Ações da Angiotensina-(1-7) na proliferação de
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA – UFPB CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA – CCEN CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Ações da Angiotensina-(1-7) na proliferação de cardiomiócitos neonatais Katyana Kaline Silva Ferreira Orientador: Prof. Dr. Enéas Ricardo de Morais Gomes Co-orientador: Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo João Pessoa – 2015 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA – UFPB CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA – CCEN CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Ações da Angiotensina-(1-7) na proliferação de cardiomiócitos neonatais KATYANA KALINE SILVA FERREIRA Orientador: Prof. Dr. Enéas Ricardo de Morais Gomes Co-orientador: Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo Monografia apresentada ao Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas (Trabalho Acadêmico de Conclusão de Curso), como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas. João Pessoa – 2015 Catalogação na publicação Universidade Federal da Paraíba Biblioteca Setorial do CCEN Josélia M. O. Silva - CRB15/nº113 F383a Ferreira, Katyana Kaline Silva. Ações da Angiotensina-(1-7) na proliferação de cardiomiócitos Neonatais / Katyana Kaline Silva Ferreira. - João Pessoa, PB, 2015. 47p. : il. : color. Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal da Paraíba. Orientador: Prof. Dr. Enéas Ricardo de Morais Gomes. Coorientador: Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo. Inclui referências. 1. Cardiomiócitos neonatais. 2. Proliferação de cardiomiócitos. 3. Angiotensina-(1-7). I. Título. UFPB/BS-CCEN CDU 616.12(043.2) Aos meus pais, Kátia e Marcos, e aos meus avós maternos, José Antônio “in memorian” e Maria das Neves, por terem me incentivado e despertado o interesse em fazer um curso superior, pois, sem eles eu não teria conseguido realizar esse sonho que é tão meu, quanto deles. Dedico Agradecimentos Primeiramente à Deus, por ter me concebido sabedoria, paciência e calma em todo o caminho percorrido até aqui, nos momentos estressantes, de pressão, de nervosismo... Aos meus pais, Kátia e Marcos, por sempre terem me incentivado e me darem o maior apoio para que eu cursasse o que eu gosto, por terem feito de tudo por mim para que eu concluísse minha graduação e por terem me gerado, sem eles eu não teria chegado até aqui. Ao meu Orientador Enéas, por ter me acompanhado na realização dos experimentos, na elaboração da monografia, por estar sempre à disposição em ajudar no que fosse preciso, por me passar conhecimento sobre a linha de pesquisa e me incentivar a seguir no meio científico. Por todos os momentos de descontração no laboratório (foram muitos!!! Rs)... e por ter me mostrado a coisa mais linda que é um cardiomiócito contraindo!!! Viva ao acoplamento excitação-contração do coração!!! Ao meu Co-orientador Demetrius, por ter me recebido tão bem no laboratório e ter me incentivado a seguir no meio científico. E por ter nos cedido espaço no laboratório para execução dos experimentos e sempre estar à disposição para me tirar dúvidas e ajudar no que fosse preciso. Aos professores do curso de Ciências Biológicas, por terem me passado um pouco de conhecimento em cada disciplina, mas que foi suficiente para a minha formação como Bióloga. E por terem me mostrado o quanto a Ciência da vida é linda e necessita cada vez mais ser estudada. Ao pessoal do Laboratório de Biotecnologia Celular e Molecular – LBCM, por terem me acolhido tão bem no laboratório, por todas as comemorações de aniversários e datas especiais, que sempre nos uniram e por todos os amigos que fiz por lá, em especial Bruna Braga, Aliny Vasconcelos, Paulo Victor, Andrezza Miná e André Monteiro, por terem acompanhado minha correria nos experimentos, nos estresses... por se disporem sempre a me ajudar no que fosse preciso e por todas as manhãs e tardes de descontração dentro e fora do laboratório. A minha amiga Karla Lima por ter me incentivado mais do que ninguém nessa reta final da elaboração dessa monografia. Por me escutar em todos os meus momentos de estresse com os experimentos que não davam certo, meus desânimos, minhas dúvidas, meus cansaços... e sempre estar por perto, me incentivando, dando opinião, tentando me acalmar e me dar ânimo para continuar, e me distrair um pouquinho, porque ninguém é de ferro!!! A todos os meus verdadeiros amigos do Ensino Médio, em especial Rhayne Helen, Gabriela Freitas e Débora Thyares por terem entendido minha ausência nos encontros, comemorações e afins, por estar estudando para provas, apresentações, elaboração de projetos... por terem me proporcionado boas recordações dos velhos tempos e ótimos momentos de descontração nos encontros que foram possíveis, e por terem me incentivado a seguir em frente e terminar meu curso. Aos colegas de curso por terem compartilhado conhecimentos ao longo desses 4 anos de curso e por todos os trabalhos em dupla, trio... que sempre nos estressaram, mas que no final dava tudo certo. A todos os amigos que ganhei durante a graduação, pela troca de conhecimento, pelas conversas jogadas fora entre uma aula e outra, pela companhia nas esperas das filas do RU... pelos momentos de descontração dentro e fora da universidade... Ao CNPq/UFPB pelo apoio financeiro dos projetos de Iniciação Científica dos quais participei. RESUMO As doenças cardiovasculares (DCVs) são as principais causas de morte por doenças não transmissíveis em todo o mundo e apesar dos grandes avanços na terapia das DCVs, elas continuam sendo as principais responsáveis por mortes no mundo, se tornando um grande problema de saúde pública. O infarto do miocárdio (IM) é a causa mais comum das lesões cardíacas, resultando na perda de um grande número de células musculares cardíacas (cardiomiócitos) e comprometendo a função miocárdica. Uma maneira de reverter esse comprometimento seria através da proliferação de cardiomiócitos na área lesada, ocasionando a regeneração cardíaca. Estudos demonstraram que a Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], um peptídeo endógeno biologicamente ativo do Sistema Renina-Angiotensina, possui ações cardioprotetoras e uma possível indução da proliferação de cardiomiócitos, porém ainda desconhecida. Com isso, o objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito da Ang-(1-7), na proliferação de cardiomiócitos e regeneração cardíaca de ratos neonatos. Para isso, foram utilizados ratos neonatos de 1-2 dias de vida, onde os corações foram retirados e os cardiomiócitos neonatais isolados por método enzimático, em seguida, os mesmos foram mantidos em cultura e tratados com a Ang-(1-7). Através da imunofluorescência e contagem de células em cultura, observou-se uma porcentagem significativa de células binucleadas e apresentando núcleos em divisão, e um aumento de mais de 100% no número de células tratadas com a Ang-(1-7) por 48 horas comparado ao grupo controle. Além disso, a inibição farmacológica do receptor intracelular da Ang-(1-7), o receptor Mas, e de enzimas demonstradas como essenciais para os efeitos cardioprotetores da mesma, NO sintase e guanilato ciclase, inibiu o efeito proliferativo causado pela Ang-(1-7). A partir dos nossos resultados concluímos que a Ang-(1-7) é um potencial estimulador da proliferação de cardiomiócitos neonatais em cultura e que este efeito também é dependente da ativação do receptor Mas e da via NO/cGMP, sendo atribuído mais um efeito cardioprotetor à Ang-(1-7). Palavras-chaves: proliferação de cardiomiócitos, cardiomiócitos neonatais, Angiotensina-(17). ABSTRACT Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading causes of death from Noncommunicable diseases worldwide and despite major advances in the therapy of CVDs, they remain the major causes of death in the world, becoming a major public health problem. Myocardial infarction (MI) is the most common cause of cardiac injuries resulting in loss of a large number of cardiac muscle cells (cardiomyocytes) and impairment of myocardial function. A solution to repair this compromised region could be cardiomyocyte proliferation in the injured area, resulting in cardiac regeneration. Studies have demonstrated that Angiotensin - (1-7) [Ang- (1-7)], a biologically active endogenous peptide from the Renin-Angiotensin System, has cardioprotective actions and a possible induction of cardiomyocyte proliferation, but still unknown. Thus, the objective of this study was to investigate the effect of Ang- (1-7), in the proliferation of cardiomyocytes in neonatal rat. To this end, 1-2 days-old neonatal rats were used, the hearts were removed and cardiomyocytes from neonatal rats were isolated by an enzymatic method. Then, they were maintained in culture and treated with Ang- (1-7). Using techniques such as immunofluorescence and cell counts in culture, we observed a significant percentage of binucleated with and cell with nuclei in division (100% increase) in the group treated with Ang- (1-7). As well, it was possible to observe an increase of more than 100% in the number of cells per field of view in the group treated with Ang- (1-7) for 48 hours when compared to the control group. Furthermore, pharmacological inhibition of intracellular receptor Ang- (1-7), Mas receptors, as well as enzymes shown as essential for the cardioprotective effects of Ang-(1-7); NO synthase and guanylate cyclase inhibited the proliferative effect caused by Ang- (1-7). From our results we conclude that Ang- (1-7) is a stimulator of the proliferation potential of neonatal cardiomyocytes in culture, and this effect is also dependent of the activation of the Mas receptor and NO/cGMP pathway, a further cardioprotective effect to the Ang- (1-7). Keywords: cardiomyocyte proliferation, neonatal cardiomyocytes, angiotensin- (1-7). LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Ciclo celular. Complexos de ciclinas e CDKs envolvidas em cada fase do ciclo celular. Adaptado de Regula et al. (2004)..................................................................................18 Figura 2 - Progressão do ciclo celular. A. Fases do ciclo celular e suas ciclinas e CDKs específicas, e inibidores do ciclo celular. B. Formação de complexos, ativação e degradação de ciclinas. Adaptado de Takeuchi (2014)......................................................................................20 Figura 3 - Ilustração simplificada da cascata proteolítica de formação e de degradação dos principais peptídeos angiotensinérgicos biologicamente ativos. ECA – enzima conversora de angiotensina; NEP – endopeptidase neutra; PEP – Prolil-endopeptidase. Adaptado de Jessup e cols. 2008..................................................................................................................................22 Figura 4 - Ilustração simplificada da cascata proteolítica de formação da Angiotensina II e Angiotensina-(1-7), e suas principais ações nos seus principais receptores. ECA – enzima conversora de angiotensina; AT1 – Receptor para Angiotensina II do tipo I; Mas – Receptor Mas. Adaptado de: CASTRO, 2008..........................................................................................23 Figura 5 - Cardiomiócitos neonatais isolados após dissociação enzimática................................................................................................................................. 27 Figura 6 - Ang-(1-7) induz binucleação de cardiomiócitos neonatais em cultura. Gráfico de barras mostrando o percentual de células binucleadas. n= número de experimentos (em cada experimento o n de células foi de pelo menos 50 células por grupo). *=p< 0,05 em relação aos grupos controle e Ang II. As setas indicam os núcleos celulares....................................................................................................................................30 Figura 7 - Efeito proliferativo da Ang-(1-7) é bloqueado por inibidores do receptor Mas, NO sintases e guanilato ciclase. Gráfico de barras mostrando o percentual de células que apresentaram binucleação. n= número de experimentos (em cada experimento o n de células foi de pelo menos 50 células por grupo). *=p< 0,05 em relação ao grupo controle. As setas indicam os núcleos celulares...................................................................................................................31 Figura 8 - Efeito proliferativo de cardiomiócitos neonatais em cultura tratados com a Ang-(17) por 36 horas. O gráfico mostra a média do número de células por campo de visualização. CT= controle; n= número de experimentos (o n de células foi de pelo menos 50 campos por experimento); *= p < 0,05..........................................................................................................32 Figura 9 - Efeito proliferativo de cardiomiócitos neonatais em cultura tratados com a Ang-(17) por 48 horas. O gráfico mostra a média do número de células por campo de visualização. CT= controle; n= número de experimentos (o n de células foi de pelo menos 50 campos por experimento); *= p < 0,05..........................................................................................................33 Figura 10 - Efeito proliferativo da Ang-(1-7) por 48h em cardiomiócitos neonatais. Imagem representativa de microscopia confocal mostrando em verde a α-tubulina e em azul os núcleos. As setas brancas indicam núcles em divisão, indicando a estimulação da proliferação celular........................................................................................................................................33 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Ang I: Angiotensina I Ang II: Angiotensina II Ang-(1-7): Angiotensina-(1-7) Ang-(1-9): Angiotensina-(1-9) ANOVA: Análise de variância ARA-C: citosina β-D-arabinofuranosida AT1: receptor de angiotensina II tipo 1 AT2: receptor de angiotensina II tipo 2 A779: D-ala-Ang-(1-7) CAK: CDK ativadas por cinases CBiotec: Centro de Biotecnologia CDK: Cinase dependente de ciclina CEUA: Comissão de Ética em Uso Animal CO2: Dióxido de Carbono cGMP: Guanosina monofosfato CT: Controle DCVs: Doenças Cardiovasculares DNA: Ácido Desoxirribonucléico ECA: enzima conversora de angiotensina ECA2: enzima conversora de angiotensina 2 EPM: Erro Padrão da Média Eq: Equação EROs: Espécies Reativas de Oxigênio FCF: Fator de crescimento de fibroblastos HBSS: Solução Balanceada de Hank’s h: horas IM: Infarto do Miocárdio L-NAME: NG-nitro-L-arginine metil éster mL: Mililitros µg: Microgramas µM: Micromolar MgCl2: Cloreto de Magnésio M199: Medium 199 NaOH: Hidróxido de Sódio NO: Óxido Nítrico ODQ: 1H-1,2,4oxadiazolo4,2-aquinoxalin-1-one PBS: Tampão fosfato-salina PFA: Paraformaldeído PI3-K: Fosfatidil inositol 3-cinase Rb: Retinoblastoma rpm: rotações por minutos SBF: Soro Bovino Fetal SRA: Sistema Renina-Angiotensina UFPB: Universidade Federal da Paraíba UV: Ultravioleta °C: graus Célsius SUMÁRIO 1. INTRUDUÇÃO................................................................................................................13 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..................................................................................15 2.1 Doenças cardiovasculares.............................................................................................15 2.1.1 Infarto do Miocárdio...................................................................................15 2.2 Proliferação de Cardiomiócitos.....................................................................................16 2.2.1 Ciclo Celular em Cardiomiócitos................................................................17 2.3 Sistema Renina-Angiotensina – Angiotensina-(1-7).....................................................21 3. OBJETIVOS.....................................................................................................................25 3.1 Objetivo Geral...............................................................................................................25 3.2 Objetivos Específicos....................................................................................................25 4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................26 4.1 Isolamento de cardiomiócitos neonatais.......................................................................26 4.2 Plaqueamento, Cultura e tratamento dos cardiomiócitos neonatais com a Ang-(1-7) .......................................................................................................................................27 4.3 Contagem de células sob microscopia óptica................................................................28 4.4 Imunofluorescência.......................................................................................................28 4.5 Análises Estatísticas......................................................................................................29 5. RESULTADOS................................................................................................................30 6. DISCUSSÃO.....................................................................................................................34 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS..........................................................................................38 8. REFERÊNCIAS...............................................................................................................39 13 1. INTRUDUÇÃO As doenças cardiovasculares (DCVs) são as principais causas de morte por doenças não transmissíveis em todo o mundo, além disso, cerca de 80% das mortes causadas por DCVs ocorrem em países de baixa e média renda, o que se deve ao fato do menor acesso a programas de prevenção mais eficazes e a maior exposição a fatores de risco a que essa parte da população está exposta, tornando as DCVs um grande problema de saúde pública (OMS, 2013). Apesar dos grandes avanços na terapia das DCVs, elas ainda continuam sendo as principais responsáveis por mortes em todo o mundo (GO et al., 2008), sendo o infarto do miocárdio a causa mais comum das lesões cardíacas, que resulta na perda de um grande número de células musculares cardíacas (GONZALEZ-ROSA et al., 2011) e consequentemente comprometendo a função miocárdica, podendo levar a insuficiência cardíaca. No infarto do miocárdio as células da região infartada são perdidas, sendo substituídas por um tecido cicatricial fibroso, que tem como função fornecer suporte mecânico e prevenir a ruptura da parede do miocárdio, porém, essas alterações ocasionam mudanças na arquitetura e geometria ventricular do coração, chamada de remodelamento ventricular, que pode ter como consequência a insuficiência cardíaca (GONZALEZ et al., 2011). Uma forma de reverter esse comprometimento seria através da proliferação de cardiomiócitos na região infartada, havendo uma reposição dos cardiomiócitos perdidos. Até então se sabia que os cardiomiócitos perdiam sua capacidade proliferativa pouco tempo depois do nascimento (PASUMARTHI; FIELD, 2002), o que tornava este fator limitante para a regeneração cardíaca por meio da proliferação de cardiomiócitos. No entanto, atualmente algumas estratégias vêm sendo utilizadas para tentar estimular a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca, no intuito de prevenir ou até mesmo tratar casos de insuficiência cardíaca causada pela perda de cardiomiócitos (WANG et al., 2011). Estudos recentes mostraram que é possível estimular a proliferação de cardiomiócitos de mamíferos tanto neonatais, quanto adultos, in vivo e in vitro, e consequentemente levar a regeneração cardíaca. Isso foi observado em camundongos neonatais e adultos submetidos a intervenção cirúrgica e ativação de vias de proliferação de cardiomiócitos (PORELLO et al., 2011; KUHN et al., 2007; BERSELL et al., 2009). 14 Estudos recentes investigando os efeitos cardioprotetores de um peptídeo endógeno, biologicamente ativo do sistema renina-angiotensina, a angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)), demonstraram que esse peptídeo exerce ações protetoras diretamente no cardiomiócito (DIASPEIXOTO et al. 2008; GOMES et al. 2010), além de possivelmente induzir a proliferação dos mesmos, porém ainda não estudada. Além disso, esses efeitos cardioprotetores da Ang-(1-7) antagonizam os efeitos hipertensores da Angiotensina II (Ang II), conhecido como um dos principais peptídeos ativos nesse sistema, enquanto que os efeitos da Ang-(1-7) causam diminuição da pressão arterial, sendo ela considerada hipotensora (GOMES et al. 2010). Diante da ampla gama de ações cardioprotetoras da Ang-(1-7) e por ter um possível potencial na indução da proliferação de cardiomiócitos, este trabalho se propôs a investigar os efeitos da Ang-(1-7) na proliferação de cardiomiócitos neonatais, utilizando-se de técnicas de Biologia Celular e Molecular. 15 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 Doenças Cardiovasculares As doenças cardiovasculares são as principais causas de morte por doenças não transmissíveis em todo o mundo e além disso, cerca de 80% das mortes causadas por DCVs ocorrem em países de baixa e média renda. Isso se deve ao menor acesso aos programas de prevenção mais eficazes e aos fatores de risco a que essas classes sociais estão mais expostas, fatores estes como o tabagismo, sedentarismo, obesidade, alimentação pouco saudável, hipertensão e entre outros, tornando as DCVs um grande problema de saúde pública (OMS, 2013). Estima-se que dentre as 17,3 milhões de pessoas que morreram por doenças cardiovasculares em 2008, cerca de 7,3 milhões ocorreram por doença coronariana (OMS, 2013). A Doença coronariana é resultante da formação de placas de aterosclerose que acumulam-se nos vasos sanguíneos a ponto de diminuir ou até mesmo impedir a passagem do fluxo sanguíneo nos vasos. Quando este fluxo é interrompido ocorre um processo chamado de isquemia, onde há um bloqueio no suprimento de nutrientes e oxigênio no tecido que seria suprido por esse sangue podendo levar a morte do tecido. Quando este processo isquêmico ocorre no coração chamamos de infarto do miocárdio (SOCERJ, 2014). 2.1.1 Infarto do miocárdio Apesar dos grandes avanços na terapia das DCVs, as mesmas ainda continuam sendo as principais responsáveis por mortes em todo o mundo (GO et al., 2008), sendo o infarto do miocárdio (IM) a causa mais comum das lesões cardíacas, resultando na perda de um grande número de células musculares cardíacas (GONZALEZ et al., 2011) e comprometendo a função miocárdica (PASUMARTHI; FIELD, 2002), sendo esta perda na escala de um bilhão ou mais de miócitos, enquanto que outras cardiomiopatias causam uma perda menor (LAFLAMME; MURRY, 2005). Além do IM, outras doenças cardiovasculares envolvem grande perda de músculo cardíaco e são causas primárias da insuficiência cardíaca, que é caracterizada por débito cardíaco insuficiente e um maior risco de morte prematura por arritmia ou insuficiência contrátil (WANG et al., 2011). No infarto do miocárdio, a lesão ocasionada leva a perda de cardiomiócitos na região infartada e uma consequente ativação de uma resposta inflamatória, caracterizada por 16 infiltração de leucócitos na região infartada e remoção de restos celulares e células mortas da região, levando a uma subsequente substituição do tecido infartado por tecido cicatricial fibroso (LAFLAMME; MURRY, 2005), que apesar de não possuir a capacidade contrátil do tecido cardíaco, fornece inicialmente, suporte mecânico para a atividade de contração do coração e previne a ruptura da parede. Como consequência, essa substituição leva a uma condição chamada de remodelamento ventricular, que é o processo no qual ocorrem progressivas mudanças na arquitetura e geometria ventricular do coração, o que pode ocasionar em insuficiência cardíaca (GONZALEZ et al., 2011). Uma maneira de reverter o comprometimento causado pelos casos de IM seria através da proliferação de cardiomiócitos na área lesada, ocasionando uma reposição dos mesmos. Recentemente, algumas estratégias vêm sendo utilizadas para tentar estimular a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca, no intuito de prevenir ou até mesmo tratar casos de insuficiência cardíaca causada pela perda de cardiomiócitos (WANG et al., 2011). 2.2 Proliferação de cardiomiócitos Durante muito tempo acreditava-se que o coração era um órgão totalmente diferenciado e incapaz de se regenerar por meio da proliferação de cardiomiócitos, sendo o mesmo constituído de células pós-mitóticas, sem capacidade regenerativa (ZAK, 1974; KONSTAM, 2000). Até então, estudos mostravam que mamíferos na fase embrionária e neonatal inicial apresentavam cardiomiócitos com significativa capacidade proliferativa, porém, sendo perdida poucos dias após o nascimento (PASUMARTHI; FIELD, 2002), tornando este fator limitante para a regeneração cardíaca após lesão. Vários estudos têm demonstrado que existe a possibilidade de estimular os cardiomiócitos a se proliferarem e a regeneração cardíaca (GONZALEZ et al., 2011; WANG et al., 2011) (BERSELL et al., 2009; PORELLO et al., 2011; HEALLEN et al., 2011; KUHN et al., 2007; JOPLING et al., 2010; KIKUCHI et al., 2010; VAN AMERONGEN et al. 2010). Em estudos com anfíbios, por exemplo, foi demonstrado que eles são capazes de regenerar o coração completamente após uma lesão (OBERPRILLER; OBERPRILLER, 1974; NEFF; DENT; ARMSTRONG, 1996; FLINK, 2002). Estudos em peixes, como o peixe-zebra, também foi demonstrada essa capacidade regenerativa (GONZALEZ et al., 2011; WANG et al., 2011; JOPLING et al., 2010; KIKUCHI et al., 2010; POSS et al., 2002; RAYA et al., 2003), onde a regeneração cardíaca no peixe-zebra se dá sem a participação significativa de células tronco, 17 mas sim ocasionada por meio de cardiomiócitos diferenciados (JOPLING et al., 2010). Alguns estudos com substâncias que já haviam demonstrado ação proliferativa em outros tipos celulares, mostraram que o coração de mamíferos adultos possui uma grande capacidade de renovar cardiomiócitos isolados ou o coração a se proliferarem por meio da estimulação com periostina ou neuregulina 1 (KUHN et al., 2007; BERSELL et al., 2009), promovendo a regeneração cardíaca. Um outro estudo demonstrou que é possível estimular a proliferação de cardiomiócitos neonatais por meio de lesão do coração em camundongos de 1 dia de vida quando ressectado cerca de 15% da massa ventricular, sendo esta regeneração ocasionada por cardiomiócitos pré-existentes e restaurando a função cardíaca normal (PORELLO et al., 2011). 2.2.1 Ciclo celular em cardiomiócitos Segundo Regula et al. (2004) “A organogênese e renovação de células diferenciadas dependem de um equilíbrio delicado entre a proliferação e a morte celular”. Enquanto isso ocorre para a maioria das células, para cardiomiócitos e outros tipos celulares não ocorre o mesmo, pois, durante o período perinatal do desenvolvimento ocorre uma parada no ciclo celular, fazendo com que essas células percam sua capacidade proliferativa. No miocárdio, após essa saída do ciclo celular, prevalece a hipertrofia de cardiomiócitos como mecanismo principal de crescimento do miocárdio e para dar suporte ao aumento da atividade do coração e/ou compensar a perda de cardiomiócitos causada por cardiopatias (CLUZEAUT; MAURER-SCHULTZE, 1986; ZAK, 1974; HOLTZER et al., 1990 apud REGULA et al., 2004). A atividade do ciclo celular é um componente intrínseco da diferenciação cardíaca e morfogênese. Durante a fase inicial do desenvolvimento é observada uma alta taxa de atividade do ciclo celular, sendo essa atividade gradualmente diminuída durante as fases posteriores do desenvolvimento e consequentemente diminuindo também a taxa global de proliferação de cardiomiócitos. Culturas primárias enzimaticamente dispersas de cardiomiócitos fetais, neonatais e do coração adulto, têm sido amplamente utilizadas para a análise do ciclo celular (PASUMARTHI; FIELD, 2002). O ciclo celular de um modo geral é um conjunto ordenado de eventos, controlados por sinais internos e externos que resultam em produção de células-filhas, ou seja, proliferação celular (REGULA et al., 2004). O ciclo celular é composto por quatro fases 18 distintas (ALBERTS et al., 2010; TAKEUCHI, 2014): a fase G1 na qual ocorre o crescimento celular e a síntese de RNA e enzimas necessárias para a replicação do DNA na fase seguinte; a fase S, na qual ocorre a replicação do DNA, em seguida a fase G2 ocorrendo um segundo período de crescimento celular e síntese de proteínas e a fase M, fase na qual ocorre a mitose e a citocinese. Além dessas quatro fases principais, existe ainda uma fase chamada G0, onde a célula entra num estado de repouso ou estado quiescente (BICKNELL; COXON; BROOKS, 2007; ALBERTS et al., 2010; TAKEUCHI, 2014) entre a fase G1 e S, não entrando na fase S para dar continuidade a síntese de DNA e consequente divisão celular (Figura 1). Dependendo do tipo de célula e de fatores ambientais, a fase G0 pode variar desde dias a anos, ou até mesmo até a morte do organismo (ALBERTS et al., 2010), como no caso de cardiomiócitos onde a grande maioria entram nesta fase poucos dias após o nascimento e permanecem durante toda a vida em camundongos, embora em alguns estudos foram mostrados que a atividade do ciclo celular é detectável nos corações juvenis e adultos, porém, em um nível muito baixo (ZHU et al., 2009). Apesar dessa limitada capacidade proliferativa de cardiomiócitos adultos, até então não são totalmente compreendidos os eventos celulares e moleculares que impedem o coração de mamíferos de se recuperarem após lesão, embora se saiba que a perda dessa capacidade proliferativa ocorre devido a uma saída progressiva do ciclo celular (BICKNELL; COXON; BROOKS, 2007). Figura 1. Ciclo celular. Complexos de ciclinas e CDKs envolvidas em cada fase do ciclo celular. Adaptado de Regula et al. (2004). 19 Segundo Regula et al. (2004): A progressão do ciclo celular é controlada por um sistema complexo de proteínas que coordenam os eventos bioquímicos dentro da célula necessários para a divisão celular. Estas proteínas incluem ciclinas, proteínas cinases dependentes de ciclina (CDK), CDK ativadas por quinases (CAK), inibidores de CDK e membros da família Retinoblastoma (Rb) que agem em diferentes fases do ciclo celular. As ciclinas são a subunidade reguladora para a atividade das CDKs. Cada ciclina contém uma região chamada the cycling box, que está envolvido na ligação específica da CDK (KOBAYASHI, 1992 apud REGULA et al., 2004, p. 397). As CDKs são ativadas por meio da formação de complexos com ciclinas específicas, que em seguida fosforilam proteínas que servem como seu substrato para darem continuidade ao ciclo celular, sendo cada fase do ciclo relacionada com a síntese e degradação de ciclinas específicas (Figura 2) (TAKEUCHI, 2014). As ciclinas expressas contitutivamente na fase G1 são ciclina D1, D2, D3 e ciclina E que são necessárias para a entrada na fase S, as ciclinas do tipo D são continuamente expressas e fazem complexos com a CDK4 e CDK6, desempenhando um importante papel na transição da fase G0 para G1. A ciclina E é expressa mais tardiamente e forma complexo com a CDK2 promovendo a entrada na fase S. As ciclinas A e B são expressas durante as fases S, G2/M, sendo a formação do complexo ciclina A/CDK2 responsável pela síntese de DNA. A ciclina B começa a ser expressa na fase S, se acumula durante a fase G2 e forma complexo com a CDC2 (também chamada de CDK1). A ativação e desativação do complexo ciclina B/CDC2 regulam a entrada e saída da mitose (REGULA et al., 2004; TAKEUCHI, 2014). Além disso, a atividade dos complexos pode ser inibida pela ligação de inibidores de CDKs de duas diferentes famílias, a família INK4 (composta por p15, p16, p18 e p19) e a família Cip/Kip (p21, p27 e p57) (TAKEUCHI, 2014; BICKNELL; COXON; BROOKS, 2007; REGULA et al., 2004). 20 Figura 2: Progressão do ciclo celular. A. Fases do ciclo celular e suas ciclinas e CDKs específicas, e inibidores do ciclo celular. B. Formação de complexos, ativação e degradação de ciclinas. Adaptado de Takeuchi (2014). Em geral, como a atividade do ciclo celular é relativamente alta em cardiomiócitos embrionários, os reguladores positivos do ciclo celular são altamente expressos na fase embrionária, enquanto que no coração adulto, essa atividade é diminuída. Essa diminuição se deve à regulação negativa dos reguladores positivos do ciclo celular, sendo a expressão de genes reguladores negativos do ciclo celular aumentada nos corações adultos, onde a atividade do ciclo é quase inexistente (PASUMARTHI; FIELD, 2002). Segundo Takeuchi (2014) a regulação da proliferação de cardiomiócitos é importante para o desenvolvimento, função e regeneração cardíaca. Visto isso, Estratégias que visem estimular a retorno ao ciclo celular por meio do controle da expressão e regulação de reguladores do ciclo celular, levando consequentemente a regeneração cardíaca são de grande importância, uma vez que, as células em atividade proliferativa expressam altos níveis de diferentes ciclinas, como as ciclinas D1, A, E e B, proteínas cinases dependentes de ciclina, como as CDK2, CDK4, CDK6, e CDC2, e baixos níveis de inibidores (BROOKS et al., 1997; POOLMAN et al., 1998; LI; BROOKS, 1999 apud REGULA, 2004), sendo estes padrões alterados em células que não estão em atividade proliferativa, uma vez que, a saída do ciclo celular está associada com a baixa regulação de reguladores positivos do ciclo celular e indução de inibidores do ciclo celular (PASUMARTHI; FIELD, 2002; WALSH et al., 2010; POOLMAN et al., 1998; MACLELLAN, et al. 2005 apud MAHMOUD et al., 2013). Um estudo recente mostrou que o fator de transcrição Meis1 além de ser requerido para o desenvolvimento cardíaco normal (PAIGE et al., 2012; WAMSTAD et al., 2012 apud MAHMOUD et al., 2013), é um regulador crítico do ciclo celular em cardiomiócitos 21 (MAHMOUD et al., 2013). Neste estudo foi demonstrado que a deleção do Meis1 em camundongos estimula a proliferação de cardiomiócitos neonatais e reativa a mitose de cardiomiócitos em corações adultos, sendo esta deleção, não deletéria para a função cardíaca, uma vez que, a deleção do mesmo não altera a função cardíaca normal; não interefere nas características fenotípicas do coração, como peso e tamanho; aumenta a taxa de proliferação de cardiomiócitos mononucleados; não altera a taxa de apoptose e entre outros efeitos, sendo o Meis1 considerado um fator de transcrição crítico na proliferação de cardiomiócitos e um importante alvo terapêutico para a regeneração cardíaca (MAHMOUD et al., 2013). Dessa forma, a intervenção terapêutica diretamente no ciclo celular por meio de alterações na expressão de reguladores do ciclo celular podem ser eficazes na estimulação e consequente ativação da proliferação de cardiomiócitos. 2.3 Sistema Renina-Angiotensina – Angiotensina-(1-7) O Sistema Renina-Angiotensina (SRA) é um importante sistema que está envolvido na manutenção da homeostase cardiovascular, estando ele relacionado com doenças cardiovasculares, doenças coronarianas, miocardites e insuficiência cardíaca (DOSTAL; KENNETH, 1999). Apesar de ter sido reconhecido por muito tempo como um sistema endócrino, diversos estudos já demonstraram funções autócrinas e parácrinas desse sistema, tendo ele ações em diversos tecidos e órgãos (DZAU, 1988; LINDPAINTNER et al., 1990; DZAU, 1993; RUZICKA; LEENEN, 1997; WOLLERT; DREXLER, 1999). As ações cardiovasculares do SRA estão relacionadas com os seus receptores angiotensinérgicos AT1 e AT2 (receptor de angiotensina II do tipo 1 e 2) distribuídos em diversos tecidos e órgãos, conferindo múltiplos efeitos quando ativados principalmente pela Ang II (SANTOS; CAMPAGNOLE-SANTOS; ANDRADE, 2000). O SRA tem como principais componentes efetores a Ang II e a Ang-(1-7) (Figura 3), ambos são peptídeos biologicamente ativos do sistema e possuem ações fisiológicas antagônicas no sistema cardiovascular (MACHADO et al., 2000; KOSTENIS et al., 2005), “com a Ang-(1-7) contra-balanceando ações biológicas da Ang II” (GOMES, 2011). A Ang II é formada a partir de uma cascata de reações enzimáticas, sendo inicialmente o angiotensinogênio o hormônio que sofre clivagem enzimática pela renina para a formação da Angioensina I (Ang I), em seguida, a Ang I sofre ação da enzima conversora de angiotensina (ECA) para consequente formação da Ang II. Além disso, a Ang II assim como a Ang I podem sofrer ação de outras enzimas e darem origem a peptídeos menores que também possuem ações 22 nesse sistema, controlando e regulando os efeitos cardiovasculares causados pelas mesmas. Um exemplo é a enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2), uma carboxipeptidase que cliva a Ang I em Angiotensina-(1-9) e a Ang II em Angiotensina-(1-7), além disso, a Ang-(1-9) também pode sofrer ação da ECA e ser convertida em Ang-(1-7) (CRACKOWER et al., 2002). Angiotensinogênio Renina Ang I PEP, NEP ECA 2 Ang II AT2 Ang-(1-12) NEP ECA ECA 2 ECA AT1 ? Ang-(1-9) ECA Ang-(1-7) Mas Figura 3: Ilustração simplificada da cascata proteolítica de formação e de degradação dos principais peptídeos angiotensinérgicos biologicamente ativos. ECA – enzima conversora de angiotensina; NEP – endopeptidase neutra; PEP – Prolil-endopeptidase. Adaptado de Jessup et al. (2008). A Ang II é um octapeptídeo que em estudos recentes tem demonstrado ações hipertensoras e deletérias no remodelamento cardíaco quando ligado ao receptor AT1, sendo estas ações vasoconstritoras, aumento na retenção de sódio, mitogênico, efeito proliferativo, fibrótico, hipertrófico, arritmogênico, e entre outros (Figura 4). Já quando ligada ao receptor AT2, a Ang II promove efeitos antagônicos como vasodilatador, inibidor da proliferação celular e indução de apoptose (TSUTSUMI et al., 1999; STOLL et al.,1995; TANAKA et al., 1995), porém, esses efeitos via receptor AT2 ainda são controversos (CASTRO, 2008). Já a Ang-(1-7) é um heptapeptídeo que tem demonstrado ações cardioprotetoras antagônicas aos efeitos da Ang II, sendo estas ações vasodilatadora, anti-hipertrófica, antiarrítmica, antifibrótica, antiproliferativa em fibroblastos e antihipertensiva, entre outros (Figura 4). A Ang-(1-7) se liga ao receptor Mas, um receptor acoplado a proteína G (SANTOS 23 et al., 2003) e/ou possivelmente outro subtipo de receptor (SILVA et al., 2007). Um conjunto de estudos apontam a Ang-(1-7) como um peptídeo do SRA que tem como principais alvos o coração e os vasos sanguíneos e melhorando a função cardíaca (CASTRO, 2008). Dessa forma, por terem sido observados diversos efeitos benéficos e antagônicos aos efeitos deletérios da Ang II quando em níveis acima dos normais no sistema cardiovascular, a Ang-(1-7) se tornou um importante alvo de estudos recentes (PAUL et al., 2006; FERRARIO et al., 1997; SANTOS et al., 2000). Figura 4: Ilustração simplificada da cascata proteolítica de formação da Angiotensina II e Angiotensina(1-7), e suas principais ações nos seus principais receptores. ECA – enzima conversora de angiotensina; AT1 – Receptor para Angiotensina II do tipo I; Mas – Receptor Mas. Adaptado de: CASTRO, 2008. Estudos desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa, investigando efeitos cardioprotetores da Ang-(1-7), demonstraram que esse peptídeo exerce ações protetoras diretamente no cardiomiócito através da produção de óxido nítrico (NO). Também foi demonstrado que a via da fosfatidil inositol-3 cinase (PI3-K), uma via já conhecida em outros estudos por estar envolvida na proliferação de cardiomiócitos, é estimulada pela Ang-(1-7) e é passo limitante na produção de NO induzida pela Ang-(1-7) (DIAS-PEIXOTO et al., 2008; GOMES et al., 2010). Além disso, já é bem demonstrado na literatura que a Ang-(1-7) antagoniza a via das MAP quinases (GALLAGHER; FERRARIO; TALLANT, 2008; YAMAMOTO et al., 2006; TALLANT; FERRARIO; GALLAGHER, 2005), onde foi demonstrado que dependendo do estímulo do fator de crescimento de fibroblastos (FCF) a inibição das MAP quinases potencializa a atividade proliferativa dos cardiomiócitos. 24 Sendo assim, podemos dizer que, em conjunto, as vias ativadas e antagonizadas pela Ang-(1-7) nos faz colocá-la como um grande alvo de estudo para a ativação da proliferação de cardiomiócitos, uma vez que ela ativa uma via que tem sido demonstrada como crucial para a ativação desse processo (via da PI3-K) e inibe uma via que pode inibir o processo de proliferação de cardiomiócitos, a via das MAP quinases. 25 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Avaliar os efeitos da Angiotensina-(1-7) na proliferação de cardiomiócitos e regeneração cardíaca de ratos neonatos. 3.2 Objetivos Específicos Verificar se a Ang-(1-7) promove a proliferação de cardiomiócitos neonatais em cultura; Identificar a via de sinalização ativada pela Ang-(1-7) no processo de proliferação de cardiomiócitos neonatais. 26 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Isolamento de cardiomiócitos neonatais Foram utilizados ratos Wistar neonatos de 1-2 dias de vida, provenientes do Biotério Prof. Thomas George (CBiotec – UFPB). O uso dos ratos foi devidamente autorizado pelo Comitê de Ética em Uso Animal (CEUA) da UFPB, por meio de aprovação do projeto com número de certidão CEUA 0204/13. Todos os experimentos foram realizados in vitro e para cada preparação de células foram utilizados de 12-15 ratos neonatos. Os ratos foram eutanasiados por decaptação, e em seguida era feita toracotomia os corações eram retirados e colocados em Solução Balanceada de Hank’s (HBSS) (pH 7,4 ajustada com NaOH) mantida em gelo, para que se pudesse manter os corações em solução nutritiva e diminuir a atividade de contração dos mesmos. Em seguida, eram feitas limpezas e cerca de 6 lavagens dos corações em HBSS para retirada do excesso de sangue, coágulos e tecidos conectivos. Após lavagens os mesmos eram picotados e transferidos para um tubo contendo a enzima tripsina 0,05% diluída em HBSS, para que se pudesse dar início a digestão do tecido e esse tubo era mantido homogeneizando a 4°C over night. No dia seguinte, era adicionado no tubo soro bovino fetal (SBF) para que ocorresse inativação da tripsina, em seguida, dava-se continuidade ao processo de digestão enzimática através da adição de uma solução contendo a enzima Colagenase Tipo II (0,33 mg/ml) diluída em meio L-15 e o tubo era mantido em banho maria a 37°C por 30-40 minutos, homogeneizando-se a cada 5 minutos. Após a digestão enzimática em banho maria, era feita uma dissociação mecânica a temperatura ambiente (25°C), em câmara de fluxo laminar com o auxílio de uma pipeta sorológica estéril, fazendo-se várias homogeneizações até que o tecido se apresentasse dissociado. Em seguida, o conteúdo do tubo era filtrado em um outro tubo estéril, utilizando-se uma rede previamente irradiada com luz UV. Após filtração, o conteúdo do tubo era deixado em descanso por 40 min para que as células se recuperassem do estresse mecânico, e logo depois, era feita uma centrifugação a 3000 rpm por 5 min. Após centrifugação, o sobrenadante era descartado e as células isoladas (Figura 5) eram ressuspendidas em meio M199 suplementado com 10% de SBF, 100 unidades/ml de penicilina e 100 unidades/ml de estreptomicina, como descrito por Guatimosim et al. (2001). 27 Figura 5: Cardiomiócitos neonatais isolados após dissociação enzimática. Fonte: http://www.cellutron.com/cell_service.html 4.2 Plaqueamento, Cultura e tratamento de cardiomiócitos neonatais com a Ang(1-7) Antes do plaqueamento final dos cardiomiócitos, as células isoladas eram préplaqueadas em garrafas para cultura T-75 por 2h em estufa de CO2 (5%) a 37°C, para a remoção dos fibroblastos, pois os mesmos aderem ao plástico mais rapidamente do que os cardiomiócitos. Após o este período, apenas o sobrenadante era coletado e a partir daí era feita a contagem dos cardiomiócitos neonatais em Câmara de Neubauer para determinar a concentração de células isoladas. Para determinar a concentração foi utilizada a Equação. (1), onde a concentração de células/mL é igual ao número total de células distribuídas nos quadrantes contados, dividido pelo número de quadrantes, onde foram considerados 4 quadrantes, multiplicado pelo fator de diluição, onde utilizamos o fator 10 e multiplicado por 104 (fator de correção da câmara). Equação (1) Concentração de células/mL = N° total de células x fator de diluição x 10.000 N° de quadrantes Determinada a concentração, as células eram plaqueadas em diferentes placas para cultura em diferentes concentrações, dependendo do experimento a ser realizado e incubadas em estufa de CO2 (5%) a 37°C em atmosfera úmida por 24-48 horas para que ocorresse a aderência dos cardiomiócitos. Após aderência, o meio era trocado para retirada de células mortas, debris celulares e remanescentes de hemácias provindas do isolamento e adicionava-se 28 meio M199 suplementado com 10% de SBF, 100 unidades/ml de penicilina e 100 unidades/ml de estreptomicina. Em seguida, a cultura era tratada com 20µg/ml de Citosina β-Darabinofuranosida (ARA-C) por 24-48 horas para inibir o crescimento de fibroblastos à cultura, uma vez que o ARA-C é incorporado no DNA inibindo a replicação do DNA por formar complexos de clivagem com a topoisomerase I, que resulta na fragmentação do DNA, porém o mesmo não inibe a síntese de RNA, diminuindo a população de fibroblastos. Passado esse período de tratamento, o meio era trocado novamente e a partir daí dava-se início ao tratamento com a Ang-(1-7). Os cardiomiócitos isolados eram mantidos em cultura em placas de 6 poços e 96 poços em estufa de CO2 (5%) a 37°C em atmosfera úmida, sendo utilizado o meio M199 suplementado com SBF 10%, 100 unidades/ml de penicilina e 100 unidades/ml de estreptomicina para cultivo dos mesmos. Para análise dos efeitos da Ang-(1-7) na proliferação de cardiomiócitos neonatais, os mesmos foram tratados com a Ang-(1-7), sendo adicionada a Ang-(1-7) a cada 12 horas por 48 horas na concentração de 10µM. 4.3 Contagem de células sob microscopia óptica Para avaliar a proliferação de cardiomiócitos neonatais em cultura, foi uttilizado o método e contagem de células sob microscopia óptica, onde tanto as células controle, quanto as células tratadas com a Ang-(1-7) foram fixadas e corados com o reagente Panótico Rápido, marcando o citosol e núcleo das células de vermelho e azul, respectivamente. Após coloração eram preparadas lâminas e levadas para o microscópio óptico para serem analisadas. Para cada lâmina, as células eram contadas em 20 campos de visualização diferentes e foi feita a média entre eles para representar o número de células. 4.4 Imunofluorescência Os cardiomiócitos foram fixados em paraformaldeído (PFA) 4% e permeabilizados com triton X-100 0.5%. Para marcação do citoesqueleto especificamente de miócitos foi utilizado um anticorpo contra a α-actinina e um anticorpo contra a α-tubulina, e anticorpos secundários anti-camundongo conjugados a Alexa Flúor-488 ou Alexa 633 (Molecular Probes). Para a marcação nuclear utilizou-se o DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). As imagens 29 foram feitas em microscopia de fluorescência, processadas e analisadas no software ImageJ (NIH). 4.5 Análises estatísticas Para os resultados de proliferação de cardiomiócitos neonatais, os dados foram apresentados na forma de média ± EPM e para comparação entre os grupos foram utilizados o teste t de Student e ANOVA de uma via. Foram consideradas significativas diferenças apresentando valor de p < 0,05. 30 5 RESULTADOS Os cardiomiócitos neonatais possuem características peculiares, tais como uma morfologia estrelada e um único núcleo celular, sendo portanto, mononucleados. A binucleação em cardiomiócitos neonatais é uma característica que indica proliferação celular, uma vez que, a binucleação é um evento do ciclo celular que precede a citocinese, ou seja, divisão celular, dando origem a uma nova célula. Porém, em cardiomiócitos a binucleação também pode indicar diferenciação celular, uma vez que, grande parte dos cardiomiócitos diferenciados se apresentam binucleados. Quando avaliamos por meio da técnica de imunofluorescência a proliferação de cardiomiócitos neonatais em cultura tratados com a Ang-(1-7) por 36h, foi observado um aumento significativo na porcentagem de cardiomiócitos apresentando binucleação quando comparado ao grupo controle, sendo este aumento correspondente a 13,47% (30,01±3,89% vs 16,54±1,92%). Quando utilizamos a combinação de Ang-(1-7) e Ang II, também foi possível observar um aumento significativo na porcentagem de células binucleadas neste grupo quando comparado com o grupo controle, tendo um aumento correspondente a 9,8% (26,34±1,28 vs 16,54±1,92%). Além disso, a Ang II não alterou a porcentagem de células binucleadas e não interferiu no efeito da Ang-(1-7) (Figura 6). Este resultado nos indica uma possível estimulação da proliferação de cardiomiócitos induzida pela Ang-(1-7). Figura 6: Ang-(1-7) induz binucleação de cardiomiócitos neonatais em cultura. Gráfico de barras mostrando o percentual de células binucleadas. n= número de experimentos (em cada experimento o n 31 de células foi de pelo menos 50 células por grupo). *=p< 0,05 em relação aos grupos controle e Ang II. As setas indicam os núcleos celulares. Quando foram utilizados inibidores farmacológicos do receptor Mas (A779) (receptor de membrana da Ang-(1-7)), e das enzimas óxido nítrico sintases (L-NAME) e guanilato ciclase (ODQ), que já foram demonstrados como moléculas essenciais para a resposta protetora da Angiotensina-(1-7) em cardiomiócitos (GOMES et al. 2010), observamos que houve inibição do aumento de células binucleadas (Ang-(1-7)= 30,01±3,89% vs Ang-(1- 7)+A779=19,07±2,99%; Ang-(1-7)= 30,01±3,89% vs Ang-(1-7)+L-NAME=16,08±3,62%; Ang-(1-7)= 30,01±3,89% vs Ang-(1-7)+ODQ=17,18±3,10%), indicando inibição da estimulação da binucleação pela Ang-(1-7) em cardiomiócitos quando a sua via de sinalização intracelular está inibida (Figura 7). Este resultado nos indica que o efeito estimulador da Ang(1-7) é dependente da ativação do receptor Mas e da via da NO/cGMP. . CT Ang-(1-7) Ang-(1-7) +A779 Ang-(1-7) +L-NAME Ang-(1-7) +ODQ α-actinina DAPI Sobreposição Figura 7: Efeito proliferativo da Ang-(1-7) é bloqueado por inibidores do receptor Mas, NO sintases e guanilato ciclase. Gráfico de barras mostrando o percentual de células que apresentaram binucleação. n= número de experimentos (em cada experimento o n de células foi de pelo menos 50 células por grupo). *=p< 0,05 em relação ao grupo controle. As setas indicam os núcleos celulares. 32 Para confirmar se estava havendo proliferação de cardiomiócitos realizamos experimentos de contagem de células em cultura tratadas com a Ang-(1-7), onde foi observado que há uma estimulação da proliferação de cardiomiócitos neonatais quando essas células eram tratadas por 36 horas com a Ang-(1-7), havendo um aumento significativo de 36,14% no número de células por campo de visualização quando comparado ao controle (Figura 8). Quando as células foram tratadas por 48 horas houve um aumento ainda maior, sendo observado aumento de 138,68% no número de células por campo de visualização com relação as células controle (Figura 9). Esses resultados nos mostram que a Ang-(1-7) estimula a proliferação de cardiomiócitos neonatais em cultura, confirmando o potencial indutor da proliferação de 5 * 4 3 2 1 n=3 n=3 ng -(1 -7 ) A C T -3 -3 6h 0 6h nº de células por campo cardiomiócitos observado em estudos realizados com a Ang-(1-7) por nosso grupo de pesquisa. Figura 8: Efeito proliferativo de cardiomiócitos neonatais em cultura tratados com a Ang-(1-7) por 36 horas. O gráfico mostra a média do número de células por campo de visualização. CT= controle; n= número de experimentos (o n de células foi de pelo menos 50 campos por experimento); *= p < 0,05. 4 *** 3 2 1 n=3 n=3 ng -(1 -7 ) A C T -4 -4 8h 0 8h nº de células por campo 33 Figura 9: Efeito proliferativo de cardiomiócitos neonatais em cultura tratados com a Ang-(1-7) por 48 horas. O gráfico mostra a média do número de células por campo de visualização. CT= controle; n= número de experimentos (o n de células foi de pelo menos 50 campos por experimento); *= p < 0,05. Ainda nos experimentos de imunofluorescência visualizamos proteínas envolvidas na divisão celular, como a α-tubulina (corada em verde) e o núcleo dos cardiomiócitos (corado em azul), onde pudemos observar com frequência, núcleos passando pelo processo de divisão nuclear no grupo de células tratadas com Ang-(1-7) por 48 horas quando comparado com o controle (Figura 10), em detalhes, observa-se núcleos em divisão apresentando tubulina ao redor dos núcleos, apontados pelas setas. Estas divisões nucleares são mais um indício de que está ocorrendo proliferação celular. CT Ang-(1-7) Figura 10: Efeito proliferativo da Ang-(1-7) por 48h em cardiomiócitos neonatais. Imagem representativa de microscopia de fluorescência mostrando em verde a α-tubulina e em azul os núcleos. As setas brancas indicam núcleos em divisão, indicando a estimulação da proliferação celular. 34 6 DISCUSSÃO Apesar de muitos estudos realizados demonstrando os efeitos cardioprotetores da Ang(1-7), até então era desconhecido algum efeito proliferativo em cardiomiócitos causado pela mesma. O presente estudo demonstrou algumas evidências de que a Ang-(1-7) tem um grande potencial de estimular a proliferação de cardiomiócitos neonatais em cultura, o que em escala maior pode levar consequentemente à regeneração cardíaca. Este efeito proliferativo adiciona mais um efeito cardioprotetor causado pela Ang-(1-7). Assim como a Ang II, que em alguns estudos mostrou efeitos proliferativos em células musculares lisas (KATO et al., 1991) e em fibroblastos no coração (CRABOS et al., 1994; SUN et al., 1997; KAWANO et al., 2000; GONZALEZ et al., 2002; SHIVAKUMAR et al., 2003), a Ang-(1-7) possui efeito estimulador da proliferação de cardiomiócitos neonatais, sendo este um efeito benéfico para o coração, uma vez que, a proliferação de cardiomiócitos neonatais na regeneração do coração após lesão é bastante limitada em estágio pós-natal mais tardio e adulto (PORELLO et al., 2011), sendo ambas (Ang II e Ang-(1-7)) peptídeos biologicamente ativos do SRA que apesar de apresentarem efeitos antagônicos na função cardiovascular, a Ang II não interfere no efeito proliferativo da Ang-(1-7). Através da marcação do núcleo celular por imunofluorescência, foi demonstrado que a Ang-(1-7) aumentou a porcentagem de células binucleadas. Assim como, quando feita a marcação de proteínas envolvidas na divisão celular, como a α-actinina e α-tubulina, foi demonstrado que a Ang-(1-7) está causando a divisão nuclear, ou seja, cariocinese, um evento essencial da mitose que precede a citocinese. Esta afirmação de divisão nuclear, se dá pela observação de núcleos em divisão rodeados por α-tubulina, uma vez que, esse arranjo de αtubulina ao redor dos núcleos é essencial no processo de divisão celular. Contudo, esse resultado não nos indica se Ang-(1-7) está causando proliferação celular, pois, a divisão nuclear pode ocasionar em proliferação ou diferenciação celular de cardiomiócitos, uma vez que, os cardiomiócitos quando diferenciados se apresentam binucleados ou até mesmo multinucleados. Além disso, não foram observados cardiomiócitos em citocinese apresentando anel contrátil como um passo inicial da mesma, como demonstrado por Li et al. (1997) na proliferação de cardiomiócitos em cultura. A binucleação de cardiomiócitos pós-natais é conhecida em diversos mamíferos, ocorrendo em uma porcentagem final de cardiomiócitos binucleados de 80-90% em 35 camundongos e ratos. Além disso, a binucleação de cardiomiócitos em diferenciação ocorre por mitose sem citocinese (TAKEUCHI, 2014). Para saber se a Ang-(1-7) estava causando a proliferação de cardiomiócitos, nós realizamos contagens de cardiomiócitos em cultura tratados com a Ang-(1-7) e observamos que o número de células quando comparado ao controle aumentou significativamente em 36 horas de tratamento e duplicou quando essas células foram estimuladas por 48 horas, mostrando um enorme aumento no número de células e sendo esse aumento causado num curto período de tempo, o que nos indica que a taxa proliferativa é muito maior que a taxa de células em apoptose, porém não quantificada. Esse resultado nos mostra que a binucleação e divisão nuclear observada nos experimentos de imunofluorescência está levando a citocinese e consequentemente a proliferação celular. Estes resultados de contagem de células nos dão consistência em nossos dados, uma vez que em outros estudos, a contagem de células também foi utilizada para indicar proliferação celular, tanto pelo aumento de células em cultura, quanto pela contagem de células de tecido cardíaco recém dissociado, como mostrado no aumento de cardiomiócitos no coração quando causada deleção do fator de transcrição Meis1 (MAHMOUD et al., 2013) e quando induzida a proliferação de cardiomiócitos pela neuregulina (BERSELL et al., 2009). Em alguns estudos foram demonstrados que a proliferação de cardiomiócitos induzida pela deleção do fator de transcrição Meis1 e neuregulina1 foi ocasionada por uma maior proliferação de cardiomiócitos mononucleados, dessa forma, indicando que cardiomiócitos mononucleados possuem uma grande capacidade proliferativa (MAHMOUD et al., 2013; BERSELL et al., 2009), ou seja, cardiomiócitos indiferenciados, como no caso de cardiomiócitos neonatais, que são mononucleados antes de se diferenciarem terminalmente. A periostina e a neuregulina não induziram citocinese antes de 6 dias de estimulação (KUHN et al., 2007; BERSELL et al., 2009), ou seja, antes de 144 horas, diferente do que ocorreu com a estimulação da proliferação induzida pela Ang-(1-7), onde em 36 horas já foi possível observar um aumento significativo no número de células em cultura, nos levando a apontar a Ang-(1-7) como um peptídeo com grande potencial estimulador da proliferação de cardiomiócitos, visto que o mesmo induziu a proliferação num curto período de tempo. Diversos estudos mostraram que os efeitos protetores causados pela Ang-(1-7) no coração são mediados pelo receptor Mas (DIAS-PEIXOTO et al., 2008; GOMES, 2011). Além disso, também foi demonstrado recentemente que a via de sinalização da Ang-(1-7) em um de 36 seus efeitos cardioprotetores é dependente de NO e cGMP, como na resposta anti-hipertrófica causada pela Ang-(1-7) (GOMES, 2010). Neste estudo, mostramos que a inibição farmacológica do receptor Mas e das enzimas NO sintase e guanilato ciclase, que são enzimas essenciais da via NO/cGMP, inibiu o efeito proliferativo causado pela Ang-(1-7) em cardiomiócitos neonatais, efeitos similares aos ocorridos no trabalho de Gomes (2010), onde foi demonstrado que o efeito anti-hipertrófico causado pela Ang-(1-7) também é inibido quando seu receptor e as enzimas da via NO/cGMP são inibidos. Isto nos indica que o efeito proliferativo causado pela Ang-(1-7) também deve estar relacionado com a participação do receptor Mas, NO e cGMP. Além disso, já foi demonstrado em estudos do nosso grupo de pesquisa, que a Ang-(17) para causar seus feitos cardioprotetores ativa a via da PI3K, uma via já conhecida por estimular a proliferação de cardiomiócitos, tanto em cardiomiócitos derivados de células tronco embrionárias humanas em cultura (MCDEVITT; LAFLAMME; MURRY, 2005), quanto em cardiomiócitos estimulados pelo FCF, periostina e neuregulina em cultura e in vivo a reentrarem no ciclo celular (KUHN et al., 2007; BERSELL et al., 2009). Porém, estudos realizando a inibição farmacológica desta via necessitam ser realizados diretamente em cardiomiócitos para confirmar se o efeito proliferativo causado pela Ang-(1-7) também é dependente da ativação da PI3-K. A análise detalhada do ciclo celular também é de grande importância, para se saber se a ação da Ang-(1-7) está interferindo direta ou indiretamente em reguladores do ciclo celular, assim como, interferindo na expressão de seus componentes e se fatores externos, como fatores ambientais, também influenciam o efeito proliferativo da Ang-(1-7), como demonstrados em estudos recentes, onde foi mostrado que a alteração na expressão de reguladores do ciclo celular como o Meis1 interferem na parada do ciclo celular em cardiomiócitos (MAHMOUD et al., 2013); e estudos onde mostraram que o oxigênio ambiental interfere na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), muda o metabolismo glicolítico para metabolismo mitocondrial, favorecendo a produção de EROs, causando estresse oxidativo celular, que por sua vez, causam danos ao DNA que interferem na parada do ciclo celular em cardiomiócitos (KIMURA et al., 2014; PUENTE et al., 2014). Apesar da Ang-(1-7) ter mostrado uma capacidade de aumentar significativamente a proliferação em cardiomiócitos neonatais, nos resta saber se essa capacidade proliferativa também é significativa no coração adulto, uma vez que, a proliferação de cardiomiócitos 37 neonatais e regeneração cardíaca já é conhecida no estágio neonatal inicial (1-7 dias após nascimento), mas não após esse período após lesão cardíaca (PORELLO et al., 2011). Com isso, estudos analisando a proliferação de cardiomiócitos adultos sob estimulação da Ang-(1-7) também precisam ser realizados, uma vez que, o grande passo chave para a regeneração cardíaca é promover a proliferação de cardiomiócitos no coração adulto após lesão, como em casos de infarto do miocárdio. 38 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS Diante do exposto, nós concluímos que a Ang-(1-7) é um potencial estimulador da proliferação de cardiomiócitos neonatais em cultura, uma vez que a mesma proporcionou uma significativa proliferação de cardiomiócitos num curto período de tempo, sendo observada essa proliferação em apenas 36 horas de tratamento e ainda maior em 48h. Além disso, concluímos que o efeito proliferativo da Ang-(1-7) também está envolvido com a ativação de seu receptor intracelular, o receptor Mas, e é dependente da via NO/cGMP. Assim como foi mostrado em outros estudos que os efeitos cardioprotetores da Ang-(1-7) conhecidos são dependentes da ativação do receptor Mas e da via NO/cGMP, nossos dados nos levam a adicionar mais um efeito cardioprotetor à Ang-(1-7), a proliferação de cardiomiócitos, visto que estimular a proliferação de cardiomiócitos no coração e consequentemente a regeneração cardíaca, é um efeito benéfico para o mesmo, uma vez que, em condições de lesão cardíaca o coração é incapaz de se regenerar. Também destacamos a necessidade de investigar outros fatores que possam nos explicar melhor como se dá essa proliferação, investigando melhor o ciclo celular de cardiomiócitos sob efeito da Ang-(1-7), a expressão de proteínas envolvidas com o ciclo celular, como as ciclinas, CDKs, inibidores do ciclo celular e fatores de transcrição, bem como, investigar em cardiomiócitos adultos e no coração, se a Ang-(1-7) é capaz de causar esse efeito proliferativo e a regeneração cardíaca após lesão, podendo levar a Ang-(1-7) a ser um potencial peptídeo estimulador da proliferação utilizado na terapêutica das doenças cardiovasculares. 39 8 REFERÊNCIAS ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Tradução: Ana Letícia de Souza Vanz et al. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. BERSELL, K. et al. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. v. 138, p. 257-70, 2009. BICKNELL, K. A.; COXON, C. H.; BROOKS, G. 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