de dissertação em pdf - Pós

Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Estudo epidemiológico da Doença Infecciosa Bursal em
sistema industrial e alternativo de produção avícola:
Caracterização molecular do vírus, soroepidemiologia e
detecção de anticorpos em aves silvestres.
Priscila Sousa da Silva
Salvador-Bahia
2011
PRISCILA SOUSA DA SILVA
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO DA DOENÇA INFECCIOSA BURSAL EM
SISTEMA INDUSTRIAL E ALTERNATIVO DE PRODUÇÃO AVÍCOLA:
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS, SOROEPIDEMIOLOGIA
E DETECÇÃO DE ANTICORPOS EM AVES SILVESTRES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
graduação em Ciência Animal nos Trópicos, da
Escola
de
Medicina
Veterinária
da
Universidade Federal da Bahia, como requisito
para a obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal nos Trópicos, na área de Saúde
Animal.
Orientadora: Profa. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes
Salvador – Bahia
2011
Sistema de Bibliotecas da UFBA
Silva, Priscila Sousa da.
Estudo epidemiológico da doença infecciosa bursal em sistema industrial e alternativo de
produção avícola : caracterização molecular do vírus, soroepidemiologia e detecção de anticorpos
em aves silvestres / Priscila Sousa da Silva. - 2011.
98 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Lia Muniz Barretto Fernandes.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária,
Salvador, 2011.
1. Galinha - Doenças. 2. Ave silvestre - Doenças. I. Fernandes, Lia Muniz Barretto.
II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária. III. Título.
CDD - 636.5
CDU - 636.52/.58
Estudo Epidemiológico da Doença Infecciosa Bursal em Sistema Industrial e
Alternativo de Produção Avícola: Caracterização Molecular do Vírus,
Soroepidemiologia e Detecção de Anticorpos em Aves Silvestres
PRISCILA SOUSA DA SILVA
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal
nos Trópicos.
Salvador, 01 de abril de 2011.
Comissão Examinadora:
Profa Dra. Lia Muniz Barreto Fernandes – UFBA
Orientadora
Profa Dra. Maria Emilia Bavia – UFBA
Prof Dr. Roberto José Meyer Nascimento
PPGIm/Labimuno/ICS/UFBA
AGRADECIMENTOS
Eis uma tarefa difícil. A Deus agradeço todos os dias por estar viva e me dar a
oportunidade de aprender. Muitas pessoas foram imprescindíveis nas diversas etapas
desse trabalho e as colaborações, grandes ou pequenas, foram fundamentais. Outros
contribuíram com amizade, carinho e afeto, ingredientes importantíssimos para um bom
trabalho. Temendo esquecer alguém, deixo aqui meus sinceros agradecimentos a todos
que conviveram comigo nestes dois últimos anos. Gostaria de destacar algumas pessoas
que foram especialmente importantes.
Minha família, que sempre me incentivou e me apoiou, especialmente meus pais pelo
apoio e incentivo em todas as decisões da minha vida. Serei eternamente grata por todos
os ensinamentos...pelo todo e por tudo!
Minha orientadora Profa. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes, minha referência na
Medicina Veterinária, pela confiança depositada em mim, pelos ensinamentos, exemplo
de profissionalismo, amor à profissão e principalmente pelo incentivo à pesquisa. Meu
sincero agradecimento.
A Família LASAB: Paulo César Costa Maia, Izabella Ramos, Tatiane Sales, Rickson
Diego, Cynthia Oliveira, Inara Gonçalves, Jamille Lima, Nilson Santana, Vinícius
Satyro e, novamente, a Profa. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes, agradeço não só pela
ajuda, mas principalmente pela companhia e por tornar o laboratório uma parte da
minha casa.
Ao Médico Veterinário Pedro Lima pela disposição e boa vontade na coleta das aves
silvestres, especialmente por não me fazer desistir de acreditar.
À Brasil Foods, por autorizar a coleta de dados para execução de parte deste trabalho.
Todas as pessoas que conheci nas localidades visitadas durante a realização desse
trabalho, pela disponibilidade e satisfação em ajudar, especialmente ao Sr. Carlos,
sempre muito solícito em me acompanhar nas coletas.
À Thaís Batinga e Bruno Beltrão pela hospegadem e ajuda.
Lia Muniz Barretto Fernandes, minha grande amiga, obrigada por ter me ajudado, tanto
na universidade como na vida pessoal, e pelo convívio tão harmonioso e saudável que
tivemos durante esses anos. Obrigada por fazer parte da minha vida!
Meus amigos Aroldo Carneiro, Thadeu Mariniello, Mariana Coelho, Elitieri Neto, Thaís
Batinga, Davi Azevedo, Leane Gondim, Matheus Resende, Alan Caine, Vanessa Silva,
Cibele Barbosa, Ana Dávila, Bianca Lopes, Marajuce Silva, Silvério Júnior, Francisco
Gonçalves, Lucas Botelho, Pablo Moreno, Gustavo Rodamilans e família Pinho saibam
que vocês fizeram parte de uma das etapas mais importantes da minha vida. As
lembranças de nosso convívio esses anos, serão por mim eternizadas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
auxílio financeiro.
“Só se pode alcançar um grande êxito quando
nos mantemos fiéis a nós mesmos.”
Friedrich Nietzsche
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS..............................................................................................
ix
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... x
LISTA DE ABREVIAURAS...................................................................................
xi
RESUMO................................................................................................................... xii
SUMMARY...............................................................................................................
xiii
1. INTRODUÇÃO............................................................................................
14
A Doença Infecciosa Bursal.............................................................................. 14
Avicultura no Brasil e na Bahia........................................................................ 16
2. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................
18
2.1 Definição...........................................................................................................
18
2.2 Histórico e Distribuição Geográfica.................................................................. 19
2.3 Características do agente etiológico..................................................................
23
2.4 Epidemiologia...................................................................................................
28
Suscetibilidade..................................................................................................
28
Transmissão......................................................................................................
30
Patogenia..........................................................................................................
32
Sinais Clínicos e Lesões....................................................................................
35
2.5 Diagnóstico.......................................................................................................
39
2.6 Prevenção e Controle........................................................................................
44
Medidas gerais de prevenção e controle..........................................................
44
Medidas específicas de prevenção e controle...................................................
45
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS.............................................................................
51
3.1 Artigo 1.............................................................................................................
50
3.2 Artigo 2.............................................................................................................
72
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS.........................................................................
82
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................
83
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
Frequência de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal e detecção
viral através da PCR/RFLP em criações de frango de corte e galinhas de quintal
no polo avícola da Bahia.
Tabela 1. Distribuição dos títulos de anticorpos, coeficiente de variação, desvio-padrão
e frequência de anticorpos em frangos de corte nas duas regiões estudadas.
Tabela 2. Distribuição dos títulos de anticorpos, coeficiente de variação, desvio-padrão
e frequência de anticorpos em galinhas de quintal nas duas regiões estudadas.
Tabela 3. Detecção e caracterização do IBDV em frangos de corte e aves de
subsistência de duas regiões do polo avícola da Bahia.
ARTIGO 2
Detecção de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal em aves
silvestres no polo avícola da Bahia.
Tabela 1. Soropositividade para Doença Infecciosa Bursal em espécies de aves
silvestres.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em frangos de corte da
região de Feira de Santana com média de títulos evidenciada.
Figura 2. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em frangos de corte da
região de Alagoinhas com média de títulos evidenciada.
Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em galinhas de quintal
da região de Feira de Santana com média de títulos evidenciada.
Figura 4. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em galinhas de quintal
da região de Alagoinhas com média de títulos evidenciada.
LISTA DE ABREVIATURAS
IBD – Infectious Bursal Disease
IBDV – Infectious Bursal Disease Virus
OIE – Escritório Internacional de Saúde Animal
EUA – Estados Unidos da América
USDA – Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
vvIBDV – very virulent Infectious Bursal Disease Virus
RNA – Ácido Ribonucléico
RT-PCR – Reação de cadeia de polimerase com transcriptase reversa
IDGA – Imunodifusão em Gel de Ágar
ELISA – Ensaio Imunoenzimático
VN – Vírusneutralização
SPF – Specific Pathogen Free
SILVA, P.S. Estudo Epidemiológico da Doença Infecciosa Bursal em Sistema
Industrial e Alternativo de Produção Avícola: Caracterização Molecular do Vírus,
Soroepidemiologia e Detecção de Anticorpos em Aves Silvestres. Salvador, Bahia,
2011. 98p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia, 2011.
RESUMO
A Doença Infecciosa Bursal é uma enfermidade viral imunodepressora, altamente
contagiosa, causadora de perdas elevadas à indústria avícola por afetar direta ou
indiretamente o desempenho das aves. O monitoramento constante e o conhecimento a
respeito da cadeia epidemiológica da doença são fundamentais para a prevenção e o
controle de surtos, uma vez que o agente etiológico possui alta resistência no ambiente e
grande capacidade rearranjo genético, gerador de variantes virulentas. Este trabalho teve
o objetivo de investigar a freqüência de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa
Bursal em criações comerciais, em galinhas de quintal e em aves silvestres no pólo
avícola da Bahia; e realizar a reação em cadeia da polimerase - transcriptase reversa (RTPCR), para a detecção e tipificação das amostras virais circulantes. Para os testes
sorológicos em aves domésticas, foram coletadas 758 amostras de soro de frangos de
corte e 320 amostras de galinhas de quintal. Para a detecção e caracterização do vírus
nestas populações, foram coletados 6 pools de bursas de Fabrícius em frangos de corte e
3 pools em criações de subsistência, analisados posteriormente com PCR/RFLP. Os
resultados revelaram que não há proteção uniforme na criação comercial nas duas regiões
estudadas, sugerindo falha na vacinação e desafio com vírus no ambiente. Também
observou-se altos títulos em aves de subsistência não vacinadas, com variação nos títulos
de relacionada com desafios de campo. Nos testes moleculares verificou-se que 3 pools
de frangos de corte eram positivos, sendo dois para cepa vacinal (G3) e um para cepa
variante (G15). Nas criações de subsistência houve uma amostra positiva para cepa
variante (G15). Os resultados demonstram a necessidade de monitoramento em ambas
criações. Para verificar a presença de anticorpos contra a doença em aves silvestres,
foram coletadas 76 amostras de soro de aves de vida livre que circulavam nos arredores
dos aviários de frangos de corte, na região do pólo avícola da Bahia, para avaliação da
presença de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal. Foi encontrada
evidência sorológica da infecção por IBDV em 5 (6,6%) das amostras em uma das
espécies aviárias analisadas. Esses resultados sugerem a possibilidade que as aves
silvestres que circulam nos arredores dos aviários comerciais atuam como propagadoras
do IBDV na região. Este é o primeiro levantamento sorológico da IBD em aves silvestres
da Bahia.
PALAVRAS-CHAVE: Doença Infecciosa Bursal, frangos de corte, galinhas caipiras,
aves silvestres, ELISA, IDGA, RT-PCR.
SILVA, P.S. Epidemiological study of Infectious Bursal Disease in Industrial and
Village Poultry System: Molecular Characterization of Virus, Seroepidemiology and
Antibodies Detection in free-living wild birds. Salvador, Bahia, 2011. 98p. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade Federal da Bahia, 2011.
SUMMARY
Infectious Bursal Disease is an immunodepressing viral illness, highly contagious, that
causes losses to avian industry, as it affects, directly and indirectly, poultry performance.
Constant monitoring and knowledge regarding epidemiological chain are fundamental for
prevention and control of outbreaks, since the etiological agent is very stable and capable
of genetic ressortment that generates virulent strains. The aim of this study was to
investigate the frequency of antibodies anti-Infectious Bursal Disease Virus as well as to
detect the virus in broilers, small scale chickens, and free-living birds at Bahia’s poultry
production area, and perform RT-PCR to detect and classify circulating viral strains. For
serological tests in domestic poultry there were collected 758 serum samples from
broilers and 320 from free-ranging chickens. For virus detection and characterization
there were collected 6 bursal pools from broilers and 3 from free-ranging chickens, which
were further analyzed with PCR/RFLP. Results showed that there is no uniform
protection in commercial flocks, suggesting that it may be occurring vaccination errors
and that it may be occurring challenge from viruses at the environment. There were
observed high titers in no vaccinated free-ranging chickens, with titers varying related
with environmental challenge. Molecular tests revealed that 3 broilers pools were positive
in which 2 matched the vaccine strain (G3) and 1 a variant strain (G15). One sample from
free-ranging chickens was positive for the variant strain (G15). These results demonstrate
the need for monitoring both types of exploration. For evaluation of the presence of
antibodies anti-IBDV in wild birds, 76 serum samples were collected from free-living
birds circulating around the broiler aviaries in the region of Bahia’s most important
poultry production area, Serological evidence of IBDV infection was found in 5 (6.6%)
samples from one of the bird species analyzed. These finding suggests that these wild
birds can be responsible for spreading IBDV in the area. This is the first report of
serological survey of IBD in wild birds from Bahia State, Brazil.
KEY-WORDS: Infectious Bursal disease, broilers, free-ranging chickens, wild birds,
ELISA, IDGA, RT-PCR.
1. INTRODUÇÃO
A Doença Infecciosa Bursal
A Doença Infecciosa Bursal é uma enfermidade aguda e contagiosa, que se caracteriza
por causar danos imunológicos permanentes nas aves afetadas. Reconhecida há mais de
40 anos, a doença continua a causar muitos prejuízos à indústria avícola comercial em
todo o mundo. As perdas econômicas decorrentes desta enfermidade são muitas e
variadas e se devem à morbidade e mortalidade, à imunossupressão observada nas aves
sobreviventes, à ocorrência de doenças causadas por outros agentes, à redução da
habilidade das aves em responder às vacinações e ao risco de introdução da enfermidade
pela importação de produtos avícolas importados. O impacto econômico da doença é
influenciado pela patogenicidade da amostra do vírus, susceptibilidade da linhagem,
prevalência de outros patógenos, condições ambientais e práticas de manejo. A maioria
dos lotes comerciais é infectada com o vírus causador da doença nos primeiros dias de
vida, e nesses casos o efeito imunossupressor é ainda maior (SAIF, 1991; SHARMA et
al., 2000, NILIPOUR, 2006).
No Brasil e na Bahia, a Doença Infecciosa Bursal é endêmica e a indústria avícola tenta
reduzir as perdas adotando estratégias baseadas em programas de vacinação
diversificados e em medidas de biosseguridade. No entanto, nem sempre tais estratégias
alcançam a eficácia esperada, devido à falhas na aplicação da vacina e de medidas
gerais de prevenção. Salle (1989), avaliou os níveis de anticorpos maternos em pintos
de 1 dia de idade provenientes de quatro diferentes empresas avícolas do Rio Grande
do Sul, observando variação entre 7 e 100% na proteção por anticorpos maternos após o
desafio com uma amostra clássica do sorotipo 1 do vírus da IBD , aos 14 e 21 dias. O
autor concluiu que era fundamental investigar os programas de vacinação, métodos de
aplicações das vacinas, a cepa vacinal (suave, intermediária ou forte) e as doenças
intercorrentes.
Estudo preliminar realizado na Bahia revelou que os programas de vacinação adotados
para prevenção da Doença Infecciosa Bursal por empresas avícolas do polo avícola não
estavam atingindo a proteção esperada.
Os títulos obtidos na análise sorológica,
também sugeriram que estavam ocorrendo desafios de campo. Além de enfatizar a
importância da revisão dos programas de vacinação, os autores alertaram para a
necessidade de implantação de medidas de biosseguridade adequadas (MOURA &
MENDES, 2007).
A eficácia dos programas de vacinação utilizados contra Doença Infecciosa Bursal no
polo avícola da Bahia também foi avaliada por Lima (2010), que analisou integrações
de frango de corte de 4 empresas avícolas. Os resultados demonstraram que nenhuma
das empresas possuía esquema vacinal excelente, sendo que duas conseguiram
resultados bons, gerando títulos de anticorpos uniformes nas aves. A falta de
uniformidade nos títulos em outras duas empresas avaliadas levou à consideração de
que as aves comerciais vacinadas desses lotes avaliados estavam sofrendo desafio a
campo pelo IBDV.
A circulação do vírus da Doença Infecciosa Bursal no ambiente da criação, a presença
de vetores e hospedeiros, aumenta o desafio para os criadores. Como o vírus é altamente
resistente no ambiente e facilmente transmissível entre aves, a presença de aves que
sirvam como reservatórios é extremamente preocupante. Gonçalves (2009) observou a
presença de altos títulos de anticorpos para IBD em galinhas de quintal na Bahia e
alertou sobre a circulação do agente etiológico próximo aos ambientes de criação.
Avicultura no Brasil e na Bahia
No Brasil, a avicultura emprega mais de 4,5 milhões de pessoas, direta e indiretamente,
e responde por quase 1,5% do Produto Interno Bruto (PIB) nacional (UBA, 2009). De
acordo com a UBABEF, a produção de carne de frango chegou a 12,230 milhões de
toneladas em 2010, com crescimento de 11,38% em relação a 2009, quando foram
produzidas 10,980 milhões de toneladas. Com este desempenho o Brasil se aproxima da
China, hoje o segundo maior produtor mundial, cuja produção de 2010 somou 12,550
milhões de toneladas, abaixo apenas dos Estados Unidos, com 16,648 milhões de
toneladas, conforme projeções do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA). O
crescimento em 2010 foi impulsionado principalmente pelo aumento de consumo de
carne de frango e pela expansão de 5,1% nas exportações. Como resultado da produção
em 2010, o consumo per capita de carne de frango no Brasil foi de 44 quilos no ano
passado (UBABEF, 2011).
A maior parte da carne de frango é produzida por grandes empresas integradas ou
cooperativas que adotam práticas de manejo e controles rígidos de produção, sendo que
mais de 70% das aves abatidas são inspecionadas pelo Serviço de Inspeção Federal
(SIF) (ALVES, 2005).
Na Bahia o aumento da produção de grãos no oeste vem permitindo que o estado se
consolide como um importante produtor de carne de frango. A disponibilidade de
matéria-prima tem favorecido a expansão das granjas no estado, a exemplo do que
aconteceu nos estados do Centro-Oeste. O alojamento de pintos de corte na Bahia
cresce u 13,3% em 2009, totalizando 107,47 milhões de aves, duas vezes acima da
média nacional, que foi de 6,2%. Entre os estados que fazem parte da nova fronteira
agrícola (BA, MA, PI e TO), a Bahia se destaca como maior produtor de frango
(SEAGRI, 2011).
Considerando a importância da avicultura para o Brasil e o crescimento da atividade na
Bahia, bem como o impacto sócio-econômico da Doença Infecciosa Bursal, este
trabalho teve o objetivo de investigar a frequência de anticorpos anti-IBDV em criações
comerciais, em galinhas de quintal e em aves silvestres no pólo avícola da Bahia; e
realizar a reação em cadeia da polimerase - transcriptase reversa (RT-PCR), para a
detecção e tipificação das amostras virais circulantes.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Definição
A Doença Infecciosa Bursal (IBD), é uma enfermidade viral, aguda e altamente
contagiosa, resultante da infecção pelo vírus da doença infecciosa bursal (IBDV)
(CASTRO et al., 2009). A enfermidade acomete galinhas jovens, principalmente entre a
terceira e a sexta semana de idade, sendo considerada mundialmente uma doença
endêmica na avicultura comercial, podendo levar a perdas significativas (GENOVA,
2000; LIU et al., 2002; PHONG et al., 2003; TIWARI et al., 2003; KULÍKOVA et al.,
2004; DIAS, 2007).
Também conhecida com Doença de Gumboro, a IBD é caracterizada pela extensa
destruição dos órgãos linfóides, em particular da bursa de Fabrício, causando severo
efeito imunossupressor e aumentando a suscetibilidade a outras doenças (WANG et al.,
2008), podendo levar à infecções oportunistas e favorecer a ocorrência de outras
enfermidades virais, como a doença de Newcastle, Bronquite Infecciosa das Galinhas e
Laringotraqueíte (BANDA et al., 2003), além de reduzir a resposta à vacinação das aves
(MÜLLER et al., 2003; PHONG et al., 2003). Como consequência da infecção, o lote
afetado geralmente apresenta-se desuniforme devido à perda de peso (BANDA et al.,
2003). O impacto econômico da Doença Infecciosa Bursal é influenciado pela
virulencia da cepa do vírus, suscetibilidade das aves do lote, intercorrencias de
patógenos primários e secundários além de fatores ambientais e de manejo (MÜLLER
et al, 2003).
A Doença Infecciosa Bursal é considerada pelo Escritório Internacional de Saúde
Animal (OIE) uma enfermidade transmissível, importante do ponto de vista sócioeconômico e/ou sanitário a nível nacional, e internacional, no comércio de animais e
produtos de origem animal (OIE, 2004).
2.2 Histórico e Distribuição Geográfica
A Doença Infecciosa Bursal emergiu na região de Delmarva (EUA), no final da década
de 50, como uma enfermidade aguda, causadora de alta morbidade e mortalidade em
frangos de corte. A primeira descrição deste surto foi feita por Albert Cosgrove, no ano
de 1962, relatando casos ocorridos na localidade de Gumboro, estado de Delaware
(EUA). O consenso inicial era de que a nefrose aviária, ou Doença de Gumboro, era
causada por uma variante do vírus da Bronquite Infecciosa (amostra Gray) devido às
alterações renais encontradas. Como se percebeu depois, o equívoco se deu porque as
duas infecções aconteciam simultaneamente em muitos casos e o agente etiológico era
difícil de isolar usando as ferramentas disponíveis no momento (LASHER & DAVIS,
1997; LOJKIC et al., 2003; AL-NATOUR et al., 2004). Um dos esforços mais intensos
para identificar o agente responsável pela Doença de Gumboro foi iniciado pelo grupo
dos laboratórios L&M, em Marykand (EUA), que determinou que o agente causador da
enfermidade era muito diferente do vírus da Bronquite (LASHER & DAVIS, 1997). O
nome Doença Infecciosa Bursal, utilizado atualmente, se deve ao reconhecimento de
que a bursa de Fabricius era o alvo principal do vírus causador da enfermidade
(BERNARDINO & LEFFER, 2009; ITO et al., 2001; LUKERT & SAIF, 2003).
Nas décadas de 60 e 70, a Doença Infecciosa Bursal foi diagnosticada em diferentes
regiões dos EUA (LEFFER, 2004). Em princípio, a prevalência da doença clínica foi
reduzida com a introdução de vacinas vivas, a partir de 1966. A primeira vacina contra
o IDBV foi preparada por Edgard na Universidade de Auburn. Essa vacina foi chamada
apropriadamente de “não atenuada” porque continha uma suspensão de bursas obtidas
de aves infectadas com um isolado de campo. Esta não foi apenas a primeira vacina
para uso no campo, mas o primeiro e único produto derivado de bursas aplicado
diretamente. Foi usado com sucesso em mais de 3 milhões de aves. A vacina satisfazia
uma importante necessidade no momento, controlando a mortalidade por IBD. No
entanto, havia a necessidade de desenvolver vacinas mais apropriadas, uma vez que o
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) julgava arriscado o
movimento para a utilização da vacina de Edgard em vários estados americanos,
considerada por ele como uma “infecção planejada” (LASHER & DAVIS, 1997).
Novas pesquisas levaram ao desenvolvimento de vacinas inativadas, no final da década
de 70. No entanto, no início da década de 80, ainda eram identificados sinais severos da
doença nos EUA, bem como casos de imunodepressão sem demonstração de sinais
clínicos, principalmente na área avícola de Delaware (VILLEGAS & BANDA, 2001).
Novos isolamentos, realizados a partir de surtos com sinais clínicos e mortalidade,
inclusive em aves adultas, demonstraram grandes alterações na estrutura antigênica das
proteínas do vírus causador da enfermidade (CHETTLE et al., 1989). As falhas vacinais
relatadas em vários países nos anos de 1986 e 1987 foram atribuídas às novas variantes
virais detectadas (JACKWOOD & SAIF, 1987; SNYDER et al., 1992).
Em 1986 surgiu na Europa uma variante muito virulenta do vírus da Doença Infecciosa
Bursal (vvIBDV). Esta amostra demonstrou-se altamente patogênica, sendo capaz de
causar infecção em lotes de frangos de corte detentores de altos títulos de anticorpos
maternais, e se disseminou rapidamente entre vários países europeus, causando perdas
econômicas sérias e mortalidade de até 100% nas aves (ABDEL-ALIM et al., 2003;
BOLIS et al., 2003; ZORMAN-ROJS et al., 2003).
A partir da primeira descrição a enfermidade já foi relatada em Cuba e Chile (NODA et
al., 2005); Brasil ( PAULA et al., 2004); Uruguai (HERNÁNDEZ et al., 2006);
Argentina (REMORINI et al., 2006); Croácia (LOJKIC et al., 2003); República
Dominicana (PAGÈS-MANTÉ et al., 2000); Polônia e Hungria (DOMANSKA et al.,
2004); China (LIU et al., 2002); Coréia (JEON et al., 2008); Malásia (TAN et al., 2004);
Paquistão (LONE et al., 2009); Egito (HASSAN, 2004); Nigéria (OKOYE & ABAADULUGBA, 1998); e Tanzânia (KASANGA et al., 2007). Esses relatos demonstram
que o IBD já foi isolado em praticamente todos os continentes.
No Brasil a enfermidade foi descrita pela primeira vez por Nakano et al. (1972), e o
primeiro relato de isolamento viral foi feito por Saukas, em 1978. Os primeiros surtos
da Doença Infecciosa Bursal no Brasil ocorreram em Minas Gerais e foram
considerados de alta patogenicidade. No entanto, até meados da década de 90, a
predominância dos casos era da forma subclínica, com atrofia da bursa e problemas
secundários decorrentes da imunossupressão, sendo que as vacinas comerciais de
mercado conferiam proteção satisfatória (LEFFER, 2004; DIAS, 2007).
No início da década de 80 a vacinação com estirpe atenuada em células (Lukert) passou
a ser realizada no nosso país, e, em meados desta, ocorreu a introdução das vacinas
oleosas nas reprodutoras, mantendo-se a utilização de vacinas suaves na progênie, e
introduzindo-se vacinas intermediárias para revacinações. Com objetivo de imunizar
aves com altos títulos de anticorpos passivos, foram introduzidas para revacinações, na
década de 90, as vacinas do tipo “forte” (CBMforte) (MICHELL, 2007).
No ano de 1997, foi diagnosticada no estado de São Paulo a forma altamente virulenta
da IBD (vvIBD), em criações de aves de postura e corte, com mortalidade alta e
sintomatologia clínica da doença. Em posterior identificação, através da similiaridade
antigênica, genética e de patogenicidade, foi comprovada a semelhança com a cepa
muito virulenta européia (DI FÁBIO et al., 1999; BERNARDINO & LEFFER, 2009).
Banda & Villegas (2004) caracterizaram geneticamente isolados brasileiros a partir da
cepa vvIBDV e encontraram maior similaridade com isolados europeus do que com
isolados americanos, sugerindo que a origem da variante brasileira seja européia.
Quatro anos após a identificação inicial da vvIBD em São Paulo, sua ocorrência foi
relatada em todos os estados do país, até mesmo nas localidades mais distantes com
pouca avicultura industrial, constituindo um problema que obriga as empresas avícolas
a adotarem novas abordagens de prevenção com relação a biosseguridade e programas
de vacinação (TESSARI et al., 2000; DI FÁBIO, 2002).
2.3 Características do agente etiológico
A Doença Infecciosa Bursal (IBD) é causada pelo vírus da doença infecciosa bursal
(IBDV), tem simetria icosaédrica, não é envelopado e possui diâmetro variando de 5565 nm. O genoma viral consiste em uma fita dupla de RNA bi-segmentada
(SCHRÖDER et al., 2000; OWOADE et al., 2004; COULIBALY et al., 2005), o que
permitiu sua classificação dentro de uma nova família de vírus, a Birnaviridae, sendo
considerada o protótipo do gênero Avibirnavirus (LEONG et al., 2000). Os vírus
pertencentes à família Birnaviridae não infectam mamíferos e, são classificados em 3
gêneros: Aquabirnavirus, onde está classificado o Infectious pancreatic necrosis vírus
(IPNV) que acomete salmonídeos e trutas; Avibirnavirus, constituído apenas pelo IBDV
que infecta somente galinhas e Entomobirnavirus, incluindo o Drosophila X vírus que
infecta Drosophila melanogaster (DOBOS et al., 1995).
Os birnavírus replicam-se no citoplasma causando leve depressão nos processos
celulares de transcrição e tradução, sendo o mRNA viral transcrito por uma RNA
polimerase dependente de RNA associada ao virion (MURPHY et al., 1999).
O IBDV possui morfologia hexagonal e seu genoma consiste de duas moléculas de
RNA fita dupla que são chamadas A e B (DIAS, 2007). O segmento A codifica as
proteínas virais VP2, VP3, VP4 e VP5, enquanto que a proteína VP1 é codificada pelo
segmento B (VAN DEN BERG, 2000). Dentro do segmento A, a VP2 e VP3 são
proteínas estruturais formadoras do capsídeo externo e interno, respectivamente (DIAS,
2007). A VP2 está relacionada com a antigenicidade do vírus, ou seja, expressão de
epitopos que induzem uma resposta de anticorpos. Por isso, os anticorpos gerados por
ela permitem efetuar sua diferenciação dos sorotipos e subtipos virais. A VP3 é a
principal responsável pela conformação estrutural do vírus e tem relação com antígenos
grupos específicos (ITO et al., 2001). A VP4 é uma protease viral, a VP5 é uma
proteína não-estrutural e ambas são responsáveis pela maturação das proteínas do
capsídeo e pela liberação do vírus na célula infectada (DI FÁBIO, 2001; MÜLLER et
al., 2003; KONG et al., 2004; LOMBARDO et al., 2000).
O segmento B codifica a proteína VP1, que possui atividade de polimerase e atua como
a RNA polimerase dependente de RNA, sendo responsável pela replicação e transcrição
do genoma do vírus nas células infectadas e, pelo encapsulamento das partículas virais
(MACREADIE & AZAD, 1993; DI FÁBIO, 2001; MÜLLER et al., 2003; KONG et al.,
2004; LOMBARDO et al., 2000). A VP1 encontra-se presente em pequenas
quantidades no virion como proteína livre (DIAS, 2007) e também está ligada ao final
do segmento do genoma viral (DIAS, 2007; MÜLLER et al., 2003). As proteínas da
VP1 formam um distinto subgrupo de RNA dependente da RNA polimerase.
O IBDV se multiplica nos tecidos linfóides, com predileção pela bursa de Fabricius
(SCHRÖDER et al., 2000; OWOADE et al., 2004; COULIBALY et al., 2005), podendo
destruir precursores de imunoglobulinas (AL-NATOUR et al., 2004). O agente é
altamente contagioso e imunossupressivo, causando morbidade e rara mortalidade em
galinhas com 3 a 6 semanas de idade.
O vírus é considerado altamente contagioso entre aves e entre lotes. A sua resistência no
meio ambiente e a ausência de imunidade são os principais fatores que facilitam a
contaminação entre galpões. O IBDV tem infectividade elevada, pois pequenas doses do
vírus são suficientes para instalação da infecção na ave. A virulência da cepa é variável
e à medida que aumenta a virulência desta aumenta também a mortalidade
(BERNARDINO & LEFFER, 2009).
Inicialmente, a maioria das variações na sequência de aminoácidos foi identificada em
uma região localizada na proteína VP2. Essa região tem a maior variação da sequência
de aminoácidos (KABELL et al., 2005; KASANGA et al., 2007) e por isso, é
responsável pela emergência de novas variantes de IBDV e, pelas diferenças de
antigenicidade e atenuação viral (MICKAEL & JACKWOOD, 2005). Contudo,
variações substanciais em VP1, VP3 e VP4 também foram detectadas (KABELL et al.,
2005; KASANGA et al., 2007). Mutações na VP1 são causas de variações antigênicas e
modificações de virulência in vivo e atenuações in vitro (ITO et al., 2001). Análises
filogenéticas indicam que o segmento B está relacionado com emergência de cepas
vvIBDV (MÜLLER et al., 2003).
Algumas estruturas e sequências são essenciais para a viabilidade do IBDV, enquanto
outras são específicas para cepas e tipos, incluindo sorotipos e patotipos. Cada
modificação na composição genética das proteínas estruturais e regulatórias, e/ou na
sequência poderia influenciar no ciclo viral, na especificidade ao hospedeiro e na
virulência da cepa (VAN DEN BERG, 2000).
Os vírus com genoma RNA segmentado, como o IBDV, possuem uma grande
diversidade genética devido a alta taxa de mutação da RNA polimerase e da possível
ocorrência de rearranjos entre os segmentos genômicos. Essas modificações podem
gerar tanto variações antigênicas quanto patogênicas, uma vez que podem alterar a
virulência do vírus (VAN DEN BERG, 2000).
Dois sorotipos são descritos para o IBDV: 1 e 2. O sorotipo 1 abrange os vírus que são
patogênicos para as galinhas. Os vírus pertencentes ao sorotipo 2 podem infectar
galinhas e perus, mas não são patogênicos para ambas as espécies (ASHARAF, 2005;
GARDIN, 2000; MAJÓ et al., 2002). No sorotipo 1 existem diferentes cepas que são
classificadas em clássica, variante antigênica, e muito virulenta (LOJKIC et al., 2008),
que expressam diferentes graus de patogenicidade (LIM et al., 1999). Dentro das cepas
clássicas encontram-se a grande maioria das amostras vacinais utilizadas em avicultura
(SAIF, 1999; ASHRAF, 2005).
Os critérios utilizados para a classificação das cepas do IBDV incluem patogenicidade,
antigenicidade e relação genética (ASHRAF, 2005). No Brasil, diferentes padrões de
vírus têm sido encontrados em várias regiões através de ensaios de enzimas de restrição
com sítios na região hipervariável da VP2, permitindo a diferenciação das cepas
variantes antigênicas, clássicas e altamente virulentas (IKUTA et al., 2001).
O conhecimento de tipos patogênicos dos IBDVs serve para estimar a relação que pode
ser estabelecida entre a exposição de uma ave ou lote ao vírus de campo ou vacinal,
com densidade populacional, eficiência do programa de vacinação e biosseguridade. O
resultado desta interação permitirá avaliar o tipo de vírus prevalente e a severidade da
doença induzida pelo vírus de campo em uma região, estado ou país (ITO et al., 2001).
O surgimento de cepas de maior virulência em criações industriais constitui um
problema para avicultura (DI FÁBIO et al., 1999), fato esse que impõe aos avicultores a
adoção novas abordagens de prevenção, no sentido de determinar vacinas, melhorar os
programas de vacinação e aplicar medidas de biosseguridade (TESSARI et al., 2001).
O IBDV é bastante estável e muito resistente à inativação por agentes químicos e
físicos, o que favorece a sua persistência no ambiente mesmo após a limpeza e
desinfecção (ITO et al., 2001). O vírus é inativado em tratamentos com pH alcalino
(12,0), porém permanece ativo em pH ácido (2,0); resiste à temperatura de 37°C por 90
minutos e 56°C durante 5 horas. O patógeno não é afetado por éter, clorofórmio,
aldeídos, fenol, etanol, amônia quaternária e misturas complexadas (BENTON et al.,
1967; VILLEGAS & BANDA, 2001; MORAES et al., 2005). Uma redução acentuada
na infectividade do vírus foi observada após o tratamento com 0,5% de formalina por 6
horas. O vírus é resistente à inativação por cozimento, e existe o risco de introdução em
criações de quintal através de produtos feitos com carne crua, já que o vírus pode estar
presente na carne de aves aparentemente saudáveis (LUKERT & DAVIS, 1974). Essa
resistência do vírus aos desinfetantes e compostos químicos acarreta longa
sobrevivência nas instalações, podendo persistir no galpão por 10 dias depois que as
aves infectadas são retiradas e pelo menos 52 dias na água, alimentos e fezes,
dificultando seu controle (VILLEGAS & BANDA, 2001; MAJÓ et al., 2002; MORAES
et al., 2005).
2.4 Epidemiologia
Suscetibilidade
As galinhas são hospedeiras naturais do IBDV, sendo susceptíveis ambos os sexos e
todas as raças (VAN DEN BERG, 2000). A manifestação clínica da doença é mais
evidente quando a infecção ocorre a partir da terceira semana de idade (SANTOS et al.,
2004). A imunidade maternal pode proteger a progênie até a terceira e quarta semanas
de vida. Pintos com menos de três semanas de idade e sem anticorpos maternos sofrem
severa imunossupressão, em alguns casos sem manifestação de sinais clínicos, podendo
resultar em aves com crescimento retardado e mortalidade (SHARMA, 1999). O
período de incubação pode ser muito curto e a duração da doença em torno de uma
semana, sendo a mortalidade observada por volta do terceiro dia após infecção
atingindo valor máximo entre três e sete dias, quando passa a declinar (TESSARI et al.,
2000).
Gallus domesticus é a única espécie de ave conhecidamente suscetível à doença clínica
e às lesões características causadas pelo IBDV. Outras espécies são suscetíveis à
infecção com o vírus, porém são resistentes às manifestações clínicas da doença
(SHARMA et al., 2000).
A doença é difundida nas aves domésticas, distribuída em todo o mundo e têm mais
importância para a indústria do que para as aves domésticas (LOJKIC et al., 2003; ALNATOUR, et al., 2004).
No Brasil, existem relatos de monitoramentos sorológicos para esses vírus na população
avícola industrial (ROMERO et al., 1989). No entanto, não existem estudos de
prevalência de anticorpos na população de aves criadas fora do sistema industrial, como
galinhas de terreiro e aves silvestres (SANTOS et al., 2008).
Altas taxas de amostras positivas contra o IBDV foram identificadas em criações de
galinha de quintal indicando que este vírus circulam amplamente na população de
galinhas de quintal. A circulação do IBDV pode ser considerada um risco à sanidade
avícola, considerando-se a capacidade de disseminação do agente viral (SANTOS et al.,
2008). Aves silvestres e ratos também podem servir de reservatório do vírus
(NILIPOUR, 2006).
Estudos sorológicos feitos por Wilcox (1983), evidenciaram uma infecção pelo sorotipo
1 em aves silvestres, sugerindo que essas aves participam da cadeia epidemiológica do
IBDV servindo de reservatório do vírus.
Kasanga et al. (2008) detectaram uma parte do genoma do vírus clássico e do vírus
muito virulento de provenientes de criações de pombos e de galinhas d’angola. Essa
relação de aves silvestres com galinhas demonstra que as aves silvestres podem estar
participando da epidemiologia da Doença Infecciosa Bursal naturalmente.
Jeon et al. (2008) investigaram a causa de mortalidade de aves silvestres na Coréia do
Sul. Das 107 aves de vida livre, de sete espécies distintas, encontradas mortas, cinco
apresentaram positividade para IBDV na reação de cadeia de polimerase com
transcriptase reversa (RT-PCR). A análise filogenética da sequência do gene VP2
revelou que a amostra do vírus encontrada nestas aves era semelhante à amostra muito
virulenta (vvIBDV) isolada de galinhas domésticas de regiões endêmicas. A inoculação
desta amostra em aves livres de patógenos específicos acarretou 60% de mortalidade e
severa atrofia bursal. Uma vez que quatro das cinco amostras positivas foram isoladas
de aves aquáticas, os autores sugeriram que estas aves possam atuar como reservatórios,
desempenhando papel importante na epidemiologia da IBD.
Transmissão
A ave infectada elimina o vírus para o ambiente por meio das fezes, sendo a transmissão
tida somente como horizontal. A disseminação do IBDV dentro de um lote de aves
ocorre pelas vias aéreas, digestiva e ocular, assim como, através de roupas, calçados,
material de limpeza e trabalho, cama e fezes de aves infectadas e também veículos
(WANG et al., 2007; VILLEGAS & BANDA, 2001; MORAES et al., 2005). Não há
evidência de transmissão via ovo e nem de que aves infectadas permaneçam portadoras
(VILLEGAS & BANDA, 2001; MORAES et al., 2005).
Cepas do IBDV isoladas de patos, gansos e pardais são patogênicas para galinhas apesar
de possuírem diferentes graus de patogenicidade. Essas aves podem servir como
possíveis veículos de transmissão do IBDV (WANG et al., 2007).
Aves silvestres, peixes ou insetos, carreadores assintomáticos ou aves com infecção
latente podem ter tido um importante papel no aparecimento das amostras
hipervirulentas (ITO et al., 2001).
O cascudinho (Alphitobius diaperinus) presente em muitos galpões de frangos é capaz
de servir como um reservatório para o IBDV (MCALLISTER et al., 1995; NILIPOUR,
2006). O vírus foi isolado de besouros adultos até 14 dias após a exposição, e foi
detectado nas larvas após 24h. O cascudinho vive em meio à cama do aviário,
principalmente ao redor dos comedouros e, também no solo (até 20 cm de
profundidade) e, encontra nos aviários, boas condições de sobrevivência, alimentandose de fezes, ração e animais mortos (ALVES et al., 2005).
Howie & Thorsen (1981) relatam a existência de uma cepa de IBDV isolada de um
conjunto de mosquitos Aedes Vexans presos ao sudoeste de Ontário. Apesar da cepa não
produzir sinais clínicos ou lesões graves após a infecção, ela induziu altos títulos de
anticorpos em galinhas inoculadas. Os autores sugeriram que a cepa isolada poderia ser
útil como uma estirpe vicinal, uma vez que é apatogênica.
O IBDV também foi isolado das fezes de um cão 24 e 48 h após a ingestão de tecidos
infectados com o vvIBDV. Embora o vírus recuperado nas fezes apresentasse taxa de
mortalidade menor do que o vírus original, as aves sobreviventes à inoculação
experimental tinham lesões claras IBD, indicando que o vírus afetou todas as galinhas
inoculadas. Cães alimentados com aves mortas infectados com vvIBDV, podem
desempenhar um importante papel como reservatório do vírus dentro das instalações, ou
a propagação do vírus facilmente de uma galinha de quintal para o outra (PAGÈSMANTE et al., 2004).
Patogenia
O sistema imune é responsável por conferir proteção às aves, evitando a entrada de
patógenos (SHARMA et al., 2000). Estes, por não encontrarem sua entrada impedida
pelas barreiras físicas ou controlados pelos mecanismos inatos de defesa, desencadeiam
uma resposta imune adaptativa que será mediada principalmente pelos linfócitos T,
linfócitos B e os macrófagos (GLICK, 1995; SHARMA et al., 2000). A imunidade
adaptativa é altamente específica para o agente que estimula seu desenvolvimento,
enquanto que a imunidade não-adaptativa ou inata é inespecífica. As células que
participam da imunidade específica retêm uma "memória" de seu encontro com os
patógenos mesmo depois deste ter sido eliminado do corpo e que a resposta imune
detectável diminuiu (SANTIAGO et al.,1999).
As imunoglobulinas (Ig), também conhecida como anticorpos, são secretadas pelos
linfócitos B, e constituem o principal componente da imunidade humoral. As aves têm
três classes principais de imunoglobulinas: IgM, IgG e IgA. A IgM é encontrada na
superfície da maioria dos linfócitos B e é o primeiro anticorpo produzido depois da
imunização primária. Com a evolução da resposta imune, as células produtoras de IgM
passam a produzir IgG ou IgA. A IgA tem importância fundamental na indução da
imunidade de mucosa. A IgG é o principal anticorpo produzido depois da imunização
secundária e é a classe de Imunoglobulina predominante no sangue, também
denominada de IgY quando extraída da gema de ovos. (HIGGINS & WARR, 2000).
Para proteção de aves contra desafios ou agente infeccioso, quatro tipos de imunidade
são importantes. Elas são: anticorpos circulantes ou humorais, imunidade produzida
localmente no trato respiratório ou intestinal, imunidade mediada por células – T e a
imunidade de origem materna. Anticorpos humorais são produzidos em resposta à
infecção ou pela vacinação. A imunidade mediada por células é considerada a mais
importante na proteção contra os desafios, embora somente agora comecem a estar
disponíveis as técnicas que possibilitam o estudo da imunidade neste sentido. Os níveis
de anticorpos maternos declinam rapidamente. Em diversos locais da cabeça da galinha,
a glândula de Harder (GH), glândula lacrimal (GL) e conjuntiva têm demonstrado
conter elementos linfóides. Estes locais são denominados como Tecido Linfóide
Associado à Cabeça (HALT) e acredita-se que eles constituem um sistema imune
regional e, que quando o HALT está comprometido, a ave como um todo está
potencialmente em risco (MONTGOMERY et al., 1997).
Em condições naturais, o modo de infecção mais frequente do IBDV se dá pela mucosa
oral, porém as vias respiratórias e ocular também são usadas. Depois de quatro a cinco
horas da entrada do vírus no organismo do animal, por células mononucleares
fagocitárias, denominadas macrófagos e células linfóides do ceco, duodeno e jejuno,
bem como nas células de Kupfer do fígado (SHARMA et al., 2000). Nesses sítios
podem ser observadas alterações funcionais importantes que resultarão em
gastroenteropatias com eliminação de fezes aquosas e, principalmete, imunodeficiência
local (ITO at al., 2001). Ao cair na corrente sanguínea, aproximadamente onze horas
após a infecção, o agente viral infecta inicialmente a bursa, afetando sua morfologia e
fisiologia, destruindo células linfóides nas regiões medulares e corticais foliculares
(SHARMA et al., 2000). Posteriormente, uma segunda viremia ocorre e se estende aos
órgãos como baço, timo e glândulas de Harder (MÜLLER et al., 2003; BERNARDINO
& LEFFER, 2009). Os antígenos virais podem ser encontrados no fígado e rim nas
primeiras horas de infecção (SHARMA et al., 2000) e, na bursa, até nove dias pósinfecção (MÜLLER et al., 2003; BERNARDINO E LEFFER, 2009).
O IBDV destrói os linfócitos B e ativa outras células imunes. As aves expostas ao vírus
são acometidas por uma imunodepressão transitória, mas que pode comprometer tanto a
resposta humoral quanto a celular. A inibição da imunidade humoral ocorre pela
destruição das células produtoras de imunoglobulinas pelo vírus. Os efeitos
imunossupressivos podem atingir as aves a partir da terceira semana de idade e tende a
desenvolver uma perda parcial ou permanente das funções do sistema imune, levando a
diminuição do desempenho destas aves e danos para sua saúde (ITO et al., 2001;
MARTINS et al., 2005)
A doença pode apresentar a forma clínica ou aguda, com mortalidade variável, e a
forma subclínica, sem mortalidade (ITO et al., 2001; SANTOS et al., 2004).
A
patogênese e a resposta imune causada pelo IBDV podem variar dependendo da idade
da ave infectada (RAUTENSCHLEIN et al., 2007). Aves a partir da terceira semana de
idade são mais sensíveis à doença clínica e aves com menos de três semanas de idade
são acometidas da doença subclínica com grave imunossupressão (ITO et al., 2001;
SANTOS et al., 2004; RAUTENSCHLEIN et al., 2007). O período de incubação da
doença é muito curto e os sinais clínicos são vistos entre dois a três dias após infecção
(ITO et al., 2001; SANTOS et al., 2004).
De acordo com Müller et al. (2003), o resultado de uma infecção pelo IBDV depende
geralmente da cepa, da quantidade de vírus infectante, da idade e da raça da galinha, da
rota de inoculação e da presença ou ausência de anticorpos neutralizantes. Como
consequência da alta taxa de mutação e variabilidade genética, as diferentes cepas do
IBDV apresentam disparidade em relação às propriedades antigênicas e patogênicas.
Sinais Clínicos e Lesões
Os sinais clínicos ocorrem em 10 a 20% das aves infectadas (MORAES et al., 2005) e
estão associados à doença aguda ou clínica e incluem anorexia, depressão, penas
arrepiadas, tremores, diminuição ingestão de água, desidratação, prostração, diarréia
com fezes de tonalidade esbranquiçada ou consistência aquosa, apresentando cloaca
suja e mortalidade variável (DI FÁBIO et al., 1999; SHARMA et al., 2000; BOLIS et
al., 2003; BANDA & VILLEGAS, 2004).
As lesões mais típicas dessa doença, nos três primeiros dias após a infecção são edema e
aumento de tamanho da bursa de Fabrícius, que é o órgão alvo do vírus, com ou sem
deposição de material gelatinoso na superfície da serosa e às vezes hemorrágica.
Existem cepas que causam severas hemorragias na bursa de Fabrícius. No período
subsequente, o edema desaparece e a bursa atrofia. As alterações da mesma sempre
estão presentes, independente de as aves apresentarem infecção clínica ou subclínica.
Na necropsia são evidenciadas hemorragias no tecido subcutâneo e, principalmente, nos
músculos das regiões das sobrecoxas e da coxas (NAGARAJAN & KIBENGE, 1997;
TESSARI et al., 2000; VAN DEN BERG, 2000; SANTOS et al., 2004). Lesões
hemorrágicas também estão presentes na porção glandular do proventrículo (STOUTE
et al., 2009). O baço encontra-se aumentado de volume e os intestinos mostram-se com
a mucosa espessa e com grande quantidade de muco. Os rins apresentam-se congestos,
aumentados de volume e com presença de uratos (TESSARI et al., 2000; SANTOS et
al., 2004).
A evolução das lesões microscópicas na bursa de Fabrícius se dá da seguinte maneira:
no primeiro dia pós-infecção pode ser observada degeneração de células linfóides,
início de afluxo de heterófilos e/ou células mononucleares e hiperemia. A partir do
segundo ao terceiro dia, visualiza-se necrose folicular com acúmulo significativo de
células inflamatórias, exsudato plasmático e, às vezes hemorragias. De modo geral, a
atrofia folicular começa no ápice da cripta e a partir de quatro dias em diante, verificase atrofia folicular com depleção linfóide e formação de cavidade cística, mais evidente
quando da infecção com o vírus mais patogênico (DI FÁBIO et al., 1999). Em outros
órgãos, há predomínio de alterações no período de dois a três dias pós-infecção e são
mais severos com vírus mais patogênicos. No baço, pode ser visualizada necrose de
bainha perarteriolar e ou acúmulo de células mononucleares na zona marginal e ou
infiltrado de heterófilo. No timo, observa-se linfocitólise e atrofia cortical. Na tonsila
cecal encontra-se infiltração aguda e predominante de heterófilos e linfocitólise. Já na
glândula de Harder, ocorre degeneração de plasmócitos e aumento de células
mesenquiais e fibroblastos. No rim aparecem aumentados e pálidos ou esbranquiçados,
observa-se também necrose tubular, nefrite e nefrose devido à desidratação. No fígado
nota-se degeneração de células de Kupffer (BOLIS et al., 2003).
As lesões post-mortem observadas incluem atrofia da bursa, desidratação e coloração
enegrecida dos músculos peitorais, ambas frequentemente associadas com hemorragias
na coxa. As aves que sobrevivem à fase aguda da doença eliminam o vírus e se
recuperam dos sinais clínicos. A inibição da função das células B e T causada pela
IBDV também é superada, e a bursa de Fabrício é recuperada (SHARMA et al., 2000).
Na forma subclínica, os sinais clínicos são moderados, manifestando com quadro de
retardo de crescimento, palidez de crista e barbela, sonolência discreta ou redução da
atividade geral. Devido a imunossupressão, as aves tornam-se mais susceptíveis a outras
infecções como: colibacilose, coccidiose, dermatite gangrenosa e doença de Marek. As
respostas vacinais também podem ser comprometidas devido à diminuição dos títulos
de anticorpos (SHARMA et al., 2000).
As cepas clássicas são caracterizadas pela indução de depressão, anorexia, penas
arrepiadas, tremores, diarréia esbranquiçada e aquosa, prostração e morte. Essas cepas
também induzem nefrite severa, bursite e atrofia da bursa (BANDA et al., 2003),
resultando em imunodeficiência e mortalidade moderada (WANG et al., 2007), podendo
chegar a 25% (VAN DEN BERG et al., 1991).
As cepas variantes antigênicas são mutações antigênicas da cepa clássica e possuem a
habilidade de induzir imunossupressão em aves com níveis adequados de imunidade
humoral. Elas causam uma rápida e severa atrofia da bursa de Fabrício, porém não
produzem sinais clínicos da doença. A presença da cepa variante em poedeiras
comerciais aumenta a suscetibilidade a outras doenças virais como a bronquite
infecciosa, doença de Newcastle e laringotraqueíte, assim como a ocorrência de
infecções oportunistas. Além disso, as aves apresentam redução no ganho de peso e,
consequentemente, desuniformidade do lote (BANDA et al., 2003).
As cepas atenuadas foram geradas a partir da adaptação das cepas clássica e cepas
variantes aos fibroblastos de embriões de galinha ou outras linhagens celulares, não
provocam doença em galinhas e são utilizadas para produzir vacinas vivas (LIM et al.,
1999).
As cepas muito virulentas podem causar dano severo na bursa de Fabrício, timo, baço e
medula óssea, e são caracterizadas por alta mortalidade, que variam entre 60-100%.
Essas cepas podem romper a imunidade conferida pelos anticorpos maternos, e apesar
de produzirem sinais clínicos semelhantes aos das cepas clássicas e possuírem o mesmo
período de incubação de 4 dias, a fase aguda é mais severa para as galinhas infectadas
(LIM et al., 1999; WANG et al., 2007).
2.5 Diagnóstico
Para que haja controle efetivo da Doença Infecciosa Bursal em determinada área
geográfica é fundamental que seja realizado o diagnóstico apropriado, uma vez que os
animais acometidos podem não apresentar sinais clínicos evidentes ou característicos. O
diagnóstico epidemiológico deve considerar informações a respeito de ocorrências
anteriores, sinais clínicos observados, morbidade, mortalidade e idade das aves afetadas
são fundamentais. A adoção rápida de medidas de controle e a redução de prejuízos
depende do conhecimento da cadeia epidemiológica da doença e do estudo de todos os
dados relacionados à ocorrência no plantel, avaliando as informações qualitativa e
quantitativamente do ponto de vista sanitário (BERNARDINO & LEFFER, 2009).
Para o diagnóstico presuntivo são utilizadas ferramentas como a necropsia, associadas à
provas laboratoriais, que são confirmatórias. O diagnóstico laboratorial pode ser direto,
por meio de isolamento viral, ou indireto, com técnicas sorológicas convencionais (DI
FÁBIO, 2002).
Inicialmente, o diagnóstico do IBDV era realizado pelo isolamento viral, pela
precipitação em gel de ágar e pelos métodos de microscopia eletrônica que detectavam
o vírus, mas não identificavam algumas de suas características antigênicas ou
patogênicas. Os métodos que empregam anticorpos monoclonais foram usados para
detectar IBDV e identificar a presença dos locais antigênicos (JACKWOOD et al.,
2003).
O diagnóstico sorológico é usualmente realizado através do teste de imunodifusão em
ágar gel (TAKASE et al., 1993), vírus-neutralização (WEISMAN & HITCHNER,
1978) ou ELISA (HOWIE & THORSEN, 1981). A imunodifusão em ágar gel é um
teste simples, mas a sensibilidade e especificidade podem variar entre laboratórios. O
teste de vírus-neutralização é altamente específico porém, laborioso e demorado,
requerendo estrutura laboratorial. Por isso não é utilizado na rotina de diagnóstico. O
ELISA é o ensaio comumente utilizado e é sensível, específico e quantitativo. Os kits
comerciais são viáveis para detectar anticorpos em amostras de soro. (JACKWOOD et
al., 1996; MARTINEZ-TORRECUADRADA et al., 2000; DEY et al., 2009).
A difusão de uma substância solúvel em um meio fluido é um processo pelo qual a
substância é transportada, de uma parte para outra, como resultado do movimento
molecular. Para realização do teste, o ágar é colocado em placa de Petri ou lâmina de
vidro. Em locais apropriados do gel são feitos orifícios em que se colocam volumes
precisos de soros a serem testados, bem como soluções-padrão. O recipiente é incubado
em câmara úmida até que ocorra a difusão (48 a 72 horas), sendo então determinada a
área do halo de precipitação formado (FERREIRA & ÁVILA, 1996).
O ELISA é o mais notável desses testes porque foi adaptado para examinar muitas
amostras em um curto intervalo de tempo (JACKWOOD et al., 2003). Desde os anos
80, o ELISA tem se tornado um método de diagnóstco de rotina fundamental para a
melhoria do manejo sanitário das granjas de frangos de corte, por demonstrar a resposta
imune em animais ou detectar anticorpos de maneira precoce, rápida, eficiente e
econômica, possibilitando assim identificar a existência de infecção em uma granja
independente da manifestação da enfermidade, observada no animal, através de
sintomas e lesões (DI FÁBIO, 2001).
O teste pode ser classificado, inicialmente, em ELISA de fase sólida ou fase líquida. O
ELISA de fase sólida é o teste comumente realizado em microplaca de 96 cavidades.
Ele compreende uma sequência de etapas de reação de subsequente lavagem. Em kits
comerciais, o antígeno já vem fixado na placa. Inicialmente coloca-se o soro sanguíneo
para teste da presença de anticorpos no soro. Os anticorpos presentes no soro fixam-se
ao antígeno na placa e a seguir procede-se a lavagem e os passos de revelação da
relação antígeno-anticorpo (VIDAL & RAZIA, 2001).
A sensibilidade e especificidade de um teste é essesncial para a interpretação do mesmo.
A sensibilidade mede a capacidade de um teste em detectar indivíduos com a infecção,
classificados como verdadeiros positivos e, a especificidade, mede a capacidade de um
teste em evitar resultados falso-positivos (ARAGON, 2007).
Independentemente do exame laboratorial solicitado é de extrema importância o envio
do histórico de vacinações, pois as vacinas vivas podem causar certo grau de lesão na
bursa (HOWIE & THORSEN, 1981). Na pesquisa de lesão através da histopatologia,
deve-se coletar bursa fechada, rins, proventrículo, fígado, baço e conservá-los em
formalina a 10 % (JACKWOOD & SOMMER, 2002). Para realização de provas
sorológicas deverão ser remetidos soros de no mínimo 20 aves do lote para realização
principalmente de ELISA e os soros devem ser límpidos e congelados a – 20 0C até a
realização do teste (HOWIE & THORSEN, 1981).
Os métodos de tipificação convencional incluem a vírus-neutralização (VN) e ensaio
imunoenzimático de captura do antígeno com anticorpos monoclonais (AC-ELISA).
Para a realização do teste de VN, as cepas de campo devem ser adaptadas a
desenvolver-se in vitro, porém, a maioria das cepas isoladas é difícil de adaptar ao
crescimento; além disso, as características antigênicas e patogênicas do vírus podem ser
modificadas durante os procedimentos de adaptação (BANDA et al., 2003). Além de
consumir muito tempo, a VN é um teste caro e requer replicação da cepa utilizada em
cultura de células SPF (JACKWOOD, 2004). O uso de técnicas moleculares cresceu
rapidamente devido à rapidez, exatidão, e versatilidade do AC-ELISA, bem como as
possíveis correlações com as propriedades antigênicas das cepas do IBDV. Os métodos
baseados em ácidos nucléicos são ferramentas úteis para detecção viral porque o vírus
pode ser detectado e tipificado sem o isolamento e propagação em culturas de células ou
ovos embrionados.
Estudos genômicos permitem analisar as mutações no cromossomo que ocorrem
naturalmente ou através de atenuações dos vírus de campo. Estes estudos permitem
estimar a virulência e antigenicidade dos diferentes vírus e avaliar a evolução dos
diferentes IBDVs (ITO et al., 2001).
Após o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR), testes diagnósticos
baseados nessa tecnologia foram criadas para o IBDV (JACKWOOD et al., 2003). A
PCR aliada à digestão por enzimas de restrição (RFLP) serve para identificar e avaliar
amostras de diferentes graus de patogenicidade, além de diferenciar isolados de campos
e vacinais (JACKWOOD & SOMMER, 2002; BANDA et al., 2003). Embora este teste
identifique somente um número relativamente pequeno dos nucleotídeos, é um teste
rápido e pode ser usado para testar um grande número de amostras para uma sequência
específica ou para uma mutação dentro dessa sequência. (JACKWOOD et al., 2003).
Através da análise dos resíduos de aminoácidos, foi possível reconhecer 13 padrões
distintos de vírus da doença infecciosa bursal, sorotipo 1. As vacinas comerciais são
classificadas em grupos 3, 4, 5, 6 e 9. Já os vírus de campo são classificados em grupos
7, 11, 14, 15, 16 e 17. A maioria dos vírus de campo do Brasil são classificados nos
grupos 15 e 16 (ITO et al., 2001).
Para prova de PCR devem ser coletadas bursas de Fabrícius de cinco a oito aves
acometidas, que devem ser congeladas para melhor conservação (JACKWOOD &
SOMMER, 2002).
Algumas lesões e sinais clínicos semelhantes à aqueles induzidos pelo IBDV podem ser
encontrados em várias outras doenças, portanto é necessário considerar o diagnóstico
diferencial para algumas enfermidades (BOLIS et al., 2003). Clinicamente a IBD
confunde-se com a coccidiose, devido à prostação e penas arrepiadas e, à doença de
Newcastle, devido a mortalidade. Quadros de nefrite/nefrose devem ser diferenciados
da Bronquite Infecciosa e, lesões no proventrículo devem ser diferenciados da Doença
de Newcastle e Anemia Infecciosa. Deve ser feito diagnóstico diferencial no quadro de
atrofia da bursa para a Doença de Marek (ITO et al., 2001; BOLIS et al., 2003).
2.6. Prevenção e Controle
Medidas gerais de prevenção e controle
Devido à alta resistência do IBDV às condições ambientais e à sua distribuição global,
medidas de biosseguridade associadas à vacinação são essenciais para o controle e
prevenção da IBD, que têm sido um dos grandes desafios da avicultura mundial (DIAS,
2007).
Em produção de aves, o programa de biosseguridade requer o desenvolvimento e
implementação de um conjunto de políticas e normas operacionais eficazes que terão a
função de proteger as aves contra a introdução de qualquer tipo de agentes infecciosos,
tais como vírus, bactérias, fungos e/ou parasitas (SESTI, 2005).
Programas de biosseguridade são compostos por várias etapas de manejo e têm como
objetivo a redução da introdução de microrganismos patogênicos, responsáveis pelos
riscos de enfermidade aguda ou crônica em plantéis de frango de corte (ANDREOTTI
& GUIMARÃES, 2003). De acordo com SESTI (2005), a implantação de bons
programas de biosseguridade inicia-se na elaboração de ações de controle a serem
estabelecidas e seguidas nas normas específicas e findam na sua aplicação prática no
campo e nas atividades diárias. Antes da elaboração e implantação de qualquer
programa de biosseguridade, é necessário que seja realizada uma análise e definição dos
riscos e desafios aos quais o sistema de produção está sujeito.
No entanto, para o êxito de um programa de biosseguridade na prevenção e controle das
doenças aviárias nas granjas, é necessária uma ação de educação continuada,
envolvendo a participação de todas as pessoas que atuam na produção, por intermédio
da orientação técnica aos funcionários e a confiança dos empresários (SESTI, 2005).
Para estabelecer um programa de controle é importante caracterizar as propriedades
antigênicas e virulentas das cepas prevalentes em determinada área geográfica. Depois é
necessário desenvolver métodos rápidos e acurados para tipificar as diferentes cepas de
IBDV (BANDA et al., 2003).
Medidas específicas de prevenção e controle
O IBDV é altamente infeccioso e muito resistente e, por isso, a vacinação torna-se
indispensável para proteger as galinhas, pois existe elevada pressão da infecção durante
a primeira semana vida (MÜLLER et al., 2003). A imunização é o principal método
utilizado para o controle da IBD em frangos, porque as aves infectadas montam uma
resposta imunológica vigorosa, e acredita-se que esta resposta de anticorpos
desempenha um importante papel na defesa contra a doença (RAUTENSCHLEIN et al.,
2003; WANG et al., 2008). A estratégia de controle contra o IBDV em galinhas consiste
em hiperimunizar matrizes para que possam ser transmitidos altos níveis de anticorpos
maternos para a progênie. Os anticorpos maternos garantem a proteção durante as
primeiras semanas de vida da ave, e a proteção contra o IBDV se mantém através da
administração da vacina com vírus vivo antes dos anticorpos maternos chegarem a
níveis de subproteção (CORLEY et al., 2002; MÜLLER et al., 2003).
O controle da doença é complexo devido ao grande número de variáveis envolvidas
como, por exemplo, a produção de aves de diferentes idades, as características do vírus,
os níveis irregulares de anticorpos, os tipos de vacinas. Estas fazem com que seja
alcançado apenas um controle parcial da atividade do vírus na granja. Todas essas
variáveis, juntamente com a ocorrência de surtos causados por novas cepas do IBDV
com grande patogenicidade, fazem com que o controle da enfermidade seja mais difícil
e as medidas de biosseguridade a serem aplicadas se tornem fundamentais (PAGÈSMANTE et al., 2004).
Ismail & Saif (1991) demonstraram que a vacinação com um subtipo do sorotipo não
protege aves contra outra variante do mesmo sorotipo, particularmente quando a dose da
vacina contém baixos títulos do vírus. A rápida identificação das cepas do IBDV é um
pré-requisito para o efetivo controle desta doença de importância econômica para aves
comerciais, com aplicação de programas de imunoprofilaxia apropriados e
desenvolvimento de vacinas que protegem eficientemente contra os isolados
encontrados (BIDIN et al., 2001).
Nos Estados Unidos, os integrados utilizam programas desenvolvidos para enfrentar
desafio precoce e imunizam suas reprodutoras com vacinas inativadas com amostras de
vírus variantes, devido à preocupação com amostras desse tipo, principalmente as
variantes que surgiram em Delaware, e, mais recentemente, com a amostra CA-6 e outra
amostra isolada no estado da Geórgia. Na Europa, África e Oriente Médio, a
preocupação desde a década de 80 é o desafio por amostras muito virulentas (vvIBDV).
A tentativa de controlar esse tipo de desafio com vacinas intermediárias não foi bem
sucedido, uma vez que o vírus altamente virulento chegava antes do vírus vacinal à
bursa de Fabrícius (RAUTENSCHLEIN & HAASE, 2005). A variação dos anticorpos
maternos e o alto desafio de campo não permitiam a ação da vacina em todas as aves
vacinadas entre 14 e 21 dias de idade (WOOD et al., 1981). Sendo assim, foi necessário
criar um programa vacinal baseado na utilização de vacinas vivas mais invasivas, para
um melhor controle da IBD nestas situações (DI FÁBIO, 1999; VAN DEN BERG,
2000; BANDA & VILLEGAS, 2004).
No Brasil, até o final da década de 90 só eram encontradas no mercado vacinas com
amostras intermediárias. Em 1997, houve no Brasil o surgimento de amostra
classificada como “grupo molecular 11” (G11), semelhante à vvIBDV européia,
levando à necessidade de utilização de vacinas mais invasivas como as intermediáriasplus e as forte, nas criações avícolas de frango de corte (MICHELL, 2007). Quanto
maior a concentração viral no galpão mais precoce tende a ser o desafio, isto explica o
porquê da enfermidade normalmente vir atingindo lotes em idades cada vez mais
jovens. Tanto na Europa, África do Sul quanto no Brasil, os problemas iniciaram em
frangos de corte entre quatro e cinco semanas de idade e depois atingiram aves de duas
a três semanas de idade (BANDA & VILLEGAS, 2004).
Borne e Comte (2003) demonstraram que as vacinas vivas atenuadas utilizadas no
controle da IBD induzem o mesmo tipo de reação sorológica, porém diferem em termos
de agressividade. As vacinas suaves são aquelas em que a amostra vacinal é de
patogenicidade muito baixa, não causando lesões na bursa de Fabrícius, e são
neutralizadas pelos anticorpos maternos. As vacinas intermediárias possuem
patogenicidade e conseguem suplantar níveis médios de anticorpos passivos. Já as
amostras intermediárias plus, possuem grau mais elevado de patogenicidade e podem
causar algumas lesões em aves sem imunidade. São recomendadas para revacinações e
em áreas de alto desafio. As vacinas fortes são bem agressivas para a bursa e são
indicadas em revacinações em situações de ocorrência da IBD muito virulenta.
Kumar et al. (2000) e Ahmed et al. (2003) observaram que os títulos de aves vacinadas
no décimo ou no décimo quarto dia de vida, com vacinas de patogenicidade
intermediária plus ou forte, apresentaram titulação crescente, chegando a altos títulos de
proteção vacinal nas aves em idade de abate.
Di Fábio (2002), demonstrou que as vacinas mais virulentas mostraram-se mais
eficientes contra o vvIBDV, no sentido de proteger contra a mortalidade, porém, não
soube relatar o grau de agressão que estas vacinas podem causar na bursa de Fabrícius e
se pode comprometer o desenvolvimento do sistema imune da ave, aumentando sua
susceptibilidade a outros patógenos.
A partir do ano de 2003, estudos permitiram a identificação de vírus menos virulentos,
classificados como clássicos e as cepas consideradas variantes moleculares. Assim, os
programas vacinais com cepas mais fortes e com várias doses de vacinas invasivas,
estão sendo substituídos por programas mais suaves, como intermediárias e
intermediárias plus e com menos doses por lote. Este é o caso da vacinação “in ovo”,
que já vem sendo utilizada para doença de Marek em várias partes do mundo, inclusive
no Brasil e começa a ser usada também contra a Doença Infecciosa Bursal (WHITFILL
et al., 2002).
A vacinação “in ovo” contra a IBD é um método relativamente novo de imunização de
aves. Baseia-se na inoculação aos 18 dias, de anticorpos específicos para IBDV
associado com uma dose ideal de vírus vacinal, cepa intermediária (estirpe 2512 IBDV-ICX). Esta combinação parece garantir a preservação do IBDV em presença de
altos títulos de anticorpos passivos, uma vez que se relata a capacidade deste
imunocomplexo em se alojar em sítios privilegiados do sistema imune, como as células
dendríticas foliculares presentes nos centros germinativos dos órgãos imunes, sendo
liberada a dose vacinal, quando os títulos de anticorpos diminuem (CORLEY &
GIAMBRONE, 2002). De acordo com Iván et al. (2001), a vacinação “in ovo” com
vacina contendo imunocomplexo (Cevac transmune IBD vaccine: IBDV-BDA) foi
causadora da depleção de folículos bursais das aves vacinadas, porém, aves comerciais
apresentaram depleção bursal mais tardia, menos severa e durante menor tempo quando
comparadas a aves livres de patógenos específicos (SPF).
Di Fábio et al. (1999) sugeriram que as amostras de vvIBDV isoladas no Brasil tenham
sofrido modificações em aspectos imunofenotípicos, com perdas ou mudanças de
epítopos, ou que tenha acontecido atenuação da virulência, pela passagem em aves. Isso
justificaria a redução de ocorrências da forma grave da doença causadas por estas
amostras, e à maior identificação de formas subclínicas.
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS
3.1 Artigo 1
Frequência de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal e detecção viral
através da PCR/RFLP em criações de frango de corte e galinhas de quintal no polo
avícola da Bahia.
SILVA, Priscila Sousa da1 *; SALES, Tatiane Santana1 ; RAMOS, Izabella1; MAIA, Paulo
César Costa1; FERNANDES, Lia Muniz Barretto1 .
1
Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva. Avenida Adhemar de Barros, 500. Ondina. Salvador, Bahia, Brasil.
*Correspondência para o autor: [email protected]
RESUMO
Esse estudo teve como objetivo determinar a frequência de anticorpos e detectar o vírus
da Doença Infecciosa Bursal em criações de frangos de corte e em criações de
subsistência localizadas em duas regiões do pólo avícola da Bahia. Foram coletadas 758
amostras de soro de frangos de corte e 320 amostras de galinhas de quintal para
avaliação da frequência de anticorpos utilizando ELISA indireto. Para a detecção e
caracterização do vírus foram coletados 6 pools de bursas de Fabrícius em frangos de
corte e 3 pools em criações de subsistência, analisados posteriormente com PCR/RFLP.
Os resultados revelaram que não há proteção uniforme na criação comercial nas duas
regiões estudadas, sugerindo falha na vacinação e desafio com vírus no ambiente.
Também observou-se altos títulos em aves de subsistencia não vacinadas, com variação
nos títulos de relacionada com desafios de campo. Nos testes moleculares verificou-se
que 3 pools de frangos de corte eram positivos, sendo dois para cepa vacinal (G3) e um
para cepa variante (G15). Nas criações de subsistência houve uma amostra positiva para
cepa variante (G15). Os resultados demonstram a necessidade de monitoramento em
ambas criações.
Palavras-chave: Doença Infecciosa Bursal, ELISA, PCR, frangos de corte, galinhas de
quintal.
SUMMARY
The aim of this study was to determine the frequency of antibodies anti-Infectious
Bursal Disease Virus as well as to detect the virus in broilers and small scale chickens,
raised in two different regions at Bahia’s poultry production area. A total of 758 serum
samples were collected from broilers and 320 from free-ranging chickens, in order to
assess the frequency of antibodies using an indirect ELISA. For virus detection and
characterization there were collected 6 bursal pools from broilers and 3 from freeranging chickens, which were further analyzed with PCR/RFLP. The results showed
that there is no uniform protection in commercial flocks of the two different regions,
suggesting that it may be occurring vaccination errors and that it may be occurring
challenge from viruses at the environment. High titers were observed in no vaccinated
free-ranging chickens, with titers varying related with environmental challenge.
Molecular tests revealed that 3 broilers pools were positive in which 2 matched the
vaccine strain (G3) and 1 a variant strain (G15). One sample from free-ranging chickens
was positive for the variant strain (G15). These results demonstrate the need for
monitoring both types of exploration.
KEY-WORDS: Infectious Bursal Disease, ELISA, PCR, broilers, free-ranging
chickens
INTRODUÇÃO
A Doença Infecciosa Bursal (IBD) é uma doença viral aguda, contagiosa, que afeta aves
jovens com 3 a 6 semanas de idade (ASHRAF et al., 2007), causando grandes prejuízos
para a indústria avícola (ABDEL-ALIM et al., 2003). O vírus da Doença Infecciosa
Bursal (IBDV) multiplica-se nos tecidos linfóides, com predileção pela bursa de
Fabrícius, provocado destruição das células linfóides com consequente imunossupressão
e aumento da suscetibilidade a outras doenças infecciosas (AL-NATOUR et al., 2004;
BANDA et al., 2003; MORAES et al., 2005; ELANKUMARAN et al., 2002).
O IBDV pertence a família Birnaviridae e gênero Birnavirus e seu genoma consiste em
dois segmentos de RNA de fita dupla (BANDA et al., 2003; ASHRAF et al., 2007). O
vírus é constituído de dois sorotipos distintos, denominados sorotipo 1 e sorotipo 2. O
sorotipo 1 é patogênico para aves e sua virulência é variável, e o sorotipo 2 é
apatogênico para aves, mas infecta galinhas e perus (BANDA et al., 2003). As mutações
genéticas no genoma do IBDV resultaram em variantes antigênicas e patogênicas que
continuam a causar a doença em frangos de corte (JACKWOOD & SOMMERWAGNER, 2005).
A IBD está presente em todas as áreas produtoras de frango e tem causado perdas
econômicas para a avicultura industrial em todo o mundo. As perdas estão relacionadas
com o aumento da mortalidade e da imunossupressão nas aves acometidas, resultando
em queda da performance (KNEIPP, 2000). No Brasil, o aumento do número de casos a
partir da década de 90 se deve ao aparecimento de formas variantes de alta virulência
(VAN DEN BERG, 2000). Surtos da enfermidade foram relatados no final da década de
90 em São Paulo envolvendo cepas muito virulentas, classificadas através de técnicas
moleculares como G-11 (TESSARI et al., 2001). Di Fábio et al. (1999) relataram surtos
de IBDV com amostras variantes consideradas de alta patogenicidade no estado de
Minas Gerais.
A caracterização das cepas de campo do IBDV tem sido fundamental no
desenvolvimento de medidas preventivas e campanhas epidemiológicas tendo como
objetivo controlar a propagação do vvIBDV. Nos últimos anos, o uso de técnicas
moleculares como a RT-PCR (reação em cadeia da polimerase) tem sido útil na
detecção e genotipagem das diferentes cepas de IBDV presentes no campo (NOUEN et
al., 2006 ).
Através da técnica molecular, são reconhecidos 17 grupos distintos de vírus da Doença
Infecciosa Bursal, sorotipo 1. As vacinas comerciais existentes são classificadas nos
grupos 3, 4, 5, 6 e 7. A maioria dos vírus de campo do Brasil estão classificados nos
grupos 15 e 16 (KNEIPP, 2000).
Banda et al. (2003) caracterizaram IBDV isolados do campo dos Estados Unidos e de
alguns países da América Latina com base nas diferenças na região hipervariável do
gene VP2 através da técnica de RT-PCR/RFLP e, observaram que as cepas brasileiras
do vvIBDV possuem identidade entre 98,8% e 100% com as cepas do vvIBDV
prevalentes na Europa e na Ásia. Cardoso et al. (2008) detectaram a cepa muito
virulenta do IBDV no Brasil, em frangos de corte em um lote com mortalidade superior
ao esperado.
A população constituída de aves que são criadas para o consumo próprio, conhecidas
como galinhas de fundo de quintal ou caipiras, não é beneficiada com o programa de
biosseguridade aplicado nas criações comerciais. No Rio Grande do Sul, foi realizada
uma pesquisa para detectar a presença de anticorpos contra o IBDV nesta população e
os resultados indicaram que o vírus está presente nessas aves, ressaltando a necessidade
de elaboração de um programa de vigilância permanente, uma vez que existe o risco de
transmissão destas criações às criações comerciais (SANTOS et al., 2008).
O conhecimento da ocorrência e distribuição da Doença Infecciosa Bursal em frangos
de corte e em galinhas de quintal pode ter grande utilidade para indicar a necessidade
implantação de medidas de prevenção e controle específicas. Uma vez que galinhas de
quintal não são vacinadas e são criadas próximas às granjas de frango de corte, este
trabalho tem por objetivo determinar a frequência de anticorpos e detectar o vírus em
ambas criações.
MATERIAL E MÉTODOS
Sorologia
Foram coletadas 1078 amostras de soro, sendo 758 amostras de frangos de corte e 320
amostras de galinhas de quintal, provenientes de 13 municípios localizados no polo
avícola da Bahia, no período de março de 2009 a dezembro de 2010. O número de
amostras coletadas em cada município variou de acordo com o tamanho dos lotes de
frango e das criações de galinhas.
As amostras foram agrupadas em duas regiões importantes do polo avícola da Bahia,
que concentram granjas comerciais de corte e criações de subsistência de galinhas. Em
criações de galinhas de quintal, a região de Feira de Santana abrange amostras dos
municípios de Feira de Santana e São Gonçalo dos Campos e, a região de Alagoinhas
abrange amostras de Alagoinhas e Irará.
Em criações de frango de corte, na região de Feira de Santana estão contemplados os
municípios de Conceição da Feira, Feira de Santana e São Gonçalo dos Campos, e a
região de Alagoinhas abrange os municípios de Alagoinhas e Entre Rios.
Em frango de corte, as amostras de sangue e a bursa foram coletadas em animais com
idade de abate, selecionados aleatoriamente. Para a coleta de amostras de galinhas de
quintal foram selecionadas aves jovens, previamente anilhadas para possibilitar
posterior identificação e coleta das bursas.
Os ensaios sorológicos foram realizados no Laboratório de Sanidade Avícola da Bahia
(LASAB) – UFBA. Os soros foram testados através da técnica de ELISA Indireto
utilizando o kit comercial FlockChek* IBD (Laboratório IDEXX ©) e, os
procedimentos do teste foram conduzidos de acordo com instruções do fabricante. Os
resultados do teste foram calculados e interpretados utilizando o programa xChek®,
onde as densidades óticas (D.O.) de cada uma das amostras são correlacionadas com o
controles positivos e negativos da placa em que foram testadas, gerando um índice
denominado razão S/P (sample/positive). A razão S/P determina o ponto de corte, ou
seja, o valor de densidade ótica no teste que determina os soros positivos e negativos.
As análises estatísticas foram feitas através do programa SPSS 13.0. Os dados foram
analisados por meio do teste t de Student, considerando o intervalo de confiança de
95%.
Biologia molecular
Para detecção do vírus, foram coletadas 09 pools de bursas de Fabricius, sendo 06 pools
de frango de corte e 03 pools de galinhas de quintal. Cada pool continha 10 bursas de
aves selecionadas aleatoriamente em frango de corte. As aves criadas no sistema
alternativo, foram anilhadas no momento da coleta de sangue e, somente as que tiveram
títulos de anticorpos elevados na sorologia foram adquiridas para a realização da técnica
de biologia molecular. Todas as bursas foram armazenadas à temperatura de -20oC no
LASAB até serem encaminhados para o JF Laboratório, onde foram processadas
utilizando a técnica PCR/RFLP.
A metodologia utilizada para genotipagem do IBDV consistiu na amplificação de uma
região do gene VP2 com posterior digestão com enzimas de restrição. A região do VP2
é escolhida para a determinação dos subtipos virais, pois está relacionada com a
produção de anticorpos neutralizantes que determinam a especificidade dos anticorpos
subtipo-específicos do IBDV (JACKWOOD & JACKWOOD, 1994).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O monitoramento sorológico de plantéis avícolas tem por objetivo analisar os níveis de
imunidade materna, determinar imunocompetência, avaliar e reajustar programas de
vacinação, diagnosticar surtos de doença e avaliar a biossegurança na granja (TESSARI
et al., 2003). ELISA é o teste sorológico rotineiramente utilizado para detectar
anticorpos contra o IBDV devido ao fato de permitir o processamento de grande número
de amostras simultaneamente (ASHRAF et al., 2006).
Os resultados obtidos na análise sorológica das 758 amostras de frango de corte,
coletadas de aves em idade de abate, provenientes de municípios localizados no pólo
avícola e agrupadas em regiões estão demonstrados na Tabela 1 e nas Figuras 1 e 2. As
aves eram vacinadas e não apresentavam sintomatologia clínica da enfermidade. Do
total das amostras de frangos de corte analisadas, 90,1% foram sorologicamente
positivas. Nas regiões de Feira de Santana e Alagoinhas, os CV foram de 54% e 70,8%,
respectivamente.
Tabela 1. Distribuição dos títulos de anticorpos, coeficiente de variação, desvio-padrão e
frequência de anticorpos em frangos de corte nas duas regiões estudadas.
Conceição da Feira
Feira de Santana
São Gonçalo dos Campos
SUBTOTAL
Alagoinhas
Entre Rios
SUBTOTAL
TOTAL
Região de Feira de Santana
Amostras
Mín-Máx
246
1-9.415
136
1-6.399
160
1-8.498
542
1-9.415
Região de Alagoinhas
108
536-12.908
108
7-7.092
216
7-12.908
758
1-12.908
SD
2032,1
1341,6
1577,6
1765,7
CV (%)
61,7
46,7
83,6
54,0
2727,5
1886,0
2519,5
2011,9
60,7
71,8
70,8
60,0
Figura 1. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em frangos de corte da região de
Feira de Santana com média de títulos evidenciada.
Figura 2. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em frangos de corte da região de
Alagoinhas com média de títulos evidenciada.
O coeficiente de variação é uma medida relativa de dispersão bastante utilizada para
verificar a uniformidade da resposta humoral e avaliar a eficiência de programas de
vacinação na avicultura. Ristow (2004) classifica os programas de vacinação de acordo
com o CV em excelente (CV<30%), bom (CV entre 30-50%), razoável (CV entre 5180%) e ruim (CV>80%). Podemos observar que dentre as amostras de frangos de corte
nos 5 municípios estudados, nenhum teve CV excelente, 20% bom, 60% razoável e
20% ruim. Coeficientes de variação classificados como bons (30-50%) demonstram que
a imunização do lote foi bem sucedida por gerar títulos uniformes (OPENGART, 2003).
Os dados obtidos nesse trabalho demonstram que não existe uniformidade nos títulos de
anticorpos dos lotes comerciais e, portanto, que o programa de vacinação não conseguiu
atingir a proteção esperada nos lotes avaliados.
Verificou-se também grande disparidade na média de títulos nos municípios analisados,
com amostras apresentando títulos inferiores a 2500, valor considerado como limite
para lotes vacinados, sugerindo que parte das aves não estava protegida, podendo ter
ocorrido falha na imunização. Além disso, várias amostras apresentaram títulos
superiores a 8.000, sinalizando que deve estar havendo exposição ao vírus no campo
(BOLIS et al., 2003). Como todos os lotes foram submetidos ao mesmo programa de
vacinação, e a coleta foi feita em aves da mesma idade, esses resultados não eram
esperados.
Falhas na imunidade conferida por vacinas podem ser devidas à má aplicação ou à
resposta deficiente de alguns indivíduos. Moraes et al. (2005), argumentaram que é
importante que sejam tomados os cuidados necessários para que a vacinação atinja o
maior número de aves possível, uma vez que nem todos respondem de acordo com o
esperado.
Nas criações de subsistência, os dados obtidos também sinalizaram que há necessidade
de maior atenção por parte das agências de vigilância epidemiológica, já que a
circulação do vírus em criações de fundo de quintal pode proporcionar o surgimento de
cepas de maior patogenicidade. Os resultados da análise das amostras de soro de 320
aves criadas em sistema alternativo de criação, em municípios localizados no pólo
avícola da Bahia estão representados na tabela 2 e nas figuras 3 e 4. As aves não eram
vacinadas e não apresentavam sintomatologia clínica. As duas regiões estudadas
apresentaram animais com resultados positivos, com índices acima de 50%. Do total de
320 amostras, 79,7% foram positivas no ELISA. Observa-se que nas duas regiões foram
obtidos elevados coeficientes de variação (CV), que sugerem não haver resposta
imunológica uniforme nas aves frente a possíveis desafios, uma vez que essas aves não
são vacinadas.
Tabela 2. Distribuição dos títulos de anticorpos, coeficiente de variação, desvio-padrão e
frequência de anticorpos em galinhas de quintal nas duas regiões estudadas.
Região de Feira de Santana
Amostras Mín-Máx
SD CV (%) No aves positivas (%)
Feira de Santana
São Gonçalo dos Campos
SUBTOTAL
Alagoinhas
Irará
SUBTOTAL
TOTAL
30
407-7.024 1453,9 68,4
139
48-9.370 1973,9 76,5
169
48-9.370 1896,2 75,9
Região de Alagoinhas
40
93-4.845 1316,9 114,2
111
1-9.727 1937,2 109,8
151
1-9.727 1810,0 112,9
320
1-9.727 1906,6 91,8
30 (100%)
117 (84,2%)
147 (87%)
26 (65%)
82 (73,9%)
108 (71,5%)
255 (79,7%)
Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em galinhas de quintal da região
de Feira de Santana com média de títulos evidenciada.
Figura 4. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em galinhas de quintal da região
de Alagoinhas com média de títulos evidenciada.
Estudo de prevalência de anticorpos contra o IBDV realizado por Santos et al. (2008)
em galinhas de quintal de 22 municípios no Rio Grande do Sul revelou positividade em
80,2% das amostras, demonstrando que o vírus está presente neste tipo de criação. Altas
taxas de amostras soropositivas também foram encontradas em criações de subsistência
avaliadas por Volk (2005) na Eslovênia e, por Hernandez-Divers (2006) no Equador,
que obtiveram em seus estudos 78% e 100% de positividade, respectivamente. A
frequência alta de amostras positivas contra o IBDV identificadas em criações de
galinhas de quintal indica que o vírus circula nessa população (TAN et al., 2000). A
circulação do vírus no ambiente em criações alternativas pode ser considerada um risco
à indústria avícola uma vez que os animais estão localizados próximos às granjas de
empresas, não apresentam sintomatologia clínica e, considerando a capacidade de
disseminação do vírus (SANTOS et al., 2008).
Os resultados obtidos na detecção e genotipagem do IBDV podem ser visualizados na
tabela 3. O PCR/RFLP em frangos de corte em idade de abate indicou a presença de
padrões de restrição compatíveis com cepas variantes brasileiras do grupo molecular
G15 em 01 pool, e de cepas vacinais do grupo molecular G3 em 02 pools de frangos de
corte vacinados. Em 03 pools enviados ao laboratório não houve amplificação
específica de ácido nucléico do IBDV da região do gene VP2. Já na análise de amostras
de bursas de Fabrícius para identificação e genotipagem do IBDV em aves criadas em
sistema alternativo de produção houve amplificação específica de ácido nucléico do
IBDV da região do gene VP2 na amostra da região de Alagoinhas.
Tabela 3. Detecção e caracterização do IBDV em frangos de corte e aves de subsistência de
duas regiões do polo avícola da Bahia.
Tipo de criação
Frangos de corte
Positivos
1 (G15) – São Gonçalo
Negativos
3
2 (G3) – Feira de Santana e
São Gonçalo
Criação de subsistência
1 (G15) - Alagoinhas
2
O resultado obtido no PCR/RFLP é baseado em sequências descritas na literatura, banco
de genes, análises de vacinas comerciais e de amostras provenientes de estudo de
campo. Este grupo é classificado como grupo de variantes brasileira com padrões não
vacinais e está disseminado em todo o país. Nossos resultados demonstram a circulação
desta variante do vírus em criações de frangos de corte e em criações de galinhas de
quintal localizadas no pólo avícola da Bahia.
Além da proximidade entre as criações comerciais e de subsistência, a presença de
vetores e reservatórios do IBDV pode favorecer a disseminação da doença. Estudos
anteriores têm sugerido que cães, aves selvagens, roedores e insetos podem ser
importantes vetores do IBDV. A viabilidade do IBDV após passar pelo sistema
digestivo de alguns animais foi demonstrada. O cão, animal frequentemente encontrado
dentro dos núcleos de criação comercial e em pequenas propriedades, pode ser bastante
importante propagador da doença. Pagès-Manté et al. (2004) isolaram o IBDV das fezes
de um cão 24 e 48h após a ingestão de tecido de animais infectados com uma cepa
muito virulenta do IBDV (vvIBDV). Park et al. (2010) isolaram o IBDV do baço,
fígado e fezes de camundongos 12 e 24h após inoculação com a cepa altamente
virulenta do IBDV, indicando a viabilidade e patogenicidade dos IBDV mesmo depois
de transitar pelo sistema digestivo, ressaltando que esses animais podem ser
considerados portadores do IBDV.
Jeon et al. (2008) relataram que a relevância da enfermidade em criação de galinhas de
quintal não está bem definida, apesar do conhecimento do risco decorrente do
surgimento de amostras virulentas e, da possibilidade de transmissão para aves
silvestres, que podem servir como reservatório do vírus. A transmissão da IBD de
galinhas de quintal para aves silvestres foi relatada na Costa Rica, onde aves do gênero
Columbas, Corvus e Passeriformes, que entraram em contato com galinhas de quintal,
apresentaram resultado positivo para a enfermidade (Hernandez-Divers et al., 2008).
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Brasil estabelece que a
criação de animais domésticos de outras espécies, deve ter um afastamento mínimo de
5m de criações comerciais (BRASIL, 2007). Os órgãos de defesa sanitária animal
exercem rigoroso controle sanitário sobre a criação industrial de galinhas, no entanto,
pouca atenção é dada às criações de galinhas de quintal em todo o Brasil (SANTOS et
al., 2008).
Nesse estudo pudemos verificar a susceptibilidade das criações comerciais de frangos
de corte à IBD, demonstradas nos testes sorológicos e na detecção molecular, bem como
identificamos o risco da presença do IBDV em criações de subsistência. Este é o
primeiro relato de detecção e caracterização do IBDV em criações de subsistência na
Bahia. Os resultados obtidos reforçam a necessidade de monitoramento constante em
ambos tipos de criação, visando evitar as perdas relacionadas a essa importante
enfermidade.
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3.2 Artigo 2
Detecção de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal em aves silvestres
no polo avícola da Bahia.
SILVA, Priscila Sousa da1 *; LIMA, Pedro C.2; RAMOS, Izabella1; MAIA, Paulo César Costa1;
FERNANDES, Lia Muniz Barretto1.
1
Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva. Avenida Adhemar de Barros, 500. Ondina. Salvador, Bahia, Brasil.
2
Médico Veterinário autônomo.
*Correspondência para o autor: [email protected]
RESUMO
Foram coletadas 76 amostras de soro de aves de vida livre que circulavam nos arredores
dos aviários de frangos de corte, na região do pólo avícola da Bahia, para avaliação da
presença de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal. Foi encontrada
evidência sorológica da infecção por IBDV em 5 (6,6%) das amostras em uma das
espécies aviárias analisadas. Esses resultados sugerem a possibilidade que as aves
silvestres que circulam nos arredores dos aviários comerciais atuam como propagadoras
do IBDV na região. Este é o primeiro levantamento sorológico da IBD em aves
silvestres da Bahia.
PALAVRAS-CHAVE: Doença Infecciosa bursal, aves silvestres, IDGA.
ABSTRACT
A total of 76 serum samples were collected from free-living birds circulating around the
broiler aviaries in the region of Bahia’s most important poultry production area, in order
to evaluate the presence of antibodies anti-IBDV. Serological evidence of IBDV
infection was found in 5 (6.6%) samples from one of the bird species analyzed. These
finding suggests that these wild birds can be responsible for spreading IBDV in the area.
This is the first report of serological survey of IBD in wild birds from Bahia State,
Brazil.
KEY-WORDS: Infectious Bursal Disease, wild birds, IDGA.
INTRODUÇÃO
A doença infecciosa bursal (IBD) é uma enfermidade viral, altamente contagiosa,
causada pelo vírus da Doença Infecciosa Bursal, caracterizada por causar
imunossupressão e mortalidade em galinhas domésticas com idade variando entre 3 a 6
semanas (SAIF, 1991). É considerada mundialmente a mais importante doença
imunossupressora na avicultura comercial, podendo levar a perdas econômicas
significativas seja por sua manifestação clínica ou subclínica. (BANDA & VILLEGAS,
2004; LASHER & DAVIS, 1997; PHONG et al., 2003).
O IBDV pertence ao gênero Avibirnavirus da família Birnaviridae. Existem dois
sorotipos do IBDV, chamados de sorotipo 1 e 2. Amostras do sorotipo 1 são
patogênicas apenas para galinhas e os vírus do sorotipo 2 são isolados de perus e não
são patogênicos para galinhas (LIN et al., 1994).
Galinhas e perus são considerados os hospedeiros naturais do IBDV (LASHER &
SHANE, 1994). No entanto o IBDV já foi identificado em várias outras espécies
aviárias, como avestruzes (GOUCH et al., 1998); gaivotas e patos (HOLLMÉN et al.,
2000); falconídeos e passeriformes (OGAWA et al., 1998); e pinguins (GARDNER et
al., 1997).
Aves silvestres podem atuar como intermediárias na disseminação de agentes
infecciosos. A probabilidade de envolvimento destas aves na propagação do IBDV a
partir de resíduos de criatórios de aves comerciais pode ocorrer a partir de um aumento
de espécies sensíveis à infecção, com hábitos gregários que conduzam a elevadas
densidades populacionais (GILCHRIST, 2005).
Relatos de infecção pelo sorotipo 1 do IBDV em aves silvestres, sugerem que essas aves
possam participam da cadeia epidemiológica do vírus, servindo como reservatório
(OGAWA et al., 1998; WILCOX et al., 1983).
A Instrução Normativa 59, de 2 de Dezembro de 2009 do Ministério da Agricultura, no
parágrafo 3, exige que todos os estabelecimentos avícolas comerciais tenham instaladas
telas com malha não superior a uma polegada ou 2,54 cm nos vãos externos livres dos
galpões (BRASIL, 2009). Essas telas, comumente chamadas de telas passarinheiras,
devem evitar o acesso de aves silvestres ao interior dos aviários comerciais. No entanto,
o prazo para adoção dessa medida vai até dezembro de 2012 e muitos estabelecimentos
ainda não se adequaram à exigência. Além disso, as aves de vida livre entram em
contato com aves de criações de subsistência e já foi demonstrada a ocorrência de IBD
em aves silvestres nestas situações (OGAWA et al., 1998).
Considerando a possibilidade das aves silvestres servirem como disseminadoras e
propagadoras do IBDV, a confirmação da circulação do vírus na Bahia e a importância
da IBD para os plantéis comerciais, este trabalho tem por objetivo detectar a frequência
de anticorpos contra o IBDV em aves silvestres que circulam nos arredores dos aviários
de corte no pólo avícola da Bahia.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das amostras
A captura das aves silvestres foi realizada entre janeiro de 2009 e agosto de 2010 em
propriedades com criação comercial de frangos de corte em atividade, na região do polo
avícola da Bahia. Foram capturadas 76 espécimes, com o auxílio de redes de espera tipo
“neblina”, armadas ao nível do solo e posicionadas próximas aos aviários de frangos de
corte. Após a captura, as aves foram retiradas das malhas de rede e acondicionadas
individualmente em sacos de tecido de algodão até o momento da identificação e
colheita de sangue. As aves foram identificadas de acordo com a espécie e anilhadas. A
seguir, puncionou-se a veia jugular e coletou-se 0,2 ml de sangue com seringas de 1ml e
agulhas estéreis 26G. Após a punção, as aves foram libertadas, e o soro separado e
mantido a -20 oC até a execução dos testes sorológicos. A coleta das amostras foi
oficialmente autorizada pelo IBAMA (SISBIO licença n°. 22935-1 / autenticação
56858429) e realizou-se seguindo as normas deste instituto.
Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA)
Os ensaios sorológicos foram realizados no Laboratório de Sanidade Avícola da Bahia
(LASAB) – UFBA. Para a realização da IDGA, utilizou-se Bacto Ágar (Difco, Brasil) a
1,25% em Solução Salina Tamponada, pH 7,6. Os poços foram perfurados com
perfurador hexagonal com sete orifícios (um central e seis periféricos) medindo 4 mm
de diâmetro, com distância entre orifícios de 3mm e com capacidade para 30 µL de
soro/antígeno por orifício. Os orifícios 1 e 4 foram preenchidos com soro controle, os
orifícios 2, 3, 5 e 6 com os soros testes e orifício central, com o antígeno. O antígeno e o
soro controle utilizados no testes foram o AGA-GUM e AGP-GUM (GD Diagnostics
Netherlands). Após a distribuição dos reagentes, as lâminas foram colocadas em câmara
úmida à temperatura ambiente e a leitura realizada após 72h de incubação, em luz
direta, sobre fundo escuro. Para a leitura, primeiramente foram observadas as linhas do
soro controle positivo (1 e 4), e em seguida as linhas dos soros testes, verificando a
ocorrencia de linhas de precipitação com identidade com àquelas do soro controle.
RESULTADOS
A maioria das aves capturadas pertencia à espécie Passer domesticus (Pardal),
totalizando 68 indivíduos. As outras espécies capturadas foram: quatro indivíduos da
espécie Agelaius ruficapillus (Chapéu-de-couro), dois indivíduos da espécie Molothrus
bonariensis (Chupim), um Molothrus badius (Asa-de-Telha) e uma Columbina
talpacoti (Rolinha-caldo-de-feijão).
Das 76 amostras analisadas para presença de anticorpos contra o vírus da Doença
Infecciosa Bursal, 6,6% (5/76) foram positivas, sendo estas oriundas de Pardais (Tabela
1). Nenhuma ave das outras espécies apresentou reação positiva no teste de
Imunodifusão em gel-de-ágar.
Tabela 1. Soropositividade para Doença Infecciosa Bursal em espécies de aves silvestres
Espécie
Nome popular
Amostras
Positividade
Passer domesticus
Pardal
68
5
Agelaius ruficapillus
Chapéu-de-couro
4
-
Molothrus bonariensis
Chupim
2
-
Molothrus badius
Asa-de-telha
1
-
Columbina talpacoti
Rolinha-caldo-de-feijão
1
-
76
5
Total
DISCUSSÃO
Ogawa et al. (1998) realizaram levantamento sorológico em aves silvestres de vida livre
no Japão, incluindo espécies sedentárias e migratórias para determinar o papel das aves
silvestres na epidemiologia do IBDV. Neste estudo foram coletados 739 amostras de
soro de aves de 44 espécies e testados os sorotipos 1 e 2 do IBDV através da técnica de
Vírus Neutralização. Os autores encontraram soropositividade dos sorotipos 1 e 2 em 15
(2%) dos soros de 6 espécies e 36 (4,9%) dos soros de 11 espécies, respectivamente.
Esses resultados sugerem que aves de vida livre e aves silvestres têm importante papel
na história natural do IBDV e, levantam a possibilidade de que o IBDV prevalente em
aves de outros países possam ser importados pelas espécies migratórias.
As aves silvestres circulam livremente nos galpões comerciais de frango, atraídas pela
ração. Essas aves podem estar infectadas ou vir a se infectar com o IBDV, uma vez que,
de acordo com Wang et al. (2007), a disseminação do vírus em um lote de aves ocorre
pelas vias aéreas, digestiva e ocular, assim como, pela cama e fezes de aves infectadas.
Liu et al. (2002) identificaram, por meio de análise molecular, que amostras de IBDV
isoladas aves selvagens estavam intimamente relacionadas com o vvIBDV isolados de
criações de frangos em regiões endêmicas da China.
Jeon et al. (2008), analisaram, por meio da técnica de RT-PCR, 107 amostras de aves
encontradas mortas na Coréia do Sul, representando 07 espécies de aves de vida livre. O
resultado da análise molecular, baseado na sequencia do gene VP2, revelou o IBDV em
05 aves, dentre as quais 04 pertenciam a espécies aquáticas sugerindo que essas
espécies podem ter importancia na epidemiologia do IBDV como reservatório, similar a
Influenza Aviária e Doença de Newcastle. Esses resultados demonstram que o IBDV
está presente em aves silvestres, destacando um papel relevante dessas aves na
epidemiologia da IBD em áreas endêmicas.
Nawathe et al. (1978) realizou estudo sorológico na Nigéria com 50 soros de aves
silvestres de 6 espécies, utilizando o IDGA e obteve 06 amostras positivas,
correlacionando a soropositividade com o fato de as aves terem sido capturadas ao redor
das criações comerciais.
Kasanga et al. (2008) realizaram levantamento sorológico e molecular do IBDV em
galinhas d’angola e pombos aparentemente saudáveis. Sorologicamente o IBDV foi
detectado apenas em 9,5% (2/21) nas galinhas d’angola. A análise filogenética realizada
através do RT-PCR indicou que as amostras de IBDV detectadas em galinhas d’angola
e em pombos são geneticamente relacionadas com o vírus muito virulento e com o vírus
clássico, sugerindo que as aves silvestres podem estar envolvidas na evolução e
epidemiologia da Doença Infecciosa Bursal naturalmente.
Neste trabalho demonstramos que aves de vida livre que circulam nos arredores dos
aviários comerciais do polo avícola da Bahia possuem anticorpos contra o IBDV. A sua
importância como propagadoras da enfermidade e o impacto para a saúde das aves
infectadas precisam ser melhor investigados.
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4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
 Neste trabalho foi determinada a frequência de anticorpos contra o IBDV em frangos
de corte, galinhas de quintal e aves silvestres do Pólo Avícola da Bahia, e detectadas
e classificadas as amostras virais circulantes nas populações de frangos e galinhas de
quintal.
 Pôde-se identificar que as os programas de controle adotados na criação comercial
não geraram a proteção esperada e que as aves de criação de subsistência entraram
em contato com o vírus no ambiente.
 A detecção do vírus revelou a circulação da amostra vacinal G3 em frangos de corte
e da amostra variante G15 em frangos de corte e em galinhas de quintal.
 A sorologia em aves silvestres revelou positividade em 6,6% das amostras,
demonstrando que as mesmas podem ser hospedeiras do vírus.
 Os resultados reforçam a importância do conhecimento da cadeia epidemiológica da
enfermidade e a necessidade do monitoramento, tanto das aves comerciais, quanto
das aves de vida livre, para melhoria da eficácia dos programas de controle da
doença.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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