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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA LUCIANA DAMACENA SILVA Influência da exposição ao carbonato de cálcio no metabolismo de compostos orgânicos e inorgânicos em Biomphalaria glabrata, hospedeiro de Schistosoma mansoni Goiânia 2014 TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Luciana Damacena Silva E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ ] Dissertação [X]Sim [X] Tese [ ] Não Vínculo empregatício do autor Universidade Estadual de Goiás/UEG Agência de fomento: Sigla: País: UF: CNPJ: Título: Influência da exposição ao carbonato de cálcio no metabolismo de compostos orgânicos e inorgânicos em Biomphalaria glabrata, hospedeiro de Schistosoma mansoni Palavras-chave: Biomphalaria glabrata, carbonato de cálcio, metabolismo energético Título em outra língua: Influence of exposure to calcium carbonate in the metabolism of organic and inorganic compounds in Biomphalaria glabrata, host Schistosoma mansoni Palavras-chave em outra língua: Biomphalaria glabrata, energetic metabolism, calcium carbonate Área de concentração: Parasitologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 26/03/2014 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública Orientador (a): José Clecildo Barreto Bezerra E-mail: [email protected] Co-orientador (a):* Ana Maria de Castro/ Clélia Christina Corrêa de Mello-Silva E-mail: [email protected]/ [email protected] *Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [X] SIM [ ] NÃO1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________________ Data: ____ / ____ / _____ Assinatura do (a) autor (a) 1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo. LUCIANA DAMACENA SILVA Influência da exposição ao carbonato de cálcio no metabolismo de compostos orgânicos e inorgânicos em Biomphalaria glabrata, hospedeiro de Schistosoma mansoni Tese de Doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública. Área de concentração: Parasitologia. Orientador: Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra Co-orientadoras: Profa. Dra. Ana Maria de Castro e Profa. Dra. Clélia Christina Corrêa de Mello-Silva Goiânia 2014 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) GPT/BC/UFG S586i Silva, Luciana Damacena. Influência da exposição ao carbonato de cálcio no metabolismo de compostos orgânicos e inorgânicos em Biomphalaria glabrata, hospedeiro de Schistosoma mansoni [manuscrito]: / Luciana Damacena Silva. - 2014. 90f. : figs, tabs. Orientador: Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014. Bibliografia. 1 Moluscos – Metabolismo energético 2. Esquistossomose mansonica 3. Biomphalaria glabrata I. Título. CDU : 594:591.1 Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO Aluna: Luciana Damacena Silva Orientador: Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra Co-orientadoras: Profa. Dra. Ana Maria de Castro e Profa. Dra. Clélia Christina Corrêa de Mello-Silva Membros: 1. Profª. Drª. Marina Clare Vinaud – IPTSP/UFG 2. Profª. Drª. Rejane da Silva Sena Barcelos – CBB/PUC 3. Prof. Dr. João Carlos Nabout– UnUCET /UEG 4. Prof. Dr. Wolf Christian Luz – IPTSP/UFG 5. Profª. Drª. Ana Maria de Castro (Suplente) - IPTSP/UFG 6. Profª. Drª. Valdirene Neves Monteiro (Suplente) – UnUCET /UEG 7. Profª. Drª. Vanessa Cristiane Santana Amaral (Suplente) – UnUCET /UEG 8. Prof. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes (Suplente) - IPTSP/UFG Data:/26/03/2014 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho ao meu esposo Rafael Braga do Amaral e a minha filha Amanda Bernardo do Amaral, por onde passa a minha vida.... AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus primeiramente por me conceder saúde, também pelas respostas dos avanços alcançados na realização deste trabalho. A meu pai Henrique Barbosa dos Santos, maior referência de vida, e a minha mãe Ana Mareilde Damacena Silva por ter me dado a vida. Ao meu orientador Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra pela confiança, motivação e parceria. As minhas co-orientadoras Profa. Dra. Ana Maria de Castro e profa. Dra. Clélia Christina Mello-Silva pela colaboração e incentivo na realização deste trabalho. Aos professores do IPTSP que tanto contribuíram para o meu crescimento científico: Drª Marina Clare Vinaud, Dra. Adelair Helena dos Santos, Dr. Wolf Christian Luz. Aos meus colegas professores da UEG pela colaboração, incentivo e amizade: Dr. João Carlos Nabout, Dra Hélida Ferreira da Cunha, Dra Samantha Salomão Caramori, Dra Solange Xavier, Dra Anamaria Ferreira, Dra Valdirene Neves Monteiro, Dra Cleide Sandra Tavares Araújo e Dr. Olacir Alves. A minha grande amiga e irmã Vanessa Cristiane Santana Amaral, agradeço de maneira especial, pela amizade, carinho, motivação, parceria e colaboração de sempre... Aos colegas que fazem parte da equipe do Laboratório de Estudos da Relação ParasitoHospedeiro (LAERPH): Carolina Aguiar de Araújo Machado, Carolina Miguel Fraga, Hânstter Hállisson, Juliana Boaventura Avelar, Aline Barbaresco, Lilian Cristina Morais de Andrade, Dayane Pereira Amaral, Glennyha Fernandes Duarte. A minha prima Daniela Braz dos Santos pela colaboração na realização dos experimentos. A minha amiga e “anjo da guarda” Solange Martins Oliveira Magalhães por fazer parte da minha história. Aos meus alunos e amigos Franscisco Junior Simões Calaça, Samanta Oliveira da Silva, Izabel Cristina Moreira e Camila Sabino Teixeira. Aos meus amigos de quem tanto orgulho Pedro, Rogério, Karine e Letícia. A todos servidores do Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública. RESUMO Moluscos do gênero Biomphalaria são conhecidos pelo seu papel como hospedeiro intermediário do parasito Schistosoma mansoni, causador da doença esquistossomose mansônica. O aumento da população desses moluscos, consequentemente sua distribuição geográfica está condicionada a presença de cálcio no ambiente, também considerado um elemento essencial no metabolismo energético do molusco. Este estudo teve por objetivo avaliar a influência da exposição às diferentes concentrações de CaCO3 (20, 40, 60, 80 e 100 mg/L), em diferentes intervalos de tempo (1, 14, 21 e 30 dias) sobre às concentrações de glicose, cálcio, proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina na hemolinfa de B. glabrata, ambas as substâncias foram dosadas através de kits específicos e lidas em espectrofotômetro em 545 nm. Através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), foi quantificado a presença de ácidos orgânicos: piruvato, oxaloacetato, citrato, succinato, fumarato, propionato, acetoacetato e β-hidroxibutirato na hemolinfa dos moluscos expostos ao CaCO3. Os resultados demonstraram que a concentração de cálcio na hemolinfa não apresentou diferença significativa (p>0,05) em relação ao controle, bem como, entre as concentrações testadas. A concentração de glicose diminuiu (p<0,05) nas exposições a 20mg e 40mg e aumentou nas exposições a 80mg e 100mg de CaCO3 em relação ao controle. Os ácidos orgânicos piruvato, oxaloacetato, citrato, succinato, fumarato e lactato tiveram suas concentrações aumentadas e propionato diminuída comparada ao controle na exposição ao CaCO3. A concentração de acetoacetato diminuiu e a de β-hidroxibutirato aumentou na exposição às concentrações testadas. Houve diminuição na concentração de proteínas totais e de ureia. A concentração de ácido úrico aumentou na exposição a 20mg de CaCO3 e, a concentração de creatinina aumentou nas exposições à 40mg e 100mg de CaCO3. Concluiu-se que moluscos expostos às diferentes concentrações de CaCO3, principalmente a partir de 14 dias, alteram o metabolismo como acontece em situações de estresse fisiológico, com a finalidade de regular o sistema redox do molusco. Palavras chave: Biomphalaria glabrata, carbonato de cálcio, metabolismo energético. ABSTRACT Biomphalaria snails act as intermediate hosts that harbor the Schistosoma mansoni parasite, the causative agent of schistosomiasis. As population increases, snails have their geographical distribution conditioned to the presence of calcium in the environment, which is essential for their energetic metabolism. The objective of this study was the assessment on the influence of exposure to different concentrations of CaCO3 (20, 40, 60, 80 and 100 mg/L) at different intervals (1, 14, 21 and 30 days) for the concentrations of glucose, calcium, total proteins, urea, uric acid and creatinine in hemolymph B. glabrata. All substances were dosed using specific kits with a spectrophotometer reading at 545 nm. High performance liquid chromatography (HPLC) was the technique applied to quantify the presence of organic acids: pyruvate, oxaloacetate, citrate, succinate, fumarate, propionate, acetoacetate and β- hydroxybutyrate in the hemolymph of mollusks exposed to CaCO3. Results revealed that the calcium concentration in the hemolymph did not present significant difference (p>0.05) with regard to control as well as to the concentrations assessed. The glucose concentration decreased (p<0.05) in exposures to 20mg and 40mg and increased in exposures to 80mg and 100mg of CaCO3 with regard to control. The organic acids pyruvate, oxaloacetate, citrate, succinate fumarate and lactate had their concentrations increased; propionate in turn had its concentration decreased set against control in exposure to CaCO3. In the exposures to the concentrations assessed, acetoacetate decreased and β-hidroxibutirato increased. Total proteins and urea presented decrease. The uric acid concentration increased in the exposure to 20mg of CaCO3; the creatinine concentration increased in the exposures to 40mg and 100mg of CaCO3. It was possible to conclude that snails exposed to different concentrations of CaCO3 had their major metabolic alterations occurring from the 14th day of exposure. Key words: Biomphalaria glabrata, energetic metabolism, calcium carbonate TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Figura 1 – Concha de Biomphalaria glabrata........................................................... 14 Figura 2 – Mecanismo de transporte de Ca2+ e HCO-3 em célula epitelial de moluscos aquáticos...................................................................................................... 16 Figura 3 – Absorção de Ca2+ exógeno, transporte através da hemolinfa para células que atuam como reservatório de cálcio........................................................................ 17 Figura 4 – Metabolismo dos corpos cetônicos entre células da glândula digestiva, hemolinfa e células de outros tecidos em Biomphalaria glabrata........................................................................................................................ 22 Figura 5 - Produção e excreção de fumarato, creatinina e uréia em mamíferos..................................................................................................................... 24 Figura 6 - Representação esquemática do delineamento experimental. Biomphalaria glabrata expostos a concentrações de CaCO3 por 1, 14, 21 e 30 dias............................................................................................................................... 30 MANUSCRITO 1...................................................................................................... 34 Figura 1 – Esquema representando os substratos utilizados em vias metabólicas na obtenção de energia por Biomphalaria glabrata exposto ao CaCO3 ao longo de 30 dias, em relação ao controle................................................................................... 43 Tabela 1 – Concentração de cálcio e glicose (mg/dL) na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a diferentes concentrações de CaCO3 por 1, 14, 21 e 30 dias................................................................................................................. 39 Tabela 2 – Concnetração de ácidos orgânicos (nMol/mL) na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a diferentes concentrações de CaCO3 por 1, 14, 21 e 30 dias................................................................................................................. 40 Tabela 3 - Valores médios de pH na hemolinfa de Biomphalaria glabrata e água de condicionamento de molusco, no grupo controle e nos grupos expostos ao CaCO3 nos diferentes intervalos de tempo................................................................. MANUSCRITO 2...................................................................................................... 44 51 Tabela 1 – Concentração de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina (mg/dL) na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a diferentes concentrações de CaCO3 por 1, 14, 21 e 30 dias........................................................ 56 SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ATP Adenosina trifosfato Acetil-CoA Acetil coenzima A Acetoacetil-CoA Acetoacetil Coenzima A ADP Adenosina difosfato Ca2+- ATPase Bomba de cálcio – ATPase CaCO3 Carbonato de cálcio cAMP Adenosina monofosfato cíclico CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CO2 Dióxido de carbono GOD Glicose oxidase H+ Ion hidrogênio HCO3- Ion bicarbonato H2CO3 Ácido carbônico H2 O Água HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril-C Na+/K+ Bomba de sódio e potássio NAD Nicotinamida dinucleotídeo NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotído oxidada NADH Nicotinamida adenina dinucleotído reduzida PCr Fosfato da fosfatocreatina O2 Oxigênio SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 11 1.1. Biomphalaria glabrata: Taxonomia, morfologia e fisiologia............................. 11 1.2. Importância do cálcio para moluscos Biomphalaria sp....................................... 14 1.3. Sistema de transporte e armazenamento de cálcio intramolusco......................... 15 1.4. Influência do pH no equilíbrio iônico.................................................................. 18 1.5. Metabolismo de Biomphalaria............................................................................ 19 1.5.1. Glicólise............................................................................................................ 19 1.5.2. Ciclo do ácido tricaboxílico.............................................................................. 19 1.5.3. Corpos cetônicos............................................................................................... 21 1.5.4. Produtos nitrogenados...................................................................................... 21 1.5.5. Estudos da influência do cálcio no metabolismo de moluscos sob diferentes condições fisiológicas................................................................................................. 25 2. JUSTIFICATIVA................................................................................................. 26 3. OBJETIVOS......................................................................................................... 28 3.1. Objetivo Geral..................................................................................................... 28 3.2. Objetivos específicos........................................................................................... 28 4. MÉTODOS............................................................................................................ 29 4.1. Manutenção de Biomphalaria glabrata............................................................... 29 4.2. Composição dos grupos de estudo....................................................................... 29 4.3. Extração de hemolinfa......................................................................................... 30 4.3.1. Medida do pH da hemolinfa e água de condicionamento de moluscos....................................................................................................................... 30 4.3.2. Dosagem da concentração de cálcio.................................................................. 31 4.3.3. Dosagem da concentração de glicose................................................................. 31 4.3.4. Dosagem da concentração de proteínas totais.................................................... 31 4.3.5. Dosagem da concentração de uréia.................................................................... 31 4.3.6. Dosagem da concentração de ácido úrico.......................................................... 32 4.3.7. Dosagem da concentração de creatinina............................................................ 32 4.3.8. Estudo do perfil dos ácidos orgânicos................................................................ 32 4.4. Análise Estatística................................................................................................. 33 5. MANUSCRITOS.................................................................................................... 34 5.1. Manuscrito 1- Influência do cálcio no metabolismo energético do molusco Biomphalaria glabrata................................................................................................. 34 5.1.1. Introdução.......................................................................................................... 35 5.1.2. Materiais e métodos........................................................................................... 36 5.1.3. Resultados.......................................................................................................... 38 5.1.4. Discussão........................................................................................................... 44 5.1.5. Referências......................................................................................................... 46 5.2. Manuscrito 2- Produtos metabólicos nitrogenados na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a diferentes concentrações de carbonato de cálcio no meio......................................................................................................................... 52 5.2.1. Introdução.......................................................................................................... 53 5.2.2. Materiais e métodos........................................................................................... 54 5.2.3. Resultados.......................................................................................................... 55 5.2.4. Discussão........................................................................................................... 58 5.2.5. Referências......................................................................................................... 59 6. CONCLUSÕES...................................................................................................... 63 7. REFERÊNCIAS..................................................................................................... 64 8. ANEXOS................................................................................................................. 75 8.1. Cromatogramas.................................................................................................... 75 8.2. Parecer do comitê de ética.................................................................................... 88 8.3. Comprovante de submissão do manuscrito........................................................... 89 11 1. INTRODUÇÃO 1.1. Biomphalaria glabrata: taxonomia, morfologia e fisiologia Os moluscos planorbídeos apresentam importância ecológica por ocuparem o segundo nível trófico alimentar. Servem como fonte de alimento para sanguessugas, crustáceos, insetos, peixes, anfíbios, aves e roedores, todavia podem viver como saprófitas, adaptando-se as variações das condições do meio (PARAENSE, 1970; BARBOSA; SIMÕES- BARBOSA, 1994). Esses moluscos possuem muita plasticidade quanto ao habitat, ocorrendo tanto em ambientes lóticos quanto lênticos (PIERI, 2007), preferem ambientes com águas mais calmas que favorecem seus hábitos bentônicos (MADSEN, 1985). Estão presentes especialmente em águas rasas e lênticas, como lagos, lagoas, poços, cisternas, brejos, riachos, valas de irrigação e de drenagem, onde o substrato pode ser lamacento ou pedregoso e com vegetação flutuante ou enraizada (BECKER, 1980). A presença e o aumento da população de Biomphalaria sp no ambiente aquático depende não só de suas características físicas e químicas, mas também do clima e da fauna existente. A composição do solo, a hidrografia, o clima e a geografia física de uma dada região têm efeitos significativos na dinâmica de populações destes moluscos (BARBOSA et al. 1994). Pertencem ao filo Mollusca, classe Gastropoda, ordem Pulmonata, subordem Basommathophora, família Planorbidae. O gênero Biomphalaria (bis = dois; omphalos = umbigo), significa uma depressão, umbigo, em cada lado da concha (SOUZA; LIMA, 1997), possui 34 espécies identificadas, 22 ocorrem nas Américas e 12 espécies são encontradas na África (PARAENSE 1975; De JONG et al. 2003). Limita-se a regiões tropicais e subtropicais, tendo o comércio de plantas aquáticas como a principal via de introdução e dispersão dos representantes desse gênero no ambiente (MADSEN; FRANDSEN, 1989). Dentre as espécies descritas, a maioria é encontrada na América do Sul, estudos filogeográficos e filogenéticos com moluscos do gênero Biomphalaria tem comprovada sua origem sul-americana (CAMPBELL et al. 2000; De JONG et al. 2001). No Brasil existem dez espécies e uma subespécie do gênero Biomphalaria, no entanto, apenas as espécies B. glabrata (SAY, 1818), B. tenagophila (ORBIGNY, 1835) e B. straminea (DUNKER 1848) têm sido encontradas naturalmente infectadas por S. mansoni (GUIMARÃES et al. 2009). A espécie B. glabrata é a principal hospedeira por ampla distribuição geográfica, adaptação a diferentes condições ambientais, assim como, tolerância 12 às grandes variações nas características físicas, químicas e biológicas do ambiente onde vive, altos índices de infecção e eficácia na transmissão da esquistossomose (CARVALHO et al. 1988; MELLO-SILVA, 2005). Estudos com esta espécie revelaram que o predatismo, indisponibilidade de alimento (jejum), estivação, uso de moluscicidas e o processo de infecção com S. mansoni, dentre outros, intereferem diretamente no seu ciclo de vida (MELLO-SILVA 2005). Moluscos do gênero Biomphalaria são hermafroditas, no entanto, a reprodução por fecundação cruzada é preferencial (PARAENSE, 1955). O sistema genital é composto por órgãos genitais masculinos e feminnos, tendo como órgãos hermafroditas, o ovoteste, glândula produtora de óvulos e espermatozóides e ovispermiduto (canal para passagem dos gametas). Os ovos de cor amarela são envolvidos por uma substância gelatinóide muito transparente, o conjunto adquire um aspecto de cápsula amarelada que se denomina massa ovígera. O número de ovos em cada massa ovígera varia de um a mais de 100. A eclosão dos ovos normalmente se inicia sete dias após a postura. Com cerca de 30 dias os moluscos podem alcançar a maturidade e começam a ovipor, podendo um só indivíduo produzir em poucos meses milhares de descendentes (SOUZA; LIMA, 1997). A respiração é feita através do saco pulmonar, pseudobrânquias e tegumento. O coração constituído por um átrio e um ventrículo, está contido no pericárdio, e o principal órgão de excreção é o rim, sendo que a urina é eliminada pelo meato do ureter. O sistema nervoso central é formado por pares de gânglios bucais, cerebrais, pleurais, pedais, parietais e um gânglio visceral, que formam um anel em torno do esôfago, atrás do saco bucal. O sistema digestório é completo, compreendendo a massa bucal, glândulas salivares, esôfago, estômago, glândula digestiva, intestino e ânus (PARAENSE, 1975). A glândula digestiva contém vários túbulos terminados em fundo cego, revestidos por epitélio colunar, cujas células são altas e apresentam microvilosidades na região apical. O lúmem dos ácinos da glândula se comunica com o lúmem do estômago através de ductos. Este órgão apresenta várias funções, incluindo a digestão intra e extracelular, além de atuar como reservatório de lipídios, glicogênio e minerais. Atua como principal fonte na produção de enzimas digestivas, absorção e armazenamento de nutrientes e excreção. Na glândula digestiva ocorre armazenamento e excreção de reservas inorgânicas, como por exemplo, do íon cálcio (CACECI et al. 1988; BARKER, 2002; ZARAI et al. 2011; FARO et al. 2013). Células da glândula digestiva Biomphalaria spp sofrem danos mecânicos e líticos na presença de esporocistos e cercárias de S. mansoni, que ocupam os espaços intertubulares da glândula, resultando em alterações 13 fisiológicas e metabólicas demonstradas a partir de análises bioquímica e histológica (FARO et al. 2013). A concha dos moluscos é caracterizada por estrutura externa rígida, com o papel de suportar e proteger os tecidos que compõem a parte mole, de predadores e suportar a pressão hídrica do meio em que habitam (Figura 1). Sua formação ocorre a partir da deposição contínua do nácar, na superfície interna da concha que inicia logo nos primeiros estágios de desenvolvimento do molusco e seu crescimento é mais ou menos continuo durante toda a vida (EBANKS et al. 2010). O desenvolvimento ocorre a partir de um núcleo embrionário denominado protoconha situado no extremo da conha conhecido como bico. A medida que a concha cresce novas camadas de calcário surgem apostas em redor de seu bordo numa disposição subparalela a este que vai, então, tornar-se interno e assinalado, superficialmente, pela linha de crescimento. Esta, portanto, marca a posição de um antigo bordo da concha que se tornou interno pela aposição de nova camada de calcário no processo de crescimento (MOREIRA, 2004). O nácar camada interna da concha é constituído por substância dura e brilhante composta de camadas de conchiolina, uma escleroproteína complexa formada de queratina, colágeno e elastina secretada pelo molusco e intercalada por camadas de calcita e aragonita (cristais de carbonato de cálcio), proporcionando alta dureza e rigidez à concha. A concha apresenta diferentes camadas de carbonato de cálcio, normalmente duas, e uma camada orgânica externa, o perióstraco, que protege as camadas calcárias da dissolução pela água (MARIN; LUQUET, 2004). A matriz inorgânica constituída por carbonato de cálcio contribui entre 95 a 99% do peso total da concha. Os 1-5% restantes são representados pela matriz orgânica, composta por polissacarídeos, proteínas, glicoproteínas e proteoglicanas (MARXEN et al. 2003). Além do cálcio, vários outros elementos inorgânicos podem ser incorporados à estrutura das conchas, cujas percentagens variam e podem estar relacionados à temperatura, pH, salinidade e concentração destes componentes na água do meio em que habitam (MARXEN; BECKER, 2000). Estudos consistentes sobre a formação orgânica e biomineralização da concha de B. glabrata foram realizados por Marxen e Becker (2000), revelando aspectos de camadas e o papel do cálcio nestes processos. 14 Figura 1 – Concha de Biomphalaria glabrata 12 mm 1.2. Importância do cálcio para moluscos Biomphalaria sp. O cálcio tem sido descrito como um fator limitante na distribuição e adaptação dos moluscos no ambiente, sua participação na contração muscular, desenvolvimento embrionário, crescimento, resistência ao ataque de predadores e nas respostas imunológicas é essencial, além de ser importante na formação da concha, onde fica armazenado na forma de carbonato de cálcio (DAWIES; ERASMUS, 1984; TUNHOLI et al. 2011). Em processos metabólicos atua como solução tampão na hemolinfa de moluscos. Por exemplo, ocorre mobilização de carbonato de cálcio, excretados ou metabolizados na concha para hemolinfa em resposta à liberação de ácidos orgânicos, podendo ser tóxicos para o molusco. (BECKER, 1980; LIEBSCH; BECKER, 1990; MELLO-SILVA et al. 2006). Em ambientes minimamente tamponados, com baixa resistência iônica, embriões de moluscos pulmonados apresentaram desenvolvimento completo direto, emergindo de suas conchas aproximadamente 10 dias pós-oviposição. O cálcio para suprir as demandas metabólicas dos embriões em desenvolvimento é proveniente do líquido perivitelino e da matriz gelatinosa (túnica interna) da massa ovígera, porém, em menos de uma semana essas fontes se esgotam e passam a utilizar o cálcio do ambiente externo (EBANKS et al. 2010). Esses moluscos contam com 80% do cálcio dissolvido na água, sendo o restante proveniente da dieta. Em ambientes onde as concentrações de cálcio são menores que 20 mg/L os moluscos tem respiração cutânea aumentada e diminuição na motilidade (DALESMAN et al. 2011), limitações no espessamento de suas conchas, as quais lhes fornecem proteção, 15 inclusive contra predadores, contribuindo para diminuição das populações ou mesmo desaparecimento do grupo (BRIERS, 2003; RUNDLE et al. 2004). Onde o cálcio é limitado a menos de 50 mg/L, as células do molusco contam com gasto de energia, para a captação de cálcio do ambiente, necessário à homeostase interna de cálcio, e estes custos são reduzidos substancialmente em nível de 80 mg/L (GREENAWAY, 1971). Estudos do papel do cálcio na distribuição de moluscos gastropodes no ambiente é crescente, bem como sua importância no metabolismo do molusco (JOKINEN, 1983; DAWIES; ERASMUS, 1984; EBANKS et al. 2010; MAGALHÃES et al. 2011; TUNHOLI et al. 2011; AUGUSTO et al. 2012). 1.3. Sistema de transporte e armazenamento de cálcio intramolusco Após absorção gastrointestinal, o cálcio em alta concentração na hemolinfa é distribuído para outros órgãos, além de funcionar como sistema tampão em processos metabólicos (ZELK et al. 1995; SANTOS et al. 2005). O equilíbrio ácido-base é um dos fatores fundamentais na manutenção da homeostase intramolusco, o que é dependente do transporte de oxigênio de maneira satisfatória, bem como, da concentração ótima de cálcio (GREENAWAY, 1971). Tem sido descritos mecanismos de transporte de íons tanto na hemolinfa como em nível celular, como os canais de cálcio voltagem-dependentes que são considerados as principais vias de entrada de cálcio para o líquido intracelular de muitos tecidos excitáveis. A identificação de diferentes tipos de canais de cálcio bem como o estudo destes em mediar respostas celulares tem sido realizado. Canais proteicos de cálcio isolados de moluscos revelaram que estes tipos de canais são altamente seletivos, entre os diversos tipos de canais, seja por impedir o fluxo de cálcio pelo canal seja pela ativação do canal (DOERING; ZAMPONI, 2003). No epitélio intestinal e cutâneo dos moluscos o cálcio é absorvido passivamente. Entretanto, se os níveis de cálcio estiverem abaixo do ótimo, esse mecanismo ocorre ativamente, ou seja, requer sistema de transporte com gasto de energia (Figura 2). Assim, é criado um gradiente eletroquímico de cálcio pela atividade basolateral das bombas de cálcio (Ca2+- ATPase) e sódio e potássio (Na+/K+), facilitado e mantido ainda pela atividade apical da bomba de H+ com efluxo desse íon, favorecendo a absorção de Ca2+ (PERRY et al. 2003). Células denominadas hemócitos apresentam importantes funções no metabolismo iônico do molusco, sendo consideradas por alguns autores, pertencentes a um sistema específico, que atua na remoção de íons metálicos da hemolinfa, mantendo suas 16 concentrações abaixo dos níveis tóxicos (NAIRAN 1973; LIE et al. 1976; MATRICONGONDRAN, 1990). Estas células são produzidas principalmente, por uma estrutura chamada de APO (amebocytes produce organ) que é considerada como órgão principal para hematopoiese, localizada na região entre o pericárdio e o epitélio posterior da cavidade do manto. Após sua formação, os hemócitos podem ser encontrados tanto na hemolinfa quanto nos espaços intersticiais de onde se locomovem por movimentos amebóides. Em molusco infectados os hemócitos mobilizam-se em direção às regiões onde aparecem formas parasitárias, acumulando-se ao seu redor e formando granulomas (LIE et al. 1976). Em muitas espécies de moluscos os hemócitos apresentam habilidade de reconhecer e fagocitar materiais estranhos que são incorporados a lisossomos no citoplasma, e por isto este mecanismo tornouse a base da classificação destas células (RUDDELL, 1971). Água Hemolinfa Célula Figura 2 – Mecanismo de transporte de Ca2+ e HCO-3 em célula epitelial de moluscos aquáticos. Na região basolateral da célula (lado esquerdo), influxo de Ca2+ através dos canais voltagens dependentes (VDCC), antiporte 2H+ e 1Ca2+, excreção de H+ pela bomba de hidrogênio, difusão de HCO-3 para o meio intracelular. Supõem que bomba de Ca2+ basolateral é responsável pelo transporte de cálcio e HCO-3 através da membrana basolateral para hemolinfa. Adaptado de EBANKS et al. (2010). 17 Moluscos B. glabrata apresentam em seus tecidos, células de cálcio classificadas em A, B e C pela natureza de suas inclusões calcárias e distribuição intra-molusco. As células tipo A se encontram distribuídas ao longo do tecido conjuntivo, ocorrendo em tecidos do manto e massa visceral, principalmente na glândula digestiva; menor quantidade pode ser encontrada nos tecidos da massa cefalopediosa; as células tipo B são encontradas em grande quantidade abaixo do epitélio do pé e quantidade menor dentro do colar do manto e cabeça, abaixo do epitélio; as células tipo C podem ser encontradas na cabeça, tentáculos e regiões dorso-lateral do pé, tecido da massa visceral e na concha (DAVIES; ERASMUS, 1984). O conteúdo dessas células é constituído por substância amorfa de carbonato de cálcio e magnésio, em pequenas quantidades, que ficam armazenados dentro de vesículas na forma de grânulos e, aparentemente envolvidas por matriz orgânica que subsequentemente se fusiona a parte mineralizada. Acredita-se que a enzima anidrase carbônica pode estar envolvida na formação destes grânulos por ser encontrada próxima a estes (SIMKISS et al. 1982). Esses depósitos de cálcio são altamente solúveis in vitro, e podem passar para fora das vesículas através de poros presentes em suas membranas. Estresses fisiológicos podem causar mobilização das reservas de cálcio in vivo e tem sido observado por diversos autores (DAVIES; ERASMUS, 1984; MISHKIN; JOKINEN, 1986; BECKER, 1980; PINHEIRO et al. 2001; TUNHOLI et al. 2011; MAGALHÃES et al. 2011). A mobilização do conteúdo de cálcio ocorre por processo de dissolução, o qual mantém a saturação dos íons cálcio e bicarbonato nos fluidos corpóreos (Figura 3), mantendo o equilíbrio do fluxo de cálcio no meio interno do molusco e ambiente externo (SIMKISS et al. 1982). 18 Figura 3 – Absorção do cálcio exógeno, transporte através da hemolinfa para células que atua como reservatórios de cálcio intramolusco. Após o cálcio ter sido absorvido pode ocorrer mobilização resultando em armazenamento de cálcio em vesículas presentes em células do tecido conjuntivo de moluscos gastrópodes (células de cálcio) e também na concha. O cálcio pode ser seqüestrado das vesículas e mobilizado da concha para hemolinfa em situações de estresse fisiológico. Adaptado de SIMKISS et al. (1982). 1.4. Influência do pH no equilíbrio iônico A acidificação natural e antrópica de ambientes aquáticos resultam em danos para comunidades que vivem neste ambiente. Invertebrados aquáticos como insetos, crustáceos e moluscos tornam-se escassos ou extintos em ambientes com pH abaixo de 5,7 (LEWIS et al. 2007). Investigações das respostas fisiológicas de moluscos aquáticos expostos a ambientes ácidos (abaixo de 5,7) apontam para mortalidade por desequilíbrio eletrolítico ou dissolução da concha. Para sobreviverem em ambientes com acidificação aguda, moluscos contam com a 19 mobilização de CaCO3 dos reservatórios intracelulares em resposta ao estresse ácido, tamponando o excesso de H+ na hemolinfa (MACHADO et al. 1988), resultando em aumento das concentrações de íons HCO3- e Ca2+ (PYNONNEN, 1991). O Ca2+ do ambiente influencia signifcativamente no pH da hemolinfa assim como nas concentrações desse íon nos diferentes órgãos que atua como armazenamento de cálcio (DAVIES; ERASMUS, 1984; EWALD et al. 2009; EBANKS et al. 2010). 1.5. Metabolismo de Biomphalaria 1.5.1. Glicólise A glicólise é uma via central quase universal do catabolismo da glicose, que ocorre em uma série de reações catalizadas por enzimas para liberar duas moléculas do piruvato. Durante as reações seqüenciais da glicólise, parte da enrgia livre liberada da glicose é conservada na forma de ATP e de NADH (LEHNINGER, 2006). Moléculas de glicose são o principal combustível da maioria dos organismos e ocupa uma posição central no metabolismo. Em moluscos são armazenadas na forma de glicogênio que se coloca como material de reserva em órgãos como glândula digestiva e massa cefalopediosa e, transportados através da hemolinfa aos tecidos do molusco (LIVINGSTONE; De ZWAAN, 1983; PINHEIRO, 1996; MELLO-SILVA et al. 2010). Ácidos orgânicos produzidos nas vias catabólica (glicólise) e anabólica (gliconeogenese) são importantes componentes do metabolismo intermediário na produção de energia. No metabolismo de B. glabrata o piruvato é o produto final da glicólise que através da piruvato desidrogenase resulta em acetil CoA, um importante elemento no ciclo do ácido tricarboxílico (ATC) na catabolização dos carboidratos de forma geral e ativação da cadeia respiratória, gerando a energia necessária (ATP) (LIVINGSTONE; De ZWAAN, 1983). 1.5.2. Ciclo do ácido tricarboxílico Um grupo acetil do acetil-coenzima A, resultante da oxidação do piruvato são introduzidos no ciclo do ATC, o acetil-CoA transfere seu grupo acetil para o oxaloacetato, para formar o citrato. O citrato é então transformado em isocitrato, e este é desidorgenado, com perda de CO2, para formar α-cetoglutarato. Este último perde CO2 e libera succinato que é oxidado a fumarato que sofre hidratação para produzir malato que por sua vez é oxidado a oxaloacetato (LEHNINGER, 2006). 20 A importância do ciclo ATC no metabolismo de B. glabrata infectado e não-infectado foi demonstrado por Bezerra et. al. (1999) e Massa et al. (2007). Em condições ecofisiológicas adversas como jejum, estivação, infecção por S. mansoni, dentre outros, esses moluscos passam por alterações na glicogênese, gliconeogênese e glicólise (BEZERRA et al. 1999; MELLO-SILVA et al. 2010). Estudos da caracterização e alterações nas concentrações dos ATC na hemolinfa de B. glabrata sob infecção por larvas de Echinostoma paraensei, demonstraram baixas concentrações de piruvato e aumento na concentração de lactato de moluscos infectados comparado com não-infectados, confirmando a ativação do metabolismo anaeróbico como via alternativa na produção de energia (TUNHOLI et al. 2011). Aumento na concentração de oxalato na hemolinfa de B. glabrata infectado por S. mansoni, sugeriu desacelaração do ciclo do ATC, consequentemente do metabolismo aeróbio (BEZERRA et al. 1997; TUNHOLI et al. 2013). No metabolismo de B. glabrata, o piruvato é o produto final da glicólise que através da piruvato desidrogenase resulta em acetil-CoA, um importante elemento no ciclo do ácido tricarboxílico na catabolização dos carboidratos de forma geral e ativação da cadeia respiratória, gerando a energia necessária (ATP) para manutenção das funções vitais. Oxaloacetato e acetil CoA por meio da citrato sintase resultará na ativação do ciclo do ATC (ALP et al. 1976). Estudos com essa espécie demonstraram que malato e fumarato, respectivamente, podem ser convertidos para succinato sendo este o produto final do metabolismo de uma inversão parcial do ciclo e este último como produto final do metabolismo (De ZWAAN; ZANDEE, 1972; HOCHACHKA, 1983). Essa inversão ocasionará a oxidação do piruvato para acetato que sob condições anaeróbicas poderá ser um dos produtos finais do metabolismo. Baixas concentrações de succinato em B. glabrata infectado foram interpretadas como redução de malato a succinato via fumarato redutase, promovendo uma inversão do ciclo do ATC. O succinato resultante foi metabolizado a propionato resultando em produção de energia e manutenção do balanço redox (TIELENS, 1994). A concentração dos ácidos orgânicos na hemolinfa de B. glabrata pode indicar ainda qual substrato está sendo utilizado na produção de energia, por exemplo, carboidratos como fonte de energia por via aeróbica, moluscos sob anoxia podem acionar ou redirecionar seu fluxo metabólico em sentido anaeróbio, utilizando aminoácidos e ácidos graxos como 21 substratos na gliconeogênese e em menor escala o uso de corpos cetônicos (BEZERRA et al. 1999). 1.5.3. Corpos Cetônicos Em B. glabrata, os corpos cetônicos provenientes da glândula digestiva podem ser utilizados como substratos energéticos para outros tecidos, através da cetólise. A formação do acetoacetato (Figura 5), ocorre por condensação enzimática de duas moléculas de acetil-CoA catalisada pela tiolase, o acetoacetil-CoA consdensa-se em acetil-CoA para formar o βhidroxi-β-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) o qual é quebrado para formar acetoacetato livre e acetil-CoA. O acetoaceto livre assim produzido é reduzido em D- β-hidroxibutirato por meio de uma reação reversível catalisada pela D- β-hidroxibutirato desidrogenase, uma enzima mitocondrial (MEYER et al. 1986). Apesar de a oxidação de ácidos graxos ser a principal fonte de corpos cetônicos, eles também são gerados do catabolismo de certos aminoácidos, tais como: leucina, isoleucina, lisina, triptofano, fenilalanina e tirosina. Esses aminoácidos são denominados cetogênicos, porque suas cadeias carbônicas são catabolizadas a acetil-CoA ou acetoacetil-CoA, substratos para a síntese de corpos cetônicos (MOTTA, 2005). A concentração de corpos cetônicos em moluscos apresenta um padrão bastante diferente do encontrado em outros animais no mesmo estado fisiológico, ou seja, em moluscos alimentados a concentração de corpos cetônicos é alta, com decréscimo após cinco dias em estivação (BECKER; LΫTH, 1977). Meyer et al. (1986), relataram alta atividade das enzimas da cetólise na massa cefalopediosa de B. glabrata infectado por larvas de S. mansoni, sugerindo o uso de corpos cetônicos como substrato energético em condições de estresse fisiológico pelos tecidos muscular e nervoso presentes nessa região. 1.5.4. Produtos Nitrogenados Os moluscos B. glabrata excretam íons amônio sob condições fisiológicas normais, e sob estresse fisiológico ocorre alteração no padrão de excreção para ureotélico (uréia) ou uricotélico (ácido úrico), devido a acelaração da via da uréia. Amônia e aminoácidos são geralmente transportados pela hemolinfa para lugares onde possam ser excretados ou metabolizados. A concentração desses produtos na hemolinfa pode indicar a atividade do metabolismo das proteínas e ácidos nucléicos em um animal exposto a situação de estresse, resultando na produção de uréia, amônia ou ácido úrico (BECKER, 1983). Mudanças na 22 degradação dos produtos nitrogenados são resultantes de um mecanismo de adaptação do molusco a condições adversas, sendo o ácido úrico um metabólito menos tóxico para moluscos aquáticos (BECKER, 1983; MELLO-SILVA, 2010). Figura 4 – Metabolismo dos corpos cetônicos entre célula da glândula digestiva, hemolinfa e células de outros tecidos em Biomphalaria glabrata. 1 – Acetil-CoA-acetiltransferase, 2 - 3hidroxi-3-metilglutaril-CoA-sintase, 3- hidroxi--metilglutaril-CoA-liase, 4- hidroxibutiratodesidrogenase a, HB – hidroxibutirato, 5-succinil-CoA-transferase, Acac – acetoacetato, Adaptado de Meyer et al. (1986). A uréia é o principal produto de excreção do excesso de nitrogênio proveniente do catabolismo dos aminoácidos. Sua síntese em moluscos ocorre via ciclo arginina-ornitinauréia (OUC), este ciclo apresenta quatro (4) passos enzimáticos: A ornitina recebe o grupo carbamil do fosfato e forma a citrulina, com a liberação de Pi. Essa reação é catalisada pela enzima ornitina-transcarbamoilase. Um segundo grupo amido, originado do aspartato, é adicionado à citrulina, formando argininosuccinato. Essa reação é catalisada pela enzima citosólica arginino succinato sintetase, e consome ATP. O argininosuccinato é degradado por uma argininosuccinase, liberando arginina e fumarato. A enzima citosólica arginase hidrolisa a arginina, formando ornitina e uréia. Estudos do metabolismo do molusco terrestre Achatina fulica revelou eficiência na taxa de síntese de uréia, bem como, na regulação das atividades 23 das enzimas OUC em respostas a situações de estresses fisiológicos resultante da desintoxicação da amônia (HIONG et al. 2005). O ácido úrico que é também o produto final da degradação de purina e nucleotídeos é excretado por moluscos, nos quais podem ainda, atuar como anti-oxidante não enzimático (BECKER, 1993). Outra substância excretada por moluscos é a creatinina, composto orgânico nitrogenado e não protéico, que surge como produto do ciclo da uréia (Figura 5) ou a partir da quebra do fosfato de creatina (CIAN et al. 2000), via pela qual a creatinina surge como propduto final é o circuito creatina-cinase-fosfatocreatina, que atua como um termostato bioenergético repondo rapidamente o ATP nos tecidos em caso de alta demanda. Quando o ATP é rapidamente esgotado, a creatina-cinase catalisa a doação de um grupo fosfato da fosfatocreatina (PCr) para ADP, produzindo mais ATP para suprir as necessidades energéticas. Por outro lado, quando a energia é liberada, um grupo fosfato individual é clivado do ATP, fazendo com que a creatina se junte a PCr. Dessa forma, trata-se de uma reação reversível tendo como produto final creatinina que é excretada (ALLEN, 2011). 24 Figura 5 - Produção e excreção de fumarato, creatinina e uréia em mamíferos. A oxidação de proteínas, gorduras e carboidratos gera Acetil-CoA utilizado no ciclo do ácido tricarboxílico. O catabolismo de aminoácidos gera glutamato utilizado no ciclo da uréia. C. citoplasma. E. produtos finais do metabolismo excretados. M. mitocôndria. Setas pontilhadas indicam substâncias absorvidas por processo ativo que passam por reações catabólicas no citoplasma (VINAUD, 2007). Sob condições fisiológicas normais, B. glabrata, excreta íons amônio, e sob estresse fisiológico ocorre alteração no padrão de excreção para ureotélico ou uricotélico, devido acelaração da via da uréia (BECKER, 1983). A síntese máxima de uréia, bem como, a incorporação de purinas (guanina e ácido úrico), coincide com os níveis mínimos de proteínas na hemolinfa (RUPPRECHT et al. 1989). Os compostos aminos excretados pelo molusco, são reciclados no interior da cavidade do manto por correntes inalantes e exalantes (MELLOSILVA et al. 2010). Adaptações anatômicas, fisiológicas, bioquímicas e ecológicas auxiliam na recuperação de aminoácidos perdidos pelo molusco durante a excreção (THOMAS; EATON, 1998). 25 1.5.5. Estudos da influência do cálcio no metabolismo de moluscos sob diferentes condições fisiológicas Estudo da influência do cálcio proveniente de fontes exógenas tem sido realizado desde a década de 70 por Greenaway (1971). O molusco aquático Elimia flava, apresentou diferentes respostas fisiológicas quando submetido experimentalmente a diferentes concentrações de CaCO3 (EWALD et al. 2009). Ao caracterizar o mecanismo de aquisição de Ca2+, HCO3-, CO32- necessários para o processo de calcificação da concha de embriões do molusco L. stagnalis, Ebanks et al. (2010), concluíram que a obtenção desses produtos estão estreitamente interligados; de acordo com esses autores os embriões vão necessitar de Ca2+ exógeno apenas quando os estoques materno presente no fluido vitelínico se esgotarem; mas ele podem utilizar o HCO3- endógeno produzido a partir da hidratação da anidrase carbônica Davies e Erasmus (1984), identificaram em tecidos de B. glabrata células de cálcio, classificadas pela natureza de suas inclusões calcárias e distribuição intra-molusco em A, B e C. A influência do parasitismo por larvas de S. mansoni e Angiostrongylus cantonensis (Nematoda), nas reservas de cálcio de B. glabrata foi avaliada por Tunholi-Alves et al. (2012). A mobilização do cálcio da concha para hemolinfa em B. glabrata exposto a diferentes soluções de CaCO3, em diferentes intervalos de tempo, foi observado por Magalhães et al. (2011), os quais concluiram que ocorre mobilização frequente de cálcio nos sítios intramolusco de acordo com a quantidade de cálcio disponível no ambiente. O efeito da exposição ao CaCO3, na emergência de cercárias por B. glabrata experimentalmente infectados por S. mansoni, foi avaliado por Augusto et al. (2012), os autores descreveram que a sobrevivência dos moluscos infectados foi diretamente associada a quantidade de carbonato de cálcio e a emergência de cercárias foi inversamente proporcional a quantidade de carbonato de cálcio. Estudos da influência do CaCO3 no metabolismo energético de B. glabrata com ênfase nos substratos utilizados para obtenção de energia, bem como,o perfil dos ácidos orgânicos e suas vias metabólicas essenciais, vem somar aos estudos já realizados. 26 2. JUSTIFICATIVA Os moluscos planorbídeos apresentam importância ecológica por ocuparem o segundo nível trófico alimentar. Servem como fonte de alimento para alguns animais invertebrados e vertebrados (PARAENSE, 1970; BARBOSA, 1994). Esses moluscos têm como habitat o ecossistema límnico, o qual apresenta características ecológicas que permitem a manutenção dos mesmos neste ambiente. A Biomphalaria glabrata, como as demais espécies hospedeiras do S. mansoni no Brasil, sobrevivem em diferentes tipos de habitas, preferencialmente em águas rasas, lênticas e lóticas de baixa correnteza (PIERI; JURBERG et al. 1980). Quanto aos aspectos físico-químicos da água apresentam altos limites de tolerância, adaptando-se a diferentes características dos sistemas dulcícolas. As concentrações de cloreto de sódio, cálcio e magnésio influenciam diretamente a permanência dos moluscos nestes ambientes. Atuam como bioindicadores de qualidade ambiental de corpos aquáticos (ABÍLIO et al. 2007), e a dinâmica de populações destes moluscos sofre influência de fatores como composição do solo, a hidrografia, o clima e a geografia de uma dada região (BARBOSA et al. 1994). Por exemplo, um fator limitante ao desenvolvimento de B. glabrata no meio límnico, é a baixa tensão de oxigênio provocada pelos resíduos orgânicos jogados neste meio e pelo aumento de produtos nitrogenados oriundos de processos de decomposição. Como um ser anaeróbico facultativo, é capaz de sobreviver por curtos períodos em micro ambientes com pequena ou nenhuma quantidade de oxigênio, enquanto se alimenta. Podem sobreviver longos períodos em ambientes com fluxos diferentes de oxigênio (diurnos e sazonais). Os moluscos podem se beneficiar e proporcionar ao meio produtos finais do metabolismo. As mudanças metabólicas destes organismos estão associadas às condições ambientais. O estudo dos elementos químicos se justifica pela participação indispensável nos processos vitais desses moluscos, sendo os metais cobre, ferro, zinco e manganês essenciais no metabolismo celulares de B. glabrata. Dentre os elementos maiores, o cálcio, objeto do presente estudo, é o que tem se mostrado mais influente na vida de Biomphalaria motivo pelo qual se tornou o elemento mais analisado tanto nos criadouros naturais (ROSA, 1987; SOUZA et al. 1998; SILVA et al. 2001), quanto em condições de laboratório DAVIES; ERASMUS, 1984; MAGALHÃES et al. 2011; AUGUSTO et al. 2012; TUNHOLI-ALVES et al. 2012). 27 A concentração de cálcio, assim como, de ácidos orgânicos estudados na hemolinfa pode indicar qual substrato e sua respectiva via metabólica está sendo utilizado na produção de energia, por exemplo, carboidratos como fonte de energia por via aeróbia, ou alternativamente anaeróbia (BEZERRA et al. 1999; MAGALHÃES et al. 2011; TUNHOLIALVES, 2013). No metabolismo das proteínas, a uréia é o principal produto de excreção do excesso de nitrogênio proveniente do catabolismo dos aminoácidos (IONG et al. 2005). Quando B. glabrata encontra-se sob condições de estresse, por exemplo, jejum ou infecção por S. mansoni ocorre alteração no padrão de excreção para ureotélico ou uricotélico, devido acelaração da via da uréia. A relevância destas observações no presente trabalho pode ajudar na compreensão de como este metabolismo no molusco pode atuar como um mecanismo antioxidante (BECKER, 1993). Em invertebrados, a creatinina pode originar como produto intermediário do ciclo da uréia ou do catabolismo do fosfato de creatina. Portanto, a exposição de B. glabrata às diferentes concentrações de CaCO3, pode fornecer respostas as condições fisiológicas em que o molusco se encontra, bem como, as possíveis alterações metabólicas desencadeadas podem subsidiar uma melhor compreensão da relação de B. glabrata com o meio e outros organismos. 28 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral Efeito das diferentes concentrações de carbonato de cálcio nos meio exógeno e endógeno de B. glabrata, bem como, em substratos e produtos do metobolismo energético do molusco. 3.2. Objetivos específicos Avaliar o pH da hemolinfa e água de condicionamento de B. glabrata exposto às diferentes concentrações de carbonato de cálcio, assim como, a concentração de cálcio, glicose, dos ácidos orgânicos piruvato, oxaloaceato, citrato, fumarato, malato, succinato, propionato, acetoacetato, β-hidroxibutirato, a concentração de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina na hemolinfa desses moluscos. 29 4. MÉTODOS 4.1. Manutenção de Biomphalaria glabrata Foram utilizados neste trabalho, B. glabrata linhagem procedente de Belo Horizonte (BH), cedidas pelo Laboratório de Esquistossomose Experimental da Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz RJ em julho de 2011. Os exemplares foram mantidos no laboratório de Malacologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) em aquários de polietileno contendo 8 L de acordo com Bezerra et al. (1999) e Magalhães et al. (2011a). Os aquários foram monitorados diariamente e lavados uma vez por semana. Os moluscos foram alimentados ad libitum, com folhas frescas de alface (Lactuca sativa), previamente lavadas em água corrente (água de condicionamento de moluscos). Este trabalho foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais CEUAPRPPG-UFG, com protocolo n. 083/12 (Anexo 2) 4.2. Composição do grupo de estudo Para compor o grupo de estudo foram utilizados 360 moluscos com diâmetro médio de concha de 8 mm. Os moluscos foram retirados aleatoriamente dos aquários de manutenção e foram alocados em caixas plásticas (Figura 5) contendo, 20 mg/L, 40 mg/L, 60 mg/L, 80 mg/L ou 100 mg/L de CaCO3 em 4 L de água. O CaCO3, pesado previamente, foi colocado primeiro na caixa e depois acrescentou-se a água para melhor solubilização do CaCO3. As caixas identificadas com o respectivo tratamento continham 60 moluscos, alternando entre indivíduos presentes na superfície e fundo do aquário. Semanalmente, as caixas foram lavadas tendo a água e as concentrações de CaCO3 renovadas. Para cada grupo controle foram seguidos os mesmos procedimentos e quantidade de moluscos utilizados para os grupos expostos ao CaCO3, porém, mantidos em água sem CaCO3. Os períodos de exposição ao CaCO3 foram de 1,14, 21 ou 30 dias, nos referentes períodos foram retirados 15 moluscos de cada grupo para extração da hemolinfa, sendo esta acondicionada em microtubos. 30 Moluscos alocados em seus respectivos grupos 0 Período de exposição a 20 mg, 40 mg, 60 mg, 80 mg ou 100 mg de CaCO3 1o dia 14o dia 21º dia n = 15 n = 15 n = 15 Extração da hemolinfa Extração da hemolinfa Extração da hemolinfa 30º dia n = 15 Extração da hemolinfa Figura 6 – Representação esquemática do delineamento experimental. B. glabrata exposto a concentrações de CaCO3 por 1, 14, 21 ou 30 dias. 4.3. Extração da hemolinfa Para a extração da hemolinfa os moluscos tiveram suas conchas limpas e secas com papel absorvente. Em seguida, com auxílio de uma seringa de 1mL, uma agulha 0,7x25 (tipo 22G 1”) foi introduzida a na cavidade pericárdica de cada indivíduo, a retirada da hemolinfafoi realizada com o auxílio de um microscópio estereoscópico Zeiss STEMI DV4. A hemolinfa coletada foi acondicionada em microtubos de 1mL e mantidas em gelo. Para cada grupo, foram sacrificados 15 moluscos nos períodos pré-estabelecidos dos quais obteve-se amostras compostas de hemolinfa, cada amostra continha hemolinfa de 5 indivíduos do mesmo grupo experimental, resultando num total de 3 amostras por grupo em cada período. 4.3.1. Medida do pH da hemolinfa e água de condicionamento de molusco Para realização das medidas de pH da hemolinfa foram utilizadas fitas para medir pH Merck®. As medidas de pH da água de condicionamento de moluscos foram obtidas utilizando pHametro digital de bancada PHS-3B Phtek. 31 4.3.2. Dosagem da concentração de cálcio na hemolinfa A concentração de cálcio foi obtida por colorimetria (Lambert-Beer), utilizando o kit cálcio Liquiform LABTEST® (BURTIS, 1986), foi utilizado o reagente 1 - tampão 920 nmol/L, pH 12; reagente 2 – o-cresolftaleína complexona 320 µmol/L, 8-hidroxiquinoleína 13 mmol/L e ácido clorídrico 130 mmol/L; padrão – cálcio 10 mg/dL (formol 0,1%) e 0,02 mL de hemolinfa. A leitura da concentração de cálcio foi realizada em espectrofotômetro (BIO 2000©), da marca BIOPLUS®, em 545 nm. 4.3.3. Dosagem da concentração de glicose A dosagem da concentração de glicose na hemolinfa dos moluscos B. glabrata foi realizada por colorimetria (Lambert-Beer), utilizando o kit glicose Liquiform LABTEST® (YONG, 1993), em cujo princípio, a enzima glicose oxidase (E.C. 1.1.3.4) catalisa a oxidação da glicose de acordo com a seguinte reação: Glicose + O2 + H2O GOD ácido glucônico + H2O2. Utilizou-se reagente contendo tampão fosfato 30 mmol/L, pH 7,5; fenol 1 mmol/L; glicose oxidase ≥ 1000U/L, peroxidase ≥ 800 U/L; 4-aminoantipirina ≥ 290 µmol/L; azida sódica 7,5 mmol/L, surfactates e 0,01 mL de hemolinfa. A leitura foi realizada em espectrofotômetro (BIO 2000©), da marca BIOPLUS®, em 545 nm. 4.3.4. Dosagem da concentração de proteínas totais A concentração de proteínas totais foi obtida utilizando o kit de proteínas totais LABTEST®, através da reação de Biureto (WEICHSELBAU, 1946). A mistura de 0,05 mL de hemolinfa com 2,5 mL de reagentes (600 mmol/L, 12 mmol/L de sulfato de cobre, estabilizador e antioxidante), foram homogeinizados e incubados a 370C por 10 minutos. Na sequência a leitura foi realizada em espectrofotômetro (BIO 2000©), da marca BIOPLUS®, em 545 nm. 4.3.5. Dosagem da concentração de ureia A concentração de ureia foi obtida através do kit de ureia LABTEST®. Para a análise utilizou-se, solução contendo: reagente 1 - tampão alcalino 20 mmol/L, pH 10,0; 2cetoglutarato 16 mmol/L; NADH 300 µmol/L; azida sódica 30,8 mmol/L e surfactante; reagente 2 - tampão 380 mmol/L, pH 8,0; urease (E.C. 3.5.1.5) ≥50000 U/L; GLDH ≥3750U/L; azida sódica 14,6 mmol/L, conservante e surfactante; solução padrão contendo 70 mg/dL de ureia e 7,7 mmol/L de azida sódica. Foi adicionado à mistura uma gota de urease e 32 0,01 mL de hemolinfa (CONNERTY et al. 1955). Posteriormente, a solução foi homogeinizada e incubados a 37ₒC por 5 minutos, e a leitura foi realizada em espectrofotômetro (BIO 2000©), da marca BIOPLUS®, em 545 nm. 4.3.6. Dosagem da concentração de ácido úrico A concentração de ácido úrico foi dosada através do kit de ácido úrico LABTEST®, pela metodologia enzimático-Trinder. Para a análise utilizou-se, solução contendo: reagente 1 - (tampão 80 mmol/L pH 7,0, 4-aminoantipirina 0,82 mmol/L, peroxidase ≥16000 U/L, azida sódica 0,8 mmol/L e octil fenol polioxietanol 1 g/L; reagente 2 – (tampão tampão 80 mmol/L pH 7,0, DHBS 10 mmol/L, uricase (E.C. 1.7.3.3) ≥ 500 U/L, octil fenol polioxietanol 1 g/L e azida sódica 0,8 mmol/L; padrão – ácido úrico 6,0 mg/dL (BISHOP et al. 1996). Posteriormente, acrescentou-se 0,02 mL de hemolinfa à solução que foi homogeinizada e incubados a 37ₒC por 5 minutos, e a leitura foi realizada em espectrofotômetro BTS 370© em 545 nm. 4.3.7. Dosagem da concentração de creatinina A concentração de creatinina foi dosada utilizando o kit de creatinina da marca DOLES®, método Jaffé modificado (HENRY, 1996). A amostra foi preparada em um bécker, adicioando: 2,0 mL de reagente Pícrico; 8,0 mL de água destilada, 8 gotas de solução alcalina e homogeinizada por 5 minutos. Os reagentes foram homogeinizados aguardando por 5 minutos. Na sequência 1 mL da solução reagente foi transferida para um tubo de ensaio, acrescentando 0,01 mL de hemolinfa, a mistura foi homogeinizada com ligeira agitação. Posteriormente, a solução foi aferida em espectrofotômetro (BIO 2000©) da marca BIOPLUS®, em 545 nm. 4.3.8. Estudo do perfil dos ácidos orgânicos Para o estudo do perfil dos ácidos orgânicos, as amostras de hemolinfa armazenadas em microtubos foram conservadas em gelo, na sequência foram centrifugados (120 g/5 min, 2°C) para separar hemócitos e partículas teciduais dos moluscos (BEZERRA et al. 1999). Os ácidos orgânicos foram extraídos por meio de uma pequena coluna de troca iônica, o Bond Elut® (coluna Varian). Com auxílio de uma bomba a vácuo, esta coluna de extração foi ativada com 1 mL de HCl (0,5 mol/L), 1 mL de metanol e 2 mL de H2O ultrafiltrada. Em seguida, 250 µL da amostra foram aplicados à coluna iônica. 33 Após a aplicação da amostra, foram acrescentados 2 mL de água ultrafiltrada e retirado o Bond Elut® do vácuo. Na sequência, foram adicionados 250 µL de H2SO4 (0,5 M) e centrifugado a 500 g (aproximadamente 2000 rpm) por cinco minutos a 2°C. A amostra resultante foi submetida à análise de cromatografia líquida alta eficiência (CLAE – Varian ProStar) com uma coluna de exclusão BIORAD-Aminex íon exclusion HPX – 87H (300 X 7,8 MM). A coluna de separação é protegida por uma pré-coluna BIORADAminex HPX – 85. O eluente utilizado na fase móvel foi o ácido sulfúrico (5 mmol/L) à temperatura de 25° a 30°C, com vazão de 0,6 mL/min, acoplado a um detector UV/visível em comprimento de onda de 210 nm. Cada amostra foi injetada num volume de 50 µL (BEZERRA et al. 1997). O tempo de retenção dos ácidos orgânicos e as áreas dos picos das substâncias detectadas foram calculados por um programa computadorizado acoplado ao cromatógrafo: Star Chromatography Workstation 5.0 Varian, fornecendo sua concentração nas amostras. Os ácidos orgânicos foram identificados de acordo com o tempo de retenção e com calibração previamente realizada no CLAE utilizando-se padrões para piruvato e lactato, indicadores da glicólise, citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato, substâncias do ciclo do ácido tricarboxílico; β-hidroxibutirato, acetoacetato, acetato e propionato, relacionados ao catabolismo de ácidos graxos (BEZERRA et al. 1999; VINAUD et al. 2007). Após a leitura dos ácidos na CLAE, obteve-se a concentração dos ácidos orgânicos em nmol/mL. 4.4. Análise estatística Os resultados deste estudo foram analisados pela ANOVA bifatorial [Fator 1: concentração de carbonato de cálcio; Fator 2: dias de exposição], seguida pelo teste de comparações múltiplas Tukey. O nível de significância adotado em todos os experimentos foi de p<0,05. Foi utilizado o Programa STATISTICA versão 7.1 (STATSOFT, 2007). 34 5. MANUSCRITOS 5.1. Manuscrito 1 INFLUÊNCIA DO CÁLCIO NO METABOLISMO ENERGÉTICO DO MOLUSCO Biomphalaria glabrata. Resumo O cálcio é considerado um elemento essencial no metabolismo do molusco aquático Biomphalaria glabrata, e tem sido descrito como um fator limitante na distribuição e adaptação desse molusco no ambiente. Este estudo teve por objetivo avaliar a influência da biodisponibilidade de cálcio sobre a concentração de glicose, dos ácidos orgânicos piruvato, alguns intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico e de cálcio na hemolinfa de B. glabrata sob exposição a diferentes concentrações de CaCO3 (20, 40, 60, 80 e 100 mg/L), em diferentes intervalos de tempo: 1, 14, 21 e 30 dias. Foram utilizados moluscos com 60 dias de vida, distribuídos em seis grupos, cinco expostos a diferentes concentrações de CaCO3 (20, 40, 60, 80 e 100mg/L) e um controle. Os exemplares foram sacrificados por meio de punção cardíaca para extração da hemolinfa, nos períodos descritos. As concentrações de cálcio e glicose na hemolinfa foram determinadas usando-se kits de diagnóstico (Liquiform LABTEST®). Os ácidos orgânicos foram extraídos por meio da coluna de troca iônica, o Bond Elut® (coluna Varian), e a amostra resultante foi submetida à análise de cromatografia líquida alta eficiência (CLAE – Varian ProStar) com uma coluna de exclusão BIORADAminex íon exclusion HPX – 87H (300 X 7,8 MM). Os resultados demonstraram que a concentração de cálcio na hemolinfa não apresentou diferença significativa (p>0,05) em relação ao controle, bem como, entre as concentrações testadas. A concentração de glicose diminuiu (p<0,05) nas exposições a 20mg e 40mg e aumentou nas exposições a 80mg e 100mg de CaCO3 em relação ao controle e demais concentrações testadas ao longo de 30 dias. Os ácidos orgânicos piruvato, oxaloaceato, citrato, succinato, fumarato, β-hidroxibutirato e lactato tiveram suas concentrações aumentadas, propionato e acetoacetato tiveram suas concetrações diminuída comparada ao controle na exposição ao CaCO3. De maneira geral a influências dos diferentes períodos de exposição ao CaCO3, nas concentrações das substâncias analisadas foi a de 14 dias. Conclui-se que as exposições ao CaCO3 influenciaram na redução de glicose, sendo esta metabolizada a piruvato produto final da glicólise. Os ácidos orgânicos dosados na hemolinfa de B. glabrata sugerem adaptações fisiológicas e servem de indicadores de um funcionamento aeróbio ou parcialmente anaeróbio. 35 5.1.1. Introdução Os moluscos gastrópodes atuam como bioindicadores da qualidade ambiental de corpos aquáticos (ABÍLIO et al. 2007), sendo influenciados por diversos fatores como: elementos químicos dissolvidos na água, a hidrografia, a composição do solo, o clima e a geografia física de uma dada região (BARBOSA et al. 1994). Os elementos químicos têm participação indispensável nos processos vitais dos moluscos, sendo os metais cálcio, cobre, ferro, zinco e manganês essenciais no metabolismo celulares destes organismos. A espécie Biomphalaria glabrata tem sido utilizada como modelo de estudos em ecologia, toxicologia e parasitologia, por ocupar o segundo nível trófico alimentar , servir como fonte de alimento para alguns animais invertebrados e vertebrados (PARAENSE, 1970; BARBOSA, 1994), atuar como bioindicadora de contaminação de ambientes dulcícolas (CANTINHA et. al. 2010), e por ser a principal espécie hospedeira intermediária do ciclo do parasito Schistosoma mansoni (SOUZA; CLARK, 1997) no Brasil. Dentre os elementos, o cálcio tem sido o mais analisado em Biomphalaria tanto nos criadouros naturais (ROSA, 1987; SOUZA et al. 1998; SILVA et al. 2001), quanto em condições de laboratório (DAVIES; ERASMUS, 1984; MAGALHÃES et al. 2011a; MAGALHÃES et al. 2011b; AUGUSTO et al. 2012; TUNHOLI-ALVES et al. 2012), demonstrando a sua importância na formação da concha, contração muscular, desenvolvimento embrionário, crescimento, resistência a predadores e nas respostas imunológicas. Além de ser importante nos processos metabólicos como solução tampão e cofator para ativação de enzimas envolvidas nas vias metabólicas da glicólise e ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (BECKER, 1980; LIEBSCH; BECKER, 1990; MELLO-SILVA et al. 2006; TUNHOLI et al. 2011). Para a produção de energia, B. glabrata utiliza a glicose disponível na hemolinfa e armazenada sob a forma de glicogênio em órgãos como glândula digestiva e massa cefalopediosa (SCHWARTZ; CARTER, 1982; LIVINGSTONE; ZWAAN, 1983; MELLOSILVA et al. 2010). Em condições de estresse fisiológico, como jejum, estivação, infecção e expostos a moluscicidas, os moluscos utilizam fontes alternativas de glicose como lipídeos e proteínas (MELLO-SILVA et al. 2011; TUNHOLI et al. 2013). Ácidos orgânicos produzidos nas vias catabólica (glicólise) e anabólica (gliconeogênese) são importantes componentes do metabolismo intermediário e indicam a via metabólica utilizada. Em condições aeróbicas são observadas na hemolinfa altas concentrações dos ácidos piruvato, oxalacetato, citrato, succinato, fumarato e malato, 36 indicando a ativação do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Em vias alternativas de produção de energia são observadas aumento nas concentrações de corpos cetônicos, sendo eles o acetoacetato e o β-hidroxibutirato, como produtos finais do metabolismo de lipídios, a partir do ciclo TCA. Enquanto que o aumento de lactato, oxalato e propionado indicam processos glicolíticos anaeróbicos (BEZERRA et al, 1999; TUNHOLI et al. 2013). Neste contexto, o presente trabalho tem por objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações de carbonato de cálcio em função do tempo de exposição no metabolismo energético de B. glabrata, a fim de subsidiar uma melhor compreensão da interferência de elementos químicos dissolvidos no meio aquático na fisiologia destes moluscos, propiciando indicadores de contaminação ambiental. 5.1.2. Materiais e Métodos Os exemplares de B. glabrata utilizados neste trabalho pertencem a linhagem procedente de Belo Horizonte (BH), e foram cedidos pelo Laboratório de Esquistossomose Experimental da Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz/RJ em julho de 2011. Os exemplares foram mantidos no laboratório de Malacologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) em aquários de polietileno contendo 8 L de acordo com Bezerra et al. (1999) e Magalhães et al. (2011). Os aquários foram monitorados diariamente e lavados uma vez por semana. Os moluscos foram alimentados ad libitum, com folhas frescas de alface (Lactuca sativa), previamente lavadas em água corrente (água de condicionamento de moluscos). Este trabalho foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA-PRPPG-UFG, com protocolo n. 083/12. Composição do grupo de estudo Foram utilizados 360 moluscos com diâmetro médio de concha de 8 mm, para compor os grupos experimentais os moluscos foram retirados aleatoriamente dos aquários de manutenção e alocados em caixas plásticas contendo, 20 mg/L, 40 mg/L, 60 mg/L, 80 mg/L ou 100 mg/L de CaCO3, acrescido de de água (4 L) para melhor solubilização do CaCO3. As caixas identificadas com o respectivo tratamento continham 60 moluscos. Semanalmente, as caixas foram lavadas tendo a água e as concentrações de CaCO3 renovadas. Os moluscos que compuseram o grupo controle foram mantidos nas mesmas condições que os expostos ao 37 CaCO3, mas sem a presença deste. Os períodos de exposição ao CaCO3 foram de 1,14, 21 ou 30 dias, nos quais os moluscos foramretirados, 15 de cada grupo, para extração da hemolinfa. Extração da Hemolinfa Para a extração da hemolinfa os moluscos tiveram suas conchas limpas e secas com papel absorvente. Em seguida, com auxílio de uma seringa de 1mL, uma agulha 0,7x25 (tipo 22G 1”) foi introduzida a na cavidade pericárdica de cada indivíduo, a retirada da hemolinfafoi realizada com o auxílio de um microscópio estereoscópico Zeiss STEMI DV4. A hemolinfa coletada foi acondicionada em microtubos de 1mL e mantidas em gelo. Para cada grupo, foram sacrificados 15 moluscos nos períodos pré-estabelecidos dos quais obteve-se amostras compostas de hemolinfa, cada amostra continha hemolinfa de 5 indivíduos do mesmo grupo experimental, resultando num total de 3 amostras por grupo em cada período. Medida do pH da hemolinfa e água de condicionamento de caramujo Para realização das medidas de pH da hemolinfa dos moluscos foram utilizadas fitas pH Merck® e para o pH da água foi medido utilizando pHmetro digital de bancada PHS-3B Phtek. Estudo do perfil dos ácidos orgânicos Para o estudo do perfil dos ácidos orgânicos, as amostras de hemolinfa armazenadas em microtubos foram conservadas em gelo, na sequência foram centrifugados (120 g/5 min, 2°C) para separar hemócitos e partículas teciduais dos moluscos (BEZERRA et al. 1999). Os ácidos orgânicos foram extraídos por meio de uma pequena coluna de troca iônica, o Bond Elut® (coluna Varian). Com auxílio de uma bomba a vácuo, esta coluna de extração foi ativada com 1 mL de HCl (0,5 mol/L), 1 mL de metanol e 2 mL de H2O ultrafiltrada. Em seguida, 250 µL da amostra foram aplicados à coluna iônica. Após a aplicação da amostra, foram acrescentados 2 mL de água ultrafiltrada e retirado o Bond Elut® do vácuo. Na sequência, foram adicionados 250 µL de H2SO4 (0,5 M) e centrifugado a 500 g (aproximadamente 2000 rpm) por cinco minutos a 2°C. A amostra resultante foi submetida à análise de cromatografia líquida alta eficiência (CLAE – Varian ProStar) com uma coluna de exclusão BIORAD-Aminex íon exclusion HPX – 87H (300 X 7,8 MM). A coluna de separação é protegida por uma pré-coluna BIORAD-Aminex HPX – 85. O eluente utilizado 38 na fase móvel foi o ácido sulfúrico (5 mmol/L) à temperatura de 25° a 30°C, com vazão de 0,6 mL/min, acoplado a um detector UV/visível em comprimento de onda de 210 nm. Cada amostra foi injetada num volume de 50 µL (BEZERRA et al. 1997). O tempo de retenção dos ácidos orgânicos e as áreas dos picos das substâncias detectadas foram calculados por um programa computadorizado acoplado ao cromatógrafo: Star Chromatography Workstation 5.0 Varian, fornecendo sua concentração nas amostras. Os ácidos orgânicos foram identificados de acordo com o tempo de retenção e com calibração previamente realizada no CLAE utilizando-se padrões para piruvato e lactato, indicadores da glicólise, citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato, substâncias do ciclo do ácido tricarboxílico; βhidroxibutirato, acetoacetato, acetato e propionato, relacionados ao catabolismo de ácidos graxos (BEZERRA et al. 1999; VINAUD et al. 2007). Após a leitura dos ácidos na CLAE, obteve-se a concentração dos ácidos orgânicos em nmol/mL. Dosagem da concentração de glicose e cálcio na hemolinfa As concentrações de glicose e cálcio foram obtidas utilizando kits específicos da marca LABTEST®. A leitura das concentrações foi realizada em espectrofotômetro (BIO 2000©), da marca BIOPLUS®, em 545 nm. Análise estatística Os resultados foram analisados pela ANOVA bifatorial [Fator 1: concentração de carbonato de cálcio; Fator 2: dias de exposição], seguida pelo teste Tukey. O nível de significância adotado em todos os experimentos foi de p<0,05. Foi utilizado o Programa STATISTICA versão 7.1 (STATSOFT, 2007). 5.1.3. Resultados Os resultados apresentados na Tabela 1 representam a concentração de cálcio e glicose na hemolinfa dos moluscos expostos a diferentes concentrações de CaCO3. Não houve diferenças significativas na concentração de cálcio na hemolinfa dos moluscos expostos a diferentes concentrações de CaCO3, nos diferentes intervalos de tempo. As análises (p<0,05) revelaram que a concentração de glicose diminuiu nas exposições a 20 mg e 40 mg de CaCO3 ao longo de 30 dias em relação ao controle e demais concentrações testadas. 39 Tabela 1 - Concentração de cálcio e glicose (mg/dL) na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a diferentes concentrações de CaCO3 - Média e desvio padrão (±) Controle (a) Cálcio 40 mg/L (c) 60 mg/L (d) 80 mg/L (e) 100 mg/L (f) 1º dia 14,43 11,70 18,20 12,60 11,10 13,60 (A) ±0,05 ±0,88 ±1,37 ±2,09 ±2,33 ±1,73 14º dia 13,90 10,90 12,96 11,90 10,83 11,86 (B) ±0,40 ±0,79 ±4,10 ±1,12 ±0,70 ±1,33 21º dia 14,40 11,80 13,80 11,76 11,16 12,00 (C) ±0,45 ±0,90 ±1,80 ±2,31 ±1,81 ±2,11 30º dia 14,36 10,63 12,20 10,60 12,40 12,10 (D) ±0,15 ±0,98 ±1,94 ±2,81 ±2,97 ±2,80 B 1º dia 96,83 (A) ±2,17 14º dia Glicose 20 mg/L (b) (B) 89,00 CD ±1,02 D 93,03 defCD ±3,15 88,56 defCD ±1,02 81,80 acdefD 88,13 adefCD ±2,37 90,63 defCD ±1,65 72,40 adef 115,20 efCD 2,81 114,20 aefCD ±1,15 95,90 efD 160,23 afBCD 179,20aBCD ±2,70 234,76 afCD ±1,15 127,70aD ±1,15 177,56 afD ±1,15 122,36aD 21º dia 101,66 (C) ±8,14 ±0,98 ±0,95 ±3,01 ±1,43 ±0,72 30º dia 98,06 61,03acdef 73,50aef 70,83aef 113,73af 45,00a (D) ±0,70 ±1,05 ±0,60 ±3,46 ±1,78 ±2,21 Letras minúsculas diferentes - diferença estatística, na concentração dos ácidos orgânicos nos grupos expostos a diferentes concentrações de CaCO3, mesmo dia (p<0,05; ANOVA) Letras maiúsculas diferentes - diferença estatística, na concentração dos ácidos orgânicos nos grupos expostos a mesma concentração de CaCO3, em dias diferentes (p<0,05; ANOVA) Concentração dos ácidos orgânicos Pode-se observar na Tabela 2, que houve diferença significativa na concentração de piruvato, oxaloaceato, citrato, succinato, fumarato, propionato, acetoacetato, β-hidroxibutirato e lactato nas exposições a diferentes concentrações de CaCO3. Houve aumento nas concentrações de piruvato, oxaloaceato, citrato, succinato, fumarato, β-hidroxibutirato e lactato, bem como, diminuição nas concentrações de propionato e acetoaceato ao longo dos períodos de exposição ao CaCO3 em relação ao controle (Figura 1). Nas comparações entre grupos (20 mg x 40 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg; 40 mg x 60 mg, 80 mg, 100 mg; 60 mg x 80 mg, 100 mg; 80 mg x 100 mg de CaCO3), foi possível observar que a concentração de piruvato, citrato, fumarato, propionato, β-hidroxibutirato e lactato diminuiu com 1 dia de exposição a 20 mg e, aumentou a partir de 14 dias em relação a maioria das concentrações de de CaCO3. A concentração de oxaloaceato aumentou com 1 dia de exposição a 20 mg de CaCO3 e diminuiu a partir de 14 dias. Houve diminuição na concentração de succinato com 1 dia de exposição a 20 mg e aumento com 30 dias comparado as demais concentrações de CaCO3. Observou-se aumento na concentração de acetoacetato aos 14 dias de exposição a 20 40 mg e 40 mg de CaCO3 e diminuição a partir de 21 dias quando comparado as demais concentrações. Tabela 2 - Concentração de ácidos orgânicos (nMol/ml) na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a diferentes concentrações de CaCO3 (mg/L). Piruvato Oxaloacetato Citrato 1º dia (A) 14º dia (B) 21º dia (C) 30º dia (D) 1º dia (A) 14º dia (B) 21º dia (C) 30º dia (D) 1º dia (A) 14º dia (B) 21º dia (C) 30º dia (D) Controle (a) 20 mg/L (b) 40 mg/L (c) 60 mg/L (d) 80 mg/L (e) 100 mg/L (f) 5,51 ±0,34 5,63 ±0,48 5,15 ±0,45 5,95 ±0,02 6,20 ±0,29 4,17 ±0,17 4,44 ±0,57 5,69 ±0,74 39,07 ±0,88 39,02 ±0,02 25,30 ±0,09 28,52 ±0,21 22,03acdefBCD ±1,17 56,34acdef ±1,08 48,63acf ±1,04 60,55acdef ±1,51 84,32acdfBCD ±0,20 25,36acdefCD ±1,53 35,91acdefD ±0,59 12,01a ±0,86 41,48 cdefBCD ±2,22 48,71cefCD ±9,36 27,32defD ±5,80 18,74cef ±2,77 59,63adefBCD ±1,34 44,10 adefC ±2,43 24,70adefD ±1,13 46,83adef ±5,95 62,07adeBCD ±2,65 12,05acdfC ±1,30 6,29ef ±0,54 8,65 ±0,46 86,92adefCD ±3,45 94,6adefCD ±9,63 36,55efD ±1,57 78,84adef ±6,50 45,62aefBD ±2,28 25,14afCD ±0,81 47,68afD ±4,27 54,17aef ±0,78 5,67aefBCD ±0,78 51,00aefCD ±3,07 10,22aef ±1,12 7,30 ±1,02 139,42aeBCD ±5,70 43,38efD ±8,81 44,35aefD ±7,50 14,07aef ±2,98 67,73afBC ±1,17 29,62afCD ±1,61 47,03afC ±2,91 67,39af ±1,05 82,07afBCD ±1,02 10,47afC ±0,61 50,43afD ±4,40 8,96 ±1,43 112,59afBC ±4,08 24,19afCD ±3,33 94,79af ±3,30 99,18af ±12,68 51,79 aBCD ±1,10 63,04aCD ±2,22 78,62aD ±4,19 23,57 ±2,51 63,20aBCD ±0,73 73,69aCD ±1,33 18,81aD ±0,61 9,31 ±0,42 139,85aBCD ±5,26 354,57aCD ±3,00 122,42aD ±7,18 35,94 ±5,05 41 Tabela 2- Continuação. Succinato Fumarato Propionato 1º dia (A) 14º dia (B) 21º dia (C) 30º dia (D) 1º dia (A) 14º dia (B) 21º dia (C) 30º dia (D) 1º dia (A) 14º dia (B) 21º dia (C) 30º dia (D) Controle (a) 20 mg/L (b) 40 mg/L (c) 60 mg/L (d) 40,98CD ±1,19 44,22 CD ±1,83 110,33 D ±1,63 78,04 ±0,17 0,91D ±0,00 0,80D ±0,00 0,58 ±0,00 0,29 ±0,00 3126,38D ±1,18 3086,72D ±1,49 2986,30 ±3,18 3032,65 ±0,70 209,09acefBCD ±21,58 145,28acdefD ±18,38 137,83cefD ±2,58 337,53acdef ±21,04 1,09cdefBCD ±0,54 2,89acdefCD ±0,06 9,49acdefD ±0,06 6,12adef ±0,11 1198,56cdefBCD ±61,44 683,70acdefCD ±63,00 3480,30acdefD ±67,89 763,44adef ±33,49 126,86adefBCD ±12,75 69,21fD ±8,44 44,50aeD ±2,06 189,02aef ±6,61 2,74aBD ±0,02 4,76adeCD ±0,01 2,57adD ±0,13 5,66aef ±0,43 931,11aBD ±72,40 692,53adeCD ±132,40 1229,63adD ±46,81 2336,00aef ±199,89 232,07aefBC ±10,60 94,15acD ±21,15 131,07efD ±9,60 206,33aef ±8,98 2,99aBCD ±0,24 8,71aefCD ±0,34 6,16aefD ±0,15 5,32aef ±0,28 1182,98aBCD ±58,34 1245,46aefCD ±41,10 1356,23aefD ±86,52 2218,75aef ±114,99 80 mg/L (e) 165,38afBCD ±8,43 66,17fD ±21,24 87,64fD ±25,25 131,58a ±18,95 3,17afBC ±0,12 1,59afCD ±0,09 2,35afD ±0,05 3,10af ±0,09 2970,75afBC ±138,53 1336,42afCD ±87,56 1117,15afD ±58,98 2222,79af ±177,74 100 mg/L (f) 293,85aBCD ±2,73 104,74aC ±14,45 45,16aD ±1,99 113,90a ±0,56 2,65aB ±0,03 4,42aCD ±0,06 2,85a ±0,11 2,39a ±0,23 2348,75aB ±43,56 1739,45aCD ±4,73 1734,67a ±137,47 2930,69a ±293,25 42 Tabela 2 - Continuação. Controle CD 20 mg/L aeB 40 mg/L 60 mg/L aeBC aefBD 80 mg/L afBD 100 mg/L 1º 2451,92 311,24 308,81 614,23 1023,44 278,15aBCD dia ±1,10 ±68,97 ±77,48 ±59,24 ±99,14 ±51,01 14º 2578,60CD 1308,88acdeCD 984,65adefCD 1729,88aeCD 300,44afC 1580,15aD dia ±0,86 ±257,01 ±88,18 ±231,04 ±86,84 ±21,62 Acetoacetato 21º 1735,94D 410,36aefD 634,32af 383,56aefD 849,71af 1714,96D dia ±2,35 ±31,25 ±86,73 ±43,94 ±222,42 ±372,11 acdf df aef af 30º 871,18 251,41 609,39 1347,60 532,23 2455,68a dia ±1,73 ±35,36 ±65,11 ±186,15 ±0,82 ±91,79 1º 924,76CD 504,42acdefBCD 1029,50BCD 1198,54aefBCD 976,86BCD 992,70CD dia ±1,55 ±40,70 ±40,84 ±33,31 ±83,75 ±218,70 14º 928,40CD 1280,46adefC 1408,28adefCD 2146,20aefCD 335,60afD 988,61CD dia ±0,93 ±5,83 ±77,17 ±36,98 ±46,87 ±4,38 Hidroxibutirato 21º 651,67D 1552,75acdef 671,64defD 2617,75aefD 292,08aD 443,52aD dia ±1,17 ±62,32 ±47,38 ±53,41 ±46,87 ±51,01 30º 1230,77 1441,80acef 1193,66def 1588,76aef 2068,12af 747,19 dia ±0,41 ±17,28 ±154,54 ±46,20 ±24,89 ±80,70 1º 2,45 9,75acdefBCD 15,51aBCD 17,91a 14,97aBCD 15,45aBCD dia ±0,12 ±0,45 ±0,60 ±1,00 ±1,37 ±0,87 14º 2,93 32,03adefCD 32,40adefCD 14,65afD 11,43afCD 20,95aCD dia ±0,66 ±2,48 ±1,48 ±1,29 ±0,54 ±0,76 Lactato 21º 3,58 25,53acdfD 10,74aefD 11,81aefD 26,12af 3,82 dia ±0,01 ±1,03 ±2,51 ±1,71 ±1,13 ±0,99 30º 4,12 13,18adef 14,59adef 20,19aef 24,83af 4,94 dia ±0,01 ±0,67 ±3,53 ±0,79 ±0,59 ±0,88 Letras minúsculas diferentes - diferença estatística, na concentração dos ácidos orgânicos nos grupos expostos as diferentes concentrações de CaCO3, mesmo dia (p<0,05; ANOVA). Letras maiúsculas diferentes - diferença estatística, na concentração dos ácidos orgânicos nos grupos expostos a mesma concentração de CaCO3, em dias diferentes (p<0,05; ANOVA). 43 Figura 1 – Esquema representando os substratos utilizados em vias metabólicas na obtentenção de energia por Biomphalaria glabrata exposto ao CaCO3 ao longo de 30 dias, em relação ao controle. As substâncias grifadas indicam que foram analisadas neste estudo e estas mesmas substâncias em negrito significa que houve aumento destas. As substâncias que não estão em negrito significam que diminuíram. Foi analisado os valores de pH médios das soluções obtidas com 20, 40, 60, 80 e 100mg de CaCO3. Estas soluções apresentaram pH 8,5 em 20mg e 9,0 nas demais soluções de CaCO3, enquanto o pH da água do controle foi 8,0. Já os valores de pH da hemolinfa dos moluscos expostos a diferentes concentrações de CaCO3 foi 8,0 (todas as concentrações) e a do controle 7,5 (Tabela 3). 44 Tabela 3 – Valores médios de pH na hemolinfa de Biomphalaria glabrata e água de condicionamento de molusco no grupo controle e nos grupos expostos ao CaCO3 (20mg, 40mg, 60mg, 80mg e 100mg CaCO3), nos diferentes intervalos de tempo (1, 14, 21 e 30 dias). Hemolinfa Água com CaCO3 Grupos 1 dia 14 dias 21 dias 30 dias Controle 20 mg CaCO3 40 mg CaCO3 60 mg CaCO3 80 mg CaCO3 100 mg CaCO3 7,5 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 7,5 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 7,5 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 7,5 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 Controle 20 mg CaCO3 40 mg CaCO3 60 mg CaCO3 80 mg CaCO3 100 mg CaCO3 7,8 8,5 8,7 8,9 8,9 8,7 7,8 8,5 8,7 8,9 8,9 8,7 7,8 8,5 8,7 8,9 8,9 8,7 7,8 8,5 8,7 8,9 8,9 8,7 5.1.4. Discussão A influência das diferentes concentrações de CaCO3 no metabolismo de B. glabrata foi avaliada neste estudo. A presença de CaCO3 no ambiente favorece a alcalinidade e disponibilidade do íon Ca2+ (LEWIS et al. 2007), esses fatores têm relação com a distribuição populacional de B. glabrata que dependem de cálcio para manter a homestasia intramolusco. O valor de pH na hemolinfa dos moluscos expostos à diferentes concentrações de CaCO3 neste estudo foi 8,0 e do controle 7,5. E as soluções obtidas com CaCO3 nas concentrações 20 mg/L, 40 mg/L, 60 mg, 80mg/L e 100 mg/L apresentaram valores de pH entre 8,5 a 9,0 enquanto os valores de pH da água de condicionamento de molusco, sem CaCO3, foi 8,0 em todas as concentrações testadas, já o pH do controle foi 7,5. Os mecanismos propostos para absorção de Ca2+ e HCO-3 em células do epitélio intestinal de moluscos aquáticos destacam o H+ e HCO-3 como produtos da reação catalisada pela anidrase carbônica sob CO2 hidratado, íons H+ são excretados pela bomba de hidrogênio contribuindo para gradiente elétrico negativo no líquido intracelular, gerando influxo de Ca2+ através dos canais voltagens dependentes. Sendo a excreção de H+ realizado por contratransporte de 2H+ e 1Ca2+ (EBANKS, 2010). A exposição de B. glabrata a diferentes concentrações de CaCO3 neste estudo não alterou a concentração de Ca2+ na hemolinfa, o que sugere transporte deste íon via hemolinfa para órgãos reservatórios como a concha (MARXEN et al. 2003), células de cálcio presentes no tecido conjuntivo do molusco (DAVIES; ERASMUS, 1984), ou ainda armazenado forma de pérolas negras em locais como glândula digestiva e intestino (MAGALHÃES et al. 2011b). A exposição de B. glabrata a 20 45 mg de CaCO3 por 15 dias resultou em aumento deste íon na hemolinfa e foi interpretado por Magalhães et al. (2011), como mobilização desse íon da concha para hemolinfa onde atua como solução tampão (BECKER, 1980). O Ca2+ apresenta relevância no metabolismo dos moluscos aquáticos pulmonados por atuar como co-fator para ativação de enzimas envolvidas nas vias metabólicas da glicólise e ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (WITT; SMINIA, 1980). Diminuição na concentração de glicose na hemolinfa dos moluscos expostos à 20 mg e 40 mg de CaCO3 observada no presente estudo com aumento de piruvato, oxaloacetato, citrato, fumarato e succinato nos diferentes intervalos de tempo, apontou para ativação do ciclo (TCA). Estudos com B. glabrata demonstraram que malato e fumarato, respectivamente, podem ser convertidos para succinato sendo este o produto final do metabolismo de uma inversão parcial do ciclo e este último como produto final do metabolismo (De ZWAAN; ZANDEE, 1972; HOCHACHKA, 1983). Neste estudo não foi detectado a concentração de malato, sugerindo que esse ácido foi reduzido a fumarato por meio do sistema enzimático da fumarase redutase (BEZERRA et al. 1997). O fumarato pode ser metabolizado a succinato que pode ser convertido em propionato para produção de energia e manutenção do balanço redox, condições observadas em B. glabrata infectada por S. mansoni (TIELENS, 1994). A concentração de propionato diminuiu nas concentrações de CaCO3 testadas neste estudo com aumento de succinato, sugerindo que succinato não foi totalmente utilizado como substrato na produção de propionato mas secretado/excretado como produto final da inversão do ciclo do ácido tricarboxílico. O aumento na concentração de β-hidroxibutirato e diminuição de acetoacetato nas concentrações testadas ao longo de 30 dias foram entendidos como redução de acetoacetato pela β-hidroxibutirato-desidrogenase sugerindo a utilização dessa via metabólica alternativa na produção de energia. Estas sugestões foram reforçadas com o aumento de citrato nas exposições a 40 mg e 60mg de CaCO3, principalmente com 1 e 30 dias comparado ao controle. O aumento na concentração de citrato pode ser resultante da conversão de acetilCoA em citrato, tendo acetil-CoA como produto da oxidação de β-hidroxibutirato (MEYER, 1996). A atividade enzimática de β-hidroxibutirato-desidrogenase foi demonstrada em B. glabrata por Bailey e Home (1972), inclusive em relação a alterações de atividades no ciclo do ácido tricarboxílico. Stanislawski e Becker (1979) observaram diminuição nas concentrações de acetoacetato e β-hidroxibutirato sob condições de jejum e aumento destes ácidos em B. glabrata infectado com S. mansoni, estes autores sugeriram que a presença de S. 46 mansoni no hospedeiro molusco estimula a cetogênese e que existe a possibilidade de ação dos corpos cetônicos no desenvolvimento da infecção no molusco. A exposição a diferentes concentrações de CaCO3 resultou em aumento na concentração de lactato. Ao analisar as diferenças signifcativas entre concentrações testadas, foi possível observar que 20 mg e 40 mg não apresentaram diferenças significativas entre si nos diferentes intervalos de tempo. Esses resultados nos levou a sugerir que nessas concentrações a obtenção de energia foi proveniente de via aeróbica e à medida que a concentração de CaCO3 aumentou B. glabrata passou a utilizar via anaeróbica na produção de energia, embora a concentração reduzida de propionato encontrada não conduz a um produto final de um metabolismo anaeróbio comum em invertebrados (HOCHACHKA, 1983). Conclui-se que as exposições ao CaCO3 influenciaram na redução de glicose, sendo esta metabolizada a piruvato produto final da glicólise principalmente nas exposições à 20 mg e 40 mg. Os ácidos orgânicos dosados na hemolinfa de B. glabrata sugerem adaptações fisiológicas nos períodos avaliados, sendo que oxaloacetato, citrato, succinato e fumarato aumentaram servindo de indicadores de um funcionamento aeróbio, ou mesmo parcialmente anaeróbio. 5.1.5. Referências ABÍLIO, F.J.P.; RUFFO, T.L.M.; SOUZA, A.H.F.F.; FLORENTIN, H.S.; JÚNIOR, E.T.O.; MEIRELES, B.N.; SANTANA, A.C.D. 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Manuscrito 2 PRODUTOS METABÓLICOS NITROGENADOS NA HEMOLINFA DE Biomphalaria glabrata EXPOSTO À DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE CÁLCIO NO MEIO Resumo Alterações no padrão de excreção dos produtos nitrogenados são observadas em moluscos aquáticos sob condições de estresse fisiológico, resultado da degradação de proteínas e aminoácidos, utilizados como substrato energético. O cálcio no meio aquático é um fator limitante para a manutenção da população de moluscos, o excesso ou a escassez do mesmo pode provocar um desequilíbrio fisiológico, que afeta diretamente a dinâmica populacional das espécies de moluscos nos criadouros naturais. Este estudo teve como objetivo quantificar as concentrações de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina na hemolinfa de Biomphalaria glabrata expostas às diferentes concentrações de CaCO3 (20, 40, 60, 80 e 100 mg/L), em diferentes intervalos de tempo: 1, 14, 21 e 30 dias. Foram utilizados moluscos com 60 dias de vida, distribuídos em seis grupos, cinco expostos a diferentes concentrações de CaCO3 (20, 40,60, 80 e 100mg/L) e um controle. Os exemplares foram sacrificados por meio de punção cardíaca para extração da hemolinfa, nos períodos descritos. As concentrações de proteínas totais, uréia, ácido úrico e creatinina foram verificadas através de kits de diagnóstico específicos. Os resultados demonstraram que as concentrações de proteínas aumentaram, enquanto que a concentração de ureia diminuiu nas exposições às concentrações de CaCO3 testadas, em relação ao controle. As concentrações de ácido úrico e creatinina aumentaram em concentrações específicas. Foram observadas alterações dos produtos nitrogenados principalmente aos 21 dias de exposição ao CaCO3. Conclui-se que as concentrações de cálcio no meio interferem diretamente nas vias basais do metabolismo, como visto nos processos de estresse fisiológico provocados por diferentes agentes. 53 5.2.1. Introdução No metabolismo energético dos gastrópodes pulmonados as principais moléculas utilizadas, bem como, as mais abundantes são o glicogênio e o galactogênio (GERAERTS, 1992). O glicogênio é armazenado na região anterior do manto, entre os ácinos da glândula digestiva e gônada (De JONG-BRINK, 1973; CHIANG, 1977) e na massa cefalopediosa (LIVINGSTONE; ZWAAN, 1983; PINHEIRO; AMATO, 1994). Em situação de estresse fisiológico, por exemplo, infecção por parasitos, ocorre um desequilíbrio na composição glicídica da hemolinfa o que leva o molusco a dispor de suas reservas de carboidratos, com consequente redução de seus estoques de glicogênio (PINHEIRO; AMATO, 1994, PINHEIRO et al. 2009). O déficit de carboidratos resulta num estado de inanição a qual leva o organismo do molusco a optar por substratos alternativos para obter energia suficiente na manutenção dos seus processos metabólicos vitais (PINHEIRO et al. 2009). A utilização de proteínas como substrato energético, gera alterações na concentração destas, assim como, de aminoácidos livres no molusco (BECKER, 1980), podendo ocorrer redução em até 80% nos níveis de proteínas totais na hemolinfa (PINHEIRO et al. 2009; TUNHOLI et al. 2010). As vias metabólicas alternativas do molusco ativadas em função do estresse resultam em vias de excreção consequentes, as quais podem ser tóxicas ao molusco e por isso precisam de detoxificação. Uma dessas consequências é a elevação dos conteúdos dos produtos nitrogenados de degradação, como a ureia, ácido úrico, amônia, tudo isso em resultado a extensa degradação de proteínas e aminoácidos (TUNHOLI et al. 2011). Dentre os produtos metabólicos nitrogenados excretados por moluscos aquáticos, sob condições normais, a ureia representa em torno 75% e o ácido úrico em média de 25% (MEYER et al. 1986). Em B. glabrata sob infecção por S. mansoni, Becker (1980), sugeriu redirecionamento de vias metabólicas com aceleração na degradação de proteínas, resultando em mudanças no padrão de excreção, passando a quase exclusivamente à uricotélico. Outra substância excretada por moluscos é a creatinina, um composto orgânico nitrogenado e não protéico formado a partir da desidratação da creatina. Em invertebrados a creatinina pode originar como produto intermediário do ciclo da uréia ou do catabolismo do fosfato de creatina (ALLEN, 2011). Estudos dos metabólitos nitrogenados de B. glabrata sob condições de estresse apontaram para alterações no padrão de excreção desses produtos (BECKER, 1980; MELLO-SILVA et al. 2006, TUNHOLI et al. 2011). Na infecção, jejum, estivação e tratamento com moluscicidas, os moluscos sofrem alterações no metabolismo de 54 carboidratos e de proteínas, resultando em liberação de ácidos orgânicos altamente tóxicos que serão neutralizados pela mobilização de carbonato de cálcio, excretados ou metabolizados em outros tecidos (BECKER, 1980; LIEBSCH; BECKER, 1990; MELLO-SILVA et al. 2006). Neste sentido, destaca-se o cálcio como um dos elementos-chave desse processo, pois é de grande importância para o molusco, por funcionar como solução tampão em processos metabólicos e participar da produção de células de defesa, os hemócitos, além de influenciar na sua capacidade fagocítica (ZELCK et al. 1995). A infecção por S. mansoni promove alterações no balanço iônico dos moluscos, levando a um processo de hipercalcificação das partes moles, devido à mobilização de cálcio da concha para estes tecidos (ZBIKOWSKA, 2003; MOSTAFA, 2007). O objetivo deste trabalho foi averiguar a concentração de proteínas totais, uréia, ácido úrico e creatinina na hemolinfa de B. glabrata exposto às diferentes concentrações de CaCO3, por 1, 14, 21 e 30 dias. 5.2.2. Materiais e Métodos Os exemplares de B. glabrata utilizados neste trabalho pertencem a linhagem procedente de Belo Horizonte (BH), e foram cedidos pelo Laboratório de Esquistossomose Experimental da Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz/RJ em julho de 2011. Os exemplares foram mantidos no laboratório de Malacologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) em aquários de polietileno contendo 8 L de acordo com Bezerra et al. (1999) e Magalhães et al. (2011). Os aquários foram monitorados diariamente e lavados uma vez por semana. Os moluscos foram alimentados ad libitum, com folhas frescas de alface (Lactuca sativa), previamente lavadas em água corrente (água de condicionamento de moluscos). Este trabalho foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA-PRPPG-UFG, com protocolo n. 083/12. Composição do grupo de estudo Foram utilizados 360 moluscos com diâmetro médio de concha de 8 mm, para compor os grupos experimentais os moluscos foram retirados aleatoriamente dos aquários de manutenção e alocados em caixas plásticas contendo, 20 mg/L, 40 mg/L, 60 mg/L, 80 mg/L ou 100 mg/L de CaCO3, acrescido de de água (4 L) para melhor solubilização do CaCO3. As caixas identificadas com o respectivo tratamento continham 60 moluscos. Semanalmente, as caixas foram lavadas tendo a água e as concentrações de CaCO3 renovadas. Os moluscos que 55 compuseram o grupo controle foram mantidos nas mesmas condições que os expostos ao CaCO3, mas sem a presença deste. Os períodos de exposição ao CaCO3 foram de 1,14, 21 ou 30 dias, nos quais os moluscos foram retirados, 15 de cada grupo, para extração da hemolinfa. Extração da Hemolinfa Para a extração da hemolinfa os moluscos tiveram suas conchas limpas e secas com papel absorvente. Em seguida, com auxílio de uma seringa de 1mL, uma agulha 0,7x25 (tipo 22G 1”) foi introduzida a na cavidade pericárdica de cada indivíduo, a retirada da hemolinfafoi realizada com o auxílio de um microscópio estereoscópico Zeiss STEMI DV4. A hemolinfa coletada foi acondicionada em microtubos de 1mL e mantidas em gelo. Para cada grupo, foram sacrificados 15 moluscos nos períodos pré-estabelecidos dos quais obtevese amostras compostas de hemolinfa, cada amostra continha hemolinfa de 5 indivíduos do mesmo grupo experimental, resultando num total de 3 amostras por grupo em cada período. Dosagem da concentração de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina As concentrações de proteínas totais e produtos nitrogenados foram obtidas utilizando kits específicos da marca LABTEST®. Para a dosagem da creatinina utilizou-se o kit da marca DOLES®, método Jaffé modificado (HENRY, 1996). Todos os materiais analisados foram lidos em espectrofotômetro (BIO 2000©), da marca BIOPLUS®, em 545 nm. Análise estatística Os resultados foram analisados pela ANOVA bifatorial [Fator 1: concentração de carbonato de cálcio; Fator 2: dias de exposição], seguida pelo teste Tukey. O nível de significância adotado em todos os experimentos foi de p<0,05. Foi utilizado o Programa STATISTICA versão 7.1 (STATSOFT, 2007). 5.2.3. Resultados Os resultados das concentrações de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina na hemolinfa de B. glabrata expostos às diferentes concentrações de CaCO3, encontram-se na Tabela 1. As análises revelaram diferenças significativas (p<0,05), para o aumento na concentração de proteínas totais dos moluscos expostos as concentrações de CaCO3 testadas 56 em relação controle, em todos os períodos de exposição. Nas comparações entre grupos (20 mg x 40 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg; 40 mg x 60 mg, 80 mg, 100 mg; 60 mg x 80 mg, 100 mg; 80 mg x 100 mg de CaCO3), foi possível observar que a concentração de proteínas totais diminuiu na exposição a 40 mg x 100 mg a partir de 14 dias, bem como, aos 30 dias de exposição a 40 mg x 60 mg, 80 mg. Houve aumento na concentração de proteínas totais na exposição a 80 mg x 100 mg de CaCO3, com 30 dias. Em relação à concentração de ureia, as análises revelaram diminuição nas exposições as concentrações de CaCO3 testadas ao longo de 30 dias em relação ao controle. Nas comparações entre grupos foi possível observar aumento na concentração de ureia na exposição a 40 mg x 60 mg, 80 mg e 100 mg de CaCO3, com 1 dia. Houve aumento na concentração de ureia dos moluscos expostos a 40 mg x 20mg com 14 dias de exposição ao CaCO3. Na exposição a 60 mg a concentração de ureia diminuiu a partir de 21 dias. As análises apontaram para diferenças significativas (p<0,05) na concentração de ácido úrico. A concentração de ácido úrico aumentou na exposição a 20 mg e diminuiuna em 40 mg com 1 dia de exposição ao CaCO3 em relação ao controle. A partir de 21 dias de exposição a 60 mg de CaCO3 a concentração de ácido úrico diminuiu em relação ao controle. Houve aumento de ácido úrico na exposição a 80 mg de CaCO3 com 30 dias de exposição comparado ao controle. A comparação entre grupos revelou aumento de ácido úrico na exposição a 20 mg x demais; diminuição em 40 mg x 60 mg, 80 mg e 100 mg de CaCO3 com 1 dia. Aos 14 dias de exposição a 60 mg x demais a concentração de ácido úrico diminuiu. Com 21 dias de exposição a 20 mg e 40 mg x 60 mg e 80 mg a concentração de ácido úrico aumentou, assim como em 100 mg x 60mg e 80 mg de CaCO3. A exposição por 30 dias a 80 mg x 20 mg, 40 mg e 60 mg resultou em aumento na concentração de ácido úrico. Foi observado aumento na concentração de creatinina na exposição à maioria das concentrações testadas de CaCO3 em relação ao controle. A comparação entre grupos mostrou aumento na concentração de creatinina nos moluscos expostos a 40 mg de CaCO3 x demais concentrações testadas, com 1 dia. Houve aumento na concentração de creatinina na exposição a 100 mg de CaCO3 comparado a maioria das concentrações testadas, a partir de 14 dias. Foi analisado a influência dos diferentes períodos de exposição à mesma concentração de CaCO3 nas concentrações de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina. As análises revelaram que a concentração de proteínas totais diminuiu a partir de 14 dias na exposição a 57 40 mg de CaCO3. A exposição por 30 dias a 60 mg e 80 mg de de CaCO3 resultou em aumento na concentração de proteínas totais. A concentração de ureia diminuiu a partir de 14 dias nas exposições a 20 mg e 40 mg de CaCO3. A exposição em 60 mg de de CaCO3 apontou para diminuição na concentração de ureia a partir de 21 dias. Em relação à concentração de ácido úrico foi observado aumento na exposição a 60 mg a partir 21 dias, em 80 mg com 30 dias e em 100 mg com 14 e 21 dias de exposição ao de CaCO3. Já a concentração de creatinina diminuiu nas exposições a 20 mg e 60 mg a partir de 14 dias e teve aumento aos 30 dias de exposição a 40 mg e 80 mg de de CaCO3. Tabela 1. Concentração de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina (mg/dL) na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a diferentes concentrações de CaCO3 (mg/L) Controle 20 mg/L 40 mg/L 60 mg/L 80 mg/L 100 mg/L 1º 2,20 4,20a 5,43aBCD 4,43a 4,23aD 4,93a dia ±0,26 ±0,52 ±0,47 ±0,92 ±0,90 ±0,60 14º 1,96 4,10a 3,70ae 4,80a 5,20aD 5,16a dia ±0,15 ±0,40 ±1,17 ±0,60 ±0,75 ±1,00 Proteínas Totais 21º 2,63 4,86a 3,56f 4,26aD 4,76aD 5,46a dia ±0,40 ±1,11 ±0,45 ±1,16 ±1,30 ±0,15 30º 2,13 2,13ae 3,33def 5,76ae 7,40af 5,43a dia ±0,15 ±0,15 ±0,20 ±0,92 ±0,52 ±1,47 1º 18,33 8,66aBC 10,00adefBCD 7,00aCD 6,33a 6,33a dia ±0,57 ±0,57 ±1,73 ±1,73 ±0,57 ±1,15 14º 17,33 5,66ad 6,33a 8,33aCD 6,66a 7,66a dia ±1,15 ±0,57 ±1,15 ±1,15 ±1,15 ±0,57 Uréia 21º 18,33 5,66d 6,66ad 4,00aef 7,66a 6,66a dia ±0,57 ±1,15 ±0,57 ±1,00 ±0,57 ±0,57 30º 18,66 8,00ad 6,66a 4,33aef 8,00a 8,33a dia ±0,57 ±1,00 ±1,15 ±0,57 ±1,00 ±0,57 1º 8,43 12,83acdefBCD 6,30adefBCD 8,30eBC 9,13fCD 8,13BC dia ±0,58 ±0,58 ±0,10 ±0,17 ±0,37 ±0,23 14º 8,76 8,73d 8,43d 5,20aefCD 8,33D 8,96 dia ±0,60 ±0,25 ±0,15 ±0,10 ±0,25 ±0,15 Ácido Úrico 21º 9,20 8,56de 8,53de 6,33aefD 7,66afD 9,03 dia ±0,45 ±0,35 ±0,35 ±0,49 ±0,20 ±0,15 30º 8,73 8,43e 8,20e 8,30e 10,30a 8,30 dia ±0,23 ±0,41 ±0,00 ±0,20 ±0,26 ±0,30 1º 0,13 0,21acdeBCD 0,36adefBCD 0,27aefCD 0,05afD 0,22a dia ±0,05 ±0,00 ±0,01 ±0,01 ±0,00 ±0,00 14º 0,13 0,06acdfC 0,13defCD 0,22aeCD 0,05afD 0,26a dia ±0,05 ±0,00 ±0,00 ±0,01 ±0,01 ±0,01 Creatinina 21º 0,10D 0,13cdefD 0,05fD 0,05f 0,03afD 0,24a dia ±1,69 ±0,01 ±0,00 ±0,01 ±0,00 ±0,01 30º 0,16 0,03acef 0,43adef 0,03aef 0,15f 0,22a dia ±0,05 ±0,00 ±0,01 ±0,00 ±0,01 ±0,01 Letras minúsculas - diferença estatística, na concentração de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina nos grupos expostos às diferentes concentrações de CaCO3, mesmo dia (p<0,05; ANOVA) Letras maiúsculas - diferença estatística, na concentração de proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina nos grupos expostos a mesma concentração de CaCO3, em dias diferentes (p<0,05; ANOVA) 58 5.2.4. Discussão No presente estudo a exposição à diferentes concentrações de CaCO3 promoveu aumento na concentração de proteínas totais na hemolinfa de B. glabrata. Análises da concentração de proteínas totais pode auxiliar no entendimento de respotas metabólicas desse molusco. Quando infectado por larvas de S. mansoni foi observado que B. glabrata entra em estado de inanição devido a contínua remoção dos depósitos de carboidratos e a manutenção dos seus processos metabolicos vitais é mantida com a utilização de substratos alternativos para obter energia (BECKER, 1980; PINHEIRO et al. 2009; TUNHOLI et al. 2011). As proteínas são exemplos de substratos alternativos utilizados na obtenção de energia, o que resulta em elevação dos conteúdos dos produtos nitrogenados de degradação, como a ureia, ácido úrico e amônia, em resposta a extensa degradação de proteínas e aminoácidos. Em relação aos produtos nitrogenados de excreção, os resultados deste estudo mostraram que a concentração de ureia diminuiu na exposição a todas as concentrações de CaCO3 testadas, enquanto que a concentração de ácido úrico aumentou com 1 dia de exposição à 20 mg, apresentando redução nos outros períodos. Foi observado que a concentração de ureia diminuiu e a de ácido úrico aumentou na exposição à 60 mg a partir de 21 dias de exposição ao CaCO3. Nas outras concentrações de CaCO3 testadas, a concentração de ácido úrico aumentou ou se manteve constante ao longo de 30 dias, o que sugere um padrão uricotélico de excreção. Estes resultados são corroborados por Rupprecht et al. (1989), ao descreverem que a síntese máxima de uréia é inversamente proporcional a concentração de proteínas e ácido úrico. Apesar do aumento na concentração de proteínas totais, os resultados referentes às concentrações de ureia e ácido úrico sob influência do CaCO3 sugerem que B. glabrata apresentou respostas semelhantes de quando infectado por S. mansoni segundo os estudos de Becker (1980) e Meyer (1986). No entanto, trabalhos realizados com esta espécie infectada por Echinostoma paraensei (TUNHOLI et al. 2011), por Angiostrongylus cantonensis (TUNHOLI-ALVES et al. 2012), bem como, expostos à concentrações subletais do látex de Euphorbia milii (MELLO-SILVA et al. 2011), contaram com diminuição na concentração de proteínas totais e a ureia como produto nitrogenado de excreção. A exposição de B. glabrata à diferentes concentrações de CaCO3 neste estudo apontou para aumento na concentração de creatinina na maioria das concentrações testadas comparado ao controle. Apesar de não contarmos com o amparo da literatura no referente a trabalhos que 59 avaliaram a concentração de produtos nitrogenados sob influência de CaCO3, os resultados deste estudo sugerem ativação do ciclo da ureia tendo creatinina como produto final. Conclui-se com este estudo que a exposição de B. glabrata às concentrações de CaCO3 testadas promoveram alterações no metabolismo das proteínas e produtos nitrogenados de excreção. As alterações mais expressivas foram observadas nas exposições a partir de 60 mg de CaCO3. Em relação à influência dos períodos, alterações metabólicas ocorreram a partir de 14 dias de exposição ao CaCO3. Com isso sugerem-se pesquisas comparativos com outras espécies de Biomphalaria nas mesmas concentrações e períodos no intuito de reforçarem os achados neste estudo. 5.2.5. Referências ALLEN, .PJ.; D’ANCI, K. E.; KANAREK, R.B. Creatine, brain functioning, and behavior. In: KANAREK, RB.; LIEBERMAN, H.R. 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O metabolismo dos corpos cetônicos, acetoaceato e β-hidroxibutirato, sob exposição CaCO3 parece indicar um relevante papel na produção de energia por atuarem como regulador do sistema redox no molusco. A exposição de B. glabrata às concentrações testadas de CaCO3 tornou o pH da hemolinfa e da água de condicionamento de molusco mais alcalino, o que provocou ajustes no metabolismo intrínseco intramolusco. A diminuição na concentração de ureia com aumento na concentração de ácido úrico, revelou um padrão uricotélico nas exposições às concentrações de CaCO3 testadas. A creatinina como produto do metabolismo intermediário da ureia teve suas concentrações aumentadas na maioria dos grupos testados. Sob diferentes concentrações de CaCO3, B. glabrata, apresentou as principais alterações metabólicas a partir de 14 dias de exposição, as concentrações 20mg e 40mg podem ser indicadas em experimentos que demonstram as menores alterações no metabolismo intermediário, sugerindo um equilíbrio dinâmico (steady-state) deste organismo para sua adaptação em situações de estresse, inclusive quando estiver sob infecção. Sob esta condição fisiológica comprovada na literatura, quanto maior a concentração de cálcio, menor será a liberação de cercárias de S. mansoni, podendo indicar que o próprio hospedeiro mobilize o cálcio na tentativa de combater o parasito. 64 7. REFERÊNCIAS ABÍLIO, F.J.P.; RUFFO, T.L.M.; SOUZA, A.H.F.F.; FLORENTIN, H.S.; JÚNIOR, E.T.O.; MEIRELES, B.N.; SANTANA, A.C.D. Macroinvertebrados bentônicos como bioindicadores de qualidade ambiental de corpos aquáticos da caatinga Oecologia Brasiliensis, v. 11, n. 3, p. 397-409. 2007. ALLEN, P.J.; D’ANCI, K.E.; KANAREK, R.B. 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Propionato Fumarato Acetoacetato Acetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Oxaloacetato Citrato Piruvato Malato 76 Propionato Fumarato Succinato Lactato Hidroxibutirato Acetoacetato Piruvato Oxaloacetato Citrato Cromatograma 3: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 20 mg de CaCO3 por 1 dia. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 4: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 40 mg de CaCO3 por 1 dia. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Acetoacetato Acetato Fumarato Succinato Lactato Hidroxibutirato Citrato Piruvato Malato Oxaloacetato 77 Propionato Fumarato Acetoacetato Acetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Citrato Piruvato Malato Oxaloacetato Cromatograma 5: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 60 mg de CaCO3 por 1 dia. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 6: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 80 mg de CaCO3 por 1 dia. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Acetoacetato Acetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Oxaloacetato Citrato 78 Propionato Acetoacetato Acetato Fumarato Hidroxibutirato Succinato Lactato Oxaloacetato Citrato Piruvato Cromatograma 7: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 100 mg de CaCO3 por 1 dia. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 8: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 20 mg de CaCO3 por 14 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Fumarato Lactato Hidroxibutirato Acetoacetato Succinato Citrato Piruvato 79 Propionato Fumarato Acetoacetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Malato Oxaloacetato Citrato Cromatograma 9: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 40 mg de CaCO3 por 14 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 10: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 60 mg de CaCO3 por 14 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Fumarato Acetoacetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Oxaloacetato Citrato 80 Fumarato Acetoacetato Lactato Hidroxibutirato Succinato Piruvato Oxaloacetato Citrato Cromatograma 11: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 80 mg de CaCO3 por 14 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 12: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 100 mg de CaCO3 por 14 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Fumarato Acetoacetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Oxaloacetato Citrato 81 Propionato Fumarato Succinato Lactato Hidroxibutirato Acetoacetato Piruvato Malato Citrato Cromatograma 13: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 20 mg de CaCO3 por 21 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 14: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 40 mg de CaCO3 por 21 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Fumarato Acetoacetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Malato Oxaloacetato Citrato 82 Propionato Fumarato β-hidroxibutirato Lactato Malato Oxalato Oxaloacetato α-cetoglurato Piruvato Cromatograma 15: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 60 mg de CaCO3 por 21 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 16: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 80 mg de CaCO3 por 21 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Fumarato Acetoacetato Lactato Hidroxibutirato Succinato Piruvato Oxaloacetato Citrato 83 Propionato Fumarato Hidroxibutirato Acetoacetato Lactato Succinato Citrato Piruvato Cromatograma 17: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 100 mg de CaCO3 por 21 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 18: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 20 mg de CaCO3 por 30 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Acetoacetato Fumarato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Malato Citrato 84 Propionato Fumarato Acetoacetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Malato Oxaloacetato Citrato Cromatograma 19: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 40 mg de CaCO3 por 30 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 20: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 60 mg de CaCO3 por 30 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Acetato Fumarato Acetoacetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Oxaloacetato Citrato 85 Propionato Acetoacetato Fumarato Hidroxibutirato Succinato Lactato Piruvato Citrato Oxaloacetato Cromatograma 21: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 80 mg de CaCO3 por 30 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 22: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata exposto a 100 mg de CaCO3 por 30 dias. (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Fumarato Acetoacetato Succinato Lactato Hidroxibutirato Piruvato Malato Oxaloacetato Citrato 86 Propionato Fumarato Hidroxibutirato Acetoacetato Oxaloacetato Citrato Piruvato Malato Cromatograma 23: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata, grupo controle de 1 dia (não exposto ao CaCO3), (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 24: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata, grupo controle de 14 dias (não exposto ao CaCO3), (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Propionato Acetoacetato Acetato Fumarato Hidroxibutirato Lactato Piruvato Malato Oxaloacetato 87 Propionato Acetato Fumarato Acetoacetato Hidroxibutirato Lactato Succinato Oxaloacetato Piruvato Malato Cromatograma 25: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata, grupo controle de 21 dias (não exposto ao CaCO3), (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). Cromatograma 26: Cromatograma de ácidos orgânicos na hemolinfa de Biomphalaria glabrata, grupo controle de 30 dias (não exposto ao CaCO3), (HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H2SO4). 88 8.2. PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA Comunicamos que o Protocolo n. 083/12, intitulado Metabolismo de Ácidos Orgânicos em Biomphalaria glabrata E B. straminea Sob Infecção de Schistosoma mansoni e Influência do Cálcio., foi Aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais/CEUAPRPPG-UFG. Reiteramos a importância desse Parecer Consustanciado, e lembramos que o(a) pesquisador(a) responsável deverá encaminhar à CEUA-PRPPG-UFG um Relatório Final baseado na conclusão do estudo e na incidência de publicações decorrentes deste, de acordo com o disposto na Lei nº. 11.794 de 08/10/2008, e Resolução Normativa nº. 01, de 09/07/2010 do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal-CONCEA. Atenciosamente, -............................................................................ Comissão de Ética no Uso de Animais/CEUA Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação/PRPPG Universidade Federal de Goiás/UFG (62)3521-1215 89 8.3. COMPROVANTES DE SUBMISSÃO DO MANUSCRITO SUBMISSION TO CBP PART B: BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY COMPLETED SUCCESSFULLY From: Comp Biochem Physiol Edit. Office <[email protected]> Date: 2014-03-08 10:09 GMT-03:00 Subject: Submission to CBP Part B: Biochemistry & Molecular Biology completed successfully To: Marina Clare Vinaud <[email protected]> Dear Dr. Vinaud: This email is to confirm that you have successfully completed your submission, titled INFLUENCE OF DIFFERENT CONCENTRATIONS OF CALCIUM ON THE TCA CYCLE OF Biomphalaria glabrata to CBP. Now that your submission is complete, we have disabled further access to it via the online submission form. This means that neither you nor any other person can access it. Your submission has been transferred to a 'secure holding tank' at CBP. Thus, the url we sent you in the first confirmation email will no longer work. This is to protect your anonymity and ensure the confidentiality of your submission, subject to the technical caveats that you agreed to at step 1 of the submission (i.e. that it is impossible to offer a 100% guarantee of confidentiality). 90 The secure holding tank where your submission has been transferred is inspected periodically by the staff at CBP. Once a staff member inspects it and verifies that your submission is complete, your manuscript is readable, and your submission is appropriate for this journal, it will be assigned a Manuscript ID number and an editor who will be in charge of it. You will receive email confirmation once an editor has been assigned and the editor determines that your submission is appropriate for the journal and merits having experts assigned to review it. This first stage of the review process could take several weeks. Note that your manuscript ID number will be different from the submission ID number your submission has been temporarily assigned, 15816, to uniquely identify it while it is awaiting final inspection in the secure holding tank at CBP. If you have questions about your submission, please contact "Comp Biochem Physiol Edit. Office" <[email protected]>. However please let a reasonable period of time elapse before making further inquiries (say at least 7 days), since the staff of CBP is not always able to inspect the submission holding tank on a daily basis. Sincerely, "Comp Biochem Physiol Edit. Office" <[email protected]>
