dissertação. final. com numeração

UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Fernanda Elízia Silva Mendes
CORRELAÇÃO ENTRE A SUSCEPTIBILIDADE IN VITRO E A ATIVIDADE IN
VIVO DO FLUCONAZOL EM MODELO MURINO DE INFECÇÃO CEREBRAL
CAUSADA POR Cryptococcus gattii
Governador Valadares
2009
FERNANDA ELÍZIA SILVA MENDES
CORRELAÇÃO ENTRE A SUSCEPTIBILIDADE IN VITRO E A ATIVIDADE IN
VIVO DO FLUCONAZOL EM MODELO MURINO DE INFECÇÃO CEREBRAL
CAUSADA POR Cryptococcus gattii
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas da Universidade Vale do Rio
Doce – Univale, para a obtenção do
título
de
Mestre em Ciências
Biológicas. Área de Concentração:
Imunopatologia
das
Doenças
Infecciosas.
Orientador: Dr. Daniel de Assis Santos
Governador Valadares
2009
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pelo cuidado e por iluminar minha vida sempre.
Aos meus pais, Moreira e Ecy, pelo incansável e incondicional apoio. Obrigada por
não permitirem que eu desista dos meus sonhos.
Ao meu marido Cláudio, pelo amor, paciência e companheirismo... sempre.
Aos meus irmãos, Fabrício e Flaviane, pela amizade e por desejarem sempre meu
sucesso e felicidade.
Ao meu orientador Daniel, por ter me dado a oportunidade de aprender e por se
fazer presente em todos os momentos necessários. Obrigada pelas palavras de
incentivo, pela dedicação, paciência e disponibilidade.
À Lorena pela preciosa ajuda durante todo o desenvolvimento deste trabalho.
Às técnicas do laboratório de Microbiologia, Elaine e Adiléia, pela presteza em me
auxiliarem sempre que precisei.
À professora Elaine Speziali por possibilitar a quantificação de citocinas.
Ao Daniel Alvarenga pelo auxílio na análise histopatológica.
À Renatha pela amizade, companheirismo e pelos conselhos.
A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste estudo.
RESUMO
Um bioensaio para a quantificação de fluconazol no tecido cerebral murino foi
desenvolvido. Camundongos Swiss receberam infusões diárias do antifúngico e o
cérebro dos animais foi retirado em diferentes períodos durante 14 dias. O método
apresentou linearidade adequada. A concentração da droga variou de 12,98 a 44,60
µg/mL no primeiro e último dia respectivamente. O ensaio foi usado para avaliar a
terapia com o fluconazol em modelo de infecção cerebral causada por Cryptococcus
gattii. Camundongos Swiss foram infectados intracerebralmente e tratados
diariamente com fluconazol durante 7, 10 e 14 dias. O tratamento antifúngico reduziu
a carga fúngica, mas um aumento no crescimento do microrganismo foi observado
no dia 14. A concentração inibitória mínima do fluconazol contra isolados
sequenciais foi 16 µg/mL, exceto para os isolados obtidos de animais tratados por 14
dias, nesse grupo a CIM foi 64 µg/mL. Esse fato foi correlacionado com o aumento
da concentração do antifúngico e com a carga fúngica. A quantificação de citocinas
dos animais com 10 dias de infecção revelou predomínio da resposta Th1 (IFN-γ e
IL-12) no grupo não-tratado e aumento na produção de citocinas Th2 (IL-10 e IL-4)
no grupo tratado. A análise histopatológica do cérebro dos animais mostrou um
maior número de células microgliais nos animais do grupo não-tratado comparado
ao grupo tratado. O modelo animal de criptococose cerebral demonstrou ser útil para
estudos in vitro-in vivo. Nossos dados revelaram a possibilidade de adquirir
resistência durante a terapia antifúngica.
Palavras-chave: Fluconazol. Susceptibilidade. Criptococose.
ABSTRACT
A bioassay for the quantitation of fluconazole in murine brain tissue was developed.
Swiss mice received daily injection of the antifungal and the brains were withdrawn in
different moments during 14 days. The method presented adequate linearity. The
drug concentrations varied from 12.98 to 44.60 µg/mL at the first and the last day,
respectively. This assay was used to evaluate the therapy with fluconazole in a
model of cerebral infection caused by Cryptococcus gattii. Swiss mice were
intracranial infected and daily treated with fluconazole during 7, 10 or 14 days. The
antifungal treatment reduced the fungal burden, but an increase of the fungal growth
was observed at the day 14. The minimum inhibitory concentration for fluconazole
against sequential isolates was 16 µg/mL, except for the isolates obtained from
animals treated during 14 days, for which MICs were 64 µg/mL. This fact was
correlated with the increase of the antifungal levels and also of the fungal burden.
Cytokines quantitation at 10 days of infection revealed a predominance of Th1
response (IFN-γ and IL-12) in the non treated group and elevation of Th2 cytokines
(IL-10 and IL-4) in the treated group. Histopathology of the brain of animals showed
an increased number of microglial cells in the non treated group compared to the
group treated. Furthermore, the animal model of cerebral cryptococcosis
demonstrated to be useful for in vitro-in vivo studies. Our data revealed the possibility
of acquired resistance during the antifungal drug therapy.
Keywords: Fluconazole. Susceptibility. Cryptococcosis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Foto 1 - Cryptococcus spp. em preparação com tinta nanquim.................................27
Foto 2 - Cultivo de C. gattii em Ágar Sabouraud Dextrose........................................27
Foto 3 - Teste canavanina-glicina-bromotimol (CGB) para identificação de C. gattii e
C. neoformans............................................................................................................27
Foto 4 - Exame direto de leveduras crescidas em meio ASD submetido à coloração
com tinta nanquim......................................................................................................55
Foto 5 - Células microgliais em quantidade moderada obtido do cérebro de
camundongos Swiss não-tratados com fluconazol e infectados com isolados de C.
gattii ATCC 32608......................................................................................................59
Foto 6 - Células microgliais em quantidade leve obtido do cérebro de camundongos
Swiss tratados com fluconazol e infectados com isolados de C. gattii ATCC
32608..........................................................................................................................60
Gráfico 1 - Logaritmo do número de UFC/g encontrado no cérebro dos camundongos
infectados via intracerebral com isolados de C. gattii e pertencentes aos grupos nãotratado (NT) e tratado (T), sacrificados respectivamente com 7, 10 e 14 dias de
infecção......................................................................................................................54
Gráfico 2 - Concentrações de fluconazol detectadas no cérebro de camundongos
sacrificados após 1, 2, 4, 8, 10, 12 e 14 dias de infusão da droga e os valores de
CIM para o fluconazol frente aos isolados obtidos no grupo tratado.........................57
Gráfico 3 - Teor de citocinas obtido de sobrenadante de cultura de células de baço
de camundongos Swiss após 10 dias de infecção com isolados de C. gattii.............58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Concentrações de fluconazol determinada pelo ensaio microbiológico
usando o cérebro de camundongos Swiss após a administração diária de fluconazol
(40 mg/Kg), durante 1, 2, 4, 8, 10, 12 ou 14 dias.......................................................53
Tabela 2 - Valores da CIM do fluconazol frente a isolados sequenciais de C. gattii
obtidos de camundongos pertencentes aos grupos tratado (T) e não tratado (NT),
sacrificados após 7, 10 e 14 dias de infecção............................................................56
Tabela 3 - Correlação entre as concentrações de fluconazol determinadas no
cérebro dos camundongos nos diferentes tempos de sacrifício com a CIM do grupo
tratado (T) e o número de UFC/g no cérebro para animais tratados (T) e não tratados
(NT)..............................................................................................................................56
LISTA DE ABREVIATURAS
AMФ - Macrófagos Alveolares
CO2 - Dióxido de carbono
ConA - Concanavalina A
DMSO – Dimetilsulfóxido
GaIXM - Galactoxilomanana
GXM – Glicuronoxilomanana
HE - Hematoxilina Eosina
H2O2 - Peróxido de hidrogênio
IFN-γ - Interferon gama
IL - Interleucina
iNOS - Óxido nítrico-sintase induzida
LCR - Líquido cefalorraquidiano
mg -miligramas
mL - mililitro
MOPS - Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico
NK - Células matadoras naturais (“natural Killer”)
nm - nanômetro
OPD - Ortofenilenodiamina
pg - picograma
Th - Linfócito T auxiliar (T “helper”)
Th1- Linfócito T auxiliar (T “helper”) do tipo 1
Th2 - Linfócito T auxiliar (T “helper”) do tipo 2
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
var. - Variedade
µg - Micrograma
µL - Microlitro
µm - Micrometro
5-FC - 5-Flucitosina
LISTA DE SIGLAS
AFLP - Amplificação de Fragmentos Aleatórios do DNA (“Amplified Fragment Lengh
Polimorphism”)
AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
APCs - Células Apresentadoras de Antígenos
ASD - Ágar Sabouraud Dextrose
ATCC - Coleção de Cultura Americana (“American Type Culture Collection”)
CGB - Canavanina-Glicina-azul de Bromotimol
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Instituto de Padronização Clínico Laboratorial (“Clinical and Laboratory
Standards Institute”)
DC - Células Dendríticas
ELISA - Ensaio de Imunoabsorção por Ligação Enzimática (“Enzime Linked
Immunosorbent Assay”)
g - grama
h - horas
HAART - Terapia anti-retroviral altamente eficaz (“Highly Active Antiretroviral
Therapy”)
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
IMC - Imunidade Mediada por Células
Kg - quilograma
NO - Óxido Nítrico
NOS - Óxido Nítrico Sintases
OMS - Organização Mundial da Saúde
PBS - Tampão Salina Fosfato (“Phosphate Buffered Saline”)
PBS-BSA - Tampão Salina Fosfato-Albumina Bovina (“Phosphate Buffered SalineAlbumin Bovine”)
RFLP - Fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (“Restriction
Fragment Length Polymorphism”)
RPMI - Meio de cultura desenvolvido pelo Roswell Park Memorial Institute
SNC - Sistema Nervoso Central
UFC - Unidades Formadoras de Colônias
LISTA DE SÍMBOLOS
% - porcentagem
ºC - grau Celsius
> - maior
< - menor
≥ - maior ou igual
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
16
2.1 A CRIPTOCOCOSE
16
2.2 AGENTES ETIOLÓGICOS
17
2.3 ECOLOGIA
18
2.4 EPIDEMIOLOGIA
20
2.5 FATORES DE VIRULÊNCIA
22
2.6 QUADRO CLÍNICO
24
2.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
26
2.8 TRATAMENTO
28
2.9 TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS
32
2.10 RESPOSTA IMUNE NA CRIPTOCOCOSE
35
2.11 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA NA CRIPTOCOCOSE
38
3 OBJETIVOS
40
4 JUSTIFICATIVA
41
5 METODOLOGIA
43
5.1 DETERMINAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO CENTRAL DE FLUCONAZOL
43
POR MÉTODO MICROBIOLÓGICO
5.1.1 Construção da curva analítica
43
5.1.1.1 Droga antifúngica
43
5.1.1.2 Isolado
43
5.1.2 Determinação da concentração de fluconazol no cérebro de
44
animais
5.1.2.1 Droga antifúngica
44
5.1.2.2 Isolado
44
5.1.2.3 Animais e infusão de fluconazol
45
5.2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL INTRACEREBRAL POR Cryptococcus gattii
46
5.2.1 Isolado
46
5.2.2 Teste piloto
46
5.2.3 Métodos de anestesia e inoculação
47
5.3 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AO FLUCONAZOL UTILIZANDO
47
MÉTODO DA MICRODILUIÇÃO EM MEIO LÍQUIDO
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS
49
5.4.1 Animais
49
5.4.2 Preparação de suspensões de células do baço
49
5.4.3 Quantificação de citocinas por Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
50
5.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
51
6 RESULTADOS
52
6.1 DETERMINAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO CENTRAL DE FLUCONAZOL
52
POR MÉTODO MICROBIOLÓGICO
6.2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL INTRACEREBRAL POR Cryptococcus gattii
53
ATCC 32601
6.3 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AO FLUCONAZOL UTILIZANDO
55
MÉTODO DA MICRODILUIÇÃO EM MEIO LÍQUIDO
6.4 QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS
57
6.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
59
7 DISCUSSÃO
61
8 CONCLUSÃO
69
REFERÊNCIAS
70
ANEXOS
83
14
1 INTRODUÇÃO
Cryptococcus spp. constitui um gênero de leveduras capsuladas causadoras
de
micose
profunda
tanto
em
indivíduos
imunocomprometidos
como
em
imunocompetentes (PFALLER et al., 2004). A meningoencefalite é a apresentação
clínica mais frequente da doença (ALLER et al., 2000). Duas espécies são as
principais responsáveis pela infecção: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus
gattii, sendo a primeira responsável pela maioria dos casos em imunocomprometidos
e a segunda responsável por acometer principalmente imunocompetentes. No
entanto, o número de indivíduos acometidos por ambas as espécies fúngicas
aumentou em diversas partes do mundo. Até o momento a maioria dos estudos tem
focado apenas na espécie C. neoformans e pouco se conhece sobre a espécie C.
gattii.
Atualmente, o tratamento da condição é realizado com um pequeno número
de agentes antifúngicos e a terapia convencional tem apresentado efeitos adversos.
O fluconazol é um antifúngico que apresenta um bom perfil terapêutico, uma vez que
apresenta menor toxicidade, porém, vários registros mostram a seleção de isolados
de Cryptococcus spp. resistentes a esta droga. A falta de um regime fungicida
efetivo e a recente seleção de isolados de C. neoformans e C. gattii resistentes,
demonstram a necessidade do estabelecimento de regimes terapêuticos seguros e
eficazes (LARSEN et al., 2004).
A análise da atividade de antifúngicos permite a comparação entre diferentes
antimicóticos, o que pode auxiliar na escolha da terapia (SANTOS; HAMDAN, 2007).
Vários estudos com o objetivo de determinar a concentração inibitória mínima (CIM)
de antifúngicos, por meio de testes de susceptibilidade, foram desenvolvidos porém
pontos de corte não foram estabelecidos para o fluconazol frente a Cryptococcus
spp. (LARSEN et al, 2005b). A maioria dos estudos de susceptibilidade de
antifúngicos para Cryptococcus spp. tem sido realizados com isolados clínicos ou
ambientais de C. neoformans e existe uma escassez de dados sobre a
susceptibilidade de C. gattii a diferentes antifúngicos. Alguns poucos estudos têm
relatado que isolados clínicos de C. gattii são relativamente menos sensíveis do que
C. neoformans a anfotericina B, 5-flucitosina e azóis (KHAN et al., 2009).
15
Experimentos utilizando modelos animais de criptococose podem auxiliar, em
muito, no estabelecimento de pontos de corte das drogas antifúngicas. Apesar do
grande número de estudos envolvendo modelos animais de criptococose, não foi
encontrado na literatura nenhum trabalho que correlacionasse a resposta do animal
à terapia com resultados de testes de susceptibilidade. No presente estudo foi
avaliada a atividade in vitro e in vivo do fluconazol contra C. gattii. A concentração de
fluconazol no cérebro dos animais foi determinada por meio de um ensaio
microbiológico e os resultados foram correlacionados com a concentração inibitória
mínima de isolados sequenciais do microrganismo. Além disso, avaliou-se o padrão
de citocinas produzidas em resposta à infecção a fim de conhecer o tipo de resposta
imune hospedeira associada ao controle da infecção na presença do fluconazol.
Exame histológico do órgão acometido também foi realizado para analisar possíveis
alterações quantitativas nas células microgliais. Os resultados apresentados no
decorrer do trabalho poderão ser úteis para o melhor norteamento da terapia contra
a infecção causada por C. gattii.
16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A CRIPTOCOCOSE
Dentro do gênero Cryptococcus spp. as espécies Cryptococcus neoformans
(sorotipos A, D e AD) e Cryptococcus gattii (sorotipos B e C) são os principais
patógenos causadores de doença em humanos (MERSHON et al., 2009). O
antígeno que determina os sorotipos das leveduras é composto fundamentalmente,
por glicuronoxilomanana (GXM) (FELDMESSER; KRESS; CASADEVALL, 2001). Os
sorotipos diferem em aspectos ecológicos, epidemiológicos, fisiológicos e genéticos
(REZENDE; MUNHÓZ; ALMEIDA, 2008). C. neoformans foi isolado e identificado
pela primeira vez como patógeno humano, em 1894, em uma lesão de tíbia
(CASADEVALL; PERFECT, 1998) e, a partir de 1980, sua importância clínica
aumentou devido à maior incidência em virtude do aparecimento da síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS) e da crescente utilização de fármacos
imunossupressores (PAPPALARDO; MELHEM, 2003). O primeiro isolamento
ambiental de C. gattii foi em 1990, associado ao Eucalyptus camaldulensis (ELLIS;
PFEIFFER, 1992). No Brasil, os primeiros relatos da doença ocorreram nos anos de
1941 e 1944, descritos por Carlos da Silva Lacaz e Floriano de Almeida (REISFILHO
et
al.,
1985).
Cryptococcus
spp.
pode
também
infectar
animais,
especialmente gatos (MITCHELL; PERFECT, 1995), porém, nenhuma transmissão
de criptococose entre animais ou seres humanos foi relatada (SORRELL, 2001).
A criptococose é uma condição infecciosa fúngica predominantemente
oportunista que ocorre com grande frequência em pacientes imunodeprimidos com
alguma doença de base como, por exemplo, AIDS, neoplasias linfoproliferativas ou
sarcomas, diabetes e em transplantados (CASADEVALL; PERFECT, 1998;
PAPPALARDO; MELHEM, 2003). No hospedeiro imunocompetente, a infecção é
muitas vezes assintomática e limitada ao pulmão. Contudo, em pacientes com a
imunidade comprometida, pode ocorrer disseminação extrapulmonar para o sistema
nervoso central (SNC), sendo a meningoencefalite a apresentação clínica mais
comum da criptococose (FELDMESSER; KRESS; CASADEVALL, 2001).
17
Acredita-se que a infecção por Cryptococcus spp. seja adquirida pela inalação
de basidiósporos ou células dissecadas da levedura (SORRELL, 2001) que se
depositam nos alvéolos, comprometendo inicialmente o pulmão de onde pode
disseminar-se para outros órgãos (RETINI et al., 2001).
A criptococose causada por C. neoformans caracteriza-se por ser uma
doença generalizada, que pode causar infecção em indivíduos hígidos, mas a maior
proporção de humanos afetados são os indivíduos imunocomprometidos. Esses
podem não responder satisfatoriamente ao tratamento com antifúngicos de forma
que o decurso da doença é geralmente fatal. Por outro lado, a doença causada por
C. gattii se diferencia por acometer principalmente indivíduos imunocompetentes,
sendo considerado um patógeno não-oportunista relacionado à criptococose de
ocorrência endêmica e focal. Nesse caso, ocorre manifestação pulmonar exuberante
que em grande parte das vezes responde bem ao tratamento com antifúngicos e
comporta bom prognóstico (LACAZ et al., 2002a; PAPPAS et al., 2001).
2.2 AGENTES ETIOLÓGICOS
Identificados ao longo dos anos nos gêneros Saccharomyces, Cryptococcus,
Torula e Debaryromyces, em 1935, todos os isolados causadores da criptococose
foram classificados em um só gênero e espécie – Cryptococcus neoformans
(CASADEVALL; PERFECT, 1998). Evans em 1949 descreveu os sorotipos A, B e
C. Posteriormente foram identificados os sorotipos D e AD. Em 1975, Kwon-Chung,
baseada em seus estudos com cruzamento sexuado entre os isolados que
causavam a micose, propôs duas variedades para a espécie de C. neoformans: a
variedade C. neoformans var. neoformans (sorotipos A, D e AD) e a variedade C.
neoformans var. gattii (sorotipos B e C) (LAZÉRA; IGREJA; WANKE, 2004).
Franzot, Salkin e Casadevall (1999), por meio do método de Restriction
Fragment Length Polymorphism (RFLP) fizeram análises moleculares de C.
neoformans e baseados em evidências genotípicas e fenotípicas, propuseram
separar os sorotipos A, D e AD em duas variedades distintas da mesma espécie.
Assim, C. neoformans var. neoformans compreende os sorotipos D e AD e C.
neoformans var. grubii compreende o sorotipo A.
18
Estudos moleculares mais recentes mostraram também que a variedade C.
gattii deve ser reconhecida como uma espécie. Barreto de Oliveira et al. (2004), por
meio de Analyse Fragment Lengh Polimorphism (AFLP), analisaram a estrutura
genética do C. neoformans revelando a existência de dois genótipos principais e
portanto duas espécies distintas. C. neoformans compreende os genótipos VN I a
VN IV e C. gattii os genótipos VG I a VG IV (KHAN et al., 2009). Já foram descritas
aproximadamente 40 diferentes espécies do gênero Cryptococccus (CASADEVALL;
PERFECT, 1998).
C. neoformans e C. gattii são leveduras ovaladas variando de 3 a 8 µm de
diâmetro, envoltos por uma cápsula de polissacarídeos (JANBON, 2004). O estado
leveduriforme corresponde à forma assexuada de Cryptococcus spp. e sua
reprodução ocorre por brotamento único ou múltiplo a partir de qualquer ponto da
parede celular. Entretanto, esse microrganismo apresenta reprodução sexuada
correspondendo ao estado perfeito, sendo identificado na classe Basidiomicetes,
família Filobasidiaceae e gênero Filobasidiella. Na reprodução sexuada, forma
teleomórfica, os isolados são heterotálicos e têm como característica principal a
produção de basidiósporos e, ocasionalmente, pseudo-hifas (KWON-CHUNG, 1976).
Os basidiósporos de C. neoformans (Filobasidiella neoformans) são esféricos,
alongados ou cilíndricos, com a parede ligeiramente rugosa, enquanto os de C. gattii
(Filobasidiella bacillispora) são baciliformes e de parede lisa (MITCHELL; PERFECT,
1995).
Todas as espécies de Cryptococcus spp. não fermentam glicose, hidrolisam
amido, assimilam inositol e produzem urease. Estas características, bem como as
características morfológicas da cápsula e a rara presença de pseudo-hifas distinguios de outras leveduras clinicamente importantes (CASADEVALL; PERFECT, 1998).
2.3 ECOLOGIA
C. neoformans é cosmopolita, encontrado principalmente em fezes de
pombos e excretas de outras aves, sobretudo aquelas relacionadas à criação em
cativeiro, no ambiente doméstico, como canários, periquitos e papagaios (FILIÚ et al,
2002). As excretas das aves são ricas em creatinina e constituem importantes
19
substratos para a levedura, uma vez que a creatinina é assimilada pelo fungo
(POLACHECK;
KWON-CHUNG,
1980).
As
aves
não
se
tornam
doentes
provavelmente porque sua temperatura corporal relativamente elevada é prejudicial
ao fungo. Contudo, esses animais são capazes de distribuir a levedura na natureza,
favorecendo a aquisição da doença (MITCHELL; PERFECT, 1995). Mais
recentemente, foi demonstrada em diferentes localidades, a ocorrência natural de C.
neoformans colonizando ocos de árvores vivas (FERNANDES et al., 2000). Estudos
posteriores apresentaram um novo habitat natural e possível nicho ecológico do
fungo, relacionado à madeira em decomposição em diferentes árvores tropicais,
inclusive do Brasil (LAZÉRA et al., 1998; LAZÉRA et al., 2000).
O primeiro isolamento ambiental de C. gattii foi descrito em 1990 na Austrália
associada a uma árvore nativa da região da espécie Eucalyptus camaldulensis
(ELLIS; PFEIFFER, 1992). Nas regiões Norte e Central da Austrália, o fungo é
endêmico (EINSIEDEL; GORDON; DYER, 2004). C. gattii foi exportado da Austrália
para outras partes do mundo por meio de sementes do E. camaldulensis, contendo o
micélio dicariótico da levedura (MELO et al., 1993). A dispersão dos basidiósporos
no ambiente ocorre concomitantemente com o período de floração do eucalipto
(SORREL, 2001). Estudos ambientais mais recentes demonstraram um novo habitat
relacionado à madeira em decomposição em ocos de árvores tropicais de diferentes
espécies (Cassia grandis, Senna multijuga, Ficus microcarpa, Moquilea tometosa e
Guettarda acreana) nas regiões Norte e Nordeste do Brasil (LAZÉRA et al., 1998;
LAZÉRA et al., 2000; FORTES et al., 2001), o que pode sugerir que C. gattii bem
como C. neoformans não estão associados a uma árvore específica, mas a um nicho
especializado resultante da biodegradação natural da madeira (LAZÉRA et al.,
2000).
Os casos humanos de infecção por C. gattii predominam em regiões tropicais
e subtropicais, no entanto, um surto recente da infecção causada por C. gattii na ilha
de Vancouver, Canadá, indicou o surgimento da infecção em clima temperado
(KHAN et al., 2009; KIDD et al., 2004; MERSHON et al., 2009), aumentando o
interesse no estudo deste patógeno (JAIN et. al., 2006). Em 2001 e 2002, C. gattii foi
isolado de árvores nativas de Vancouver como Arbutus menziensii, Alnus spp.
Cedrus spp. e Pseudotsuga spp. (KIDD et al., 2004). Provavelmente, as alterações
climáticas, sobretudo o aquecimento global, favoreceram a colonização de C. gattii
20
em ambientes de clima temperado (DATTA; BARTLETT; MARR, 2009; KIDD et al.,
2004).
2.4 EPIDEMIOLOGIA
Não se tem idéia da exata prevalência da criptococose em todo o mundo. É
certo que após o advento dos transplantes e o surgimento da AIDS sua frequência
aumentou de maneira significativa, sendo C. neoformans o agente mais incriminado
como causa de meningite em indivíduos com AIDS (DANNAOUI et al., 2006;
MANSOUR et al., 2004). Em muitos pacientes a criptococose é a primeira indicação
de AIDS (MITCHELL; PERFECT, 1995). O estado imune do hospedeiro pode ser um
determinante significativo da infecção causada por C. neoformans ou por C. gattii.
Nos estudos de Chen et al. (2000), 80% dos pacientes infectados com C.
neoformans estavam imunocomprometidos e, 89% das infecções causadas por C.
gattii ocorreu em hospedeiros imunocompetentes.
Antes de 1981 a criptococose era uma infecção rara, com um número total de
casos entre 500 a 1000 nos Estados Unidos. Desde então, pacientes em estágios
avançados de AIDS foram associados com marcada susceptibilidade à infecção por
C. neoformans. No início dos anos 90, a criptococose foi epidêmica em algumas
regiões. Em 1991 apenas na cidade de Nova York foram registrados 1200 casos de
meningite criptococócica (CASADEVALL; PERFECT, 1998). C. neoformans e C.
gattii são endêmicos na Austrália e Nova Guiné onde a criptococose tem sido
relatada principalmente em aborígenes (CHEN et al., 2000). No Brasil, 215.810
casos de AIDS foram registrados entre 1980 a 2002, sendo a criptococose
diagnosticada em 6% desses pacientes e São Paulo o estado com maior incidência
(MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, 2002).
A criptococose é considerada atualmente a doença oportunista com maior
morbidade e mortalidade entre os pacientes soropositivos (MOREIRA et al., 2006). A
doença já foi relatada em diversos estados do Brasil como Mato Grosso do Sul
(FILIÚ et al., 2002), Minas Gerais (MOREIRA et al., 2006; SILVA et al., 2008;
SOARES et al., 2008), Pará, Roraima, Amazonas (CORRÊA et al., 1999), Piauí,
Maranhão (SEVERO; OLIVEIRA; LONDERO, 1999), São Paulo (ALMEIDA et al.,
21
2007; LACAZ et al., 2002b), Rio de Janeiro (LACAZ et al., 2002a), Espírito Santo
(BALTAZAR; RIBEIRO, 2008) e Rio Grande do Sul (REOLON; PEREZ; MEZZARI,
2004). C. neoformans é prevalente nos estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do
Sul e C. gatti é endêmico no Pará, Maranhão, Piauí e outros estados nordestinos,
provocando doença em indivíduos imunocompetentes (SEVERO; OLIVEIRA;
LONDERO, 1999). Segundo Barreto de Oliveira et al. (2004), a diversidade
genotípica de Cryptococcus spp., no Brasil, é distribuída em C. neoformans var.
grubii sorotipo A (65%), C. neoformans var. neoformans sorotipos D (9%) e AD (5%),
e C. gattii sorotipos B (17,5%) e C (3,5%).
Em todo o mundo, é estimado que 25% a 30% dos pacientes com AIDS
morrerão em virtude da meningite criptococócica. Sua incidência varia em diferentes
partes do planeta apresentando-se entre 5 a 10% na Europa Ocidental e Estados
Unidos e mais de 20% na África Central e leste da Ásia (LARSEN et al., 2004;
MITCHELL; PERFECT, 1995). De acordo com os estudos de Pappalardo e Melhem
(2003) desenvolvidos no Brasil, a letalidade da infecção criptococócica com ou sem
condição predisponente, situa-se entre 45% a 65%.
Estudos apontam que a criptococose ocorre com maior prevalência no sexo
masculino tendo sido observado em algumas pesquisas que aproximadamente 80%
dos casos de criptococose do SNC pertencem a este sexo (FERNANDES et al.,
2000; MOREIRA et al., 2006; SILVA et al., 2008). Chen et al. (2000) também
observaram um predomínio da doença no sexo masculino, principalmente em
indivíduos imunocompetentes infectados com C. gattii. O fato foi atribuído a maior
exposição de homens ao reservatório ambiental do fungo, influências hormonais
e/ou predisposição genética. É relatado também a rara ocorrência da doença em
crianças (CHEN et al., 2000; FERNANDES et al., 2000; MOREIRA et al., 2006),
entretanto, na região Norte do Brasil, houve um incremento nos relatos da
criptococose nessa faixa etária (CORRÊA et al., 1999).
Em Minas Gerais, foi relatado um caso de criptococose com envolvimento do
SNC causado por C. gattii em uma criança de 10 anos de idade sem sinal aparente
de imunossupressão (SOARES et al., 2008). Lacaz et al. (2002b) identificaram em
São Paulo um caso de criptococose cutânea provocado por C. gattii em um homem
sem qualquer doença de base. Entre 1999 a 2003 a incidência da infecção por C.
gattii em Vancouver foi de 37 casos por milhão de habitantes por ano (KIDD et al.;
2004). Esta incidência é significativamente maior do que a infecção caudada por C.
22
gattii na Austrália (0,94 casos por milhão de habitantes por ano), onde C. gattii é
endêmico (CHEN et al., 2000). A infecção também foi diagnosticada em uma grande
variedade de animais em Vancouver (KIDD et al.; 2004). Nos últimos dois anos, nos
EUA, oito casos humanos de criptococose causada por C. gattii foram registrados
em Washington, sendo que quatro destes indivíduos não haviam viajado para fora
do estado. Nove casos foram relatados em Oregon. O potencial de dispersão de
linhagens de Cryptococcus spp. capazes de infectar imunocompetentes é motivo de
preocupação e C. gattii é atualmente um patógeno emergente na América do Norte
(MERSHON et al., 2009).
Outras espécies, como C. albidus, C. curvatus, C. laurentii, C. luteolus e C.
uniguttulatus também já foram isoladas de pacientes com diferentes formas de
criptococose (CASADEVALL; PERFECT, 1998; MITCHELL; PERFECT, 1995).
2.5 FATORES DE VIRULÊNCIA
Como muitos outros patógenos, Cryptococcus spp. é capaz de manipular o
sistema hospedeiro para facilitar a sua evasão (JONG et al., 2008). A cápsula do
Cryptococcus é a principal responsável por sua virulência e também por diversos
efeitos inibitórios sobre a resposta imune. A mesma é constituída de polissacarídeos,
polímeros de xilose, manose e ácido glicurônico, livres de nitrogênio e enxofre. O
antígeno que determina os sorotipos das leveduras é composto fundamentalmente
por 90% de GXM e em menores quantidades de galactoxilomanana (GaIXM) e
manoproteínas
(FELDMESSER;
KRESS;
CASADEVALL,
2001;
MITCHELL;
PERFECT, 1995). O tamanho da cápsula é determinado pelo genótipo e condições
de crescimento oferecidas, sendo que normalmente as leveduras apresentam
pequenas cápsulas quando no ambiente e cápsulas espessas durante a infecção
(MITCHELL; PERFECT, 1995). Os polissacarídeos capsulares inibem a fagocitose,
consomem complemento, adsorvem e neutralizam opsoninas e outros anticorpos
protetores. (LAZÉRA; IGREJA; WANKE, 2004). Além disso, conforme Larsen et al.
(2005a), os polissacarídeos capsulares podem ainda inibir a migração leucocitária;
induzir espalhamento de L-selectina; promover edema cerebral e desregulação na
produção de citocinas. Por todas estas razões, o polissacarídeo capsular de
23
Cryptococcus spp. é um importante fator de virulência que interfere com os
mecanismos de defesa do hospedeiro (DIXIT; CARROLL; QURESHI, 2009).
Cryptococcus spp. produz uma enzima fenoloxidase capaz de oxidar
substâncias fenólicas, como a tirosina, produzindo pigmento tipo melanina que se
deposita na parede e confere às colônias a cor escura (LACAZ et al., 2002a). Na
criptococose a melanina parece interferir na virulência da levedura, com grande
tropismo para o SNC, rico em catecolaminas como a L-DOPA (FELDMESSER;
KRESS; CASADEVALL, 2001). A melanina pode funcionar ainda como um
antioxidante que pode proteger Cryptococcus spp. da defesa oxidativa do
hospedeiro. Estudos anteriores mostraram que mutantes deficientes da enzima
fenoloxidase são mortos pelo sistema oxidativo do hospedeiro, enquanto que fungos
tipo selvagem são resistentes. A capacidade de produzir melanina também é um dos
fatores responsáveis pela dificuldade de obter sucesso na terapia antifúngica
(MITCHELL; PERFECT, 1995). A produção de melanina contribui ainda para a
proteção do fungo contra os raios ultravioletas provenientes da luz solar (DATTA;
BARTLETT; MARR, 2009).
A capacidade de crescer em condições fisiológicas também é um fator de
virulência do fungo (CASADEVALL; PERFECT, 1998). C. neoformans mantém sua
curva de crescimento a 38-39 ºC e começa a perder a viabilidade somente após 24 h
a 40 ºC. C. gattii possui limite de tolerância de 35 ºC e tem seu crescimento reduzido
a 37 ºC (LAZÉRA; IGREJA; WANKE, 2004).
De acordo com Jain et al. (2006) a capacidade de mudar fenotipicamente é
outro importante fator de virulência de Cryptococcus spp.. No estudo dos autores foi
observado que C. gattii é capaz de mudar de colônia lisa para rugosa sendo essa
mudança reversível em alguns sorotipos. O microambiente do hospedeiro pode
determinar o fenótipo rugoso ou liso dominante da população patogênica. A
mudança fenotípica tem papel crucial na patogênese e facilita a disseminação do
fungo para o SNC. A modificação fenotípica permite ainda que o patógeno se adapte
a diferentes microambientes, o que pode afetar a relação patógeno-hospedeiro com
consequências que podem levar à alteração na virulência. A capacidade de mudar
fenotipicamente foi associada com mudanças na cápsula polissacarídica, fato que
pode afetar a fagocitose ou impedir a rápida destruição da levedura pelo intenso
processo inflamatório.
24
O gene CPS1 da cápsula de C. neoformans codifica a síntese do ácido
hialurônico, que pode funcionar como molécula de adesão durante a infecção da
levedura (JONG et al., 2008). A produção de manitol pode contribuir para o aumento
da pressão intracraniana e na proteção fúngica contra o estresse, choque térmico,
diferenças osmóticas e radicais de oxigênio (DIXIT; CARROLL; QURESHI, 2009;
HOANG et al., 2004). É provável que a urease produzida por Cryptococcus spp.
facilite a disseminação da levedura para o SNC (DIXIT; CARROLL; QURESHI,
2009). Adicionalmente, a capacidade de secreção de proteinases e fosfolipases
extracelulares, tolerância a baixos pH e elevados níveis de sal também contribuem
para a patogenicidade do fungo (DIXIT; CARROLL; QURESHI, 2009).
2.6 QUADRO CLÍNICO
A criptococose se manifesta com quadros clínicos variados que incluem
desde um simples nódulo no pulmão até a disseminação sistêmica do
microrganismo (MANSOUR et al., 2004), dependendo do estado imunológico do
hospedeiro (HOANG et al., 2004). As manifestações clínicas gerais podem ser
inespecíficas. Geralmente, os doentes relatam história crônica com duração de
semanas ou meses caracterizada por febre baixa, anorexia e perda de peso. As
manifestações específicas são polimorfas e variam com os órgãos afetados
(KAVANAUGH; FRASER; DIETRICH, 2006; MITCHELL; PERFECT, 1995).
O pulmão é invariavelmente a porta de entrada e o sítio de infecção inicial de
Cryptococcus spp. A infecção pulmonar inicial pode ser assintomática, mas tem
potencial para disseminar no hospedeiro. Nos casos sintomáticos pode ocorrer tosse
(54%), dor no peito (46%), produção de escarro (32%), perda de peso (26%), febre
(26%) e hemoptise (18%). Outros sintomas podem ocorrer com menor frequência e
incluem dispnéia, suores noturnos, e obstrução da veia cava superior (MITCHELL;
PERFECT, 1995). As lesões pulmonares são frequentes, podendo ser primárias ou
secundárias (LACAZ et al., 2002a).
A maioria dos casos de lesões tegumentares é decorrente da doença
disseminada, ocorrendo em 10 a 15% dos casos de criptococose (TANEJA et al.,
2008). Tais lesões podem se apresentar como lesões acneformes, pápulas,
25
vesículas,
nódulos,
tumores,
abcessos,
úlceras
e
granulomas
superficiais
(MITCHELL; PERFECT, 1995). De acordo com Franzot, Salkin e Casadevall (1999),
C. neoformans var. grubii sorotipo A, é o agente etiológico predominante nas lesões
criptococócicas cutâneas. Lesões mucosas também podem ocorrer (LACAZ et al.,
2002a).
A criptococose disseminada corresponde a 90% dos casos diagnosticados
quando o paciente procura assistência médica (LAZÉRA; IGREJA; WANKE, 2004)
devido à diminuição da visão ou é encaminhado em decorrência de distúrbios
mentais, tais como confusão, depressão, ou agitação (MITCHELL; PERFECT, 1995).
A mais frequente manifestação de disseminação é a meningoencefalite sendo essa
a forma clínica mais importante e que se não tratada é fatal (POSTERARO et al.,
2003). Outros locais atingidos pela disseminação sistêmica da criptococose incluem
retina, conjuntiva, seios paranasais, esôfago, próstata, glândulas adrenais, ossos,
coração, fígado, linfonodos, articulações, músculos, rins e placenta (CASADEVALL;
PERFECT, 1998). Dentre os sintomas que podem ser encontrados pode-se citar
cefaléia intermitente ou contínua, diplopia, diminuição da visão chegando mesmo à
cegueira, nistagmo, letargia, sonolência, vômitos, hidrocefalia, rigidez de nuca,
fotofobia (PAPALLARDO; MELHEM, 2003), hipertensão intracraniana, redução do
estado de consciência, papiledema bilateral grave podendo ocorrer hemorragia da
retina e paralisia de nervos cranianos (EINSIEDEL; GORDON; DYER, 2004).
Segundo Chen et al. (2000), algumas características clínicas da criptococose
diferem conforme a espécie de Cryptococcus spp. A doença pulmonar localizada é
incomum em pacientes imunocomprometidos (11%) e é frequentemente associada a
hospedeiros imunocompetentes (60%), sendo esse sintoma mais comumente
associado à infecção causada por C. gattii.
Inversamente, 90% dos pacientes
imunocomprometidos apresentam meningite contra somente 30% a 40% dos
imunocompetentes. Nos estudos de Hoang et al. (2004) o envolvimento pulmonar
também foi significativamente mais comum em pacientes imunocompetentes,
enquanto
que
pacientes
HIV
positivos
apresentaram
principalmente
compromentimento do SNC. A presença de criptococomas (lesões de > 1 cm de
diâmetro)
nos
pulmões
ou
cérebro
são
mais
frequentes
em
pacientes
imunocompetentes, sendo associado à infecção por C. gattii (CHEN et al., 2000). A
ocorrência de disseminação para outros sítios é característica da infecção por C.
neoformans. De acordo com Lizarazo (2006), 60% dos pacientes com meningite
26
criptococócica e AIDS apresentam hipertensão intracraniana sem hidrocefalia no
momento do diagnóstico. Contudo, é importante mencionar que o estado imune
hospedeiro também é um fator determinante da apresentação clínica da
criptococose (SORRELL, 2001).
2.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O exame micológico direto do material suspeito submetido à coloração com
tinta nanquim (tinta da China) é considerado o padrão ouro para o diagnóstico
laboratorial da criptococose, uma vez que a tinta revela muito bem a cápsula do
agente etiológico (LACAZ et al., 2002a) (foto 1). A levedura pode ser isolada do
fluido cérebro-espinhal, dos tecidos, escarro e amostras respiratórias, raspados e de
aspirados de lesões cutâneas. Para o cultivo, utiliza-se o meio Sabouraud (foto 2). A
levedura cresce facilmente, formando colônias mucóides, lisas e úmidas, de
coloração branca a creme (MITCHELL; PERFECT, 1995).
O teste mais usado para diferenciar C. neoformans de C. gattii é o CGB (foto
3). C. gattii é resistente à L-canavanina metabolizando-a a produtos não tóxicos e
sendo portanto capaz de crescer no meio CGB, onde a glicina é utilizada como única
fonte de carbono e nitrogênio. A alcalinização do meio resulta da liberação de
amônia durante a degradação da glicina levando à elevação do pH e alteração da
cor do indicador para azul-cobalto. Por outro lado, C. neoformans é inibido pela Lcanavanina e não é capaz de crescer ou utilizar a glicina no meio CGB, portanto não
alteram o pH e a cor original do meio é mantida (CASADEVALL; PERFECT, 1998;
LAZÉRA; IGREJA; WANKE, 2004).
27
Foto 1 – Cryptococcus spp. em preparação com tinta
nanquim. Fonte: Lazéra, Igreja e Wanke, 2004
Foto 2 - Cultivo de C. gattii em Ágar Sabouraud
Foto 3 - Teste canavanina-glicinabromotimol (CGB). Á esquerda teste
CGB (+) identifica C. gatti. À direita teste
CGB (-) identifica C. neoformans. Fonte:
Canelo et al. (1999)
28
Nenhuma espécie do gênero Cryptococcus spp. fermenta açúcares e a
maioria produz urease (MITCHELL; PERFECT, 1995). A produção de melanina é
uma característica amplamente utilizada para a identificação de C. neoformans e C.
gattii em laboratório de pesquisa (PEDROSO et al., 2007). Os testes de aglutinação
de partículas de látex e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) são sensíveis
e específicos para detecção de antígenos capsulares (BROUWER et al., 2005). A
pesquisa de anticorpos específicos não se mostrou de utilidade prática até o
momento (LAZÉRA; IGREJA; WANKE, 2004). Exames subsidiários podem ser úteis
ou necessários como o hemograma, o exame liquórico e as provas radiológicas
(LACAZ et al., 2002a).
Os cortes histológicos corados pela Hematoxilina-Eosina (HE) permitem a
visualização dos basidiósporos de C. neoformans que se apresentam esféricos,
ovais ou elípticos com parede fina rósea ou azul pálido com 5 a 15 µm de diâmetro.
A cápsula não se cora pelo HE devido a sua natureza mucopolissacarídea,
permanecendo em seu lugar um halo claro. No entanto, a cápsula pode ser
visualizada pelas colorações PAS, azul alciano ou mucicarmim de Meyer (LACAZ et
al., 2002a).
A tomografia computadorizada e a ressonância magnética são muito
informativos com o último tendo sensibilidade muito elevada para a detecção e
caracterização das lesões criptococócicas (PATRO et al., 2009).
A medição da pressão do líquido cefalorraquidiano (LCR) durante a punção
lombar diagnóstica de meningite aguda é um procedimento simples com implicações
terapêuticas. A presença de meningite, LCR claro e alta pressão intracraniana
podem ser úteis para o diagnóstico diferencial de meningite por Cryptococcus spp. A
punção do LCR pode diminuir a hipertensão intracraniana e contribuir para a
redução das taxas de mortalidade e sequelas neurológicas nos pacientes que
recebem esse tipo de tratamento (LIZARAZO, 2006).
2.8 TRATAMENTO
Em decorrência dos fungos serem agentes eucarióticos, assim como o
hospedeiro humano, o desenvolvimento das drogas antifúngicas surgiu bem mais
29
tarde que os agentes antibacterianos e tem sido limitado (SIDRIM; ROCHA, 2004).
Além disso, o pequeno espectro de atividade, a toxicidade, a baixa estabilidade, a
falta de disponibilidade oral e o alto custo das drogas antifúngicas também limitam a
terapia com antifúngicos (WIDMER et al., 2006). Apesar dos diversos avanços
terapêuticos ainda é considerado difícil o tratamento da criptococose e vários
esquemas terapêuticos têm sido empregados (LARSEN et al., 2004).
A anfotericina B foi introduzida em 1950 e continua a ser a principal terapia de
escolha para o tratamento da meningite criptococócica. A 5-flucitosina (5-FC) foi
introduzida no final de 1970, e os azóis itraconazol e fluconazol foram introduzidos
no final dos anos de 1980 e início de 1990. Essas são as drogas mais utilizadas para
o tratamento da criptococose (LARSEN et al., 2004).
A anfotericina B é um poliênico cuja ação primária consiste na alteração da
permeabilidade celular da membrana fúngica. O fármaco liga-se ao ergosterol,
principal esterol da membrana celular dos fungos, produzindo poros ou canais
(SANGLARD, 2002) que aumentam a permeabilidade da membrana, permitindo o
extravasamento de íons e macromoléculas intracelulares, levando à morte da célula
fúngica (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2005). Esse fármaco tem se mostrado eficaz no
tratamento de todas as formas de criptococose, porém, a droga apresenta diversos
efeitos colaterais dentre os quais, nefrotoxicidade, fato que limita seu uso terapêutico
(BENNETT, 2003). Poucos relatos têm sido descritos na literatura sobre a
resistência à anfotericina B (SILVA et al., 2008) e tal resistência é explicada pelo
decréscimo da quantidade de ergosterol presente na membrana fúngica ou pela
modificação da molécula-alvo de esterol de modo a reduzir sua afinidade pela droga
(SHEPPARD; LAMPIRIS, 2005). Devido a alta nefrotoxicidade dessa droga, novas
formulações lipídicas de anfotericina B (lipossomal, em dispersão coloidal e
complexo lipídico) já estão disponíveis para uso clínico. Tais formulações são de
baixa toxicidade, fácil utilização e permitem alcançar doses mais elevadas em curto
espaço de tempo. Contudo, seu preço é tão alto que poucos pacientes podem
utilizá-la (MARTINEZ, 2006).
A 5-FC é captada pelas células fúngicas pela enzima citosina permease. A
droga apresenta mecanismo de ação que interfere na síntese do DNA da célula
fúngica. O uso do fármaco deve ser monitorado uma vez que apresenta toxicidade
para medula óssea com anemia, leucopenia e trombocitopenia (SHEPPARD;
LAMPIRIS, 2005). Além disso, essa droga não deve ser utilizada isoladamente uma
30
vez que podem ocorrer casos de resistência da célula fúngica. A taxa de recidiva da
meningite criptococócica com isolados resistentes a 5-FC é de 30 a 40%
(MITCHELL; PERFECT, 1995).
O fluconazol e o itraconazol são triazólicos que inibem a atividade da 14-αdemetilase lanosterol, uma enzima fundamental na síntese do ergosterol da célula
fúngica (DUNKEL, 2008). Sem a incorporação do ergosterol, a fluidez e a
estabilidade da membrana ficam comprometidas, assim como o crescimento e a
divisão celular. Esses fármacos possuem efeito fungistático nas concentrações
terapêuticas (SANGLARD, 2002). O surgimento de efeitos colaterais com fluconazol
não é comum, podendo alguns pacientes apresentar distúrbios gastrointestinais
relativamente insignificantes (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2005).
O fluconazol pode ser administrado por via oral ou intravenosa e sua
biodisponibilidade é de aproximadamente 90% após ingestão oral (KOKS et al.,
1996). No plasma, as concentrações máximas são obtidas 0,5 a 1,5 h após a
administração oral, com meia vida de 30 h (SIDRIM; ROCHA, 2004). A ligação a
proteínas plasmáticas é baixa possibilitando uma boa penetração no líquido
cefalorraquidiano. É excretado principalmente por via renal (KOKS et al., 1996). É
uma droga pouco tóxica e, entre todos os azóis é o que possui menos efeito sobre
as enzimas microssomais hepáticas (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2005). Porém,
diversos casos de isolados resistentes ao fluconazol já foram relatados (ALLER et
al., 2000; CASADEVALL; PERFECT, 1998; MITCHELL; PERFECT, 1995).
Alterações nas bombas de efluxo estão associadas à seleção de isolados de C.
neoformans resistentes ao fluconazol (POSTERARO et al., 2003).
O itraconazol é administrado por via oral. Esse fármaco apresenta boa
distribuição em tecidos queratinizados como a pele, entretanto, não alcança níveis
terapêuticos em alguns fluidos orgânicos como líquor e humor aquoso (SIDRIM;
ROCHA, 2004).
Estudos clínicos que testaram um único agente antifúngico contra a
criptococose obtiveram taxas de sucesso de 35 a 40%. Por outro lado, estudos que
utilizaram combinações de droga tiveram como resultado taxas de sucesso na faixa
de 55 a 65% em indivíduos com e sem AIDS (DIAMOND et al., 1998). Assim, as
melhorias no tratamento da meningite criptococócica vieram principalmente com a
utilização da combinação de antifúngicos. No entanto, a necessidade do uso
frequente de agentes tóxicos, particularmente a associação de anfotericina B e 5-FC,
31
e o recente surgimento de isolados de C. neoformans resistentes ao fluconazol
demonstram a necessidade de melhorias dos regimes terapêuticos e da utilização de
terapias combinadas que sejam menos tóxicas a fim de prevenir o aparecimento de
organismos resistentes (LARSEN et al., 2004).
A terapia de escolha mais comumente indicada para as formas disseminadas
da criptococose é a associação da anfotericina B com a 5-FC (MITCHELL;
PERFECT, 1995). A combinação dessas drogas permite uma menor quantidade de
anfotericina B a ser administrada com consequente diminuição na incidência de seus
efeitos colaterais, sem haver prejuízo na resposta terapêutica. No entanto, devido à
alta toxicidade para a medula óssea da 5-FC, o uso da droga exige monitoramento
terapêutico e não se encontra disponível no Brasil e em outros países da América
Latina (SIDRIM; ROCHA, 2004).
A toxicidade da anfotericina B e da 5-FC levou à prática comum de usar
anfotericina B com ou sem 5-FC durante um período curto de tratamento, seguido
por terapia com azóis. O fluconazol e o itraconazol têm sido associados à
anfotericina B em imunocomprometidos, sendo a combinação de anfotericina B e
fluconazol mais utilizada devido à capacidade dessa combinação de melhor
esterilização do líquor (LARSEN et al., 2004).
A introdução da terapia anti-retroviral altamente eficaz (HAART) a partir de
1995-1996 diminuiu a incidência da criptococose em todo o mundo. No Brasil dados
mostram que houve diminuição da ocorrência de meningite criptococócica em
pacientes com AIDS após a introdução da HAART, com redução do percentual de
7,7% em 1995 para 3,1% em 2001 (PAPPALARDO; MELHEM, 2003), mas ainda
assim existe uma clara e urgente necessidade de desenvolver antifúngicos mais
seguros e específicos contra a criptococose. Estudos in vitro demonstram que
isolados de Cryptococcus spp.
são sensíveis aos triazóis de última geração,
voriconazol (PERFECT et al., 2003) e posaconazol (PITISUTTITHUM et al., 2005).
Esses fármacos apresentam maior potência e espectro de ação mais amplo que os
antigos azóis, porém, seu custo é mais elevado. As equinocandinas não apresentam
boa atividade antifúngica contra Cryptococcus spp. (BERGOLD; GEORGIADIS,
2004).
Como a
maioria
dos
pacientes
com meningite
criptococócica
está
imunocomprometida, Larsen et al. (2005a), propuseram que uma alternativa lógica
para a melhoria dos resultados do tratamento nesses indivíduos seria melhorar a
32
resposta imune do hospedeiro. O método estudado pelos pesquisadores é a
administração de anticorpos que se ligam ao polissacarídeo capsular do fungo.
Segundo os autores, a administração de anticorpos contra o polissacarídeo capsular
do C. neoformans em camundongos infectados prolonga sua sobrevivência, reduz a
carga fúngica no tecido e reforça a formação do granuloma. Além disso, anticorpos
contra o polissacarídeo capsular aumenta a morte fúngica em camundongos
tratados com anfotericina B, fluconazol e 5-FC. Blasi et al. (1994) observaram que o
tratamento de camundongos com células de leveduras de C. neoformans inativados
pelo calor, alguns dias antes da infecção com organismos viáveis, aumenta o tempo
de sobrevivência dos animais e diminui o crescimento fúngico comparado a
camundongos sem nenhum tratamento prévio. Assim, o desenvolvimento de uma
vacina contra C. neoformans pode ser promissor.
2.9 TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS
O interesse e dedicação da comunidade científica pela padronização de
testes de susceptibilidade de fungos a drogas antifúngicas é relativamente recente.
O aumento na incidência de micoses sistêmicas e a mudança no espectro dos
microrganismos causadores dessas micoses aliado aos casos de resistência dos
fungos às drogas disponíveis, justificam o interesse no desenvolvimento de testes de
susceptibilidade in vitro para os antifúngicos (COLOMBO; ALVES, 2004).
O objetivo dos testes de susceptibilidade in vitro é prever a resposta do
paciente ao tratamento. Um teste in vitro que prediz com confiança a resposta clínica
do paciente permite ao clínico selecionar os medicamentos com melhor atividade,
estender tratamentos intensivos, indicar a utilização de combinação de drogas ou
substituir uma droga por outra (LARSEN et al., 2005b).
A fim de obter um método padrão, o Clinical and Laboratory Standards
Institute
(CLSI),
designou
um
subcomitê
para
padronizar
os
testes
de
susceptibilidade de fungos a drogas antifúngicas. As variáveis mais importantes na
definição do resultado final do teste e que foram objeto de padronização, incluíram a
definição de método e preparo do inóculo, composição e pH do meio a ser utilizado,
temperatura e tempo de incubação e determinação dos critérios de leitura do teste
33
(COLOMBO; ALVES, 2004). O protocolo aprovado M27 A2 é um método de
referência desenvolvido para facilitar a concordância entre laboratórios na
determinação da susceptibilidade de leveduras do gênero Candida e de C.
neoformans a agentes antifúngicos. O protocolo descreve os parâmetros para a
determinação da CIM dos antifúngicos para fungos leveduriformes por meio de
técnicas de diluição em meio líquido (CLSI, 2002). A CIM indica a atividade de uma
determinada droga antifúngica em condições laboratoriais e pode auxiliar na escolha
do
tratamento
mais
adequado
levando
em
consideração
fatores
como
farmacocinética, farmacodinâmica e mecanismos de resistência (RODRIGUEZTUDELA et al., 2008).
Apesar dos avanços na padronização dos testes de susceptibilidade e
embora a resistência in vitro do Cryptococcus spp. tenha sido associado à falha
clínica durante o curso da doença em alguns casos, ainda é limitado o número de
estudos que avaliam a potencial relação entre os resultados dos testes de
susceptibilidade in vitro obtido no momento do diagnóstico e o resultado do
tratamento da criptococose (DANNAOUI et al., 2006).
Estudos mostraram resistência in vitro quando a 5-FC foi usada isoladamente
em testes de susceptibilidade para meningite criptococócica. Tal fato foi confirmado
por recaídas e falhas durante o tratamento clínico para infecções criptococócicas
usando a 5-FC isoladamente (MITCHELL; PERFECT, 1995). Sabe-se também que a
anfotericina B é uniformemente ativa contra isolados iniciais de Cryptococcus spp., e
que as CIMs são geralmente baixas e apresentam pouca variação (MITCHELL;
PERFECT, 1995). A resistência a anfotericina B não é comum (SILVA et al., 2008).
A terapia com fluconazol tem se mostrado mais eficaz e com melhor resposta clínica,
quando os testes de susceptibilidade in vitro com isolados de C. neoformans
apresentam CIM menor que 16 µg/mL (PFALLER et al., 2004).
É importante ressaltar que a CIM de antimicrobianos não define isoladamente
o resultado da terapia anti-infecciosa com a droga testada. A capacidade de
resposta imunológica do hospedeiro, formação de coleções purulentas em vísceras
ou cavidades, presença de próteses ou cateteres e diagnóstico tardio da doença são
fatores que podem causar falha no tratamento, independente da eficácia
microbiológica da droga utilizada. Assim, existe uma correlação parcial entre falha ou
sucesso terapêutico com o perfil de susceptibilidade in vitro à droga utilizada.
34
Entretanto espera-se que, se resistente, tenha-se maior chance de falha do
tratamento e, se susceptível, maior chance de eficácia (COLOMBO; ALVES, 2004).
Quando existe uma boa correlação clínico-laboratorial é possível prever a
resistência clínica pela determinação laboratorial da resistência micológica, de forma
que são estabelecidos pontos de corte que são utilizados para indicar ou modificar
os tratamentos com antimicrobianos (LARSEN et al., 2005b). Pontos de corte são
valores específicos da CIM que permitem classificar os fungos nas categorias
susceptíveis, intermediários e resistentes (RODRIGUEZ-TUDELA et al., 2008).
O fluconazol foi o primeiro antifúngico a ter pontos de corte estabelecidos
para
leveduras
do
gênero
Candida.
Resultados
entre
a
correlação
da
farmacocinética do antifúngico e dados clínicos do tratamento de pacientes com
candidose orofaríngea por Candida albicans, permitiram o estabelecimento de
pontos de corte para a interpretação dos resultados da CIM obtidos pelo método de
referência. Dessa forma, linhagens de Candida spp. que apresentam CIM ≤ 8 µg/mL
são consideradas susceptíveis. Isolados de Candida spp. com CIM entre 16 e 32
µg/mL
são
classificados
como
susceptibilidade
dependente
da
dose
ou
intermediários e, isolados com CIM ≥ 64 µg/mL são considerados resistentes (REX
et al., 1997).
Para Cryptococcus spp. não existem pontos de corte definidos (DANNAOUI et
al., 2006; LARSEN et al., 2005b). Muitos estudos são ainda necessários para
correlacionar os valores das CIMs para as drogas contra Cryptococcus spp. com a
evolução clínica dos pacientes, para então se estabelecer pontos de corte
significativos para a escolha ou modificação do tratamento da criptococose
(LARSEN et al., 2005b). Além disso, apenas testes com C. neoformans tem sido
incluído no documento do CLSI e dados sobre C. gattii são escassos (KHAN et al.,
2009). Suspeita-se que C. gattii seja menos susceptível aos antifúngicos que C.
neoformans (KHAN et al., 2009; SILVA et al., 2008; TRILLES et al., 2004). Mais
investigações relacionadas aos testes de susceptibilidade in vitro de Cryptococcus
spp. são necessárias e urgente devido ao crescente número de indivíduos com
criptococose (LARSEN et al., 2005b).
35
2.10 RESPOSTA IMUNE NA CRIPTOCOCOSE
As citocinas constituem o principal fator envolvido na comunicação entre
células T, macrófagos e outras células do sistema imune durante o curso da
resposta imune a antígenos e agentes infecciosos. Diversos estudos com clones de
células T helper (Th) de camundongos e de humanos mostraram a existência de
duas subpopulações diferentes de células T que foram divididas em células T helper
do tipo 1 (Th1) e T helper do tipo 2 (Th2), conforme a função e padrões diferenciais
de produção de citocinas (BELARDELLI, 1995).
A resposta imune Th1 é geralmente associada com a produção de IgG2 e o
desenvolvimento da imunidade celular. A resposta Th2 está associada à produção
de IgE, eosinófilos e mastócitos. Derivadas de células Th1, as citocinas interferon
gama (IFN-γ), interleucina 2 (IL-2) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) favorecem
a ativação de macrófagos, enquanto que citocinas Th2 como interleucina 4 (IL-4) e
interleucina 10 (IL-10) exibem atividade supressora sobre a função dessas células.
Um fator chave na diferenciação da resposta imune para o tipo Th1 é a produção de
interleucina 12 (IL-12), uma citocina produzida principalmente por macrófagos. As
citocinas produzidas por células Th1 e Th2 podem regular-se mutuamente, sendo
exemplo disto o IFN-γ produzido por células Th1, que pode aumentar a produção de
IL-12 e inibir a proliferação de células Th2 bem como a produção de lL-10, enquanto
que as citocinas Th2 são capazes de inibir a síntese de citocinas produzidas por
células Th1 (BELARDELLI, 1995).
Como C. neoformans é ubíquo na natureza pode-se considerar que a
incidência da criptococose é ainda relativamente baixa. Tal fato implica que muitas
pessoas provavelmente são expostas ao fungo, mas não desenvolvem os sintomas.
Essa observação sugere que no hospedeiro hígido um ou mais componentes do
sistema imune pulmonar tem função protetora contra a infecção (WOZNIAK; VYAS;
LEVITZ, 2006).
A integridade da defesa hospedeira é fundamental na criptococose, assim, a
elevada susceptibilidade à infecção de indivíduos com AIDS evidencia a importância
da imunidade mediada por células (IMC). Nesses pacientes ocorre uma redução
progressiva
da
imunidade
celular
devido
à
diminuição
ou
alteração
do
funcionamento de linfócitos T levando à disfunção do sistema linfocítico-fagocitário e
36
favorecendo o aparecimento de infecções fúngicas oportunistas (MITCHELL;
PERFECT, 1995).
Durante o inicio do processo de infecção por C. neoformans, as células T
produzem citocinas ativadoras de macrófagos com formação de granuloma e
destruição do fungo intracelular (FELDMESSER; KRESS; CASADEVALL, 2001).
Nos
indivíduos
com
a
imunidade
celular
debilitada,
o
fungo
multiplica
intracelularmente podendo lisar o macrófago e então infectar outros fagócitos,
aumentando o crescimento fúngico. C. neoformans também é capaz de crescer
extracelularmente escapando da fagocitose por meio da produção de fatores
específicos que bloqueiam a sua adesão e internalização pela célula fagocítica,
incapacitando o reconhecimento e o desenvolvimento da resposta imune do
hospedeiro (DEL POETA, 2004).
A criptococose é iniciada no pulmão após a inalação de células
leveduriformes. As células fúngicas que não são expelidas pelo epitélio respiratório,
podem penetrar nos alvéolos (MITCHELL; PERFECT, 1995). No espaço alveolar, os
microrganismos são inicialmente confrontados pelos macrófagos alveolares (AMФ)
(CHEN et al., 2008; MITCHELL; PERFECT, 1995). Se a infecção ativa vai prosseguir
depende da competência das células de defesa do hospedeiro bem como do
número e da virulência da célula fúngica (MITCHELL; PERFECT, 1995). Os AMФ
com o fungo interiorizado possuem atividade apresentadora de antígeno e produzem
citocinas pró-inflamatórias que podem controlar a infecção (WOZNIAK; VYAS;
LEVITZ, 2006).
As células dendríticas (DCs) são um grupo heterogêneo de células
apresentadoras de antígenos (APCs), importantes na ativação do sistema imune
inato e adquirido. Elas apresentam os antígenos estranhos às células T no tecido
linfóide, iniciando uma resposta imune adaptativa contra estes. Estudos mostraram
que as DCs pulmonares são capazes de fagocitar C. neoformans in vivo e iniciar
uma resposta imune adaptativa anticriptococócica. Neutrófilos também são capazes
de fagocitar o fungo (WOZNIAK; VYAS; LEVITZ, 2006).
A indução da produção de citocinas pró-inflamatórias que recrutam e ativam
leucócitos para inibir e matar as células fúngicas é fundamental para uma resposta
imune mediada por células que protege o hospedeiro de infecções causadas por
fungos. Vários estudos demonstraram que a IL-12 é uma citocina importante na
defesa do hospedeiro contra C. neoformans por induzir a produção de IFN-γ. O IFN-
37
γ estimula a atividade anticriptococócica de macrófagos (RETINI et al., 2001). De
fato, há evidências que respostas polarizadas Th1 são mais protetoras que
respostas polarizadas Th2, no entanto, o equilíbrio entre ambos os tipos de resposta
é importante para evitar danos ao hospedeiro (ZARAGOZA, et al., 2007).
A formação do granuloma foi descrito como a reação tecidual clássica da
criptococose nos casos em que a inflamação se desenvolve. Células gigantes com
múltiplas leveduras intracelulares foram descritas em vários casos indicando que o
fungo pode persistir em ambos espaços intracelular e extracelular (CASADEVALL;
PERFECT, 1998).
A cápsula e talvez outros componentes da levedura são capazes de modular
e subverter a resposta imune do hospedeiro (MANSOUR et al., 2004). O GXM da
cápsula fúngica afeta diversos parâmetros da resposta imune capazes de promover
a persistência do fungo no interior do hospedeiro. Os principais aspectos afetados
são as funções dos macrófagos (inibição da fagocitose e da apresentação de
antígenos), de células T (modulação da secreção de citocinas) e interferência com a
migração leucocitária (LARSEN et al., 2005a). A cápsula do C. neoformans também
inibe a fagocitose do fungo por DCs e neutrófilos e inibe a internalização do fungo
por células endoteliais (DEL POETA, 2004).
C. neoformans encapsulado promove a secreção de IL-10 por monócitos
humanos, e em contraste, este parece suprimir a secreção de IL-12. Este fenômeno
pode estar associado com a habilidade de C. neoformans encapsulado suprimir a
resposta Th1, por meio da supressão de IL-12, inibindo consequentemente a
produção de IFN-γ (RETINI et al., 2001).
A atividade anti-Cryptococcus exercida pelas células do sistema imune
também parece ser dependente de outros mediadores solúveis além das citocinas. A
produção de óxido-nítrico (NO) por leucócitos humanos possui um papel importante
na defesa contra diversas infecções, por apresentar ação microbicida (RIVERA et
al., 2002). O NO é um radical livre ubíquo, gasoso, produzido por ação de uma
família de enzimas denominadas de óxido nítrico sintases (NOS) a partir do
aminoácido L-arginina que produz NO e L-citrulina. O NO é produzido por uma
ampla variedade de tipos celulares que incluem células epiteliais, nervosas,
endoteliais e inflamatórias. Existem três isoformas de NOS. Duas delas são
denominadas constitutivas, sendo uma forma encontrada nas células neuronais e
outra nas células endoteliais. A terceira isoforma é a NOS induzível (iNOS), que
38
pode ser encontrada em quase todos os tipos celulares após estimulação (FILHO;
ZILBERSTEIN, 2000). Citocinas pró-inflamatórias como TNFα, IL-1β ou IFN-γ e
produtos microbianos como o LPS, estimulam as iNOS a produz NO (CERQUEIRA;
YOSHIDA, 2002).
2.11 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA NA CRIPTOCOCOSE
O exame histológico de camundongos e humanos com criptococose revela
que quando a função das células T está intacta, granulomas e células gigantes
multinucleadas podem ser observadas nos órgãos afetados, com reduzido
crescimento fúngico comparado a animais e humanos com função das células T
prejudicada (LIPOVSKY et al., 1998).
A
análise
histopatológica
da
resposta
granulomatosa
pulmonar
à
criptococose em indivíduos imunocompetentes, feita por Shibuya et al. (2005),
apresentou presença de um granuloma típico formado por um agregado compacto
de macrófagos e células gigantes multinucleadas contendo numerosas leveduras
intracitoplasmáticas, mas com infecção limitada e benigna. Em pacientes
imunocomprometidos foi observado proliferação da levedura nos alvéolos, resposta
histiocítica, presença de células gigantes multinucleadas e extenso envolvimento
capilar.
Resposta
inflamatória
purulenta
não
foi
observada
nas
lesões
criptococócicas dos últimos pacientes provavelmente devido aos polissacarídeos
criptococócicos, especialmente o GXM, causar espalhamento de L-selectina na
superfície de neutrófilos, o que pode impedir os neutrófilos de se ligar à superfície da
célula endotelial. De acordo com Patro et al. (2009), o desenvolvimento de lesões
granulomatosas depende da resposta imune do hospedeiro e é incomum em
pacientes imunocomprometidos.
Hoang et al. (2004) realizaram avaliações histológicas do tecido cerebral de
pacientes
imunocompetentes
e
imunocomprometidos
com
criptococose
e
constataram inflamação mínima com predomínio de linfócitos e praticamente
nenhum polimorfonucleares. A inflamação mínima observada provavelmente reflete
a habilidade do microrganismo de evadir do sistema imune do hospedeiro. Os
estudos neuropatológicos não revelaram diferenças discerníveis entre os pacientes
39
imunocompetentes e imunocomprometidos. A análise histopatológica do cérebro de
camundongos com infecção criptococócica realizada por Blasi et al. (1994) também
mostrou poucas células inflamatórias.
Alguns estudos histopatológicos tanto do cérebro humano como de
camundongos infectados por Crytococcus spp. demonstraram que células
microgliais são capazes de internalizar Cryptococcus spp. (LEE et al., 1995a; LEE et
al., 1995b; ZHOU et al., 2007). As células microgliais são macrófagos residenciais
encontrados no cérebro que podem permitir a sobrevivência e replicação intracelular
de Crytococcus neoformans ou exercer atividade anticriptococócica (ORSI et al.,
2009). Tais células precisam ser ativadas para aumentar sua capacidade fagocítica
e provavelmente o IFN-γ participa dessa ativação (ZHOU et al., 2007).
40
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a correlação entre a susceptibilidade in vitro e a atividade in vivo do
fluconazol em modelo murino de infecção cerebral causada por C. gattii.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver um método microbiológico para quantificar os níveis de fluconazol no
cérebro de camundongos.
Desenvolver um modelo de infecção cerebral causada por C. gattii.
Determinar a susceptibilidade in vitro de isolados sequenciais de C. gattii ao
fluconazol e correlacionar os valores de CIM com o número de UFC em modelo
animal.
Avaliar comparativamente a produção de citocinas entre grupos de animais tratados
e não-tratados com o fluconazol.
Comparar, por meio de análise histopatológica, as possíveis alterações quantitativas
nas células microgliais, causadas pela criptococose em camundongos tratados e
não-tratados.
41
4 JUSTIFICATIVA
De acordo com os dados da Organização Mundial da Saúde (OMS)
reportados por Lin e Heitman (2006), aproximadamente três milhões de pacientes
infectados pelo HIV morrem por ano no mundo, devido a complicações associadas a
criptococose. O número de indivíduos acometidos por C. gattii também aumentou
em diversas partes do mundo, no entanto, a maioria dos estudos tem focado apenas
na espécie C. neoformans e existe uma escassez de dados sobre C. gattii. Além
disso, o tratamento da condição ainda hoje é considerado difícil devido aos diversos
efeitos tóxicos e a emergência de isolados fúngicos resistentes às drogas
comumente utilizadas. O fluconazol é uma droga com bom perfil terapêutico uma vez
que é pouco tóxico e apresenta boa penetração no SNC. O aparecimento de
resistência de determinadas leveduras à terapia usual, em especial o fluconazol, tem
estimulado o desenvolvimento de testes de susceptibilidade in vitro para escolha e
acompanhamento da quimioterapia antifúngica mais adequada a cada caso. Apesar
das investigações atuais visando determinar a CIM de antifúngicos por meio de
testes de susceptibilidade, pontos de corte não foram estabelecidos para isolados de
Cryptococcus spp. frente a antifúngicos.
Apesar do grande número de estudos envolvendo modelos animais de
criptococose, não foi encontrado na literatura nenhum trabalho que correlacionasse
a resposta do animal à terapia com resultados de testes de susceptibilidade.
Acredita-se também que tal correlação deva levar em consideração a concentração
do antifúngico no alvo de infecção e, para isso torna-se necessário a determinação
da concentração do antifúngico no órgão acometido. Assim, poder-se-ia aventar
sobre uma provável concentração da droga que promoveria o efeito terapêutico em
um órgão específico. No entanto, as técnicas utilizadas para a quantificação de
antifúngicos em fluidos e tecidos biológicos são baseadas na utilização de aparelhos
de alto custo, não acessíveis à maioria dos laboratórios clínicos.
A identificação do perfil de citocinas produzidas após a infecção com
Cryptococcus spp., bem como a análise histológica do tecido acometido podem
ampliar os conhecimentos sobre os mecanismos da resposta imunológica
hospedeira, possibilitando o estabelecimento de estratégias futuras para o
tratamento da infecção.
42
Diante do exposto, a proposta desse trabalho foi correlacionar a
susceptibilidade in vitro e a atividade in vivo do fluconazol em modelo murino de
infecção cerebral causada pelo C. gattii. O teste de microdiluição em meio líquido foi
realizado utilizando o método proposto pelo CLSI, segundo protocolo M27 A2, para
determinar a CIM de isolados de C. gattii frente ao fluconazol. Os valores da CIM
foram correlacionados com o número de UFC/g de cérebro de camundongos
infectados com isolados ATCC 32608 de C. gattii. Também foi desenvolvido um
método microbiológico para quantificar a concentração do fluconazol no cérebro dos
animais em diferentes períodos de tratamento. Visando ampliar os conhecimentos
sobre os mecanismos da resposta imunológica hospedeira, foi avaliada a produção
de citocinas em resposta à infecção criptococócica. Além disso, análises histológicas
do cérebro infectado foram realizadas a fim de observar possíveis alterações
quantitativas nas células microgliais. Espera-se que os resultados obtidos possam
contribuir para melhor conhecimento sobre o valor prognóstico dos testes de
susceptibilidade ao fluconazol para o tratamento da criptococose.
43
5 METODOLOGIA
5.1 DETERMINAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO CENTRAL DE FLUCONAZOL POR
MÉTODO MICROBIOLÓGICO
5.1.1 Construção da curva analítica
5.1.1.1 Droga antifúngica
Para construção da curva analítica, 10 mg de fluconazol obtido na forma de
padrão da Cipla Limite, foi diluído em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração final
de 1000 µg/mL. A partir desta solução foram realizadas diluições seriadas de razão
2 em tubos de ensaio contendo 9 mL de meio RPMI-1640 tamponado com MOPS
[ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico], propiciando a obtenção de concentrações
de 15 a 0,007 µg/mL.
5.1.1.2 Isolado
Como reagente biológico foi utilizado o isolado Candida parapsilosis ATCC
22019, obtido da coleção de culturas da Universidade da Geórgia, Athens, EUA,
recomendado pelo CLSI (documento M27 A2, 2002) para bioensaio e testes de
susceptibilidade aos antifúngicos. O isolado foi mantido em Ágar Sabouraud
Dextrose (ASD) a 4 ºC e repicado no mesmo meio 24 h antes da realização do teste.
A partir das colônias obtidas foi feita uma suspensão da levedura em água destilada
esterilizada. A suspensão foi ajustada para se obter a transmitância de 85% medida
em espectrofotômetro (Femto, modelo 700S, 530 nm, São Paulo – SP), que
corresponde a 1,0 X 106 – 5,0 X 106 UFC/mL (FIGUEIREDO et al., 2007).
44
Posteriormente, a suspensão foi diluída 10 vezes em água destilada esterilizada,
resultando na concentração final de 1,0 X 105 – 5,0 X 105 UFC/mL.
Na série de tubos contendo as diferentes concentrações da droga, foi
adicionado 1,0 X 105 – 5,0 X 105 UFC da suspensão de C. parapsilosis ATCC 22019
em volume de 1 mL. Os tubos foram incubados a 28 ºC durante 48 h e a leitura foi
efetuada pela medição da transmitância determinada em espectrofotômetro (530
nm).
Como controle negativo (branco) foram testados tubos contendo apenas o
meio RPMI-1640, e como controle de crescimento, tubos contendo o meio RPMI1640 e o inóculo.
Os dados foram plotados para a construção de uma curva analítica. Esta
curva foi utilizada para padronizar e relacionar as diferentes concentrações de
fluconazol com o crescimento do inóculo por meio da transmitância e para
determinar a concentração da droga no cérebro dos animais em diferentes períodos.
5.1.2 Determinação da concentração de fluconazol no cérebro de animais
5.1.2.1 Droga antifúngica
Em todos os experimentos a solução de fluconazol foi preparada em água
destilada esterilizada na concentração de 2 mg/mL. A solução foi preparada a cada
três dias e estocada a 4 ºC.
5.1.2.2 Isolado
A suspensão contendo o inóculo de C. parapsilosis ATCC 22019 foi
preparada como supramencionado (item 5.1.1.2).
45
5.1.2.3 Animais e infusão de fluconazol
Em todos os experimentos foram utilizados camundongos Swiss, machos,
com idade entre seis a oito semanas e pesando de 23 a 33 g. Os camundongos
foram mantidos em gaiolas e foi fornecido ração e uma garrafa de água por gaiola. A
utilização de camundongos foi aprovada pelo Comitê de Ética da Univale – parecer
CEP/UNIVALE 10/2007 de 12 de março de 2007 (ANEXO A). Os animais foram
divididos em sete grupos, cada um contendo, pelo menos, seis animais.
Camundongos não submetidos à infusão de fluconazol foram utilizados como
controle.
Com exceção dos camundongos do grupo controle, os outros animais
receberam uma dose diária de fluconazol por via intraperitoneal. A concentração da
droga administrada foi de 40 mg/Kg/dia em volume máximo de 1 mL (LARSEN et al.,
1996). Cada grupo recebeu a infusão até o dia do sacrifício, sendo o tempo máximo
de infusão de 14 dias. Todos os animais foram pesados após o sacrifício. Os
animais foram anestesiados por via intraperitoneal com ketamina / xilazina (80mg/kg/
10 mg/kg) em volume de 300 µL e sacrificados por deslocamento cervical, sendo o
primeiro grupo de camundongos sacrificado 24 h após ter recebido a primeira
infusão de fluconazol. O sacrifício dos outros grupos aconteceu aos 2, 4, 8, 10, 12
ou 14 dias de infusão após terem recebido a primeira dose de fluconazol.
Posteriormente, os cérebros foram retirados, pesados em uma balança analítica e
diluídos em tubos de ensaio contendo 9 mL de meio RPMI-1640 tamponado com
MOPS. Cada tubo foi inoculado com 1,0 X 105 – 5,0 X 105 UFC/mL do inóculo de C.
parapsilosis ATCC 22019, em volume de 1 mL. Os camundongos do grupo controle
não receberam o tratamento com fluconazol, mas o cérebro dos animais foi retirado
e inoculado com C. parapsilosis ATCC 22019. Outro grupo foi constituído por
camundongos que não receberam infusão de fluconazol nem o inóculo de C.
parapsilosis ATCC 22019 (branco). Os tubos foram incubados a 28 ºC durante 48 h
e a transmitância foi determinada em espectrofotômetro (530 nm). Os valores de
transmitância foram utilizados para a determinação da concentração da droga no
cérebro pela utilização da equação gerada pela curva analítica.
46
O teste Análise de Variância (ANOVA) foi usado para verificar se o aumento
na concentração de fluconazol no cérebro dos camundongos ao longo dos dias foi
estatisticamente significativo, considerando p<0,01, como significativo.
5.2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL INTRACEREBRAL POR Cryptococcus gattii
5.2.1 Isolado
O isolado Cryptococcus gattii ATCC 32608, obtido da coleção de culturas da
Universidade da Geórgia, Athens, EUA, foi mantido em ASD a 4 ºC e repicado nesse
meio 48 h antes da realização de cada teste.
5.2.2 Teste piloto
Testes-piloto foram realizados com diferentes concentrações do inóculo de C.
gattii ATCC 32608 com objetivo de verificar aquela que melhor se estabelecesse no
modelo animal. O primeiro inóculo testado foi uma suspensão fúngica com 85% de
transmitância medida em espectrofotômetro (530 nm) que corresponde a 1,0 X 106 –
5,0 X 106 UFC/mL (FIGUEIREDO et al., 2007). Antes da infecção, a suspensão foi
diluída 10 vezes de forma que o animal foi inoculado com 1,0 X 105 – 5,0 X 105
UFC/mL. Foi observado que esse inóculo não foi suficiente para promover a
recuperação de colônias após 14 dias de infecção.
O inóculo escolhido para o experimento foi de 1,2 X 106 UFC que
correspondeu a 70% de transmitância determinada em espectrofotômetro (530 nm).
O número de UFC foi confirmado pelo método de diluição até 1:10000, usando
placas com ASD. Após 48 h de incubação a 28º C, as colônias foram contadas.
47
5.2.3 Métodos de anestesia e inoculação
Grupos de seis camundongos foram utilizados e todos os animais foram
pesados no início e no final do experimento.
Os animais foram anestesiados por via intraperitoneal com ketamina / xilazina
(80mg/kg/ 10 mg/kg) e infectados por via intracerebral com 1,2 X 106 UFC do inóculo
de C. gattii ATCC 32608 em volume de 50 µL. A infecção foi feita com seringa
acoplada a uma agulha número 25 X 7, inserida na região frontal, acima dos olhos
dos camundongos.
Após 24 h, os animais foram divididos em dois grandes grupos cada um
contendo dezoito camundongos, sendo um grupo tratado com 40 mg/Kg/dia de
fluconazol por até 14 dias, e outro grupo não-tratado.
Os animais do grupo tratado receberam uma dose diária de fluconazol por via
intraperitoneal até o dia do sacrifício. O sacrifício dos animais ocorreu aos 7, 10 e 14
dias após a infecção. Seis animais tratados e seis não-tratados foram sacrificados
em cada dia. O cérebro de cada animal foi retirado, pesado e homogeneizado em
tubos de ensaio contendo 9 mL de água peptonada, sendo diluídos seriadamente
até 1:1000. Cada diluição foi plaqueada em duplicata no volume de 100 µL em
placas de ASD a 4 ºC e incubadas a 28 ºC durante 48 h. A leitura foi feita por meio
da contagem de colônias e os resultados foram expressos em UFC/g de órgão.
Para confirmar a identidade dos isolados nas placas de ASD, amostras das
colônias foram submetidas a exame direto com tinta nanquim. A pesquisa dos
fungos foi feita por meio de microscópio óptico em objetiva de 40 X.
A análise estatística foi feita por meio do teste ANOVA.
5.3 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AO FLUCONAZOL UTILIZANDO MÉTODO DA
MICRODILUIÇÃO EM MEIO LÍQUIDO
Para o teste de susceptibilidade ao fluconazol foram utilizadas colônias
isoladas em 7, 10 e 14 dias dos grupos tratado e não-tratado. As colônias foram
colocadas em tubos de ensaio contendo 5 mL de solução salina esterilizada e a
48
transmitância da suspensão foi ajustada para 85% que corresponde a 1,0 X 106 –
5,0 X 106 UFC/mL (FIGUEIREDO et al., 2007). Desta forma, no último dia de leitura,
foram obtidos seis inóculos diferentes em solução salina. Posteriormente, foi feita
uma diluição de cada suspensão do inóculo em meio RPMI-1640 resultando em uma
concentração de 1,0 X 103 a 5,0 X 103 UFC/Ml (CLSI, 2002). Em seguida, cada
suspensão do inóculo foi dispensada em volume de 100 µL em placas de
microdiluição de 96 poços, fundo chato, esterilizadas e com tampa. A CIM de
colônias de C. gattii ATCC 32608 antes da infecção nos animais também foi
determinada.
Para realização do teste, o fluconazol foi diluído em DMSO na concentração
de 1000 µg/mL. A partir desta solução foram realizadas diluições seriadas em meio
RPMI-1640 tamponado com MOPS [acido 3-(N-morfolino) propanosulfônico] (pH
ajustado para 7,0 com NaOH), obtendo-se as seguintes concentrações de
fluconazol: 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 µg/mL. As referidas diluições foram
dispensadas em volume de 100 µL nas placas de microdiluição contendo o inóculo.
Em cada placa foi realizado o controle de esterilidade do meio e o controle de
crescimento do isolado. As placas foram incubadas a 28 ºC durante 72 h. A
determinação das CIM foi realizada visualmente como 80% de redução do
crescimento fúngico em comparação ao controle de crescimento conforme CLSI,
documento M27 A2 (CLSI, 2002).
Os dados obtidos da análise da concentração de fluconazol no cérebro foram
correlacionados com os resultados dos testes de susceptibilidade e com o número
de UFC/g de cérebro. O quociente da concentração de fluconazol no cérebro pela
CIM (CD/CIM) foi usado para a interpretação dos resultados encontrados no número
de UFC/g de cérebro. Todos os experimentos foram repetidos duas vezes e
resultados similares foram obtidos.
49
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS
5.4.1 Animais
O nível das citocinas IFN-γ, IL-12, IL-10 e IL-4 foi determinado utilizando
sobrenadante de cultura de células de baço dos camundongos dos grupos tratado e
não-tratado (seis animais de cada grupo) sacrificados após 10 dias de infecção.
Camundongos não infectados foram utilizados como controle negativo.
5.4.2 Preparação de suspensões de células do baço
O baço de cada animal foi retirado e colocado em tubos de ensaio estéreis
contendo meio RPMI-1640 incompleto (ausência de antibióticos e aminoácidos não
essenciais). O órgão foi macerado com auxílio do êmbolo de uma seringa de 5 mL e
a suspensão foi transferida para tubos falcon estéreis. Com uma pipeta Pasteur a
suspensão celular foi retirada até a obtenção de debris no fundo de cada tubo. O
sedimento celular foi centrifugado a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 oC. Água
bidestilada estéril foi usada para lisar as hemácias e posteriormente, foi adicionado 1
mL de tampão salina fosfato (PBS). A suspensão foi novamente centrifugada, o
sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio RPMI1640 completo. O número de células foi ajustado para 5 x 106/mL.
As suspensões celulares foram distribuídas em placas de ELISA e
estimuladas com Concanavalina A (ConA). As placas foram incubadas a 28 ºC
durante 72 h em estufa de CO2.
50
5.4.3 Quantificação de citocinas por Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
As concentrações das citocinas IFN-γ, IL-12, IL-10 e IL-4 foram avaliadas no
sobrenadante de cultura de células de baço de camundongos dos grupos controle,
tratado e não-tratado por ELISA utilizando kits Pharmigen.
As placas de ELISA foram sensibilizadas com 100 µL/poço com o anticorpo
purificado da citocina a ser quantificada. Em seguida as placas foram estocadas a 4
ºC overnight em câmara escura e posteriormente lavadas três vezes com SalinaTween (NaCl 0,9% contendo 0,05% de Tween20).
Para o bloqueio foram utilizados 200 µL/poço de PBS-BSA (Albumina Bovina).
As placas foram mantidas durante uma hora a 37 ºC, posteriormente foram
novamente lavadas três vezes com Salina-Tween.
Os respectivos anticorpos biotinilados foram diluídos em PBS-BSA e 100 µL
da solução foram colocados nos poços da placa. As placas foram mantidas durante
uma hora a temperatura ambiente e lavadas seis vezes com Salina-Tween. Foi
adicionada a placa 100 µL da solução de Estreptavidina/Peroxidase na concentração
de 3 µL para 15 mL de PBS-caseína. As placas foram mantidas por 60 minutos a
temperatura ambiente e novamente foram lavadas seis vezes com Salina-Tween.
Foram adicionados 100 µL/poço de peróxido de hidrogênio (H2O2) e
ortofenilenodiamina (OPD) diluídos em tampão citrato. As placas foram mantidas no
escuro à temperatura ambiente por 30 minutos e posteriormente foi adicionado 20
µL/poço de ácido sulfúrico para paralisar a reação. A leitura foi feita em leitor de
ELISA Bio-Rad Modelo 450 (492 nm).
Para verificar se os diferentes níveis de cada uma das citocinas dosadas em
cada
um
dos
grupos
(tratado,
não-tratado
e
controle),
foram
diferentes
estatisticamente, foram feitas análises estatísticas por meio dos teste ANOVA e
Tukey, sendo p<0,05.
51
5.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Análises histopatológicas do cérebro dos camundongos infectados via
intracerebral com isolados de C. gattii ATCC 32608 e pertencentes aos grupos
tratado e não-tratado, sacrificados com 7, 10 e 14 dias de infecção foram realizadas.
O cérebro de camundongos não infectados foi utilizado como controle. Os cérebros
dos animais foram fixados em formalina a 10%, desidratados e embebidos em
parafina. Cortes histológicos de quatro micra foram corados com HE. Os cortes
foram observados em microscópio óptico.
52
6 RESULTADOS
6.1 DETERMINAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO CENTRAL DE FLUCONAZOL POR
MÉTODO MICROBIOLÓGICO
Os resultados obtidos durante a determinação da transmitância dos tubos
contendo as diferentes concentrações da droga (15 a 0,007 µg/mL) e o teor fixo do
inóculo (1,0 X 105 – 5,0 X 105 UFC/mL) de C. parapsilosis ATCC 22019 foram
usados para a construção da curva analítica.
A curva analítica foi construída plotando-se a concentração de fluconazol
versus a porcentagem de transmitância e apresentou a equação y = 5,2029x +
4,6394 (R2 = 0,9926 e R = 0,9963). A curva apresentou inclinação de 5,203 ± 0,2004
e intercepto no eixo y de 4,639 ± 1,190. Esses dados demonstram linearidade
adequada da curva (p<0,05).
A tabela 1 apresenta as concentrações de fluconazol recuperadas do cérebro
dos animais em cada dia.
A detecção máxima da droga presente no cérebro foi de 44,60 µg/mL nos
animais que receberam infusões de fluconazol durante 14 dias. A média da
concentração de fluconazol recuperada do cérebro dos camundongos foi de 27,29
µg/mL.
Por meio do teste ANOVA foi verificado que o aumento na concentração de
fluconazol presente no cérebro dos camundongos foi estatisticamente significativo
(p<0,01) nos animais sacrificados com até 8 dias de administração do antifúngico.
Após esse período, o aumento nos níveis da droga não foi diferente
estatisticamente.
53
Tabela 1 - Concentrações de fluconazol (µg/g de cérebro ± desvio padrão) determinada pelo ensaio
microbiológico usando o cérebro de camundongos Swiss após a administração diária de
fluconazol (40 mg/kg), durante 1, 2, 4, 8, 10, 12 ou 14 dias
Tempo de sacrifício (dias)
Fluconazol (µg/g de cérebro)
n=6
1
12,99 ± 3,47
2
16,49 ± 3,56
4
18,60 ± 9,59
8
30,98 ± 6,69
10
32,91 ± 15,43
12
34,45 ± 13,52
14
44,60 ± 7,65
6.2 INFECÇÃO INTRACEREBRAL POR Cryptococcus gattii ATCC 32608
O modelo animal utilizado neste trabalho possibilitou a recuperação de
unidades formadoras de colônias em todos os dias de sacrifício testados. O
resultado das médias da contagem das colônias de C. gattii ATCC 32608
provenientes do cérebro dos animais do grupo tratado foi igual a 4,81 x 103 UFC/g
para os animais sacrificados sete dias após a infecção, 6,08 x 103 UFC/g para os
animais sacrificados com dez dias e 1,75 x 104 UFC/g para os animais sacrificados
com quatorze dias de infecção. Os resultados das médias da leitura das colônias dos
animais do grupo não-tratado revelaram valores estatisticamente (p<0,05) maiores,
que foram respectivamente 4,82 x 104; 9,79 x 104 e 4,28 x 105 UFC/g para os
animais sacrificados com sete, dez e quatorze dias de infecção. O gráfico 1
apresenta as médias dos log UFC/g de cérebro dos camundongos dos grupos
tratado e não-tratado sacrificados em diferentes dias.
54
*
Log UFC/g de cérebro
6
5
*
*
4
3
2
1
0
7 NT
7T
10 NT
10 T
14 NT
14 T
T e m p o ( d ia s )
Gráfico 1 - Logaritmo do número de UFC/g encontrado no cérebro dos camundongos
infectados via intracerebral com isolados de C. gattii ATCC 32608 e pertencentes aos
grupos não-tratado (NT) e tratado (T), sacrificados respectivamente com 7, 10 e 14
dias de infecção. Os asteriscos representam diferença estatisticamente significativa
(p<0,05) no número de UFC/g de cérebro nos animais do grupo não-tratado. Diferença
também estatisticamente significativa (p<0,05) foi observada entre o grupo tratado e
não-tratado em todos os dias de sacrifício
O método estatístico ANOVA mostrou que o aumento no número de UFC no
cérebro dos animais do grupo tratado durante os períodos analisados não foi
estatisticamente significativo (p>0,05). Entretanto para o grupo de animais nãotratado esse aumento foi estatisticamente significativo (p<0,05). Resultados
semelhantes foram obtidos quando se comparou o número de UFC/g no cérebro do
grupo tratado e do grupo não-tratado em todos os dias de sacrifício dos animais.
O crescimento fúngico em 7 dias no grupo tratado correspondeu a 9,97 % do
total de crescimento do grupo não-tratado, de forma que o tratamento nesse período
inibiu 90,02% do crescimento da levedura. Em 10 dias o crescimento fúngico do
grupo tratado correspondeu a 6,21% do total de crescimento do grupo não-tratado,
sendo a inibição igual a 93,78%. Em 14 dias o crescimento do microrganismo no
grupo tratado correspondeu a 4,08% do total de crescimento do grupo não-tratado e
a inibição foi de 95,91%.
O exame micológico direto das colônias crescidas em meio ASD, submetido à
coloração com tinta nanquim, revelou a presença de leveduras (foto 4).
55
Foto 4 - Exame direto de leveduras crescidas em meio ASD submetido à coloração
com tinta nanquim
6.3. TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AO FLUCONAZOL UTILIZANDO MÉTODO
DA MICRODILUIÇÃO EM MEIO LÍQUIDO
A CIM de fluconazol capaz de inibir 80% do crescimento de C. gattii ATCC
32608 obtidos do cérebro de camundongos foi igual a 16 µg/mL, exceto para os
isolados provenientes de animais do grupo tratado sacrificados com 14 dias. Nesse
grupo a CIM foi de 64 µg/mL (tabela 2), sendo verificado aumento de quatro vezes
no valor da CIM quando comparado aos demais. A CIM do isolado de C. gattii ATCC
32608 antes da infecção foi de 16 µg/mL.
56
Tabela 2 - Valores da CIM (µg/mL) do fluconazol frente a isolados sequenciais de C. gattii ATCC
32608 obtidos de camundongos pertencentes aos grupos tratado (T) e não tratado (NT),
sacrificados após 7, 10 e 14 dias de infecção
CIM (µg/mL)
Tempo (dias)
T
NT
7
16
16
10
16
16
14
64
16
A tabela 3 apresenta as correlações entre as concentrações de fluconazol
encontradas no cérebro dos camundongos e os valores da CIM do grupo tratado
(CD/CIM), e as médias de UFC/g de cérebro nos grupos tratado e não-tratado.
Tabela 3 - Correlação entre as concentrações de fluconazol determinadas no cérebro dos
camundongos nos diferentes tempos de sacrifício e a CIM do grupo tratado (T). O
quociente da concentração da droga no órgão / CIM (CD/CIM) foi calculado para cada
dia e correlacionado com a redução no número de UFC/g no cérebro para animais
tratados (T) e não tratados (NT)
CIM
Tempo de
Fluconazol
sacrifício
(µg/g de
(dias)
cérebro)
7
30,98
16
1,936
4,81 X 103
4,82 X 104
10
32,91
16
2,056
6,08 X 103
9,79 X 104
14
44,60
64
0,696
1,75 X 104
4,28 X 105
(µg/mL)
Grupo
CD/CIM
UFC/g de
cérebro (T)
Tratado
UFC/g de
cérebro
(NT)
O gráfico 2 demonstra a tendência de aumento na concentração de fluconazol
até cerca de oito dias de infusão do antifúngico. Após este período foi observado um
menor grau de aumento na concentração do antifúngico. Os valores dos índices
CD/CIM foram semelhantes em 7 e 10 dias (1,936 para 7 dias e 2,056 para 10 dias)
57
e o aumento na inibição do crescimento fúngico foi de 3,76% nesse período. Os
teores da droga detectados nestes dias foram superiores aos valores de CIM.
Apesar da maior concentração de fluconazol ter sido detectada em 14 dias, a
porcentagem de inibição do crescimento fúngico nesse período aumentou apenas
2,12% comparado ao dia 10, sendo observada uma notável redução na taxa CD/MIC
(0,696).
Gráfico 2 - Concentrações de fluconazol (µg/g de cérebro) detectadas no cérebro de
camundongos sacrificados após 1, 2, 4, 8, 10, 12 e 14 dias de infusão da droga. Os
asteriscos representam os valores de CIM para o fluconazol frente aos isolados
obtidos no grupo tratado
6.4 QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS
A resposta imune foi caracterizada por uma predominância do padrão do tipo
1 demonstrado pela elevada produção das citocinas IFN-γ e IL-12, quando
comparado a produção das citocinas IL-10 e IL-4 em ambos os grupos tratado e
58
não-tratado, embora o nível de produção de cada citocina tenha sido diferente em
cada um desses grupos. Comparado ao grupo não-tratato, os animais do grupo
tratado apresentaram níveis menores de produção de IFN-γ e IL-12 e aumento na
produção de IL-10, o que possivelmente pode representar um equilíbrio entre as
respostas do tipo 1 e tipo 2.
O gráfico 3 ilustra os teores das citocinas IFN-γ, IL-12, IL-10 e IL-4 obtidos do
sobrenadante de cultura de células de baço de camundongos tratados, não-tratados
e controle.
2500
*
2000
pg/mL
1500
1000
*
500
*
0
IFN -γ
IL-12
IL-10
IL-4
Gráfico 3 - Teor de citocinas (pg/mL) obtido de sobrenadante de cultura de células de
baço de camundongos Swiss após 10 dias de infecção com isolados de C. gattii ATCC
32608. As células foram estimuladas com ConA. As barras pretas correspondem ao
grupo controle, as barras pontilhadas representam grupos de camundongos infectados e
não tratados e as barras listradas representam grupos de camundongos infectados e
tratados por dez dias com fluconazol. Os asteriscos representam teores com diferença
estatisticamente significativa (p<0,05)
Os métodos estatísticos ANOVA e teste de Tukey foram usados para verificar
se os níveis de produção de cada citocina dosada foram diferentes estatisticamente
em cada um dos grupos de animais. O nível de citocinas no grupo não-tratado foi
caracterizado por uma elevação estatisticamente significativa (p<0,05) na produção
de IFN-γ (1924,57 pg/mL) quando comparado aos grupos controle (125,67 pg/mL) e
59
tratado (1448,33 pg/mL), e aumento significativo de IL-10 (267,96 pg/mL) comparado
ao grupo controle (43,97 pg/mL), porém, a produção de IL-10 nesse grupo foi
estatisticamente menor quando comparado ao grupo tratado (541,36 pg/mL). A
produção de IL-12 foi mais elevada no grupo não-tratado (982,70 pg/mL) comparado
ao grupo tratado (744,20 pg/mL), embora essa diferença não tenha sido significativa.
No grupo controle o nível de IL-12 foi de 126,72 pg/mL. Os níveis de IL-4 foram
similares entre os grupos tratado e não-tratado (225,31 e 234,51 pg/mL
respectivamente), e no grupo controle foi de 80,84 pg/mL.
6.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
A análise histopatológica do cérebro dos camundongos infectados com
isolados de C. gattii ATCC 32608 revelou presença moderada de células microgliais
no grupo de animais não-tratado (foto 5) e presença leve de células microgliais no
grupo de animais tratados (foto 6). Dentro de cada grupo não foi observada
diferenças significativas nas células microgliais ao longo dos dias.
Foto 5 – Células microgliais em quantidade moderada obtido do cérebro
de camundongos Swiss não-tratados com fluconazol e infectados com
isolados de C. gattii ATCC 32608
60
Foto 6 – Células microgliais em quantidade leve obtido do cérebro de
camundongos Swiss tratados com fluconazol e infectados com isolados de
C. gattii ATCC 32608
61
7 DISCUSSÃO
Embora uma variedade de terapias antifúngicas para o tratamento da
meningite criptococócica tenha sido experimentada, os progressos têm sido lentos
(LARSEN et al., 1996; LARSEN et al., 2004). Os principais antifúngicos usados no
tratamento da infecção são tóxicos e frequentemente ineficazes para a erradicação
da infecção do SNC mesmo após semanas de terapia (LARSEN et al., 2004). Por
ser o fluconazol uma droga pouco tóxica (MITCHELL; PERFECT et al., 1995), ele é
o antifúngico de escolha quando há a necessidade da manutenção terapêutica
durante longos períodos. No entanto, o uso dessa droga por períodos prolongados
está associado à emergência de isolados de Cryptococcus spp. resistentes ao
antifúngico (ALLER et al., 2000). A frequência crescente dos casos de criptococose,
a toxicidade dos principais antifúngicos disponíveis e a existência de isolados de
Cryptococcus spp. resistentes, demonstram a dificuldade da terapia contra esta
doença.
O desenvolvimento de testes de susceptibilidade aos antifúngicos pode ser
importante ferramenta para selecionar e monitorar drogas apropriadas para o
tratamento de infecções criptococócicas (ALLER et al., 2000). Diante desses fatos, o
presente estudo avaliou a utilização de modelo murino de criptococose cerebral para
estudo de correlação clínico-laboratorial de testes de susceptibilidade ao fluconazol.
Além disso, desenvolveu-se um método microbiológico para quantificar a
concentração da droga presente no órgão do animal, e por último, observou-se o
tipo de resposta imune do hospedeiro associada à infecção criptococócica.
Os animais utilizados no presente trabalho podem ser considerados
imunologicamente competentes. Sinais de apatia foram observados em alguns
animais pertencentes principalmente ao grupo não-tratado, porém, outros sinais
clínicos associados à doença do SNC ou morte por criptococose não ocorreram
provavelmente devido ao curto período de infecção.
O método microbiológico para quantificação de fluconazol desenvolvido no
presente trabalho foi satisfatório, simples, reprodutível e apresentou linearidade
suficiente para avaliar a concentração da droga presente no cérebro dos animais. A
maioria dos estudos desenvolvidos para quantificar a concentração de drogas
presente em tecidos biológicos utilizam a cromatografia líquida (KOKS et al., 1996) e
62
a cromatografia gasosa (HARRIS et al., 1989), sendo este o primeiro trabalho a
utilizar a metodologia aqui apresentada para avaliar a concentração do antifúngico
no cérebro animal. Sabe-se que o modelo animal não fornece a dose precisa do
antifúngico que irá produzir o melhor efeito terapêutico na clínica (DIAMOND et al.,
1998). Contudo, informações sobre a distribuição da droga no cérebro e sua
correlação com a redução do número de UFC/g no tecido animal podem auxiliar no
esclarecimento do processo clínico. Os trabalhos anteriores que avaliaram modelos
animais de criptococose, utilizaram C. neoformans para infecção (DING et al., 1997;
KIRKPATRIC et al., 2007; LARSEN et al., 1996; LARSEN et al., 2004), sendo este o
primeiro trabalho utilizando C. gattii para infecção intracerebral de camundongos.
Nenhuma morte animal foi desejada no presente estudo uma vez que o mesmo
visou analisar a correlação da atividade in vivo do fluconazol com os valores da CIM
in vitro do antifúngico em diferentes momentos da infecção criptococócica.
O método microbiológico possibilitou a detecção de 12,98 µg/mL de
fluconazol no cérebro de animais que receberam uma dose de 40 mg/Kg do
antifúngico. Esse resultado está de acordo com os encontrados por Lortholary et al.
(1999). Por meio dos métodos HPLC-UV e bioensaio por difusão em ágar, estes
pesquisadores detectaram concentrações de fluconazol no cérebro de camundongos
infectados com C. neoformans e tratados durante 4 dias com 15 mg/Kg/dia do
antifúngico correspondentes a 19,10 µg/g e 14,85 µg/g respectivamente.
No presente modelo experimental de criptococose, o fluconazol foi eficaz na
inibição do crescimento fúngico em animais tratados quando comparado a animais
não-tratado. Assim, em 7 dias de infecção o número de UFC/g de cérebro do grupo
não-tratado foi 10 vezes maior do que o número de UFC/g de cérebro do grupo
tratado. A mesma relação foi de 16 vezes em 10 dias e de 24 vezes em 14 dias de
infecção. Ding et al. (1997) também avaliaram o efeito da terapia com o fluconazol
em modelos murinos de meningite criptococócica e
observaram redução
significativa da carga fúngica no cérebro de camundongos tratados comparado aos
animais não-tratados.
Houve uma tendência de aumento significativo na concentração de fluconazol
no cérebro até cerca de oito dias de infusão da droga, sendo nesse momento
observada uma inibição do crescimento fúngico de 90,02%. Após esse período de
tempo o aumento na concentração da droga no cérebro não foi significativo e a
porcentagem de inibição do crescimento fúngico aumenta muito pouco quando se
63
compara os dados de atividade da droga em 10 e 14 dias (93,78% e 95,91%
respectivamente).
A taxa CD/CIM pode auxiliar a interpretação dos resultados do teste de
susceptibilidade in vitro associado aos níveis de fluconazol encontrados no cérebro.
No presente estudo, os valores dos índices CD/CIM foram praticamente os mesmos
em 7 e 10 dias (1,936 e 2,056 respectivamente) e foi observado notável redução em
14 dias (0,696). Neste período esperava-se maior inibição do crescimento fúngico,
uma vez que a concentração de fluconazol detectado no cérebro de 14 dias foi
superior aos obtidos nas dosagens anteriores, entretanto esse fato não foi
observado uma vez que ocorreu nesse período um aumento no valor da CIM de 16
para 64 µg/mL no grupo tratado. Esse aumento no valor da CIM promoveu a
redução na taxa CD/CIM e uma inibição no número de UFC/g de somente 2,13% a
mais quando comparado ao grupo tratado por 10 dias. Foi observado ainda que os
níveis da droga determinados no cérebro dos animais foram superiores aos valores
de CIM nos dias 7 e 10 e inferiores no dia 14.
O
CLSI
(2002)
estabeleceu
os
seguintes
pontos
de
corte
para
susceptibilidade de isolados de Candida spp. ao fluconazol: isolados que
apresentam CIM ≤ 8 µg/mL são considerados susceptíveis, isolados com CIM entre
16 e 32 µg/mL são classificados como susceptíveis dose-dependente ou
intermediários e, isolados com CIM ≥ 64 µg/mL são considerados resistentes.
Considerando os pontos de corte propostos para Candida spp., os isolados do
presente trabalho obtidos do grupo não-tratado e os isolados do grupo tratado de 7 e
10 dias são classificados como susceptíveis dose-dependente e, os isolados obtidos
do grupo tratado de 14 dias são classificados como resistentes. Mondon et al.
(1999), estudaram a susceptibilidade ao fluconazol de isolados de C. neoformans
obtidos de dois pacientes infectados e demonstraram que a proporção de isolados
resistentes aumentou de forma constante durante períodos prolongados de terapia,
sendo considerados resistentes aqueles que apresentaram CIM igual a 64 µg/mL.
Mitchell e Perfect (1995) sugeriram que um aumento na CIM da droga de 4 vezes
para isolados de C. neoformans pode representar resistência. No presente estudo foi
observado aumento de quatro vezes no valor da CIM quando os isolados foram
expostos por 14 dias a terapia com fluconazol, apoiando a hipótese de que a
resistência pode surgir durante o tratamento. O aumento no valor da CIM pode
predizer maior dificuldade de eliminar o microrganismo. Dessa forma, apesar da
64
redução no número de UFC/g de cérebro, as leveduras remanescentes podem exibir
maior resistência in vivo, o que pode revelar a necessidade da administração de
altas doses da droga ou a substituição do antifúngico. Dessa forma, é possível que o
aumento da concentração de fluconazol a fim de alcançar níveis da droga no
cérebro superiores a 64 µg/mL (CIM do dia 14), possa reduzir a gravidade da
infecção.
Almeida et al. (2007) sugeriram que isolados de C. neoformans possam
tornar-se resistentes durante o tratamento com fluconazol. Os autores observaram
em seus estudos aumento no valor da CIM de 2 para 16 µg/mL frente ao fluconazol.
Soares et al. (2008) também relataram um caso de resistência em um garoto
infectado com C. gattii e tratado com fluconazol. Os valores da CIM encontrados no
último estudo foram ≥ 64 µg/mL. Aller et al. (2000), mostraram que uma melhor
resposta clínica a terapia é observada quando as amostras de C. neoformans
apresentavam valores de CIM menores que 16 µg/mL e Larsen et al. (2005b)
relataram que os resultados de CIM in vitro podem corresponder ao efeito in vivo
para o antifúngico fluconazol. No entanto, também foi demonstrado em um modelo
experimental de criptococose disseminada que outros fatores além da CIM, tais
como o tamanho da carga fúngica no cérebro, influencia na eficácia do fluconazol in
vivo (DANNAOUI et al., 2006).
Estudos que estabelecem valores de CIM para prever a resposta clínica à
terapia em indivíduos com infecções criptococócicas são escassos (ALLER et al.,
2000) e muitos estudos são ainda necessários para se estabelecer pontos de corte
para o fluconazol frente a esse patógeno. Suspeita-se que os isolados clínicos de
Cryptococcus são menos susceptíveis ao fluconazol do que os isolados ambientais
(ALVES et al., 2001), e Khan et al. (2009) relataram que isolados de C. gattii são
relativamente menos sensíveis do que C. neoformans a anfotericina B, 5-flucitosina
e azóis. Porém, as causas das diferenças de susceptibilidade a antifúngicos entre C.
neoformans e C. gattii não são totalmente compreendidas, e segundo os autores um
importante fator que pode estar implicado na susceptibilidade aos antifúngicos é o
conteúdo de melanina na parede celular, o qual pode impedir a droga de alcançar
seu local de ação na célula fúngica. Assim, é ainda necessário determinar se
isolados de C. gattii e C. neoformans diferem em sua capacidade de sintetizar
melanina in vitro e/ou in vivo. Almeida et al. (2007) evidenciaram em seus estudos a
ocorrência de mudanças genéticas em algumas linhagens de C. neoformans e C.
65
gattii durante o curso da infecção e que tais mudanças podem estar associadas ao
aumento nos valores da CIM. O mecanismo que causa a diversidade genética entre
os isolados não é totalmente compreendido, mas é possível que a população fúngica
se altere e se adapte a fim de escapar da pressão de drogas antifúngicas ou para
evadir do sistema imunológico. Outras formas de resistência dos fungos aos azóis
vêm sendo estudado (ALBERTSON et al., 1996; NAKAMURA et al., 2001; WHITE;
MARR; BOWDEN, 1998). Apesar da maioria desses estudos serem desenvolvido
com espécies de Candida albicans é provável que muitos dos mecanismos descritos
para essa espécie possam ser aplicados a outros fungos. Estes incluem a
superexpressão de genes que codificam para bombas de efluxo (CDR1, CDR2 e
MDR1), alterações no nível de expressão ou mutações no gene ERG11 que codifica
para a proteína alvo dos azóis, a enzima 14α-demetilase, envolvida na via de
biosíntese do ergosterol (WHITE; MARR; BOWDEN, 1998). Alguns desses
mecanismos têm sido explorados para C. neoformans (POSTERARO et al., 2003).
Por meio das bombas de efluxo o fungo é capaz de reduzir as concentrações
intracelulares do antifúngico, sendo esse o principal mecanismo de resistência de
isolados clínicos de C. albicans ao tratamento com fluconazol (ALBERTSON et al.,
1996; NAKAMURA et al., 2001), e o gene CDR1 o mais frequentemente associado
ao efluxo de drogas nesses microrganismos (NAKAMURA et al., 2001). Posteraro et
al. (2003), por meio de técnicas moleculares, identificaram que a superexpressão do
gene CnAFR1 que codifica uma bomba de efluxo da família de transportadores ABC
pode estar associado ao aumento da resistência de C. neoformans após várias
exposições ao fluconazol. As mutações no gene ERG11 podem ocasionar
alterações conformacionais que interferem na afinidade de ligação do azol no seu
alvo conferindo resistência ao microrganismo. Há relatos de substituição de
nucleotídeos no gene ERG11 de isolados resistentes a azóis (SANGLARD, 2002). O
melhor entendimento dos mecanismos de resistência do Cryptococcus spp. poderão
auxiliar a interpretação de testes de susceptibilidade.
Embora dados clínicos e experimentais demonstrem que a imunidade
mediada por células é crucial na defesa hospedeira contra Cryptococcus spp. os
mecanismos específicos por meio dos quais a resposta resulta em proteção são
pobremente compreendidos. A indução de citocinas pró-inflamatórias, as quais
recrutam e ativam leucócitos para inibir e matar fungos invasivos, é central para a
resposta imune protetora contra infecções causadas por fungos. Entre as citocinas
66
mais importantes envolvidas na resposta protetora ao Cryptococcus spp. estão IL-12
e IFN-γ (RETINI et al., 2001).
De uma forma geral, nesse estudo houve predomínio de um padrão de
resposta tipo 1 caracterizada pelo aumento na produção das citocinas IFN-γ e IL-12.
A IL-12 é essencial para iniciar uma sequência de respostas envolvendo
macrófagos, células natural killer (NK) e linfócitos T, que resultam na eliminação de
microrganismos. Para o desenvolvimento da resposta imune específica, o fungo
deve ser fagocitado e seus antígenos devem ser apresentados pelas células
apresentadoras de antígenos às células T, que estimulam a produção de IL-12. A IL12 secretada estimula células NK e células T a produzirem IFN-γ (ABBAS;
LICHTMAN, 2005). O IFN-γ acentua a função microbicida dos macrófagos levando a
eliminação dos microrganismos fagocitados (RETINI et al., 2001) por meio da
produção de moléculas tóxicas como o NO. O NO é uma importante molécula
microbicida, sendo que trabalhos com camundongos Knock-out para a enzima iNOS
(NOS2-/-) mostraram um maior número de células fúngicas no pulmão destes
animais após a infecção com C. neoformans comparado aos camundongos normais
(RIVERA et al., 2002).
Diversos estudos sugeriram que citocinas tipo 1 podem estar associadas com
a resposta imune protetora na criptococose. Guillot et al. (2008) mostraram que a
diminuição significativa da carga fúngica nos pulmões de camundongos infectados
com C. neoformans foi associada a uma resposta Th1 caracterizada por elevados
níveis de IFN-γ e IL-12, enquanto que uma maior carga fúngica esteve relacionada a
uma resposta Th2 mostrada por meio da eosinofilia e produção de IL-4. Biondo et al.
(2008) demonstraram que camundongos que não possuíam receptores para IFN-γ
morreram devido à infecção criptococócica, sendo a resposta imune nesses animais
caracterizada pelo aumento da expressão das citocinas IL-4, IL-13 e IL-10.
Conforme Biondo et al. (2003), citocinas Th2 podem ser responsáveis pela patologia
pulmonar destrutiva na criptococose e, de acordo com Zaragoza et al. (2007), a
resistência à infecção criptococócica está relacionada a uma resposta Th1
envolvendo a formação de granuloma e, uma resposta polarizada Th2 está
associada ao aumento da susceptibilidade ao Cryptococcus em camundongos. No
entanto, a produção exagerada de citocinas Th1 pode causar danos teciduais ao
hospedeiro devido à inflamação exacerbada e pior controle da disseminação
fúngica. Portanto, a resposta Th1 é importante para a eliminação do fungo, mas, o
67
equilíbrio entre as respostas Th1 e Th2 é essencial para que não ocorram danos ao
hospedeiro.
A citocina IL-10 é uma citocina do tipo 2 (ABBAS; LICHTMAN, 2005) e é
também uma citocina moduladora da resposta imune (MILLS, 2004), sendo capaz de
inibir a produção de IL-12 que é um estímulo crítico para a secreção de IFN-γ
(ABBAS; LICHTMAN, 2005). A IL-10 é também um potente inibidor da função de
macrófagos (ZARAGOZA et al., 2007). É também importante mencionar que o GXM
da cápsula criptococócica induz as células mononucleares a secretar IL-10, podendo
no caso dessa infecção, balancear o desenvolvimento de uma efetiva resposta
imune do hospedeiro (EISENDEL; GORDON; DYER, 2004).
A análise histológica da infecção criptococócica do cérebro dos camundongos
revelou a participação de células microgliais da resposta imune hospedeira. Foi
observado maior número destas células no cérebro dos animais não-tratado
comparado aos animais tratados com fluconazol. Estes dados podem ser
correlacionados com os maiores níveis de IFN-γ para os animais do grupo nãotratado, uma vez que esta citocina pode estar envolvida na ativação de fagócitos.
Estudos in vitro sobre a função das células microgliais na infecção criptococócica
cerebral indicaram que tais células são capazes de internalizar e conter inicialmente
as leveduras dentro de fagolisossomas (LEE et al., 1995b). Além da associação do
gene AFR1 ao aumento da resistência de C. neoformans ao fluconazol
(POSTERARO et al., 2003), Orsi et al. (2009) evidenciaram o papel desse gene na
resistência de C. neoformans à atividade antifúngica de células microgliais. No
estudo
dos
autores,
as
linhagens
mutantes
de
C.
neoformans
que
superexpressavam o gene AFR1 sobreviveram por mais tempo dentro de células
microgliais comparado às linhagens tipo selvagem. Apesar de ambas as linhagens
terem sido fagocitadas em extensão semelhante, na linhagem mutante foi observada
reduzida acidificação e maturação mais tardia dos fagócitos em relação à linhagem
selvagem. Nos estudos de Zhou et al. (2007), a ativação de células microgliais inibiu
o crescimento criptococócico e prolongou o tempo de sobrevivência dos
camundongos.
Como o fluconazol é uma droga fungistática, nem todos os microrganismos
presentes no organismo do hospedeiro são eliminados, e os microrganismos
restantes deverão ser combatidos pelo sistema imune do hospedeiro e pela droga.
No presente estudo, o número de UFC/g presente no cérebro dos camundongos do
68
grupo tratado foi significativamente menor, indicando a ação do fluconazol. A
diminuição do número de células fúngicas causada pela droga, provavelmente
permitiu ao hospedeiro produzir uma resposta inflamatória menor, demonstrada pela
diminuição na expressão de IFN-γ e aumento significativo de IL-10, proporcionando
um equilíbrio entre as respostas tipo 1 e tipo 2. Além disso, o tratamento dos animais
resultou em uma resposta imune mais controlada demonstrada pelo menor número
de células microgliais.
69
8 CONCLUSÃO
Os resultados observados após a análise e processamento dos dados
apresentaram as seguintes conclusões:
8.1 O ensaio microbiológico desenvolvido no presente trabalho foi adequado para a
determinação da concentração de fluconazol presente no cérebro de camundongos.
8.2 O modelo animal de infecção intracerebral criptococócica demonstrou ser útil
para estudos de correlação da atividade in vitro e in vivo do fluconazol.
8.3 Apesar da redução na carga fúngica, os isolados sequenciais de C. gattii obtidos
de camundongos infectados via intracerebral desenvolveram menor susceptibilidade
no 14º dia de terapia com fluconazol.
8.4 A terapia com fluconazol contra a criptococose favoreceu o equilíbrio entre as
respostas hospedeira tipo 1 e tipo 2.
8.5 O tratamento de animais infectados propiciou uma menor carga fúngica, que foi
correlacionado com o menor número de células microgliais quando comparado aos
animais não-tratados.
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83
ANEXOS
84
ANEXO A - Parecer CEP/UNIVALE 10/2007
85
ANEXO B - Manuscrito em confecção para publicação
Correlation of the in vitro antifungal drug susceptibility with the in vivo activity
of fluconazole in a murine model of cerebral infection caused by Cryptococcus
gattii
Fernanda Elízia Silva Mendesa, Lorena Vivien Neves Oliveiraa, Elaine Speziali Fariaa,
Daniel Gomes Alvarengaa, Marcia Ribeiro Pintob, Patrícia S. Cisalpinoc, Carlos
Pelleschi Tabordab, Daniel Assis Santosb,c*
a
Laboratório de Microbiologia, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Vale
do Rio Doce, Rua Israel Pinheiro, 2000, Bairro Universitário, 35020-220, Governador
Valadares, Minas Gerais, Brazil.
b
Laboratório de Fungos Dimórficos Patogênicos, Departamento de Microbiologia,
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu
Prestes, 1374, 2° andar, São Paulo, SP, 05508-900, Phone: 55 11 3091 7345, Brazil.
c
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais, Av. Antonio Carlos, 6627, Belo Horizonte, Minas Gerais,
31270-901, Brazil.
* Corresponding author: [email protected]
Abstract
A bioassay for the quantitation of fluconazole in murine brain tissue was developed.
Swiss mice received daily injection of the antifungal and the brains were withdrawn in
different moments during 14 days. The method presented adequate linearity. The
drug concentrations varied from 12.98 to 44.60 µg/mL at the first and the last day,
respectively. This assay was used to evaluate the therapy with fluconazole in a
model of cerebral infection caused by Cryptococcus gattii. Swiss mice were
intracranial infected and daily treated with fluconazole during 7, 10 or 14 days. The
antifungal treatment reduced the fungal burden, but an increase of the fungal growth
86
was observed at the day 14. MIC for fluconazole against sequential isolates was 16
µg/mL, except for the isolates obtained from animals treated during 14 days, for
which MICs were 64 µg/mL. This fact was correlated with the increase of the
antifungal levels and also of the fungal burden. Cytokines quantitation at 10 days of
infection revealed a predominance of Th1 response (IFN-γ and IL-12) in the non
treated group and elevation of Th2 cytokines (IL-10 and IL-4) in the treated group.
Our data revealed the possibility of acquired resistance during the antifungal drug
therapy.
Keywords: fluconazole, susceptibility, cryptococcosis
1. Introduction
Cryptococcus spp. are fungal pathogens that present a polysaccharide
capsule composed mainly of glucuronoxylomannan. Two species, C. neoformans
and C. gattii are the main human pathogens of the genera. C. neoformans tends to
infect immunocompromised patients, while C. gattii generally infects apparently
immunocompetent people (1, 2) and it is predominantly restricted to tropical regions
(3). Exposure to colonized soil or trees enhances the possibility of inhalation of
airborne propagules and may cause pulmonary and/ or central nervous system
disease (4).
Fluconazole, a triazole agent, is one of the most commonly prescribed
systemic antifungals (5,6). It is well absorbed after oral administration and shows
good penetration into cerebrospinal fluid (7, 8). The recent emergence of C.
neoformans fluconazole-resistant isolates highlights the need for improved treatment
regimens for the resistant organisms (9). Aiming the detection of the resistance, the
in vitro analysis of the antifungal activity may clarify the reasons for lack of clinical
response and assist clinicians in choosing an effective therapy for their patients (10).
However it is not clear yet whether the antifungal prescription could be based on the
available data from susceptibility studies (11).
During the last decades, considerable efforts have been expended to establish
a reproducible standard for minimum inhibitory concentration (MIC) determination of
the antifungals against the yeasts. The limited data provided by the method
87
developed by the Clinical and Laboratory Standard Institute (12) suggest that this
method might also be useful for C. neoformans, but data regarding C. gattii are
scarce; in addition, no interpretative guidelines or breakpoints have been identified
(13). A difficult that applies to the most of the studies focused on MIC-clinical
outcome correlation is that potentially resistant isolates (elevated MIC values) are not
frequently found in most of the clinical trials, and this circumstance may limits the
detection of the emergence of resistance. There are few published studies of in vivoin vitro correlation and they did not include a representative number of strains,
besides they are focused mainly on candidiasis (14). Based on these difficulties,
animal models of cryptococcosis caused by C. neoformans (9, 13) have been used
for studying the predictable value of the in vitro susceptibility data. Some of them
used a nonparametric regression method to estimate the dose-response curve for
antifungal agents in the animal blood (13).
There is a scarcity of works focused on the in vivo-in vitro correlation of
cerebral infection caused by C. gattii. Recently, a possible predictable value of CLSI
method was proposed by Soares et al. (15). The present study was designed to
evaluate the in vitro and in vivo activity of fluconazole against C. gattii. The
fluconazole levels in the mice’s brain were determined by a microbiological assay
and the results were correlated to MIC for sequential isolates of the microorganism.
In addition, the inflammatory response was evaluated for treated and non-treated
mice by measuring cytokine levels.
2. Material and methods
2.1. Determination of fluconazole levels in the brain of mice by microbiological
assay
(i) A turbidimetric assay was developed and a standard curve was plotted using
fluconazole reference standard (kindly donated by Cipla Limite) in concentrations
from 15.00 to 0.007 µg/mL. The antifungal was diluted in dimethilsulfoxide (DMSO)
and further in RPMI-1640 medium buffered with 3-(N-morpholinepropanesulfonic)
acid (MOPS) in 5 mL tubes. An inoculum constituted of Candida parapsilosis ATCC
22019 were made with yeasts grown on Sabouraud Dextrose Agar at 28 °C during
24 h. A small quantity of the colony was diluted on sterile distilled water and the
88
transmittance was adjusted to 85% at 530 nm, which corresponds to 1.0 x 106 to 5 X
106 CFU/mL (16). The inoculum was adjusted to 1.0 x 103 to 5.0 x 103/ mL in the
tubes containing the dilutions of fluconazole. The tubes with the drug inocula were
incubated at 28 °C during 48 h and the transmittanc e values at 530 nm were
determined and used to plot a curve versus the tested drug concentrations.
(ii) Non infected male Swiss mice with six to eight weeks (weigh from 23 to 33 g)
were submitted to a daily intraperitoneal injection of fluconazole (40 mg/kg/day) in a
maximum volume of 1 mL for 1 to 14 consecutively days. This work was approved by
Ethics Committee from Universidade Vale do Rio Doce, Brazil. Groups of at least six
animals were injected with ketamine/ xilazine (80mg/kg/ 10 mg/kg) anesthesia and
they were sacrificed after 1, 2, 4, 8, 10, 12 or 14 days of fluconazole injection. The
heads of the mice were swabbed with 70% alcohol and the brain tissue were
withdraw without blood contamination with further dispersal in a tube containing 9 mL
of RPMI-1640 (buffered with MOPS) with 1.0 x 103 to 5.0 x 103 CFU of C.
parapsilosis ATCC 22019. The final volume was adjusted to 10 mL. The tubes with
the inocula and the tissue were incubated at 28 °C during 48 h and the
transmittances were determined at 530 nm. The brains from mice with no injection of
the drug were submitted to the same protocol and they were used as blank control.
The transmittance values were used to calculate the fluconazole concentration in the
brain tissue by using the equation of the standard curve.
2.2. Cerebral infection with Cryptococcus gattii
The strain Cryptococcus gattii ATCC 32601 was used for the intracranial infection of
male Swiss mice with 6 to 8 weeks (weigh from 23 to 33 g). The microorganism was
cultured on Sabouraud Dextrose Agar during 48 h at 28 °C. The yeast was
transferred to sterile saline and the transmittance was adjusted to 70% at 530 nm
which corresponds to 1.2 x 107 CFU/mL. The mice were submitted to intraperitoneal
ketamine/ xilazine (80mg/kg/ 10 mg/kg) anesthesia previously to the intracranial
infection. Further their heads were closely clipped, and the area was swabbed with
70% alcohol. The inoculum (in a maximum volume of 50 µL) was delivered through a
27-gauge needle following direct puncture through the cranial vault approximately
6mm posterior to the orbit.
89
Groups of at least six infected animals were daily treated intraperitoneally with 40
mg/kg/day of fluconazole during 7, 10 or 14 days of infection. Non treated groups
were also included as control. The groups of mice were sacrificed after ketamine/
xilazine (80mg/kg/ 10 mg/kg) anesthesia in the days mentioned. The brain of each
mouse was obtained without blood contaminatin, followed by dispersal and serial
dilutions in sterile peptone water from 1:10 to 1: 1000. 100 µL of each dilution were
placed into duplicate plates containing Sabouraud Dextrose Agar. The plates were
incubated at 28 °C during 48 h. The colonies were c ounted and the results were
expressed as CFU/ g of brain. The identity of the yeast was confirmed by microscopic
test with Indian ink.
Colonies of each plate were used for susceptibility testing with fluconazole. The
spleens from the animals sacrificed at the day 10 were chosen to be used for
cytokines quantitation.
2.3. Susceptibility testing
Colonies obtained after 7, 10 and 14 days of infection from the treated (T) and non
treated (NT) groups were obtained randomly to be tested with fluconazole according
CLSI method (12). The inocula were performed in sterile saline with the yeast and the
transmittance was adjusted to 85% (530 nm), followed by further dilution in RPMI1640 medium to achieve 1.0 x 103 to 5.0 x 103 CFU/mL. The fluconazole was diluted
in DMSO, followed by dilution in RPMI-1640 in order to test the concentrations of
128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 and 0.25 µg/mL. An aliquot of 100 µL of the inocula
and 100 µL of the different drug concentrations were placed into sterile 96-flat
bottomed well plates, which were incubated during 72 h at 28 °C. Sterile and growth
control were also performed. The MICs were determined visually as 80% of growth
inhibition in comparison to the growth control. For the interpretation of the data, the
rate Drug Concentration in brain /MIC (DC/MIC) was calculated using the fluconazole
levels obtained in the same days (7, 10 and 14) of the MIC determination.
2.4. Measurement of cytokines
The spleens from animals of the non treated and treated groups sacrificed after 10
days of infection were withdrawn and their cells were dispersed manually, followed by
90
centrifugation at 1,200 rpm during five minutes. The lyses of erythrocytes were
performed by adding 1 mL of sterile distilled water. A new centrifugation step was
performed and the cell pellet was suspended in 1 mL of RPMI-1640 medium with 20
mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 100 U of penicillin/mL, 100 mg of streptomycin/ml, 2
mM L-glutamine and 100 mM nonessential amino acids with 1% normal human
serum. The cells were counted in 1:1 dilutions in 0.1% trypan blue. Viable cells were
cultured at a density of 5 x 106 per well in 96-well plates with concanavalin A during
72 h at 37 °C and 5.0% of CO 2. The supernatants of the culture were collected and
the concentration of
IFN-γ, IL-12, IL-4 and IL-10 were analyzed by sandwich
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with a Pharmingen kit, following all
directions except for the substrate, which was replaced by orthophenylenediamine
(Sigma) at 500 mg/ml. The final reading was at 492 nm. Recombinant cytokines
(Pharmingen) were used for standard curves with the respective monoclonal
antibodies. Spleen cells from non infected mice were submitted to the same protocol
and they were used as control.
2.5. Analysis of the Results
The concentration of fluconazole in the brain were correlated with the results from
susceptibility testing, CFU/g of brain and with the cytokine measurement. The rate
fluconazole concentration/ MIC (DC/MIC) was used for the interpretation of the fungal
burden. Student’s t test, ANOVA and Tukey test were used for statistical analysis, a
P value of < 0.05 was considered to be significant.
All the experiments were repeated twice and similar results were obtained.
3. Results
3.1. Determination of the fluconazole concentrations in the brain of mice: The
standard curve of fluconazole concentrations (from 15.00 to 0.007 µg/mL) versus %
of transmittance resulted in the equation y = 5.2029x + 4.6394 with adequate linearity
(R=0.9963). The slope was 5.203 ± 0.201 and the Y-intercept was 4.639 ± 1.190.
The equation was used for the determination of fluconazole concentration in the brain
of mice. Table 1 summarizes the levels of the antifungal in the brain. The
concentrations of fluconazole obtained varied form 12.98 ± 3.47 µg/g of brain at the
91
first day to 44.60 ± 7.65 µg/g of tissue at the day 14 (Table 1). Fig. 1 illustrates the
pharmacokinetics of fluconazole in the brain during the period of this study. We
observed a significantly (p<0.05) increase of the drug concentrations from day 1 to
day 8 and a maintenance of the levels from 8 to 14 days.
3.2. Cerebral infection with C. gattii: The animal model of cerebral infection
developed in this work resulted in the recovery of countable colonies in all the days of
sacrifice. We did not detect any morbidity signals of cerebral disease despite the
significant increase of fungal burden. The identity of C. gattii was confirmed by
microscopic test with Indian ink. Fig. 2 illustrates the log10 of CFU/g of brain obtained
for treated and non treated groups. The values of CFU/g in brain of non treated
groups increased from 7 to 14 days (p<0.05). We also noted a significantly difference
(p<0.05) when data within each day were analyzed, revealing an important reduction
(of at least 1 log) on the fungal burden in the treated group in comparison to the
animals with no fluconazole administration (data also shown on table 2). In general,
the CFU/g in brain for the treated group varied from 4.81 x 103 to 1.70 x 104 CFU/g of
tissue, while the results for the non treated group varied from 4.82 x 104 to 4.30 x 105
CFU/g of brain (Table 2). The spleen, liver and lungs were tested for the presence of
countable CFU in pilot experiments and no dissemination of the C. gattii was verified.
3.3. Susceptibility testing: All the MIC values found for fluconazole against the
sequential isolates of C. gattii obtained at distinct moments were 16 µg/mL, except
for the yeasts isolated from the treated group at the day 14, for which the MICs were
four times higher (64 µg/mL). Table 2 also demonstrates the MIC values obtained,
the fluconazole concentrations found in the brain and the data about CFU/g of brain.
We verified an increasing on the rate DC/MIC from 1.93 to 2.05 from 7 to 10 days of
test. Furthermore, a reduction on DC/MIC from 2.07 to 0.70 was observed from the
day 10 to the day 14. An engrossing observation is that the reduction in the rate
DC/MIC occurred concomitantly with the increase from 6.1 x 103 to 1.7 x 104 CFU/g
of brain from the day 10 to 14. Fig. 1 also demonstrates the MIC values obtained in
each day in the context of the kinetics of fluconazole in the brain. In general, MIC
values were lower than the fluconazole concentration found in the brain, except for
the colonies obtained at the day 14.
92
3.4. Measurement of IFN-γ, IL-12, IL-10 and IL-4: The cytokine levels on
supernatant of spleen culture from animals after 10 days of infection for groups
treated and non-treated are illustrated on Fig. 3. Control groups (non infected
animals) were included as control. The levels of IFN-γ and IL-12 were higher in the
non treated group. Different results were obtained for the treated animals, from which
IL-10 and IL-4 presented higher levels. A significant (p<0.05) reduction of IFN-γ and
increasing of IL-10 quantities were verified when non treated and treated groups
were compared.
4. Discussion
In this work we developed a microbiological assay for the fluconazole quantitation in
the murine brain tissue. The most common described methods aiming the
fluconazole determination in biological tissues are performed using blood samples
and the equipments used were liquid chromatograph (LC) and gas chromatograph
(GC) (5, 7). Our method showed adequate linearity and demonstrated to be reliable.
The levels of the antifungal in the brain of mice found in our study are close to those
obtained by Lortholary et al. (17). In that study, the authors determined the antifungal
concentration in the brain by an agar diffusion method with similar doses to those
used in our work. We can expect that the contents determined by bioassay could be
higher than that quantified by chemical methods, since subtle changes can not be
revealed by chemical assays and bioassay also gives the possibility to evaluate the
real activity of fluconazole (8, 19). The drug activity is an important factor to be
considered since it might be correlated with the effect of the drug against the
infection. Furthermore, the drug levels in the brain could be an important information
for predicting the adequate concentration of the drug in the organ in order to achieve
a successful outcome of cerebral fungal infections. It is widely recognized that animal
models are not likely to provide the precise doses which will produce the optimum
therapeutic effect in the clinic (20). However, information regarding the antifungal
distribution to the brain and its correlation with the fungal burden provides best
response in the animal model and the results could be helpful for the delineation of
clinical trials.
Previous works focused on animal model of cerebral cryptococcosis used C.
neoformans as test organism for the infection of mice and guinea pigs (9, 17, 21, 22)
93
being the present work the pioneer using C. gattii for the cerebral infection. A slowly
progressive infection with no deaths during the protocol was desired, since we aimed
analyzing the correlation of the in vivo activity of fluconazole with the in vitro MIC
values for this antifungal in different moments of the therapy. In addition, we consider
the intracranial injection a simple, reproducible and reliable way for the infection of
mice with C. gattii, since it mimics the clinical characteristics of the disease, which
shows focal features in the cerebrum and prolonged symptoms. Neurological
sequelae may occur requiring surgery and extended therapy; the dissemination rarely
occurs in immunocompetent patients (23). Some cases reported the occurrence of
only cerebral infection without pulmonary disease (15). As we can expect, therapy
with fluconazole (40 mg/g/day) resulted in significantly reduction of the fungal burden
in comparison to the non treated group, although an increasing on CFU/g of brain
was verified at the day 14 in comparison to the day 10. The possibility of the
degradation of the drug should not be considered, since bioassay revealed the
biological activity of the antifungal in the brain during all the protocol. This result
might reveal a probably lack of efficacy and lower activity of the drug at this time of
treatment due to the emergence of fungal resistance. Further increasing on the
fluconazole doses in order to achieve levels of the drug in the brain higher than 64
µg/mL (the MIC at day 14) could possible reduce the severity of the infection.
According to Larsen et al. (13), it is not known whether the drug concentrations used
in vitro that correspond to the observed murine response represent peak or through
drug levels in the brain. We proposed that the rate DC/MIC could be helpful for the
interpretation of the in vitro susceptibility data associated with the kinetics of the drug.
In this work the increase of fluconazole in the brain occurred concomitantly with the
increase of the MIC values from 16 to 64 µg/mL. It might reveal the possible
evolution of a change in microbial response to the increasing drug concentrations,
suggesting the emergence of resistant organisms, which in part may clarify the
meaning of the increase of the CFU/g of tissue (table 2). The goal of the in vitro
susceptibility testing is to predict the clinical outcome. An in vitro measure that can
reliably predict the response of the treatment would permit physicians to select the
drug with the highest activity (13). Taking into consideration the breakpoints
proposed by CLSI (12), for Candida spp., the isolate was classified as susceptible
dose-dependent when it was obtained from non-treated group and also from treated
group at the days 7 and 10. On the other hand, the strain was classified as resistant
94
when obtained from treated group at the day 14, which might reveal the need of
higher doses of the drug or even its replacing by other antifungal agent. Similar
results were found by Almeida et al. (24) when comparing sequential isolates
provided from patients under antifungal therapy. The authors verified an increasing
on MIC values for fluconazole against Cryptococcus spp. They also suggested a
clinical significance for the heteroresistant phenotype as a potential cause of the
failure of the fluconazole treatment, raising the hypothesis of the acquired resistance
during the antifungal treatment.
The possibility of less favourable response to antifungal therapy and relatively worse
prognosis for infections caused by C. gattii than those caused by C. neoformans was
related (25), reinforcing the need to establish whether susceptibility data would be
helpful for treating diseases caused by the former microorganism. An interesting
observation is that the most recurrences of cryptococcal meningitis during
maintenance therapy were due to the persistence of the original infecting strains
rather than the reinfection with a new criptococcal strain (24) Previous works (26)
revealed that Cryptococcus isolates can undergo genetic changes in vitro and in vivo,
which may contribute to the survival by providing means to evade host defenses. For
human pathogens, the host represents a microenvironment of particular interest, and
phenotypic alterations may affect the host-pathogen relationship with consequences
that can translate into changes in virulence (3) and also in drug susceptibility profile.
The Th1 response based on the production of cytokines such as IFN-γ is essential for
the clearance of the infection. We noted the predominance of IFN-γ and IL-12 mainly
for the non treated group. On the other hand, higher levels of Th2 cytokines were
verified for the treated group. It is important to consider that the major capsular
component of Cryptococcus spp. induces the peripheral blood mononuclear cells to
secrete IL-10, which suppress the production of pro-inflammatory cytokines, such as
IFN-γ and IL-12, and may inhibit the development of an effective host immune
response (27). A possible reason for the increase of the IL-10 levels is that
fluconazole, provides higher levels of circulating cryptococcal capsular antigens by
promoting cell membrane destabilization, which could drives the course of the host
response. Another hypothesis is that the IL-10 in treated mice may reflect the animals
regulating the inflammatory IFN-γ and IL-12 responses.
In conclusion, our microbiological assay developed for the quantitative determination
of fluconazole in murine brain tissue provided analytical information when dealing
95
with the in vitro susceptibility data of this agent against C. gattii. Furthermore, the
animal model of cerebral cryptococcosis demonstrated to be useful for in vitro-in vivo
studies. The correlation of the data raised the possibility of the development of
resistance during the antifungal therapy.
5. Acknowledgments
This investigation, FESM and LVNO were financially supported by Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) grant APQ-2864-07.
DAS was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) grant 2008/04289-7. MRP was supported by CNPq.
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Table 1: Fluconazole concentration in the brain of male Swiss mice determined by
the microbiological assay after the daily administration of 40 mg/kg/day.
Time (days)
Fluconazole
in the brain (µg/g of tissue ± s.d.*) (n=6)
1
12.98 ± 3.47
2
16.49 ± 3.56
4
18.60 ± 9.59
8
30.98 ± 6.69
10
32.91 ± 15.43
12
34.45 ± 13.52
14
44.60 ± 7.65
*s.d.: standard deviation
99
Table 2: Minimum inhibitory concentration (MIC) values for fluconazole against C.
gattii obtained from mice at 7, 10 and 14 days of intracerebral infection and treated
with that antifungal. The rate DC/MIC (Drug Concentration/ Minimum Inhibitory
Concentration) was calculated for each day. CFU/g of brain is shown for treated and
non treated groups. The increase of the MIC value and the reduction on the rate
DC/MIC occurred concomitantly with the increase of the CFU/g of tissue in the group
treated with fluconazole during 14 days.
Time of
MIC (µg/mL) for
infection
(days)
DC/MIC
CFU/g of
CFU/g of brain
fluconazole in
brain from
from treated
the treated
non treated
groups
group
groups
7
16
1.93
4.82 x 104
4.81 x 103
10
16
2.05
9.80 x 104
6.10 x 103
14
64
0.70
4.30 x 105
1.75 x 104
100
Figure 1: The line represents the pharmacokinetics of fluconazole (µg/g of tissue ±
s.d.) in the brain of male Swiss mice determined by microbiological assay after the
daily administration of 40 mg/g/day. The curve demonstrates the significantly
(p<0.05) increasing of the antifungal in the brain from the day 1 to 8. There were two
determinations which the MIC value was 16 µg/mL (at days 7 and 10) and there was
one determination which MIC was 64 µg/mL (at the day 14). The first two values
were below the fluconazole kinetics curve, while the last MIC was above the
antifungal levels in brain. This high MIC value occurred concomitantly with the
increasing on CFU/g of tissue in the animals treated during 14 days.
101
Log CFU/g of brain
6
5
4
3
2
7 NT
7T
10 NT 10 T 14 NT 14 T
Time (days)
Figure 2: Log10 of CFU/g of brain of C. gattii obtained from male Swiss mice infected
with C. gattii. The lines represent the average of the determinations. The animals
were sacrificed after 7, 10 and 14 days of infection for non treated (NT) and treated
(T) groups. The levels of CFU/g of tissue significantly increased in the NT groups
from 7 to 14 days of infection (p<0.05). A significantly reduction (p<0.05) on the
CFU/g of brain occurred in the T groups in comparison to the NT animals. Within
treated groups, higher levels of CFU/g of brain were obtained from animals sacrificed
at the day 14. This fact occurred concomitantly with the reduction of the susceptibility
(increase on MIC) for the tested isolate.
102
2500
*
2000
pg/mL
1500
1000
*
500
*
0
IFN -γ
IL-12
IL-10
IL-4
Figure 3: Cytokine levels (pg/mL ± s.d.) obtained from the culture of spleen from male
Swiss mice. Black bars correspond to the control group (non infected and non treated
mice), dotted bars correspond to the results obtained from infected and non treated
mice, while hatched bars correspond to the animals infected and treated with
fluconazole. We noted significantly reduction (p<0.05) on the IFN-γ and increase on
the IL-10 levels when comparing the non treated with the treated groups. The
asterisks represent statistically difference within data obtained for the same cytokine
(p<0.05).