HPN

Hemoglobinúria Paroxística Noturna
Di
Diagnóstico
ó ti e Tratamento
T t
t
» Dra. Nydia Strachman Bacal
» Hematologista e Patologista Clínica
» MBA em Economia e Gestão na Saúde
Dra. Nydia Strachman Bacal
Hematologista e Patologista Clínica
Hemoglobinúria
g
Paroxística Noturna
Diagnóstico por Citometria de Fluxo
•
•
•
•
•
Doença HPN
HAM x Citometria de Fluxo
Antígenos envolvidos
Tamanhos de clones HPN na HPN
Clones HPN em falência medular (Anemia Aplástica)
Clones HPN em Desordens medulares: MDS
(Anemia Refratária), Mielopatias (Mielofibrose/ LMC)
• Experiência do HIAE e Conclusão
A Doença: Hemoglobinúria
P
Paroxística
í i Noturna
N
• Expansão clonal adquirida
adquirida, não maligna de
células-tronco hematopoéticas
• Hemoglobinúria noturna,
noturna icterícia,
icterícia hemosiderinúria
• Mutação somática adquirida do gene PIG-A
• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de
proteínas de superfície
• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:
CD55 e CD59 , ambas proteínas inibidoras do
complemento
p
e,, associadas à patogênese
p g
da
doença clínica.
A Doença: Hemoglobinúria
Paroxística Noturna
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Anemia Hemolítica / Trombose e Pancitopenia
p
Prevalência: < 1/100.000 (rara)
Sobrevida: 10 a 15 anos
Morte: trombose ou citopenias progressivas
raramente transformação leucêmica (<5%)
Muitos pacientes apresentam hemólise intermitente e
alguns evoluem para remissão espontânea
espontânea.
Hemólise intravascular crônica com exacerbações.
Necessidade transfusional e muitas vezes, deficiência de
ferro.
A trombose apresenta predileção pelas veias hepáticas
(S.Budd Chiari).
Pacientes com AA e evidencias laboratoriais de HPN tem
menor probabilidade de trombose.
Quadro laboratorial
• Sangue Periférico
– Anemia,
e a, Reticulocitose
e cu oc ose
– Leucopenia e granulocitopenia
– Deficiência de ferro
• Medula óssea
– hiperplasia eritróide
– aplasia
• Urina
Ui
– Hemoglobinúria
– Hemossiderinúria
Teste de HAM
GV com HPN são susceptíveis à lise com complemento
37°C / HCL / pH
p
Medida colorimétrica da Hb livre
HPN: lise de 5% a 80% dos G.V.
Scottish Charles - 1794 (cirurgião)
Strübing Paul - 1882 (urina escura matutina, hemólise intravascular, trombose.
Defeito no G.V.)
Marchiafava, 1911 / Michelli, 1931 (anemia hemolítica com esplenomegalia
e hemoglobinúria e hemosiderinúria)
Ham TH, Dingle JH. Studies on the destruction of red
blood cells II. Chronic haemolytic anaemia with paroxysmal
nocturnal haemoglobinuria. Certain immunological aspects
off the haemolytic mechanism with special reference
f
to
serum complement.
J Clin Invest 1939;18:657–72.
Teste de HAM
• Não existe Falso (-)
()
• Existe Falso (+)
Diseritropoese congênita tipo II , mas não se
o soro do paciente for utilizado ou se os
globulos vermelhos do paciente já foram
lisados com anticorpo à frio. Portanto o
Teste de Coombs deve ser realizado em
paralelo e se (+) invalida o teste de Ham.
AHAI > HPN
Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol
GPI
NH2
âncora
através da
qual um
peptídeo
se fixa à
superfície
das células
âncora
GPI
C-terminal
C
terminal
proteína
ancorada
etanolamina
glican
fosfato
glucosamina
inositol
membrana celular
1,2 diacilglicerol
1980. Low et cols.
Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol
Normal
camada bilipídica
HPN
A deficiência da âncora GPI resulta na perda de
várias proteínas da superfície da célula.
Mutação de
gene PIG-A
defeito na
acetilglucosa
minil
transferase
Proteínas que se ligam a membrana
celular através da âncora GPI
Enzimas
Acetilcolinesterase
Fosfatase Alcalina Leucocitária
ADP-ribosil transferase
Moléculas de adesão
Antígeno associado a função linfocitária - LFA-3 ou CD58
CD66b
Proteínas de superfície reguladoras de complemento
D
Decay
accelerating
l ti ffactor
t - DAF - ou CD55
Homologous Restriction Factor HRF
Membrance inhibitor of reactive lysis MIRL ou CD59
Proteínas que se ligam a membrana
celular através da âncora GPI
Receptores
Fc γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16)
Fc-γ
Antígeno de diferenciação monocitária (CD14)
Antígenos eritrocitários
Yt antigens (AchE)
Holley Gregory antigen
Antígenos neutrofílicos
NB1/NB2
Outras proteínas de superfície de função desconhecida
CAMPATH-1 antigen (CDw52)
CD24
GP500
CD55 - DAF
Decay Accelerating Factor
Participa
P
ti i d
do controle
t l d
da ativação
ti
ã d
do
Complemento na superfície da célula
Reduz a ação
ç do complexo
p
C4bC2a impedindo
p
a ativação de C3
Sua deficiência isoladamente não justifica o
quadro clínico
CD59- MIRL Membrane
Inhibitor of Reactive Lysis
IInibe
ib a fformação
ã d
de C9 cujo
j complexo
l
resulta
lt
na lise da célula
Inibe a interação com C8 e C9
Sua inibição resulta em hemólise
Sua reintrodução restaura a resistência ao
Complemento
CD14 - Receptor da proteina que
se liga
li à endotoxina
d
i
O LPS (lipopolissacaride da parede
bacteriana) ligada à uma proteina sérica
específica se liga à superfície de
monócitos e macrófagos através deste
receptor.
Este complexo resulta na liberação de
citoquinas TNF
TNF-α
α, IL
IL-4
4 e IL-6
IL 6.
MOLÉCULAS LIGADAS AO GPI NA CÉLULA HEMATOPOÉTICA HUMANA
G.V.
PMN
Monocitos
Plts
Linfocitos
CD 55 (DAF)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
CD 59 (MIRL)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
HSC
Reguladoras
Complemento
(+)
Moléculas de Adesão
CD 48
CD 58 (LFA-3)
(+)
(+)
CD66b e CD66c
(+)
Enzimas
Acetilcolinesterase
(+)
Fosfatase Alc.Leucocitária
(+)
CD 157
(+)
(+)
Receptores
CD 14
(+)
CD 16 ((FcγRIII)
γ
)
((+))
CD 87 (u-PAR)
(+)
((+)) - linf B
(+)
(+) - linf T
((+))
((+))
Outros
CD 52
CD 90
Proteina Prion
(+) - linf T
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
Hoffbrand A. V.;Catovsky D.; Tuddenham E.G.D. Postgraduate Haematology –2005 5a Ed. Blackwell Publishing
Citometria de Fluxo
Eritrócitos
E
it ó it
Granulócitos
Monócitos
Linfócitos
Plaquetas
CD55 DAF
CD59 MIRL
Van der Schoot, 1990
Citometria de Fluxo
Detectores
FL1
FL2
LASER
FSC
SSC
FL3
Injeção da
amostra
Foto
multiplicadores
Impulsos Elétricos
Sistema
Hidrodinâmico
Di it li
Digitalização
ã
Modos de
Apresentação
Citometria de Fluxo de células HPN
com anti CD59 em eritrócitos
Número de
Nú
d
Eventos
Células HPN Tipo II
Tipo I : Normal
Células HPN Tipo III
Intensidade de fluorescência
anti-CD59 Eritrócitos
Controle isotipo
(b) Células de HPN l e HPN III
(c) Discreta população de Células
HPN I, HPN II e HPN III
(d) Discreta população de Células
HPN I e HPN II (transição
indistinta)
((e)) Células HPN III
(f) Células HPN II indistintas das
Células HPN I e HPN III
Hall e Rosse, 1996
CD55 e CD59 em Granulócitos
Amostra Controle
Paciente
Controle isotipo
CD 59
CD 55
CD55 e CD59 em Eritrócitos
Amostra Controle
Paciente
Controle
isotipo
CD 59
CD 55
CD14 em Monócitos
Amostra Controle
Paciente
Atenção !
Controle
C
t l
isotipo
Interessante
• Pode ocorrer diminuição do percentual de eritrócitos
CD55/CD59 negativos devido à hemólise.
• Eritrócitos com CD59 positivos apresentam vida média
maior do que os eritrócitos com CD 59 negativos.
• A severidade
id d d
da anemia
i por h
hemólise
óli e hi
hipoplasia
l i não
ã
está correlacionada com o percentual de CD59 positivos
Fujioka 1994
Diagnóstico
g
p
por Citometria de
Fluxo
G ld S
Gold
Standart
d
Praticidade
Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)
Eritrócitos: interferentes na avaliação do clone
meia-vida diminuída
transfusões
Detecção de pequenos clones
Células HPN na HPN
Expressão
p
variável de antígenos
g
ligados
g
através do GPI em 3 linhagens
g
celulares
CD59
eritrócitos
CD59
granulócitos
CD14
monócitos
Controle
normal
Paciente 1
Paciente 2
Paciente 3
Sharon 1996
Interessante
Pacientes com menos de 20% de células anormais
raramente apresentam hemoglobinúria mas podem
ter hemólise e hemossiderinúria.
Qualquer ponto de corte é arbitrário, mas <5%
5% de
glóbulos vermelhos tipo HPN não se observa anemia
hemolítica.
Clone de células HPN III maior que 60%, apresentam
hemoglobinúria, mas às vezes, isto não ocorre por
razões desconhecidas
Indicação de Pesquisa de células
HPN
Pancitopenias sem causa definida,principalmente
se apresentar reticulocitose
T
Tromboses
b
d repetição
de
ti ã sem causa d
definida
fi id
Hemólise intravascular sem causa definida
Clone de células HPN em síndromes de
falência medular
Anemia Aplastica
HPN
Mielodisplasia
11/29 p
pacientes com Anemia Aplástica
p
((38%)) com p
presença
ç de células HPN.
Schubert J, 1994
Aumento de células HPN em 21 dos 119 pacientes com Anemia Refratária (17,6%)
AR
HPN (+)
AR
HPN (-)
P
p
((%))
Anormalidades cariotípicas
1 / 21 ((4.8))
21 / 64 ((32.8))
.01
Contagem de plaquetas (x 103/μL)
31 (4-121)
91 (9-126)
.01
Resposta terapêutica a ciclosporina (%)
7 / 9 (77.8)
0 / 8 (0)
.002
0 / 21 (0)
4 / 65 (6.2)
.57
Progressão para SMD avançada ou
LMA (%)
Pesquisar
P
i
células
él l HPN em ttodos
d os pacientes
i t com falência
f lê i de
d medula
d l óssea
ó
antes do tratamento, para auxílio na escolha terapêutica.
Wang H, 2002 Blood
Clone de células HPN em
sindromes de falência medular
• Relação entre HPN e AAA
• Paciente menos hemolítico e mais pancitopenico pode
evoluir para AA
• AAA-Doença auto imune orgão específica mediada por
linfócitos T citotóxico ativado (CD8) que inibe HSC
• HPN
HPN-Expansão
Expansão de clone de célula T anormal
• Tratamento de imunosupressão melhora AAA e HPN
• HPN é uma forma de AAA, HPN dano auto imune ao
stem
t
cellll e mutação
t ã somática
áti d
do gene PIG
PIG-A
A
• Mutação do PIG-A pode ser demonstrada em população
normal em 10/1.000.000
Pesquisa de HPN
• Exames realizados desde 19/01/2004;
• Até 29/03/2007: 107 solicitações;
• 5 casos positivos (4,7%).
•
•
•
•
•
•
Técnica
CD 55 – PE / CD59 – FITC (Immunotech)
CD 14 (clone My4) – PE (Coulter)
CD 64 – FITC (Immunotech)
CD13 – PE (B
(B.D.)
D)
Glicoforina A (CD235) – PE (Dako)
Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223-233
223 233
42: 234-238 – Aug 15, 2000
Pratical Haematology – Dacie JV., Lewis SM
Controle de Qualidade
• Proficiência através dos interlaboratoriais
• CAP - desde Abril/2006; média de 51 laboratórios participantes.
CD55/CD59
• UKNEQAS - desde Novembro/2004;
média de 65 laboratórios participantes
CD55/CD59/CD14
CD16 / CD24 / CD66b
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Hemácias
Ausência de expressão antigênica
d CD55 em 46,5%
do
46 5%
Ausência de expressão antigênica
d CD59 em 34,9%
do
34 9% das
d células
él l
identificadas por Glicoforina A
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Neutrófilos
Controle normal: CD55(+) = 99,8%
Ausência de expressão antigênica do
CD55 em 97,7% dos neutrófilos.
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Neutrófilos
Controle normal: CD59 (+) =
100 0%
100,0%
Ausência de expressão antigênica
g
de
CD59 em 82,7% das células
identificadas pelo CD13.
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Monócitos
Controle normal: CD14(+) = 99
99,8%
8%
Ausência de expressão
p
do CD14 em
98,3% das células CD 64 (+)
RTS, 16 anos – 16/05/2006
Hemácias -não
não realizado
realizado, pois recebeu
transfusão. Neutrófilos:
Controle normal: CD55(+) =
99,0%
Ausência de expressão de CD55
em 5,7% dos neutrófilos
RTS, 16 anos – 16/05/2006 - Neutrófilos
Controle normal: CD59(+) = 99,3%
Ausência de expressão do CD59 em
6 1% das células CD13 (+)
6,1%
(+).
RTS, 16 anos – 16/05/2006 – Monócitos
Controle normal: CD14(+) = 99
99,0%
0%
Ausência de expressão do CD14 em
14,3% das células CD64+.
HPN – Acompanhamento e
T
Terapêutica
ê i
• Tratamento de suporte:
p
Ácido fólico, ferro suplementar se necessário
Transfusão
C ti óid – controverso
Corticóide
t
profilaxia com anticoagulante em caso de
trombose
terapia trombolítica (tPA)
• Transplante e terapia imunosupressora - ATG e ciclosporina
• Eculizumab – inibe a ativação do complemento (C5)
reduz hemólise intravascular, diminui hemoglobinuria e
diminui a necessidade de transfusão
Raiola AM, Van Lint MT, Lamparelli T. Haematologica 85 (1): 59-62 -2000.
Hillmen P., Hall C., Marsh JC. New England Journal of Medicine 350: 552-9 2004
Conclusões
O estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica de
citometria de fluxo é o método de escolha para o diagnóstico
de HPN devido à maior sensibilidade.
As proteínas mais estudadas são o CD55 e CD59 em
granulócitos e eritrócitos e CD14 em monócitos.
A CMF permite a detecção de quantidades pequenas de
células com deficiência parcial ou total das proteínas
dependentes de GPI,
Mesmo após
M
ó crises
i
h
hemolíticas
líti
severas, pode-se
d
analisar
li
a
ausência de expressão na população de leucócitos.
• EQUIPE
•
• Ana Claudia M.
M Brito
João Carlos C Guerra
•
Nydia
y
Strachman Bacal
• Alexandra M.Cavalcante
• Ruth Hissae Kanayama
• Sonia Tsukasa Nozawa
• Obrigada !
• [email protected]
• [email protected]
Gene PIG-A
Localizado no
braço curto do
cromossomo X
Xp22
Miyata, 1993 Science