Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina
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Fundação Oswaldo Cruz Instituto Fernandes Figueira Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Amelia Raquel Neves de Noronha Rio de Janeiro Fevereiro de 2010 Fundação Oswaldo Cruz Instituto Fernandes Figueira Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Amelia Raquel Neves de Noronha Rio de Janeiro Fevereiro de 2010 Fundação Oswaldo Cruz Instituto Fernandes Figueira Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Amelia Raquel Neves de Noronha Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Saúde Materno Infantil Orientadora: Profª. Drª. Célia Regina Moutinho de Miranda Chaves Rio de Janeiro Fevereiro de 2010 iv DEDICATÓRIA À minha querida filha, Júlia, meu grande amor, este sim o meu maior e melhor projeto; Ao meu marido Luís, pelo seu coração bondoso; Aos meus pais, Leonel e Salvina, pela sólida formação, dedicação e amor, que me proporcionaram chegar até aqui; À minha irmã Claudia, pela sua amizade e carinho; A minha sobrinha e afilhada Joana, a pequena que mudou uma história; Aos meus sobrinhos e afilhados, Victor, João Pedro e Rafael, pelos momentos de diversão, alegrias e carinho durante toda uma vida; E a Deus, amigo de todas as horas, com certeza, sozinha eu não faria isso. v AGRADECIMENTOS À Drª. Célia Regina Moutinho de Miranda, orientadora querida e acima de tudo mestre, pela paciência, pela generosidade em compartilhar seus conhecimentos. A ela, toda a minha admiração e gratidão; Especial agradecimento à Drª. Laurinda Yoko S. Higa, que admiro, pela oportunidade que me deu em participar deste projeto, pela atenção e recomendações na minha qualificação; Ao Dr. Antônio Celso Calçado, que foi embora para sempre, mas deixou um pouco de si nessa dissertação, o meu muito obrigado; À Drª. Maria Vírginia Peixoto Dutra, um agradecimento muito especial pelas idéias, disponibilidade, por sua atenção e sugestões efetivas na realização deste trabalho; À equipe do Laboratório de Imunopatologia Humana do IFF, em especial à Drª. Maria Ignez Capella Gaspar Elsas, Dr. Pedro Paulo Elsas, Dr. Zilton Vasconcelos e Dr. Ricardo Luz, que muito me ajudaram a construir esta dissertação, pela simpatia, conhecimento e presteza no auxílio da técnica, pela ajuda na interpretação dos resultados obtidos, minha profunda gratidão; Ao Dr. Pedro Cabello, coordenador do projeto Pensa Rio À Drª Maria Elisabeth Lopes Moreira, pelo apoio financeiro; Aos professores da Pós-Graduação, pelos saberes que me foram transmitidos; Ao Prof. Dr. Saint Clair Gomes, pela disponibilidade na discussão e ajuda na aplicação das técnicas de estatística, apesar das férias; Aos meus amigos, Cynthia e Marcelo, que de muitas formas, contribuíram com sua amizade, carinho e atenção, para a realização deste trabalho; vi Aos colegas do Ambulatório de Nutrição, Maria Luiza, Teresa, Roseli, Célio, Myrian, Ana Lúcia, Carlos, Eduardo, Danilo, pelo incentivo, apoio e afeto; Aos colegas do curso de Mestrado Profissional, pela diversão, aprendizado, convivência e pela amizade; Aos funcionários da secretaria de Pós-Graduação, pela disponibilidade e presteza; Ao Departamento de Patologia Clínica, em especial, Dr. Jânio Alves Cordeiro, que disponibilizou um ambiente para armazenamento e processo do material; A todos os meus queridos amigos de longa data, da vida inteira, pelo apoio; A todos os pacientes com Fibrose Cística, gostaria de expressar minha profunda gratidão. vii RESUMO Objetivo:avaliar a presença de Insuficiência Pancreática pelo método de dosagem de Elastase1 fecal nos pacientes com Fibrose Cística acompanhados no IFF e associar este teste com a dosagem de gordura fecal. Metodologia: Trata-se de um estudo transversal. A concentração de Elastase1 fecal foi realizada por ensaio imunoenzimático (Schebo-Tech,Wettenberg, Alemanha) e a dosagem de gordura fecal pelo método Van der Kamer. Considerou-se insuficientes pancreáticos pacientes com EF1<200µgE1/g e suficientes pancreáticos aqueles com valores >200µgE1/g. As análises estatísticas foram feitas no programa Epi Info 2000 (CDC). O ponto de corte para o valor de significância dos testes estatísticos foi o p-valor ≤ 0,05. A Sensibilidade, especificidade e valor preditivo positivo e negativo foram avaliados comparando a Elastase1 fecal com a gordura Fecal. Resultados:Um total de 72 pacientes participaram do estudo (com idade de 4 meses a 20,5 anos): 60 com diagnóstico confirmado e 12 em investigação diagnóstica de Fibrose Cística. A prevalência de Insuficiência Pancreática no grupo todo e nos pacientes com diagnostico confirmado foi de 62,5 e 73,3 respectivamente. A associação da classificação da função pancreática pela dosagem da Elastase1 Fecal com a dosagem da gordura fecal foi estatisticamente significante (p=0,0002). O RR foi de 2,15 vezes do paciente com Insuficiência Pancreática apresentar gordura fecal positiva. A sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e negativo foram de 88%, 58,3%, 85,7%, 63,6% respectivamente. Conclusão: A determinação da Elastase1Fecal, como um novo método de avaliação da função pancreática mostrou-se uma ferramenta útil para o screening em pacientes com FC. viii ABSTRAC The aim of this study was to evaluate the presence of pancreatic insufficiency using fecal elastase1(FE1) in patients with CF followed at the IFF and associate this with the 3-day fecal fat balance study. It’s a cross-seccional study. FE1 concentration was determined with enzyme immunoassay (schebo-Tech, Wettenberg, Germany) and fecal fat study by Van der Kamer method. Was considered pancreatic insufficient patients with Elastase1fecal <200μgE1/g and pancreatic sufficient those with values> 200μgE1 /g. Statistical analysis was done using Epi Info 2000 (CDC). The significance value of statistical tests was p-value ≤ 0.05, the sensitivity, specificity and positive predictive value and negative were evaluated by comparing the Elastase1 with fecal fat balance. Results: A total of 72 patients were studied (age 4 months-20.5 years): 60 with known CF and 12 in investigation of Cystic Fibrosis. The prevalence of pancreatic insufficiency in the whole group and in patients with confirmed diagnosis was 62.5 and 73.3 respectively. The association of the classification of pancreatic function by measuring the Elastase1 Fecal with the determination of fecal fat study was statistically significant (p = 0.0002). The RR was 2.15 times of patients with pancreatic insufficiency have positive fecal fat. The sensitivity, specificity and positive predictive value and negative were 88%, 58.3%, 85.7%, 63.6% respectively. Conclusion: The determination of Elastase1Fecal, as a new method of evaluation of pancreatic function showed to be a useful tool for screening in patients with CF. ix ABREVIATURAS FC Fibrose Cística EF1 Elastase1 Fecal IFF Instituto Fernandes Figueira IP Insuficiência Pancreática SP Suficiência Pancreática DIOS Síndrome de obstrução intestinal distal HCO3 Bicarbonato CCK Colecistoquinina CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator CO2 Dióxido de carbono Na+ Sódio K+ Potássio Cl- Cloro H2O Água H2CO3 Ácido Carbônico AMPc Adenosina-mono-fosfato-cíclica FDA Food and Drug Administration VIP Peptídeo vasoativo intestinal GP2 Glycosylphosphadyl inositol-anchored protein x LISTA DE TABELAS Tabela1: Estimuladores e inibidores da secreção pancreática..................pág.26 Tabela2: Principais causas de insuficiência pancreática exócrina em crianças......................................................................................................pág. 36 Tabela3: Suplementação de vitaminas de acordo com o Consenso de Nutrição de pacientes pediátricos com FC................................................................pág.49 Tabela4: Características gerais das crianças e adolescentes que participaram de estudo de dosagem de EF1 com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009.................................................................pág.56 Tabela5: Valores de EF1 encontrados nos pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009........................................pág.57 Tabela 6. A classificação da função pancreática pela dosagem da EF1 nos 2 grupos de pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009......................................................................................................pág.58 Tabela 7. A distribuição da concentração da EF1 nos 2 grupos de pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009..........pág.58 Tabela 8. A associação da concentração da EF1 com o uso de enzimas em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009............................................................................................................pág.59 Tabela 9. A associação da classificação da função pancreática pela dosagem da EF1 com a sintomatologia de ma absorção em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009........................................pág.60 Tabela10. Distribuição da gordura fecal em associação com a sintomatologia em pacientes com diagnostico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009............................................................................................................pág.61 xi Tabela 11. A associação da classificação da função pancreática pela dosagem da EF1 com o valor da gordura fecal em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009......................................................pág.62 Tabela 12. Distribuição da gordura fecal em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009........................................pág.62 Tabela 13: Teste de sensibilidade..............................................................pág.63 xii LISTA DE FIGURAS Figura1: Cascata de ativação das enzimas pancreáticas..........................pág.28 Figura2: Algoritmo para avaliação da função exócrina do pâncreas.........pág.43 Figura3: Curva Padrão de dosagem de EF1.............................................pág.53 xiii SUMÁRIO INTRODUÇÃO............................................................................................pág.15 CAPÍTULO I – REFERENCIAL TEÓRICO.................................................pág.21 1.1 Fibrose Cística...................................................................pág.21 1.2 Embriogênese....................................................................pág.23 1.3 Anatomia do pâncreas.......................................................pág 24 1.4 Função Digestiva...............................................................pág.26 1.5 Pâncreas e Fibrose Cística................................................pág.29 1.6 Causas de Insuficiência Pancreática.................................pág.34 1.7 Métodos Diagnósticos da Insuficiência Pancreática........pág.36 1.8 Manifestações clínicas da Insuficiência Pancreática.......pág.44 1.9 Tratamento de reposição...................................................pág.46 1.9.1 Enzimas.................................................................pág.46 1.9.2 Suplementação de vitaminas lipossolúveis..........pág.49 CAPÍTULO II – OBJETIVOS......................................................................pág.50 2.1 Objetivo Geral....................................................................pág.50 2.2 Objetivos Específicos.........................................................pág.50 CAPÍTULO III – METODOLOGIA..............................................................pág.51 3.1Tipo de estudo....................................................................pág.51 3.2 População de estudo.........................................................pág.51 3.3 Critérios de seleção...........................................................pág.51 3.4 Coleta de dados.................................................................pág.51 3.5 Dosagem de gordura fecal.................................................pág.52 3.6 Dosagem da Elastase1 Fecal............................................pág.52 3.7 Análise Estatística..............................................................pág.54 xiv CAPÍTULO IV- RESULTADOS..................................................................pág.55 CAPÍTULO V- DISCUSSÃO.......................................................................pág.64 CAPÍTULO VI- CONCLUSÕES..................................................................pág.71 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................pág.72 APÊNDICES...............................................................................................pág.79 Apêndice1: Planilha de coleta de dados..................................pág.79 Apêndice2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido......pág.80 Apêndice3: Procedimento Operacional Padrão.......................pág.82 ANEXOS.....................................................................................................pág.90 Anexo1:Consenso para o diagnóstico de Fibrose Cística......pág.90 Anexo2: Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa............pág.91 15 INTRODUÇÃO As doenças pancreáticas crônicas reduzem inevitavelmente a capacidade funcional do pâncreas exócrino. As mais comumente encontradas, são: a fibrose cística na infância e as pancreatites crônicas no adulto (Goldberg, 2000). A Fibrose cística (FC) é uma doença crônica, progressiva e letal de herança autossômica recessiva, que atinge as glândulas exócrinas de múltiplos órgãos sistêmicos (Adde et al., 2007). Esta doença é decorrente de uma mutação do gene codificador da proteína reguladora Transmembrane da condutância Conductance transmembrana Regulator)-CFTR (Castro (Cystic et al., Fibrosis 2003), descoberto em 1985 e localizado no braço longo do cromossomo 7 7q31region- (Reis et al., 1998). A falta ou função deficiente da proteína CFTR resulta em produção de muco com viscosidade aumentada e bloqueio dos ductos das glândulas exócrinas principalmente a nível pulmonar e pancreático, com eventual disfunção do órgão (Daftary et al., 2006). A FC é considerada a segunda doença genética mais comum na Europa (Botton et al., 2003) Apesar de ser mais comum na raça branca, principalmente na população caucasóide, a miscigenação racial fez com que ela se tornasse presente entre outras populações não caucasóides. Mais de 1500 mutações nesse gene já foram identificadas, o que torna o diagnóstico molecular bastante difícil. Porém, a mutação DF508 apresenta alta freqüência entre os eurodescendentes (66%) (Friedrich, 2007). No Brasil a 16 estimativa de sua incidência é de um para cada 6902 nascidos vivos (Cabello et al., 1999). A fibrose cística é a maior causa de insuficiência pancreática (IP) em crianças, acometendo cerca de 85 a 90% dos pacientes (Gaskin et al., 1982). A alteração pancreática pode progredir com a idade e muitos pacientes inicialmente suficientes podem desenvolver insuficiência pancreática (Taylor et al., 2002). O início dos sintomas, o grau de envolvimento e a taxa de progressão da doença em órgãos afetados podem variar consideravelmente de paciente para paciente. A sintomatologia clínica é influenciada por vários fatores: genéticos e ambientais e estratégias de manejo. Em uma tentativa de fazer previsões de gravidade da doença com base nas mutações do gene, tem sido possível analisar os genótipos dos pacientes e seus fenótipos correspondentes. A importância dos fatores genéticos sobre o grau de doença pancreática e sua taxa de progressão já é reconhecida (Durie , 2000). A maioria dos pacientes DF508 homozigotos apresenta IP, enquanto os heterozigotos com mutação parcial podem apresentar função pancreática residual e são classificados como suficientes pancreáticos (SP) (Castro et al., 2003). O pâncreas exócrino é responsável pela produção de enzimas para digestão dos alimentos na luz intestinal e do fluido rico em bicarbonato que manterá um ambiente alcalino, possibilitando a atividade enzimática máxima para a hidrólise dos substratos (Taylor et al., 2002). A redução da concentração luminal das lípases e proteases resulta na digestão inadequada de gorduras e proteínas, com conseqüente má absorção 17 e importante perda fecal destes nutrientes, causando diarréia crônica e distensão abdominal. Assim, os principais sinais clínicos da insuficiência pancreática são a esteatorréia e a desnutrição. Porém a esteatorréia ocorre somente após perda de grande parte (cerca de 95%) da função pancreática (Gaskin et al., 1988). Em crianças a IP, tem um impacto significativo no crescimento e nutrição (Bronstein et al., 1992) Além disso a correlação negativa entre o grau de desnutrição com a função pulmonar, o estado clínico e a sobrevida são reconhecidos de longa data (Kraemer et al., 1978). Desta forma é importante determinar rápida e precisamente a função pancreática de pacientes com FC para tratar a má digestão e otimizar o estado nutricional e por outro lado, evitar que pacientes utilizem enzimas pancreáticas sem apresentar IP conforme relatos de estudos citados por Borowitz e colaboradores (2004) A desnutrição é considerada um dos principais fatores de mau prognóstico (Dodge, 1992). Sendo assim a prevenção da desnutrição está associada a um melhor prognóstico e é considerada um dos principais objetivos no tratamento da FC (Gaskin, 1988). O teste do suor é essencial para o diagnóstico da FC (Durie, 2000). Porém existem pacientes com FC chamada não-clássica ou atípica, que têm um fenótipo de FC em pelo menos um órgão e uma concentração normal (<30 mmol / l) ou Borderline (30-60 mmol / l) de cloro no suor (De Boeck et al., 2005). Nesses casos, pacientes com diarréia crônica, esteatorréia, dor abdominal, failure to thrive (falência de desenvolvimento) e perda de peso devem realizar testes de avaliação da função pancreática exócrina. Esta pode 18 ser avaliada por métodos diretos ou indiretos. Na prática clínica pediátrica, os testes indiretos são usados rotineiramente (Walkowiak et al., 2005). O teste secretina-colecistoquinina é um teste de estimulação direta do pâncreas, apesar de ser considerado padrão ouro para estimar a função pancreática é invasivo, desconfortável, caro e consome tempo, além disso não possui padronização para crianças (Walkowiak et al., 2005). O balanço da gordura fecal de 72hs (conhecido como método de Van de Kamer), é um teste indireto da função pancreática, considerado padrão ouro para avaliação de esteatorréia. Porém apresenta várias desvantagens desde a dificuldade para obtenção do material, o armazenamento e a necessidade de ingestão adequada de gordura, durante os dois dias que antecedem o exame e os três dias de coleta das fezes (Bahu et al., 2003). Assim uma coleta inadequada das fezes e/ou um erro na ingestão preconizada de gordura pode resultar em um resultado equivocado. Outra desvantagem deste teste é não discriminar a causa da esteatorréia (Leus et al., 2000). O desenvolvimento de novos testes indiretos tem melhorado abordagem diagnóstica. Recentemente a Food and Drugs Administration(FDA) aprovou o uso do ensaio imunoenzimatico monoclonal humano ( ELISA-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) para a dosagem da elastase pancreática 1 nas fezes (Walkowiak, 2000). Este exame é referido como um excelente método para diagnóstico de insuficiência pancreática, com especificidade variando de 93 a 100% e sensibilidade de 98 a 100% (Borowitz et al., 2004). A elastase pancreática 1 é uma enzima específica do pâncreas, não degradada na luz intestinal, com excelente estabilidade na passagem pela luz intestinal e não influenciada pelo tratamento de reposição enzimática (Dominici 19 et al., 2002). Este teste possui vantagens de ser não invasivo, quantitativo, reproduzível, fácil de realizar com pequena quantidade de fezes e é útil para crianças e adultos. Além disso, serve tanto para o diagnóstico como para o acompanhamento da função pancreática (Littlewood et al., 2006). Entretanto uma pesquisa com dados do PubMed, Medline, Cochrane, de 1997-2009, utilizando como palavras chaves: insuficiência pancreática exócrina, elastase1 fecal; elastase1 pancreática; fibrose cística, revelou 44 artigos, sobre o tema, nenhum de âmbito nacional, Apenas um projeto em desenvolvimento no Rio Grande do Sul versa sobre o assunto. Justifica-se avaliar a função pancreática exócrina em todo paciente sem ou com diagnóstico firmado de FC, pois esta é importante para o prognóstico, abordagem terapêutica e clínica. Por isso, a dosagem elastase pancreática1 fecal pode ser um instrumento padrão de atendimento a pacientes com FC (Borowitz et al., 2004). Diante do exposto este estudo se propôs a determinar a concentração da Elastase pancreática 1 nas fezes de crianças e adolescentes com FC, para avaliar as propriedades de teste (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo) no diagnostico correto da insuficiência pancreática ao comparar com a dosagem de gordura fecal. Além de servir como alternativa para esclarecer o diagnóstico de casos duvidosos de FC. Uma vez que 85 a 90% dos pacientes com FC tem IP e esta doença é a principal causa de IP na infância. O presente estudo encontra-se vinculado ao projeto de pesquisa Desenvolvimento e Avaliação de Tecnologias de Diagnóstico Clínico e Molecular da Fibrose Cística – (2007 a 2009), Projeto Pensa Rio, pela 20 plataforma FAPERJ (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), e receberá apoio financeiro do DECIT/ FINEP/ Ministério da Saúde. As informações sobre o Kit indicado para o exame foram obtidas por meio do contato com o Doutor Antônio Fernando Ribeiro, que realiza o teste na Unicamp. 21 CAPÍTULO I - REFERENCIAL TEÓRICO 1.1: Fibrose Cística: A primeira descrição anatomo-patológica da FC foi feita no ano de 1905 em um recém-nascido com quadro de íleo meconial, falecido no quinto dia de vida (Landsteiner apud Reis,1998). Em 1936, Fanconi descreveu alterações pancreáticas em uma criança com sintomas pulmonares e intestinais, em cuja necropsia foram encontradas bronquiectasias e fibrose cística do pâncreas. Nos dois anos seguintes (1938), Dorothy Andersen publicou um estudo clínico e patológico no American Journal of Disease of Children reconhecendo a FC pela primeira vez como uma situação diferente, única, quando estudos de autópsia crianças desnutridas demonstravam uma doença de entupimento dos ductos glandulares por muco, e fibrose cística do pâncreas, diferente da doença celíaca (Apud Gaskin 2004). Em 1946, Farber e Glanzmann criaram o termo Mucoviscidose ao descreverem que outras secreções do organismo também estavam afetadas. No ano de 1953, Di Sant`Agnese descobriu que esses pacientes tinham um alto conteúdo de eletrólitos no suor ao detectar uma desidratação importante durante um verão muito quente (Apud Gaskin 2004). Esta doença foi caracterizada por má absorção de gordura e proteína, esteatorréia, crescimento deficiente e infecção pulmonar. A lesão pancreática e a conseqüente falta de secreção das enzimas pancreáticas representariam a causa da falha nutricional, que foi assumida como o fator que conduzia a vulnerabilidade à infecção pulmonar, muitas vezes o evento terminal (Davis, 2006). 22 No Brasil, a primeira publicação sobre FC foi feita em 1949 por Gesteira, que revisou os conhecimentos e ressaltou a importância da sua existência em nosso meio (Apud Reis et al., 1998). Nas décadas que se seguiram, foram feitas várias publicações, porém só nos anos 80, novos e importantes conhecimentos contribuíram para a compreensão da FC. Dentre eles a descoberta do gene responsável, no braço longo do cromossoma 7, em 1985. A FC é causada por mutações no gene que codifica uma proteína reguladora de condutância transmembrana (Cysic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator /CFTR) que é um complexo macromolecular formado de várias proteínas. A CFTR funciona como um canal de cloro, regulado pelo AMPc (Atlas et al., 2006). O diagnóstico pode ser feito em várias oportunidades: • antenatal, quando já houver casos na família (por biópsia de vilosidade coriônica, seguida de análise genética); • no primeiro ano de vida, por manifestações precoces, como íleo meconial; • pela realização da triagem neonatal ou, • finalmente, quando há manifestações clínicas da doença (Santos et al., 2005). Indivíduos com suspeita de FC são identificados de algumas maneiras, incluindo triagem antenatal e neonatal, a partir daí, o diagnóstico pode ser feito por diferentes abordagens, dependendo da idade, genótipo e fenótipo. Esse diagnóstico é feito atualmente de acordo com os critérios propostos no Guidelines for Diagnosis of Cystic Fibrosis in Newborns throught Older Adults: 23 consenso de 2008 da Cystic Fibrosis Foundation modificado de Rosenstein e Cutting publicado em 1998, usando critérios clínicos (anexo:1) e laboratoriais Teste do Suor, análise genética, função pancreática exócrina, diferença de potencial nasal) ( Farrel et al., 2008). A doença pulmonar é a maior causa da morbidade e mortalidade da FC. O acometimento das vias respiratórias é progressivo e com intensidade variável, ocorre em cerca de 95% dos pacientes e a sua intensidade determina o prognóstico final. No curso da doença crônica são comuns os períodos de exacerbações, com sinusites, bronquites, pneumonias e bronquiectasias ( Davis, 2006). O defeito genético da fibrose cística compromete o trato gastrointestinal de várias formas. A insuficiência pancreática acomete cerca de 85-90% dos pacientes, resultando na digestão e absorção inadequadas de macro e micronutrientes, comprometendo o estado nutricional e desencadeando sintomas como dor abdominal, diarréia, distensão abdominal, desnutrição, entre outros (Leus et al.,2000). A doença pulmonar e gastrointestinal são as apresentações clínicas mais freqüentes da FC, porém outras alterações clínicas significativas são descritas como o diabetes e infertilidade no sexo masculino (Ratjen et al., 2003). 1.2: Embriogênese Pancreática : O pâncreas desenvolve-se a partir dos brotamentos pancreáticos dorsal e ventral de células endodérmicas que se originam da parte caudal do intestino 24 anterior que, por sua vez, está se desenvolvendo na parte proximal do duodeno. O parênquima pancreático é derivado do endoderma, que forma uma rede de túbulos. No período fetal, os ácinos começam a se desenvolver a partir de agregados celulares em torno da parte final destes túbulos ou ductos primitivos. A partir da 9ª semana de gestação, grupos de células endócrinas podem ser identificadas e pela 12ª semana de gestação, células exócrinas contendo grânulos secretórios estão evidentes (Moore et al., 1984). 1.3: Anatomia do Pâncreas: O pâncreas é uma glândula com estrutura lobulada de aproximadamente 2 cm de espessura e 5 cm da borda superior para a inferior (Taylor et al., 2002) e está localizado no retroperitôneo. O pâncreas maduro, do ponto de vista morfológico e funcional, apresenta duas distintas populações de células necessárias para manter o equilíbrio nutricional: as células endócrinas responsáveis pela produção de hormônios e as células exócrinas que produzem as enzimas digestivas (Lowe et al., 2004). Cerca de 2% do pâncreas é tecido endócrino, constando de 4 principais tipos de células, são elas: produtoras de insulina (células βeta), glucagon (células alfa), somatostatina (células delta) e polipeptídeo pancreático (células PP) organizadas em ilhotas dispersas por todo o pâncreas exócrino (Dominici et al., 2002). A unidade funcional do pâncreas exócrino é o ácino e o correspondente ducto de drenagem. Os ácinos estão rodeados por tecido conjuntivo suportando uma rede de capilares e terminações nervosas (Godinho, 2000). 25 O pâncreas exócrino constitui o maior volume da glândula e é responsável pela produção e secreção de enzimas digestivas e de fluido rico em bicarbonato. Essas enzimas são suficientes para digestão de nutrientes alimentares incluindo carboidratos complexos, proteínas e gorduras. Alem disso assegura um pH ideal (ótimo) para a atividade das enzimas (Lowe et al., 2004). No polo apical quer das células acinares quer das ductulares as células encontram-se intimamente aderentes pelas chamadas tight junctions, constituindo uma barreira à difusão de moléculas de grande calibre. O contato célula-célula é determinado pelas adherens-junctions nas paredes basolaterais e a comunicação intercelular pelas gap-junctions. No polo baso-lateral das células acinares encontram-se os receptores neuro-humorais da secreção que se dividem em dois grupos diferentes em função do modo de estimulação. A secretina e o peptídeo vasoativo intestinal (VIP) atuam através da mediação do AMPc intracelular; a colecistoquinina (CCK), acetilcolina, bombesina e a substância P atuam através dos fosfoinositois e do cálcio livre intracelular (Godinho, 2000). A secreção ductal é controlada pelo hormônio secretina; entretanto a eventual concentração de HCO3 no fluido depende tanto da concentração como da troca de Cloro/HCO3 ao longo da arvore ductal (Taylor et al., 2002). Por outro lado a secreção enzimática é regulada pela colecistoquininapancreozimina, que é um potente estimulador com pouca ação sobre as células ductais, porém potencializa o efeito da secretina (Taylor et al., 2002). Os precursores das enzimas são armazenados dentro de grânulos, os zimogênios localizados nas porções apicais das células acinares para serem 26 descarregados a partir dessas células por exocitose, após esse estímulo hormonal (Chang, 1996). A regulação da secreção pancreática é mediada por uma complexa interação de vários estimuladores e inibidores gastrointestinais, via hormonal e neuronal (Tabela 1) (Turkish et al., 2006). Tabela 1: Estimuladores e inibidores da secreção pancreática: ESTIMULADORES INIBIDORES Colecistoquinina Somatostatina Secretina Polipeptideo pancreático Peptídeo intestinal Vasoativo Peptídeo YY Peptídeo liberador de gastrina Neuropeptideo Y Insulina Calcitonina Gastrina Glucagon Óxido Nítrico Serotonina Serotonin Encefalina Substância P Leptina Fosfolipase pancreática A2 1.4 :Função Digestiva: A principal função do pâncreas é produzir enzimas digestivas que são liberadas no intestino delgado para a hidrólise dos nutrientes complexos. Muito do nosso entendimento de enzimas digestivas vem de estudos em animais (Lowe, 2005 & Whitcomb, 2007). 27 Essas enzimas são proteolíticas, lipolíticas e amilolíticas responsáveis, respectivamente pelo desdobramento em moléculas menores das proteínas, gorduras e hidratos de carbono contidos na alimentação, para que possam ser absorvidas pelo epitélio intestinal (Moot e Guarita, 2003). A síntese das enzimas ocorre nos ribossomas do retículo endoplásmico e são transportadas nas chamadas vesículas de transporte para o Aparelho de Golgi onde são separadas em diferentes grupos, segundo a sua função: as enzimas digestivas são armazenadas em grânulos de zimogênios e as hidrolases lisosómicas em lisosomas (Godinho , 2000). Os grânulos de zimogênios com essas enzimas inativas se concentram na porção apical das células acinares e são liberados no ducto pancreático num fluido alcalino (rico em bicarbonato), ocorrendo a ativação das enzimas na luz intestinal. A concentração de bicarbonato depende da troca entre o HCO3- e Cl- determinada pela proteína CFTR (Lowe, 2004). As proteínas normalmente perfazem cerca de 10% da ingestão calórica em dietas ocidentais. São de grande importância para um bom crescimento, desenvolvimento e funções corporais. A variedade e a complexidade das proteínas dietéticas e o sua função crítica reflete-se na quantidade de proteases na secreção pancreática (Whitcomb et al., 2007). Cerca de 80% das enzimas secretadas pelo pâncreas são proteases, que digerem proteínas em oligopeptídeos, peptídeos e aminoácidos, sendo os principais grupos: tripsinas, quimiotripsinas, elastases, carboxipeptidases A e B (Whitcomb et al.,2007). A elastase é a terceira maior categoria de serina endopeptidase em suco pancreático. A proelastase pancreática é estruturalmente semelhante ao 28 tripsinogênio e outras proteases. Ela digere peptídeos em alanina, glicina, e serina. A designação de uma enzima como uma elastase depende da sua capacidade de digerir elastina, uma proteína extracelular altamente insolúvel que dá a muitos tecidos propriedades elásticas. (Whitcomb et al., 2007). A atividade destas enzimas surge quando, uma enzima produzida pelas células do duodeno, a enteropeptidase, desencadeia uma cascata de reações para a conversão do tripsinogênio em tripsina, que por sua vez ativa uma série de outras proenzimas como mostra a Figura 1(Lowe, 2004). Fig1: Cascata de ativação das enzimas pancreáticas, adaptação e livre tradução de Lowe (2004). Vários mecanismos protetores defendem o pâncreas da ação das enzimas proteolíticas que produz: • as enzimas são armazenadas e secretadas na forma inativa; 29 • isoladas em compartimentos impermeáveis a proteínas e separados das restantes estruturas celulares; • um pH inadequado à maior parte das enzimas; • são permanentemente acompanhadas por uma protease que degrada a tripsina ativada e a própria tripsina pode destruir outras moléculas de tripsina (Godinho,2000). Os lipídios são digeridos pelas lípases, fosfolipases, carboxilesterlipase e colipase (Chang 1996 e Whitcomb 2007). Os carboidratos, na forma de amido, são hidrolisados pelas amilases em dextrinas (oligossacarídeos, maltose e maltotriose) e, após, submetidos a ação das enzimas da borda em escova dos enterócitos, serão absorvidos na forma de glicose (Chang 1996 e Whitcomb 2007). 1.5: Pâncreas e Fibrose Cística: A FC é de longe a causa mais comum de IP exócrina na infância. No pâncreas a proteína CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) é encontrada na porção apical na membrana da célula centroacinar e no epitélio ductal intralobular, o qual é responsável pela secreção do fluido com alta concentração de bicarbonato de sódio. Normalmente o cloro excretado na luz é trocado por bicarbonato seguido de água e sódio (Atlas et al., 2006). Qualquer processo que leve a obstrução crônica de pequenos ductos pode causar disfunção exócrina (Stormon et al., 2002). Existem três possíveis mecanismos pelos quais a FC pode levar à disfunção pancreática. São eles: • obstrução dos ductos pancreáticos por tampões, 30 • inibição da endocitose nas células acinares, • desequilíbrio na membrana (lipídeos) das células. Qualquer uma destas anormalidades isoladamente ou em combinação poderia explicar o desenvolvimento de insuficiência pancreática exócrina (Freedman et al., 2000). Na FC a troca limitada ou ausente de cloro e bicarbonato torna as secreções com baixa concentração de bicarbonato. Isto resulta em prejuízo na secreção intraluminal com baixo pH e pouco volume comparada com o normal. Essas secreções espessas bloqueiam os ductos, causando dilatação com obstrução ao fluxo do suco digestivo das enzimas. Isto, por sua vez, causa degeneração das células acinares e posterior fibrose pancreática, prejudicando a digestão das gorduras, proteínas e amido. A lesão no pâncreas pode progredir com a idade e muitos pacientes inicialmente SP se tornam IP (Taylor et al., 2002). A formação de tampões intraductal parece ser um processo multifatorial. Este processo pode envolver alterações quantitativas ou qualitativas em proteínas ou de mucinas. O meio que contém essas moléculas, as alterações no pH e da concentração de íons, podem influenciar a solubilidade, levando a precipitação dentro o sistema de dutos. O muco também pode desempenhar um papel na gênese desses tampões, porque a hipersecreção intraductal de muco é uma característica proeminente da CF. Acredita-se que a MUCLIN (glicoproteína sulfatada) e a MUC - 6 possam estar envolvidas na patogênese de mudanças dentro do pâncreas da CF (Freedman et al., 2000). Supunha-se que o principal papel da secreção de bicarbonato ductal era neutralizar o ácido no duodeno. As evidências indicam, no entanto, que o 31 bicarbonato desempenha um papel fundamental dentro do lúmen ductal para regular dois processos: 1- solubilização de proteínas secretadas para o ducto pancreático; 2- reciclagem na membrana plasmática apical da célula acinar; Proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático das células acinares são transportados para o complexo de Golgi, onde ocorre a separação de acordo com o seu grupo. Este processo requer acidificação, resultando em agregação e condensação de proteínas destinadas aos grânulos de zimogênios. Na exocitose, o conteúdo do zimogênio no lúmen acinar exige resolubilização, que presumivelmente é mediada pela alcalinização do meio regulada pela CFTR. O fato deste processo, ser completamente reversível em pH 7,5, indica que a acidificação não desnatura a proteína, mas sim próenzimas pancreáticas agregadas em um pH específico, de forma dependente. Resultados semelhantes foram obtidos por Freedman em 1993, para a agregação da GP2 (glycosylphosphatidyl inositol-anchored protein) que está presente em abundância na membrana do grânulo zimogênio. Valores de pH inferiores a 7,0 resultaram na formação de complexos GP2. Conclui-se que a alcalinização do ducto pancreático pela secreção de bicarbonato, pode ser o mecanismo pelo qual, as proteínas secretoras são dissolvidas. Esse mecanismo poderia explicar a localização do gene CFTR. Estudos relatados por Freedman(1998) em ácinos de ratos, em meio tamponado a pH 6,0, simulando as condições encontradas na FC, levou a precipitação de proteína no lúmen acinar. O aumento do pH do meio para 8,0, resulta em dissolução destes precipitados. Esses resultados sugerem que a alcalinização do lúmen acinar é necessária para a resolubilização das proteínas 32 secretadas. O bloqueio da secreção de bicarbonato ductal que ocorre na FC seria esperado resultar em ductos cheios de proteínas precipitadas. Após exocitose, a membrana do grânulo de zimogênio é inserida na membrana plasmática apical, postula-se que esta permaneça como um pequeno canal lipídico. Esta membrana é então seletivamente recuperada para a célula através de um processo conhecido como endocitose para reutilização na via secretora regulada (Freedman et al., 2000). Para elucidar esses mecanismos envolvidos, um modelo utilizando ácinos de rato foi desenvolvido. Na primeira etapa, os ácinos são estimulados com colecistocinina para maximizar exocitose. Esta situação provoca a dilatação do lúmen acinar como resultado dessa intensa exocitose e com isso ocorre inserção da membrana do grânulo zimogênio a uma taxa superior a recuperação da membrana dentro da célula, resultando em um aumento global da área de superfície da membrana. Na segunda etapa, o hormônio é removido, os ácinos, são então incubados e avaliados em diferentes valores de pH. Em condições de pH alcalino (pH 8,3), a endocitose foi ativada, resultando em contração do lúmen acinar. Sob condições de pH ácido (pH 6,0), semelhante ao pH do pâncreas na FC, resultou em persistente dilatação do lúmen acinar, e a segmentação mínima de GP2 (glycosylphosphatidyl inositolanchored protein) da superfície da célula apical. Esta situação sugere que a dilatação do lúmen acinar, semelhante a observada em patientes com FC e em camundongos CFTR-1, não necessariamente é devido exclusivamente à obstrução por tampões mas pode resultar de um bloqueio na endocitose na membrana plasmática apical (Freedman et al., 2000). 33 A deficiência de ácidos graxos essenciais é bem descrita em pacientes com FC, mesmo na ausência de deficiências nutricionais. Ácido docosahexaenóico é reconhecidamente importante na regulação da fluidez e do trânsito da membrana celular, bem como para a regulação na incorporação do ácido araquidônico. Mutações na CFTR podem produzir bloqueio na biossíntese de ácido docosahexaenóico, que leva a um aumento secundário de n-6 (ácido araquidônico) e N-9 (ácido eicosatrienóico). A diminuição do ácido docosahexaenóico em conjunto com a elevação do ácido araquidônico, podem potencialmente explicar a hipersecreção de mucina, alterações na endocitose e a inflamação observados na FC. Os estudos estão em andamento para determinar o mecanismo pelo que as mutações no CFTR levam a essa anormalidade lipídica da membrana. Anormalidades na concentração de ácido araquidônico e do ácido docosahexaenóico podem explicar as alterações no função da membrana celular, tais como o trânsito, endocitose, a regulação de bombas ou canais e modulação da inflamação. Ainda estão em curso estudos para determinar a relação entre estes processos e a disfunção pancreática (Freedman et al., 2000) A lesão no pâncreas que se inicia intra-útero, foi confirmada em estudo anátomo-patológico pelo acúmulo de material protéico dentro de pequenos ductos pancreáticos (Stormon et al., 2002). Cerca de 40% dos pacientes nascem com a função pancreática preservada, entretanto, mais da metade destes pacientes desenvolvem lesão pancreática importante nos primeiros meses de vida e cerca de 85 a 90% apresentarão IP no final do primeiro ano de vida (Littlewood et al., 2006). 34 Inicialmente, a porção endócrina da glândula é relativamente preservada, mas com o avanço da idade, a perda de ilhotas pancreáticas vai ocorrer em pacientes com IP. Sintomas clínicos de diabetes mellitus ou evidência bioquímica de intolerância à glicose podem estar presentes em um terço dos adolescentes ou adultos com FC (Durie, 2000). 1.6 Causas de Insuficiência Pancreática: O pâncreas exócrino é funcionalmente imaturo ao nascimento. A função da protease provavelmente é adequada, porém nos primeiros três a seis meses de vida pós-natal, lactentes saudáveis podem ter uma esteatorréia fisiológica devido à deficiência de secreção de acido biliar e lípase que corresponde a 510% dos valores nos adultos (Stormon et al., 2002). A isoamilase pancreática se encontra em valores desprezíveis ao nascimento e somente atinge seus valores normais em torno de dois a três anos de idade (Stormon et al., 2002). Nos primeiros meses de vida pode ser observada uma má absorção fisiológica de gordura (Leus et al., 2000). Em neonatos a média do coeficiente de absorção de gordura (CAG) é de aproximadamente 85% que aumenta com a idade. O percentual do CAG mede a eficácia da absorção de gordura por meio da equação: Gordura ingerida(g) – gordura perdida nas fezes(g) x100 Gordura ingerida De acordo com o CAG, o paciente é considerado como suficiente pancreático se, com até seis meses de vida apresentar perda menor de 15%, 35 de seis a 12 meses com perda menor de 10% e naqueles maiores de 1 ano a perda for até 7% de gordura ingerida (Bronstein et al., 1992). O pâncreas exócrino tem uma grande capacidade de reserva funcional. Este achado foi primeiramente demonstrado em adultos nos estudos clássicos de DiMagno et al (1973), que mostraram que a má digestão pancreática não ocorreu até que a secreção de enzimas pancreáticas diminui-se para menos de 10% dos valores controle. Usando ensaios de enzima mais sensíveis, foi demonstrado que aproximadamente 98% a 99% da capacidade de secreção da enzima deve ser perdida antes da clínica de má absorção se tornar evidente (Durie, 2000). O termo IP é usado para definir os pacientes que tenham perda da função exócrina, a ponto de ser incapaz de digerir e assimilar nutrientes normalmente. Por conclusão, os sintomas da IP vão se desenvolver, quando mais de 98% da reserva pancreática estiver perdida. O termo SP, descreve pacientes com evidência de disfunção pancreática, mas em quem a reserva pancreática continua acima do limiar para o desenvolvimento de má-digestão (Durie, 2000). A disfunção pancreática exócrina ocorre em um número de doenças que incluem: anomalias congênitas, alterações herdadas e pancreatites, agudas ou crônicas. As principais causas de insuficiência pancreática exócrina em crianças estão listadas na tabela 2 (Walkowiak et al., 2005): 36 Tabela2: Principais causas de insuficiência pancreática exócrina em crianças Anormalidades anatômicas Agenesia do pâncreas Hipoplasia do pâncreas Doenças com herança genética Fibrose cística Síndrome de Swachman-Diamond Síndrome de Johanson-Blizzard Síndrome de Pearson Pancreatites hereditárias Deficiências enzimáticas isoladas ( lipase e colipase) Pancreatites Idiopática Traumática Viral Induzida por drogas Nutricional Auto-imune Insuficiência Secundária a outras Ressecção Pancreática Doença celíaca e outras causas de atrofia vilositária Desnutrição Colangite Esclerosante primária Síndrome de Allagile Diabetes Deficiência de Enteroquinase doenças Doenças Neoplasícas 1.7: Métodos diagnósticos da Insuficiência Pancreática: Os critérios adotados para um teste ser considerado ideal na avaliação da função pancreática são: ser de baixo custo, fácil realização, não invasivo, específicos para doença pancreática e capaz de excluir pacientes com outras 37 alterações digestivas devido à doença da mucosa do intestino delgado e defeitos do transporte de gorduras ou colestase. Além disso, deve definir o exato grau da função pancreática em indivíduos com SP e nos quais a perda da função exócrina é presente, mas a absorção do nutriente não é afetada. O teste também deve ser, reproduzível entre os laboratórios, capaz de monitorizar a função exócrina longitudinalmente e não sofrer interferência da suplementação com as enzimas pancreáticas. (Huynh et al., 2000). Os testes utilizados para avaliação da função pancreática podem ser divididos nas seguintes categorias (Lankisch, 1982): 1. Testes diretos São aqueles em que a secreção de HCO3 e enzimas pancreáticas são medidas no suco pancreático ou duodenal após estimulação hormonal do pâncreas. Um exemplo deste tipo é o teste da secretina-colecistoquinina, considerado padrão ouro para confirmação da IP, porque tem alta sensibilidade e especificidade. Porém raramente é utilizado na prática clínica, principalmente na pediátrica por ser de execução mais laboriosa e exigir a passagem de uma sonda naso-enteral no paciente e administração de medicação endovenosa, além de não estar bem padronizado em crianças (Walkowiak et al., 2005). 2. Testes indiretos: São simples, não invasivos, mais rápidos e menos dispendiosos do que testes diretos, daí a grande vantagem da sua utilização na clínica pediátrica. Dentre eles podemos citar: 38 • Dosagem de enzimas pancreáticas no sangue (amilase, lipase, elastase-1 , isoamilase , tripsinogênio ) ou nas fezes ( quimiotripsina, elastase1, lipase ). • Avaliação da absorção de marcadores que se conjugam após sua hidrolise por ação de enzimas pancreáticas e posteriormente são detectados na urina ou no soro (teste do Pancreolauril e teste de Bentiromida (BT-PABA)). • Análise nas fezes de componentes alimentares não digeridos e não absorvidos (excreção fecal de gordura de 72hs, expresso como coeficiente de absorção de gordura) ou análise de produtos de oxidação das gorduras por testes respiratórios. A coleta de fezes durante 72 h para dosagem de gordura (titulação de Van de Kamer), continua a ser o padrão-ouro para a quantificação de esteatorréia. No entanto, ela possui muitos inconvenientes, incluindo a sua inespecificidade para doenças pancreáticas (Borowitz et al., 2004). Por isso pode ser positiva em outras doenças como: supercrescimento bacteriano, doenças hepatobiliares, síndrome do intestino curto e, doenças da mucosa do intestino delgado, como a doença celíaca e doença de Crohn (Lieb et al., 2008). Mesmo sendo o teste mais comumente utilizado, a dosagem de gordura fecal, é imprecisa principalmente quando realizada à nível ambulatorial, devido a diversas razões: • o período de coleta das fezes é de três dias, podendo em alguns casos chegar a cinco dias, • há necessidade de uma dieta especial durante a coleta do material. Uma dieta supervisionada prescrita com no mínimo 3g/Kg/dia (50g 39 geralmente para criança) de gordura, atingindo um máximo de 100g ingerida por dia para cada paciente adulto (Weintraub et al., 2009). Essas recomendações diminuem a aderência ao teste pela dificuldade que, as crianças e os familiares têm em juntar todas as fezes e de informar sobre a quantidade de gordura ingerida. Além de ser de difícil coleta em crianças pequenas que fazem uso de fraldas (Leus et al., 2000). Essas dificuldades com certeza vão interferir no resultado do exame (Huynh et al., 2000). Cabe ressaltar que naqueles pacientes que ingerem grande quantidade de triglicerídeos de cadeia media o método utilizado para avaliar a gordura fecal deve ser o de Jeejeebhoy (Apud Beharry et al 2002). Esses testes podem ser usados com dois propósitos: 1- detecção da insuficiência pancreática exócrina, avaliação da lesão do órgão; 2- follow-up da digestão das gorduras durante a terapia de reposição enzimática em pacientes com FC. A freqüência da IP varia e pode declinar com a idade. Portanto é necessário realizar testes regularmente para adaptar a quantidade de enzimas sistematicamente (Walkowiak et al., 2005). Outros métodos mais simples, apesar de pouco precisos, podem ser utilizados para triagem ou acompanhamento clínico, como a pesquisa da gordura fecal pelo Sudam III e o esteatócrito. O Sudam III tem a vantagem de ser muito simples de ser realizado, a técnica consiste em visualizar gotículas de gordura no microscópio óptico, porém não tem uma positividade estatística significativa para o diagnóstico de 40 esteatorréia (Bahú et al., 2003). Além disso, geralmente detecta somente a esteatorréia de 25g/dia ou mais (Lieb et al., 2008). Um resultado maior que seis gotículas de gordura por campo de alta potência é indicativo de esteatorréia. O esteatócrito utiliza apenas uma amostra de fezes é realizado num tubo de hematócrito e, segue o seguinte princípio, as fezes são homogeneizadas e centrifugadas a 15.000 rpm por 15 minutos , a porção lipídica se separa, observando-se a formação de três camadas: uma fase sólida inferior (S), uma fase líquida intermediária (L) e uma fase superior (G) que constitui a gordura presente nas fezes. São medidas as alturas das fases G e S e calculado o esteatócrito pela fórmula G/(G+S) x 100. Sua sensibilidade pode melhorar com a adição do ácido perclórico. Ele pode ser útil no acompanhamento da resposta a suplementação com as enzimas pancreáticas (Couper et al., 2004). A quimotripsina fecal é outro exame que pode ser utilizado para avaliação da função pancreática. A tripsina é a principal protease secretada pelo pâncreas, no entanto, sofre degradação no intestino delgado distal. Portanto, não é um bom marcador fecal para a avaliação da produção de enzimas. Este teste é alterado pela suplementação de enzima pancreática exógena (Lieb et al., 2008). Por outro lado, a interferência de enzimas exógenas cria a possibilidade de verificar a adesão ao tratamento de suplementação enzimática recomendado. Assim, a suplementação de enzimas pancreáticas deve ser parada pelo menos durante três dias antes do teste (Walkowiak et al., 2005). Como em todos os exames de dosagem de protease nas fezes, a diarréia aquosa, aguda ou decorrente a síndrome do intestino curto, podem dar 41 resultados falso-positivos (baixa quimotripsina fecal), diluindo a amostra (Lieb et al., 2008). Outro teste indireto é dosagem da elastase pancreática que foi descrita pela primeira vez em 1950 por Balo e Banga (Daftary et al., 2006). Ela é uma protease humana específica, sintetizada pelas células acinares do pâncreas junto com outras enzimas digestivas, e é composta de 240 aminoácidos com peso molecular de 26 KDa. A designação de uma enzima como uma elastase depende da sua capacidade de digerir a elastina, uma proteína extracelular altamente insolúvel dando a muitos tecidos suas propriedades elásticas (Whitcomb et al., 2007). Devido a essa sua especificidade única, está envolvida na patogênese do enfisema, arteriosclerose e envelhecimento (Dominici et al., 2002). A medida da Elastase1 Fecal é considerada de fácil realização e sensível para classificar os pacientes com FC com IP ou com SP (Borowitz et al., 2004). Pode ser usada para rastreamento da função pancreática nos pacientes com FC a partir duas semanas de vida porque desta idade a elastase fecal alcança níveis do adulto (Nissler et al., 2001). A sua concentração é determinada pela reação de anticorpos monoclonais específicos contra a elastase pancreática humana. O princípio da análise é baseado no método ELISA onde a placa é revestida com anticorpo monoclonal o qual apenas reconhece especificamente a Elastase 1 Pancreática Humana (E1). Sua concentração é determinada fotometricamente (Leus et al., 2000) A Elastase 1 pancreática é determinada dentro de uma faixa de valor que vai de 15 a 500 μg E1/g de fezes. Os resultados com concentrações de < 42 100 μg /g, 100-200 μg /g, e de > 200 μg /g são considerados como insuficiência pancreática grave, leve e função pancreática normal, respectivamente. Para a sua execução é necessário apenas uma única amostra de fezes com cerca de 0,1g. Essas amostras se mantém estáveis e podem ser estocadas em laboratório por mais de três dias a 4° – 8°C ou por um ano a -20°C (Leus et al., 2000). A Elastase 1 pancreática é uma enzima proteolítica produzida exclusivamente pelo pâncreas. Quando passa pelo intestino se mantém estável com elevada concentração nas fezes se compararmos com a concentração do suco duodenal (Borowitz, 2006). A sua determinação está relacionada com pancreatite crônica, FC, câncer de pâncreas, Diabetes Mellitus tipo I (insulinodependente), Síndrome de S. Diamond e outras patologias relacionadas à Insuficiência Pancreática (Garcia et al., 2002). Este ensaio imunoenzimático tem duas importantes vantagens: a elastase-1 é altamente estável ao longo do trato digestório resistindo a considerável degradação proteolítica deste meio e a reação imunoenzimática determina especificamente a elastase-1 humana, assim promovendo uma avaliação da função pancreática, sem necessidade da suspensão da reposição enzimática (Katschinski et al., 1997). Uma importante limitação do teste é a incapacidade de distinguir a IP exócrina primária da secundária à lesão da vilosidade intestinal (Walkowiak, 2001). O resultado deve ser avaliado criteriosamente nos casos de fezes diarréicas (intestino curto) na qual é influenciada pela diluição, e na presença 43 de inflamação intestinal ou enteropatia (doença celíaca) (Daftary et al. ,2006). Em adultos baixas concentrações de EF1 podem ser observadas associadas a outras condições como: pós-gastrectomias, cirrose hepática e doença de Crohn (Beharry et al., 2002). Apesar da sensibilidade do teste nos casos de IP severa ser de 100%, pode ser encontrada dificuldade na interpretação dos resultados com concentrações na faixa de IP leve (100 a 200µg/g). Por isso recomenda-se a repetição do teste (Walkowiak et al., 2005). Segundo Walkowiak (2005), deve ser seguido o algoritmo descrito abaixo para avaliação da função exócrina. Suspeita de insuficiência pancreática exócrina (realizar teste de elastase1 fecal) Concentração de EF1 anormal?* Não Sim Reanalisar a suspeita. Urgência no diagnóstico? Não Observar EF1 Anualmente ou quando necessário Sim Referência ao centro especializado IP altamente provável (EF1< 100µg/g) Suplementação Enzimática? Dosagem de gordura fecal *Em casos de valores borderline sugerido repetir dosagem em três amostras diferentes. Figura2:Adaptação e livre tradução de Walkowiak (2005) o 44 1.8 Manifestações Clínicas da Insuficiência Pancreática: O defeito genético da fibrose cística compromete o trato gastrintestinal de várias maneiras. A IP compromete cerca de 85% dos pacientes com FC, 65% ao nascimento e 20% tornam-se rapidamente insuficientes durante os primeiros meses ou anos de vida (Couper et al., 2002). O diagnostico de IP é suspeitado com base na clinica. Os sintomas incluem: íleo meconial neonatal, esteatorréia (Meyts et al., 2002). Sendo a esteatorréia o critério clínico mais freqüentemente utilizado. A má absorção de gordura resulta em distensão abdominal, com saída de fezes pálidas, volumosas, gordurosas de difícil limpeza, ganho ponderal insuficiente ou failure to thrive (falência de desenvolvimento) em crianças pequenas (Taylor et al., 2002). Com base na mutação do gene que codifica a proteína CFTR, o fenótipo da doença varia em gravidade. A mutação mais comum é a supressão de fenilalanina na posição 508 (ΔF508) (Lee et al., 2008). Com a secreção pobre em fluidos e HCO3-, as pró-enzimas retidas nos ductos pancreáticos são prematuramente ativadas, levando a destruição tecidual e fibrose. A má-absorção resultante contribui para o fracasso em satisfazer a elevada demanda energética causada pelo estado hipermetabólico associado às infecções brônquicas (Ratjen e Doring, 2003). A IP exócrina resulta em má digestão de gordura e proteína com aumento das perdas fecais. Desnutrição com hipoalbuminemia, edema e anemia, é uma complicação grave que ocorre com mais freqüência entre 3 e 4 meses de idade (Durie, 2000). 45 A má absorção de vitaminas lipossolúveis também faz parte do quadro clínico da IP exócrina. São quatro as vitaminas lipossolúveis: A, D, E e K, que são absorvidas no trato gastrointestinal juntamente com as gorduras da dieta. O organismo não é capaz de sintetizá-las ou sintetiza em quantidades insuficientes (Roncada, 1998). A vitamina A desempenha papel essencial na visão, desenvolvimento e manutenção do tecido epitelial, processo imunológico e reprodução normal, sendo necessária para o crescimento e desenvolvimento do esqueleto, partes moles e células epiteliais formadoras do esmalte dentário (Mejia e Arroyave, 1991). Autores como Wood et al (2001) e Homnick et al(1993) sugerem que a deficiência de vitamina A é comumente encontrada em pacientes com FC e pode ter causas multifatoriais. Durante a fase de intercorrência infecciosa, a concentração de vitamina A plasmática está reduzida, sendo assim além da má absorção, conta-se com o consumo elevado durante o estresse inflamatório das exacerbações. A deficiência de vitamina D em crianças se manifesta como raquitismo, doença associada com malformação de ossos devido à deficiente mineralização da matriz orgânica. Entre as manifestações gerais da deficiência desta vitamina, ainda, podem-se citar irritabilidade, sudorese, palidez e retardo de crescimento (Hollick, 1989). A sua deficiência é rara na FC. No entanto, a deficiência subclínica pode contribuir para a doença óssea, que é relativamente comum. A vitamina D é responsável pela homeostase do cálcio, aumentando a absorção intestinal de cálcio e estimulando a mineralização óssea. Baixas 46 concentrações aumentam a produção de hormônio da paratireóide, que estimula a reabsorção óssea, que por conseguinte, contribui para a osteoporose (Wolfe et al., 2006). A pouca aderência ao tratamento e a ingestão inadequada podem explicar a diminuição da massa óssea, mesmo naqueles suplementados com vitamina D e cálcio (Botton et al., 2003). A carência de vitamina D também é muito freqüente nas inflamações respiratórias crônicas principalmente quando associada a condições de baixa exposição solar e desnutrição (Borowitz et al., 2002). Uma das principais funções da vitamina E é a proteção que confere às membranas celulares contra a destruição oxidativa. Por isto, desempenha importante função na imunocompetência e reparação de membranas. A sua deficiência leva à anemia hemolítica, degeneração neuromuscular, assim como déficit cognitivo e alteração na retina (Borowitz et al., 2002). A vitamina K é essencial para a síntese de protrombina, que é elemento fundamental na formação do coágulo sanguíneo. Também age como cofator na carboxilação, estando envolvida na formação da osteocalcina que age no metabolismo ósseo (Wolfe et al., 2006). A deficiência subclínica pode influenciar no quadro de osteopenia e osteoporose dos pacientes com FC. 1.9: Tratamento de reposição: 1.9.1 Enzimas: O tratamento com reposição enzimática é a única terapia disponível e deve ser iniciado logo que a IP seja diagnosticada. As enzimas mais utilizadas são cápsulas de microesferas de origem suína. Embora essas microesferas de liberação entérica facilitem a liberação de enzimas no intestino delgado, ainda há problemas com a miscibilidade das microesferas com o alimento e 47 dissolução subótima das esferas no meio relativamente ácido (Couper et al., 2002). Estas enzimas dissolvem-se bem num pH de 5,5 a 6,0. As enzimas são administradas em todas as refeições incluindo fórmulas hidrolisadas, leite materno e nas frutas com alto teor de gordura, como abacate e açaí (Borowitz et al., 2002). Preconiza-se uma dose inicial de 500 a 1.500 UI de lípase/kg/ refeição Se a dose chega a exceder 2500 UI/Kg/por refeição, justifica-se realizar uma investigação de outras condições gastrointestinais que podem estar associadas à FC, tais como intolerância à lactose, parasitose (especialmente giardíase), supercrescimento bacteriano, doença celíaca, doença de Crohn, colestase e doença biliar (Borowitz et al., 1995). No caso de lactentes ou crianças que não consigam ingerir a cápsula inteira, recomenda-se abri-las e oferta-las à criança com leite materno, fórmula infantil ou preferencialmente, suco ou papa de fruta ácida. Sempre oferecê-las na colher e numa única dose, não misturando no total da comida (Borowitz et al., 1995). Os grânulos não devem ser amassados, o que resultaria na perda da sua proteção entérica e diminuição da sua atividade. A ativação das enzimas na mucosa oral (grânulos previamente amassados ou mastigados) pode desencadear lesões locais, com desenvolvimento de ulcerações. A monitorização da terapia de reposição enzimática deverá ser feita regularmente em consultas periódicas (mensais no primeiro ano de vida e após, a cada 3-6 meses), observando-se o controle dos sintomas, o crescimento e ganho ponderal, e a perda de gordura fecal (Kerem et al., 2005). 48 Enzimas pancreáticas são rapidamente degradadas pelo suco gástrico e funcionam melhor em meio alcalino. A lípase e colipase necessitam de ácido biliar para a digestão de gordura e formação de micelas. Uma diminuição do bicarbonato em combinação com a alta acidez gástrica comum no paciente com FC pode levar o duodeno e jejuno proximal a permanecerem ácidos, impedindo a dissolução da cápsula e ação da enzima, esses fatores podem limitar a eficácia da suplementação das enzimas pancreáticas (Couper et al., 2002). Isso pode ser tratado com a administração de inibidores da secreção gastrica, como inibidores da bomba de prótons e antagonistas H2, que reduzem a acidez gástrica e aumentam o pH do duodeno (Borowitz et al., 2002). Vários tipos de enzimas são disponíveis comercialmente, com apresentações em pó, comprimidos e cápsulas com microesferas, nas seguintes doses: 4500 UI, 10000 UI, 12000 UI, 18000 UI e em altas doses 20000 e 25000 UI de lípase, sendo o tipo prescrito dependente de alguns fatores como disponibilidade local e idade do paciente. A eficácia da terapia de reposição com as enzimas depende de muitos fatores, como o tipo de enzima, dose, esvaziamento gástrico, conteúdo de gordura da dieta, modo e tempo de administração e armazenamento da enzima (Litlewood et al., 2006). Os efeitos colaterais da terapia enzimática são raros, sendo o mais temido a colonopatia fibrosante, que está associado com doses maiores que 6000 UI lípase /Kg por refeição por mais de 6 meses, e deve ser considerada em pacientes que apresentem evidência clínica de obstrução, dor abdominal 49 com diarréia persistente, por vezes com sangue e pouco ganho de peso (Borowitz et al., 1995). 1.9.2: Vitaminas Lipossolúveis: O Consenso Americano sobre Nutrição do paciente com fibrose cística recomenda a monitoração anual das vitaminas A e E. A suplementação de vitaminas segue as seguintes recomendações do Consenso de Nutrição de pacientes pediátricos com FC conforme descrito na Tabela3 (Borowitz et al., 2002). A suplementação de zinco deve ser efetuada nos pacientes com níveis subótimos de vitamina A ou com cegueira noturna, que não respondem à suplementação de vitamina A, sendo recomendada também para crianças com falência de crescimento, durante um período de seis meses. Tabela 3 Suplementação de vitamina de acordo com o Consenso de Nutrição de pacientes pediátricos com FC IDADE 0a 12 meses 1 a 3anos 4 a 8anos > 8 anos VIT A(UI) 1.500 5.000 5.000 a 10.000 10.000 VIT D(UI) VIT E(UI) VIT K(mg) 400 400 a 800 400 a 800 400 a 800 40 a 50 80 a 150 100 a 200 200 a 400 0,3 a 0,5 0,3 a 0,5 0,3 a 0,5 0,3 a 0,5 50 CAPÍTULO II - OBJETIVOS 2.1- OBJETIVO GERAL: Avaliar a presença de Insuficiência Pancreática pelo método de dosagem de Elastase1 fecal nos pacientes com Fibrose Cística acompanhados no IFF. 2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS: • Apresentar a prevalência de IP diagnosticada pela Elastase1 fecal. • Associar o diagnóstico de IP pela Elastase1 fecal com o exame de Dosagem de Gordura Fecal. • Auxiliar no diagnóstico de FC 51 CAPÍTULO III – MÉTODO: 3.1-Tipo de estudo: Trata-se de um estudo do tipo transversal descritivo. Essa pesquisa foi realizada no Instituto Fernandes Figueira (IFF) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Ministério da Saúde, Centro de Referência para o tratamento de crianças e adolescentes com Fibrose Cística. 3.2- População de estudo: O estudo foi realizado em pacientes de ambos os sexos, com idades de 1m a 21 anos, com diagnóstico de FC de acordo com consenso da Cystic Fibrosis Foundation (2008) e naqueles em investigação diagnóstica acompanhados nos ambulatórios de Pneumologia, Fisioterapia e Nutrição do IFF. 3.3- Critérios de seleção: 3.3.1- de inclusão: Possuir diagnóstico ou suspeita (em investigação) de Fibrose Cística, estar na faixa de idade de 1m a 21 anos e ter realizado a dosagem de elastase fecal . 3.3.2- de exclusão: Pacientes com fezes aquosas permanentemente (ostomizados, com exceção dos gastrostomizados), diarréia aguda e outras patologias associadas como doença celíaca, HIV e doença inflamatória intestinal. 3.4- Coleta de dados: A coleta de dados foi realizada pela pesquisadora no período de junho a dezembro 2009. A pesquisadora utilizou dados retrospectivos, e solicitou a colaboração dos profissionais especializados de cada Setor de Atendimento 52 com o objetivo de complementar dados insuficientes, e interagir com as equipes multiprofissionais que tem contato direto com todos os pacientes. Alguns dados foram obtidos do Prontuário Médico da rotina de atendimentos dos Ambulatórios de Nutrição e Pneumologia para as seguintes variáveis: • Identificação do paciente: número do prontuário; idade; sexo; • Teste do Suor, • Sintomas relacionados à IP. Essas informações foram anotadas em uma planilha. 3.5- Dosagem de gordura fecal: A dosagem de gordura fecal foi pedida para todos os pacientes do estudo pela equipe médica do ambulatório de Nutrição. Sendo agendada, recebida pelo Laboratório de Patologia clínica e encaminhadas ao laboratório DLE. O método de escolha utilizado foi o de Van de Kamer. Os pacientes que utilizavam enzimas de reposição foram orientados a suspendê-las durante a coleta de fezes de 72hs e submetidos a uma dieta de 3g /kg/dia, máximo de 100g/dia durante a coleta. 3.6- Dosagem da Elastase1 Fecal: A Elastase 1 fecal foi determinada imunologicamente com um ensaio imunoenzimático (Schebo-Tech, Wettenberg, Alemanha). A medida foi realizada de acordo com as orientações do fabricante. A construção da curva padrão foi adequada com um R²=0,97, o que indica precisão da curva (figura:3). Para cada um dos pacientes a EF1 foi determinada em duplicata. Os resultados foram expressos em µg de elastase-1 por grama de fezes. A densidade ótica (DO) utilizada foi de 415-490 nm. Valores abaixo de 200µg/g 53 de fezes foram considerados anormais. O controle de qualidade do exame foi realizado com 10 crianças saudáveis, dentro da mesma faixa etária. Curva Padrão de E1 y = 0,0038x + 0,3153 2 R = 0,974 DO 415-490 nm 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 100 200 300 400 500 600 E1 pg/mL curva padrao Regressao Figura 3: Curva padrão construída a partir da solução padrão fornecida pelo Kit Schebo-Tech Elastase Pancreática 1 em fezes. A dosagem foi solicitada em todos os pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados nos ambulatórios de Pneumologia e Nutrição do IFF. A solicitação foi feita pela equipe médica do ambulatório de Nutrição. As amostras foram recebidas no próprio ambulatório e encaminhadas ao laboratório de Patologia clínica onde foram armazenadas em freezer a temperatura de -20°C e posteriormente processadas pela pesquisadora (E1 Quick Prep). O princípio da análise é baseado no método ELISA. Foram fornecidos 03(três) frascos coletores, secos para coleta de material (fezes), etiquetados com o nome e número de prontuário da criança. O responsável foi orientado em relação a coleta do material. Na devolução, o nome, número de prontuário e data de entrega foram anotados em livro 54 pautado, em seguida levados pela pesquisadora ao Laboratório de Patologia clínica. O material foi acondicionado em uma caixa plástica identificada com o nome da pesquisadora, departamento que ela pertence e nome do projeto. O procedimento para o correto processamento do material foi feito inicialmente com o descongelamento do material à temperatura ambiente, por cerca de 45 minutos. Após esse procedimento foi realizada a extração com dispositivo E1 QUICK-PREP (indicado para utilização em conjunto com o Kit SCHEBO ELASTASE PANCREÁTICA 1 EM FEZES). O Procedimento Operacional Padrão (POP) para a realização do exame foi elaborado pela pesquisadora (Apêndice1). 3.7- Análise Estatística: 3.7.1-As análises estatísticas foram feitas utilizando o teste Quiquadrado (variáveis categóricas). Utilizou-se o teste “t”-student para as variáveis com distribuição normal, e testes não-paramétricos para variáveis que não apresentaram distribuição normal. O ponto de corte para o valor de significância dos testes estatísticos foi o p-valor ≤ 0,05. Sensibilidade, especificidade e valor preditivo positivo e negativo foram avaliados comparando a concentração de E1 fecal no grupo com FC com a gordura fecal de 72 hs (considerada como padrão ouro). 3.7.2-O Banco de Dados foi construído no programa Microsoft Excel e as análises estatísticas foram realizadas no programa Epi Info 2000 (CDC). 55 CAPÍTULO IV - RESULTADOS: Dos 120 pacientes acompanhados no IFF, 72 forneceram amostra para a realização de dosagem da elastase 1 fecal. Sendo que 12 são pacientes em investigação diagnóstica e 60 possuem critérios para diagnostico de FC, de acordo com o consenso da Cystic Fibrosis Foundation (2008). Na amostra dos 72 pacientes estudados, 34 (47,2%) eram do sexo feminino e 38 (52,8%) do masculino. A idade variou de quatro meses a 20,5 anos com mediana de nove e média de 8,7(± 4,8) anos. Os 72 pacientes foram divididos em dois grupos: grupo A (60 pacientes), com diagnostico confirmado de FC( 29 do sexo feminino, 31do sexo masculino). O diagnóstico foi baseado nos sinais e sintomas clínicos e no Teste do Suor. O grupo B de 12 pacientes(5 do sexo feminino e 7 do sexo masculino) que corresponde aquelas crianças em investigação diagnóstica das formas atípicas, com teste do suor negativo ou duvidoso. As 10 crianças saudáveis que realizaram a dosagem da Elastase 1 fecal para controle de qualidade do exame tinham de 7,9 (±3,5)anos de idade, mediana de 8,35 anos com variação de 1,4 anos a 14,5 anos. Todas apresentaram SP com concentração de EF1 acima do valor referido como normal (>200µg/g) com média de 450,7µg/g (DP±45,7). controle 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Elastase1 447,8 452,8 475,6 447,4 476,4 326,6 464,8 452,4 484 479,4 Os sintomas de má absorção devido à IP com evidente esteatorréia (fezes volumosas, malformadas, oleosas e fétidas) foram referidos por 58 pacientes (80,6%). A suplementação enzimática foi realizada por 60 pacientes (83,3%) 56 sendo que a freqüência do uso de enzima foi de 90% (54 pacientes) no grupo A e 50% (6 pacientes) no grupo B (Tabela4). Tabela 4. Características gerais das crianças e adolescentes que participaram do estudo de dosagem de EF1 com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009. Grupo A Grupo B Total Pacientes n(%) 60(83,3) 12(16,7) 72 Sexo Feminino 29 5 34 Sexo Masculino 31 7 38 Idade em anos Média(DP) IP n(%) 8,7(±4,9) 8,2(±4,7) 8,7(±4,8) 44(73,3) 1(8,3) 45 SP n(%) 16(26,7) 11(91,7) 27 Presença de sintomas n(%) 50(83,3) 8(66,7) 58 Reposição Enzimas n(%) 54(90) 6(50) 60 51(85) 8(13,3) 0 3(25) 51 11 34(87,1) 5(12,9) 39 Teste do Suor >60mEq/L 40-60mEq/L n(%) GF positiva n(%) IP= Insuficiência Pancreática SP=Suficiência Pancreática GF=Gordura Fecal A dosagem da Elastase 1 fecal apresentou valores abaixo de 200 µg / g de fezes em 45 dos 72 pacientes estudados (62,5%). Sendo 44(73,3%) do grupo A e 1(8,3%) do grupo B. 57 A classificação da função pancreática de acordo com os valores encontrados da dosagem de EF1 fecal foi: 61,11% dos pacientes com IP severa, 1,39% com IP moderada e 37,50% com SP (Tabela5). Tabela 5. Valores de EF1 encontrados nos pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 EF1µg/g n % <15(indetectável) 42 58,33 15-100 2 2,78 100-≤200 1 1,39 >200-500 15 20,84 >500 12 16,66 EF1= Elastase1 fecal A prevalência de IP em relação ao gênero observada em 51,1% no sexo feminino e em 48,9% no masculino não demonstrou diferença estatisticamente significante (p=0,2). Ao agruparmos os pacientes pela concentração de elastase 1 fecal em SP e IP a diferença de proporção entre o grupo de pacientes com diagnóstico (A) e suspeitos de FC (B) foi altamente significativa (p<0,001) e está descrita na Tabela 6. 58 Tabela 6. A classificação da função pancreática pela dosagem da EF1 nos 2 grupos de pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 EF1µg/g Grupos Grupo A n(%) Grupo B n(%) ≤200µg/g(IP) 44(73,3) 1(8,3) 45 >200µg/g(SP) 16(26,7) 11(91,7) 37 60 12 72 total TOTAL EF1= Elastase1 fecal IP= Insuficiência Pancreática SP=Suficiência Pancreática No grupo A nove pacientes apresentaram concentração de Elastase1 fecal acima de 500 µg/g. Somente três apresentam concentrações entre 15µg/g e 200µg/g, o restante da amostra do grupo, 41 pacientes (68,3%), apresentaram concentrações indetectáveis (<15µg/g) (Tabela 7). Tabela 7. A distribuição da concentração da EF1 nos 2 grupos de pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 EF1µg/g Grupos Grupo A n(%) Grupo B n(%) 41(68,3 ) 1(8,3 ) 42 15-≤200 µg/g 3(5,0 ) 0 3 200-≤500µg/g 7(11,7 ) 8(66,7 ) 15 9(15 ) 3(25 ) 12 60 12 72 <15 µg/g >500 µg/g total EF1= Elastase1 fecal TOTAL 59 A associação do uso da reposição da enzima pancreática, com a função pancreática determinada pela dosagem da elastase1 fecal, demonstra que das 60 crianças que usavam enzimas 16 (26,7%) não apresentaram IP. Dentre os 12 pacientes sem reposição enzimática um apresentou IP. O teste da diferença das proporções foi significativo (p=0,001) de acordo com o teste do Quiquadrado (Tabela8) Tabela 8. A associação da concentração da EF1 com o uso de enzimas em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 EF1µg/g Enzimas Sim n(%) Não n(%) ≤200 µg/g 44(73,3) 1(8,3) 45 >200 µg/g 16(26,7) 11(91,7) 37 60 12 72 total TOTAL EF1= Elastase1 fecal Em relação a sintomatologia, dos 58 pacientes que apresentavam evidencia clinica de esteatorréia, sugestiva de IP, a concentração de EF1 obteve resultados baixos em 41 (70,7%), demonstrando importante associação entre os dois (valor de p=0,003). No grupo A sintomatologia esteve presente em 50 (83,3%) pacientes, dos quais 41 (93,2%) foram classificados em IP pela dosagem de EF1 e desses, 38 (92,7%) apresentavam níveis indetectáveis de Elastase1 nas fezes (p=0,0011)(Tabela9). 60 Tabela 9. A associação da classificação da função pancreática pela dosagem da EF1 com a sintomatologia de ma absorção em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 EF1µg/g Sintomas Presentes(n) Ausentes(n) TOTAL IP 41 4 45 SP 17 10 27 total 58 14 72 IP= Insuficiência Pancreática SP=Suficiência Pancreática EF1= Elastase1 fecal No grupo A, a dosagem de gordura fecal pelo método Van der Kamer, não foi realizada por 14 pacientes por dificuldade de agendamento e coleta, duas crianças realizaram o exame pelo método Sudam III, e no grupo B dois pacientes não realizaram o exame. Com relação a sintomatologia, dos 46 pacientes que apresentavam queixa de má absorção a dosagem de gordura fecal foi positiva em 35(76%). A associação entre essas duas variáveis demonstrou haver significância estatística (p=0,019) (Tabela10). 61 Tabela10. Distribuição da gordura fecal em associação com a sintomatologia em pacientes com diagnostico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 Sintomas Gordura Fecal Positiva n(%) Negativa n(%) Presentes 35(76) 11(24) 46 Ausentes 4(40) 6(60) 10 39 17 56 total TOTAL p =0,034(Teste Exato de Fisher) A associação da classificação da função pancreática pela dosagem da elastase 1 fecal com pacientes com a dosagem da gordura fecal mostrou que dos 39 esteatorréia 31 (79,5%) apresentaram IP e oito (20,5%) pacientes com esteatorréia apresentaram SP pela dosagem da elastase1 fecal (Tabela11). A associação foi significativa (p=0,0002). 62 Tabela 11. A associação da classificação da função pancreática pela dosagem da EF1 com o valor da gordura fecal em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 Elastase1fecal Gordura Fecal Positiva n(%) Negativa n(%) IP 31(79,5) 5(29,4) 36 SP 8(20,5) 12(70,6) 20 39 17 56 total IP= Insuficiência Pancreática TOTAL SP=Suficiência Pancreática P<0,00000 No grupo A 34 pacientes (73,9%) e no grupo B 5 pacientes (50%) possuíam gordura fecal positiva (Tabela12). O resultado não foi significativo (p=0,08). Tabela 12. Distribuição da gordura fecal em pacientes com diagnóstico e suspeita de FC acompanhados no IFF em 2009 Grupo de Gordura Fecal pacientes Positiva n(%) Negativa n(%) Grupo A 34(73,9) 12(26,1) 46 Grupo B 5(50) 5(50) 10 39 17 56 total p=0,08 TOTAL 63 O resultado da sensibilidade foi calculado utilizando como “padrão ouro” o teste de dosagem de gordura fecal de 72hs, e realizado somente nos pacientes do grupo A, com o diagnóstico confirmado de FC (Tabela 13). Tabela 13: teste de sensibilidade TESTE Gordura Fecal(“padrão ouro”) EF1µg/g Positiva(n) Negativa(n) TOTAL Positivo(<200) 30 5 35 Negativo(>200 4 7 11 total 34 12 46 Sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e negativo dos valores de dosagem da gordura fecal de 72hs foi de 88%, 58,3%, 85,7%, 63,6% respectivamente. 64 CAPÍTULO V- DISCUSSÃO: A função pancreática possui uma grande influencia sobre o prognóstico da FC. A presença de IP requer um tratamento vitalício com reposição de enzimas pancreáticas exógenas. Por isso, a avaliação da função pancreática exócrina no paciente com FC é obrigatória no momento do diagnóstico e ao longo do acompanhamento dos pacientes SP. Segundo Beharry et al. (2002) um teste “ideal” de avaliação da função pancreática não deve ser invasivo, ser quantitativo, reprodutível e de fácil realização. Um teste deste tipo é um desafio principalmente para a população pediátrica. Neste estudo realizou-se a dosagem de Elastase1 pancreática nas fezes de 72 pacientes acompanhados no ambulatório de Pneumologia, Nutrição e Fisioterapia Respiratória. Como cerca de 85 a 90% dos pacientes com FC tem IP e sendo esta doença a principal causa de IP na infância, um teste que avalie a função pancreática serve como alternativa para esclarecer o diagnóstico de casos duvidosos de FC. Uma vez que, apesar do Teste de suor ser uma ferramenta muito boa para diagnóstico de fibrose cística na maioria dos pacientes, um pequeno grupo que apresenta teste do suor normal ou com resultados limítrofes, porém com sinais e sintomas fortemente sugestivos podem exigir outros testes que auxiliem no diagnóstico. Por isso estudamos 12 pacientes em investigação diagnostica para FC. Entretanto só obtivemos o teste da elastase 1 fecal positivo em um paciente deste grupo. Isso pode ter ocorrido porque nem sempre o failure to thrive tem 65 origem na IP ou porque esses pacientes apresentem um genótipo que não curse com IP ou desenvolvam mais tardiamente ou não apresentem FC. No estudo de Walkowiak (2003) foi observado o desenvolvimento progressivo do IP em cinco crianças com o aumento da idade (follow-up de 2 anos). Nesses pacientes, repetidas medições da concentração de EF1 levantou a suspeita inicial de possível esteatorréia. Este autor concordou que a EF1 é uma ferramenta útil para avaliação longitudinal de pacientes com SP e no momento do diagnóstico da FC. Segundo ele o desenvolvimento tardio de IP nos pacientes SP, pode ser mais comum do que geralmente se supõe. A diminuição da concentração de EF1 precede o aparecimento de esteatorréia. No nosso estudo, 45 crianças apresentaram baixas concentrações de Elastase 1 fecal (<200µg/g) que correspondeu a 62,5% da amostra total. Entretanto se considerarmos só o grupo (A) com diagnóstico firmado de FC esta prevalência vai para 73,3%. Mesmo assim, este resultado difere do encontrado na literatura, em que aproximadamente 85% dos pacientes com FC apresentam IP (Stormon & Durie, 2002). Possíveis causas para essa divergência pode ser pelo pequeno número de pacientes estudados e porque segundo Zielenski (2006) a intensidade das manifestações pancreáticas é determinada pela mutação genética de base (relação genótipo – fenótipo pancreático). Sendo assim, a maioria dos pacientes DF508 homozigotos apresenta IP, enquanto os heterozigotos com mutação parcial ou leve podem apresentar função pancreática residual e são classificados como SP. Entretanto como não foi realizada a analise genética da população estudada não se pode atribuir este resultado ao tipo genético. 66 Apesar da incerteza quanto ao valor normal da elastase-1 fecal, se acima de 100 ou 200µg/g de fezes, o ponto de corte utilizado para definição de IP foi de 200µg de elastase1 por grama de fezes, de acordo com as orientações do Kit utilizado (Schebo-Tech, Wettenberg, Alemanha). Além disso Weintraub et al (2009), realizaram um estudo comparando os dois valores e não encontrou diferença estatisticamente significante entre eles Observou-se que 61,11% dos pacientes apresentou IP severa, ou seja, com EF1 <100µg/g de fezes e 1,39% insuficiência pancreática moderada (EF1 entre 100 e 200 µg/g de fezes). Dados obtidos em um grande estudo transversal (1215 pacientes) nos Estados Unidos realizado em 33 centros de FC por Borowitz (2004), também encontrou maior prevalência (87%) de pacientes com EF1 <100µg/g e apenas 1,5% dos casos com EF1 entre 100 e 200 µg/g de fezes. Isto mostra que a maioria dos pacientes com FC apresentam IP grave. A reposição enzimática foi realizada por 60 dos pacientes estudados, sendo que 16 (26,7%) destes foram classificados em SP pela dosagem de EF1 e 1 (8,3%) paciente que não usava enzima apresentou IP com concentração de EF1 indetectável. Estes resultados também foram demonstrados no estudo descrito por Borowitz (2004), em que 24 (2,2%) de 1074 pacientes com EF1 inferior a 200µg/g de fezes não tinham sido medicados com enzimas pancreáticas e 81 (57,8%) de 141 pacientes com EF1 maior de 200 µg/g receberam enzimas. Borowitz (2004), também constatou que, apenas 15% de um grande grupo de pacientes com FC na população dos Estados Unidos realizaram qualquer teste da função pancreática (5,5% gordura fecal; 0,3% teste de estimulação do pâncreas; 0,4% tripsinogênio imunoreativo (IRT); 8,7% 67 outros testes não especificados). Estes resultados demonstram que na maioria dos casos, a reposição de enzima é prescrita com base na impressão clínica tanto de má absorção como failure to thrive. Nos casos diagnóstico subestimado, há piora do prognóstico da doença por deteriorar o estado nutricional, mineralização óssea e consequentemente a função pulmonar. Nos casos em uso indevido da reposição enzimática onera os cofres públicos. Estes dados também mostram a falta padronização de um teste para o diagnostico laboratorial preciso da IP. A terapia de reposição enzimática, embora sem dúvida essencial para aqueles que são classificados em IP, tem efeito psicossocial, principalmente em adolescentes. No nosso estudo, somente três adolescentes não faziam uso de enzimas, todos três classificados como SP pela concentração de EF1. Outro fator de erro na avaliação clinica dos sintomas da IP, se deve ao fato de que a consulta pediátrica apresenta características próprias, a história é obtida através das informações do cuidador, os sintomas geralmente são subjetivos e por se tratar de uma doença com manifestações multissistêmicas pode haver superposição de sinais e sintomas. Por outro lado, quando associou-se apenas os sintomas de má absorção devido a IP com a concentração de EF1, observou-se que dos 58 pacientes com queixas de IP, 41 (70,7%) foram classificados como insuficientes pancreáticos. Isto mostra a importância do diagnóstico clínico, de avaliações repetidas da função pancreática exócrina, para tratar a má digestão e otimizar o estado nutricional. A associação se mostrou significativa. No estudo de Meyts et al (2002) a categorização baseada nos sintomas de má absorção em 68 conjunto com o teste de excreção de gordura nas fezes implicou que o grupo com IP clinica clássica, compreende os pacientes com IP severa. Com relação à gordura fecal não ter sido realizada por 14 pacientes já era esperado devido a dificuldade para a coleta do material, durante 72 horas, armazenamento e a necessidade de ingestão adequada de gordura, durante os dois dias que antecedem o exame e os três dias de coleta das fezes. Estas recomendações diminuem a aderência ao teste pela dificuldade que, as crianças e os familiares têm em juntar todas as fezes. Quando comparada a dosagem de Elastase1 nas fezes dos pacientes que realizaram a coleta de gordura fecal, esta foi positiva em 31 (86,1%) dos 36 pacientes considerados insuficientes pancreáticos. A associação entre a função pancreático e a esteatorréia é grande. O fato de oito pacientes (20,5%) considerados suficientes pancreáticos pela concentração da EF1 apresentarem gordura fecal positiva, pode ser devido ao fato que, a esteatorréia, especialmente em pacientes com FC, ser influenciada por outros fatores, como distúrbios da motilidade gastrointestinal, diminuição da secreção de bicarbonato com acidez duodenal posterior, inativação de enzimas do pâncreas por baixo pH e perda de sais biliares, supercrescimento bacteriano, além da própria insuficiência pancreática. Beharry et al (2002), examinou dois grupos de pacientes: um deles com esteatorréia documentada de etiologia variada, e encontrou uma sensibilidade para o teste de 98% e uma especificidade de 80%. Um fato que não se pode desconsiderar é que o exame de gordura fecal não se baseou no coeficiente de absorção de gordura e sim no resultado do exame de Van der Kamer desta forma podemos ter exames duvidosos uma 69 vez que o valor normal de excreção de gordura fecal varia dependendo da idade do paciente. Neste estudo encontrou-se a sensibilidade da E1F de 88%,a especificidade de 58,3%, e os valores preditivos positivo e negativo de 85,7% e 63,6% respectivamente. A sensibilidade foi semelhante a encontrada por Terbrack et al (1995) em pacientes com FC (89,5%). Mas diferente do encontrado por Amir et al 2009 que encontraram usando um ponto de corte de 200µg/g, a sensibilidade foi 40%, a especificidade 81%, valor preditivo positivo de 40%, e valor preditivo negativo de 81%. Entretanto usando um corte de 100µg/g, estes mesmos autores encontraram a sensibilidade da EF1 foi de 94%, a especificidade foi de 20%, valor preditivo positivo 50%, e valor preditivo negativo 79%. Em nosso estudo não houve diferença estatisticamente significante nos dois pontos de corte que justificasse que o menor o ponto de corte produzisse maior sensibilidade. O resultado do presente estudo demonstrou que a E1F é um teste muito sensível, com capacidade de detectar a doença quando ela está presente, com bom valor preditivo positivo, mas com especificidade limitada. Ele serve para screening, muda a decisão clinica e possui efeito no desfecho (tratamento da IP com melhor prognóstico da FC) e desta forma melhora a sobrevida dos que fizerem o exame. Todavia tem que se ficar atento, pois o teste, tem suas limitações:não reflete a resposta ao tratamento enzimático; na presença de diarréia , pode dar falso positivo; não distingue entre IP primária ou secundária; resultados boderline devem ser interpretados com cautela. Outro fato é que os resultados deste estudo foram comparados com a gordura fecal que não é o padrão ouro (teste de estimulação direta do pâncreas 70 pela secretina) para diagnostico de IP em pacientes com FC. Por isso foi semelhante na sensibilidade, mas diferente na especificidade do estudo de Walkowiak (1999), em pacientes de FC, comparando com o “padrão ouro” utilizando-se um ponto de corte de 200 µg/g revelou uma sensibilidade de 89,3% e uma especificidade de 96,4%. Uma variedade de estudos analisaram a sensibilidade e especificidade da EF1, segundo uma revisão realizada por Lankisch (2004). Mas a comparação dos resultados é difícil e devem ser interpretados com cuidado, avaliando se a população estudada incluiu somente indivíduos com fibrose cística ou incluídos indivíduos com outras doenças. A limitação deste estudo foi o pequeno número de pacientes e a falta de estudos semelhantes na literatura (44 artigos com utilização das palavras chaves: insuficiência pancreática exócrina; elastase1fecal; fibrose cística) que comparem os resultados da dosagem da elastase1 fecal em pacientes com fibrose cística com a estimativa da gordura fecal, que não é o padrão ouro, mas o teste que realizamos no serviço para avaliação da função pancreática. Por isso, esses resultados precisam ser confirmados em um estudo com um número maior de pacientes com fibrose cística. 71 CAPÍTULO VI- CONCLUSÕES A prevalência de IP em pacientes com FC foi alta (73,3%), porém menor que a encontrada na literatura. No grupo em investigação diagnostica, não auxiliou no diagnóstico de FC, porque provavelmente como é um grupo que não preenche os critérios, ou eles são formas atípicas da doença, ou apresentam mutações leves (devido à heterogeneidade da nossa população) associadas com a função pancreática normal, ou não apresentam FC. A dosagem da elastase1 fecal, como um novo método atualmente disponível mostrou-se uma ferramenta útil para o screening da função pancreática de pacientes com FC devido a sua boa sensibilidade, reprodutibilidade, facilidade de coleta da amostra e simplicidade de execução da dosagem numa pequena quantidade de fezes. Desta forma a medida da elastase 1 fecal cumpre os requisitos de um marcador quase ideal para avaliação da função pancreática exócrina, principalmente nos casos de IP severa, porém ainda pouco utilizado em nosso meio. A prevalência de pacientes com esteatorréia e concentração de EF1 diminuída foi de aproximadamente 80%. A dosagem da gordura fecal não apresentou boa aderência, cerca de 23% dos pacientes não realizaram a coleta, sendo um exame de difícil execução, devido ao preparo, técnica, inconvenientes de coleta e armazenamento de fezes. Além disso, seu resultado pode ser incorreto porque nos pacientes com FC outros fatores que não o comprometimento pancreático podem levar a esteatorréia, Entretanto durante o seguimento dos pacientes com FC e IP, há necessidade de uma cuidadosa monitorização da assimilação de gorduras e a resposta ao tratamento enzimático e neste caso a dosagem da gordura fecal é a indicada. 72 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adde FV, Silva Filho LVRF, Damaceno N, Rodrigues JC. Fibrose Cística. Programa de Educação Continuada de Pediatria.2007, ciclo X- nº 4. Anjos LA. Vigilância nutricional em adultos: experiência de uma unidade de saúde atendendo população favelada. Cad Saúde Pública 1992; V-8, n.1, p 521. Atlas A, Rosh J. 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O objetivo deste estudo é avaliar a presença da insuficiência pancreática exócrina pelo exame de medida da Elastase1 fecal. Sua participação nesta pesquisa consistirá em: coletar uma amostra de fezes para dosagem de Elastase 1 fecal e amostra de 03 dias para dosagem de gordura fecal de 72 horas com a suspensão da reposição enzimática durante esta coleta com dieta adequada prescrita pela nutricionista. As informações obtidas através dessa pesquisa poderão ser publicadas em meios de divulgação científica, porém sem a identificação dos participantes reveladas, sendo informações confidenciais com o sigilo assegurado. Não haverá pagamento pela colaboração ao projeto. O Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) encontra-se ciente e a disposição para eventuais esclarecimentos no telefone:2554-1730 e fax:2552-8491. ______________________________________ Nome e assinatura do pesquisador 82 Pelo presente instrumento, declaro que fui suficientemente esclarecido (a) pelo (a) médico (a) (____________________) sobre os procedimentos (suspensão da reposição enzimática por três dias para realização da coleta de gordura fecal de 72 hs e coleta de uma amostra de fezes para dosagem de Elastase 1 fecal), a que vou me submeter, ou a que vai ser submetido (______________), do qual sou responsável legal. Declaro também que fui informado (a) de todos os cuidados e orientações (suspensão das enzimas e administração de gordura na dieta durante a coleta, armazenamento das amostras) que devo seguir a fim de alcançar o melhor resultado. Estou ciente que a realização do exame proposto não causará nenhum agravo a saúde de (______________). Pelo presente também manifesto expressamente minha concordância e meu consentimento para realização do procedimento acima descrito. Local e data ____________________________________________ Nome e assinatura do paciente (ou representante legal) ____________________ Documento de Identidade ______________________________ Testemunha ______________________________ Testemunha 83 Apêndice3:Procedimento Operacional Padrão PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO Pag.: 01/01 POP – 01 Projeto: Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Índice de Revisões Revisã Itens o Revisados Elaborado Nome Data Amélia 17/09/0 Raquel 9 Neves de Noronha Aprovado Vist o Nome Data Visto Célia Regina Chaves 1 - OBJETIVO: Captar pacientes com Fibrose Cística atendidos no Ambulatório de Nutrição, Pneumologia e Fisioterapia do Instituto Fernandes Figueira(IFF). 2- DEFINIÇÕES: Fibrose cística (FC) é uma doença genética, de caráter autossômico recessivo, causada por mutações em um gene, responsável pela codificação de uma proteína denominada:cystic fibrosis transmembrane condutance regulator (CFTR). 3- DESCRIÇÃO: 3.1- ROTINA DE TRABALHO: 3.1.1- Captação dos pacientes elegíveis: a- Todos pacientes com diagnóstico de Fibrose Cística acompanhados no IFF agendados pelo ambulatório de Pneumologia de acordo com a sua colonização bacteriana são encaminhados para o Ambulatório de Nutrição (2ª e 5ª feiras pela manhã e 4ª feira à tarde) para consulta, avaliação nutricional e orientação alimentar. b- Serão incluídos todos os pacientes que possuem diagnóstico de Fibrose Cística, e estejam na faixa de idade de 1m a 18 anos e excluídos os Pacientes com fezes aquosas permanentemente (ostomizados), com quadro de diarréia aguda e outras patologias associadas como doença celíaca, HIV e doença inflamatória intestinal 84 c- Todas consultas são realizadas por duas médicas Pediatras uma Nutróloga e em Gastroenterologista. Os pacientes são atendidos após a consulta médica, por uma nutricionista da equipe. d- Na consulta é preenchido uma folha de dados, com nome, número de prontuário, data de nascimento, sintomas relacionados a insuficiência pancreática exócrina e resultados de exames de gordura fecal realizados . (apêndice1) e- Após a consulta os responsáveis e o paciente no caso de adolescentes são esclarecidos sobre o projeto e convidados a participar dele. Aqueles que aceitarem, assinam o termo de consentimento livre e esclarecido 85 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO Pag.: 01/01 POP – 02 Projeto: Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Índice de Revisões Revisã Itens Revisados o Elaborado Nome Data Visto Aprovado Nome Data Visto 1 - OBJETIVO: Orientar a coleta do material para determinar a concentração de Elastase1 nas fezes de crianças e adolescentes com FC. 2- DEFINIÇÕES: Elastase1 pancreática é uma enzima proteolítica produzida exclusivamente pelas células acinares do pâncreas. A medida da Elastase1 Fecal é considerada de fácil realização e de alta sensibilidade para classificar os pacientes portadores de FC com Insuficiência ou Suficiência Pancreática, com a vantagem de ser um teste não invasivo, importante para o prognóstico, abordagem terapêutica e clínica. 3- DESCRIÇÃO: 3.1- ROTINA DE TRABALHO: São fornecidos 03(três)frascos coletores, secos para coleta de material (fezes), etiquetados com o nome e número de prontuário da criança. O responsável é orientado a coletar uma amostra de fezes da seguinte forma: 1- O paciente deve evacuar em recipiente limpo e seco 2-Uma amostra pequena dessas fezes formadas recém emitidas é coletada 3- Uma pequena quantidade(cerca de 100mg) deve ser distribuída em cada um dos três frascos. 4-As fezes não podem ser misturadas com urina ou água 5- Conservar os frascos com as fezes refrigerados até a entrega 6-Essas amostras podem ser estocadas por um ano a -20° 86 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO Pag.: 03/01 POP – 03 Projeto: Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Índice de Revisões Revisã Itens Revisados o Elaborado Nome Data Visto Aprovado Nome Data Visto 1 - OBJETIVO: Receber o material e envia-lo para congelamento. 2- DEFINIÇÕES: Os três frascos coletores com a amostra simples de fezes, devidamente identificados com nome e número do prontuário. 3- DESCRIÇÃO: 3.1- ROTINA DE TRABALHO: a- Os responsáveis pelos pacientes entregam o material para a pesquisadora responsável pelo projeto, ou para o secretário do ambulatório de Nutrição. b- A pessoa que recebe o material (fezes em frasco coletor com tampa) deve checar se este está devidamente identificado com nome e número de prontuário, e anotar em livro pautado, que se encontra no ambulatório de Nutrição: a data do recebimento e numerá-lo pela ordem de entrega. c- Os frascos são acondicionados imediatamente em caixa de isopor e em seguida levados pela pesquisadora ao Laboratório de Patologia clínica para estocagem e congelamento a -20°C. d- No freezer, os frascos são acondicionados em uma caixa plástica identificada com o nome da pesquisadora, departamento que ela pertence e nome do projeto. 87 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO Pag.: 01/01 POP – 4 Revisão no: 02 Projeto: Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Índice de Revisões Revisã Itens Revisados o Elaborado Nome Data Visto Aprovado Nome Data Visto 1 – OBJETIVO: Descongelar o material congelado a -20°C. 2- DEFINIÇÕES: O processo de descongelamento é aquele que devolve as fezes ao seu estado normal(anterior) 3- DESCRIÇÃO: 3.1- ROTINA DE TRABALHO: 3.1.1- Descongelar as fezes à temperatura ambiente a- O ambiente específico utilizado para o descongelamento e processamento de material humano deve obrigatoriamente possuir janelas e ser arejado. c- As fezes são colocadas sobre uma bancada do laboratório e deixadas a temperatura ambiente por um período de aproximadamente 45 minutos. d- As fezes se encontram adequadas para processamento quando estiverem totalmente descongeladas. 88 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO Pag.: 01/01 POP – 5 Revisão no: 02 Projeto: Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência. Índice de Revisões Revisã Itens Revisados o Elaborado Nome Data Visto Aprovado Nome Data Visto 1 – OBJETIVO: Identificação do dispositivo E1 QUICK-PREP(indicado para utilização em conjunto com o KIT SCHEBO ELASTASE PANCREÁTICA 1 EM FEZES) 2- DEFINIÇÕES: Definir as etapas de identificação de cada dispositivo 3- DESCRIÇÃO: 3.1- ROTINA DE TRABALHO: a- Os dispositivos devem ser identificados com o mesmo número dos frascos entregues por cada paciente. b- Os dispositivos são distribuídos na bancada por ordem numeral crescente. 89 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO Pag.: 01/01 POP – 6 Revisão no: 02 Projeto: Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência Índice de Revisões Elaborado Aprovado Revisã Itens Revisados o Nome Data Visto Nome Data Visto 1 – OBJETIVO: Processamento das fezes 2- DEFINIÇÕES: Definir as etapas do procedimento para o correto processamento do material 3- DESCRIÇÃO: 3.1- ROTINA DE TRABALHO: 3.1.1- Passo a passo do E1 QUICK-PREP a- Gire somente a tampa dosadora amarela em sentido anti-horário. b- Remova a tampa amarela puxando para cima. c- Insira a ponta da tampa amarela na amostra a uma profundidade de 1 cm (todos os entalhes devem ser preenchidos com as fezes) d- Remova da amostra. e- Insira a tampa dentro do tubo até o fim do cone azul e feche o tubo girando a tampa até travar. f- Agite o tubo. g- Extraia por 10 minutos. h- Misture novamente. i- Gire o cone azul em sentido anti-horário, então puxe-o para cima até ouvir o estalido de abertura. j- Remova o cone azul com a tampa acoplada do tubo k- Após decantação das partículas, dilua a amostra extraída em 1:70 (10 µL de amostra extraída + 700 µl de tampão de lavagem). l- Essas amostras podem ser armazenadas no laboratório por até 1 ano a -20°C. 90 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO Pag.: 01/01 POP – 6 Revisão no: 02 Projeto: Avaliação da Insuficiência Pancreática Exócrina pela medida da Elastase1 Fecal em pacientes com Fibrose Cística acompanhados em um Centro de Referência Índice de Revisões Elaborado Aprovado Revisã Itens Revisados o Nome Data Visto Nome Data Visto 1 – OBJETIVO: Preparo da leitura pelo Método ELISA 2- DEFINIÇÕES: O kit (SCHEBO ELASTASE PANCREÁTICA1) é indicado para determinação quantitativa dos níveis de elastase pancreática 1 em fezes. 3- DESCRIÇÃO: 3.1- ROTINA DE TRABALHO: 3.1.1Procedimentos para leitura de ELISA: 1- Pipete 50 μL de cada amostra diluída dentro do poço correspondente em duplicata, e controle. 2- Incube por 30 minutos em temperatura ambiente. 3- Lavagem: Deve ser realizado 3 ciclos de 250 μL/poço). 4- Adicione 50 μL/poço de conjugado. 5- Incube por 15 minutos no escuro, em temperatura ambiente. 5- Lavagem 6- Adicione 100 μLde solução de substrato em cada poço. 7- Incube por 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. 8- Adicionar 100 μL de solução de parada e agite suavemente para misturar os reagentes. 9- Leia a densidade óptica a 405 nm ou em leitora de placas entre 5 e até 30 minutos após a adição da solução de parada. 91 ANEXOS Anexo1:Consenso para o diagnóstico de Fibrose Cística : Características compatíveis com diagnóstico de FC: 1. Doença pulmonar ou sinusal crônica, manifestada por: a. colonização/infecção persistente por germes típicos da FC, incluindo Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza não classificado, Pseudomonas aeruginosa mucóide e não mucóide , Stenotrophomonas maltophilia Burkhoderia cepacia. b. tosse crônica e produtiva. c.anormalidades persistentes na radiografia de tórax (ex. bronquiectasias, atelectasias, infiltrados e hiperinsuflação). d. obstrução de vias aéreas, manifestada por chiado e. pólipos nasais; radiografia ou tomografia computadorizada de seios paranasais. f. baqueteamento digital. 2. Anormalidades nutricionais e gastrointestinais, incluindo: a. Intestinal: íleo meconial, síndrome de obstrução intestinal distal, prolapso retal. b. Pancreática: insuficiência pancreática, pancreatite aguda recorrente, pancreatite crônica, pâncreas com imagem anormal. c. Hepática: icterícia neonatal prolongada, doença hepática crônica com evidencias clinicas ou histológicas de cirrose biliar focal ou cirrose multilobular. d. Nutricional: failure to thrive (desnutrição protéico-calórica), hipoproteinemia e edema, complicações secundárias a deficiência de vitaminas lipossolúveis. 3. Síndromes de perda de sal: depleção aguda de sal, alcalose metabólica crônica. 4. Anormalidades genitais no sexo masculino, resultando em azoospermia obstrutiva. 92 Anexo2: Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ENVOLVENDO SERES HUMANOS Instituto Fernandes Figueira FIOCRUZ Título do Projeto de Pesquisa: Avaliação da insuficiência pancreática exócrina pela medida da elastase1 fecal em pacientes com fibrose cística acompanhados em um centro de referência. CAEE: 0049.0.008.000-09 Folha de Rosto: 269332 Registro no CEPIFF: 0049/09 Aprovado em: 15/07/2009
