Relatório 2-3

Mestrado em Engenharia Biomédica
Engenharia Genética
Relatório – Amplificação do Gene pgmG por recurso
à técnica de PCR e respectiva Hibridação de Southern
utilizando sondas não radioactivas
Relatório realizado por:
Miguel Amador Rosa nº58484
Joana De Jesus David Nunes nº58497
João Gonçalo Silva Marques nº58513
Tatiana Andreia de Matos Sirgado nº58412
1º Semestre, Ano Lectivo 2008/2009
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1. Resumo
O objectivo do trabalho realizado foi identificar a presença de uma sequência de nucleótidos,
correspondentes ao gene pgmG, proveniente de DNA cromossómico de Sphingomonas elodea
ATCC 31461 digerido por enzimas de restrição, fazendo uso da técnica de hibridação de Southern
com sondas não radioactivas.
Inicialmente, fez-se uso de bases de dados biológicos acessíveis através da Internet para
determinar os primers a serem usados na técnica de PCR de forma a amplificar o gene pgmG. O
produto desta amplificação, depois de marcado de forma não radioactiva, e de visualizado em gel
de electroforese, foi usado como sonda na Hibridação de Southern. A amostra de DNA de
Sphingomonas elodea ATCC 31461 foi digerido por quatro enzimas de restrição (BamHI, EcoRI,
HindIII, PstI) e posteriormente sujeito à Hibridação de Southern. Os resultados finais da hibridação
foram reproduzidos através de uma autorradiografia sendo possível a identificação do gene pgmG.
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2. Introdução
Tendo em conta os objectivos delineados para o trabalho é necessário compreender quer as
características dos elementos que estamos a usar, quer a metodologia e fundamentação das
técnicas que foram usadas durante a actividade experimental.
Antes de entrarmos na análise teórica de cada uma das técnicas é importante referenciar
alguns conceitos que já foram abordados noutros trabalhos e/ou servem para contextualizar
alguns aspectos que, no entanto, não constituem parte fundamental para a análise deste trabalho:
Como já se tinha observado em trabalhos anteriores, o gene pgmG da Sphingomonas
elodea ATCC 31461, codifica uma proteína com actividade de fosfoglucomutase /
fosfomanomutase, importante na produção de um exopolissacárido, o gelano, com interesse a
nível industrial e utilizado como goma gelificante.
As enzimas de restrição são enzimas que cortam o DNA em determinados locais, ao
reconhecerem uma determinada sequência de nucleótidos. Nesta experiência foram usadas a
BamHI, EcoRI, HindIII e a PstI. A BamHI é derivada da espécie Bacillus amyloliquefaciens, a sua
sequência de reconhecimento é (G'GATCC), e deixa uma extremidade coesiva no corte. A EcoRI é
isolada a partir de certas estirpes de E. coli, a sua sequência de reconhecimento é (G'AATTC) e
deixa uma extremidade coesiva no corte. A HindIII é isolada a partir de haemophilus influenzae, a
sua sequência de reconhecimento é (A'AGCTT) na presença do cofactor Mg2+ e deixa igualmente
uma extremidade coesiva no corte. A PstI é isolada a partir de certas estirpes de E. coli, a sua
sequência de reconhecimento é (G'ACGTC) e deixa uma extremidade coesiva no corte.
Feita deste modo a introdução de alguns conceitos a serem usados posteriormente seguese fundamentação teórica das técnicas usadas neste trabalho.
2.1.PCR
A técnica de PCR, ou reacção em cadeia da polimerase, é uma técnica que foi desenvolvida em
meados dos anos 80 e que veio revolucionar a estratégia de análise de genes. A técnica possibilita
a amplificação de porções específicas de fragmentos de DNA em condições laboratoriais.
A reacção de PCR é um método fácil e rápido que necessita essencialmente de uma sequência
de DNA a amplificar, um par de primers, nucleótidos livres (dNTP) e uma enzima que realize a
síntese de DNA, tudo isto numa solução tampão com composição adequada, fazendo-se uso
apenas de uma ampola incubada num termociclador, que fornece as diferentes temperaturas
óptimas para cada etapa. Uma enzima óptima para este processo é a Taq DNA polimerase que é
isolada de uma bactéria (Thermus aquaticus) que habita locais de temperatura elevada, pelo que
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esta é resistente a estas, tornando-a útil para as altas temperaturas utilizadas durante cada ciclo
do PCR para desnaturar o DNA. Deste modo, a enzima não é destruída entre ciclos, podendo todo
o processo ser autómato. Para melhorar a acção da enzima deve-se usar um cofactor Mg2+.
Em relação aos primers, estes são oligonucleótidos iniciadores e são sintetizados de modo a
serem complementares às extremidades 3’ do segmento de DNA a amplificar, flanqueando-o. Os
primers codificante e não-codificante, nomeadamente o PGMinc-Up e o PGMinc-low, são primers
que vão delimitar uma zona do DNA cromossómico da S. Elodea que contém o gene pgmG,
promovendo a amplificação desta porção na técnica de PCR. Para a escolha destes primers são
necessárias informações sobre a sequência de forma a proceder à selecção, usando, por exemplo,
métodos informáticos acessíveis na Internet. Há diversas considerações a ter em conta:
•
•
•
A sequência nucleotídica deve ser determinada com base no fragmento a amplificar e
os terminais 3’ dos primers hibridados devem apontar um para o outro.
Devem ser constituído por 20/30 nucleótidos e não deverá conter repetições de
sequências, nem regiões de intracomplementaridade. Não podem ser, no entanto,
muito menores, porque mais facilmente podem hibridar em locais diferentes do alvo.
Os dois primers devem ter Tms (melting temperatures) semelhantes.
Uma reacção de PCR baseia-se numa sequência de ciclos, constituído cada um por reacções
efectuadas a diferentes temperaturas. Assim, cada ciclo envolve a desnaturação de DNA,
emparelhamento de primers e síntese de DNA.
A desnaturação típica consiste em incubar o DNA a 94ºC-96ºC separando-o em cadeiras
simples, que vão servir de molde à síntese de novo DNA. Segue-se o emparelhamento dos primers
com a diminuição gradual da temperatura até cerca de 50ºC – 65ºC, 1-2ºC abaixo da temperatura
de hibridação de forma a permitir a ligação do primer, mas instabilizar ligações pouco específicas
que se possam estabelecer. Esta temperatura pode variar com as características do primer e do
DNA alvo, nomeadamente do conteúdo CG deste, do qual depende a força de ligação entre as
duas cadeias complementares. Neste passo, não há emparelhamento das cadeias simples do DNA
alvo uma vez que a concentração é baixa. Há, no entanto, emparelhamento dos primers, que se
encontram em grande concentração. Após a ligação dos primers, o ciclo é completado pela Taq
DNA polimerase, realizando-se a síntese da cadeia complementar a uma temperatura de 72ºC74ºC, que elonga os primers usando como molde a cadeia a que cada primer está emparelhado.
Trata-se de uma replicação semiconservativa.
Tudo isto é um processo que dura apenas alguns minutos, sendo possível num curto período
de tempo realizar diversos ciclos. Em n ciclos, teoricamente, são produzidas 2n moléculas de DNA
idênticas ao DNA alvo, apesar de na prática não se obter exactamente esse número, já que não se
trata de um processo ideal, existindo algumas perdas. De referir que, só após o terceiro ciclo de
PCR se consegue obter moléculas grandes o suficiente, com DNA em cadeia duplas, cujas
extremidades são definidas pelas extremidades 5’ dos primers utilizados.
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Figura 1 – Esquema da amplificação de DNA por PCR.
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Todavia, a técnica de PCR levanta alguns problemas. Um é que a Taq polimerase não tem
actividade de exonuclease 3’-5’, o que significa que não é capaz de corrigir erros comuns às DNA
polimerases, levando à introdução de alguns erros que podem ser mais ou menos relevantes
consoante são, respectivamente, em ciclos iniciais ou finais do processo. A PCR revela ainda um
problema que resulta da sua grande sensibilidade. No caso a reacção seja contaminada com DNA
estranho, este pode emparelhar com os primers e ser igualmente amplificado por esta técnica.
Para além disso, caso a sequência a copiar seja demasiado grande (superior a 4kb), esta técnica
não garante uma cópia intacta do segmento. Deve-se ainda ter em conta a dificuldade que é
conhecer as posições correctas de ligação dos primers.
O PCR tem uma diversidade imensa de aplicações permitindo uma série de novas técnicas no
campo da Eng. Genética que são relevantes na manipulação genética, mapeamento de gene,
estudo de doenças ou até estudos forenses.
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Imagem retirada de [2]
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2.2. Electroforese em Gel de Agarose
A separação electroforética é um dos métodos mais utilizados para estimar o tamanho dos
fragmentos de ácidos nucleicos. Esta estimação depende da taxa de migração de cada fragmento
que depende da sua forma e razão carga-massa.
A electroforese, nomeadamente a do DNA, é feita em geral num gel de agarose, preparado
através da dissolução de uma suspensão de agarose numa solução tampão que solidifica numa
forma específica, deixando-se locais para a colocação das amostras (poços). O gel é colocado num
recipiente, denominado tanque de electroforese, contendo uma solução tampão, e que permite a
aplicação de um campo eléctrico nas extremidades do gel. Como sabemos, em pH neutro os
ácidos nucleicos têm uma carga negativa, pelo que vão migrar para o pólo positivo localizado na
extremidade oposto à localização das amostras. O papel do gel de agarose é servir como peneira
permitindo uma migração mais fácil das moléculas mais pequenas, que migram mais do que as
moléculas maiores, num determinado período de tempo. Com o uso da agarose o tamanho tornase o principal factor. Assim, moléculas do mesmo tamanho migram juntamente e formam bandas.
Estas bandas são geralmente observadas através da exposição à luz ultravioleta, fazendo uso de
brometo de etídio, que emite uma fluorescência alaranjada quando exposto a raios UV, e que por
ser uma substância mutagénica se intercala nas cadeias de DNA.
1
Figura 2 – Electroforese de DNA em gel de agarose
Esta técnica é bastante útil já que a taxa de migração se relaciona com o peso molecular,
permitindo fazer uso de uma amostra que contenha diversas porções de DNA com tamanhos
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Imagem retirada de [2]
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diversificados, no entanto conhecidos, e daí traçar uma recta que permite atribuir um certo peso
molecular às bandas formadas a partir das amostras em estudo, consoante a sua deslocação.
Figura 3 – Relação entre o tamanho do DNA e a sua migração em gel.
1
2.3. Hibridação de Southern
A hibridação de Southern é uma técnica que permite a detecção de moléculas de DNA após a
sua separação por electroforese, fazendo uma hibridação com uma sonda (que é marcada
radioactivamente ou não radioactivamente), cuja sequência é complementar à desse DNA. Caso se
estivesse a tratar de uma molécula de RNA, teríamos de usar a hibridação de Northern,
semelhante à de Southern.
Este método faz uso da propriedade de duas cadeias simples de DNA se associarem, formando
cadeias duplas estáveis, através da criação de pontes de hidrogénio entre sequências de
nucleótidos com bases complementares.
Nesta técnica, o DNA é cortado fazendo uso de enzimas de restrição e os fragmentos são
separados pela técnica anterior de electroforese em gel de agarose. É fotografado o gel com
iluminação UV para ficar com o registo da distribuição dos pesos moleculares dos genes nesta
fase.
Depois, o gel é imerso numa solução alcalina para ocorrer a desnaturação do DNA, e desta
forma termos cadeias simples para que, posteriormente, ocorra a hibridação com a sonda. É
neutralizado o pH e o gel é colocado sobre um papel de filtro grosso que se encontra em contacto
com uma solução salina tampão. Por cima é colocado uma membrana de nylon, seguido de
camadas de papel absorvente e um objecto pesado que as comprima. Deste modo, promove-se a
passagem para as folhas de papel da solução salina tampão, através do gel, eluindo o DNA. As
cadeias simples vão-se ligar à membrana de nylon, ocupando ao mesmo posição que tinham no
gel, por um processo de capilaridade. Esta membrana oferece um meio mais propício à hibridação.
Para terminar este passo, fixa-se o DNA na membrana através de calor ou irradiação com UV.
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Imagem retirada de [2]
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Figura 4 – Esquema da experiência de Southern .
O passo seguinte é incubar a membrana com um DNA heterólogo, isto é, sem qualquer relação
com o DNA a sondar, reduzindo a possibilidade de ocorrência de hibridações não específicas entre
este e a sonda. A este passo é vulgar denominar-se de pré-hibridação.
Em paralelo, é preparada uma sonda de DNA de cadeia simples (pode-se usar também cadeias
de RNA) a ser marcada. A marcação pode ser efectuada por métodos químicos ou enzimáticos e
pode ser directa ou indirecta. Na marcação directa, liga-se à molécula de ácido nucleico um grupo
repórter, que gera um sinal detectável. Por exemplo, podem ser incorporados nucleótidos
radioactivos (32P ou 35S), ou, noutros casos, não radioactivos, mas que permitam serem
identificados por métodos de imagiologia próprios. Neste trabalho foi usada a fluoresceína. Este
foi um método indirecto. Nos métodos indirectos liga-se à sonda um grupo modificador ao qual,
durante de detecção dos híbridos se liga um conjunto formado por duas moléculas: um anti-corpo
específico para o grupo modificador, ligado a um grupo-repórter que possibilita a detecção de
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Imagem retirada de [2]
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todo o conjunto. O fragmento marcado a servir como sonda foi obtido anteriormente por
amplificação por PCR, correspondendo à parte do gene pgmG.
Por último, usa-se o sistema comercial Gene Images random prime labelling (Amersham). Este
marca as sondas de DNA, por extensão de iniciadores aleatórios, onde pequenas sequências de
nucleótidos se ligam ao DNA, que se encontra em cadeia simples, de forma aleatória, sendo depois
sintetizados por uma DNA polimerase I. Faz-se uso de um nucleótido, previamente marcado com
fluoresceína (FI-dUTP) na polimerização, sendo, deste modo, incorporada nas cadeiras em
formação originando uma sonda idêntica ao DNA inicial, mas marcada com fluoresceína.
Figura 5 – Esquema da marcação de um fragmento de DNA utilizando iniciadores aleatórios.
1
A membrana e a sonda são então misturadas num processo, chamado hibridação, em que a
sonda vai emparelhar com as moléculas de DNA suficientemente complementares (sequências de
nucleótidos complementares). Estas moléculas, após se lavar os restos de sonda, consistem em
híbridos que podem ser detectados através de autorradiografia. Este processo é efectuado de
acordo com o sistema comercial Gene Images CDP-Star detection kit. Perante as ligações entre a
sonda e os fragmentos de DNA, ou seja, aos híbridos que se formaram, liga-se um anticorpo de
fluoresceína o qual está associado a um grupo repórter, que é a enzima fosfatase alcalina. Esta
enzima catalisa a produção, por decomposição, de um substrato de dioxetano, que permite obter
no final uma chapa radiográfica, que revela a localização dos diferentes fragmentos das amostras
de DNA de S. elodea que hibridaram com a sonda utilizada.
No fim, ao se comparar com a fotografia original do gel é possível identificar as bandas de DNA
complementares da sonda.
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Imagem retirada de [1]
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Esta é uma técnica bastante sensível, sendo por isso aplicada em diversas situações. Permite
detectar um único fragmento de restrição no meio de uma grande quantidade de fragmentos de
outro tipo, que podem resultar do corte do DNA do genoma, pelas das enzimas de restrição.
Assim, pode-se, por exemplo, distinguir dois indivíduos, ou estirpes diferentes, que diferem na sua
constituição genética. Serve igualmente para identificar genes homólogos ou parecidos de
diferentes organismos.
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3. Resultados e Análise
3.1.Determinação dos primers necessários à amplificação, por PCR, do
fragmento de DNA contendo o gene pgmG
Para a determinação dos primers a usar na técnica de PCR recorreu-se a ferramentas
bioinformáticas disponíveis na Internet. A exploração destas ferramentas está descrita num
relatório paralelo.
As características obtidas, relativamente aos oligonucleótidos iniciadores, estão descritas nas
tabelas:
PGMinc-UP
PGMinc-Low
Tabela 1 – Sequência nucleótida dos olignucleótidos a usar.
5’ GCGCTGATCGAGGGCCTGAC 3’
5’ GCGTACTGGGCATCGTCGAA 3’
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Temperatura de Ligação
Tamanho do Produto do PCR
Tabela 2 – Características dos primers relevantes para o PCR.
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2
62ºC
839 Pb
2
Imagem retirada de [1]
Imagem retirada de [1]
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3.2.Separação e visualização em gel de agarose do produto de PCR
Finalizada a amplificação da região do DNA cromossómico codificante para o gene pgmG de S.
elodea ATTCC 31461, realizou-se uma electroforese dos produtos do PCR dos vários grupos Figura . No primeiro poço foi colocado um marcador com bandas com peso molecular conhecido,
cujo exemplo se pode ver na Figura .
Figura 6 – Gel de electroforese dos produtos de PCR obtido
pelos diferentes grupos (no primeiro poço encontra-se o
marcador padrão).
Figura 7 – Esquema das bandas do marcador padrão
utilizado e correspondência com peso molecular.
Como foi observado na introdução, a taxa de migração e os pesos moleculares apresentam
uma relação. Deste modo, de forma a linearizar, colocámos a distância percorrida em função do
logaritmo dos pesos moleculares. As distâncias de migração das bandas de pesos moleculares
foram determinadas com o auxílio de um régua, para medir a distância de cada banda ao topo do
gel, de modo a calcular a regressão linear, relativamente ao marcador padrão, de forma a usar a
mesma relação para as nossas amostrasErro! A origem da referência não foi encontrada.. De
referir que a medição foi feita com a imagem numa determinada ampliação, sendo que poderia
ser realizada noutra, pois apenas é importante a relação entre as distâncias de cada banda.
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Distância
(cm)
2,55
Peso Moleucular
(Pb)
12000
3,60
5000
3.699
5,00
2000
3.301
5,30
1650
3.217
6,05
1000
3.000
6,30
850
2.929
6,60
650
2.813
log(Pb)
4.079
Tabela 3 – Tabela de distâncias de migração para cada banda.
Relacionando os dados acima tabelados (Tabela
(
3)) é possível construir um gráfico (Gráfico
(
1) que ilustra a relação existente entre a distância migrad
migradaa e o logaritmo do peso molecular, bem
como a obtenção de uma recta de calibração (regressão linear).
Log(Peso) em função da distância percorrida
4,5
y = -0,3038x + 4,8274
R² = 0,998
4
Log(Peso(Pb))
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
1
2
3
4
Distância (Cm)
5
6
7
Gráfico 1 – Regressão Linear do logaritmo do peso em ordem à distância.
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A equação resultante da regressão linear dos valores obtidos é:
y = -0,3038x + 4,8274
Observando-se a Figura constata-se que apenas um dos resultados é passível de ser
trabalhado. Isto porque, no PCR feito pretendia-se ampliar apenas uma porção de DNA, pelo que,
deveria ter aparecido em todas as amostras uma única banda. Deste modo iremos usar
exclusivamente o resultado obtido no último poço que, ao possuir apenas uma banda, se coaduna
com a análise que iremos fazer deste trabalho.
Distância da Amostra = x = 6,25cm
Peso Amostra = 10(-0,3038x + 4,8274) = 848 Pb
Distribuição de Resíduos
0,03
0,02
0,01
0
0
1
2
3
4
5
6
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
Gráfico 2 – Gráfico da distribuição de resíduos (diferença entre a distância medida e a distância linear).
As bandas referentes aos produtos do PCR foram recortadas do gel de forma a serem
utilizadas como sondas para a hibridação de Southern.
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3.3. Separação e visualização do DNA cromossómico de S. Elodea
ATCC31461
As amostras de DNA da S. elodea ATCC31461 foram digeridas pelas seguintes enzimas de
restrição:
BamHI
EcoRI
HindIII
PstI.
Figura 6 – Gel de electroforese do DNA digerido por 4 enzimas de restrição (1º poço – marcador padrão, 2º poço – EcoRI,
3º poço – BamHI, 4º poço- PstI, 5ºpoço – HindIII, 6º poço- marcador padrão).
Nos poços 2,3,4 e 5 da Figura 8, observa-se a digestão do DNA cromossómico por cada
uma das enzimas de restrição. Pode observar-se a existência de uma banda contínua de fraca
intensidade. Isto deve-se a uma grande dispersão de fragmentos de DNA de vários pesos
moleculares, o que demonstra a existência de digestão das amostras de DNA por parte das
enzimas.
No caso de não ter ocorrido digestão do DNA, observar-se-ia uma única risca. Deste modo,
seria possível determinar um peso molecular específico. Neste caso concreto, a dispersão das
bandas não permite retirar nenhum dado quantitativo.
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3.4.Detecção dos sinais da Hibridação de Southern
Figura 7 – Autorradiografia da hibridação de Southern das amostras digeridas
pelas diferentes enzimas. Resultados obtidos no curso de Eng. Biológica. (1º poço
– marcador padrão, 2º poço – BamHI, 3º poço – HindIII, 4º poço- PstI, 5ºpoço –
EcoRI, 6º poço- marcador padrão).
Não foi possível obter resultados satisfatórios com a hibridação de Southern obtida pelo
nosso grupo, pelo que a imagem e consequente análise se basearam numa autoradiografia de
outro turno, e cuja identificação da relação poço/enzima de restrição utilizada nos foi facilitada.
Distância
(cm)
5
Peso
(Pb)
12000
log(Pb)
7,8
5000
3,70
10,1
2000
3,30
10,7
1650
3,22
12,2
1000
3,00
12,65
850
2,93
4,08
Tabela 4 – Relação entre a distância percorrida e o peso molecular.
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Log(Peso) em função da distância percorrida
4,5
y = -0,1523x + 4,8551
R² = 0,9984
4
Log(Peso(Pb))
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
2
4
6
8
Distância (Cm)
10
12
14
Gráfico 3 - Regressão Linear do logaritmo do peso em ordem à distância.
A equação resultante da regressão linear dos valores obtidos é:
y = -0,152x + 4,855
Recorrendo à recta de regressão linear acima encontrada, é possível estimar o peso
molecular dos vários fragmentos provenientes das amostras de DNA digerido com as quatro
enzimas de restrição que hibridaram com o DNA da sonda, devidamente marcado.
Enzimas de restrição
Distância (cm)
Log (peso molecular)
Peso Molecular (Pb)
EcoRI
BamHI
PstI
HindIII
6,5
4,4
4,5
8,7
3,8670
4,1862
4,1710
3,5326
7 362
15 353
14 825
3 409
Tabela 5 – Cálculo dos pesos moleculares dos fragmentos presentes na autorradiografia.
autorradiografia
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4. Discussão dos Resultados
Após a realização do trabalho experimental, do qual resultou o presente relatório, é possível
retirar algumas ideias base através da análise dos resultados obtidos, os quais se fundamentam na
teoria apresentada na Introdução.
Inicialmente, verificou-se que o isolamento de genes por PCR é um método relativamente
rápido quando é comparado com a clonagem tradicional. É possível obter-se uma amostra pura de
um gene, já que a região de inicio da molécula de DNA, que é copiada durante o PCR, é o
segmento cujos limites são definidos pela ligação dos primers. Deste modo, não existe qualquer
problema relacionado com a selecção, desde que os primers tenham hibridado nas posições
correctas. Assim, serão sintetizadas inúmeras cópias do gene. Relativamente aos resultados
obtidos, é notório em todas as todas as bandas o processo de arrastamento do DNA durante a
migração. Contudo, os resultados obtidos não foram de todo satisfatórios, uma vez que apenas
um dos poços (5º poço), respeitante ao trabalho de um grupo, apresentou uma única banda, o
que seria de esperar como resultado do PCR, uma vez que se procede a várias cópias de um
mesmo segmento com o mesmo peso molecular, tornando-se a quantidade dos restantes
segmentos, de diferentes pesos, residual. No 5º poço, onde se verifica a presença de uma única
banda, conclui-se que a solução introduzida neste possui cópias do fragmento pretendido, ou seja,
a amplificação ocorreu com alta especificidade.
Antes da análise dos resultados deve-se constatar que o peso molecular do fragmento de DNA
a amplificar garante bons resultados no PCR ao ser de apenas 839 Pb (ver Tabela 2), muito inferior
ao limite 4 kb a partir do qual não estão garantidos bons resultados da técnica. Também os
primers escolhidos possuem características importantes para a eficácia deste método de
amplificação, nomeadamente o número de nucleótidos constituintes (20) e o elevado conteúdo
GC que facilita as ligações específicas.
Analisando os resultados, verifica-se que o valor obtido para o número de pares de bases foi
848 Pb o que é bastante próximo do valor esperado, 839 Pb (erro relativo de 1%). Confirma-se a
amplificação do gene pgmG, pertencente a uma região do DNA cromossómico de S. elodea
seleccionada, já que o valor é muito semelhante ao valor teórico.
No entanto, os possíveis erros no resultado devem-se essencialmente ao processo de
electroforese, já que se trata de um método que pode ter associado diversos erros que
influenciam a correcta medição do peso molecular da amostra. Ou seja, a técnica do PCR pode não
apresentar resultados ideais, isto é, a quantidade obtida ao final de n ciclos não corresponde ao 2n
esperados e algumas cópias apresentarem erros na sequência, resultantes das limitações da
técnica. Todavia, procede-se à ampliação em grande escala de uma mesma sequência, com peso
molecular definido, pelo que no final a amostra apresenta geralmente uma maioria da porção de
DNA amplificada, com um peso já conhecido.
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Experimentalmente, em relação à electroforese, a introdução das várias amostras nos
diversos poços do gel pode não ter sido realizada da forma mais correcta, já que pode ter havido
perdas dessas mesmas amostras. Relativamente à análise de resultados, devido à largura das
riscas, resultante de alguma dispersão, e, por vezes, fraca visibilidade das mesmas, tornou-se difícil
definir o seu centro. O peso molecular do produto do PCR foi calculado tendo por base a taxa de
migração da banda do 5º poço. Erros na construção da recta de calibração, do marcador padrão,
também podem influenciar os resultados finais, já que também é difícil calcular, com exactidão, a
localização de cada uma das bandas. Porém, apesar do desvio em relação ao resultado esperado, é
possível dizer-se que os fragmentos de DNA amplificados correspondem ou contém o gene pgmG.
Em suma, os resultados obtidos foram bons levando à conclusão de que a escolha dos
primers foi acertada, a temperatura e a duração das diversas fases do ciclo de amplificação, foram
adequadas, pois todas estas condições contribuíram para o sucesso desta experiência.
Em relação ao passo prévio à hibridação de Southern, o DNA cromossómico de S. elodea
foi sujeito à acção de quatro enzimas de restrição ( EcoRI, HindIII, BamHI e PstI).
Analisando o gel de DNA cromossómico digerido, verifica-se que cada enzima de restrição
tem vários locais de reconhecimento no genoma em estudo. Por este motivo os resultados surgem
sobre a forma de uma banda contínua, uma vez que contém diversos fragmentos de diferentes
tamanhos moleculares.
No caso dos resultados obtidos, de referir que, observa-se no final uma banda de grande
intensidade resultante do facto do processo de electroforese ter sido interrompida antes do
tempo.
Não é possível construir um mapa de restrição, já que o genoma não se encontra
sequenciado. Contudo, podemos verificar que não houve identificação de sequências no interior
do gene pgmG pois se tivesse havido, teríamos no autorradiografia mais do que um fragmento.
Através do esquema abaixo apresentado é possível verificar que de facto nenhuma das enzimas de
restrição utilizadas reconhece sequências no interior do gene pgmG.
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Figura 8 – Mapa de restrição do fragmento de DNA contendo o gene pgmG de S. elodea.
Como se verifica, nenhuma das enzimas corta regiões no interior do gene pgmG, o que
torna este método (e respectivas enzimas) bastante útil na hibridação de Southern, já que se
garante a existência de fragmentos de DNA que contêm o gene pgmG que se pretende identificar
nesta técnica. Para além disso, o facto de as enzimas apenas cortarem no exterior permite ainda
identificar a localização deste gene.
Outro passo prévio importante é a remoção do DNA que vai servir como sonda, e que foi
previamente amplificado. Este foi feito recortando, do gel de agarose, a porção identificada como
contendo o gene pgmG no PCR.
Em relação à hibridação de Southern, este método utiliza DNA tanto para sonda como
para a molécula alvo. É a partir deste processo que se detecta a presença de sequências de DNA
complementares de uma sonda.
Um passo indispensável para se determinar a ocorrência de hibridação é a marcação da
sonda. Neste método específico, a marcação realiza-se sem se utilizar radioactividade, o que torna
o método menos sensível, mas os resultados não são prejudicados de forma relevante, para além
de que não é prejudicial, nem para quem o executa, nem para o meio ambiente. Assim, este
método torna-se vantajoso.
Relativamente às lavagens restringentes, estas constituem uma parte fulcral no método já
que são responsáveis pela eliminação das ligações não específicas de modo a que, no final, se
obtenham apenas as moléculas cuja hibridação foi específica. Observou-se que este processo
ocorreu de forma satisfatória já que apenas se identifica uma banda por poço, correspondente à
ligação da sonda ao segmento pretendido. No caso concreto deste trabalho experimental, de
referir que foi perdida durante as lavagens alguma sonda, o que, junto aos danos causados no gel
(antes da passagem por capilaridade do DNA digerido deste para a membrana de nylon), e ainda à
queda do peso durante a noite, justifica a ausência de resultados satisfatórios no nosso turno, pelo
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que tivemos de recorrer aos resultados da autorradiografia de um outro turno. Os fragmentos
obtidos apresentam diferentes pesos moleculares. Pode concluir-se que os fragmentos de maior
peso molecular apresentam para além da sequência do gene de interesse um maior número de
nucleótidos, que difere consoante a enzima de restrição considerada. A enzima PstI é a que
apresenta o menor fragmento, já que foi onde a banda migrou mais. Este facto seria de esperar já
que se observa que esta enzima corta pouco antes do gene, o que revela alguma coerência.
O cálculo dos pesos moleculares da 1ª e 2ª banda não se podem garantir que sejam os
mais correctos, já que se tratam de uma extrapolação, isto porque deveria ter-se considerado uma
amostra padrão que estivesse numa gama de pesos moleculares que abrangesse todas as
amostras. Este facto pode estar na origem de erros significativos no cálculo destes últimos pesos
moleculares do trabalho. Esta extrapolação é justificada pela não linearidade absoluta da relação
entre a taxa de migração e o logaritmo do peso molecular. Segundo as informações da literatura, o
comportamento destes pontos é descrito por uma curva do tipo sigmóide, pelo que pode ser feita
uma correcta aproximação a uma recta nos pontos intermédios que a constituem. Daí os valores
de pontos nas extremidades da gama, e principalmente fora, das bandas do marcador padrão
apresentem aproximações pouco precisas na determinação do seu peso molecular por este
método. O estudo desta característica foi feito para a electroforese do PCR. Na distribuição dos
resíduos deste (Gráfico 2) é possível ver um maior afastamento da realidade nos primeiros pontos,
que não se caracteriza por uma forma aleatória por ser progressivo, consoante o apontado na
teoria na Figura 3.
Teve-se em conta que a ordem dos poços difere entre o gel de DNA cromossómico obtido
e a autorradiografia usada para o passo seguinte, pois como já foi referido, a autorradiografia
utilizada não foi obtida dos resultados do nosso turno, mas de um outro turno de Eng. Biológica.
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5. Conclusão
A realização desta actividade experimental proporcionou um contacto mais aprofundado
com algumas técnicas utilizadas correntemente em Engenharia Genética:
PCR;
Electroforese;
Hibridação de Southern.
Relativamente ao PCR, demonstrou ser uma técnica que envolve processos simples e
eficientes, quando realizada em ambientes favoráveis (escolha cuidadosa das sequências
iniciadoras, temperatura à qual se realiza e duração das diversas fases do ciclo de amplificação). A
electroforese veio, posteriormente, comprovar o resultado do PCR. Esta segunda técnica
experimental realizou-se, neste caso concreto, em gel de agarose, e provou ser um método prático
e eficaz já que se verificou a separação de fragmentos de DNA de acordo com os respectivos pesos
moleculares. Por último, em relação à hibridação de Southern, concluiu-se que se trata de uma
técnica que requer uma execução elaborada e mais experiência por parte dos utilizadores.
Contudo, permitiu a constatação da presença do gene pgmG em DNA cromossómico de S. elodea.
Deste modo, trata-se de uma técnica bastante importante na pesquisa genómica, sendo útil em
inúmeras aplicações, em particular na investigação clínica (nomeadamente na Biotecnologia).
Em suma, pode afirmar-se que a actividade decorreu com sucesso e os objectivos propostos
foram alcançados.
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6. Bibliografia
[1] VÁRIOS, Guias de Trabalhos Laboratoriais de Engenharia Genética, Lisboa:
Secção de Folhas - AEIST, 1º semestre 2008/2009;
[2] VIDEIRA, ARNALDO, Engenharia Genética – Princípios e Aplicações, Lidel, 1ª
Edição;
[3] http://www.e-escola.pt, mantida pelo Instituto Superior Técnico, Lisboa,
Portugal, consultada a 20/11/2008;
[4] L. Moreira, Acetatos Aulas Teóricas Engenharia Genética (1º semestre
2008/2009), Lisboa.
[5] T.A.Brown, Gene Cloning and DNA Analysis, Blackwell Publishing, 2001.
[6] Primrose S.B., Twyman R.M., Old R.W. , Principles of Gene Manipulation: An
Introduction to Genetic Eng. , 2002, 6th ed., Backwell Publishers
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