Texto Completo - Apresentação

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Curso de Mestrado em Nanociências
Fernanda Pés de Camargo
Inclusão de Sulfadiazina de Prata em β-Ciclodextrina
Santa Maria, RS
2011
4
Fernanda Pés de Camargo
Inclusão de Sulfadiazina de Prata em β-Ciclodextrina
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
Nanociências do Centro Universitário Franciscano
de Santa Maria como requisito parcial para
obtenção do título de Mestrado em Nanociências.
Orientadora: Profª. Drª. Solange Cristina da Silva Martins Hoelzel
Co-orientadora: Profª. Drª. Renata Rafffin
Santa Maria, RS
2011
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6
Ficha Catalográfica
C172i
Camargo, Fernanda Pés de
Inclusão de Sulfadiazina de prata em β-ciclodextrina /
Fernanda Pés de Camargo ; orientação Solange Cristina da
Silva Martins Hoelzel ; co-orientação Renata Rafffin – Santa
Maria, 2011.
62 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Nanociências) – Centro
Universitário Franciscano
1.Sulfadiazina de prata 2. β-ciclodextrina 3. Atividade
antimicrobiana I. Hoelzel, Solange Cristina da Silva Martins
II. Rafffin, Renata III. Título
CDU 615.262.1:62-181.4
Elaborada pela Bibliotecária Eunice de Olivera CRB10/1491
7
Dedico este trabalho, a minha mãe, meu exemplo de vida!
8
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela força que me deste durante esta difícil trajetória, para persistir apesar
dos desafios e adversidades, alcançando esta etapa de minha vida.
A minha mãe àquela que é minha fortaleza e refúgio, dedico e agradeço de todo o meu
coração esta conquista tão importante em minha vida, pelo incentivado, por acreditar mesmo
muitas vezes tendo muito medo de me deixar sozinhas neste trajeto para Santa Maria, mas
sempre me passando a lição que a vida é assim mesma, devemos ser independentes. Há
momentos em nossas vidas, que a única coisa de que precisamos, é poder olhar a nossa volta e
ver alguém que realmente se importa conosco e que simplesmente nos diga. "estou tão
orgulhoso de você... e não importa o que aconteça, sempre estarei ao seu lado te
apoiando." Mãe meu muito obrigada, estarás sempre junto de mim, pois deixou tua semente
aqui!
À minha querida amiga e colega Isabel Roggia, pela dedicação e competência em todas as
horas difíceis que encontrei, pelo carinho recebido sempre me apoiando. Obrigada!
A minha orientadora, Drª. Solange Cristina da Silva Martins Hoelzel, pela ajuda, apoio e
incentivo na realização deste mestrado.
A minha Co-orientadora: Profª. Drª. Renata Rafffin pela atenção dedicada sempre que
necessário.
Um agradecimento especial a minha família irmãs e sobrinhos que mesmo com todas as
dificuldades que passamos nestes dois anos, me deram força incentivo, me escutaram nas
horas de choro, mau humor, tristeza com o amor de vocês eu consegui. Amo vocês!
As minha minhas colegas de trabalho, Tere, Paulinha e Raquel pelo carinho e compressão
nesta minha etapa. Obrigada pelo ombro amigo. Valeu!
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RESUMO
A sulfadiazina de prata é o fármaco de escolha para tratamento de queimaduras por sua ação
cicatrizante, bem como pela sua ação antimicrobiana. Apresenta baixa solubilidade em água
e sofre oxidação quase total em apenas 12 h quando exposta a luz e umidade. A
ciclodextrina tem sido utilizada como uma alternativa para aumentar a solubilidade de
fármacos através da formação de complexo de inclusão. Este trabalho teve como objetivo
preparar, caracterizar e avaliar a atividade antimicrobiana frente a Pseudomonas aeruginosa
e Candida albicans do complexo de inclusão da Sulfadiazina de prata com β-ciclodextrina.
O método de preparação utilizado foi o da suspensão na razão molar 1:2 e caracterizado por
IV e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). A análise dos espectros IV demonstrou
que houve diminuição das bandas características do fármaco sugerindo que houve uma
interação da β-ciclodextrina com Sulfadiazina de Prata (SDAg). A formação do complexo de
inclusão foi confirmada pela análise de DSC, demonstrando pico endotérmico na faixa de
temperatura de 32,67 a 42,62°C, com ponto máximo em 42,31°C, caracterizando a
temperatura de fusão da amostra (Tm). A quantificação da SDAg complexada com βciclodextrina por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) variou de 11,32 a
17,66%. Os resultados obtidos pelo método microbiológico comprovam que a sulfadiazina
de prata complexada com β-ciclodextrina apresentou atividade frente a bactéria
Pseudomonas aeruginosa e a levedura Candida albicans, mostrando, assim, que o fármaco
incluso, mesmo com baixa concentração, foi capaz de inibir o crescimento dos
microrganismos testados.
Palavras-chave: Sulfadiazina de prata, β-ciclodextrina, atividade antimicrobiana.
10
ABSTRACT
Silver sulfadiazine is the drug of choice for treatment of burnings for its cicatrizing action as
well as for its anti microbial action. It presents low solubility in water and it suffers almost
total oxidation in 12 hours when displayed the light and humidity. Cyclodextrin has been used
as an alternative to increase the solubility of drugs by the formation of inclusion complexes.
This work had as objective to prepare, to characterize and to evaluate the anti microbial
activity front Pseudomonas aeruginosas e Candida albicans of the inclusion complex of the
Silver sulfadiazine with β-cyclodextrin. The used method of preparation was of the
suspension in the molar rate 1:2 and characterized by IV and DSC. The analysis of the
specters of IV demonstrated that it had reduction of the characteristic bands of the medicine
suggesting that it had an interaction of the β-cyclodextrin with SDAg. The formation of the
inclusion complex was confirmed by the DSC analysis, demonstrating endothermic peak in
the band of temperature of 32,67°C until 42,62°C, with maximum point in 42,31°C,
characterizing the temperature of fusing of the sample (Tm). The quantification of the SDAg
complexed with β-cyclodextrin for High Performance/Pressure Liquid Chromatography
(HPLC) varied of 11,32 until 17,66%. The results gotten for the microbiological method
prove that the Silver sulfadiazine complexed with β-cyclodextrin presents activity front the
Pseudomonas aeruginosa
and
Candida albicans, showing, this way, that the enclosed
medicine a although the low concentration it was able to inhibit the growth of the tested
microorganisms.
Keywords: Silver Sulfadiazine, β-cyclodextrin, microbiological activity.
11
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Estrutura Química da Sulfadiazina de Prata ............................................23
FIGURA 2 - Representação esquemática da β-CD ......................................................26
FIGURA 3 - Estruturas: α-ciclodextrina, β-ciclodextrina e γ-ciclodextrina................27
FIGURA 4 - Características estruturais definidas pelo arranjo das unidades de
glicose............................................................................................................................27
FIGURA 5 - Espectro de infravermelho para β-ciclodextrina......................................39
FIGURA 6 - Espectro de infravermelho para sulfadiazina de prata.............................40
FIGURA 7 - Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão 1:1
Sulfadiazina de prata + β-Ciclodextrina........................................................................40
FIGURA 8 - Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão 1:2
Sulfadiazina de prata + β-Ciclodextrina........................................................................41
FIGURA 9 - Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão 1:3
Sulfadiazina de prata + β-Ciclodextrina........................................................................41
FIGURA 10 - Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão 1:5
Sulfadiazina de prata + β-Ciclodextrina........................................................................42
FIGURA
11
-
Representação
das
curvas
de
DSC
da
amostra
de
β-
CD..................................................................................................................................43
FIGURA 12 - Amostra da Sulfadiazina de prata com Intervalo de análise 30°C a
300°C.............................................................................................................................43
FIGURA
13
-
Sulfadiazina
e
prata
com
Intervalo
de
análise
30°C
250°C.............................................................................................................................44
FIGURA 14 - Representação gráfica da curva analítica da sulfadiazina de prata........45
FIGURA 15 - Placa utilizada no teste de microdiluição para Candida albicans após
sua inoculação e incubação...........................................................................................47
FIGURA 16 - Placa utilizada no teste de microdiluição, para Pseudomonas aeruginosa
após sua inoculação e incubação...................................................................................47
a
12
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Valores referentes à construção da curva analítica da SDAg ............
45
TABELA 2 – Valores referentes à concentração da amostra de SDAg complexada
com β-CD.................................................................................................................... 45
TABELA 3 – Valores referentes à Concentração Inibitória
Mínima........................................................................................................................ 46
13
LISTA DE ABREVIATUTAS, SIGLAS E SÍMBOLO
ACN- Acetonitrila
Ag - Prata
α - CD - Alfa Ciclodextrina
β - CD - Beta Ciclodextrina
γ - CD - Gama Ciclodextrina
CDs - Ciclodextrinas
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLAE - Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute
DMSO - Dimetilsulfóxido
DSC - Calorimetria Exploratória Diferencial
ERG - Ergosterol
FDA - Food and Drug Administration
F.M - Fase Móvel
g/mol - Grama por mol
HP β CD - Hidroxipropil- β- Ciclodextrina
HP γ CD- Hidroxipropil- γ – Ciclodextrina
IV - Espectrometria de Infravermelho
LAPEMI- Laboratório de Pesquisa de Micologia
14
MET - Microscópio Eletrônico de Transmissão
MEV - Microscópio Eletrônico de Varredura
MO - Microscópio Óptico
MOPS - Ácido Morfolino Propano Sulfônico
NCCLS - National Committee of Clinical Laboratory Standards
NF - Nitrofurazona
mV - milivolts
SDAg - Sulfadiazina de prata
SDBA - Meio de cultura Sabourand 2% Dextrose Agar
SIDA - Sindrome da Imunodeficiência Adquirida
UNIFRA - Centro Universitário Franciscano
UV/vis- Ultravioleta ao Visível
UV- Ultravioleta
14 DM - 14 – alfa- demetilase
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 17
2 REFERENCIAL TEÓRICO ..............................................................................
20
2.1 Queimaduras .......................................................................................................
20
2.2 Gênero Candida spp............................................................................................
21
2.3 Pseudomonas aeruginosa....................................................................................
22
2.4 Mecanismo de resistência Candida spp e Pseudomonas aeruginosa.................. 23
2.5 Sulfadiazina de prata............................................................................................ 23
2.6 Ciclodextrina........................................................................................................ 25
2.7 Preparação dos complexos de inclusão................................................................ 29
2.8 Caracterização dos complexos de inclusão de CDs............................................. 30
3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................
33
3.1 Materiais..............................................................................................................
33
3.1.1 Equipamentos.................................................................................................... 33
3.2 Métodos ..............................................................................................................
34
3.2.1 Origem e preparação da amostra.....................................................................
34
3.2.2 Preparação dos complexos de Inclusão............................................................
34
3.2.3 Espectrofotômetro Infravermelho (IV).............................................................
34
3.2.4 Caracterização por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) .................. 35
3.2.5 Preparação das amostras para doseamento.......................................................
35
3.2.6 Doseamento da Sulfadiazina de prata complexada com Ciclodextrina............ 35
4 Preparação de meios de cultura e cultivo...........................................................
36
4.1 Meio de cultura Sabourand 2% Dextrose Agar (SDBA).....................................
36
4.2 Meio de cultura Ágar Müeller Hinton.................................................................
36
4.3 Meio de cultura RPMI-1640...............................................................................
36
16
4.4 Microrganismos e padronização dos inóculos.....................................................
36
4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)..................................
37
4.5.1 Solução padrão da sulfadiazina de prata
....................................................... 37
4.5.2 Microdiluição para Pseudomonas aeruginosa................................................
37
4.5.3 Microdiluição para Candida albicans............................................................... 38
4.6 Determinação dos pontos finais da CIM.............................................................
38
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES.......................................................................
39
5.1 Espectrometria de Infravermelho (IV) ...............................................................
39
5.1.1 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)................................................... 42
5.1.2 Doseamento por CLAE....................................................................................
44
5.1.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima..........................................
46
6 CONCLUSÕES..................................................................................................... 49
7 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS...............................................................
50
17
1 INTRODUÇÃO
As queimaduras são lesões da pele, geralmente provocadas pela exposição a agentes
químicos, térmicos, radiantes, elétricos, podendo ser classificada de acordo com a camada da
pele atingida, em 1o, 2o e 3o graus, respectivamente relacionadas às camadas. 1° grau resulta
numa ferida superficial afetando apenas a epiderme; 2° grau classificada como superficial ou
profunda, caracterizadas por formação de bolhas; 3° grau queimaduras de extensão intensa
podendo ocorrer necrose do tecido (AZEVEDO et al, 2002; PATEL et al, 2008). As pessoas
que sofrem queimaduras são consideradas imunossuprimidas, pois, após o trauma, ocorre uma
série de alterações orgânicas que modificam seu mecanismo de defesa, facilitando a
colonização do ferimento por microrganismos oportunistas (RAGONHA et al, 2005).
Nos Centros de Tratamento de Queimados, a infecção é responsável por 75 a 80% das
taxas de mortalidade. Além da extensão da superfície corporal queimada, que acarreta
alteração estrutural na cobertura cutânea com grande carga de colonização bacteriana, entre
elas destacam-se a bactéria Pseudomonas aeruginosa e entre os fungos a espécie de Candida
spp. Outros fatores que também favorecem as complicações infecciosas nos queimados são a
imunossupressão decorrente da lesão térmica, a possibilidade de translocação bacteriana
gastrintestinal, internação prolongada e o uso inadequado de antimicrobianos (FERREIRA et
al, 2003; MACEDO; SANTOS, 2005).
Pseudomonas aeruginosa permanece como um dos mais prevalentes agentes de
infecções hospitalares em todo o mundo, mesmo com os avanços tecnológicos em relação ao
desenvolvimento de fármacos de maior potência antibacteriana, suas características naturais
de resistência a mantém em papel de destaque referente às dificuldades terapêuticas
(ARRUDA et al, 1999).
As espécies do gênero Candida emergiram como uma das crescentes causas de
infecções superficiais, cutâneas, mucocutâneas e sistêmicas, e constituem a principal causa de
micose oportunista, comprometendo pacientes que apresentam fatores predisponentes
(HAYNES, 2001; ANDRADE, 2004; SIDRIM; ROCHA, 2004; FERRAZA et al, 2005;
CASTRO et al, 2006; TAMURA et al, 2007).
A resistência microbiana tem representado um grande desafio para a clínica, frente às
dificuldades observadas no tratamento de microrganismos. Este aumento pode ser decorrente
do uso de terapias seletivas com doses inadequadas ou devido ao uso crescente desses
fármacos na profilaxia de infecções, o que pode condicionar a seleção da resistência clínica
(DENNING; BAILY; HOOD, 1997; ESPINEL-INGROFF, 2001; SANGUINETTI et al,
18
2005). Na tentativa de um melhor tratamento, têm-se buscado estabelecer e avaliar novos
fármacos eficazes e com melhor tolerância e segurança.
A Sulfadiazina de prata é utilizada com sucesso há muitos anos no tratamento de
queimaduras, possui propriedades cicatrizantes, oferecendo aumento na sobrevida dos
pacientes queimados através da ampla proteção antimicrobiana, na sua forma comercial é
conhecida como Dermazine®. É usada na forma de um creme e exige várias aplicações
diárias, interferindo no processo de cicatrização, pois a troca de curativos expõe os pacientes
aos agentes infecciosos, além do trauma e da dor, o creme de sulfadiazina não é biodegradável
e requer a remoção antes da reaplicação. (LICHTENSTEIN; MARGALIT, 1995; FERREIRA
et al, 2003).
As ciclodextrinas (CDs) constituem uma nova classe de excipientes farmacêuticos. Estes
oligossacarídeos cíclicos são compostos por ligações glicosídicas do tipo α-(1-4) e podem ser
consideradas moléculas anfifílicas. Por apresentarem duas regiões de comportamento
diferentes, o exterior das CDs é formado por grupos hidroxilas sendo altamente polar,
enquanto seu interior da cavidade é relativamente apolar. Dessa forma, as CDs são capazes de
interagir com diversas espécies, formando complexos estabilizados por ligações não
covalentes, os quais são denominados complexos de inclusão (CUNHA; BARRETO, 2007;
VENTURINI et al, 2008). Estes complexos são caracterizados pela penetração parcial ou total
de moléculas na cavidade das CDs. A formação dos complexos pode ter o propósito de
aumentar a solubilidade, estabilidade, taxa de absorção ou reduzir a toxicidade do fármaco
neles associado (IRIE; UEKAMA, 1997; CUNHA; BARRETO, 2007; SZEJTLI, 2004;
UEKAMA; HIRAYAMA; ARIMA, 2006; LOFTSSON; DUCHENE, 2007).
A complexação da sulfadiazina em CD pode melhorar a velocidade de liberação do
fármaco. Uma elevada constante de estabilidade do complexo favorece a passagem do
princípio ativo através da membrana celular, visando assim à obtenção de maior concentração
intracelulares do fármaco com menor toxicidade e a maior eficiência no tratamento das
infecções fúngicas, as quais levam ao desenvolvimento de lesões irreversíveis nos pacientes
acometidos por períodos mais prolongados. (SZEJTLI, 1998; SZEJTLI, 2004, CUNHA:
BARRETO, 2007).
Considerando tais aspectos, a avaliação da atividade antimicrobiana do fármaco
complexado em CD, assumindo importância no sentido de ser uma opção viável para
contornar tais problemas de solubilidade do fármaco e sua respectiva dissolução desejada. O
presente trabalho tem como objetivo desenvolver e caracterizar complexos de sulfadiazina de
19
prata com -CD e avaliar a atividade antimicrobiana in vitro da sulfadiazina de prata
complexada em CD, frente à Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans.
Este trabalho demonstra com clareza o caráter interdisciplinar que tem como proposta a
conexão de diversas áreas do conhecimento, tanto na área da física, química, biologia, como
mostra no decorrer da realização desta dissertação, trabalhadas juntas e de forma complementar.
20
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Queimaduras
As queimaduras são as lesões mais agressivas que o corpo humano pode sofrer, são a
terceira causa de morte acidental em todas faixas etárias; 75% desses acidentes resultam da
ação da vítima e ocorrem no ambiente domiciliar de acordo com dados da National Burn
Information Exchange. Podemos classificar as lesões por queimaduras de acordo com o
mecanismo agressor em físicas e químicas. As queimaduras causadas por agentes químicos
podem ser provocadas por ácidos ou álcalis. Outros agentes causadores de queimaduras são os
físicos, que podem ser térmicos, radiantes ou elétricos (ROSSI et al, 2003).
Nesse tipo de trauma há liberação de mediadores celulares e humorais que determinam
alteração da permeabilidade capilar, metabólica e imunológica levando a distúrbio
hidroeletrolítico, desnutrição e infecção (COSTA et al, 1999). Artz e colaboradores 1980,
afirmam que a dor da queimadura está geralmente relacionada com atividades específicas tais
como limpeza da ferida, desbridamento, mudança de curativos e fisioterapia. Por isso, podem
manifestar-se com maior intensidade principalmente na primeira e na segunda fase da
queimadura, momentos em que esses procedimentos são realizados com maior frequência.
A lesão provocada pela queimadura pode ser descrita com base na sua profundidade,
sendo classificada como de primeiro grau, quando é comprometida apenas a epiderme,
apresentando eritema e dor; de segundo grau, quando atinge a epiderme e parte da derme,
provocando a formação de flictenas; e de terceiro grau, quando envolve todas as estruturas da
pele, apresentando-se esbranquiçada ou negra, pouco dolorosa e seca (GOMES; SERRA;
GUIMARÃES, 2001; FERREIRA et al, 2003).
Torna-se importante o tratamento adequado para tais lesões, sendo que estas
necessitam de limpeza e troca de curativos diários expondo o paciente ainda mais a infecções.
Os agentes tópicos representam substância, utilizada, na superfície da pele, podendo ter ação
antimicrobiana, alguns agentes tópicos ajudam no desbridamento dos tecidos. Dentro das
diversas opções para tratamento observa-se a recomendação da utilização de um creme de
Sulfadiazina de Prata a 1% para o tratamento de queimaduras, com a finalidade de desbridar
tecidos necrosados e combater infecção local. A Sulfadiazina de Prata é um composto de
nitrato de prata e sulfadiazina de sódio, efetivo contra uma ampla microbiota de Gramnegativas como Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella sp e Pseudomonas aeruginosa,
21
além de incluir bactérias gram-positivas como Staphylococus aureus, e também fungo
Candida albicans (FERREIRA et al, 2003).
2.2 Gênero Candida spp.
Nas três últimas décadas a incidência de infecções fúngicas tem aumentado
dramaticamente, espécies de Candida são responsáveis por cerca de 80% das infecções
fúngicas hospitalares (SPELLBERG; FILLER; EDWARDS, 2006).
As espécies de Candida fazem parte da microbiota humana da pele, do trato
gastrointestinal e trato geniturinário. A transição da forma comensal desta levedura para a
forma patogênica acontece em casos onde ocorram alterações nos mecanismos de defesa do
hospedeiro, assim, o microrganismo se multiplica, invade a mucosa e causa infecção. Os
principais fatores de virulência desta levedura são: formação de hifas e pseudohifas, produção
de enzimas hidrolíticas, e capacidade de multiplicação a 37°C (LIU, 2002; SAVILLE et al,
2003; ZHENG; WANG, 2004 SHOHAM; LEVITZ, 2005; FERRAZA et al, 2005; CASTRO
et al, 2006).
Apesar de ser um microrganismo dimórfico, Candida spp pode assumir uma forma
patogênica frente a determinadas condições que comprometem o sistema imunológico. Entre
os fatores predisponentes para candidiase, destacam-se: diabetes mellitus, uso prolongado de
antibióticos, corticóides, pacientes com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, leucemia,
queimaduras, transplantados e tratamento quimioterápico (LEUNG et al, 2000; ANDRADE,
2004; RICHTER et al, 2005).
Esta levedura é considerada o principal fungo isolado em pacientes queimados, sendo
que as espécies mais encontradas são Candida albicans, Candida tropicali e Candida krusei.
O isolamento dos fungos oportunistas aumenta com o tempo de internação, principalmente
após a terceira semana, associado ao uso prolongado de antimicrobianos e queimaduras
extensas não cobertas por enxertos (URIZAR, 2002; MACEDO, 2005). Candida spp é
considerado um patogeno inofensivo quando esta colonizando a ferida, mas quando invade os
tecidos viáveis ou a corrente sanguínea pode levar a uma taxa de letalidade acima de 50%
(MACEDO; ROSA; CASTRO; 2003).
22
2.3 Pseudomonas aeruginosa
A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, invasiva e toxigênica.
Tem se tornado uma das principais causas de mortalidade entre pacientes criticamente
enfermos e imuno-comprometido, apesar do desenvolvimento de fármacos de maior potência
antibacteriana, sendo que suas características naturais de resistência a mantém em papel de
destaque referente às dificuldades terapêuticas. O principal local de colonização e uma fonte
frequente de infecção subsequente é o reservatório do trato gastrointestinal, onde mais de 50%
dos pacientes criticamente doentes estão colonizados dentro de três dias de internação, que
apresentam resistência (ZABORINA et al, 2008).
As infecções mais graves causadas pela Pseudomonas ocorrem em indivíduos
debilitados cujo sistema imune é comprometido. Estes microrganismos são difíceis de tratar
devido à suscetibilidade limitada aos agentes antimicrobianos e da alta frequência de
aparecimento de resistência a antibióticos durante o tratamento, resultando em graves
consequências adversas (SOLH et al, 2008).
A Pseudomonas aeruginosa pode infectar o sangue, a pele, ossos, ouvidos, olhos,
trato urinário, válvulas cardíacas e os pulmões. As queimaduras podem tornar-se gravemente
infectadas pela Pseudomonas aeruginosa, acarretando uma infecção sanguínea que é
frequentemente fatal. A extensão e a profundidade da queimadura estão ambas associadas a
mortalidade sendo que quanto maior a área corpórea atingida maior será o risco de
contaminação (ROSSI et al, 2000).
No estudo realizado por Damas (2003), em análise de óbitos em crianças queimadas
no hospital infantil Joana de Gusmão de janeiro de 1991 a dezembro de 2002, a cultura de
pele foi solicitada na maioria dos pacientes, sendo Pseudomonas aeruginosa considerada a
bactéria mais encontrada apresentando um percentual (35,7%), seguida por Staphylococcus
aureus (21,4%), Klebsiella sp (14,3%) e entre os fungos Candida spp e Criptococcus
(14,3%), estando de acordo com a maior parte da literatura.
Macedo (2007), em seu estudo, mostrou que os microrganismos que mais causam
infecções em pacientes queimados foram Stapyylococcus aureus, estafilococo coagulasenegativa e Pseudomonas. Os pacientes colonizados por Pseudomonas aeruginosa
desenvolveram infecção da corrente sanguínea em 44,9% dos casos.
23
2.4 Mecanismo de resistência Candida spp e Pseudomonas aeruginosa
A resistência aos antimicrobianos tem representado um grande desafio para a clínica,
frente às dificuldades observadas no tratamento da candidíase e pseudomonas. Este aumento
surge através de vários mecanismos um deles, é o aumento decorrente do uso de terapias
seletivas com doses inadequadas ou devido ao uso incorreto desses fármacos na profilaxia de
infecções, o que pode condicionar a seleção da resistência clínica (PENILDON SILVA,
2006).
As modificações na rota de biossíntese dos esteróis e a expressão aumentada do gene
ERG 11, envolvidos na síntese da enzima 14α-demetilase (14 DM), também promovem o
desenvolvimento de resistência em Candida spp. As mutações do gene ERG11 determinam
uma produção de 14DM alterada, isto resulta numa afinidade diminuída aos azóis a enzima,
com consequente redução intracelular da droga (DENNING; BAILY; HOOD, 1997;
SHEEHAN; HITCHCOCK; SIBLEY, 1999; ZARDO; MEZZARI, 2004).
Frequentemente, isolados de Pseudomonas aeruginosa apresentam um amplo espectro
de resistência, podendo ser resistentes a diferentes classes de agentes antimicrobianos. Além
das características intrínsecas de apresentar baixo nível de sensibilidade, têm sido
identificadas em Pseudomonas aeruginosa, características como hiper-expressão de bombas
de efluxo, produção de β-lactamases, perda ou expressão reduzida pela proteína de membrana
externa (WARNOCK, 2007).
Estudos sobre resistência a drogas antimicrobianas sugerem que novos sistemas de
liberação de fármacos possam ter lugar no tratamento de infecções resistentes a drogas, sendo
possível que diferentes sistemas de liberação de drogas alterem a maneira como uma célula
microbiana interage com o fármaco, podendo ter efeito no desenvolvimento microbiano
(SOUSA, 2007).
2.5 Sulfadiazina de prata
A sulfadiazina de prata (Figura 1), cuja fórmula é C10H9AgN4O2S, apresenta peso
molecular de 357,14 g/mol. No Chemical Abstract System, é identificada pelo número 2219908-2, sendo denominada benzenosulfonamida, 4-amino-N-2-pirimidinil1-monoprata (+1). Seu
pH é entre 4,0 e 7,0 (THE INDEX MERCK, 2001, p. 1586; THE UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2007).
24
Figura 1: Estrutura Química da Sulfadiazina de Prata (BORGES et al, 2005)
É um antimicrobiano tópico da classe da sulfanilamida encontrado na forma de pó
branco, inodoro. Foi desenvolvida por Charles L. Fox Jr., da Universidade de Columbia,
Estados Unidos, por meio da associação de dois agentes antibacterianos já conhecidos e
utilizados no tratamento de queimaduras – nitrato de prata e sulfadiazina – criando, assim, um
composto extremamente efetivo contra infecções, aprovado pelo Food and Drug
Administration (FDA), em 1973 (RAGONHA et al, 2005).
A partir de sua aprovação, a sulfadiazina de prata tornou-se o fármaco de escolha para
o tratamento de queimaduras, possui propriedades cicatrizantes, oferecendo aumento na
sobrevida dos pacientes queimados através da ampla proteção antimicrobiana. É usada na
forma de creme 1%, e exige várias aplicações diárias, interferindo no processo de
cicatrização, pois a troca de curativos expõe os pacientes aos agentes infecciosos, além do
trauma e da dor, o creme de sulfadiazina não é biodegradável e requer a remoção antes da
reaplicação (LICHTENSTEIN; MARGALIT, 1995).
Vários estudos foram desenvolvidos com a sulfadiazina de prata para melhorar a
aplicação tópica e minimizar a dor provocada pela troca de curativos. Entre eles, podemos
citar o trabalho de Gear e colaboradores (1997) que desenvolveram um novo gel com uma
base solúvel em água contendo sulfadiazina de prata, podendo ser facilmente removido da
superfície das ferida. De acordo com os autores este gel apresenta algumas vantagens em
relação ao creme de SDAg disponível comercialmente como
Dermazine®, Pratazine®,
Siglos®, Ag derm® (RAGONHA et al 2005; SPANN et al, 2004).
A fim de melhorar a aplicação tópica em pacientes queimados Foroutan, Ettehadi e
Toralei (2002) desenvolveram um spray contendo sulfadiazina de prata, com a vantagem de
promover uma aplicação tópica rápida e efetiva
A Sulfadiazina de prata apresenta atividade in vitro contra diversos microrganismos
patógenos de presentes em pacientes com queimaduras incluindo Pseudomonas aeruginosa e
Candida albicans (PENILDON SILVA, 2006).
25
Seu mecanismo de ação está diretamente ligado ao íon de prata que causa a
precipitação de proteínas e age diretamente na membrana citoplasmática da célula bacteriana,
exercendo ação bactericida imediata, e ação bacteriostática residual, pela liberação de
pequenas quantidades de prata iônica (COWARD; CARR; ROSENKRANZ, 1972; LIMA,
2003).
2.6 Ciclodextrina(CD)
Ciclodextrinas vêm despertando grande interesse na comunidade científica e na
química de macromoléculas, atraindo a atenção dos investigadores tanto no campo da
pesquisa como no campo da tecnologia aplicada (VENTURINI et al, 2008).
Este açúcar pertence à família dos oligossacarídeos cíclicos (Figura 2), obtidas a partir
da degradação enzimática do amido, e são muito adequadas para microencapsulamento por
inclusão molecular. As CDs obtidas com maior rendimento, conhecidas como naturais,
contém seis, sete e oito unidades de glicose, sendo denominadas de α-ciclodextrina (α CD), βciclodextrina (β CD) e γ-ciclodextrina (γ CD), respectivamente (Figura 3). Destes três
derivados, a β-ciclodextrina (β-CD) parece ser a mais vantajosa para utilização farmacêutica
como agente complexante, devido as suas propriedades físico-químicas e ao tamanho da sua
cavidada. A β-CD possui baixa solubilidade em água, quando comparada aos outros tipos de
CDs. A explicação para este efeito é que a molécula de β-CD apresenta um cinto secundário
constituído de pontes de hidrogênio, e com isso forma-se uma estrutura rígida e estável.
(DUCHÊNE; DEBRUÈRES; BRÉTILLON, 1984; SZEJTLI, 1994; FRÖMMING; SZEJTLI,
1994; BRITTO; NASCIMENTO; SANTOS, 2004).
A presença das hidroxilas livres na parte externa das CDs confere a essas moléculas
um caráter hidrofílico, devido às hidroxilas primárias e secundárias, e uma cavidade interna
relativamente hidrofóbica devido ao oxigênio das ligações glicosídicas que, por sua vez,
permite as ciclodextrinas complexarem-se com moléculas que apresentam dimensões
compatíveis com a sua cavidade. A complexação altera as propriedades físico-químicas, como
a solubilidade em água, estabilidade e biodisponibilidade de drogas complexadas (ARAÚJO
et al, 2003; BRITTO et al, 2004; VENTURINI et al, 2008).
Estudos realizados por Bergeron (1977) demonstrou que existe a possibilidade de
formação de pontes de hidrogênio entre os grupos OH ligados aos átomos de carbono C2 e C3
e verificou também que há liberdade conformacional do anel macrociclíco. Este arranjo força
as ligações, das quais participam os átomos de oxigênio, para o interior da cavidade, fazendo
26
com que esta apresente um ambiente hidrofóbico, enquanto a superfície externa é hidrofílica.
A presença de uma cavidade hidrofóbica e de grupos hidroxilas livres na parte externa da
molécula permite a “dissolução” em meio aquoso de compostos (hóspedes) de baixa
solubilidade que podem penetrar e se ligar no seu interior (Figura 4), desde que dimensões das
moléculas sejam compatíveis com o tamanho da cavidade (SZEJTLI, 1998; IRIE; UEKAMA,
1999; BÉNI, 2007). Esse aspecto molecular tem possibilitado a utilização de ciclodextrinas
em diferentes áreas da ciência e tecnologia, sendo o principal domínio de aplicação a indústria
farmacêutica, em função da possibilidade de obtenção de novos fármacos com propriedades
físicas e químicas diferentes e o mesmo princípio ativo (IRIE; UEKAMA, 1997; BRITTO et
al, 2004; ERDAL et al, 2008). Franco (2008) demonstrou que a associação do comestrol com
a β-ciclodextrina proporciona um grande aumento da solubilidade do fármaco em água. Com
isso, sua entrega através da pele se torna mais fácil e rápida, o que é bastante promissor já que
a maioria dos receptores do comestrol encontra-se na derme e epiderme, e o fármaco, em sua
forma livre, apresenta baixa solubilidade.
.
Figura 2: Representação esquemática da β-CD (BRITTO et al, 2004).
27
Figura 3 - Estruturas: a) α-ciclodextrina b) β-ciclodextrina c) γ-ciclodextrina (SZEJTLI,
1998).
Figura 4- Características estruturais definidas pelo arranjo das unidades de glicose
(BRITTO et al, 2004).
Alguns fatores determinam o tipo e a natureza da CD necessária para um tratamento
terapêutico específico, ou seja, para cada fármaco e possível utilizar uma CD mais adequada.
28
Os fatores que auxiliam nessa escolha são: natureza química do fármaco, tamanho da
cavidade, solubilidade, facilidade de preparação, possibilidade de co-encapsulamento,
eficiência de encapsulação.
A inclusão das CDs pode modificar a velocidade de liberação de fármacos pouco
solúveis em água, reduzir a toxicidade, diminuir os efeitos colaterais e adversos, aumentar a
estabilidade através da encapsulamento, melhorando a sua absorção através da membrana
biológica, e também para inibir o polimorfismo e velocidade de cristalização de fármacos
pouco hidrossolúveis durante seu armazenamento, mantendo suas caracteristicas de
dissolução (UEKAMA ; HIRAYAMA ; ARIMA, 2006 ; VEIGA; PERCORELLI; RIBEIRO,
2006).
Com a molécula encapsulada na cavidade da CD, os reagentes tem acesso limitado aos
fármacos, assim os compostos apresentam melhor estabilidade contra hidrolise, oxidação e
fotodegradação (SZEJTLI, 2004; LOFTSSON; DUCHENE, 2007). A presença de uma
cavidade que permita a formação de complexos de inclusão dos fármacos com características
hidrofóbicas permite alterar a solubilidade, aumentar a estabilidade, modelar a velocidade de
dissolução, proteger as mucosas da irritação causada por determinados fármacos em alguns
casos, melhorando a biodisponibilidade (FERNANDES; VEIGA, 1999, DUCHÊNE;
WOUESSIDJEWE; PONCHEL, 1997; FIGUEIRAS et al, 2007). As CDs também são
utilizadas em pomadas, géis, cremes para uso tópico reduzindo a toxicidade, as reações
adversas
e
melhorar
a
permeação
de
compostos
insolúveis
(EUROPEAN
PHARMACOPOEIA, 2002).
De acordo com Loftsson e Brewster (2007) existe uma resistência natural das
membranas em relação à entrada de fármacos na célula e as ciclodextrinas são capazes de
aumentar a solubilidade dos fármacos associados a ela, aumentando assim o gradiente de
concentração do fármaco na membrana e permitindo sua passagem por esta barreira.
Diniz (2007) estudando compostos de tetraciclina com β-ciclodextrina nas mesmas
razões molares (1:1) também relatou diferenças nas propriedades microbiológicas e físicoquímicas destes compostos sugerindo a formação de compostos diferentes entre si e com
arranjos supramoleculares diferenciados.
Cortés e Esperanza (1999) estudaram a complexação de clorexidina com βciclodextrina nas razões molares 1:1 e 1:2 e verificaram que nas mesmas concentrações de
clorexidina, estes compostos foram microbiologicamente mais efetivos que o fármaco puro.
29
2.7 Preparação dos complexos de inclusão
Para obter os complexos de inclusão com CDs são utilizados vários métodos, pois
cada substância a ser inclusa tem suas características, que devem ser observadas para obter
melhores respostas. A preparação de complexos de inclusão é simples, o procedimento mais
comum é agitar ou misturar a ciclodextrina numa solução aquosa (fria ou quente, neutra,
alcalina ou ácida). Os métodos mais utilizados para obter o complexo de inclusão com CDs
são: co-precipitação, suspensão, empastagem, moagem conjunta (UEKAMA, 2004;
MACEDO, 2010).
Co-precipitação – adiciona-se uma solução do hóspede a uma solução aquosa de CD
(1:1). Se for preciso utilizar um solvente diferente da água para solubilizar o fármaco, deve-se
escolher um solvente que seja miscível com água (1/5). A mistura é agitada até o equilíbrio,
em seguida levada a evaporação a vácuo a 50ºC ou liofilização (RIBEIRO, 2003).
Suspensão – o hóspede sólido é adicionado a uma solução aquosa de CD formando
uma suspensão que é agitada vigorosamente e filtrada. O complexo filtrado é coletado por
evaporação a vácuo ou liofilização (UEKAMA; HIRAYAMA; IRIE, 1998, MACEDO, 2010).
Empastagem (Kneading) – assim como na suspensão, o hospede sólido é adicionado a
uma mistura de CD com água. Contudo é utilizado apenas 0,5 parte de água por parte de CD.
O complexo sólido pode ser removido sob vácuo ou aquecimento (UEKAMA; HIRAYAMA;
ARIMA, 2006; MACEDO, 2010).
Malaxagem - mistura-se a CD e o hospede no estado sólido, os quais são triturados
vigorosamente até formar uma pasta a partir da adição da mínima quantidade de líquido (água
ou álcool) suficiente para umedecer a mistura em pó de fármaco e CD (DUCHÊNE;
WOUESSIDJEWE; POELMAN; 1997; FERNANDES, VEIGA, 1999).
Melo e colaboradores (2007), em seu estudo utilizaram a técnica de co-precipitação
para formação de complexo, seguindo o procedimento descrito por Azevedo e colaboradores
(2002). Neste procedimento, uma solução contendo Nitrofurazon (NF) foi preparada
utilizando acetona como solvente (devido ao fármaco apresentar uma maior solubilidade neste
solvente) e uma solução de hidroxipropil- ciclodextrina (HP)-CD preparada em água, ambas
nas mesmas razões molares (1:1).
Pinto e colaboradores (2005) utilizaram o método que consiste em misturar β- CD e
amostra em água sob agitação por 24 h até atingir o equilíbrio, sendo estes posteriormente
liofilizados e armazenados em dessecador até o momento da utilização.
30
2.8 Caracterização dos complexos de inclusão de CDs
A caracterização dos complexos de inclusão pode ser realizada de acordo o método
utilizado na preparação do complexo. Entre eles, podemos citar a microscopia eletrônica de
varredura, os métodos termoanalíticos (calorimetria exploratória diferencial e a difração em
raios-X), métodos espectroscópicos (espectroscopia de infravermelho por transformada de
Fourier e espectroscopia Raman) (RIBEIRO, 2003; RAO, 2006; PEREIRA, 2007; MACEDO,
2010).
A espectroscopia no infravermelho é uma técnica que pode ser usada para identificar
moléculas através da análise das suas ligações. Cada ligação química numa molécula vibra
com uma frequência característica dessa ligação. As freqüências vibracionais da maioria das
moléculas correspondem a frequências da luz infravermelha. Esta técnica é usada para obter
informação acerca da composição da amostra, no que diz respeito à presença de grupos
químicos e à sua pureza (INFRARED consultado em agosto 2010). São determinações
rápidas e precisas, ainda que a informação conseguida por este ensaio apresente limitações.
(HEDGES, 1998). Melhorias importantes na precisão e sensibilidade dos equipamentos mais
recentes e a utilização de modelos matemáticos, como a integração das bandas por equações
lorenzianas, tornam possível obter informações mais confiáveis sobre a conformação espacial
dos complexos de inclusão (ILIESCU et al, 2004).
Hussei, Turk, Wahl (2007) avaliaram a complexação do ibuprofeno e β-CD, através da
espectroscopia no IV e demonstraram que houve desaparecimento parcial das bandas
características do fármaco indicando a complexação da molécula.
Doile e colaboradores (2008) compararam diferentes métodos de caracterização
usando acetato de dexametasona, observando mudanças características no espectro
infravermelho de bandas de absorção da carbonila e grupos de alcenos do fármaco.
Macedo (2010) estudou a preparação e caracterização do complexo de inclusão entre
trimetoprin e 2 hidroxipropil-gamaciclodextrina, na análise por IV, observou a diminuição da
intensidade das bandas do complexo HP-γ-CD/TMP indicando que há alguma interação entre
o hospede e o hospedeiro e verificou ainda que alguns picos oriundos do espectro do fármaco
trimetopin sumiram quando em comparação com o espectro do complexo, indicando desta
forma a interação das espécies.
A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma forma de espectrometria de
absorção, na qual sob condições apropriadas, uma amostra pode absorver radiação
eletromagnética a uma frequência referente às características estruturais da amostra. A
31
absorção é em função de determinados núcleos da molécula (SILVERSTEIN; BASSLER;
MORRILL, 1994).
Numanoglu e colaboradores (2007) utilizaram a técnica RMN para confirmar a
formação do complexo de inclusão do linalol e acetato de benzila, com β-CD e com HPβCD,
com a finalidade de aumentar a estabilidade e a solubilidade destes compostos.
A análise térmica dos sistemas sólidos contendo CDs é uma das formas mais utilizadas
para estudar suas interações com moléculas hóspedes (CABRAL et al, 1990). Este ensaio
consegue, muitas vezes, proporcionar informações quantitativas quanto ao grau de
complexação, além de informações valiosas da estabilidade do sistema e de sua cristalinidade
(VEIGA et al, 2001).
Entre os métodos mais utilizados, pode-se citar a calorimetria exploratória diferencial
(DSC), que é uma técnica na qual é medida a diferença de energia dentro e fora de uma
amostra e da referência em uma atmosfera controlada e sob gradiente de temperatura
(IONASHIRO, 2004; ARAUJO et al., 2008).
Castilho e colaboradores (1999) avaliaram o efeito de diferentes CDs para aumentar a
solubilidade em água do albendazol (ABZ), mebendazol (MBZ) e ricobendazol (RBZA), a
caracterização do complexo de inclusão foi realizada por calorimetria diferencial de
exploratória e estudo de liberação dos respectivos fármacos.
Giordano, Novak e Moyano (2001) confirmaram a presença de um complexo entre a
trimetropim e HP-γ-CD por DSC e concluíram que a inclusão do fármaco na cavidade das
CDs e alteram as propriedades físicas como pontos de fusão e de ebulição.
Araújo e colaboradores (2003) propuseram a caracterização química e termoanalítica
do complexo de inclusão zidovudina/β-ciclodextrina, uma das técnicas utilizadas para a
caracterização foi a calorimetria exploratória diferencial que através da simples mistura
mecânica de zidovudina (β-ciclodextrina não foi possível promover a complexação do
fármaco à molécula hospedeiro, no entanto pelo método de liofilização ou secagem à vácuo,
foi possível verificar a ocorrência de interação zidovudina/β-ciclodextrina.
Bergamasco, Zanin e Moraes (2005), utilizaram a β-ciclodextrina para aumentar a
estabilidade térmica da sulfluramida e testaram seu encapsulamento molecular. Entre as
caracterizações foi usada a calorimetria diferencial, indicando a formação de complexo, e
também demonstraram que a liberação da sulfluramida complexada ocorre na faixa de 270300°C um intervalo que se encontra bem acima da temperatura em que sublima sulfluramida
(40°C), garantindo a perda de sulfluramida reduzida.
32
Spricigo e colaboradores (2008) obtiveram complexos da furosemida com
ciclodextrinas e utilizaram a calorimetria exploratória diferencial (DSC) e espectrofotometria
na região do infravermelho (IV) para confirmar a formação os produtos. Os resultados
obtidos foram comparados com aqueles obtidos a partir de misturas físicas entre o fármaco e
as ciclodextrinas utilizadas. Neste estudo os autores também realizaram ensaios de dissolução
e sugeriram que a técnica de liofilização mostrou-se eficiente na formação de complexos de
inclusão.
Bencini e colaboradores (2008) utilizaram o técnica de calorimetria exploratória
diferencial para caracterização dos complexos de β-CD e aciclovir, desaparecendo o pico de
fusão da amostra indicando sua complexação.
Entre as técnicas cristalográficas, a difração de Raio X é a mais empregada devido a
sua simplicidade e rapidez. A técnica de difratometria de Raios-X mede a intensidade de
Raios-X espalhados em uma amostra sólida sobre diferentes ângulos. A interferência entre as
ondas difratadas pode ser construtiva, quando as ondas em fase se somam, ou destrutiva,
quando as ondas fora de fase se cancelam. (CULLITY, 1959; FORTUNATI; ABBRUZZESE;
NUNZIO, 1992; LEE et al, 1995).
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é muito utilizada para a análise
microestrutural de materiais sólidos, fornecendo um resultado com uma imagem de fácil
interpretação. O aumento máximo conseguido pelo MEV fica entre o microscópio óptico
(MO) e o microscópio eletrônico de transmissão. As análises por Microscopia Eletrônica de
Varredura podem ser utilizadas para investigar a morfologia do fármaco puro e modificações
na presença de outras substâncias.
Figueiras e colaboradores (2007) utilizaram metil-β-ciclodextrina e β-ciclodextrina
para formar complexo de inclusão com omeprazol. Estes produtos foram caracterizados por
espectroscopia no infravermelho, difração de raios-X e microscopia eletrônica de varredura.
33
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
 Acetonitrila (ACN) – Merck
 Ácido morfopropileno sulfônico (Sigma-Aldrich)
 Ácido Fosfórico – Nuclear

Água de MilliQ®

β-Ciclodextrina-Acros Organics

Cloreto de sódio – Nuclear

Hidróxido de amônio – Nuclear

Hidróxido de sódio-Nuclear
 Meio de cultura Agar Mueller Hinton – Acumedia
 Meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose – Acumedia
 MEIO RPMI
 Membrana 0,45 μm – Millipore
 Metanol grau CLAE – J.T. Baker
 Sulfadiazina de prata – Delaware
3.1.1 Equipamentos
 Autoclave – Phoenix
 Balança analítica AX200 – Shimadzu
 Capela de fluxo laminar – Pachane
 Centrifuga TDL80-2B – Centribio
 Cilindro de aço inox

Cromatógrafo líquido de alta eficiência – CLAE – Cromatógrafo líquido Young Lin
Instrument modelo YL9100 CLAE System, equipamento com bomba modelo YL
9110, detector com comprimento de onda variável UV/VIS modelo YL 9160

Espectrofotômetro Infravermelho-Spectrum One
 Estufa bacteriológica – Nova Técnica
 Liofilizador-CHIST
 Ultra Cleaner-Unique
34
3.2 Métodos
3.2.1 Origem e preparação
A inclusão do fármaco e preparação da amostra foi obtida nos laboratórios do Centro
Franciscano Universitário – UNIFRA, sob a responsabilidade da professora a orientadora
Solange Hoelzel e co-orientadora Renata Raffin. Os microrganismos utilizados neste estudo
foram cedidos pela Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), laboratório LAPEMI
(Laboratório de Pesquisa de Microbiologia) sob a responsabilidade do professor Sydney Hartz
Alves.
3.2.2 Preparação do complexo de Inclusão (SDAg/CD)
O complexo de inclusão de sulfadiazina de prata com β-ciclodextrina foi obtido pelo
método de suspensão. O fármaco (5mg) foi suspenso em 10 mL de solução salina (NaCl 120
mM) e o pH ajustado para pH 7,4 com NaOH 0,1M. A mistura assim obtida foi adicionada
à uma solução aquosa de β-CD nas proporções molares de 1:1, 1:2, 1:3 e 1:5, sob agitação
constante em ambiente escuro a 25ºC por 4 horas. As suspensões obtidas foram centrifugadas
por 15 min a 3000 rpm. Em seguida o sobrenadante foi filtrado em membrana de
0,45µm(Millipore). O filtrado obtido foi submetido à liofilização em ambiente escuro
(VENTURA et al, 2005; RODRIGUEZ-PEREZ et al, 2006). As amostras liofilizadas foram
armazenadas em dessecador até o momento de uso.
3.2.3 Caracterização do complexo SDAg/CD por Espectroscopia no Infravermelho com
Transformada de Fourrier ( FTIR)
A caracterização por IV foi realizada por espectroscopia no infravermelho com
transformada de Fourrier, a amostra foi analisada na forma de pastilha (sólida). Utilizou-se
aproximadamente 1 a 1,5 mg da amostra, triturou-se com cerca de 300 mg de brometo de
potássio em gral com pistilo em ágata. Colocou-se o cilindro de compressão inferior com face
polida virada para cima. Transferiu-se a mistura, através do orifício do cilindro superior.
Inseriu-se o segundo cilindro de compreensão com fase polida virada para baixo em seguida o
pastilhador. Colocou-se na prensa hidráulica aumentando a pressão através da alavanca
35
hidráulica ate atingir 8 toneladas, deixou-se sob pressão durante 1 minuto diminuindo
gradativamente a pressão. Após o preparo da pastilha os espectros foram obtidos.
3.2.4 Caracterização por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
As amostras foram enviadas para a FEEVALE para a caracterização através de DSC.
O equipamento utilizado foi o DSC – 60 (Shimadzu), com intervalo de análise de 30 a 300°C,
a taxa de aquecimento foi de 10°C/min, em atmosfera gasosa com nitrogênio a 50 mL/min.
Para calibração utilizou-se o padrão de índio.
3.2.5 Preparação das amostras para doseamento microbiológico
Pesou-se 250 mg de sulfadiazina de prata e transferiu-se para balão volumétrico de 25
mL e completou-se o volume com dimetilsulfóxido (DMSO). Alíquotas desta solução foram
diluídas em DMSO para obter as soluções trabalho nas concentrações de 50; 100 e 150 μg/mL
(P1, P2 e P3), as quais foram utilizadas no ensaio, segundo as recomendações do Clinical
Laboratory Standards Institute (CLSI) (2002).
3.2.6 Doseamento da Sulfadiazina de prata complexada com Ciclodextrina por CLAE
O doseamento da sulfadiazina de prata foi realizado através de Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE) segundo metodologia descrita por Foroutan e colaboradores
(2002).
As análises foram realizadas em cromatógrafo YL9100 HPLC, utilizando-se detector
ultravioleta 254 nm, coluna C18 (Lichrospher® 100 RP 18250 mn x 40 cm), pré-coluna do
mesmo material (5 μm) e fase móvel isocrática de água, acetonitrila e ácido fosfórico em uma
proporção 900: 99: 1 (v/v), com fluxo de 2,0 mL por minuto.
Para o doseamento, foi pesado o equivalente a 0,07g de amostra em um balão
volumétrico de 100 ml, adicionou-se 30 ml da fase móvel (água, acetonitrila e ácido fosfórico,
900:99:1 v/v) e foi submetida a agitação em vórtex por 5 mim, completou-se o volume do
balão com a fase móvel, colocando em banho de ultra som por 20 minutos. Centrifugou-se
por 15 minutos para separar as fases. Posteriormente realizou-se a leitura. O procedimento foi
realizado em triplicata.
36
4 PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E CULTIVO
4.1 Meio de cultura Sabourand 2% Dextrose Agar (SDBA)
O meio SBDA foi preparado conforme orientação do fabricante. Pesou-se 32,5 g de
meio de cultura e adicionou-se 500 ml de água. Após sua solubilização, esterilizou-se por 15
minutos a 121 oC, em autoclave. O meio foi armazenado sob refrigeração.
4.2 Meio de cultura Ágar Müeller Hinton
Pesou-se 38,0 g de meio de cultura. Transferiu-se para um erlenmeyer de 1000 mL e
completou-se o volume com água destilada. Após completa solubilização, esterilizou-se a
solução durante 15 minutos a 121 oC. Antes do ensaio, o meio de cultura foi aquecido à
temperatura de 37 oC.
4.3 Meio de cultura RPMI-1640
Dissolveu-se o meio RPMI-1640 em pó em 900mL de água destilada. Acrescentou-se
tampão MOPS (concentração final de 0,165mol/L), agitando até dissolver. Enquanto agitava,
ajustou-se o pH para 7,0 a 25° C usando solução de hidróxido de sódio 1mol/L. Acrescentouse água adicional para levar o meio a um volume final volume de 1 L. O meio foi esterilizado
por filtração e armazenado a 4° C até o momento do uso.
4.4 Microrganismos e padronização dos inóculos
As cepas padrões de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Candida albicans
ATCC 10231 foram selecionadas para os ensaios. Colônias foram transferidas assepticamente
para o meio de cultura Agar Mueller Hinton (Pseudomonas aeruginosa) incubadas por 48
horas a 37 oC e Sabouraud Dextrose (Candida albicans), por 24 horas a 37oC. Repiques da
cultura inicial foram realizados em tubos contendo 10 mL do meio de cultura específico para
cada uma das amostras analisadas, inclinados e incubados a 37 oC, durante 24 e 48 horas
antes do ensaio. Após o repique das culturas, colônias foram transferidas para uma solução
salina 0,85% estéril e padronizadas conforme o padrão de turbidez da escala 0,5 de Mc
Farland, que corresponde a 1,0x105 a 5,0 x106 UFC/mL.
37
Os inóculos foram preparados escolhendo-se cinco colônias com diâmetro de ~1mm, a
partir de cultura de 24 horas para espécies de Candida ou cultura de 48 horas para
Pseudomonas aeruginosa. As colônias foram suspensas em 5 mL de solução salina estéril
0,145 mol/L (8,5 g/L NaCl; salina a 0,85%).
As condições experimentais para o desenvolvimento do ensaio microbiológico para
avaliação de potência de sulfadiazina de prata foram sendo testadas e ajustadas para
proporcionar um bom desempenho do método.
4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
4.5.1 Solução padrão de sulfadiazina de prata
Pesou-se uma quantidade de 150 mg da sulfadiazina de prata e transferiu-se para balão
volumétrico de 100ml e completou-se o volume com dimetilsulfóxido (DMSO), obtendo-se
concentração final de 1500µg/mL. Esta foi utilizada no ensaio de microdiluição, segundo as
recomendações da Clinical Laboratory Standards (CLSI).
4.5.2 Microdiluições para Pseudomonas aeruginosa
O teste de suscetibilidade para sulfadiazina de prata foi realizado conforme o
protocolo M7-A6 do CLSI, sendo realizada a técnica de microdiluição. O meio de cultura
utilizado foi Mueller Hinton. A amostra liofilizada (SDAg e β-CD) e o fármaco foram
conservados sob refrigeração e ao abrigo da luz até o momento do uso. As diluições das
amostras foram realizadas em caldo Mueller Hinton a fim de se obter nos tubos testes
concentrações que variaram de 0,25-32 mg/mL. Os inóculos foram preparados a partir de
colônias com crescimento de 24 h. A solução de inóculo foi realizada conforme a escala de
Mc Farland, obtendo uma turbidez correspondente a 1x106 a 5x106 UFC/mL. Esta suspensão
foi diluída 1:50, seguida de uma nova diluição 1:20 em caldo Muller Hinton. As placas de
microdiluições foram incubadas a 37ºC por 48 h, para posterior determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM). O critério de leitura considerou que a CIM seria a
menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano.
38
4.5.3 Microdiluição para Candida albicans
O teste de suscetibilidade para sulfadiazina de prata foi realizado conforme o
protocolo M-27A2 do CLSI, sendo realizada a técnica de microdiluição. O meio de cultura
utilizado foi o RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) tamponado com ácido morfopropileno sulfônico
(MOPS) 1,65 M pH 7,2. A amostra liofilizada (SDAg e β-CD) e o fármaco foram
conservados sob refrigeração e ao abrigo da luz até o momento do uso. As diluições das
amostras foram realizadas com o meio RPMI 1640 a fim de se obter nos tubos testes
concentrações que variaram de 0,25-32. Os inóculos foram preparados a partir de colônias
com crescimento de 24 h em meio de ágar Saboraud as quais foram ressuspensas em solução
salina estéril, a fim de se obter uma turbidez correspondente a 1x106 a 5x106 UFC/mL. Esta
suspensão foi diluída 1:50, seguida de uma nova diluição 1:20 em meio líquido RPMI 1640.
As placas de microdiluições foram incubadas a 37ºC por 48h, para posterior determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM). O critério de leitura considerou que a CIM seria a
menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico.
4.6 Determinação dos Pontos Finais da CIM
A CIM foi considerada como a menor concentração de agente antimicrobiano que
inibiu
completamente o crescimento do microrganismo nos poços de microdiluição,
detectado a olho nu. A quantidade de crescimento nos poços contendo o antibiótico foi
comparada com a quantidade de crescimento nos poços controle de crescimento (sem
antibiótico) usada em cada conjunto de testes ao determinar os pontos finais de crescimento.
Para validação do ensaio, é necessário que haja crescimento (≥ 2mm turbidez definitiva) no
poço de controle positivo.
Este ensaio são procedimentos destinados a avaliar a potência de princípios ativos
contidos nas matérias-primas e preparações farmacopêicas utilizando reagentes biológicos,
tais como os microrganismos (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).
39
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Neste estudo a formação do complexo de inclusão da sulfadiazina de prata com a βCD foi utilizado o método de suspensão com razão molar de 1:1, 1:2, 1:3 e 1:5. A avaliação
da cinética de formação do complexo de inclusão foi analisada observando o melhor espectro
no IV para a amostra.
5.1 Espectroscopia de Infravermelho (IV)
Os espectros no IV da β-ciclodextrina (Figura 5), foram comparados com os espectros
de IV sulfadiazina de prata (Figura 6) e do complexo de inclusão da β-CD com Sulfadiazina
de prata (Figura 7) na razão molar 1:1; 1:2(Figura 8); 1:3(Figura 9) e 1:5(Figura 10).
Como podemos observar na Figura 6, os picos característicos da sulfadiazina de prata
que estão entre 1325 a 1140 cm-1 correspondente a ligação S=O e entre 3350 a 3250 cm-1
correspondente a N=H. Os espectros dos compostos de inclusão de Sulfadiazina de prata e βciclodextrina nas quatro razões molares foram muito semelhantes, porém
quando
comparamos o espectro da sulfadiazina de prata com os espectros obtidas das diferentes
razões molares, observamos que os picos característicos da sulfadiazina não foram detectados
no complexo liofilizado obtido na razão molar 1:2. Esta observação foi devido ao tipo de
interação entre o hospedeiro (β-ciclodextrina) e o fármaco (sulfadiazina de prata) (SZEJTLI,
1998; SZEJTLI, 2004).
81,2
80
8 5 4 ,5 5
75
2 9 3 0 ,1 2
1 3 8 3 ,3 3
6 1 3 ,9 5
70
1 6 3 7 ,5 2
1 6 1 8 ,2 3
65
1 1 5 9 ,4 7
1 0 3 2 ,2 3
60
%T
55
50
45
40
3 4 1 5 ,4 6
34,0
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
600
450,0
Figura 5. Espectro no infravermelho para β-ciclodextrina.
40
93,1
90
85
80
75
70
6 6 4 ,4 0
65
1 6 5 3 ,4 8
60
1 5 0 2 ,0 0
3 2 6 1 ,5 7
1 2 9 2 ,9 1
1 3 5 5 ,2 7
1 2 6 0 ,3 1
5 2 5 ,9 7
7 3 4 ,9 3
7 0 6 ,8 4
7 8 4 ,4 4
6 8 6 ,5 9
1 0 1 6 ,4 1
9 7 6 ,8 3
55
5 5 5 ,0 2
%T 50
3 3 4 3 ,6 7
8 3 9 ,0 3
1 5 8 3 ,9 0
1 5 9 8 ,7 1
45
3 3 9 1 ,3 1
40
1 2 3 2 ,5 8
1 5 5 1 ,6 3
5 8 6 ,1 2
1 0 7 7 ,7 7
1 1 3 5 ,4 5
35
30
25
1 4 2 1 ,0 5
20
15
11,7
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
600
450,0
Figura 6. Espectro no infravermelho para sulfadiazina de prata.
83,8
80
4 7 8 ,6 6
75
1 0 3 3 ,4 7
6 1 8 ,4 6
70
1 6 3 7 ,6 9
1 6 1 7 ,9 5
65
%T
60
55
50
45
3 4 1 4 ,7 5
39,6
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
600
450,0
Figura 7. Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão molar 1:1 Sulfadiazina
de prata- β-Ciclodextrina
41
93,7
90
85
80
4 7 8 ,1 1
75
2 9 3 0 ,6 6
6 1 7 ,8 5
70
1 4 2 0 ,6 4
1 6 3 7 ,5 1
65
1 0 3 4 ,1 0
1 6 1 7 ,9 4
%T 60
55
50
45
40
3 4 1 4 ,5 1
35
28,6
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
600
450,0
Figura 8. Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão molar 1:2 Sulfadiazina
de prata- β-Ciclodextrina
80,8
75
7 5 8 ,1 9
8 5 3 ,7 3
70
6 1 1 ,1 2
65
2 9 3 0 ,6 7
1 6 3 7 ,5 9
1 6 1 8 ,2 7
1 4 2 1 ,6 7
60
%T
55
1 1 5 8 ,9 3
50
1 0 8 3 ,0 7
45
1 0 3 1 ,3 9
40
3 4 1 4 ,5 4
33,8
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
600
450,0
Figura 9. Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão molar 1:3 Sulfadiazina
de prata- β-Ciclodextrina
42
82,2
80
8 5 4 ,0 4
4 8 2 ,7 5
75
2 9 3 0 ,3 6
1 4 2 0 ,3 6
6 1 6 ,0 5
70
65
1 6 3 7 ,8 7
1 6 1 7 ,6 9
1 0 3 2 ,3 3
60
%T
55
50
45
40
3 4 1 4 ,2 4
34,1
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
600
450,0
Figura 10. Espectro de infravermelho para complexo liofilizado razão molar 1:5 Sulfadiazina
de prata- β-Ciclodextrina
Bariccatii e colaboradores (2008) monitoraram a degradação do fármaco amoxicilina
na presença e ausência de β-ciclodextrina através de técnicas espectroscópicas, verificando
que as soluções contendo β-ciclodextrina sofrem uma fototransformação mais lenta que as
soluções sem β-ciclodextrina.
5.1.1 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
A técnica termoanalítica por meio de DSC foi utilizada para caracterização das
propriedades térmicas das amostras, no que se refere à determinação do ponto de fusão,
transição vítrea, calor específico, avaliação da presença ou não de polimorfos.
Analisando o termograma obtido, pela análise de DSC, da amostra de β-CD (Figura
11), observou-se que durante o aquecimento da amostra, um pico endotérmico na faixa de
temperatura de 29,65°C a 111,06°C, com ponto máximo em 74,35°C, caracterizando a
temperatura de fusão da amostra (Tm).
43
endo
Figura 11: Representação termograma da curva de DSC da amostra de β-CD.
A Figura 12 mostra o termograma obtido pela análise de DSC da amostra de
sulfadiazina de prata, com intervalo de análise RT 30°C a 300°C, indicando que não apresenta
pico endotérmico e nem pico exotérmico na faixa de temperatura de análise. Apresentando
um possível início de degradação próximo a 30°C.
Figura 12: Termograma da sulfadiazina de prata com intervalo de análise RT 30°C a 300°C.
44
Analisando o termograma da Figura 13, de β-ciclodextrina e Sulfadiazina de prata,
observou-se que durante o aquecimento da amostra, um pico endotérmico na faixa de
temperatura de 32,67°C a 42,62°C, com ponto máximo em 42,31°C, caracterizando a
temperatura de fusão da amostra (Tm).
Figura 13: Termograma do complexo sulfadiazina de prata- β-ciclodextrina
Bilensoy (2006) realizaram caracterização por DSC com amostra de clotrinazol, βciclodextrina e clotrimazol: β-ciclodextrina lifiolizado. O termograma DSC indicou
claramente endoterma, que o clotrimazol tem fusão bem definido em 148 º C e desidratação
da β-ciclodextrina é observada entre 50 e 120 º C. Al- Marzouqi e colaboradores (2009)
obtiveram desaparecimento do pico de fusão indicando complexação das amostra de
itraconazol, econazol e fluconazol em β-CD.
5.1.2 Doseamento por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A Tabela 1 apresenta as áreas referentes às diferentes concentrações de sulfadiazina de
prata, determinada por cromatografia líquida de alta eficiência, em um comprimento de onda
de 254 nm. As amostras foram analisadas seguindo a metodologia da Farmacopéia Americana
(THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2007).
45
Tabela 1– Valores referentes à construção da curva analítica da SDAg
Concentração
Áreas
Médias ± DP
DPR (%)
(μg/ml)
5
85.620,5
86.620,5
79.910,5
84.050,5±3,62
4.31
10
162.952
154.548
155.236
157.579,2±4,67
2.96
15
231.486
229.092
237.546
232.708,2±4,36
1.87
20
332.442
318.577
309.344
320.121,3±11,63
3.63
25
434.879
391.375
377.021
401.092 ± 30,13
7.51
DP = Desvio Padrão DPR (%) = Desvio Padrão Relativo
A Figura 12 representa a curva de calibração e a equação da reta obtidas por regressão
linear pelo método dos mínimos quadrados para SDAg.
Figura 14: Representação gráfica da curva analítica da sulfadiazina de prata.
A tabela 2 apresenta as concentrações das amostras obtidas a partir da curva de calibração.
Tabela 2– Valores referentes à concentração da amostra de SDAg complexada com β-CD.
Amostra
área 1
Área 2
Média
[] µg/ml [ ] %
1
30,70
23,66
27,18
1,698
11,32
2
36,78
42,2
39,49
2,471
16,47
3
38,71
45,93
42,32
2,648
17,66
O teor de inclusão do complexo de β-CD/SDAg foi determinado por CLAE utilizando
a curva padrão. A concentração da amostra injetada no cromatográfico foi calculada
46
utilizando-se a área e a equação da reta da Tabela 2. O teor de inclusão do complexo variou de
11,32 a 17,66%.
Melo e colaboradores (2007) estudaram a preparação e caracterização inicial de
complexo de inclusão entre nitrofurazona (NF) e 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, para a
quantificação do teor de fármaco foi utilizada a curva analítica determinada por CLAE.
Observou-se que a concentração de NF diminuiu em uma taxa de decomposição maior para o
fármaco em ausência de ciclodextrina.
5.1.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para Pseudomonas
aeruginosa e Candida albicans
As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) da sulfadiazina de prata (SDAg) e
sulfadiazina
de
prata
complexada
com
ciclodextrina
(β-CD/SDAg),
frente
aos
microrganismos Candida albicans e Pseudomonas aeruginosa evidenciadas no estudo, estão
representadas na Tabela 3.
Tabela 3 – Valores das CIM (µg/mL) de SDAg e β-CD/SDAg frente à Candida
albicans e Pseudomonas aeruginosa.
Candida albicans
Pseudomonas aeruginosa
AMOSTRA CIM (µg/mL)
CIM (µg/mL)
SDAg
4
2
β-CD/SDAg 1
2
A levedura Candida albicans requereu CIMs de 4 µg/mL e 1 µg/mL para SDAg e βCD/SDAg, respectivamente, para serem inibidas. A bactéria Pseudomonas aeruginosa
requereu CIMs iguais para sua inibição, onde a CIM foi igual a 2 µg/mL tanto para SDAg
quanto para β-CD/SDAg (Figura 15).
47
Figura 15: Placa utilizada no teste de microdiluição,
para Candida albicans após sua inoculação e incubação.
Figura 16: Placa utilizada no teste de microdiluição, para
Pseudomonas aeruginosa após sua inoculação e incubação.
Segundo Choran et al, (2009), sulfadiazina de prata é um antimicrobiano com eficácia
elevada contra vários microrganismos, até mesmo frente a leveduras do gênero Candida spp.
No presente estudo as CIM de sulfadiazina de prata necessárias para inibir o crescimento de
C. albicans foi igual a 4 µg/mL, este resultado foi semelhante ao encontrado por Choran et al,
(2009) onde CIM foi de 2 µg/mL. A CIM capaz de inibir o crescimento de Pseudomonas
48
aeruginosa frente a sulfadiazina de prata isoladamente encontrada neste estudo foi CIM = 2
µg/mL. Em um estudo de Waasbergen e colaboradores (2009) encontraram CIM = 1 µg/mL
de sulfadiazina de prata capaz de inibir o crescimento de Pseudomonas aeruginosa, revelando
semelhança com o estudo realizado.
49
6 CONCLUSÕES
A caracterização do complexo de inclusão foi realizada por IV e DSC. A análise dos
espectros de IV demonstrou que houve deslocamentos dos picos característicos da
sulfadiazina de prata (1325 a 1140cm-1
correspondente a S=O;
3350- 3250cm-1
correspondente a N=H), sendo esses dois picos utilizados como um indicador da formação do
complexo de inclusão da SDAg e β-ciclodextrina na razão molar 1:2.
As amostras obtidas em diferentes razões molares(1:1, 1:3 e 1:5) apresentaram
espectro de IV muito semelhantes, esta observação pode ser devido ao tipo de interação que
ocorre entre a SDAg e β-ciclodextrina.
A espectroscopia no IV utilizado neste estudo foi o método de escolha para avaliar a
formação do complexo de inclusão da SDAg/ β-ciclodextrina;
Em relação ao DSC utilizado na caracterização de Sulfadiazina de prata inclusa na βciclodextrina, observou-se um pico endotérmico na faixa de temperatura de 32,67°C a
42,62°C, com ponto máximo em 42,31°C; e foi comparado com o comportamento térmico da
β-ciclodextrina que apresentou um pico endotérmico na faixa de 29,65 a 111,06 °C, indicando
uma possível perda de água da SDAg;
O doseamento realizado por Cromatografia Líquida de alta eficiência (CLAE)
apresentou um teor que variou de 11,32 a 17,66%.
Os resultados obtidos pelo método microbiológico comprovam que a sulfadiazina de
prata inclusa em β- ciclodextrina embora com baixo teor, apresentou-se ativa contra bactéria
Pseudomonas aeruginosa e a levedura Candida albicans.
Mostrando, assim, que o fármaco incluso mesmo com baixa concentração apresentou
o mesmo efeito antimicrobiano do fármaco.
50
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