antiradioativa
Yamamoto, 1981
Micélio
Hericum erinaceus
Kawagishi, Ando e
Mizuno, 1990
Lentinus edodes
Chihara, 1969;
Chihara et al.,
1970; Hobbs, 2000
Glucana,
Antitumoral
schizophyllana
Corpo de
Heteroglucana,
Hiperglicemia,
frutificação, micélio heteroglucanapeptídeo imunomodulatória,
Antitumoral
Caldo de cultivo,
Manoglucana,
Imunomodulatória,
corpo de
complexo
antitumoral,
frutificação
polisacarídeoantiviral
proteína,
glucana, lentinana
21
Sclerotinia
sclerotiorum
Palleschi,
Bocchinfuso,
Coviello e
Alhaique, 2005
Cui e Chisti, 2003
Polystictus
versicolar
Grifola frondosa
Inonotus obliquus
Kim et al., 2005
Trametes
robiniophila
Pleurotus ostreatus
Morchella
esculenta
Heteroglucana,
glicopeptídeo,
krestin (PSK)a
Imunomodulatória,
antitumoral,
antiradioativa,
hiperglicemia,
antiinflamatória
Proteoglucana,
glucana,
galatomanan,
heteroglucana,
grifolana
Imunomodulatória,
antitumoral,
antiviral,
hepatoprotetora
Zeng, 1990
Corpo de
Complexo glucanafrutificação, micélio proteína,
glicoproteína
Antitumoral,
antiinflamatória,
antiviral,
imunomodulatória
Nakashim, Umeda
e Kanada, 1979
Yang et al., 2004
Corpo de
frutificação
Micélio
Glucana
Antitumoral
Glucana
Antitumoral,
imunomodulatória
Liang, Miao e
Zhang, 1996
Wang et al., 2005
Corpo de
frutificação
Corpo de
frutificação
Micélio
Glucana
Antitumoral
Galactomanana
Antitumoral
Proteoglucana
Imunomodulatória,
hepatoprotetora,
anti-câncer
Zhang, 1995
Huang, 1982
Corpo de
frutificação,
micélio, caldo de
cultivo
Heteroglucana
Hiperlipidemia,
hiperglicemia,
imunomodulatória,
antitumoral,
anti-decrepitude,
antitrombótica
Liu, Xie, Su, Han e
Liu, 2003
Solomko, 1992
Corpo de
frutificação, micélio Heteroglucana
Corpo de
Glicoproteína
frutificação
Imunomodulatória,
hiperglicemia
Antitumoral,
hiperglicemia,
antioxidante
Tremella fuciformis
Tremella
aurantialba
Corpo de
frutificação, caldo
de cultivo,
micélio
Antitumoral,
imunomodulatória
Antitumoral
Flammulina
velutipes
Clitopilus
caespitosus
Pleurotus
citrinopileatus
Antitumoral
Corpo de
Glucana
frutificação, micélio
Corpo de
Glucana,
frutificação, micélio heteroglucana,
glucana proteína,
Glucomananacomplexo proteico
Agaricus blazei
Polypours
umbellatus
Glucana,
scleroglucana (SSG)a
Cun et al., 1994;
Corpo de
Zhuang et al., 1994; frutificação
Zhuang, Mizuno,
Ito, Shimura e
Sumiya, 1993
Mizuno, 1992;
Mizuno, 1998
Ganoderma
applanatum
Esclerotia
Duncan et al., 2002 Corpo de
frutificação
Heteroglucana
Hiperglicemia,
antitumoral
22
Omphalia
lapidescens
Saito, Nishijima,
Ohno, Yadomae e
Miyazaki, 1992
Phellinus linteus
Kim, Choi, Lee e
Park, 2004
Armillariella
tabescens
Dictyophora
indusiata
Peziza vericulosa
Tricholoma
mongolium
Cordyceps SP
Corpo de
frutificação
Glucana
Antiinflamatória,
imunomodulatória
Corpo de
frutificação
Glucana
Kiho, Shiose, Nagai Micélio
e Ukai, 1992
Hara et al., 1991
Corpo de
frutificação
Mimura, Ohno,
Corpo de
Suzuki, e Yadomae, frutificação
1985
Wang, Ooi, Ng,
Corpo de
Chiu e Chang, 1996 frutificação
Glucana
Antitumoral
Heteroglucana
Antitumoral
Heteroglucana,
manana, glucana
Proteoglucana,
glucana
Antitumoral,
hiperlipidemia
Imunomodulatória,
antitumoral
Glucana
Antitumoral
Glucana,
heteroglucana
Antitumoral,
imunomodulatória,
antitumoral,
hiperglicemia
Hsu, Shiao, Hsieh e Corpo de
Chang, 2002
frutificação,
micélio, caldo de
cultivo
Fonte: ZHANG et al (2007)
2.1.2.3 Atividade Antitumoral de Basidiomicetos
Diversos estudos vêm demonstrando o efeito antitumoral de fungos basidiomicetos.
Kiho et al. (2010) verificaram o efeito antitumoral in vitro de extratos etanólicos dos
cogumelos medicinais comestíveis Tremella aurantia, Pholiota adipose e Pholiota aurivella
contra células humanas de câncer de próstata, linhagens LNCaP e PC-3. Os extratos
etanólicos nomeados TA-70E, PAD-70E e PAU-70E, respectivamente, foram obtidos a partir
da desidratação dos corpos de frutificação (100 g) de cada fungo e deslipidificação com etanol
(700 mL) em Soxhlet. Em seguida, extrações com etanol 70% foram realizadas 4 vezes (500
mL) por 12 h em banho-maria. O extrato foi evaporado e liofilizado, obtendo-se um extrato de
etanol 70%. O extrato foi seco e suspenso em PBS, obtendo-se uma concentração final de 5
mg mL -1. As células LNCaP e PC-3 foram tratadas com 0,5 mg mL -1 ou 1 mg mL -1 de cada
23
extrato. Os extratos de todos os fungos inibiram acentuadamente o crescimento das células
LNCaP. A viabilidade das células LNCaP e PC-3 foi drasticamente reduzida pelo TA-70E em
uma concentração de 1 mg mL-1 para 12% e 32% em relação ao controle, respectivamente, e
foi mais significativa do que PAD-70E e 70E-PAU. Os resultados desse trabalho
demonstraram a atividade inibitória dos extratos sobre o crescimento das linhagens de células
LNCaP e PC-3.
Em um estudo realizado por Soares et al. (2011) uma fração bioativa composta de um
polissacarídico ligado a proteínas, de Grifola frondosa (maitake), foi extraída e preparada por
um procedimento padronizado desenvolvido por Maitake Produtos Inc. Este estudo examinou
o efeito dessa fração sobre a viabilidade e apoptose de células de câncer de mama humano
(MCF7). Essas células foram tratadas com extrato de maitake (fração D) a 18 µg mL-1, 36 µg
mL-1, 91 µg mL-1, 183 µg mL-1 ou 367 µg mL-1 ou foram deixados sem tratamento (controle)
por 24 horas. A apoptose foi dose dependente, atingindo quase 98% de morte celular na
concentração máxima de 367 µg mL-1. Um ensaio de microarray revelou upregulation da
BAK-1 e transcrições do citocromo c, duas proteínas diretamente envolvidas na via de
apoptose. BAK-1 foi um dos genes mais expressos. Estes resultados confirmam o efeito
apoptótico de maitake fração D em células de câncer de mama.
Tanaka et al. (2011) examinaram o efeito antitumoral induzido por ingestão oral de
uma dieta imunomoduladora composta por extrato micelial de Lentinula edodes (L.E.M.).
Camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea na pata com melanoma B16 e
após 24h iniciou-se a ingestão de alimento contendo 1%, 2% ou 10% de extrato L.E.M. A
ingestão de 1% ou 2% do extrato inibiu significativamente o crescimento tumoral nos animais
tratados em relação ao grupo controle. O crescimento do tumor nos animais que foram
alimentados livremente com 2% de extrato L.E.M. foi significativamente suprimido em
24
comparação com camundongos alimentados com 1% de extrato de L.E.M. Não houve
diferença no crescimento do tumor entre os camundongos que foram alimentados livremente
com extrato L.E.M. 2% ou 10%.
2.1.3 Fungos do Gênero Pleurotus
Espécies de Pleurotus, comumente conhecidos como cogumelos ostra (MANDEEL,
AL-LAITH e MOHAMED, 2005) devido ao formato do píleo ser semelhante a uma concha
(CHANG e MILES, 2004), são fungos comestíveis cultivados em todo o mundo,
especialmente no sudeste da Ásia, Índia, Europa e África (MANDEEL, AL-LAITH e
MOHAMED, 2005).
O gênero Pleurotus pertence à classe dos basidiomicetos e é composto por um grupo
de cogumelos ligninolíticos, com propriedades medicinais e importantes aplicações
biotecnológicas e ambientais. Na indústria de alimentos, o cultivo de Pleurotus spp é
mundialmente importante do ponto de vista econômico (COHEN, PERSKY e HADAR,
2002). Essas propriedades e aplicações, bem como o fato de poderem ser facilmente
manipulados e apresentarem um rápido desenvolvimento devido ao uso de matéria orgânica
em decomposição para o crescimento, apresentando uma grande variedade de alternativas
para uso como substrato no cultivo, fazem com que os cogumelos deste gênero estejam entre
os mais cultivados no mundo (CARVALHO, SALES-CAMPOS e ANDRADE, 2010).
Eles apresentam elevado teor de proteínas, aminoácidos essenciais, proporção elevada
de ácidos graxos insaturados, diversas vitaminas e minerais, além de teores baixos de
25
gorduras, ácidos nucléicos, açúcares e calorias (RAMPINELLI et al., 2010).
Um estudo, realizado por Guo, Lin e Lin (2007) verificou que Pleurotus djamor,
Pleurotus ferulae, Pleurotus nebrodensis e Pleurotus sapidus apresentam quantidades de
carboidratos totais, polissacarídeos, fibra bruta, proteína bruta, gordura bruta e cinzas nas
faixas de 46,2-59,9%, 9,02-18,8%, 11,2-17,2%, 15,6-30,3%, 1,65-7,35% e 3,84-5,83%,
respectivamente.
Rampinelli et al. (2010) avaliaram o valor nutricional de basidiomas de Pleurotus
djamor cultivados em palha de bananeira e verificaram teores de carboidratos totais, proteína
bruta, fibra bruta e cinzas para o 1o fluxo produtivo de 32,7%,
respectivamente e
20,5%, 22,4%, 7,4%,
para o 2o fluxo produtivo de 27,4%, 19,8%, 12,7% e 6,3%,
respectivamente.
Devido à habilidade de secretar várias enzimas, como peroxidases, lacases, celulases,
hemicelulases e xilanases, o cultivo desses fungos torna-se possível em uma variedade de
substratos lignocelulósicos (COHEN, PERSKY e HADAR, 2002). Assim, os resíduos de
atividades agroindustriais como palha de milho, casca de café (DIAS et al., 2003), palha de
trigo (SHER, MOHAMAD e KHAN, 2011), palha de bananeira (GERN et al., 2010), entre
outros, podem ser utilizados para produção de cogumelos, trazendo consigo uma vantagem
tanto comercial, pela redução do custo de produção e agregação de valor ao resíduo, como
uma vantagem ambiental, pela disposição final adequada de um resíduo até então degradado
no meio ambiente.
Além do cultivo sólido, é possível a realização do cultivo submerso (WISBECK,
FURLAN e NINOW, 2005; ZANOTELLI, FURLAN e WISBECK, 2007; GERN et al.,
2008).
A aplicação ambiental desses fungos é também demonstrada pela capacidade de
26
degradação de compostos poluentes.
P. ostreatus mostrou-se capaz de degradar 2,4-diclorofenol, importante poluente
encontrado nos resíduos da indústria de papel e celulose (SILVA et al., 2009). Garcia (2009)
validou a capacidade de P.ostreatus e P. sajor-caju em degradar 2,4 diclorofenol e 2, 4, 6
triclorofenol. Libardi Junior (2010) demonstraram a capacidade da lacase encontrada em
caldo fermentado por P. ostreatus em degradar os compostos interferentes endócrinos tnonilfenol, bisfenol-A e 17α-etinilestradiol.
Além da aplicação ambiental, destacam-se também diferentes atividades medicinais
atribuídas aos fungos do gênero Pleurotus. Estudos têm sido conduzidos e diversas dessas
atividades já foram comprovadas em espécies do gênero, como mostra resumidamente a
Tabela 2.
Tabela 2 - Efeitos medicinais de Pleurotus spp
Efeito medicinal
Antimicrobiano
Antitumoral
Anti- hipertensivo
Fungo
Pleurotus ostreatus
Wolff et al., 2008;
Wisbeck, Robert e Furlan, 2002
Pleurotus ostreatus
Pleurotus sajor-caju
Pleurotus djamor
Pleurotus geesteranus
Pleurotus eryngii
Pleurotus cornucopiae
Wolff et al., 2008
Dalonso et al, 2009
De Barba, 2010
Zhang et al., 2011
Jung et al., 2011
Jang et al., 2011
Pleurotus ostreatus
Jayakumar, Thomas,
2009;
Xia et al., 2011
Pleurotus eryngii
Pleurotus. sajor-caju
Pleurotus eous
Pleurotus florida
Pleurotus tuber-regium
Pleurotus eryngii
Oke e Aslim, 2011
Telles et al., 2011
Suseem et al., 2011
Ghazanfari et al., 2009
Wong et al., 2011
Han et al., 2011
Antioxidante
Analgésico
Imunomodulatório
Antialérgico
Fonte: Primária (2012)
Referências
Geraldine,
27
2.1.3.1. Atividade antitumoral de Pleurotus spp.
Resultados obtidos por Sousa, Nascimento e Correia (2004) sugerem que a fração
solúvel em água obtida a partir do cogumelo Pleurotus ostreatoroseus, testada in vitro contra
a linhagem de células NCI-H292 (originadas de células de carcinoma pulmonar humano) e in
vivo após indução do tumor Sarcoma 180 em camundongos albinos suíços, tem potencial
farmacológico no tratamento de tumores. Apesar de um efeito tóxico não ter sido observado
na cultura de células in vitro, quando o teste foi realizado in vivo, o grupo de animais tratados
mostrou sinais clínicos sugestivos de toxicidade e a mortalidade começou mais cedo do que
no grupo não tratado. Porém os camundongos tratados apresentaram uma inibição tumoral de
41,96% do tumor.
Frações solúveis em água de um proteoglicano obtido do micélio de P. ostreatus por
Sarangi et al. (2006) foram purificadas por meio de preciptação alcólica, cromatografia de
troca iônica e de permeação em gel. Foram obtidas 3 frações, com diferentes relações entre
polissacarídeos e proteínas. Essas frações foram testadas in vivo em camundongos inoculados
intraperitonealmente com Sarcoma 180. O tratamento com cada uma das três frações (5mg
kg-1 de massa corporal) foi realizado durante 6 dias consecutivos e revelou que todas as
frações foram capazes de reduzir o número de células de câncer significativamente. A fração
III, com relação de 18,3mg de polissacarídeo/ proteína, apresentou a maior atividade
antitumoral, chegando a mais de 90% de redução.
Para investigar o efeito antineoplásico de P. ostreatus, Wolff et al. (2008) utilizaram o
caldo de cultura in natura, o extrato do caldo de cultura (obtido pela precipitação do caldo de
cultivo por 4 volumes de acetona) e o extrato dos corpos de frutificação (obtido pela
28
precipitação com 5 volumes de etanol do sobrenadante resultante de extração aquosa - 100ºC
por 4h - de corpos frutíferos frescos). Os testes foram conduzidos em camundongos albinos
Swiss fêmeas, inoculados com o tumor ascítico de Ehrlich no peritônio dos animais, na
concentração de 5x106 cel.animal-1. Todas as substâncias testadas inibiram o desenvolvimento
tumoral em níveis próximos de 70% quando injetadas via intraperitoneal nos camundongos. A
maior inibição tumoral foi 76%, alcançada para o tratamento com o extrato do caldo de
cultura.
Li et al. (2008), após isolarem a lectina, uma proteína ligada a carboidrato, de
basidiomas frescos do fungo Pleurotus citrinopileatus, verificaram cerca de 80% de inibição
do crescimento tumoral em camundongos ICR com sarcoma 180. O tratamento foi realizado
por via intraperitoneal, administrando-se 5 mg kg-1 diários durante 20 dias, após indução
tumoral.
Dalonso et al. (2010) investigaram a atividade antitumoral de 4 frações
polissacarídicas obtidas do basidioma de Pleurotus sajor-caju,. As frações foram
administradas por via intraperitoneal por 6 dias na dose de 10 mg kg-1 em camundongos
fêmeas da raça Swiss, inoculados com o tumor ascítico de Ehrlich- TAE. As frações FI e FII
apresentaram redução no número de células neoplásicas presentes no líquido ascitíco de
86,2% e 85%, respectivamente, quando comparado ao controle positivo (grupo inoculado com
o tumor, mas sem tratamento). As frações FIII-I e FIII-II inibiram o desenvolvimento tumoral
em 54% em 52%, respectivamente.
DE BARBA (2010) investigou em camundongos albinos suíços machos, inoculados
com Sarcoma 180 (S180), a atividade antitumoral de polissacarídeos extracelulares de
Pleurotus djamor, cultivado em meio líquido. Os extratos polissacarídicos foram obtidos por
precipitação com etanol (PE1) e com acetona (PE2), e foram administrados por via
29
intraperitoneal nos animais durante 10 dias. Os resultados mostraram que ambos os
precipitados foram efetivos contra S180, com taxas de inibição de 60%, 83%, 94% e 64%
para doses de 3, 10, 30 e 100 mg kg-1 de massa corporal de PE1, respectivamente, e de 55%,
82%, 93% e 89% para doses de 3, 10, 30 e 100 mg kg-1 de massa corporal de PE2,
respectivamente.
Em um estudo in vitro realizado por Jung et al. (2011), corpos de frutificação de
Pleurotus eryngii secos a 40ºC por 24 horas e triturados, foram suspensos em água destilada
(1000g) e agitados a 100º C por 3 horas. Após centrifugação, adicionou-se ao sobrenadante 3
volumes de etanol a 4ºC por 24h. Após nova centrifugação, o precipitado foi dialisado com
água destilada por 5 dias. Os extratos, tanto na forma nativa como na forma modificada por
sulfatação, foram testados em dois diferentes tipos de células cancerosas: A549, de pulmão
humano e H4IIE, de fígado de rato. Os derivados sulfatados com diferentes graus de
substituição (0,12 a 0,92) demonstraram atividade inibitória da ordem de 80% sobre A549, de
forma dependente da dose, enquanto a forma nativa mostrou inibição de quase 40%,
dependendo da dose.
Zahng et al. (2011) obtiveram 4 frações a partir de cogumelos da espécie Pleurotus
geesteranus utilizando um tratamento com água quente e posterior fracionamento com
gradiente de precipitação em água e sulfato de amônia. Células humanas de câncer de mama
(linhagem MCF7) foram tratadas com 12,5, 25, 50, 100, e 200 µg mL-1 de cada fração durante
72h. Uma das frações, que apresentou alta massa molar e era composta principalmente de
glucose, exerceu um efeito citotóxico significativo sobre a linhagem de células MCF7. O
percentual de inibição do crescimento celular de MCF7 foi de 32% para a concentração de
200 µg mL-1 e 37% para a concentração de 100 µg mL-1.
Facchini (2011) avaliou a eficácia na redução do desenvolvimento do Tumor Ascítico
30
de Ehrlich (TAE) e do Sarcoma 180 de seis extratos obtidos por meio de fracionamentos
subsequentes da biomassa micelial de Pleurotus ostreatus DSM 1833 congelada: FS
(tratamento com etanol a 80ºC por 3h, 4 vezes), FI (extração aquosa a 100ºC por 3h, 4 vezes),
FII (extração com NH4-oxalato a 100ºC por 3h, 4 vezes), FIII-1 (extração com NaOH e
NaBH4 em temperatura ambiente por 24h, 2 vezes e precipitação com AcOH até pH 6) e FIII2 (precipitação com etanol do sobrenadante de FIII-1) e ainda FC (fração etanólica do caldo
de cultivo). As substâncias foram administradas em camundongos por via intraperitoneal. O
tratamento dos animais foi iniciado 24 horas após o implante tumoral e foi conduzido durante
10 dias, na dose de 30 mg kg-1. A avaliação do desenvolvimento tumoral foi realizada 21 dias
após a indução do tumor pela determinação do volume e da massa tumoral. Os resultados
mostraram que as frações FC, FI e FII, na dose de 30 mg kg-1 proporcionaram um valor médio
de 70 % de inibição do desenvolvimento do TAE. A fração FII exerceu inibição, também, do
sarcoma 180 nessa mesma dose, bem como a fração FIII-2. Ambas resultaram num valor
médio de 90% de inibição contra este tumor. Sendo assim, S180, que apresentou melhor
resposta às frações e a fração FII, por ser obtida mais facilmente que FIII-2 foram
selecionados para os testes de determinação da dose capaz de proporcionar maior regressão
tumoral. As doses testadas foram, então, de 10, 30 e 50 mg kg-1. As doses 10 e 30 mg kg-1,
promoveram a maior inibição do Sarcoma 180, cerca de 75%, sem diferença significativa
entre si, sendo a dose de 10 mg kg-1, a que representou a necessidade de uma menor massa
para a realização do tratamento.
Assis (2011) avaliou a atividade antitumoral dos polissacarídeos extracelulares (PE1) e
intracelulares (PM1 e PM2) de Pleurotus sajor-caju, obtidos da seguinte forma: PM1 extração aquosa a 80ºC por 4 horas da biomassa liofilizada. Após aquecimento, a solução foi
filtrada em membrana de 0,45µm. O filtrado foi concentrado a vácuo em rotavapor e
31
adicionado de etanol PA na proporção 1:4 (filtrado: etanol, v:v), agitado vigorosamente e
mantido “overnight” a 4°C. Após, o precipitado formado foi separado por centrifugação (5500
rpm por 20 minutos); PM2 – obtido a partir da biomassa liofilizada por processo de extração
em soxhlet com éter de petróleo por 8-10 horas para deslipidificação. O material isento de
lipídeo foi adicionado de metanol PA e, após a evaporação do metanol, liofilizado e mantido
em frasco vedado, em temperatura ambiente, até a sua utilização; PE1 – precipitação com
etanol PA na proporção 1:4 (caldo de cultivo:etanol, v:v) “overnight” a 4ºC, adicionado ao
caldo de cultivo isento de biomassa. Após, o precipitado formado foi separado por
centrifugação, liofilizado e mantido em frasco vedado, em temperatura ambiente, até sua
utilização. Os testes foram conduzidos em camundongos machos da raça albino swiss,
inoculados com S180 e submetidos a tratamento pós-indução tumoral com quatro diferentes
doses (3, 10, 30 e 100 mg kg-1) das substâncias teste. O precipitado polissacarídico PE1 e o
extrato PM2 apresentaram taxas de inibição da ordem de 86% e 82%, respectivamente, em
relação ao controle positivo. No caso do extrato polissacarídico PM1, apenas a dose de 100
mg kg-1 apresentou redução tumoral (80%), já que para as demais doses não se observou
diferença estatisticamente significativa no peso tumoral em relação ao controle.
Lavi et. al. (2011) avaliaram o papel de extratos obtidos de corpos frutíferos (FBE) e
do micélio (ME) do cogumelo comestível Pleurotus pulmonarius em cancer de colon
induzido. In vitro, células humanas de câncer colorretal foram tratadas com FBE e ME e
analisadas quanto à resposta inflamatória, marcadores de apoptose e progressão do ciclo
celular. In vivo, FBE e ME foram administrados oralmente a camundongos modelo FVB/N.
Os animais foram avaliados quanto a colite associada à carcinogênese colorretal induzida. Os
camundongos tratados foram alimentados com uma dieta diária contendo 2 ou 20 mg de FBE
ou ME por camundondo por 80 dias. Os autores concluíram que os extratos obtidos a partir de
32
P. pulmonarius inibiram colite associada à carcinogênese de cólon induzida em camundongos
por meio da modulação da proliferação celular, indução de apoptose e inibição da inflamação.
2.2 Protocolos de Tratamentos a Base de Substâncias Fúngicas Bioativas
2.2.1 Protocolos de Pré-Tratamento
Trabalhos avaliaram a eficácia do pré-tratamento com substâncias fúngicas contra
diversos danos.
Nosáľová et al. (2001) demonstraram o possível papel imunomodulador preventivo de
Pleurotus ostreatus. Os autores estudaram a ação da pleuran, uma ß-1,3 glucana isolada do
cogumelo cometível P. ostreatus, em um modelo de colite aguda induzida em ratos pela
administração intracolon de ácido acético. Houve uma redução de 75% da classificação do
dano do cólon, após pré-tratamento intracólon único com suspensão de pleuran 2%, realizada
30 minutos antes da indução ao dano, em relação ao grupo de animais tratados com uma ração
à base de celulose. Resultados obtidos após administração intraperitoneal repetida de pleuran
em doses de 30 e 100 mg kg-1 48 e 24h anteriormente à exposição ao ácido acético foram de
75% e 90,42% de redução da classificação do dano de cólon, respectivamente. O prétratamento com pleuran, administrado por via oral como componente de 10% da ração
alimentar por mais de 4 semanas anteriores à administração de ácido acético foi eficaz na
redução da extensão do dano em 38,85%.
33
Em um estudo realizado por Shamtsyan et al. (2004) corpos frutíferos de Pleurotus
ostreatus secos a 60ºC foram tratados com etanol 85% a 80ºC durante 8h. Duas extrações com
água fervente durante 3h foram realizadas com o precipitado. O filtrado obtido foi evaporado
sob vácuo e as frações de polissacarídeos foram precipitadas em 5 volumes de etanol,
dialisadas contra água destilada e liofilizadas. Os extratos obtidos foram administrados por
duas semanas, por via oral (100mg de extrato por kg do animal) em camundongos fêmeas
C57BL. Após esse período, melanoma B16 foi transplantado subcutaneamente nos animais (1
x 106 cel.animal-1). A avaliação da inibição tumoral foi realizada de 8 a 40 dias após o
transplante. A inibição do tumor aumentou, entre o 8° e o 26º dia, de 30 para 80%, em relação
ao grupo controle.
Nada, Omara e Abdel-Salam (2010) avaliaram o efeito de polissacarídeos fúngicos
insolúveis livres de amido (MINSP) em ratos que sofreram dano hepatológico induzido por
tetracloreto de carbono (CCl4 ). MINSP (100 e 200 mg kg-1) foi administrado oralmente por
15 dias antes da indução do dano hepático com CCl4 (1,5mL kg-1). O pré-tratamento com
MINSP melhorou significativamente os parâmetros testados quando comparados ao grupo
controle. Observou-se a melhora na atividade antioxidante no fígado de forma dependente da
dose, e a análise histopatológica do tecido hepático revelou que a administração de MINSP
protegeu hapatócitos de danos causados por CCl4.
Ishii et al. (2011) reportaram um percentual de 45,52% de redução de genotoxicidade
em camundongos suíços machos, após administração de ração suplementada com 10% do
cogumelo Agaricus blazei desidratado. O dano no DNA dos animais foi induzido pela
administração de DMH pelo período de duas semanas. O tratamento com A. blazei foi
realizado pelo período de 2 semanas, antes do inicio da indução do dano, seguindo um
protocolo de pré-indução. Em relação à redução de danos no cólon dos animais, os autores
34
observaram uma redução de 54,60%.
2.2.2 Protocolos Pré/Pós-Tratamento
Whistler et al. (1976) utilizaram polissacarídeo derivado do cogumelo Schizophyllum
commune (Schizophyllan) em camundongos implantados com células de sarcoma 180 e
reportaram um aumento da sobrevida em 57% dos animais que foram submetidos a um
tratamento pré/pós-indução tumoral.
Bobek, Galbavy e Ozdin (1998) estudaram o efeito da dieta suplementada com 5% de
Pleurotus ostreatus desidratado sobre a carcinogenese de colon induzida em ratos da raça
Wister. A indução tumoral foi realizada pela administração de 20 mg kg-1 de dimetil-hidrazina
(DMH) uma vez por semana, pelo período de 12 semanas. As lesões tumorais que ocorreram
foram caracterizadas como carcinomas in situ ou adenocarcinomas infiltrantes. A dieta
suplementada com Pleurotus ostreatus foi administrada concomitantemente à aplicação de
DMH, ou seja, anteriormente ao surgimento de lesões tumorais e mantido durante todo o
processo de indução tumoral com DMH. A dieta fúngica reduziu significativamente a
incidência de hiperplasia linfóide. Uma redução no número total de tumores foi observada nos
grupos de animais alimentados com dieta de cogumelo. Além disso, uma redução significativa
do número de focos tumorais do carcinoma in situ foi observada em animais alimentados com
P. ostreatus. Estes animais tiveram o número significativamente menor de focos de criptas
aberrantes no colon.
Ishii et al. (2011) ao seguirem um protocolo de pré-tratamento + condições contínuas,
35
em que os animais se mantiveram sob tratamento, durante todo o tempo do experimento, com
ração suplementada pelo cogumelo A. blazei, como citado no item 3.3.1, observaram
atividade antigenotóxica demonstrada por um precentual de redução de danos de 38,76%.
Quando os autores avaliaram a redução de danos em relação a integridade do cólon dos
animais,
análises
comprovaram
50,45%
de
redução,
comprovando
a
atividade
anticarcinogênica de A. blazei.
2.2.3 Protocolos de Pós-Tratamento
Whistler et al. (1976), ao seguirem um protocolo de pós-tratamento verificaram um
aumento no tempo de sobrevida de 43% em animais implantados com células de sarcoma 180
tratados com polissacarídeo derivado do cogumelo Schizophyllum commune (Schizophyllan).
Bobek, Galbavy e Ozdin, (1998) admistraram uma dieta imunomoduladora,
suplementada com 5% de Pleurotus ostreatus desidratado por 21 semanas após indução
tumoral descrita anteriormente no item 2.2.2. Houve redução no número total de tumores.
No protocolo de tratamento pós-indução seguido por Ishii et al. (2011), em que
animais receberam o tratamento de dieta suplementada com A. blazei após a indução do dano,
os autores verificaram uma redução de 50,09% da genotoxicidade induzida e a redução no
número de criptas aberrantes no cólon dos animais foi de 30,56%.
Diversos estudos comprovam a ação antitumoral de substâncias bioativas produzidas
por fungos do gênero Pleurotus em protocolos de pós-tratamento contra Sarcoma 180. A
Tabela 3 mostra os resultados da literatura com respeito ao percentual de inibição (%) do
36
Sarcoma 180 por substâncias obtidas de diferentes espécies de Pleurotus adiministradas após
indução tumoral.
Tabela 3 - Percentuais de inibição (%) do Sarcoma 180 por substâncias obtidas de diferentes
espécies de Pleurotus adiministradas após indução tumoral
Espécie
Origem da
fração
polissacarídica
Concentração Tempo/ tipo
do tumor
de
(cel.animal-1) administração
(s* ou i.p.)
Dose
(Dias/ i.p. ou
(mg kg1)
oral)
Tempo
de
avaliação
Inibição
(dias)**
(%)
Referência
Ikekawa et
al. (1969)
P. ostreatus
Corpos
frutíferos
- (s)
10/i.p.
200
35
75,3
P. ostreatus
Corpos
frutíferos
5x106 (s)
10/i.p.
0,2
35
95
Yoshioka et
al. (1985)
P.
citrinupileatus
Corpos
frutíferos
secos (FI)
2x106 (s)
10/i.p.
10
21
23
Zhang et al.
(1994)
P.
citrinupileatus
Corpos
frutíferos
secos (FII)
2x106 (s)
10/i.p.
10
21
24,1
Zhang et al.
(1994)
P.
citrinupileatus
Corpos
frutíferos
secos (FIII-1)
2x106 (s)
10/i.p.
10
21
79,5
Zhang et al.
(1994)
P.
citrinupileatus
Corpos
frutíferos
secos (FIII-2)
2x106 (s)
10/i.p.
10
21
93,5
Zhang et al.
(1994)
P. tuber-regium
Corpos
frutíferos
secos
1x105 (s)
10/i.p.
20
17
75
Zhang et al.
(2004a)
P. tuber-regium
Biomassa
micelial seca
1x105 (s)
10/i.p.
20
17
65,4
Zhang et al.
(2004b)
P.
citrinupileatus
Precipitado do
caldo de
cultivo
3x106 (i.p.)
20/oral
50
20
74
Wang et al.
(2000)
P. ostreatus
Biomassa
micelial fresca
2x106 (i.p.)
6/i.p.
5
7
98
Sarangi et
al. (2006)
P. tuber-regium
Corpos
frutíferos
secos
1x105 (s)
8/i.p.
20
9
Tao, Zhang
21,6 e Cheung,
(2006)
37
P. tuber-regium
Corpos
frutíferos
secos
P. ostreatus
Tao, Zhang
72,1 e Cheung,
(2006)
1x105 (s)
8/i.p.
60
9
Precipitado do
caldo de
cultivo
5x106 (i.p.)
6/i.p.
10
7
72
Wolff et al.
(2008)
P. djamor
Precipitado do
caldo de
cultivo
- (s)
10/i.p.
10
21
83
De Barba
(2010)
P. djamor
Precipitado do
caldo de
cultivo
- (s)
10/i.p.
30
21
94
De Barba
(2010)
P. djamor
Precipitado do
caldo de
cultivo
- (s)
10/i.p.
100
21
64
De Barba
(2010)
6x106 (s)
28/i.p.
40
56
53,1
6x106 (s)
28/i.p.
80
56
P. eryngii
P. eryngii
Biomassa
micelial
Biomassa
micelial
Jeong et al.
(2010)
Jeong et al.
25,7
(2010)
P. sajor-caju
Precipitado do
caldo de
cultivo
5x106 (s)
10/i.p.
10
21
79
Assis
(2011)
P. sajor-caju
Precipitado do
caldo de
cultivo
5x106 (s)
10/i.p.
30
21
86
Assis
(2011)
P. sajor-caju
Precipitado do
caldo de
cultivo
5x106 (s)
10/i.p.
100
21
86
Assis
(2011)
5x106 (s)
10/i.p.
30
21
85,6
Facchini
(2011)
5x106 (s)
10/i.p.
30
21
54,1
Facchini
(2011)
5x106 (s)
10/i.p.
30
21
93,6
Facchini
(2011)
5x106 (s)
10/i.p.
10
21
74,1
5x106 (s)
10/i.p.
30
21
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
Biomassa
micelial (FII)
Biomassa
micelial (FIII1)
Biomassa
micelial (FIII2)
Biomassa
micelial (FII)
Biomassa
micelial (FII)
Biomassa
5x106 (s)
10/i.p.
50
micelial (FII)
*s= subcutâneo, i.p.= intraperitoneal **contados a partir do início do tratamento
Fonte: Facchini (2011)
P. ostreatus
21
Facchini
(2011)
Facchini
75,5
(2011)
53,7
Facchini
(2011)
38
2.3 Neoplasias
Neoplasias são formas de crescimento celular não controladas, dando origem a uma
proliferação anormal de tecido que foge parcial ou totalmente ao controle do organismo,
tendendo à autonomia e à perpetuação com efeitos agressivos ao hospedeiro (INCA, 2008).
Apresentam elevada atividade proliferativa, capacidade de invasão tecidual e o
desenvolvimento de metástases para outros órgãos (PINHO, 2005).
2.3.1 Classificação e Nomenclatura
De acordo com a manifestação biológica os tumores podem ser benignos ou malignos.
Alguns critérios morfológicos são utilizados para o diagnóstico, tais como encapsulação,
crescimento, diferenciação morfológica em relação ao tecido de origem, mitoses,
antigenicidade e metástases. A Tabela 4 mostra os critérios de diferenciação entre tumores
benignos e malignos (INCA, 2008).
39
Tabela 4 - Diferenciação entre tumores benignos e malignos
Critérios
Encapsulação
Mitoses
Benignos
Presença frequente
Lento, expansivo e bem
delimitado.
Reproduz o aspecto do tecido de
origem
Raras e típicas
Antigenicidade
Ausente
Metástases
Fonte: INCA (2008)
Não ocorrem
Crescimento
Morfologia
Malignos
Geralmente ausente
Rápido, infiltrativo com
delimitação imprecida
Caracteres diferentes do tecido de
origem
Frequentes a atípicas
Presente- embora geralmente
fraco
Frequentes
A nomenclatura dos tumores depende do tecido que lhes deu origem. O tumor benigno
pode apresentar mais de uma linhagem celular, recebendo na maior parte dos casos o nome
dos tecidos que o compõe acrescido do sufixo “oma”. Os tumores malignos podem ser
subdividos em dois grandes grupos de acordo com sua origem. Aqueles formados a partir de
tecidos epiteliais (de revestimento, derivados do ectoderma ou endoderma), são denominados
como carcinomas. Por outro lado, tumores oriundos de tecidos mesenquimais são
classificados em geral como sarcomas, podendo ser melhor caracterizados pela adição do
nome de seu tecido específico de origem, como por exemplo o tumor maligno do tecido
cartilaginoso – condrossarcoma, o tumor maligno do tecido gorduroso – lipossarcoma, entre
outros (INCA, 2008).
A Tabela 5 mostra a classificação dos tumores segundo sua origem tecidual.
40
Tabela 5 - Classificação dos tumores segundo sua origem tecidual
Origem
Revestimento
Glândula
Benignos
Tecido epitelial
Papiloma
Adenoma
Malignos
Carcinoma
Adenocarcinoma
Tecido conjuntivo
Fibroso
Mixóide
Adiposo
Cartilagem
Vasos sanguíneos
Glômus
Pericitos
Vasos linfáticos
Mesotélio
Meninge
Mielóide
Linfoide
Células de lagerhans
Liso
Estriado
Neuroblasto
Neurônio
Fonte: INCA (2008)
Fibroma
Mixoma
Lipoma
Condroma
Hemangioma
Glomangioma
Hemangiopericitoma
Linfangioma
Meningioma
Tecido hemolinfopoético
Tecido muscular
Leiomioma
Rabdomioma
Tecido nervoso
Ganglioneuroma
-
Fibrossarcoma
Mixossarcoma
Lipossarcoma
Condrossarcoma
Hemangiossarcoma
Hemangiopericitoma maligno
Linfangiossarcoma
Mesotelioma maligno
Menigioma maligno
Leucemia (vários tipos)
Leucemia linfocítica
Linfoma
Plasmocitoma
Doença de Hodgkin
Histiocitose X
Leiomiossarcoma
Rabdomiossarcoma
Ganglioneuroblastoma
Neuroblastoma
2.3.2 Carcinogênese
O câncer é causado pela falta de controle sobre nascimento e morte celular (FRANK,
2007). São os genes e seus mecanismos reguladores os responsáveis por determinar as
41
características de crescimento das células e, também, quando ou se essas células devem
dividir-se para formar novas células. Uma mutação ou alguma outra forma de ativação
anormal desses genes controladores do crescimento e da divisão celular predispõem um
organismo ao câncer. Esses genes anormais são chamados de oncogenes (GUYTON e HALL,
1997). O câncer tem início com a proliferação descontrolada de células malignas causada por
problemas ocorridos na apoptose, processo que leva à morte celular (VULIMIRI E
DIGIOVANNI, 2006).
Segundo BORCHERS; KEEN e GERSHWIN (2004), a carcinogênese, processo de
formação do câncer, pode ser dividida em três etapas: iniciação, promoção e progressão.
Durante a iniciação, exposição a produtos químicos, por exemplo, muitas vezes
causam uma mutação (FRANK, 2007).
Após a iniciação, um promotor tumoral é necessário para estimular a divisão celular e
a formação de pequenos tumores benignos. A progressão resulta na proliferação
descontrolada de células cancerosas e envolve também a capacidade dessas células de invadir
tecidos adjacentes e, eventualmente, a metástase (BORCHERS, KEEN e GERSHWIN, 2004).
Para Pinho (2005) um distúrbio local, que tem origem na perda da capacidade
regulatória de uma única célula, resulta em uma linhagem celular que apresenta um ganho
proliferativo, resultando em nódulos de crescimento acelerado. Segundo o autor, essa etapa é
seguida pelo desencadeamento de uma série de reações análogas ao processo de inflamação,
que dá origem a uma progressiva formação de vasos sanguíneos, denominada como
angiogênese, o que favorece o ritmo proliferativo devido ao maior aporte nutricional.
A proliferação indefinida de células cancerosas demanda, eventualmente, toda a
nutrição disponível para o corpo. Como resultado, os tecidos normais sofrem, gradualmente,
morte nutricional (GUYTON e HALL, 1997).
42
No entanto, uma única mutação ocorrida na etapa de iniciação, mesmo que causando
danos irreversíveis ao DNA, é insuficiente para causar câncer, sendo necessário um
progressivo acúmulo destas (BOCHERS, 2004). O surgimento de células com alterações em
seu DNA decorrente de defeitos ocorridos em divisões celulares é bastante frequente.
Entretanto, apenas um número reduzido destas irá de fato levar ao desenvolvimento de uma
neoplasia invasiva (câncer) em decorrência de diversos fatores, como descreve Guyton e Hall
(1997):
•
A maioria das células mutantes tem menos capacidade de sobrevivência e,
simplesmente morrem;
•
Controles normais por feedback impedem o crescimento excessivo de células
mesmo que essas apresentem grandes mutações;
•
Ativação do sistema imune do corpo em resposta à formação de proteínas
anormais pelas células, devido aos seus genes alterados, fazendo com que
formem anticorpos, ou linfócitos sensibilizados que reagem contra as células
cancerosas, destruindo-as;
•
Necessidade de que vários oncogenes diferentes sejam ativados ao mesmo
tempo.
A metástase ocorre quando células se desprendem de um tumor primário e invadem a
circulação sanguínea ou linfática e, após vencerem diversas barreiras, estabelecem nova
colônia em outro local (LIU e ROBINS, 2006). Algumas dessas barreiras são descritas por
Liu e Robins (2006) para o processo de invasão e metástase de um carcinoma epitelial no
pulmão. Segundo os autores, as células necessitam:
43
•
Ganhar mobilidade (secreção de fatores de mobilidade);
•
Desprender-se de seu local ou afrouxar sua adesão (perda de E-caderina) às
células vizinhas;
•
Superar sua membrana basal;
•
Encontrar outra membrana basal;
•
Evitar sua detecção pelo sistema imunológico para finalmente se alojar num
leito capilar;
•
Afastar as células endoteliais;
•
Repenetrar a membrana basal endotelial;
•
Formar um novo aporte sanguíneo (angiogênese).
O conhecimento sobre os mecanismos mais importantes responsáveis pela ocorrência
de metástases levou pesquisadores a tomarem como alvo as etapas individuais da invasão.
Estão sendo estudados, por exemplo, inibidores especiais de metaloproteinase, que impedem
as células cancerosas de penetrarem nas membranas basais, e inibidores antiangiogênese,
como por exemplo, inibidores de fatores de crescimento vascular - endotelial (VEGF), a
talidomida e a endostatina (LIU e ROBINS 2006).
2.3.3 Incidência do Câncer Humano
O impacto global do câncer mais que dobrou em 30 anos. No Brasil, as neoplasias
malignas constituem-se na segunda causa de morte na população, representando quase 17%
44
dos óbitos de causa conhecida (INCA, 2012a, web).
Em 2010 e 2011 estimou-se a ocorrência de 489.270 casos novos de câncer no Brasil.
Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, seriam os
cânceres de próstata e de pulmão no gênero masculino e os cânceres de mama e do colo do
útero no gênero feminino (INCA, 2012a, web).
O ônus global do câncer continua a aumentar. As estimativas para o ano de 2012,
válidas também para 2013, segundo o Instituto Nacional do Câncer apontam a ocorrência de
aproximadamente 518.510 casos novos de câncer (INCA, 2012b, web). Tal fato se dá, em
grande parte, devido ao envelhecimento e crescimento da população mundial e uma crescente
adoção de hábitos que predispõem ao câncer, particularmente o tabagismo, em países
economicamente em desenvolvimento (JEMAL et al., 2011).
Idade, gênero, raça e lugar de residência são variáveis que segundo Coates e
McCreddie (1998), afetam a incidência da maioria dos cânceres. Entre homens brancos com
idade entre 80 e 84 anos, nos Estados Unidos, o câncer de cólon, por exemplo, é mais de 200
vezes mais frequente do que em indivíduos desse mesmo grupo com idade de 30 a 34 anos.
Homens em geral também apresentam uma incidência maior para a maioria dos cânceres, o
que é explicado por exposições mais frequentes a agentes conhecidamente causadores de
câncer do que as mulheres. Os autores supracitados mencionam ainda a etnia como fator de
influência visto que, a incidência de câncer de próstata, por exemplo, é duas vezes maior em
negros do que em brancos, nos Estados Unidos. Cotran, Kumar e Collins (2000) explicam que
a influência étnica pode ser decorrência de fatores genéticos.
Indivíduos que moram na zona rural têm menos casos de certos cânceres registrados,
tais como câncer de pulmão e de mama, do que indivíduos que moram na zona urbana
(COATES e McCREDDIE, 1998).
45
Os fatores ambientais, tais como físicos (raio ultravioleta, radiação ionizante),
químicos (aflatoxinas) e biológicos (vírus) e a hereditariedade, são apontadas como
causadores de mutações gênicas, predispondo os organismos ao surgimento de diversas
neoplasias (GUYTON e HALL, 1997; COTRAN, KUMAR e COLLINS, 2000).
Segundo Guyton e Hall (1997), os íons formados nas células teciduais sob influência
de radiações ionizantes, tais como raios X, raios gama, as partículas radiantes de substâncias
radioativas e, até mesmo, a luz ultravioleta, são extremamente reativos e podem romper
filamentos de DNA, causando assim muitas mutações. Além disso, os autores relatam que
substâncias químicas de certos tipos apresentam elevada propensão de causar mutações. Estes
agentes carcinogênicos podem ser encontrados na fumaça do cigarro, por exemplo. A abrasão
continuada do revestimento do trato intestinal por alguns tipos de irritantes físicos, como os
encontrados em alguns tipos de alimentos, é também um dos fatores citados por pelos autores
como causador de mutações, pois leva à rápida substituição mitótica das células, elevando a
probabilidade de alterações gênicas. De acordo com os autores, no caso de mutações causadas
por vírus, o DNA viral pode inserir-se diretamente em um dos cromossomos. Os autores
sugerem ainda que em muitas famílias existe forte tendência hereditária para o surgimento do
câncer. Nestes casos, já que uma ou mais mutações podem ter sido herdadas a partir do
genoma paterno ou materno, diminuem o número de outras mutações necessárias para o
desenvolvimento do câncer.
46
2.3.4 Sarcomas
Sarcomas é um grupo diverso e raro de tumores que são derivados de tecidos
conjuntivos, incluindo músculo, osso e cartilagem (HELMAN e MELTZER, 2003). Os
sarcomas acometem indivíduos de todas as faixas etárias e é a quinta causa mais comum de
morte por câncer em crianças. São classificados em sarcoma ósseo e sarcoma de partes moles,
sendo o primeiro mais raro que o segundo (PATEL e BENJAMIN, 2008). Segundo os
autores, os sarcomas de partes moles podem acometer músculos, tendões, gordura, tecidos
fibrosos e sinoviais, vasos e nervos. Os membros são afetados em 60% dos casos, sendo os
membros inferiores 3 vezes mais afetados que os superiores. O tronco é afetado em 30% dos
casos e a cabeça e pescoço em 10%. Aproximadamente 20 grupos diferentes de sarcomas de
partes moles são reconhecidos com base nos padrões de diferenciação para o tecido normal.
Por exemplo, o rabdomiossarcoma mostra evidências de fibras musculares esqueléticas com
estrias cruzadas, os leiomiossarcomas contêm fascículos entrelaçados de células fusiformes
que se assemelham ao músculo liso e, os lipossarcomas contêm adipócitos (PATEL e
BENJAMIN, 2008).
Os sarcomas metastáticos de partes moles são em grande parte incuráveis (PATEL e
BENJAMIN, 2008).
Baker (2009) classifica os sarcomas ósseos, segundo suas características citológicas e
produtos celulares em osteossarcomas, sarcomas de Ewing e condrossarcomas. O
osteossarcoma é uma neoplasia que forma osteóide (osso não mineralizado) e é responsável
por quase 45% dos sarcomas ósseos (PATEL E BENJAMIN, 2008). Os condrossarcomas são
tumores de cartilagem (BAKER, 2009) e representam aproximadamente de 20 a 25% dos
47
sarcomas ósseos (PATEL E BENJAMIN, 2008). Os tumores de Ewing representam 10 a 15%
dos tumores ósseos (PATEL E BENJAMIN, 2008) e, segundo Baker (2009), a célula de
origem
desses
tumores
permanece
desconhecida,
mas
admite-se
uma
origem
neuroectodérmica.
2.3.5 Tratamentos
2.3.5.1 Cirurgia
A cirurgia é o método mais utilizado de combate ao câncer (PERRY, 2009).
Estima-se que 60% de todos os pacientes com câncer necessitem de procedimento
cirúrgico (INCA, 2008).
A cirurgia é denominada curativa quando, após a cirurgia, não há câncer residual e as
margens cirúrgicas são microscopicamente livres de lesão. Quando a cirurgia é realizada com
a finalidade de apenas reduzir a população de células tumorais, a fim de controlar sintomas,
que põem em risco a qualidade de vida do paciente (descompressão de estruturas vitais,
controle de hemorragias, controle da dor, entre outros) é então denominada paliativa (INCA,
2008).
Gomes (2003) classifica os tipos de cirurgias oncológicas, além da curativa e paliativa,
ainda em cirurgia diagnóstica, e em um grupo diversificado, denominado “outros
procedimentos”.
48
Na cirurgia diagnóstica, um dos procedimentos mais importantes é a biópsia,
fundamental para o planejamento terapêutico dos tumores malignos (GOMES, 2003).
Dentre as cirurgias classificadas por Gomes (2003) no grupo denominado “outros
procedimentos”, destacam-se a endocrinocirurgia,
realizada como
complementação
terapêutica nos tumores hormodependentes; cirurgia para implante de cateteres; cirurgia
reconstrutora, entre outras.
2.3.5.2 Quimioterapia
A quimioterapia do câncer usa normalmente drogas que bloqueiam os mecanismos de
duplicação celular, síntese de DNA, RNA e proteínas (DELGADO, 2003).
A maioria dos antineoplásicos quimioterápicos atua de forma não específica, lesando
tanto células malignas como células benignas por atuarem indistintamente no tumor e tecidos
normais de proliferação rápida, como o sistema hematopoiético e as mucosas (INCA, 2008).
A quimioterapia pode ser curativa se o seu resultado final puder levar a cura dos
pacientes, como é o caso das leucemias e linfomas, tumor do testículo e doença trofoblástica.
A quimioterapia paliativa é aquela que se aplica após tratamento loco-regional (cirurgia e
radioterapia), com o intuito de destruir micrometástases (DELGADO, 2003).
Perry (2009) cita ainda como modalidades de quimioterapia, a quimioterapia
neoadjuvante ou primária, que é utilizada antes da cirurgia ou radioterapia para diminuir o
tamanho de cânceres localmente avançados, permitindo assim melhor ressecção cirúrgica e
erradicação de metástases identificáveis e, a quimioterapia adjuvante, aplicada após
49
tratamento cirúrgico ou radioterápico com o intuito de se evitar recidiva.
Os quimioterápicos antineoplásicos são classificados quanto à sua relação com o ciclo
celular, sendo divididos em ciclo-específicos, que atuam nas células que se encontram numa
fase específica do ciclo celular e ciclo-inespecíficos, que apresentam seus efeitos citotóxicos
em qualquer fase do ciclo celular. Eles são ainda classificados quanto à estrutura e função
química, podendo ser alquilantes, causando alterações nas cadeias de DNA; antimetabólicos,
bloqueando a produção de enzimas ou interpondo-se entre as cadeias de DNA e RNA,
transmitindo mensagens errôneas; antimitóticos, interferindo na formação do fuso mitótico;
topoisomerase-interativos, interagindo com a enzima topoisomerase I e II, interferindo assim
na síntese de DNA; antibióticos antitumorais, interferindo com a síntese de ácidos nucléicos,
impedindo a duplicação e a separação das cadeias de DNA e RNA (INCA, 2008).
2.3.5.3 Radioterapia
A radioterapia consiste na aplicação clínica de radiação para o tratamento de doenças
neoplásicas, que pode se realizar por meio de três métodos distintos de administração:
teleterapia, que envolve a aplicação da radiação a partir de uma fonte externa ao corpo,
braquiterapia, que coloca a fonte de radiação em contato com o corpo, a poucos centímetros
do tumor, podendo o implante físico da fonte ocorrer dentro dos tecidos, dentro das cavidades
existentes ou próximas da superfície do corpo (INCA, 2008; WALDRON e O’SULLIVAN,
2006) e a isoterapia, que consiste na administração intravenosa ou oral de isótopos radioativos
que são seletivamente absorvidos por tecidos específicos que contenham tumores
50
(WALDRON e O’SULLIVAN, 2006).
A radioterapia pode ser aplicada como uma única modalidade curativa ou em
associação com a cirurgia ou a quimioterapia, para o tratamento da doença neoplásica. O
objetivo do tratamento é obter o melhor equilíbrio entre a probabilidade de cura do tumor e de
danos ao tecido normal, o que é chamado de índice terapêutico (WALDRON e
O’SULLIVAN, 2006).
Segundo Gates e Fink (2009), a radioterapia pode ser aplicada em caráter paliativo
proporcionando não a cura, mas a melhoria da qualidade de vida do paciente. As doses desse
tipo de radioterapia são baixas ou moderadas e auxiliam na redução de sintomas em certos
cânceres, como o alívio da dor em lesões ósseas, redução de metástases no cérebro,
desobstrução de lesões obstrutivas, atenuação de sangramento em neoplasias ginecológicas
(PERRY, 2009).
A radiação ionizante funciona induzindo à interrupção do ciclo celular em etapas de
controle específicas e, embora qualquer molécula dentro das células possa sofrer danos pela
radiação, é provável que a grande maioria desses danos não tenha conseqüências. No entanto,
lesões aos tecidos normais podem ocorrer devido à radiação por conseqüência de perda
celular (WALDRON e O’SULLIVAN, 2006). As manifestações clínicas de lesões em tecidos
normais podem ocorrer em um curto prazo depois da irradiação como nos tecidos da pele,
hemocitopoiético, linfóide, mucosa, aparelho, digestivo, ovário e outros (INCA, 2008),
carcterizando-os como tecidos de resposta rápida (BAKER, 2009). Alterações podem ocorrer
também em tempo mais prolongado após a irradiação, como nos tecidos ósseo, conjuntivo,
muscular e nervoso. Esses tecidos, caracterizados como tecidos lentos (BAKER, 2009)
apresentam baixa atividade proliferativa e menor suscetibilidade à apoptose (INCA, 2008).
Os danos às células são causados pela interação da radiação com o oxigênio
51
molecular, induzindo a formação de superóxido ou peróxido de hidrogênio, ou radicais
hidroxila, que danificam o DNA, levando à morte celular (PERRY, 2009).
2.3.5.4 Tratamentos Complementares
Tanto a radioterapia como a quimioterapia invariavelmente causam danos ou
enfraquecem as defesas imunológicas do paciente, que também podem ter sido danificadas
pelo câncer em si. A partir dessas observações, vem-se desenvolvendo um novo conceito na
terapia contra o câncer, a de que é possível modificar a resposta do hospedeiro às células
cancerígenas (SMITH, ROWAN e SULLIVAN, 2003; SMITH, ROWAN e SULLIVAN,
2006).
As células tumorais são reconhecidas pelo sistema imunológico por elementos da
imunidade inata e adaptativa. Sendo assim, como parte da imunidade inata, macrófagos,
quando ativados, podem secretar, por exemplo, a TNF-α, que quando secretada, induz morte
por apoptose. Também como parte da imunidade inata, células NK (natural killers) são
responsáveis pelo reconhecimento e lise de células tumorais. Entre as células efetoras da
imunidade adaptativa, encontram-se os linfócitos B e os linfócitos T (CHAMMAS et al.,
2009).
Segundo Smith, Rowan e Sullivan (2006), agentes imunoestimulantes poderiam ser
coadjuvantes úteis para terapias contra o câncer se não interferirem com a eficácia do
tratamento convencional. Sendo assim, modificadores de resposta biológica (BRMs) vêm
52
evoluindo como um quarto método de tratamento de câncer (SMITH, ROWAN e
SULLIVAN, 2003).
Modificadores da resposta biológica são compostos usados para tratar o câncer,
alterando ou aumentando os processos que ocorrem naturalmente no corpo. A imunoterapia
faz uso de BRMs para melhorar a atividade do sistema imunológico aumentando os
mecanismos de defesa naturais do organismo contra o câncer (GOLDSBY, KINDT e KUBY
2000).
Bisht, Bist e Dhasmana (2010) classificam os BRMs em:
•
IFN: IFN-α - pequenas proteínas sintetizadas pelas células imunes em resposta
a vários estímulos. Promovem a resposta imune celular (células T);
•
IL: IL-2, IL-6, IL-11- citocinas produzidas no organismo, pelos linfócitos;
•
Fatores estimuladores de colônias (CSFs) - fatores de crescimento mediadores
da proliferação, maturação, regulação e ativação de células hematopoiéticas;
•
Anticorpos monoclonais - clones de anticorpos similares que são dirigidos
contra antígenos específicos;
•
Agentes diferenciadores- tretinoína, bexaroteno;
•
Inibidores de tirosina quinase (TKIs);
•
TNF-α; secretadas por macrófagos ativados por endotoxinas. A TNF liga-se ao
receptor em membranas celulares, inicia a atividade celular e é citotóxica a
célula.
•
Talidomida e seus congêneres;
•
Inibidores angiogênicos- atuam impedindo
sanguíneos;
o
crescimento de novos vasos
53
•
Vacinas contra o câncer - utilizadas contra agentes infecciosos que podem
causar câncer.
Segundo os autores os BRMs apresentam mecanismo de ação direta, propiciado pela
atividade citotóxica sobre células tumorais, como a conferida por anticorpos monoclonais;
mecanismo de ação indireta, atuando como imunoestimulantes, causadas por interleucinas e
interferons; ou mecanismo de ação mista caracterizada tanto pela promoção de diferenciação
celular, conferida pelos fatores estimuladores de colônias, ajudando a substituir células
alteradas, como pela interferência em alterações neoplásicas, exercida por agentes que
facilitam a diferenciação das células tumorais em células normais e pela prevenção de
metástases, causados por inibidores angiogênicos.
A atividade imunomoduladora de compostos isolados de macrofungos medicinais está
relacionada
à
ação
exercida
sobre
células
imuno-efetoras,
como
células-tronco
hematopoiéticas, linfócitos, macrófagos, células T, DCs e células NK envolvidas na
imunidade inata e adaptativa, resultando na produção de citocinas (MORADALI et al., 2007).
A estimulação dos sistemas de defesa imunológica por polímeros bioativos de
cogumelos medicinais tem efeitos significativos sobre a maturação, diferenciação e
proliferação de muitos tipos de células do sistema imunológico do hospedeiro (WASSER,
2011). Segundo Bohm e Bemillar (1995) parecem agir como imuno-estimulantes
inespecíficos, embora alguns tenham efeitos citotóxicos diretos.
Mizuno, Minato e Tsuchida (1998) sugeriram que a atividade antitumoral de Agaricus
blazei em camundongos se dá por meio da modulação do sistema imune, tratados com uma
fração solúvel em água de polissacarídeos deste cogumelo.
Akramiené, Didžiapetrienė e Kėvelaitis (2007) associam a atividade medicinal de
54
fungos aos polissacarídeos encontrados na parece celular. Segundo o autor esses
polissacarídeos apresentam composições diferentes, sendo a maior parte pertencente ao grupo
das β-glucanas. Chan, Chan e Sze (2009) relatam que β-glucanas agem sobre vários
receptores imunológicos incluindo Dectin-1, receptor de complemento (CR3) e TLR-2/6 e
desencadeiam um grupo de células do sistema imunológico, incluindo macrófagos,
neutrófilos, monócitos, células natural killer e células dendríticas. Como consequência, tanto a
resposta adaptativa quanto inata podem ser moduladas por β-glucanas que também podem
aumentar a fagocitose.
O efeito imunomodulador de polissacarídeos de P. tuber regium e P. rhinocerus foram
estudados por Wong (2011). Os resultados obtidos nesse estudo demonstram um significativo
aumento do baço dos camundongos tratados com os extratos obtidos destes fungos, indicando
um aumento de atividade mitogênica, que leva à maturação de linfócitos.
A utilização de substâncias provenientes de cogumelos que seguem protocolos de
tratamento pré-indução demonstraram ação preventiva contra danos no cólon (NOSÁĽOVÁ
et al., 2001), tumores (SHAMTSYAN et al., 2004) e danos hepatológicos (NADA, OMARA
e ABDEL-SALAM, 2010). Protocolos pré/pós-indução tumoral demonstram a atividade
antitumoral exercida pelo fungo Pleurotus ostreatus (BOBEK, GALBAVY e OZDIN, 1998) e
pelo cogumelo Agaricus blazei (ISHII et al., 2011).
Tais relatos sugerem que substâncias fúngicas podem atuar como modificadores de
resposta biológica, podendo conferir um efeito preventivo ao surgimento de tumores.
55
3 METODOLOGIA
3.1 Obtenção da Biomassa Deslipidificada
A biomassa deslipidificada foi obtida pelo processo demonstrado na Figura 2.
Figura 2 – Diagrama do processo de produção da biomassa deslipidificada
Fonte: Primária (2012)
56
3.1.1 Microrganismo e Manutenção
O fungo utilizado para a produção da biomassa deslipidificada foi o Pleurotus djamor
UNIVILLE 001, isolado pelo Grupo de Pesquisa de “Processos Biotecnológicos” da Univille.
A linhagem foi mantida em meio sólido Trigo-Dextrose-Ágar (TDA) (FURLAN et al., 1997),
sob refrigeração (4 ºC) e os repiques feitos a cada três meses.
3.1.2 Preparo do Inóculo
O inóculo foi preparado em frasco da marca DURAN de 2L contendo 400 mL de meio
POL. O meio POL foi preparado conforme descrito por Cavazzoni e Adami (1992): 5,0g de
(NH4)2SO4; 0,2g de MgSO4. 7H2O; 1,0g de K2HPO4; 2,0g de extrato de levedura; 1,0g de
peptona; 1,0g de CaCO3; 1,0L de H20 qsp; pH 6,5 – 7,0), com concentração inicial de glicose
igual a 20g L-1. O frasco foi inoculado com micélio de 7 dias, contido em uma placa de Petri
conforme item 3.1.1. Após a inoculação, o frasco foi incubado a 30ºC e mantido sob agitação
recíproca de 120 min-1, por seis dias.
57
3.1.3 Produção de Biomassa
A biomassa foi obtida a partir de cultivos submersos, realizados em regime
descontínuo, em reator de mistura completa modelo Biostat B, B. BRAUN, com dorna de
vidro de capacidade de volume útil de 5,0L e volume de trabalho de 4,0L. O sistema possuía
três turbinas, estando a primeira turbina situada imediatamente acima do anel dispersor de ar.
O diâmetro das turbinas era de 63mm e a distância entre elas de 75mm. O pH foi controlado
em 3 pela da adição automática de soluções de NaOH 6M e H3PO4 12N, tendo acoplado ao
biorreator um sensor de pH (modelo EASYFERM PLUS K8 325, INGOLD ELECTRODES).
Conforme Wisbeck (2003), a temperatura foi controlada em 30ºC por meio de sensor
de temperatura (modelo PT 100, B.BRAUN) e um banho termostático. A vazão de ar foi
mantida em 0,25L min-1 e a frequência de agitação fixada em 300 min-1. No entanto, durante o
cultivo não foi monitorada a pressão parcial de oxigênio dissolvido (pO2) por meio do
eletrodo polarográfico, devido a aderência dos pellets formados à sonda de pO2, dificultando
assim a medida do KLa. Na preparação do sistema, o biorreator contendo 1,5L de água
destilada foi esterilizado em autoclave a gás a 121ºC por 20 minutos. Neste processo, os
sensores de temperatura e pH foram esterilizados juntamente com o biorreator. O meio de
cultivo (POL), concentrado em 1,5L, a solução de glicose (40gL-1), concentrada em 0,4L e a
solução de CaCO3 (1 g L-1), concentrada em 0,2L, foram esterilizados separadamente. O
volume de inóculo foi de 0,4L, completando o volume de trabalho de 4L e, tendo-se uma
fração de inóculo equivalente a 10% v/v (WISBECK, 2003). Após toda a preparação e
montagem do sistema, foi dado início ao processo de cultivo.
58
3.1.4 Separação da Biomassa
O caldo de cultivo e a biomassa obtidos dos cultivos em biorreator foram separados
por filtração em papel Whatmann n° 1.
A biomassa micelial de Pleurotus djamor foi liofilizada e o conteúdo lipídico foi
extraído em Soxhlet com éter de petróleo por 8-10h, a fim de remover moléculas não
associadas a atividade antitumoral. Após, ao material deslipidificado, adicionou-se metanol na
proporção 2:3 (biomassa: metanol) e acondicionou-se a 4ºC “overnight”. O metanol foi
evaporado a 40º- 50ºC e o material foi liofilizado e armazenado em temperatura ambiente até
utilização (JOSE, AJITH e JANARDHANAN, 2004).
3.1.5 Dose de Tratamento
O material liofilizado deslipidificado foi solubilizado em solução tampão fosfato (PBS
0,01M, pH 7,0) e testado nas doses de 10 mg kg-1, 30 mg kg-1e 50 mg kg-1.
3.2. Avaliação In Vivo da Biomassa Deslipidificada
59
3.2.1 Animais e Manutenção
Foram utilizados camundongos albinos suíços machos, com peso de 25 ± 5g, mantidos
em biotério, com água e ração ad libitum, controle de temperatura em 21±1°C e fotoperíodo
de 12 horas. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com
Animais da UNIVILLE (Anexo A).
3.2.2 Tumor e Manutenção
A linhagem tumoral, Sarcoma 180 (S180), foi obtida do Departamento de
Farmacologia da UNIVALI (Itajaí – SC) e mantida por meio de repiques intraperitoneais
realizados a cada 7 dias em camundongos albinos Swiss machos (PAGNO et al., 2006).
3.2.3 Indução Tumoral
A indução tumoral foi realizada, via subcutânea, no dorso de cada camundongo dos
grupos teste e controle positivo na concentração de 5x106 cel animal-1 conforme Pagno et al.
(2006).
60
3.2.4 Delineamento Experimental do Tratamento Antitumoral
O número total de animais utilizados foi de 100 indivíduos, sendo 50 para o tratmento
pré/pós-indução tumoral e 50 para o tratamento pós-indução. Os animais em cada tratamento
foram divididos em grupos como descrito a seguir:
a) Grupo Teste (GT) - composto por 30 animais nos quais foi realizada a indução tumoral e
administração da substância teste por via intraperitoneal. Este grupo foi subdividido em 3
subgrupos, de acordo com a dose da substância utilizada:
•
Grupo T1 (n=10): 10 mg kg-1 da substância teste;
•
Grupo T2 (n=10): 30 mg kg-1 da substância teste;
•
Grupo T3 (n=10): 50 mg kg-1 da substância teste.
b) Grupo Controle Substância (CS) - composto por 5 animais, nos quais foi realizada a
administração da substância, na dose de 50 mg kg-1 por, via intraperitoneal, sem indução
tumoral.
c) Grupo Controle positivo (CP) - composto por 10 animais, nos quais foi realizada a indução
tumoral e administração de PBS na dose de 10 mg kg-1, por via intraperitoneal.
d) Grupo Controle negativo (CN) - Composto por 5 animais, nos quais foi realizada a
administração de PBS na dose de 10 mg kg-1, por via intraperitonial, porém sem a indução
61
tumoral.
O delineamento experimental utilizado tanto para o tratamento pré/pós- indução,
quanto para o tratamento pós-indução tumoral está demonstrado na Figura 3.
*
*
*
*
5 animais s/ tumor
*substância a ser testada como antitumoral
Figura 3 - Delineamento experimental para o tratamento antitumoral
Fonte: Primária (2012)
3.2.5 Testes Dose x Resposta
A avaliação do tratamento antitumoral foi realizada por meio de dois tipos de teste
dose x resposta:
a) Teste pré/pós-indução– os animais dos grupos T1, T2 e T3 foram tratados uma vez ao dia,
durante os 10 dias que precediam a indução tumoral; o tratamento foi reiniciado 24 horas após
a indução do tumor e mantido por mais 10 dias. Esta metodologia foi adaptada a partir da
metodologia utilizada por Ajith e Janardhanan (2003).
Aos animais do grupo CP foi realizada a administração de PBS, iniciando-se também
62
10 dias antes da indução tumoral e mantendo-os sob tratamento por 10 dias após indução do
tumor. Ao grupo CN foi realizada a administração de PBS, sem indução tumoral, por 20 dias,
uma vez ao dia. Ao grupo CS foi realizada a administração da substância, sem indução
tumoral, por 20 dias, uma vez ao dia.
Cada grupo recebeu a dose indicada na sessão 3.2.4.
b) Teste pós-indução – os animais dos grupos T1, T2 e T3 foram tratados uma vez ao dia,
iniciando-se 24h após a indução tumoral. O tratamento foi mantido por 10 dias consecutivos
(ZHANG et al., 1994; MIZUNO et al., 1999; AJITH e JANARDHANAN, 2003).
Aos animais do grupo CP foi realizada a administração de PBS iniciando-se também
24 h após a indução tumoral. Ao grupo CN foi realizada a administração de PBS, sem
indução tumoral, por 10 dias, uma vez ao dia. Ao grupo CS foi realizada a administração da
substância, sem indução tumoral por 10 dias, uma vez ao dia. As doses de tratamento estão
indicadas na sessão 3.2.4.
As soluções de tratamento foram preparadas na concentração de 1g L-1 da biomassa
deslipidificada para a dose de 10 mg kg-1 de peso do animal. Para as doses de 30 e 50 mg kg-1
de peso do animal as soluções foram preparadas na concentração de 10g L-1 da biomassa
deslipidificada.
3.2.6 Avaliação do Desenvolvimento Tumoral
A avaliação do desenvolvimento tumoral, tanto para o teste pré/pós como para o teste
63
pós-indução tumoral, foi realizada após 21 dias, a contar da indução tumoral (ZHANG et al.,
1994; MIZUNO et al., 1999; AJITH e JANARDHANAN, 2003), considerando-se três
variáveis: determinação da massa (g) do tumor (MISAKI et al., 1984), obtida utilizando-se
balança analítica; do volume tumoral (AJITH e JANARDHANAN, 2003), calculado pelo uso
da fórmula da esfera após obtenção de duas medidas, a de menor diâmetro e a de maior
diâmetro, com uso de paquímetro; e determinação da taxa de inibição, obtida por meio da
relação [(1-T)/C]*100, onde T é a massa média do tumor do grupo teste e C é a massa média
do tumor do grupo controle positivo. (MIZUNO et al., 1999; ZHANG et al., 2004).
3.2.7 Avaliação da taxa de Sobrevida
O número utilizado para o teste de sobrevida foi de 30 indivíduos divididos em grupos
como descrito a seguir.
a) Grupo Teste (GT) - composto por 10 animais nos quais foi realizada a indução tumoral e
administração da substância teste por via intraperitoneal na dose de 10 mg kg –1.
b) Grupo Controle Substância (CS) - composto por 5 animais, nos quais foi realizada a
administração da substância, na dose de 10 mg kg-1 por, via intraperitoneal, sem indução
tumoral.
c) Grupo Controle positivo (CP) - composto por 10 animais, nos quais foi realizada a indução
64
tumoral e administração de PBS na dose de 10 mg kg-1, por via intraperitoneal.
d) Grupo Controle negativo (CN) - Composto por 5 animais, nos quais foi realizada a
administração de PBS na dose de 10 mg kg-1, por via intraperitonial, porém sem a indução
A substância teste, descrita no item 3.1.5, foi administrada na dose diária de 10 mg kg1
de peso do animal, via intraperitonial, durante 5 dias consecutivos, iniciando 24 horas após a
inoculação tumoral (KASAI et al., 1991). Nos grupos controle negativo e controle positivo foi
administrado solução de PBS.
A sobrevivência dos animais foi avaliada por 30 dias após a inoculação tumoral
(KASAI et al., 1991).
O delineamento experimental para o teste de sobrevida está representado na Figura 4.
Grupo Teste
T1 (10 mg Kg-1
sub. teste). 10
animais c/
tumor
Grupos controle
Controle positivo
(10 mg kg-1 PBS).
10 animais c/
tumor
Figura 4 - Delineamento experimental do teste de sobrevida
Fonte: Primária (2012)
Controle substância
(50 mg kg-1 sub.
teste). 5 animais c/
tumor
Controle negativo
(10 mg kg-1 PBS). 5
animais s/ tumor
65
3.2.8 Teste de Citotoxicidade
Foi utilizado o método colorimétrico 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il) 2,5-Difenil Brometo de
Tetrazoilium (MTT) descrito por Mosmann (1983), que consiste em medir indiretamente a
viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas.
O ensaio de MTT é um rápido e sensível ensaio espectrofotométrico usado para
determinar a viabilidade celular de culturas de linhagens de células que formam
monocamadas (SELVI et al., 2011). Detecta células vivas que são metabolicamente ativas
(BASSIL et al., 2012). O tetrazólio amarelo MTT (3-(4, 5- Dimetiltiazol -2- il)-2,5 Difenil
brometo de Tetrazoilium) é reduzido por células metabolicamente ativas, em parte pela ação
das enzimas desidrogenase, gerando equivalentes redutores como NADH e NADPH. A cor
roxa
intracelular
resultante
pode
ser
solubilizada
e
quantificada
por
meios
espectrofotométricos (SELVI et al., 2011).
Uma concentração de 54 x 104 células por poço da linhagem tumoral de Sarcoma 180,
tratada com a biomassa deslipidificada de Pleurotus djamor por 24h nas concentrações de 0,5,
1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0 mg mL-1, foi adicionada aos poços de cultivo celular em placas ELISA.
Cada dose foi avaliada em 11 replicatas. Após o período de 24h também se adicionou 10 µL
de MTT, na concentração de 5 mg mL-1. A placa foi então incubada por 3 horas em estufa a
37°C. Após este período, foram acrescentados 100 µL de Dodecil sulfato de sódio (SDS) a
10% e a placa foi recoberta por papel alumínio e colocada na estufa a 37°C por 24h. A
quantificação da densidade óptica foi medida em espectofotômetro utilizando-se o filtro de
interferência de 550 nm. A determinação do percentual de citotoxicidade foi relizada por meio
da comparação do valor obtido em cada dose com o obtido com o controle celular.
66
O controle celular continha uma concentração de 54 x 104 células por poço da
linhagem tumoral de Sarcoma 180, porém não tratadas com a biomassa deslipidificada de P.
djamor.
3.2.9 Análise Estatística
Todos os dados obtidos de massa e volume tumoral foram analisados pelo teste
estatístico para rejeição de valores desviantes, denominado Teste ‘Q’ de Dixon (r10), com
nível de confiança de 95% (RORABACHER, 1991). Os dados resultantes do teste Q foram
submetidos à análise de variância de valores médios (ANOVA), por meio do Teste Tukey com
o nível de significância de 5% (p<0,05).
67
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação da Atividade Antitumoral
4.1.2 Teste Pré/Pós-Indução Tumoral
Na Figura 5 estão apresentados os valores dos volumes (cm3), das massas (g) e dos
percentuais de inibição (%) do Sarcoma 180 nos animais tratados com 10, 30 e 50 mg kg-1 da
substância de tratamento no teste pré/pós-indução tumoral. Os asteriscos sobre as barras de
dados indicam os valores que não apresentaram diferença estastística.
A)
6,31
1,51
0,61
1,02
10 mg kg-1 30 mg kg-1 50 mg kg-1
Figura 5 – (A) massas (g), (B) volumes (cm3) e (C) percentuais de inibição (%) do Sarcoma 180 (S 180) após o
tratamento pré/pós-indução tumoral dos animais com 10, 30 e 50 mg kg-1 da biomassa deslipidificada, obtida de
68
Pleurotus djamor. CN = controle negativo, CP = controle poistivo. Os valores se referem às medias dos valores
de massa e volume obtidos ao fim do experimento ± erro padrão.
Fonte: Primária (2012)
B)
20,25
6,33
3,5
3,53
10 mg kg-1 30 mg kg-1
C)
50 mg kg-1
90,4%
83,8%
76,0%
10 mg kg-1
30 mg kg-1
50 mg kg-1
Figura 5 – (continuação)
Fonte: Primária (2012)
Observa-se na Figura B que as doses de 10, 30 e 50 mg kg-1 apresentaram diferença
significativa em relação ao grupo controle positivo tanto no que diz respeito ao volume
quanto à massa tumoral, porém não apresentaram diferença significativa entre si.
69
Os volumes tumorais foram de 6,3cm3 para o grupo tratado com 10 mg kg-1 e 3,5 cm3
para os grupos tratados tanto com 30 mg kg-1 quanto com 50 mg kg-1, O volume tumoral no
grupo controle positivo foi de 20,2cm3.
A massa tumoral observada nos grupos tratados foi de 1,5g, 0,6g e 1,0g para as doses
de 10, 30 e 50 mg kg-1, respectivamente. Já, a massa no grupo controle positivo foi de 6,3g.
O percentual de inibição tumoral em cada grupo tratado em relação ao grupo controle
foi de 76,0%, 90,4% e 83,8% para as doses 10 mg kg-1, 30 mg kg-1 e 50 mg kg-1,
respectivamente.
Considerando que o percentual de inibição tumoral é calculado a partir da massa
tumoral e que este parâmetro não apresentou diferença significativa entre as doses de
tratamento, pode-se dizer que para a concentração da substância de tratamento variando de 10
a 50 mg kg-1, a redução tumoral é de em média, 83,3%.
4.1.3 Teste Pós-Indução Tumoral
Na Figura 6 estão apresentados os valores dos volumes (cm3), das massas (g) e dos
percentuais de inibição (%) do Sarcoma 180 nos animais tratados com 10 mg kg-1, 30 mg kg-1
e 50 mg kg-1 da substância de tratamento no teste pós-indução tumoral.
70
9,93
A)
4,02
2,82
2,06
10 mg kg-1 30 mg kg-1 50 mg kg-1
29,29
B)
12,27
9,15
5,01
10 mg kg-1
30 mg kg-1
50 mg kg-1
Figura 6 – (A) massa (g), (B) volume (cm3) e (C) percentuais de inibição (%) do Sarcoma 180 (S 180) após o
tratamento pós-indução tumoral dos animais com 10, 30 e 50 mg kg-1 da biomassa deslipidificada, obtida de
Pleurotus djamor. CN = controle negativo, CP = controle poistivo. Os valores se referem às medias dos valores
de massa e volume obtidos ao fim do experimento ± erro padrão.
Fonte: Primária (2012)
71
C)
79,2%
71,6%
59,5%
10 mg kg-1
30 mg kg-1
50 mg kg-1
Figura 6 – (continuação)
Fonte: Primária (2012)
Os perfis obtidos nos testes pós-indução tumoral foram muito similares aos
observados no teste pré/pós-indução tumoral. Observa-se na Figura 6 que as doses 10 mg kg-1,
30 mg kg-1 e 50 mg kg-1 apresentaram diferença significativa em relação ao grupo controle
positivo tanto no que diz respeito ao volume quanto à massa tumoral, porém não apresentaram
diferença significativa quando comparadas entre si.
A massa tumoral observada nos grupos tratados foi de 2,8g, 2,0 g e 4,0g para as doses
10, 30 e 50 mg kg-1, respectivamente, enquanto a massa no grupo controle positivo foi de
9,93g. Já, o volume tumoral nos grupos tratados foi de 12,3cm3, 5,0cm3 e 9,2cm3 para as
doses 10, 30 e 50 mg kg-1 respectivamente, enquanto o volume tumoral no grupo controle
positivo foi de 29,3cm3.
72
O percentual de inibição tumoral em cada grupo tratado em relação ao grupo controle
foi de 71,6%, 79,2% e 59,5% para as doses 10, 30 e 50 mg kg-1, respectivamente. Seguindo o
mesmo raciocínio usado para a análise do primeiro teste, pode-se considerar que
independentemente da dose (10 a 50 mg kg-1) da substância de tratamento, obtém-se, em
média, 70% de redução tumoral.
4.1.4 Comparação Entre os Testes Pós e Pré/Pós-Indução Tumoral
Comparando-se os resultados dos testes pré/pós-indução tumoral com os resultados
dos testes pós-indução tumoral, observa-se que para a dose da substância de tratamento
variando de 10 a 50 mg kg-1 no teste pré/pós, a redução tumoral é de, em média, 83,3%. No
caso dos testes pós-indução tumoral, obteve-se, em média, 70% de redução tumoral, também
de forma independente da dose (10 a 50 mg kg-1). Os testes pré/pós-indução tumoral
conferiram um percentual de inibição em média 13,3 % maior do que os testes realizados após
a indução. A Figura 7 apresenta a comparação entre os testes pré/pós-indução tumoral e os
testes pós-indução tumoral em relação à massa tumoral média obtida com as doses 10, 30 e 50
mg kg-1.
73
10 mg/Kg
30 mg/Kg
50 mg/Kg
6
4,01
**
Massa Tumoral (g)
5
4
2,81
**
3
2,06
**
1,51
2
*
1,02
*
0,60
*
1
0
Pré-Pós
Pós
Pré-Pós
Pós
Pré-Pós
Pós
Figura 7 - Comparação entre os testes pré/pós-indução tumoral e pós-indução tumoral para cada dose avaliada.
Os valores se referem às medias dos valores de massa obtidos ao fim do experimento ± erro padrão.
Fonte: Primária (2012)
Verifica-se diferença significativa entre os tipos de tratamentos em todas as doses
testadas.
Em relação à dose de 10 mg kg-1, o teste pré/pós apresenta uma massa tumoral média
46,27% menor do que o teste pós-indução. Nesta dose o valor médio da massa tumoral foi de
1,51g para o teste pré/pós-indução tumoral e 2,81g para o teste pós-indução. Para a dose de 30
mg kg-1, a massa tumoral média observada no teste pré/pós-indução tumoral foi de 0,6 g,
enquanto que para o teste pós foi de 2,0g. Nesta dose a massa tumoral no teste pré/pós foi
70,88% menor que no teste pós. Para a dose de 50 mg kg-1 a massa tumoral média observada
74
no teste pré/pós foi de 1,02g e para o teste pós-indução, de 4,01g, ou seja, a massa tumoral do
teste pré/pós foi 74,57% menor do que a massa tumoral do teste pós.
O elevado percentual de inibição tumoral apresentado nos testes pré/pós-indução
tumoral em relação àquele obtido nos testes pós-indução pode estar relacionado à estimulação
do sistema imunológico, proporcionado pelas substâncias bioativas presentes na biomassa
deslipidificada do cogumelo testado, conferindo um efeito preventivo.
Outros autores compararam protocolos de pré e pré/pós-tratamento fúngico.
Whistler et al. (1976) reportam diferenças em testes pré-indução tumoral, pré/pósindução tumoral combinado, e pós-indução tumoral que utilizaram polissacarídeo derivado do
cogumelo Schizophyllum commune (Schizophyllan) em camundongos implantados com
células de Sarcoma 180. Os autores relatam que, nesse estudo, o tratamento prévio com
schizophyllan não teve qualquer efeito. Já, o tratamento pré/pós combinado e o tratamento pós
resultaram no aumento da sobrevida em 57% e 43% dos animais tratados, respectivamente. O
teste pré/pós-indução realizado neste trabalho também foi o que apresentou melhor resposta.
No trabalho realizado por Bobek, Galbavy, Ozdin (1998) observou-se uma redução no
número total de tumores tanto no grupo de animais alimentados com dieta de cogumelo que
seguiu protocolo de pós-tratamento como no grupo tratado duranto todo o experimento. No
entanto, observou-se uma redução significativa do número de focos de tumor do carcinoma in
situ em animais alimentados com os cogumelos durante todo experimento. Esses animais
também tiveram o número significativamente menor de focos de cripta aberrante.
Ishii et al. (2011) verificaram a redução dos danos sofridos pelo DNA, induzidos por
1,2 dimetilhidrazina (DMH) em camundongos suíços machos, conferida pela administração
de ração suplementada com 10% do cogumelo Agaricus blazei desidratado, em testes de
tratamento simultâneo, de pré-tratamento + condições contínuas, pré-tratamento e pós-
75
tratamento. O teste pré-tratamento + condições contínuas, que se equivale ao teste pré/pósindução deste trabalho, apresentou um percentual de redução de danos de 38,76%. O teste
pós- tratamento apresentou um percentual de redução de danos 25,85% maior que o teste prétratamento + condições contínuas. Os resultados apresentados por Ishii e colaboradores
apresentam uma tendência contrária à apresentada neste trabalho, em que os testes pré/pósindução apresentam, em média, maior taxa de inibição do que os testes pós-indução. No
entanto, quando o autor avaliou a redução de danos em relação à integridade do cólon dos
animais, análises estatísticas indicaram a atividade anticarcinogênica de A. blazei nos grupos
pré-tratamento e pré-tratamento + condições contínuas com uma redução percentual de danos
de 54,60 e 50,45%, respectivamente. Os grupos tratamento-simultaneo e pós-tratamento
apresentaram redução percentual de danos de 48,96 e 30,56, respectivamente. O autor
argumenta que mesmo não havendo diferença significativa entre os grupos existe uma
tendência à prevenção. No presente trabalho, os resultados obtidos com os testes em que o
tratamento teve início anteriormente à indução tumoral fica clara a ação antitumoral
preventiva de P. djamor, já que a taxa de inibição foi maior para todas as doses em relação
aos testes pós-indução.
A maioria dos trabalhos que avaliaram a ação antitumoral de substâncias bioativas
provenientes de fungos do gênero Pleurotus seguiram protocolos de tratamento pós-indução
tumoral.
Sousa, Nascimento e Correia (2004) realizaram testes in vivo em camundongos albinos
suíços. Os camundongos tratados após indução de Sarcoma 180 com uma fração solúvel em
água obtida a partir do cogumelo Pleurotus ostreatoroseus na dose de 0,1mL 10g-1
apresentaram uma redução de 41,96% do tumor, valor este inferior à média obtida no presente
trabalho.
76
Li et al. (2008) verificaram cerca de 80% de inibição do desenvolvimento tumoral em
camundongos ICR com sarcoma 180. A substância de tratamento foi obtida de corpos
frutíferos frescos do fungo Pleurotus citrinopileatuse e administrada na dose diária de 5 mg
kg-1 durante 20 dias, por via intraperitoneal, após inoculação tumoral. Comparando-se,
observa-se que o percentual de inibição verificado pelos autores é maior do que o obtido neste
trabalho.
De Barba (2010) testou extratos etanólicos obtidos a partir do caldo de cultivo da
mesma espécie fúngica utilizada no presente trabalho (P. djamor), para o tratamento pósindução tumoral de camundongos albinos suíços machos inoculados com S180. A redução do
crescimento do S180 nos animais tratados foi de 83% e 94% para as doses de 10 e 30 mg kg-1,
respectivamente, com tratamento intraperitoneal (i.p.) por 10 dias consecutivos. Verifica-se
que as taxas de inibição proporcionadas pelo caldo de cultivo no trabalho de De Barba foram
maiores do que as apresentadas neste trabalho para biomassa micelial.
Assis (2011) avaliou a taxa de inibição tumoral de camundongos albinos swiss machos
inoculados com S180 tratados após indução tumoral com uma substância de tratamento
proveniente de Pleurotus sajor-caju, obtida da mesma forma que a substância utilizada neste
trabalho. Os camundongos foram tratados por 10 dias e as doses utilizadas foram de 3, 10, 30
e 100 mg kg-1. Em todas as doses testadas a autora observou inibição tumoral de
aproximadamente 80% nos grupos tratados em relação ao controle, valor maior do que o
obtido com protocolo de pós-tratamento de Pleurotus djamor neste trabalho.
As três frações polissacarídicas obtidas de Pleurotus ostreatus, FII, FIII-1 e FIII-2,
avaliadas por Facchini (2011) apresentaram um percentual de inibição tumoral contra S180 de
85,6, 54,1 e 93,6%, respectivamente na dose de 30 mg kg-1. Após, o autor realizou a avaliação
da atividade antitumoral da fração FII por meio de ensaios dose x resposta nas doses de 10, 30
77
e 50 mg kg-1. As doses de 10 e 30 mg kg-1 promoveram a maior taxa de inibição, cerca de
75%, sem diferença significativa entre si e a maior dose, 50 mg kg-1, promoveu uma menor
taxa de inibição (53,7%).
Um estudo realizado por Jeong et al. (2010) também revelou atividade antitumoral
contra S180 de uma fração polissacarídica obtida de biomassa micelial de P. eryngii após
extração aquosa a quente. Os animais foram tratados com 10 a 80 mg kg-1 de extrato micelial
durante 28 dias. A maior inibição observada foi de 53,1% para a dose de 40 mg kg-1, enquanto
80 mg kg-1 inibiu apenas 25,7%. Embora no presente trabalho não tenha sido possível
observar influência da dose da substância sobre o desenvolvimento tumoral, pode-se afirmar
que a biomassa deslipidificada de P. djamor, mostrou-se mais eficaz do que a biomassa de P.
eryngii, com maior redução tumoral em menor tempo de tratamento, muito embora, o método
de obtenção da substância seja outro.
Durante os testes dose x resposta realizados neste trabalho observou-se a morte de
alguns animais. Nos testes pré/pós-indução, o grupo controle substância (animais sem tumor e
tratados com biomassa deslipidificada de P. djamor na dose de 50 mg kg-1) apresentou a
perda de 2 animais, verificada a partir do décimo sexto dia de tratamento. No grupo controle
positivo (animais tratados com PBS), foi observada a morte de 1 animal no 20º dia do
experimento. No grupo controle negativo (animais sem tumor e trados com PBS) não houve
mortes. No grupo T1 (animais tratados com a dose de 10 mg kg-1 da substância) observou-se a
morte de 1 animal no décimo dia após indução. No grupo T2 (animais tratados com a dose de
30 mg kg-1 da substância) observou-se a morte de 6 animais, verificadas a partir do quarto dia
após inoculação tumoral (décimo quarto dia de tratamento). No grupo T3 (animais tratados
com a dose de 50 mg kg-1 da substância) observou-se a morte de 4 animais, verificadas a
partir do quarto dia após inoculação tumoral (décimo quarto dia de tratamento). O grupo
78
tratado com a menor dose da substância de tratamento nos testes pré/pós-indução tumoral
(T1) foi o que apresentou a menor perda de animais, o que sugere que as doses administradas
nos outros grupos estão acima do tolerável, conferindo, provavelmente, um efeito tóxico nos
animais.
Nos testes pós-indução tumoral, observou-se a perda de 3 animais, verificadas a partir
do quarto dia de tratamento no grupo controle substância (animais sem tumor e tratados com
biomassa deslipidificada de P. djamor na dose de 50 mg kg-1). O grupo controle positivo
apresentou morte de 1 animal no nono dia do experimento. O grupo controle negativo não
apresentou mortes. No grupo T1 (animais tratados com a dose de 10 mg kg-1 da substância)
observou-se a morte de 1 animal, verificada no sétimo dia de tratamento. No grupo T2
(animais tratados com a dose de 30 mg kg-1 da substância) observou-se a morte de 7 animais,
verificada a partir do terceiro dia de tratamento. No grupo T3 (animais tratados com a dose de
50 mg kg-1 da substância) observou-se a morte de 5 animais, verificadas a partir do segundo
dia de tratamento. O grupo tratado com a menor dose da substância (10 mg kg-1) nos testes
pós-indução tumoral foi o que apresentou a menor perda de animais. Estes resultados vão de
encontro aos obtidos nos testes pré/pós-indução tumoral, em que o grupo T1 também teve o
menor número de mortes.
Devido ao exposto, mostrou-se necessário a realização do teste de sobrevida dos
animais, sendo, para tanto, escolhida a dose de 10 mg kg -1.
4.2 Teste de Sobrevida
79
Durante o teste de sobrevida os animais foram tratados com 10 mg kg-1 da biomassa
deslipidificada de P. djamor e apresentaram uma taxa de sobrevivência de 90% em
comparação ao grupo controle positivo. Os animais do grupo controle positivo começaram a
morrer a partir do 18º dia, chegando a uma taxa de sobrevida de 0% em 30 dias. Já, a taxa de
sobrevivência do grupo controle substância (animais sem tumor e tratados com biomassa
deslipidificada de P. djamor na dose de 10 mg kg-1) foi de 100% em 30 dias.
De Barba (2010) utilizou precipitado de polissacarídeos extracelulares de Pleurotus
djamor obtidos com etanol (PE1) e com acetona (PE2) para avaliação do tempo de sobrevida
de camundongos inoculados subcutâneamente com uma concentração celular de 25x106 cel
mL-1 de tumor S180. A substância PE1, quando administrada por via intraperitoneal,
promoveu uma taxa de sobrevida em 30 dias de 100%, 100% e 80% para as doses de 30, 100
e 300 mg kg-1, respectivamente. A substância PE2, promoveu uma taxa de sobrevida em 30
dias de 100%, 100% e 0% para as doses de 30, 100 e 300 mg kg-1, respectivamente. A dose
testada neste trabalho para avaliação da taxa de sobrevida foi de apenas 10 mg kg-1 e conferiu
uma taxa de 90% de sobrevida dos animais. Nos estudos realizados por De Barba (2010)
doses maiores das substâncias teste (30 e 100 mg kg-1) conferiram maiores taxas de sobrevida
aos animais do que a apresentada neste trabalho. Vale ressaltar que apesar de se tratar do
mesmo fungo, trata-se de fontes diferentes da substância teste (extrato polissacarídico do
caldo de cultivo no trabalho de De Barba e biomassa deslipidificada no presente trabalho).
Wang, Gao e NG (2000), realizaram estudos de avaliação do tempo de sobrevida de
camundongos inoculados intraperitonealmente com células de S180 ou hepatoma H-22 nas
concentrações de 5 x 106 e 2,5 x 105. Os animais foram tratados com uma lectina obtida de
Pleurotus ostreatus e observou-se que os animais inoculados com uma concentração celular
de 5x106 células de Sarcoma 180 tratados com a lectina apresentaram um aumento do tempo
80
de sobrevida de 57,6%. Já os animais inoculados com uma concentração celular de 2,5x105
desse mesmo tumor apresentaram um aumento do tempo de sobrevida na ordem de 106,7%
em relação ao grupo de animais não tratados. Para os grupos inoculados com H-22 observouse um aumento no tempo de sobrevida de 21,9 e 37,9% em grupos de animais inoculados com
uma concentração tumoral de 5 x 106 e 2,5 x 105, respectivamente. Neste trabalho os animais
também foram inoculados com uma concentração celular de 5x106 células por animal do
tumor Sarcoma 180. O presente trabalho corrobora os resultados de Wang, Gao e NG (2000),
que validam a influência na sobrevida positiva de animais portadores de tumores tratados com
substâncias bioativas obtidas de fungos do gênero Pleurotus.
Shamtsyan et al. (2004), avaliaram o efeito do extrato etanólico obtido de P. ostratus
em camundongos inoculados com melanoma B16 e verificaram uma taxa de sobrevida de
100% para o grupo tratado com o extrato 24 dias após transplante tumoral, enquanto o grupo
controle apresentou uma taxa de 50%. A taxa de sobreviventes chegou em 0% no 27º dia para
os animais do grupo controle, enquanto no grupo tratado 70% dos animais ainda estavam
vivos. No 30º dia após a inoculação tumoral, a taxa de sobrevida dos animais tratados era de
60%. A morte de todos os animais só foi atinginda no 44º dia no grupo tratado. Comparando
aos resultados obtidos neste trabalho, a taxa de sobrevida conferida por P. djamor em animais
inoculados com S180 é bem maior do que a observada por Shamtsyan e colaboradores
(2004). Vale notar que não só as espécies fúngicas são diferentes bem como se trata de
linhagens tumorais distintas.
81
4.3 Teste de Citotoxicidade
Neste estudo várias concentrações da substância teste, obtida da biomassa
deslipidificada de P. djamor, foram testadas sobre células de Sarcoma 180 para avaliação do
efeito citotóxico da substância. As concentrações da substância teste foram 0,5, 1,0, 2,0, 4,0,
8,0 e 16,0 mg mL-1. A porcentagem final da viabilidade celular em 24 h de tratamento foi de
113,7; 76,5; 82,7; 94,9; 63,5; 9,88, respectivamente. A Figura 8 apresenta os valores de
viabilidade celular (%) em função das concentrações da substância teste em 24h de
tratamento. Os asteriscos indicam diferença significativa em relação ao controle.
Concentrações da substância teste mg mL-1
Figura 8 – Viabilidade celular (%) de células de Sarcoma 180 tratadas com biomassa deslipidificada de P.
djamor. CC = controle celular de S180. Os valores representam as médias de 11 replicatas ± erro padrão.
82
Fonte: Primária (2012)
Citotoxicidade em cultura de células é normalmente expressa como LC50, a
concentração de um determinado agente que é letal para 50% das células (ZHANG et. al.,
2007). Sendo assim, a viabilidade celular observada nos tratamentos com as concentrações de
0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg mL-1 não foram consideradas citotóxicas, pois em todas essas
concentrações, mais de 50% das células permaneceram viáveis. Não houve diferença
significativa em relação ao controle celular (cc).
A partir da concentração de 8 mg mL-1, observa-se diferença significativa em relação
ao controle celular, indicando um efeito inibitório do crescimento celular de 36,41% para esta
concentração. Porém, 8 mg mL-1não foi considerada uma concentração citotóxica, já que o
percentual de inibição celular não chegou à marca de 50%.
A concentração mais alta (16,0 mg mL-1) mostrou um efeito citotóxico sobre as células
de Sarcoma 180, em que 90,12% das células não apresentavam atividade metabólica.
Apesar de vários autores atribuirem a atividade antitumoral fúngica à ativação do
sistema imune do hospedeiro e não à citotoxicidade direta, estudos demonstraram a inibição
da proliferação celular e o efeito citotóxico sobre diversos tipos de linhagens de células
cancerosas em testes in vitro, conferidos por fungos do gênero Pleurotus.
Venkatakrishnan et al. (2010) examinaram o efeito de extratos de P. ostreatus na
proliferação celular de HL-60, uma linhagem de células de leucemia, utilizando o teste MTT.
O extrato de Pleurotus ostreatus inibiu a proliferação de células de forma dependente da dose,
após 72h de tratamento com 0,1, 0,2, 0,4 e 0,8 mg mL-1 de extrato do cogumelo em 32,42,
47,2, 52,66 e 78,27%, respectivamente. Doses menores do que as utilizadas no presente
83
trabalho apresentaram efeito citotóxico (0,4 e 0,8 mg mL-1). No entanto, tanto a espécie
fúngica quanto a linhagem tumoral e o tempo de tratamento diferem do presente trabalho.
Um estudo realizado por Maness et al. (2011), para determinar a atividade
antiproliferativa de extratos etanólicos e aquosos de P. tuberregium contra HCT-116 (células
de câncer de cólon) e HeLa (células de câncer de colo uterino) em concentrações de 0, 100,
200, 400, 600 e 800 µg mL-1 após 24, 48 e 72h de exposição, utilizou o ensaio MTT. Após 72
horas, o extrato etanólico de P. tuberregium na concentração de 800 µg mL- 1 apresentou
atividades inibidoras de 65 e 47% quando testado em células HCT 116 e HeLa,
respectivamente, enquanto o extrato aquoso na mesma concentração tinha atividades
inibidoras de 45 e 37%. No presente trabalho doses bem mais altas da substância teste
causaram efeito inibidor sobre as células de Sarcoma 180 (8,0 e 16,0 mg mL-1), porém em um
tempo menor de tratamento. Tanto a espécie fúngica quanto a linhagem tumoral utilizados
diferem em comparação a este trabalho.
Bassil et al. (2012) verificaram o efeito citotóxico de extratos etanólicos obtidos de
corpos frutíferos de P. ostreatus sobre células Jurkat (uma linhagem de células humanas de
leucemia linfoblástica aguda), utilizando o ensaio MTT e demonstram que P. ostreatus
induziu um aumento da atividade metabólica das células em 24h e 48h de tratamento em
baixas concentrações do extrato, até 8 mg mL-1. No presente trabalho as doses abaixo de 8 mg
mL-1 também não apresentaram efeito inibitório. O IC50 no trabalho de Bassil et al. (2012) foi
entre 10 e 16 mg mL-1 em 48h de tratamento. Para o tratamento de 24h um plateau foi
observado entre 10 e 20 mg mL-1, não atingindo a marca de 50%, ou seja não foi citotóxico. O
tratamento realizado com P.djamor neste trabalho apresenta citotoxicidade de 90,12% em um
tratamento de 24h para uma dose de 16 mg mL-1 e uma inibição do crescimento celular a
partir da dose de 8 mg mL-1 .
84
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com relação aos testes antitumorais realizados com a biomassa deslipidificada de P.
djamor, tanto as doses testadas nos tratamento pré/pós-indução tumoral quanto as doses
testadas no tratamento pós-indução apresentaram potencial antitumoral. No entanto, entre os
dois tipos de tratamentos avaliados, o que apresentou maiores taxas de inibição tumoral foi o
pré/pós-indução tumoral para todas as doses testadas, indicando um efeito preventivo da
biomassa deslipidificada de P.djamor sobre o desenvolvimento de Sarcoma 180.
Os resultados do estudo da taxa de sobrevida demonstraram que a administração de 10
mg kg-1 da biomassa deslipidificada de P.djamor aumenta a sobrevida dos animais portadores
de Sarcoma 180.
O teste realizado para avaliar a citotoxicidade revelou que apenas na concentração de
16 mg mL-1 a substância apresenta citotoxicidade sobre as células de Sarcoma 180.
85
PERSPECTIVAS
Para trabalhos futuros sugere-se que seja realizada a caracterização das substâncias
presentes na biomassa deslipidificada do fungo Pleurotu djamor; avaliada a atividade
antitumoral em outros modelos tumorais, para comprovar o efeito antitumoral em outros tipos
de células neoplásicas; realizado um estudo imunológico, para elucidação do mecanismo de
ação das substâncias bioativas da biomassa deslipidificada de Pleurotus djamor; estudada a
atividade citotóxica sobre células saudáveis, a fim de verificar se células saudáveis são
preservadas,
após
se
alcançar
a
redução
do
tumor.
86
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100
ANEXO
101
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVILLE, do Projeto de Pesquisa
“Estudo da produção de substâncias bioativas por Pleurotos djamour Univille 001 e avaliação
de atividade antimoral contra sarcoma 180”.