NOTAS DE AULA – POLUIÇÃO MARINHA ECOTOXICOLOGIA II
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NOTAS DE AULA – POLUIÇÃO MARINHA ECOTOXICOLOGIA II ÍNDICE 1. Testes de Toxicidade 1.1. Introdução 1.2. Objetivos 1.2.1. Gerais 1.2.2. Parecer Técnico 1.2.3. Pesquisa Científica 1.3. Classificação 1.3.1. Local 1.3.2. Tempo 1.3.3. Biomonitores 1.3.4. Método 1.4. Aspectos da Legislação 1.5. Escolha da Espécie Para o Teste 1.5.1. Nível Trófico 1.5.2. Sensibilidade 1.5.3. Técnicas de Cultivo 1.5.4. Tamanho e Ciclo de Vida 1.5.5. Disponibilidade 1.5.6. Distribuição 1.5.7. Interesse Local 1.6. Fonte de Organismos 1.6.1. Ambiente 1.6.2. Cultivo – Produtores 1.6.3. Cultivo – Laboratório 1.7. Controle de Qualidade 1.8. Validação 1.9. Tríade de Qualidade dos Sedimentos (TQS) 2. Biomarcadores 2.1. Classificação 2.2. Avaliação Ambiental 2.3. Exemplo 3. Respostas Ecológicas 4. Legislação 1. TESTES DE TOXICIDADE COMO INSTRUMENTO DE AVALIAÇÃO AMBIENTAL (com organismos aquáticos) 1.1. Introdução A idéia geral de um teste de toxicidade é reproduzir eventos que ocorrem no ambiente com um animal, em laboratório. Deve-se atentar também para que os efeitos sofridos pela exposição ao contaminante em laboratório reflitam o que ocorre no ambiente. Os primeiros testes foram feitos com peixes, por se tratar de um grupo de fácil acesso, fácil visualização de efeitos, elevada importância ecológica e econômica. Porém, com o tempo passou-se a buscar por espécies e métodos mais apropriados para os testes. E mais recentemente, optou-se pela padronização de espécies e métodos como uma maneira de comparar as respostas obtidas por diferentes laboratórios. 1.2. Objetivos 1.2.1. São vários os objetivos de um teste de toxicidade: Determinar a toxicidade (em diferentes níveis) dos agentes químicos (um composto químico é testado em diferentes níveis); Avaliar a toxicidade relativa destes agentes químicos (principalmente em casos de substituição de compostos. O exemplo mais marcante é o das tintas antiincrustantes, que passaram a ser constituídas de novos compostos em detrimento da proibição de outros); Determinar a toxicidade de efluentes líquidos (têm-se como exemplo os testes feitos em aula prática); Estabelecer limites máximos de lançamentos de efluentes líquidos no ambiente aquático; Avaliar a necessidade de tratamento destes efluentes líquidos; Estabelecer critérios e padrões de qualidade de água (os valores estabelecidos pelo CONAMA são resultantes de testes de toxicidade – Muito embora não sejam resultados de testes realizados no Brasil); Avaliar a qualidade de amostras ambientais de água e sedimento (também há o exemplo da aula teórica); Estimar os impactos provocados em acidentes ambientais; Avaliar a sensibilidade relativa de organismos aquáticos. 1.2.2. Uso para fornecer um parecer técnico: Para tal objetivo, deve-se lançar mão de testes padronizados, simples e de baixo custo. Utilizar espécies ecologicamente importantes. Suas respostas devem mostrar boa repetitividade, reprodutibilidade e exatidão. 1.2.3. Uso em pesquisa: Não existem regras e o pesquisador deve determinar os métodos mais apropriados (o céu é o limite! Ahuahuahuauhaua!). 1.3. Classificação 1.3.1. Quanto ao local em que são realizados: Estudos de campo: são os chamados “cosmos”. Podem utilizar um ambiente inteiro (como um lago, por exemplo), pode-se fazer uma compartimentalização no ambiente ou tentar ao máximo imitar o ambiente natural (em laboratório – incluindo sedimento, muitas espécies, etc). Em geral, são multiespecíficos. A principal vantagem consiste no resultado mais realista para o teste. No entanto, como não há controle sobre os parâmetros ambientais, as respostas podem ser confundidas com simples reações ás variações (de salinidade, temperatura, por exemplo). Não há relação causa-efeito explícita. São muito utilizados nos testes com agrotóxicos. Estudos de laboratório: são mais comuns. Geralmente são monoespecíficos, com volumes pequenos, são feitos testes em diferentes níveis de diluição (exposição do organismo a diferentes concentrações) e há, portanto, maior controle sobre as variações ambientais e, conseqüentemente, isolamento do fator de interesse (mantidas as condições ambientais, os efeitos podem ser relacionados às variações nas concentrações dos contaminantes com mais propriedade). A principal desvantagem consiste na falta de resultados realistas. Alguns estudos, denominados microcosmos, visam minimizar tal falta de realismo nas respostas inserindo o maior número de componentes do sistema possível no teste. ESTUDOS DE CAMPO + Realistas - Relação causa-efeito + Caros + Complexos ESTUDOS DE LABORATÓRIO - Realistas + Relação causa-efeito + Baratos + Simples 1.3.2. Classificação quanto ao tempo: Estudos Agudos: São testes de curta duração (horas ou dias); Respostas severas (respostas graves vistas no ambiente em curto período – Refletem uma maior toxicidade de um composto); São mais fáceis, rápidos e baratos (principal base de dados); Principais respostas: morte, imobilidade. Exemplos de testes agudos. Mostra que o tempo de teste pode variar mesmo para o mesmo tipo: um teste agudo com Daphnia dura 48 horas, com peixes dura 46-96 horas e com Hyalella pode chegar a 10 dias. Estudos Crônicos: Possuem uma maior duração, buscando testar os organismos durante todo o seu ciclo de vida, caracterizando os testes Crônicos Verdadeiros. Bem como os efeitos nas segundas gerações ou terceiras gerações. As respostas são, em geral, subletais. Como a exposição sobre todo o ciclo de vida de um organismo pode ser uma tarefa dispendiosa, buscou-se avaliar a exposição apenas nos estágios mais sensíveis do ciclo, caracterizando testes Crônicos de Curta Duração. 1.3.3. Classificação por Biomonitores: Trata-se de máquinas que podem perceber mudanças no comportamento dos organismos. ALGAS: fluorescência espontânea; DAPHNIAS: capacidade natatória; MOLUSCOS: freqüência de movimentação das conchas; PEIXES: mede a movimentação dos opérculos (relação com a taxa respiratória), direção da natação (contra ou a favor do fluxo). 1.3.4. Classificação Quanto ao Método de Exposição: Estático: não há renovação do meio. São os mais comuns. Semi-estáticos: a cada 24 horas (por exemplo), o meio é renovado. Fluxo Contínuo: bombeamento para renovação mais periódica. Praticamente não há variação no meio de teste. 1.4. Aspectos Sobre a Legislação O CONAMA denomina testes de toxicidade como complementares a testes químicos. São poucas as espécies padronizadas para testes: Oriço do mar: Lytechinus variegatus, Echinometer lucunter Misidáceo: Mysidopsis juniae, Mysidium gracile Branchiopoda: Artemia sp. Microalga: Skeletonema costatum Exemplo de teste crônico padronizado: Exemplo de teste agudo padronizado: Trata-se de um teste crônico por avaliar as respostas em uma fase mais sensível do ciclo de vida (larvas ou ovos). ESTUDOS AGUDOS CL50, CE50, CI50 Amostra tóxica ou não-tóxica Morte ESTUDOS CRÔNICOS CENO (Efeito Não Observado), CEO (Efeito Observado), VC (Média Entre os Anteriores) Amostra tóxica ou não-tóxica Alterações no desenvolvimento, reprodução, atividade enzimática, metabolismo, comportamento. 1.5. Escolha da Espécie Critérios: 1.5.1. Nível Trófico: é indicado que se tenha um representante de microalga, um organismo zooplanctônico e um vertebrado. 1.5.2. Sensibilidade: são escolhidos indivíduos pertencentes a grupos de maior sensibilidade ou estágios de maior sensibilidade. (o mexilhão Perna perna adulto, por exemplo, é muito resistente e portanto não indicado. Porém, seu estágio larval é adequado para a realização dos testes. Torna-se necessário portanto compreender bem a biologia das espécies a serem estudadas). 1.5.3. Técnicas de cultivo: espécies cultiváveis são mais indicadas, uma vez que seu histórico é conhecido. Não há o risco de coletar um organismo já danificado no ambiente. 1.5.4. Tamanho e ciclo de vida: em geral, são escolhidos organismos pequenos, tanto pela praticidade quanto pela maior sensibilidade. Organismos com ciclos de vida mais curto são preferenciais, pois são mais fáceis de cultivar em laboratório. 1.5.5. Disponibilidade: quando se trabalha com um organismo coletado no ambiente, não se deve escolher uma espécie que não se encontra disponível em alguma época do ano na área de estudo. Por exemplo, o camarão rosa, possui um ciclo de vida muito variado e, portanto não é aconselhável para uso nos testes. 1.5.6. Distribuição geográfica: ampla distribuição. 1.5.7. Interesse Local: quando há interesse em testar o efeito de uma contaminação local, deve-se levar em conta: É preciso que seja um grupo representativo no ecossistema; Espécies chave no ambiente; Economicamente interessante (reforça a idéia de dano por contaminação). 1.6. Fonte dos Organismos: 1.6.1. No ambiente: devem-se buscar espécies de locais não contaminados. Evitar ao máximo o stress dos organismos tanto durante a coleta quanto durante o transporte. É preciso que os organismos passem por um processo de aclimatação (condições de água, temperatura, fotoperíodo, etc.). 1.6.2. Cultivo por Produtores Especializados: são muito utilizados peixes ornamentais, animais para repovoamento, alimento para aqüicultura, ou outros animais cultivados. 1.6.3. Cultivados no Laboratório: exigem recipientes adequados, meio de cultivo adequados, substrato apropriado, parâmetros devidamente monitorados e boas condições de alimentação. Exemplo: cultivo de Daphnia 1.7. Controle de Qualidade: A atividade em laboratório exige controle rigoroso sobre: o Pessoal: devidamente instruídos e avaliados para exercer as funções laboratoriais; o Equipamento; o Organismos: o Controle através das taxas de sobrevivência; o Taxas de reprodução; o Cistos: formas de resistência para algumas espécies. Quando formados, a utilização da espécie é desaconselhável; o Substâncias de referência: mais clássico. Trata-se do uso de substâncias tóxicas com respostas conhecidas. Se o organismo responder de maneira diferente, é sinal de diferente nível de sensibilidade e, portanto, seu uso é desaconselhável. Exemplos: cloretos, nitratos, sulfatos, DSS. As principais características que uma substância de referência deve ter são: o Ser um contaminante ambiental; o Ser fácil de analisar quimicamente; o Estar disponível no mercado com pureza; o Ser solúvel em água; o Ser estável em água; o Ser tóxico, mas não altamente tóxico (riscos); o Ter dados toxicológicos básicos disponíveis; o Escolha em função do tipo de amostra avaliada. o Material e Métodos do Teste. Para manter a qualidade, devem ser seguidas algumas normas: Boas Práticas de Laboratório (BPL) ISO 17025 INMETRO Para que a qualidade do serviço prestado pelo laboratório seja devidamente comprovada, deve-se: -dizer o que faz; -fazer o que diz; -provar que faz o que diz; -verificar constantemente os procedimentos através de auditorias internas e externa. Laboratórios acadêmicos contam com uma maior dificuldade na obtenção de um “selo de qualidade”, devido principalmente à alta taxa de mudança no grupo de pessoas associado à pesquisa (Alunos! Que são treinados, especializados e vão embora! Bando de parasitas do conhecimento! Hauahuahu =P). 1.8. Validação Indica que o teste realizado em laboratório é capaz de produzir uma resposta de toxicidade encontrada no ambiente. Não caracteriza a reprodução de uma mesma resposta ambiental, mas sim, caracteriza que o método empregado em laboratório demonstra uma toxicidade que pode é encontrada no ambiente. Exemplo: O estudo acima exemplifica uma validação de um método em laboratório: As águas de um rio (Rio Otawa) encontram-se submetidas à emissão de efluentes de uma ETE (ponto 2 no gráfico), de uma Refinaria (Ponto 3 no gráfico) e de uma Indústria Química (Ponto 4 no gráfico). Amostras em diferentes pontos ao longo desse rio foram coletadas (inclusive de pontos à jusante dos pontos de emissão) e testes crônicos com a espécie Ceriodaphnia foram realizados. As curvas cheias mostram a quantidade de juvenis liberados por fêmea de Ceriodaphnia em cada ponto. As linhas pontilhadas indicam a diversidade de espécies de bentos (no gráfico superior) e de peixes (no gráfico inferior) presentes no rio. As respostas obtidas no laboratório (diminuição no número de filhotes liberados nos pontos submetidos à contaminação por efluentes) foram validadas por respostas ambientais (diminuição na diversidade de outros organismos nesses mesmos pontos). A toxicidade foi verificada no laboratório e no ambiente, com diferentes organismos. 1.9. Tríade de Qualidade dos Sedimentos (TQS) Têm por objetivo agrupar, correlacionar e resumir dados químicos, toxicológicos e da estrutura da comunidade bentônica. Tais dados são transformados em índices (de toxicidade, contaminação e estrutura da comunidade bentônica) e os mesmos são inseridos num gráfico em conjunto com os mesmos índices para um ponto controle. O grau de impacto naquele ponto é proporcional à área do triângulo. O fator de maior impacto também pode ser verificado. Exemplo: O impacto nessa área foi visualizado para os três fatores. O impacto nessa área foi dominantemente visualizado pela presença do contaminante (índice químico maior). Os índices estão acima do permitido, muito embora não sejam visualizados efeitos tóxicos. 2. Biomarcadores Tendo o problema detectado, as medidas a serem tomadas devem intuir: frear o problema, eliminar o problema ou prevenir impactos maiores, como a destruição do ecossistema ou danos ecológicos a populações/comunidades que, em geral, são irreversíveis. Um teste de toxicidade não possui valor preventivo, uma vez que evidencia impactos já muito grandes, como a morte dos organismos. Para que tais medidas preventivas possam ser tomadas e para que os impactos gerados sejam constatados em um nível reversível, utilizam-se os biomarcadores. Quando um contaminante atinge um organismo, segue uma cascata de efeitos até que os danos atinjam níveis maiores (população/comunidade). Antes da morte do organismo, vários outros efeitos subletais ocorreram e não foram registrados por testes de toxicidade, tais como alterações nas respostas bioquímicas, fisiológicas, enzimáticas, etc. 2.1. Classificação 1º Classificação: Exposição: são vistas respostas no organismo que demonstram que o mesmo foi exposto a um composto tóxico. Tais respostas podem consistir na presença do contaminante ou de metabólitos do mesmo no organismo. Ou presença de produtos da interação entre o contaminante e uma molécula do organismo. Efeito: já há registro de estresse no organismo por ação de um contaminante. Alterações bioquímicas, fisiológicas, comportamentais ou outras que demonstrem que o organismo está fora de sua condição de bem-estar. Trata-se de um efeito deletério que induz a um mecanismo de defesa. 2ª Classificação: Tóxico-específicos: agente causador de toxicidade conhecido (Exemplo: ALAD, Chumbo). Não-específicos: agente causador de toxicidade não conhecido (Exemplo: Sistema Imunológico). 3ª Classificação: De acordo com a resposta: Bioquímicos, Fisiológicos, Morfológicos, etc. 2.2. Utilização de um Biomarcador Como Instrumento de Avaliação Ambiental: Ambiente a ser avaliado (Exemplo: Saco da Mangueira): é preciso que haja uma caracterização mínima de seus parâmetros físico-químicos, de suas principais espécies, seu histórico quanto à contaminação, etc.; Ambiente Controle (Exemplo: Saco do Justino); Escolha dos locais (exemplos anteriores), espécies (presentes em ambos os ambientes), biomarcadores; Coleta de amostras representativa da população exposta e Controle (mais comum); Ou coleta da amostra ambiental e exposição dos organismos em laboratório; O nível do biomarcador deve indicar o nível de degradação (biomarcadores em cascata); Exemplos: Proteínas de estresse (Não-específico / Efeito): heat-shock proteins. São verificadas alterações nessas proteínas sob qualquer condição de estresse; Danos genéticos (Não-específico / Efeito); Integridade da membrana (Não-específico / Efeito); Exemplo de estudo: Estudo de exposição ao Cobre em três grupos de organismos: Bivalve filtrador; Gastrópode pastador; Crustáceo Onívoro. Foi verificada a morte em um nível populacional. Biomarcadores utilizados: Fisiológico: Freqüência Cardíaca (FC) e Nível de Proteínas no Sangue (Prot.); Celular: Estabilidade da Membrana Lisossômica (EML); Bioquímico: MT (Metalotioneínas) e AChE (Acetilcolina Esterase). Seqüência de Respostas Esperada: As repostas observadas foram muito variadas para os três grupos de organismos nas diferentes concentrações em que foram expostas. Em muitos casos, não houve resposta de acordo com a seqüência esperada. 3. Respostas Ecológicas Refere-se à constatação de que o dano ecológico já ocorreu. Exemplo: Respostas interessantes, mas que já evidenciam dano ao ambiente de difícil reversão. 4. Aspectos da Legislação – Ecotoxicologia CONAMA 344 – Material Dragado CONAMA 375 – Classes dos Corpos de Água O efluente do Vieira não deveria causar toxicidade!!! Para pensar! De uma maneira geral, a legislação brasileira exige testes agudos ou crônicos (nem cita o uso de biomarcadores), apenas complementares às análises químicas. Vantagens e Desvantagens das três principais ferramentas ecotoxicológicas para avaliação ambiental: testes de toxicidade (agudo/crônico), biomarcadores, respostas ecológicas (diversidade, densidade, etc.). Como foi avaliado o impacto toxicológico sobre o Arroio Vieira.
