título do resumo

IDENTIFICAÇÃO TAXONOMICA (GENERO) DE BACTÉRIAS
ASSOCIATIVAS ISOLADAS DA PLANTA MEDICINAL “ALECRIM-DOCAMPO” (Baccharis dracunculifolia DC)
Giovana Oliveira Gutuzzo; Elisete Pains Rodrigues; Fernando Gomes
Barcellos, email: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Biologia Geral/CCB.
Ciências Biológicas/Genética Molecular e de Microrganismos.
Palavras-chave: actinobactéria, bactérias associativas, ribossomal gene 16S.
Resumo
Plantas nativas da flora brasileira constituem uma fonte promissora para
o estudo da biodiversidade e a bioprospecção de microrganismos com
potencial aplicação biotecnológica em diferentes áreas de interesse. Neste
contexto, as plantas medicinais são especialmente importantes para a
bioprospecção de microrganismos com potencial aplicação na prospecção de
antimicrobianos e outras biomoléculas ativas. Plantas com possível atividade
antimicrobiana devem ser testadas contra um modelo microbiano adequado
para confirmar a atividade e verificar os parâmetros associados a ele. Os
efeitos de extratos de plantas sobre as bactérias têm sido estudados por um
grande número de pesquisadores em diferentes partes do mundo. Como em
outras espécies nativas, muito pouco se conhece sobre a diversidade de
microrganismos associados à B. dracunculifolia DC. B. dracunculifolia e outras
espécies do gênero Baccharis têm sido estudadas pelo grupo de pesquisa do
Laboratório de Genética de Microrganismos (LAGEM-UEL) visando estabelecer
uma coleção de bactérias associadas à estas plantas e estudar a diversidade e
o potencial biotecnológico destas bactérias associativas. Neste contexto, o
objetivo do presente trabalho foi identificar o gênero das bactérias associativas
da coleção do Laboratório de Genética de Microrganismos por técnicas
moleculares baseadas na amplificação e sequenciamento do gene ribossomal
16S.
Introdução e objetivo
Os microrganismos possuem uma grande adaptabilidade genética e uma
extensa diversidade metabólica, o que os torna uma importante fonte de
recursos para os avanços da biotecnologia (OLIVEIRA et al., 2006). As
bactérias associadas (endofíticas e epifíticas) às plantas são importantes fontes
de antibióticos e outras bio-moléculas de importância biotecnológica em
1
diferentes áreas de interesse. Portanto este trabalho tem como objetivo
identificar taxonômicamente (gênero) de bactérias associadas à planta
medicinal Baccharis dracunculifolia, provenientes da coleção de
microrganismos associativos às plantas medicinais do gênero Baccharis do
Laboratório de Genética de Microrganismos (LAGEM) da EU. A identificação
taxonômica (gênero) destas bactérias da coleção irá possibilitar futuros estudos
de bioprospecção de enzimas de interesse industrial, antibióticos e outras biomoléculas de interesse biotecnológico em diversas áreas de interesse.
Procedimentos metodológicos
Foram estudados 32 isolados de actinobactérias provenientes da
coleção de culturas do Laboratório de Genética de Microrganismos da
Universidade Estadual de Londrina, sendo estas provenientes de diferentes
partes da planta medicinal B. dracunculifolia. Para o isolamento de
microrganismos endofíticos foi utilizada a técnica descrita por Matsumoto,
2014. A extração de DNA destes isolados foi efetuada a partir do protocolo de
CTAB/NaCl descrito por Matsumoto (2014). Para a reação de PCR foram
utilizados os primers FD1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) E RD1 (5’AAGGAGGTGATCCAGCC-3’) (Weissburg et al., 1991), que amplificam quase
todo comprimento da região correspondente ao gene ribossomal 16S (1500
pb). O sequenciamento foi feito em um sequenciador ABI PRISM 3500 (Applied
Biosystems Inc.). A reação de sequenciamento consistiu de 3 L do produto
purificado, 3 L de corante (Big dye - Applied Biosystems Inc.) e 3 pmol do
primer
362f
(região
339–362
do
DNA
ribossomal 16S)
(5′CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG-3′), conforme descrito por Menna et al.
(2006). As sequências obtidas foram analisadas utilizando os programas
Phred/Phrap (EWING et al, 1998) e editadas com o programa BioEdit (HALL,
1999). A sequencias parciais do gene ribossomal 16S dos isolados foram
comparados com o banco de dados disponíveis no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), utilizando o programa BLASTN (NCBI). Com
base nos níveis de similaridade encontrados com sequencias disponíveis no
Genbank foram determinados os gêneros bacterianos dos isolados.
Resultados e discussão
Após realização das extrações de DNA dos isolados bacterianos e a
quantificação dos mesmos, os DNAs foram então submetidos à amplificação
por PCR do gene ribossomal 16S. Após amplificação por PCR com os primers
FD1 e RD1 e eletroforese em gel de agarose, foi demonstrado que os
amplicons obtidos possuíam em torno de 1500 pares de bases como esperado
para o gene ribossomal 16S (dados não apresentados). Após a amplificação
dos genes ribossomais, estes foram submetidos ao sequenciamento parcial,
2
conforme descrito anteriormente. Dos 32 isolados analisados inicialmente,
somente 18 resultaram em sequências de qualidade suficiente para os estudos
de identificação taxonômica. Desta forma, as 18 sequencias parciais obtidas do
gene ribossomal 16S, proveniente de 18 diferentes isolados, foram
comparadas com o banco de dados GenBank com o uso da ferramenta BlastN
para determinação do gênero dos isolados (Tabela 1).
Tabela 2 – Identificação taxonômica (gênero) dos isolados com base nos níveis
de similaridade (identidade) com sequencias gênicas depositadas no banco de
dados GenBank com o uso da ferramenta BlastN (NCBI).
Isolados
Identificação
N Acesso
130
Acinetobacter
radioresistens
Actinobacterium
Actinobacterium
Actinobacterium
Bacillus aryabhattai
Bacillus cereus
Bacillus cereus
Bacillus safensis
Bacillus sp.
Bacillus sp.
Pantoea ananatis
Pantoea ananatis
Pantoea ananatis
Staphylococcus sp.
Streptomyces
bungoensis
Streptomyces lydicus
Streptomyces
prasinopilosus
Streptomyces
regensis
KP769427
Identidade
(%)
99%
KP216747
KP185311
KP185320
AB934966
KP215642
KP243196
KP318459
HM755813
KR094815
KM675660
KM675660
KP704411
DQ659036
U320652
99%
99%
99%
100%
100%
100%
100%
99%
98%
99%
99%
100%
99%
99%
CP007699
KF772672
100%
99%
NR_04349
5
99%
371
397
405
175
115
206
332
287
418
131
184
229
286
113
395
180
353
Número de Acesso – da sequência de maior similaridade no GenBank
Conclusão
A identificação taxonômica (gênero) de 18 isolados de bactérias isoladas
previamente da planta Baccharis dracunculifolia e do solo associado a estas
plantas, proveniente da coleção de microrganismos associados a plantas do
Laboratório de Genética de Microrganismos da UEL, permitiu a identificação de
3
6 gêneros: Streptomyces sp.; Staphylococcus sp.; Pantoea ananatis; Bacillus
sp.; Actinobacterium sp. e Actinobacter sp. A identificação taxonômica (gênero)
destas bactérias da coleção irá possibilitar futuros estudos de bioprospecção
destes isolados.
Agradecimentos
Ao CNPq, a mestranda Ana Camila Muniz. Ao técnico Ideval Azarias de
Souza e a prof. Dra. Elisete Pains Rodrigues. A Msc. Jakeline Renata Marçon
Delamuta, Dr. Renan Augusto Ribeiro e Monica Alzate pela assistência no
sequenciamento.
Referências
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phred II. Error probabilities, Genome Research, v.8, p.186-194, 1998.
HALL, T.A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and
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n.41, p.95-98, 1999.
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rep-PCR fingerprinting techniques. 2014. 57p. Trabalho de Conclusão de
Curso (Especialização em Genética Aplicada) – Universidade Estadual de
Londrina, Londrina, 2014.
MENNA, P., HUNGRIA, M., BARCELLOS, F. G., BANGEL, E. V., HESS, P. N.;
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York. 1987.
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