universidade federal de goiás programa de pós - IPTSP
Propaganda
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA SUELLEN ROCHA ARAÚJO CASTILHO Caracterização fenotípica e molecular de Acinetobacter baumannii isolados de pacientes de UTIs de Goiânia, com relação à capacidade de formar biofilmes e resistência aos carbapenêmicos Goiânia 2013 Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor(a): SUELLEN ROCHA ARAÚJO CASTILHO CPF: 007.904.911-76 E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ X ]Sim [ ] Não Vínculo Empregatício do autor: Professora da Rede Municipal de Educação Agência de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Sigla: CAPES Superior País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: Caracterização fenotípica e molecular de Acinetobacter baumannii isolados de pacientes de UTIs de Goiânia, com relação à capacidade de formar biofilmes e resistência aos carbapenêmicos Palavras-chave: Acinetobacter baumannii / formação de biofilme / blaPER-1 / resistência / carbapenêmicos / OXA Título em outra língua: Phenotypic and molecular characterization of Acinetobacter baumannii isolated from ICU patients in Goiânia, with respect to the ability to form biofilms and carbapenem resistance Palavras-chave em outra língua: Acinetobacter baumannii / biofilm formation / blaPER-1 / resistance / carbapenem / OXA Área de concentração: Microbiologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 21/02/2013 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública Orientador(a): Dr. André Kipnis CPF: 075.965.498-02 E-mail: [email protected] 3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ X ] total [ ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Outras restrições: ________________________________________________ Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. SUELLEN ROCHA ARAÚJO CASTILHO Assinatura do(a) autor(a) 1 Data: _17_ / _04_ / _2013_ Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados. SUELLEN ROCHA ARAÚJO CASTILHO Caracterização fenotípica e molecular de Acinetobacter baumannii isolados de pacientes de UTIs de Goiânia, com relação à capacidade de formar biofilmes e resistência aos carbapenêmicos Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientador: Prof. Dr. André Kipnis Goiânia 2013 ii Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Aluno (a): SUELLEN ROCHA ARAÚJO CASTILHO Orientador (a): DR. ANDRÉ KIPNIS Membros: 1. Dr. André Kipnis 2. Dr. João Alves de Araújo Filho 3. Dra. Maria Cláudia Dantas P. B. André Data: 21/02/2013 iii DEDICATÓRIA Ao meu esposo Alexandre, pelo carinho, paciência, compreensão e apoio. Aos meus pais, Péricles e Suelma, por todo amor a mim dedicado. Amo vocês! iv AGRADECIMENTOS A Deus, por me capacitar diante de todas as dificuldades enfrentadas e por me fortalecer a cada manhã. Sei que Ele esteve atento às minhas orações e a Sua resposta se concretiza com esta grande vitória! “Espera no Senhor, anima-te, e Ele fortalecerá o teu coração; espera, pois, no Senhor.” Ao meu esposo Alexandre, que em todo o tempo me apoiou, compreendeu e me aconselhou, mesmo quando era o principal alvo, e muitas vezes o único, dos meus surtos e crises de nervosismo e desespero, de modo que por vezes acabou por renunciar a si mesmo. Não há como mensurar o meu amor, respeito e carinho por você! Aos meus pais, Péricles e Suelma, que sempre acreditaram em mim. Por vezes vi as lutas que enfrentaram para garantir minha educação e ajudar na formação da pessoa que me tornei. Devo minha vida a vocês! À minha querida irmã Suelenne e meu cunhado Uadson, pelos momentos de descontração que me proporcionaram e por me deixarem fazer parte da vida de uma princesa chamada Alice. Amo vocês! À minha sogra Joasira, por fazer de pequenos instantes em sua companhia momentos de muita alegria. É um prazer fazer parte de sua família! A todos os meus familiares, que direta ou indiretamente, contribuíram para eu alcançar esta vitória. Em especial, minha vovó Eledyr e minhas cunhadas Rosângela e Solange. Ao meu orientador, Dr. André Kipnis, pela oportunidade de estágio e vaga na seleção de Mestrado e por todo apoio e confiança a mim dispensados. Seus conhecimentos e a dedicação em nos tornar cientistas me fizeram ver além das minhas limitações! Muito obrigada! Aos professores, Dra. Carla Afonso S. Bitencourt Braga, Dra. Maria Cláudia Dantas P. B. André e Dr. Plínio Lázaro Faleiro Naves, que participaram da Banca de Qualificação e moldaram a minha Dissertação com sugestões, críticas, elogios e conhecimentos compartilhados. À professora Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis, pela dedicação em corrigir meu artigo e me ajudar a vencer os desafios para uma escrita perfeita. Não poderia deixar de registrar a sua ajuda e apoio! Obrigada! v Ao autor MSc. Arto Baghdayan, da Universidade de Oklahoma (EUA), que respondeu com carinho aos meus e-mails, dedicando-me um pouquinho de seu tempo e instruindo-me na realização da técnica de formação de biofilme. I have no words to thank such attention! Your help was essential for the conclusion of this work! Thanks a lot! Às minhas amigas Sanair Santana e Alyne Pereira, por todo o companheirismo e por estarem sempre atentas ao meu desespero com conselhos de motivação. Espero contar sempre com vocês! A todos os meus colegas de laboratório, em especial Déllys Leonora, Bruna Daniella, Lázaro Moreira, Renato Beilner e Jacqueline Souza, por toda ajuda a mim prestada para que fosse possível a conclusão deste trabalho, e também aos colegas Viviane Lopes, Maysa Paula, Fabiana Metzker, Fábio Muniz, Rogério Coutinho e Aureliano Guedes, por tornarem nossos dias no laboratório mais leves e descontraídos! É muito bom ter todos vocês ao meu lado! Aos meus colegas de trabalho da Escola Municipal Senador Darcy Ribeiro, em especial à Diretora Valéria Alves, por compreender minhas muitas faltas, e também às colegas Lucilene Camilo, Rosane Vera, Fernanda Padilha, Louise Gonçalves, Isabella Barbosa, Valéria de Almeida e Jussimária Almeida, por fazerem meus dias na escola bem mais divertidos e menos estressantes. À CAPES, pelo apoio financeiro. vi SUMÁRIO TABELAS, FIGURAS E ANEXOS ix SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS xi RESUMO xv ABSTRACT xvi 1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA 1 1.1 TAXONOMIA DO Acinetobacter baumannii 1 1.2 Acinetobacter baumannii E PATOGÊNESE 2 1.3 IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL DE Acinetobacter baumannii 4 1.3.1 Identificação fenotípica 4 1.3.2 Identificação genotípica 5 1.4 PERFIL DE RESISTÊNCIA 8 1.4.1 β-lactamases de classe D 12 1.4.1.1 β-lacatamase OXA-23 14 1.4.1.2 β-lactamase OXA-40 14 1.4.1.3 β-lactamase OXA-51 15 1.4.1.4 β-lactamase OXA-58 15 1.4.2 Sequência de inserção ISAba1 16 1.4.3 blaPER-1 17 1.5 FORMAÇÃO DE BIOFILMES 17 1.5.1 Biofilme 20 1.5.2 Formação e maturação do biofilme 20 1.5.3 Sistema quorum-sensing 22 1.5.4 Resistência e Formação de Biofilme 23 1.6 EPIDEMIOLOGIA 26 2 JUSTIFICATIVA 32 3 OBJETIVOS 34 3.1 GERAL 34 3.2 ESPECÍFICOS 34 4 MATERIAL E MÉTODOS 35 4.1 ASPECTOS ÉTICOS 35 vii 4.2 RECRUTAMENTO DOS CASOS E COLETAS DE AMOSTRAS CLÍNICAS 4.3 ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO, SUSCEPTIBILIDADE MICROBIANA 35 36 4.4 TESTE DE VIABILIDADE DE Acinetobacter baumannii 37 4.5 EXTRAÇÃO DE DNA CROMOSSOMAL 37 4.6 EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL 38 4.7 TESTE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM POLIESTIRENO 38 4.8 IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA 40 4.8.1 Identificação do gene blaPER-1 41 4.8.2 Identificação dos genes OXA e ISAba1 41 5 RESULTADOS 43 5.1 FORMAÇÃO DE BIOFILME 43 5.2 GENE blaPER-1 43 5.3 RELAÇÃO DO GENE blaPER-1 COM A FORMAÇÃO DE BIOFILME 43 5.4 AMPLIFICAÇÃO DOS GENES OXA E ISAba1 44 5.5 RESISTÊNCIA E FORMAÇÃO DE BIOFILME 48 5.6 RELAÇÃO ENTRE A RESISTÊNCIA E O GENE blaPER-1 49 6 DISCUSSÃO 51 7 CONCLUSÕES 56 REFERÊNCIAS 57 ANEXOS 76 Anexo 1. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa 76 Anexo 2. Manuscrito 77 viii TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Tabela 1. Provas de identificação Acinetobacter. Tabela 2. Sistema de classificação para bactérias produtoras de β-lactamases de acordo com o substrato. 11 Tabela 3. Oligonucleotídeos usados para detecção de blaPER-1, βlactamases do tipo OXA e ISAba1 em Acinetobacter baumannii. 41 Tabela 4. Relação entre presença do gene blaPER-1 com a formação de biofilme bacteriano. 44 Tabela 5. Relação entre a intensidade da formação de biofilme e a presença do gene blaPER-1. 44 Tabela 6. Distribuição de genes β-lactamases do tipo OXA em isolados Acinetobacter baumannii com perfil de resistência aos antimicrobianos relacionados. 46 Tabela 7. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii na presença de genes β-lactamases do tipo OXA. 47 Tabela 8. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii na presença exclusiva de um dos genes β-lactamases do tipo OXA. 47 Tabela 9. Resultados do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados de Acinetobacter baumannii, em porcentagem (%). 48 Tabela 10. Padrão de resistência multidrogas de formadores e não-formadores de biofilme. 49 Tabela 11. Relação entre a presença do gene blaPER-1 e a resistência à cefepima. 50 Figura 1. Métodos genotípicos para identificação de espécies Acinetobacter. 7 Figura 2. Mecanismos potenciais Acinetobacter. 9 Figura 3. Divisão das carbapenemases em Classe A, B e D, de acordo com a classificação de Ambler. 10 Figura 4. Dendograma obtido para 73 β-lactamases de classe D de acordo Phillip (clustalW). 13 de bioquímica resistência para espécies antimicrobiana de 4 em ix Figura 5. Desenho esquemático mostrando três exemplos de possíveis pontos de entrada no corpo para biofilmes infecciosos. 19 Figura 6. Conceituação de desenvolvimento de biofilme e comportamento dinâmico em cada etapa da formação. 21 Figura 7. Representação esquemática das várias etapas de desenvolvimento de um biofilme de acordo com o modelo aceito para Pseudomonas aeruginosa. 22 Figura 8. Três hipóteses para os mecanismos de resistência a antibióticos em biofilme. 25 Figura 9. Países que relataram surtos por Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos. 26 Figura 10. Esquema representando a distribuição dos isolados e a disposição dos controles positivo e negativo e do BRANCO. 39 x SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS µg Micrograma µL Microlitro µM microMolar AFLP Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (do inglês, Amplified Fragment Lenght Polymorphism) AI Autoindutores AMI Amicacina AMP/SUL Ampicilina/sulbactam AmpC Enzima cefalosporinase cromossomal β-lactamase de classe C ARDRA Análise de Restrição do DNA ribossomal Amplificado (do inglês, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) ARI-1 Acinetobacter resistente ao imipenem (do inglês, Acinetobacter resistant imipenem) ATCC Coleção americana de tipos de cultura (do inglês, American Type Culture Collection) blaPER-1 Enzima β-lactamase de espectro estendido que hidrolisa cefalosporinas CAZ Ceftazidima CcrA Metallo- β-lactamase de Bacteroides fragilis CFPM Cefepima CHDL β-lactamases da classe D que hidrolisam carbapenêmicos (do inglês, Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase) CLSI Instituto de Padronização Laboratorial Clínica (do inglês, Clinical Laboratory Standards Institute) CPX Ciprofloxacina CRAB Acinetobacter baumannii resistente aos carbapenêmicos (do inglês, Carbapenem Resistant Acinetobacter baumannii) CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio (do inglês, cetyl trimethylammonium bromide) xi DNA Ácido Desoxirribonucléico (do inglês, Deoxyribonucleic Acid) dp Desvio padrão EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, ethylenediaminetetraacetic acid) ELISA Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (do inglês, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) EPS Exopolissacarídeo ESBL β-Lactamase de Espectro Estendido (do inglês, Extended-Spectrum βLactamase) g Aceleração de gravidade GEN Gentamicina GES Enzima de espectro estendido descrita em Guiana (do inglês, Guiana Extended Spectrum) GIM Imipenemase descrita na Alemanha (do inglês, German imipenemase) HCl Ácido clorídrico HDT Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad IMI Enzima β-lactamase que hidrolisa o imipenem (do inglês, Imipenemhidrolyzing β-lactamase) IMP Impenemase IPM Imipenem IS Sequência de Inserção (do inglês, Insertion Sequence) ISAba1 Sequência de Inserção Acinetobacter baumannii (do inglês, Insertion Sequence Acinetobacter baumannii) K1 Enzima β-lactamase descrita em Klebsiella KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase LACEN Laboratório Central de Saúde Pública Dr. Giovanni Cysneiros LB Lúria Bertani LVX Levofloxacina MDR Multidroga resistente xii MER Meropenem mg Miligrama MIR Enzima β-lactamase mediada por plasmídeo mL Mililitro mM miliMolar MYSTIC Programa de coleção de informações do teste anual de susceptibilidade ao imipenem (do inglês, Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) NaCl Cloreto de Sódio NaOH Hidróxido de Sódio NMC-A Enzima β-lactamase que hidrolisa carbapenemases da classe A de Ambler (do inglês, Not Metalloenzyme Carbapenemase) OD Densidade óptica (do inglês, Optic Density) OMP Proteína de Membrana Externa (do inglês, Outer Membrane Protein) OXA Enzima oxacilinase pb Pares de base PBP Proteínas que se ligam à penicilina (do inglês, Penicillin Bilding Protein) PBS Tampão fosfato-salino (do inglês, Phosphate Buffered Saline) PCR Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction) PDR Pandroga resistente pH Potencial hidrogeniônico PIP/TAZ Piperacilina/tazobactam POL Polimixina B/colistina PSE Enzima específica de Pseudomonas (do inglês, Pseudomonas specífic enzyme) rDNA DNA ribossomal (do inglês, ribosomal DNA) RNA Ácido Ribonucleico (do inglês, RiboNucleic Acid) RNAse Ribonuclease xiii rpoB Subunidade β da RNA polimerase (do inglês, RNA polymerase betasubunit) SDS Dodecil Sulfato de Sódio (do inglês, sodium dodecyl sulfate) SENTRY Programa Internacional de Vigilância em Microbiologia (do inglês, Worldwide Antimicrobial Surveillance Program) SHV Cefalosporinase da família sulfidril variável (do inglês, Sulfhydryl variable) SIM Imipenase descrita em Seoul (do inglês, Imipenase Seoul) SME Enzima específica de Serratia marcescens (do inglês, Serratia marcescens enzyme) SPM Metallo-β-lactamase descrita em São Paulo (do inglês, São Paulo metallo-β-lactamase) TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TE Tris EDTA TEM Enzima β-lactamase pertencente à família Temonieira TET Tetraciclina TGC Tigeciclina TSA Ágar de soja tríptica (do inglês, Triptic Soy Agar) TSB Caldo de soja tríptica (do inglês, Triptic Soy Broth) UTI Unidade de Terapia Intensiva VIM Imipenemase descrita em Verona (do inglês, Verona imipenemase) xiv RESUMO A espécie Acinetobacter baumannii é a representante mais importante do gênero, sendo considerado o patógeno de maior relevância, dentro do complexo A. baumannii – A. calcoaceticus, para as instituições de saúde mundialmente. Sua importância clínica tem aumentado nos últimos anos em parte devido a sua notável capacidade de aderência a superfícies devido a presença de estruturas como pili, produção de EPS (exopolissacarídeo) e presença de genes que favorecem a formação de biofilme, proporcionando maior adesão entre as células e consequente resistência aos antimicrobianos. Outro destaque é sua capacidade de regular ou adquirir resistência, em particular por meio das oxacilinases, codificadas pelo gene OXA, que apresentam atividade hidrolítica potente contra penicilinas resistentes às penicilinases. Até o momento, 250 tipos de OXA já foram descritas. A expressão de genes OXA pode ser aumentada na presença do elemento de inserção ISAba1, localizado à montante do gene, conferindo uma vantagem seletiva para o isolado quando este depende da expressão eficiente de uma variedade de genes de resistência a antibióticos. Na sua ausência, a resistência geralmente é expressa na presença de dois ou mais genes OXA. A capacidade de formar biofilme e a presença dos genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-58 e ISAba1 foram investigados em 84 isolados provenientes de 64 pacientes de UTIs de Goiânia. Observou-se que 78,5% dos isolados formaram biofilme, dos quais 23% apresentaram o gene blaPER-1. A presença do gene OXA-51 foi detectada em todos os isolados, enquanto que 64,3% dos isolados apresentavam o gene OXA-23, e em 24% dos isolados foi encontrado o gene OXA-58. O gene ISAba1 foi detectado à montante dos genes OXA-51, OXA-23 e OXA-58, em 33,3% (28/84), 92,6% (50/54) e 10% (2/20) dos isolados, respectivamente. Nenhum isolado estudado apresentou o gene OXA-40. Dos 62 isolados resistentes ao imipenem e meropenem, 76% dos isolados possuíam o gene OXA-23 enquanto que 24,2% possuíam o gene OXA-58. Dentre estes isolados, 79% (49/62) apresentaram a sequência de inserção ISAba1. No presente estudo, a presença do gene blaPER-1 não foi associada com a formação de biofilmes, enquanto que a presença de genes OXA estava relacionada à resistência em Acinetobacter baumannii. xv ABSTRACT The species Acinetobacter baumannii is the most important representative of the genus, being globally considered the pathogen of larger relevance, within the complex A. baumannii – A. calcoaceticus, to healthcare institutions worldwide. Its clinical significance has increased in recent years partly due to its notable capacity of adherence to surfaces due to presence of structures such as pili, production of EPS (exopolysaccharides) and presence of genes that favor biofilm formation, providing larger adhesion between the cells and consequent resistance to the antimicrobials. Another important characteristic is its capacity to regulate or to acquire antibiotic resistance, specifically through oxacilinases, encoded by the gene OXA, that presents potent hydrolytic activity against penicilinase-resistant penicillins. Until the moment, 250 types of OXA were already described. The expression of OXA genes can be increased in the presence of the insertion element ISAba1, which when located upstream of the gene, confer a selective advantage for the isolate when this depends on the efficient expression of a variety of resistance genes. In its absence, the resistance is usually expressed in the presence of two or more OXA genes. The capacity of biofilm formation and the presence of the genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA58 and ISAba1 were investigated among 84 isolates from 64 patients of the Intensive Care Units of Goiânia. It was observed that 78.5% of the isolates formed biofilm, of which 23% presented the gene blaPER-1. The presence of OXA-51 gene was detected in all isolates, whereas 64.3% of the isolates had the OXA-23 gene and 24.0% of the isolates had the OXA-58 gene. The ISAba1 gene was detected upstream of the OXA-51, OXA-23 and OXA-58 genes in 33.3% (28/84), 92.6% (50/54) and 10.0% (2/20) of the isolates, respectively. None of the isolates studied presented the gene OXA-40. Of the 62 isolates resistant to imipenem and meropenem, 76.0% possessed the OXA-23 gene while 24.2% of the isolates possessed the OXA-58 gene. Of these isolates, 79.0% (49/62) presented the gene ISAba1. In the present study, the blaPER-1 gene presence was not associated with the biofilm formation, while the presence of OXA genes was related to resistance in Acinetobacter baumannii. xvi 1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA 1.1 TAXONOMIA do Acinetobacter baumannii A história da descrição do gênero Acinetobacter remonta ao início do século 20, em 1911, quando Beijerinck, um microbiologista holandês, descreveu um organismo chamado Micrococcus calcoaceticus que foi isolado do solo por enriquecimento em um meio contendo acetato de cálcio. Nas décadas seguintes, organismos semelhantes foram descritos e atribuídos a pelo menos 15 gêneros e espécies diferentes, incluindo Diplococcus mucosus, Micrococcus calcoaceticus, Alcaligenes haemolysans, Mima polymorpha, Moraxella lwoffii, Herellea vaginocola, Bacterium anitratum, Neisseria winogradskyi, Achromobacter anitratus e Achromobacter mucosus (Peleg et al. 2008). A designação atual do gênero, Acinetobacter (do grego akineto, ou seja, sem motilidade), foi inicialmente proposta por Brisou e Prévot em 1954 para separar microorganismos móveis de não-móveis dentro do gênero Achromobacter. Antes mesmo de 1968, esta designação do gênero tornou-se mais amplamente aceita. Baumann et al. (1968) publicou uma pesquisa abrangente e concluiu que as diferentes espécies listadas acima pertenciam ao mesmo gênero, para o qual o nome de Acinetobacter havia sido proposto e que a subclassificação entre espécies diferentes com base em características fenotípicas ainda não era possível. Estas descobertas resultaram no reconhecimento oficial do gênero Acinetobacter pela Subcomissão Sobre a Taxonomia de Bactéria Moraxella e afins em 1971 (Lessel 1971 apud Peleg et al. 2008). Na edição de 1974 do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Lautrop 1974 apud Peleg et al. 2008) o gênero Acinetobacer foi listado com a descrição de uma única espécie, Acinetobacter calcoaceticus, no qual foi recomendado que o gênero compreendesse apenas isolados oxidase-negativos. Estudos posteriores incluíram A. lwoffi no gênero, com base na observação de que algumas cepas eram capazes de acidificar a glicose e outras não (Skerman et al.1980 apud Peleg et al. 2008). Com base em dados taxonômicos mais recentes, foi proposto que os membros do gênero Acinetobacter, como ficou definido, deveria ser retirado da família Neisseriaceae e classificados na nova família Moraxellaceae (Bergogne-Berezin & Towner 1996; Giamarellou et al. 2008), a qual inclui Moraxella, Acinetobacter, Psychrobacter e organismos relacionados (Rossau et al. 1991). Um grande avanço na 1 longa e complicada história do gênero foi realizado em 1986 por Bouvet e Grimont que, baseado na hibridização do DNA, foram delineados 12 grupos de DNA (genoespécies) de Acinetobacter, dos quais quatro novas espécies foram propostas, A. baumannii, A. haemolyticus, A. johnsonii e A. junii e a descrição das espécies já conhecidas, A. calcoaceticus e A. lwoffii, foram feitas (Bouvet & Grimont 1986). Desde a década de 1980, em paralelo com a descrição de Acinetobacter como patógeno nosocomial, a taxonomia do gênero tem sido refinada (Dijkshoorn et al. 2007). Até o ano de 2010, o gênero abrangia 19 espécies com nomes validamente publicados e uma série de espécies com denominações provisórias (Nemec et al. 2010). Com a recente descrição de Acinetobacter bereziniae (genoespécie 10), A. guillouiae (genoespécie 11), o gênero compreende 23 espécies nomeadas e 11 espécies com denominações provisórias (de Breij et al. 2010; Nemec et al. 2010). Diversos autores relatam pequenas diferenças genômicas entre as espécies do gênero Acinetobacter, no entanto as espécies 1 (A. calcoaceticus), 2 (A.baumannii), genoespécie 3 e genoespécie 13TU apresentam uma relação muito estreita, recebendo a denominação de complexo A. calcoaceticus – A. baumannii devido à dificuldade na separação destas espécies a partir de testes convencionais (Bouvet & Grimont 1986; Gerner-Smidt et al. 1991; Bergogne-Berezin & Towner 1996). Este complexo contém isolados que são, em sua maioria, acidificantes da glicose (Bergogne-Berezin& Towner 1996) e são responsáveis pela maioria das infecções adquiridas quer na comunidade, quer no hospital (Peleg et al. 2008). A. baumannii é a espécie de maior importância na medicina humana dentro do complexo A. baumannii – A. calcoaceticus (Tomaras et al. 2003). 1.2 Acinetobacter baumannii E PATOGÊNESE Em 1986, um sistema de identificação fenotípica de espécies de Acinetobacter foi descrito por Bouvet e Grimont, possibilitando a identificação de várias espécies do gênero, em particular o complexo A. calcoaceticus – A. baumannii (Bouvet & Grimont 1986; Dijkshoorn et al. 2007). A espécie Acinetobacter baumannii é o representante mais importante, sendo considerado o patógeno mais relevante para as instituições de saúde mundialmente (Peleg et al. 2008). São persistentes no ambiente hospitalar e causam uma variedade de infecções nosocomiais oportunistas (Loehfelm et al. 2008), incluindo infecções no trato 2 respiratório ou urinário, meningite, endocardite, bacteremia, especialmente em pacientes internados em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs), unidades neonatais e enfermarias de neurocirurgia (Tomaras et al. 2003; Lee et al. 2008; Rao et al. 2008; Nucleo et al. 2009; Tiwari et al. 2012). Frequentemente causam infecções associadas a dispositivos médicos como, por exemplo, catéteres vasculares, derivações liquóricas, catéteres de Foley bem como pneumonia associada à ventilação mecânica (Rodriguez-Bano et al. 2008). Sua significância clínica tem sido justificada por sua alta prevalência em epidemias e situações endêmicas, por sua notável capacidade de regular ou adquirir resistência aos antibióticos, à dessecação e sua capacidade de formar biofilmes em dispositivos médicos, contribuindo para a sua persistência no cenário hospitalar (Roberts et al. 2001; Peleg et al. 2008; de Breij et al. 2010). O uso extensivo de terapias antimicrobianas em hospitais tem contribuído para o surgimento e aumento no número de isolados resistentes a uma ampla gama de antimicrobianos, tornando-se um organismo que ameaça a eficácia dos mesmos (Zarrilli et al. 2004; Peleg et al. 2008; de Breij et al. 2010). A. baumannii é responsável por surtos de infecções hospitalares repentinos e de difícil controle. As circunstâncias locais das unidades de saúde e seu ambiente determinam o tipo de infecção e, consequentemente, o risco de contaminação, podendo contribuir para o surgimento de um surto de infecções hospitalares. Esta bactéria é considerada um agente patogênico de baixa virulência, podendo habitar sobre ou dentro do corpo humano sem causar doença. Assim, a disseminação por meio das mãos da equipe de saúde frequentemente não é detectada. Pacientes com sintomas de infecção por Acinetobacter representam a ponta do iceberg da colonização e disseminação. Quando as infecções tornam-se aparentes, é provável que o número de pacientes colonizados já esteja elevado, de modo que se tornam tardias as precauções para evitar um surto. Uma vez que um surto está estabelecido, todas as superfícies inanimadas no ambiente podem ser reservatórios de Acinetobacter (Joly-Guillou 2005). 3 1.3 IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL DE Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii compreende bactérias em forma cocobacilos Gramnegativas, ubíquas, aeróbias estritas, catalase-positiva e oxidase-negativa, imóveis (Bergogne-Berezin & Towner 1996), não fastidiosas, não fermentadoras de glicose (Peleg et al. 2008), que podem ser recuperadas a partir de diversas fontes, tais como o solo, água, produtos alimentares e ambientes médicos (Tomaras et al. 2003). Crescem bem em ágar sangue onde formam colônias branco-acinzentadas ou em ágar MacConkey com colônias levemente rosadas normalmente cremosas, mas que podem eventualmente ter aspecto mucóide (Peleg et al. 2008). A. baumannii tem requisitos de crescimento simples explorando uma variedade de fontes de alimentação e é adaptável a diferentes temperatura, teores de pH, salinidade e níveis de umidade (Iacono et al. 2008). Suas colônias assemelham-se às de Enterobacteriaceae, com um diâmetro de 1,5 a 3 cm após 18 horas de crescimento em meios sólidos, enquanto que a maioria das outras espécies de Acinetobacter produz colônias menores e mais translúcidas (Peleg et al. 2008). 1.3.1 Identificação Fenotípica A identificação bioquímica de A. baumannii compreende provas bioquímicas básicas, como a fermentação de glicose, redução de nitrato a nitrito, detecção de hemólise em ágar sangue de carneiro, utilização de citrato e outras fontes de carbono, e principalmente crescimento em caldo de infusão de cérebro e coração a 42°C (tabela 1) (Bouvet & Grimont 1986). Tabela 1. Provas bioquímicas de identificação das espécies de Acinetobacter. OXI MOT OFG Cresc. a 42°C CIT A. baumannii N N O P P P N N A. calcoaceticus N N O N P P N N A. haemolyticus N N I/O N P N P P A. lwoffii N N I N N N N N Acinetobacter sp N N I/O N P V V V Micro-organismos MAL GEL HEM OXI: oxidase; MOT: motilidade; CIT: citrato; MAL: malonato; GEL: gelatina OFG: meio de oxidação fermentação da glicose de Leifson; HEM: hemólise em ágar sangue; N: negativo; P: positivo; O: oxidativo; I: inerte; I/O: inerte/oxidativo; V: variável Fonte: Adaptado de ANVISA (2004a). 4 Em particular, as espécies estreitamente relacionadas e clinicamente mais relevantes A. baumannii e Acinetobacter genoespécie 13TU não podem ser distinguidas por identificação fenotípica, enquanto que A. calcoaceticus e Acinetobacter genoespécie 3 só podem ser separadas por suas propriedades de crescimento à diferentes temperaturas. Isto se deve à similaridade genética e fenotípica das espécies (Peleg et al. 2008). 1.3.2 Identificação Genotípica O método de hibridização de DNA proposto inicialmente por Bouvet e Grimont, 1986, para identificação e separação do gênero Acinetobacter em espécies não tem sido apropriado, uma vez que o complexo A. calcoaceticus – A. baumannii é altamente semelhante, combinando três das espécies clínicas mais relevantes (A. baumannii, genoespécie 3 e genoespécie 13TU) com uma espécie ambiental (A. calcoaceticus) (Bouvet & Grimont 1986; Dijkshoorn et al. 2007). A dificuldade em se distinguir o complexo A. calcoaceticus – A. baumannii têm levado ao desenvolvimento de métodos genotípicos para a identificação de espécies de Acinetobacter (Dijkshoorn et al. 2007). Entre eles estão a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR – Polimerase Chain Reaction) utilizando diferentes oligonucleotídeos iniciadores; a análise do perfil de restrição do produto amplificado do 16S rDNA (ARDRA); a análise fingerprint de alta resolução por Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) e o sequenciamento da região intergênica do gene 16S23R e ou sequenciamento do gene que codifica a subunidade β da RNA polimerase (rpoB) (Turton et al. 2006b; Dijkshoorn et al. 2007; Peleg et al. 2008). A identificação molecular de espécies de Acinetobacter pode ser determinada pelo sequenciamento de todo o genoma, análise de restrição de uma sequência particular de DNA e da determinação da sequência de DNA. A figura 1 mostra dois métodos genotípicos para a identificação de espécies de Acinetobacter: AFLP e ARDRA. AFLP (figura 1a) compreende os seguintes passos: digestão do DNA celular com duas enzimas de restrição; ligação dos adaptadores aos fragmentos de restrição; amplificação seletiva dos fragmentos; eletroforese de fragmentos em um sequenciador; e visualização dos perfis de restrição. Os perfis são comparados por análise de clusters àqueles de uma biblioteca de referência de fingerprints de AFLP usando software específico. Este método usado para a identificação de espécies é útil também para a identificação de estirpes (tipagem) e clones. ARDRA (figura 1b) compreende a amplificação de 5 sequências de 16S rDNA, seguido de restrição dos fragmentos amplificados com cinco enzimas de restrição e eletroforese. Os perfis resultantes são comparados com uma biblioteca de perfis de restrição. Padrões de restrição ARDRA podem ser comparados entre laboratórios. A análise da sequência de DNA, em particular da sequência 16S rDNA, é uma abordagem amplamente utilizada para avaliar as relações entre os microorganismos, e os dados são universalmente comparáveis. No entanto, algumas espécies Acinetobacter não relacionadas tem alta similaridade na sequência 16S rDNA, embora algumas espécies estreitamente relacionadas são encontradas em diferentes ramos da árvore filogenética 16S rDNA. Mais estudos são necessários para avaliar os níveis de cut-off das semelhanças intra e interespécies (Dijkshoorn et al. 2007). A identificação da espécie A. baumannii também pode ser confirmada pela detecção da presença do gene OXA-51. Este gene foi identificado a partir de uma ampla coleção de isolados A. baumannii coletados de diversas áreas geográficas. O gene ocorre naturalmente no cromossomo de A. baumannii, sendo caracterizado como um gene intrínseco à espécie (Brown et al. 2005; Heritier et al. 2005; Turton et al. 2006a; Turton et al. 2006b; Feizabadi et al. 2008). 6 Figura 1. Métodos genotípicos para identificação de espécies de Acinetobacter: AFLP (a) e ARDRA (b). Fonte: Adaptado de Dijkshoorn et al. (2007) 7 1.4 PERFIL DE RESISTÊNCIA Inicialmente, A. baumannii foi considerado um patógeno nosocomial de baixa virulência, no entanto, estudos recentes têm mostrado que este micro-organismo é mais virulento do que previamente relatado (Smani et al. 2012). O ambiente hospitalar pode representar um importante reservatório para A. baumannii durante infecções nosocomiais; em particular pacientes que permanecem em unidades de cuidado por períodos prolongados, podem ser colonizados por esta bactéria e carregá-la por longos períodos sem sintomas visíveis. A sua habilidade à persistência está relacionada à resistência multidrogas, permitindo que a mesma sobreviva a terapias antimicrobianas prolongadas em pacientes hospitalizados (Nucleo et al. 2009). Os isolados clínicos de A. baumannii geralmente são multidroga resistentes às tetraciclinas, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, maioria dos β-lactâmicos e alguns carbapenêmicos (Dijkshoorn et al. 2007; Shahcheraghi et al. 2011). A resistência é mediada por uma variedade de mecanismos (figura 2), como modificações do local alvo, bombas de efluxo, inativação enzimática de antimicrobianos (Nucleo et al. 2009) e presença de elementos como plasmídeos, integrons e transposons que são adquiridos, sugestivamente, por transferência horizontal (Dijkshoorn et al. 2007; D'Arezzo et al. 2009). A resistência aos aminoglicosídeos tem sido atribuída a pelo menos, nove distintas enzimas modificadoras, que podem ser encontradas em diferentes combinações em algumas estirpes. Mutações pontuais específicas nos genes que codificam a DNA-girase e topoisomerase IV, tem sido correlacionadas com a resistência às fluoroquinolonas e a resistência às tetraciclinas tem sido associada com genes que codificam as bombas de efluxo tetraciclinas-específicas (Dijkshoorn et al. 2007). A produção de enzimas βlactamases tem sido relatada como um importante mecanismo de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, hidrolisando o anel β-lactâmico pela quebra da ligação amida, perdendo assim, a capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana (Williams 1999), neutralizando o efeito de antibióticos como o imipenem, meropenem e penicilina. Estas enzimas são produzidas por bactérias Gram-negativas como um importante meio de autodefesa contra antimicrobianos β-lactâmicos e A. baumannii não é exceção (Tiwari et al. 2012). Os carbapenêmicos são as drogas de escolha para o tratamento de infecções causadas por bacilos Gram-negativos multirresistentes (Quale et al. 2003), mas a 8 resistência de A. baumannii aos mesmos tem aumentado em todo o mundo na última década (Sohrabi et al. 2012). Figura 2. Mecanismos potenciais de resistência antimicrobiana em Acinetobacter O Acinetobacter, como outra bactéria Gram-negativa, tem uma membrana externa e uma membrana citoplasmática, entre as quais (o espaço periplasmático) residem as β-lactamases (carbapenemases, AmpC β-lactamases e β-lactamases de espectro estendido). As penicillinbinding proteins (PBPs), localizadas na membrana citoplasmática, constituem o alvo final dos β-lactâmicos. Uma vez no espaço periplasmático, os β-lactâmicos se ligam às PBPs ou são ativamente expelidos da estrutura bacteriana através de bombas de efluxo. Acinetobacter pode abrigar integrons e transposons, elementos genéticos no cromossomo bacteriano ou em plasmídeos, que podem carregar múltiplos genes de resistência que codificam a síntese de enzimas (ex: β-lactamases de espetro estendido e metalo β-lactamases). Fonte: Adaptado de Munoz-Price & Weinstein (2008) A resistência aos carbapenêmicos em espécies de Acinetobacter ocorre devido à combinação de vários mecanismos de resistência, incluindo a produção de β-lactamases 9 que pode estar associada com a perda de porinas de membrana externa e/ou superexpressão da bomba de efluxo ou, mais raramente, com a alteração das proteínas que se ligam às penicilinas (PBPs – penicillin-binding protein) (Gur et al. 2008). A combinação de diferentes mecanismos são classificados como enzimáticos e nãoenzimáticos, porém o mecanismo mais importante de resistência a esta classe de antibióticos é a hidrólise enzimática, mediada por enzimas chamadas carbapenemases. Estas enzimas pertencem a uma das três classes moleculares, de acordo com a classificação de Ambler (figura 3) (Opazo et al. 2012). Vários estudos têm relacionado a presença de enzimas metalo- β-lactamases com a resistência de A. baumannii aos carbapenêmicos, mas as carbapenemases mais prevalentes nesta espécie são as βlactamases de classe D que hidrolisam carbapenêmicos (CHDLs, - carbapenemhidrolizing class D β-lactamases) (Mugnier et al. 2008; Opazo et al. 2012). Figura 3. Divisão das carbapenemases em Classe A, B e D, de acordo com a classificação de Ambler. As carbapenemases de classe D são representadas pelas Oxacilinases (OXA). Fonte: Adaptado de Opazo et al. (2012) As oxacilinases, também conhecidas como β-lactamase de classe D, são compostas por enzimas com serina no sítio ativo assim como as β-lactamases de classes A e C de Ambler, que diferem na estrutura de aminoácidos; enquanto as β-lactamases de classe B são compostas por enzimas com zinco em seu sítio ativo. A maioria das enzimas de classe D pertence ao grupo 2d do esquema de classificação funcional de β-lactamases de Bush et al. (1995) (tabela 2). Entre as quatro classes moleculares, a classe D apresenta maior diversidade de enzimas, a qual é observada tanto nos níveis genético como 10 bioquímico, com enzimas que possuem hidrólise quer de espectro estreito ou estendido. Além disso, várias β-lactamases de classe D possuem atividade de espectro estendido, resultante de mutações pontuais (Poirel et al. 2010). Tabela 2. Sistema de classificação para bactérias produtoras de β-lactamases de acordo com o substrato alvo. Grupo Bush, Jacoby e Medeiros Classe Molecular Ambler 1 C Cefalosporinas - - Enzimas AmpC de bactérias Gram-negativas; MIR-1 2a A Penicilinas + - Penicilinases de bactérias Gram-positivas 2b A Penicilinas e Cefalosporinas + - TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be A Penicilinas, Cefalosporinas de espectro reduzido, Cefalosporinas de amplo-espectro e Monobactâmicos 2br A Penicilinas 2c A Penicilinas e Carbenicilinas 2d D Penicilinas, Cloxacilina e Carbapenêmicos 2e A Cefalosporinas 2f A 3 B 4 Inibida por Substrato alvo Exemplo ACa EDTA TEM-3 a TEM-26, SHV-2 a SHV-6, K1 K. oxytoca + +/- - TEM-30 a TEM-36, TRC-1 + - PSE-1, PSE-3, PSE-4 +/- - OXA-1 a OXA-11, PSE-2 (OXA-10) + - Cefalosporinases induzíveis de Proteus vulgaris Penicilinas, Cefalosporinas e Carbapenêmicos + - NMC-A de E. cloacae, Sme1 de Serratia marcescens Maioria β-lactâmicos, incluindo Carbapenêmicos - + L1 de Stenotrophomonas maltophilia, CcrA de Bacterioides fragilis - ? Penicilinases de B. cepacia Não determinada Penicilinas a AC. Ácido Clavulânico Fonte: Adaptado de Bush et al. (1995) Há diferentes mecanismos envolvidos na resistência aos antibióticos carbapenêmicos, dentre eles a produção de diferentes β-lactamases do tipo OXA é a mais prevalente (Sohrabi et al. 2012). A classe D (OXA) tem emergido como a principal carbapenemase no mundo (Shahcheraghi et al. 2011). O primeiro surto nosocomial com A. baumannii resistente aos carbapenêmicos (CRAB – Carbapenem-Resistant A. baumannii) foi relatado nos Estados Unidos em 1991. Desde então, infecções por CRAB e surtos hospitalares têm sido relatados 11 mundialmente (Shahcheraghi et al. 2011). Surtos nosocomiais com isolados de Acinetobacter que produzem enzimas de resistência OXA tem sido relatados no Brasil, Polinésia Francesa, Espanha, Sudeste Europeu, Coréia e Argentina (Feizabadi et al. 2008). 1.4.1 β-lactamases de classe D Originalmente, a denominação oxacilinase (OXA), deveu-se à capacidade deste grupo de carbapenemases de hidrolisar mais rapidamente a oxacilina, cloxacilina e a meticilina do que as penicilinas clássicas e ao fato de não serem inibidas pelo ácido clavulânico e EDTA (Heritier et al. 2005; Opazo et al. 2012). Hoje essa definição não é válida, uma vez que tem sido descrito, recentemente, que as enzimas inativam fracamente a cloxacilina e a oxacilina (Opazo et al. 2012) e o grupo é fracamente inibido pelo ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam, enquanto que a sua atividade pode ser inibida por NaCl in vitro (Heritier et al. 2005; Poirel et al. 2010). Embora identificados primeiramente em plasmídeos, tem sido demonstrado que muitas espécies Gram-negativas possuem naturalmente em seus genomas os genes que codificam as OXA sendo, portanto, consideradas enzimas residentes (Poirel et al. 2010). Baseado na identidade de suas sequências de aminoácidos, as carbapenemases foram divididas em grupos filogenéticos (figura 4), dos quais OXA-23, OXA-40, OXA51 e OXA-58 têm sido identificados em A. baumannii. 12 Figura 4. Dendrograma obtido para 73 β-lactamases de classe D de acordo com Phillip (clustalW). Os comprimentos de ramificação à escala são proporcionais ao número de alterações no aminoácido. A distância ao longo do eixo vertical não tem qualquer significado. Os diferentes clusters identificados, permitiram a identificação de nove grupos principais, considerando que as proteínas de um mesmo grupo têm uma identidade maior que 80% na sequência de aminoácidos. Fonte: Adaptado de Poirel et al. (2010) Até o momento, já foram descritas 250 tipos de OXA (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1) as quais apresentam grande divergência em termos de propriedades bioquímicas. Enquanto algumas enzimas do tipo OXA possuem espectro hidrolítico restrito às penicilinas e cefalosporinas de primeira e segunda geração (oxacilinases de espectro limitado), outras são capazes de hidrolisar 13 cefalosporinas de terceira e quarta gerações (ESBL do tipo OXA), e certas variantes ainda apresentam atividade hidrolítica contra o imipenem (carbapenemases do tipo OXA) (Picão 2009). 1.4.1.1 β-lactamase OXA-23 A primeira descrição de OXA em A. baumannii foi em 1985, em um hospital escocês. Inicialmente recebeu o nome de ARI-1 (Acinetobacter Resistent to Imipenem); mais tarde seu gene foi sequenciado e designado como OXA-23 (Opazo et al. 2012; Sohrabi et al. 2012). Desde então, essa enzima tem sido relatada em diferentes partes do mundo (Feizabadi et al. 2008; Sohrabi et al. 2012), porém somente em Acinetobacter sp., com uma única exceção, uma vez que este gene também foi identificado no cromossomo de um Proteus mirabilis resistente a carbapenêmicos isolado na França (Poirel et al. 2010). A enzima apresenta resistência ao ácido clavulânico (Nordmann & Poirel 2002) e o gene pode estar localizado no cromossomo ou no plasmídeo de A. baumannii (Mugnier et al. 2008; Mugnier et al. 2010). De acordo com os resultados apresentados por Poirel e Nordmann, as medições hidrolíticas mostraram baixa atividade de OXA-23 contra o imipenem; no entanto, em comparação com outras βlactamases de classe D, esta hidrólise foi significativa e permitiu definir o novo subgrupo de OXAs, atualmente chamado CHDL (Poirel & Nordmann 2006a). Brown detectou em seus experimentos uma lenta hidrólise do imipenem pelo OXA-23, mas não detectou hidrólise do meropenem. O mesmo foi observado com OXA-40 e OXA-51 (Brown et al. 2005). 1.4.1.2 β-lactamase OXA-40 O grupo OXA-40 (inicialmente denominado OXA-24 devido a um erro de sequenciamento inicial, ver http://www.lahey.org/Studies/) foi originalmente identificado no cromossomo de um isolado de A. baumannii resistente a carbapenêmicos na Espanha. Em seguida o gene foi identificado em diferentes áreas, especialmente em Portugal, na Espanha e também nos Estados Unidos. O gene tem sido identificado no cromossomo ou no plasmídeo (Brown et al. 2005; Poirel et al. 2010). O perfil de atividade hidrolítica é restrito, inclui principalmente as penicilinas. A hidrólise do imipenem é de baixo nível, e a do meropenem não foi detectada (Joly-Guillou 2005). O OXA-40 apresenta 60% de similaridade com a sequência de aminoácido do OXA-23 e não é inibido por NaCl (Poirel et al. 2010; Sohrabi et al. 2012). 14 1.4.1.3 β-lactamase OXA-51 Recentes relatos de diferentes países têm mostrado que o gene OXA-51 é intrínseco à espécie A. baumannii, sendo encontrado no cromossomo desta espécie (Turton et al. 2006a; Turton et al. 2006b; Feizabadi et al. 2008; Gur et al. 2008). Esta enzima não contribui significativamente para o padrão de resistência natural observada em A. baumannii, apresentando fraca atividade carbapenemases (Hu et al. 2007; Poirel et al. 2010). Takagi et al. (2009) relataram a combinação entre a expressão deste gene como os mecanismos responsáveis pela resistência ao imipenem. Nenhuma das cefalosporinas é hidrolisada por OXA-51, com exceção da cefaloridina. A hidrólise do imipenem é lenta e meropenem não é hidrolisado por esta enzima (Brown et al. 2005). Os genes que codificam OXA-51 e derivativos, foram identificados a partir de uma grande coleção de isolados de A. baumannii recuperados de amplas áreas geográficas. Provavelmente, a maioria das variantes de OXA-51, se não todas, partilham propriedades bioquímicas idênticas (Poirel et al. 2010). 1.4.1.4 β-lactamase OXA-58 A ocorrência de OXA-58 em Acinetobacter sp. é generalizada e consistentemente associada com a resistência não somente aos carbapenêmicos, mas também a muitos outros antimicrobianos, assim com β-lactâmicos, fluoroquinolonas e aminoglicosídeos (Figueiredo et al. 2011). Esta β-lactamase hidrolisa penicilinas e carbapenêmicos em um nível baixo. Foi identificada pela primeira vez na França, em um isolado A. baumannii multidroga resistente (Poirel et al. 2010; Sohrabi et al. 2012) e frequentemente é mediada por plasmídeo, apresenta similaridade superior a 50% com as sequências de aminoácidos dos outros três grupos (Sohrabi et al. 2012). Turton et al. (2006a) destacaram em seus resultados a resistência de OXA-58 ao imipenem e meropenem. Feizabadi et al. (2008) concluíram em seus estudos que a resistência aos carbapenêmicos está relacionada com a presença de, no mínimo, dois genes do tipo OXA. 15 1.4.2 Sequência de inserção ISAba1 As sequências de inserção (IS – Insertion Sequence) são os menores e mais abundantes elementos transponíveis. Estes elementos podem conter fortes promotores que desempenham um papel importante na expressão dos genes de resistência a antibióticos, os quais estão localizados próximos ao local de inserção destes elementos. Recentemente uma sequência de inserção foi identificada em A. baumannii, denominada ISAba1 ( Insertion Sequence Acinetobacter baumannii) (Sohrabi et al. 2012). Diferentes IS têm sido descritas em Acinetobacter, cada uma em associação com genes específicos, desempenhando importante papel no desenvolvimento da resistência aos carbapenêmicos (Poirel & Nordmann 2006a, 2006b; Turton et al. 2006a; Feizabadi et al. 2008; Mugnier et al. 2008; Sohrabi et al. 2012). As mais conhecidas são ISAba1, ISAba2, ISAba3 e ISAba4, onde ISAba1 parece estar relacionada unicamente com a espécie A. baumannii (Peleg et al. 2008). A introdução da sequência de inserção ISAba1 pode agir como um forte promotor aumentando a expressão dos genes (Poirel & Nordmann 2006a; Turton et al. 2006a; Sohrabi et al. 2012;). Os grupos OXA-23, OXA-51 e OXA-58 possuem com frequência associação com esses IS. Dentre eles, o OXA-23 é o mais comum e frequentemente associado aos ISAba1 e ISAba4 (Poirel & Nordmann 2006a; Turton et al. 2006a; Bogaerts et al. 2008; Mugnier et al. 2010;; Sohrabi et al. 2012). Tem sido relatado a associação do grupo OXA-51 com os elementos de inserção ISAba1 e ISAba9, proporcionando sequências promotoras para a expressão de alto nível desta enzima (Turton et al. 2006a; Figueiredo et al. 2009; Sohrabi et al. 2012). As sequências promotoras que desempenham importante papel na expressão de OXA-58 foram descritas como ISAba1, ISAba2 e ISAba3 (Poirel & Nordmann 2006a, 2006b; Turton et al. 2006a; Bertini et al. 2007; Gur et al. 2008; Sohrabi et al. 2012). A diminuição da susceptibilidade a carbapenêmicos pode não estar relacionada à presença única de alelos intrínsecos do tipo OXA-51, sendo uma explicação plausível a regulação mediada por sequências de inserção ISAba1 (Turton et al. 2006a). No entanto, a detecção de alelos genéticos que codificam enzimas do tipo OXA-23 e OXA-58 estão associados com, no mínimo, a diminuição da susceptibilidade aos carbapenêmicos (Woodford et al. 2006). De acordo com Segal et al. (2005), a abundância de ISAba1 em Acinetobacter sp. reflete a motilidade do elemento e indica que os eventos de transposição ocorram com frequência. Sugerem ainda plasticidade do genoma do Acinetobacter como transposição da sequência de inserção, podendo causar uma variedade de rearranjos genômicos. 16 1.4.3 blaPER-1 O gene blaPER-1 foi identificado pela primeira vez em 1993 na Turquia, em isolados de Pseudomonas aeruginosa e mais tarde em Salmonella enterica sorovar Typhimurium e isolados de Acinetobacter (Paterson & Bonomo 2005; Poirel et al. 2005). Um estudo conduzido na Turquia em 1996 revelou uma alta prevalência do gene blaPER-1 entre isolados nosocomiais de Acinetobacter spp. (46%) e P. aeruginosa (11%) (Vahaboglu et al. 1997). Durante anos, pensou-se que a presença de genes que codificam β-lactamases PER fosse significativa somente na Turquia (PER-1) e na Argentina (PER-2) (Danel et al. 1995; Bauernfeind et al. 1996). No entanto, a identificação do gene blaPER-1 tem sido relatada recentemente em vários países da Europa (Miro et al. 2005; Hou et al. 2007; Naas et al. 2007b), Coréia do Sul (Yong et al. 2003; Jeong et al. 2005), China (Hou et al. 2007) e Japão (Yamano et al. 2006). Este gene codifica uma enzima que está classificada na classe A de Ambler (Nordmann & Naas 1994) e confere resistência às penicilinas, cefotaxima, aztreonam monobactâmico, porém é sensível aos carbapenemas e cefamicinas. A sua atividade é inibida pelo ácido clavulânico. É um gene comum entre as espécies de Acinetobacter (Paterson & Bonomo 2005; Poirel et al. 2005). Estudos recentes têm mostrado uma correlação positiva entre a formação de biofilme e a presença da β-lactamase de espectro estendido (ESBL – extended spectrum β-lactamase) codificada pelo gene blaPER-1 entre os isolados de A. baumannii (Sechi et al. 2004; Lee et al. 2008). 1.5 FORMAÇÃO DE BIOFILMES Os isolados de A. baumannii têm sido avaliados quanto à capacidade de sobreviver longos períodos de tempo em superfícies abióticas com habilidade de tolerar a dessecação (Roberts et al. 2001; Gaddy & Actis 2009), devido a fatores de virulência como a habilidade em captar o ferro do meio ambiente, sobrevivendo em condições de déficit de ferro, produção de cápsula polissacarídica, capacidade de aderência a diversas superfícies e às células do epitélio respiratório por meio de estruturas como pili, fímbrias, proteínas de membrana externa (OMP) e presença de genes relacionados à formação de biofilme (Tomaras et al. 2003; Wroblewska et al. 2008; Smani et al. 2012). 17 A potencial habilidade de A. baumannii para formar biofilmes pode explicar sua excelente resistência a antibióticos e propriedades de sobrevivência (Tomaras et al. 2003; Rao et al. 2008). Gaddy & Actis (2009) e Lee et al. (2008) relataram a formação de biofilme de A. baumannii em poliestireno. Vidal et al. (1997) destacam que poucos estudos têm mostrado a capacidade destes isolados clínicos em formar estruturas de biofilme em superfícies de vidro. Biofilmes bacterianos, arranjo em que as células são morfológica, metabólica e fisiologicamente diferentes de suas contrapartes planctônicas, foram observados associados a dispositivos médicos pela primeira vez em 1980 quando, por microscopia eletrônica, foram visualizadas bactérias depositadas sobre a superfície de dispositivos de longa permanência, como catéteres intravenosos e marca-passos. A formação de biofilme também tem sido observada em tubos de incubação, catéteres, válvulas cardíacas artificiais, catéteres de diálise peritoneal, linhas de água e instrumentos (figura 5) (Tomaras et al. 2003; Hall-Stoodley et al. 2004). Os biofilmes são notoriamente difíceis de erradicar, sendo fonte de muitas infecções crônicas. Um biofilme maduro pode tolerar uma concentração de antibióticos na ordem de 10 a 100 vezes maior do que é necessário para matar as bactérias planctônicas. Bactérias em biofilmes são resistentes à fagocitose, tornando extremamente difícil a erradicação de biofilmes em hospedeiros (Mohamed & Huang 2007). Pouco se sabe sobre a formação de biofilme em A. baumannii (Rao et al. 2008; Rodriguez-Bano et al. 2008). 18 Figura 5. Desenho esquemático mostrando três exemplos de possíveis pontos de entrada no corpo para biofilmes infecciosos. O biofilme pode ser disseminado em todo o corpo, quer por células individuais ou aglomerados de êmbolos protegidos, os quais podem ganhar a corrente sanguínea próxima aos pontos de entrada (setas). Desprendimentos esporádicos podem levar a ciclos de bacteremia. Fonte: Adaptado de Hall-Stoodley et al. (2004). 19 1.5.1 Biofilme Biofilme é uma comunidade microbiana séssil altamente estruturada (Tomaras et al. 2003; Lee et al. 2008), que é caracterizado por células que são irreversivelmente ligadas a superfícies bióticas ou abióticas e incorporadas em uma matriz hidratada de substâncias exopoliméricas, proteínas, polissacarídeos e ácidos nucleicos (Mohamed & Huang 2007; Lee et al. 2008). A formação de biofilme é um processo complexo que envolve o desenvolvimento de fixação e imobilização sobre uma superfície, a interação célula-a-célula, a formação de microcolônias, a formação de um biofilme confluente e o desenvolvimento de uma estrutura tridimensional de biofilme. As bactérias em um biofilme se comportam de maneira diferente de sua forma livre. A regulação da expressão do gene bacteriano em resposta à densidade de população celular, chamado quorum-sensing, é realizado através da produção de moléculas de sinais extracelulares, chamados autoindutores (Mohamed & Huang 2007; de Breij et al. 2010). Vários fatores ambientais regulam a formação do biofilme bacteriano, tais como variações na disponibilidade de nutrientes, de oxigênio e de pH e a concentração de metabólitos bacterianos, o que provoca diferenças entre os biofilmes, de modo que um biofilme formado numa corrente difere de um formado sobre tecido biológico (Singh et al. 2006). No biofilme as bactérias são protegidas contra as defesas do hospedeiro e contra a ação de antimicrobianos (Shannon et al. 2010). 1.5.2 Formação e maturação do biofilme Biofilmes não são simplesmente um conjunto de células passivas que estão presas à superfície, mas são sistemas biológicos complexos que possuem estrutura e são dinâmicos (figura 6) (Hall-Stoodley et al. 2004). A formação do biofilme é geralmente descrita como uma série de fases discretas em um ciclo de vida (figura 7), que se inicia quando as células planctônicas aderem a uma superfície (Nadell et al. 2009). Após a fixação inicial ocorre divisão binária, resultando na agregação das células aderidas (Melchior et al. 2006). A aderência inicial geralmente é reversível, de modo que as células podem se afastar da superfície se as condições alteram. Algumas bactérias podem posicionar-se usando pili, permitindo a movimentação entre as bactérias e ao longo do substrato sólido (Nadell et al. 2009). 20 Estes agregados de células primárias produzem exopolissacarídeos para facilitar a agregação. Assim a fase inicial da formação de biofilme envolve duas etapas: a primeira fase compreende a aderência das células a uma superfície, facilitada pelas adesinas associadas à parede celular, que são produtos de diferentes genes. Nesta etapa ocorre a liberação de autoindutores do quorum-sensing. A aderência às superfícies poliméricas nativas é aumentada na presença de proteínas de matriz, incluindo fibronectina e fibrinogênio. A segunda etapa é caracterizada por multiplicação celular e formação de uma estrutura madura que consiste em muitas camadas de células, ligadas entre si por polissacarídeos extracelulares. Finalmente no processo de maturação, os componentes extracelulares interagem com as moléculas orgânicas e inorgânicas do meio favorecendo a produção de glicocálice, ocorrendo ligações iônicas e protegendo as células do biofilme (Melchior et al. 2006). Figura 6. Conceituação de desenvolvimento de biofilme e comportamento dinâmico em cada etapa da formação. Fonte: Adaptado de Hall-Stoodley et al. (2004). 21 Figura 7. Representação esquemática das várias etapas de desenvolvimento de um biofilme de acordo com o modelo aceito para Pseudomonas aeruginosa. Fonte: Adaptado de Ghigo (2003) 1.5.3 Sistema quorum-sensing Quorum-sensing é um mecanismo de sinalização célula-célula que se refere à capacidade das bactérias para responder a moléculas químicas, chamadas autoindutores (AI), no seu ambiente de uma forma dependente da dose. Os AI podem ser produzidos a partir de bactérias de mesma espécie ou de gêneros diferentes (Kaper & Sperandio 2005). Nos diferentes organismos que realizam o quorum-sensing, o processo segue essencialmente as mesmas etapas. Quando a concentração de AI atinge um limiar crítico, as bactérias detectam e respondem a este sinal, alterando a expressão do seu gene alvo. Este fenômeno permite que as bactérias ajam como uma unidade coletiva (Kaper & Sperandio 2005). O nível de especificidade e de controle é intrigante, dadas as complexidades associadas com as comunidades microbianas: os biofilmes bacterianos geralmente são formados por múltiplas espécies, onde cada uma das espécies pode produzir múltiplos sinais, e o circuito de resposta utilizado por esses sinais também está interligado (Jayaraman & Wood 2008). A primeira caracterização de quorum-sensing foi na bactéria marinha Vibrio fischeri. Esta espécie vive em associação com diferentes hospedeiros animais marinhos e pode colonizar o órgão de luz do hospedeiro, na qual cresce a altas densidades emitindo luminescência. Quando as bactérias encontram-se livres na água do mar, a luminescência não é observada. Ou seja, V. fischeri produz um complexo enzima 22 luciferase codificado pelos genes luxCDABEGH que é responsável pela produção de luz. No entanto, a transcrição do operon lux e subsequente produção de luz ocorrem apenas em altas densidades de V. fischeri, e são reprimidos em baixas densidades (Kaper & Sperandio 2005: Jayaraman & Wood 2008). O quorum-sensing é mediado de forma semelhante ao de V. fischeri na maioria das bactérias Gram-negativas. Esse sistema codifica uma gama de funções, incluindo a produção de sideróforo, a divisão celular, a síntese de polissacarídeo e motilidade (Jayaraman & Wood 2008; Christiaen et al. 2011). 1.5.4 Resistência e Formação de Biofilme Os mecanismos de resistência a antibióticos conhecidos, tais como bombas de efluxo, enzimas modificadoras e mutações alvo (Walsh 2000), não parecem ser responsáveis pela proteção de bactérias em um biofilme. Mesmo bactérias sensíveis que não têm uma base genética conhecida para resistência podem ter a sensibilidade profundamente reduzida quando elas formam biofilme (Stewart & Costerton 2001). Quando as bactérias estão dispersas de um biofilme, geralmente tornam-se rapidamente suscetíveis a antibióticos (Anwar et al. 1989; Williams et al. 1997), o que sugere que a resistência das bactérias em biofilme não é adquirida através de mutações ou elementos genéticos móveis. Os mecanismos de resistência a antibióticos convencionais não são suficientes para explicar a maioria dos casos de infecções de biofilme resistentes a antibióticos, porém este fato não exclui a possibilidade de que os mecanismos de resistência convencionais sejam expressos em biofilmes contribuindo para a resistência a antibióticos. Resistência a antibióticos convencionais pode ser desenvolvida em biofilmes tratados repetidamente, ou por um longo período de tempo, contribuindo para a persistência de infecções com biofilmes (Bagge et al. 2000). Os mecanismos de resistência aos antibióticos no biofilme bacteriano estão começando a ser elucidados (Mah & O'Toole 2001); a figura 8 mostra três principais hipóteses. A primeira hipótese é a possibilidade de lenta ou incompleta penetração do antibiótico no biofilme. A mensuração da penetração de antibióticos em biofilmes in vitro tem mostrado que alguns antibióticos permeiam facilmente o biofilme bacteriano (Stewart 1996). Não existe nenhuma barreira genérica para a difusão de solutos, do tamanho de antibióticos, através da matriz do biofilme, que é principalmente água (Stewart 1998). No entanto, se o antibiótico é desativado no biofilme, a penetração pode ser retardada. No biofilme tipo-selvagem, o antibiótico é desativado nas camadas 23 superficiais mais rapidamente do que se difunde. Antibióticos que adsorvem na matriz do biofilme também podem ter uma penetração retardada, o que pode explicar a penetração lenta de antibióticos aminoglicosídeos (Kumon et al. 1994; Shigeta et al. 1997). Esses agentes carregados positivamente se ligam a polímeros carregados negativamente na matriz do biofilme (Gordon et al. 1988; Nichols et al. 1988). A segunda hipótese depende de um microambiente químico alterado dentro do biofilme. Microescala de gradientes em concentrações de nutrientes são uma característica bem conhecida de biofilmes. Resultados de estudos com eletrodos miniaturizados têm mostrado que o oxigênio pode ser totalmente consumido nas camadas superficiais de biofilme, levando a nichos anaeróbios em camadas profundas do biofilme (de Beer et al. 1994). Os aminoglicosídeos são menos eficazes contra o mesmo organismo em condições anaeróbias do que em condições aeróbias (Tack & Sabath 1985). Alternativamente, a depleção de substratos ou acúmulo de um produto inibidor residual podem levar à inibição da expansão de algumas bactérias, protegendoas da morte. As penicilinas, que têm como alvo a síntese de parede celular, inibe apenas o crescimento bacteriano (Tuomanen et al. 1986). Esta segunda hipótese é reforçada pela visualização experimental direta de zonas metabolicamente inativas dentro de biofilmes alimentados continuamente (Xu et al. 2000). Além disso, o ambiente osmótico dentro de um biofilme pode ser alterado, levando à indução de uma resposta de estresse osmótico (Prigent-Combaret et al. 1999). Tal resposta pode contribuir para resistência aos antibióticos, alterando as proporções relativas das porinas de uma maneira que reduz a permeabilidade do envelope celular aos antibióticos (Stewart & Costerton 2001). Um terceiro mecanismo da resistência aos antibióticos é que uma subpopulação de micro-organismos num biofilme forma um único, e altamente protegido, estado fenotípico – uma diferenciação celular semelhante à formação de esporos. Esta hipótese está apoiada nos resultados que mostram que há resistência em biofilmes recémformados, mesmo que ainda sejam muito finos para representar uma barreira para a penetração de um agente antimicrobiano ou substratos metabólicos (Das et al. 1998; Cochran et al. 2000). Além disso, as bactérias no biofilme, mas não todas, são rapidamente mortas por antibióticos (Goto et al. 1999; Brooun et al. 2000). As bactérias sobreviventes, que podem consistir de 1% ou menos da população original, persistem apesar da exposição continuada ao antibiótico. A hipótese de um estado letárgico semelhante a esporos, aceita para algumas bactérias do biofilme, proporciona uma 24 poderosa e genérica explicação para a redução da susceptibilidade de biofilmes a antibióticos e desinfetantes (Stewart & Costerton 2001). Figura 8. Três hipóteses para os mecanismos de resistência a antibióticos em biofilmes. A superfície de fixação é mostrada na parte inferior e a fase aquosa contendo o antibiótico, na parte superior. Fonte: Adaptado de Stewart & Costerton (2001) 25 1.6 EPIDEMIOLOGIA As infecções por A. baumannii têm sido uma questão clínica substancial em muitas partes da Europa (figura 9) (Van Looveren & Goossens 2004). Desde o início de 1980, os surtos de infecções hospitalares por este patógeno na Europa, principalmente na Inglaterra, França, Alemanha, Itália, Espanha e Holanda (Bergogne-Berezin & Towner 1996; Villegas & Hartstein 2003; Fournier & Richet 2006), foram investigados usando métodos epidemiológicos de tipagem molecular. Na maioria dos casos, um ou dois isolados epidêmicos foram detectados num dado contexto epidemiológico. A transmissão de tais isolados tem sido observada entre hospitais, muito provavelmente através de transferência de pacientes colonizados (Turton et al. 2004; van den Broek et al. 2006; Da Silva et al. 2007). Figura 9. Países que relataram surtos por Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos. Em vermelho os surtos relatados antes de 2006, e em amarelo os surtos relatados após 2006. Fonte: Adaptado de Peleg et al. (2008) A propagação de A. baumannii multidrogas resistentes (MDR) não se limita aos hospitais dentro de uma cidade, mas também ocorre em escala nacional. Exemplos são a propagação do clone denominado Sudeste e o OXA-23 clones 1 e 2 no Sudeste da Inglaterra (Coelho et al. 2006; Turton et al. 2004), a disseminação de um clone A. baumannii mutidroga resistente em Portugal (Da Silva et al. 2007), a propagação interhospitalar do clone A. baumannii produtora de VEB-1 de espectro estendido de um total de 55 centros médicos no norte e sudeste da França (Naas et al. 2006) e da propagação 26 de um clone A. baumannii resistente à amicacina observada em nove hospitais em várias regiões na Espanha (Vila et al. 1999). A transferência internacional de pacientes colonizados tem levado à introdução e disseminação da epidemia subsequente de isolados A. baumannii MDR do sul em países do norte da Europa, como a Bélgica e a Alemanha (Schulte et al. 2005; Bogaerts et al. 2006). A propagação intercontinental também foi descrita entre a Europa e outros países, como consequências de viagem de avião (Peleg et al. 2006a; Naas et al. 2007a). Estes eventos destacam a importância do rastreio adequado e possível isolamento de pacientes com altas taxas de organismos resistentes às drogas. Na América do Norte há um destaque para os Estados Unidos, onde no período de 1991 e 1992 foram observados surtos de CRAB em um hospital de Nova York (Griffith et al. 2006). Os organismos neste surto foram MDR, mantendo a susceptibilidade somente para polimixinas e ampicilina/sulbactam (Griffith et al. 2006). Outros hospitais de Nova York tiveram surtos clonais de A. baumannii MDR ou pan-drogas resistentes (PDR) (Durand et al. 1993; Jones et al. 2004; Griffith et al. 2006; Landman et al. 2007), e surtos semelhantes têm sido frequentemente relatados em muitas outras regiões dos Estados Unidos (Jones et al. 2004; Maslow et al. 2005; Lolans et al. 2006). Uma importante contribuição para a epidemiologia das infecções com A. baumannii nos Estados Unidos foi o retorno de militares que lutaram no Iraque ou no Afeganistão (Davis et al. 2005; Murray et al. 2006; Scott et al. 2007). Um aumento nas infecções por A. baumannii foi descrita pela primeira vez em militares americanos em março de 2003, logo após que as operações de combate começaram no Iraque. Os militares mais acometidos foram primeiro tratados em hospitais de campanha, antes de serem encaminhados para o Centro Médico Regional Landstuhl (Alemanha) ou Walter Reed Army Medical Center (Estados Unidos) (Scott et al. 2007). A maioria destas infecções foi detectada no momento ou logo após a admissão a essas instituições (Murray et al. 2006; Scott et al. 2007). Os dados sobre o grau de resistência de A. baumannii na África são em grande parte limitados à África do Sul, embora hajam relatos esparsos de outros países (Iregbu et al. 2002; Nejjari et al. 2003). Brink et al. (2007) mostraram que cerca de 30% de isolados de A. baumannii de corrente sanguínea de pacientes na África do Sul são resistentes aos carbapenêmicos, mais de 40% são resistentes à cefepima e piperacilina/tazobactam, e mais de 30% são resistentes à ciprofloxacina e levofloxacina. Esses isolados resistentes 27 são endêmicos em algumas unidades, por exemplo queimaduras e UTIs, e foram disseminados inter institucionalmente (Marais et al. 2004) Numerosos surtos têm sido documentados em hospitais na Ásia e Oriente Médio (figura 9), e uma variedade de carbapenemases também tem sido descritas (Afzal-Shah et al. 2001; Abbo et al. 2005; Ko et al. 2007). Taxas de resistência em isolados SENTRY (2001 – 2004) na região Ásia-Pacífico, foram superiores a 25% para imipenem e meropenem, 40% para cefepima e ceftazidima, 40% para ampicilina/sulbactam, 35% para amicacina e 45% para ciprofloxacina (Gales et al. 2006). A resistência para a tigeciclina (Navon-Venezia et al. 2007) e polimixina B (Gales et al. 2006; Ko et al. 2007) já foi descrita para essa região. O primeiro surto australiano descrito de A. baumannii adquirido em hospital foi na Austrália Ocidental (Riley et al. 1996). Estes isolados foram resistentes à gentamicina, cefalosporinas e ticarcilinas, com alguns isolados também resistentes à ciprofloxacina. A análise epidemiológica molecular identificou que 11% das amostras provenientes das mãos de funcionários foram positivas para o mesmo isolado de A. baumannii que causou a infecção dos pacientes (Riley et al. 1996). Mais recentemente, surtos de A. baumannii têm afetado outras grandes cidades ao longo da costa leste da Austrália, incluindo Brisbane, Sydney e Melbourne (Peleg et al. 2006b; Playford et al. 2007; Valenzuela et al. 2007). Estes surtos têm envolvido isolados CRAB, com OXA-23 contribuindo para este fenótipo (Valenzuela et al. 2007). Surtos de A. baumannii resistentes a carbapenêmicos também ocorreram na Polinésia Francesa (Naas et al. 2005). Segundo Turton et al. (2006b), as taxas de resistência ao imipenem, meropenem, ceftazidima, piperacilina/tazobactam, ciprofloxacina e gentamicina na América Latina, parecem estar entre as mais altas do mundo. Em estudo de vigilância envolvendo Argentina, Brasil, Chile e Colômbia, de 1997 a 2001, as taxas de resistência foram mais elevadas na Argentina, mas em todos os países foram isolados micro-organismos multirreristentes (Tognim et al. 2004). Outra questão é a detecção do gene blaPER-1, que desde 1995 tem se disseminado na Itália (Docquier et al. 2001) e, mais recentemente, na Bélgica (Claeys et al. 2000), França (De Champs et al. 2004), Espanha (Miro et al. 2005), Romênia (Naas et al. 2007b), Coréia (Jeong et al. 2005), Japão (Yamano et al. 2006) e China (Hou et al. 2007), sendo mais comumente encontrado em espécies de Pseudomonas aeruginosa. A presença do gene blaPER-1 em espécies de Acinetobacter, tem sido relatada na Coréia, 28 codificando resistência à cefepima e ceftazidima (Yong et al. 2003) e na Turquia conferindo resistência à ceftazidima, meropenem e imipenem (Kolayli et al. 2005). No Brasil não existem muitos dados sobre infecções nosocomiais por Acinetobacter. De acordo com Turrini & Santo (2002), mesmo com a legislação vigente no país, os dados sobre infecção hospitalar são pouco divulgados pelo fato de não serem consolidados por muitos hospitais, o que tem dificultado a aquisição de um diagnóstico que retrate a dimensão real do problema no país. A Organização Mundial de Saúde considera um índice médio aceitável de infecção hospitalar entre 9% a 20% por espécies bacterianas. Segundo o Ministério da Saúde e uma pesquisa realizada e publicada em 1995 no Brasil, a taxa média de infecção hospitalar é cerca de 15%, porém este índice varia significativamente, já que está diretamente relacionado com o grau de atendimento e complexidade de cada hospital (ANVISA 2004b). Em hospitais brasileiros, A. baumannii MDR constituem uma causa grave de infecção hospitalar, compreendendo 8,8% do total de isolados bacterianos nosocomiais que causam infecções em pacientes de UTI, de acordo com o Programa Brasil MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) (Kiffer et al. 2005). A este respeito, os carbapenêmicos permanecem como a opção terapêutica de amplo espectro para o tratamento de tais infecções. Contudo a resistência a esses agentes antimicrobianos tem aumentado, resultando na utilização de agentes potencialmente mais tóxicos, tais como as polimixinas (Fernandez-Cuenca et al. 2003). Embora altas taxas de resistência aos carbapenêmicos entre isolados de Acinetobacter sp. tenham sido relatadas, muito pouco se sabe sobre os mecanismos de resistência. De acordo com os relatórios do Programa Brasil MYSTIC, A. baumannii foi o quarto patógeno mais prevalente isolado de pacientes hospitalizados em 20 centros brasileiros e apresentou altas taxas de resistência a todos os antimicrobianos testados (Kiffer et al. 2005). Dalla-Costa et al. (2003) relataram um surto por CRAB produtores da enzima OXA-23 em dois hospitais de Curitiba (PR), assim como Schimith Bier et al. (2010) que detectou OXA-23 nos 172 isolados de CRAB , os quais apresentaram sensibilidade somente à tigeciclina e polimixina B. Em estudo publicado por Carvalho et al. (2009), foi comum a ocorrência de isolados A. baumannii MDR produtoras de OXA-23 disseminados em hospitais públicos e privados do Rio de Janeiro (RJ), as quais apresentaram resistência ao meropenem, ciprofloxacina, amicacina, cefepima, ceftazidima, piperacilina/tazobactam e ampicilina/sulbactam. A detecção desta enzima em isolados de CRAB também foi relatada por Martins et al. (2009), em estudo 29 realizado na cidade de Porto Alegre (RS), onde todos apresentaram resistência ao imipenem, meropenem, piperacilina/tazobactam, gentamicina e ciprofloxacina. Além de detectar OXA-23 em todos os isolados, Werneck et al. (2011b) em estudo realizado em oito cidades de quatro diferentes regiões geográficas brasileiras, também detectou a sequência de inserção ISAba1 à montante de OXA-23 em todos os isolados. A resistência aos carbapenêmicos foi relatada para 83,5% dos isolados que possuíam OXA-23, porém o autor não destaca quantos, dentre estes, possuíam ISAba1. Até o momento, o único relato que se tem de OXA-40 no Brasil foi publicado por Werneck et al. (2011a), o qual foi detectado em um isolado de A. baumannii, sendo este o único isolado do estudo. O mesmo apresentou susceptibilidade à polimixina B e colistina, redução de susceptibilidade para ampicilina/sulbactam e resistência para ceftazidime, cefepime, imipenem, meropenem, ciprofloxacina e amicacina. A detecção do gene OXA-58 no Brasil, Rio de Janeiro, foi relatada por Figueiredo et al. (2011), apresentando resistência à amicacina, ceftazidima, ciprofloxacina, cefepima, gentamicina, imipenem, meropenem e piperacilina/tazobactam e por Gusatti et al. (2012), apresentando ISAba1 à montante do gene e expressando resistência ao imipenem. O gene OXA-51 foi detectado em todos os isolados de A. baumannii mencionados nos estudos brasileiros supracitados. Em Goiás foi detectado um surto de infecção hospitalar em fevereiro de 2009 pela Superintendência de Vigilância Sanitária e Ambiental (Svisa), no Hospital de Urgências de Aparecida de Goiânia (HUAPA). Foram 83 mortes no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2010. A taxa de infecção hospitalar chegou a 88,23% em abril de 2009. De acordo com a Sociedade Brasileira de Terapia Intensiva (SOBRATI) a taxa de infecção em todas as alas de um hospital deve chegar, no máximo, a 2% e nas UTI entre 10 e 15%. A contaminação se deve a vários tipos de bactérias, porém a mais comum, letal e mais persistente nas UTI são as A. baumannii MDR (SVS 2010). Um relatório técnico da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) caracterizou, através de tipagem molecular, os isolados bacterianos de sua rede de monitoramento de resistência e incluiu 540 amostras enviadas pelos Laboratórios Centrais do Brasil, entre agosto/2009 e julho/2010. Das 540 amostras recebidas, 165 amostras eram isolados de A. baumannii. Dos 165 isolados de A. baumannii, 89 amostras foram encaminhadas pelo LACEN/GO: 13 amostras (de três hospitais de Goiânia) tinham 11 isolados positivos para OXA-23, e 76 amostras (consideradas de um surto) tinham 66 isolados 30 positivos para OXA-23. Todas as 89 amostras enviadas pelo LACEN/GO pertenciam a três hospitais públicos goianos e confirmam a presença de padrão genômico de resistência aos carbapenêmicos no estado de Goiás (FIOCRUZ-Rio de Janeiro, 2010 apud Godoy 2012). Não foram encontrados relatos sobre a detecção dos genes OXA-40, OXA-58 e ISAba1 no Estado de Goiás, e do gene blaPER-1 no Brasil. 31 2 JUSTIFICATIVA Acinetobacter baumannii é um importante patógeno adquirido em hospitais que causa uma variedade de infecções em seres humanos, especialmente em pacientes imunocomprometidos (Dalla-Costa et al. 2003; Dijkshoorn et al. 2007). Em hospitais brasileiros, A. baumannii MDR constituem uma causa significativa de infecção hospitalar (Kiffer et al. 2005). A resistência a múltiplas drogas mediadas por enzimas do tipo OXA e a sua capacidade de formar biofilme sob condições de estresse, contribuem para sua persistência no cenário hospitalar e representam importantes fatores de virulência (Poirel & Nordmann 2006a, 2006b; Perez et al. 2007; Feizabadi et al. 2008). Embora seja relevante, poucos estudos tem relacionado a presença do gene blaPER1 com a formação de biofilme, cujos resultados já apresentados têm sido conflitantes. Sechi et al. (2004) relaciona a produção de blaPER-1 com a aderência, enquanto Lee et al. (2008) sugere que a presença do gene seja altamente significativa para a aderência e formação de biofilme. Em contrapartida, a ocorrência de CHDLs tem sido relatada entre isolados clínicos de A. baumannii em todo o mundo. Os primeiros relatos de OXA-23, OXA-40 e OXA-58 em CRAB no Brasil foram em 2003, 2010 e 2012, respectivamente (Dalla-Costa et al. 2003; Werneck et al. 2011a; Gusatti et al. 2012). Na tentativa de justificar a multirresistência dos isolados investigados, este estudo analisou a capacidade de formação de biofilme em poliestireno a partir de 84 isolados clínicos, provenientes de pacientes de cinco UTIs de quatro instituições de referência (3 públicas e 1 filantrópica), que adquiriram A. baumannii através de infecção hospitalar. Através da técnica de biologia molecular de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi investigada a presença do gene blaPER-1, a qual foi correlacionada com a formação de biofilme em poliestireno, e dos genes OXA-23, OXA-40, 0XA-51, OXA-58 e ISAba1, cujas presenças foram relacionadas com a resistência aos antibióticos carbapenêmicos, tais como imipenem, piperacilina/tazobactam, meropenem, ceftazidima, e também amicacina, à ampicilina/sulbactam, gentamicina, ciprofloxacina, levofloxacina, polimixina B/colistina, tetraciclina, tigeciclina e cefepima. Considerando que não foram encontrados relatos da identificação de alguns destes genes em A. baumannii no Estado de Goiás, nem mesmo no Brasil para o gene blaPER-1, e prevendo possível relevância destes achados, este estudo tem como objetivo contribuir para um melhor entendimento da real prevalência das β-lactamases 32 nos hospitais goianos e, consequentemente, auxiliar nas ações de controle dos isolados e na redução das infecções por A. baumannii. Cabe ressaltar a importância deste estudo, de grande relevância para o sistema de saúde, uma vez que os resultados apresentados possibilitam uma análise qualitativa, comparativa e complementar a outras abordagens científicas do tema, auxiliando na implementação de estratégias visando a redução dos surtos hospitalares, bem como na conscientização dos profissionais de saúde quanto à necessidade de maior rigor na prescrição de antimicrobianos, contribuindo assim para o bem estar da população. 33 3 OBJETIVOS 3.1 GERAL Analisar a capacidade de formação de biofilme em poliestireno de isolados de Acinetobacter baumannii e caracterizar, por biologia molecular, a presença dos genes blaPER-1, blaOXA-23, blaOXA-40, blaOXA-51, blaOXA-58, ISAba1. 3.2 ESPECÍFICOS Analisar a capacidade dos isolados formarem biofilme em poliestireno; Investigar a presença do gene blaPER-1 nos isolados; Avaliar a relação entre a formação (ou não) de biofilme e a presença do gene blaPER-1; Avaliar a relação entre a formação (ou não) de biofilme e a resistência aos antibióticos; Investigar a prevalência dos genes β-lactamases OXA-23, OXA-40, OXA-51 e OXA-58 e a presença de ISAba1 à montante dos genes OXA; Correlacionar a presença de ISAba1 com os níveis de resistência aos carbapenêmicos. 34 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 ASPECTOS ÉTICOS As coletas das amostras usadas neste estudo foram realizadas de acordo com as normas de conduta da ética médica, após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa das instituições envolvidas (Protocolos: CEPACCG N° 005/10; HC/UFG N° 070/2010 e HDT N° 002/2010), pelos pacientes e/ou seus responsáveis, nos quais estavam claros os procedimentos e objetivos do projeto (Anexo I). 4.2 RECRUTAMENTO DOS CASOS E COLETAS DE AMOSTRAS CLÍNICAS Trata-se de um estudo transversal de caracterização fenotípica e molecular de isolados clínicos de Acinetobacter baumannii. Para este estudo foram usados os isolados clínicos provenientes de um estudo anterior (Infecções por Acinetobacter baumannii em adultos admitidos em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) de Goiânia e Aparecida de Goiânia), onde foram coletadas 84 amostras de Acinetobacter baumannii de 64 pacientes adultos no período de julho a dezembro de 2010 nos seguintes locais: UTI de atendimento clínico (UTI-1) e UTI de atendimento cirúrgico (UTI-2), com oito leitos cada, pertencentes a um hospital universitário com 300 leitos; UTI (UTI-3) de atendimento clínico com nove leitos, pertencente a um hospital estadual de referência no tratamento de doenças infecciosas e parasitárias com 126 leitos; UTI (UTI-4) de atendimento cirúrgico com nove leitos, pertencente a um hospital filantrópico de referência em câncer no Estado de Goiás, com 211 leitos; UTI (UTI-5) de atendimento clínico com dez leitos, pertencente a um hospital estadual de referência em urgências com 75 leitos, em Aparecida de Goiânia. 35 4.3 ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE MICROBIANA A coleta dos espécimes biológicos ocorreu conforme a indicação da equipe médica assistente, sendo que todas as UTIs possuíam assistência de médico infectologista. As amostras foram encaminhadas e identificadas no laboratório de referência local segundo a rotina de cada unidade hospitalar, por método automatizado e/ou manual. As amostras da UTI-3 e UTI-5 foram encaminhadas ao Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN) e as da UTI-4 para o laboratório do próprio hospital, onde as culturas foram processadas pelo método manual, com isolamento da bactéria em ágar MacConkey e identificação através da bacterioscopia com coloração pelo método de Gram e por provas bioquímicas: motilidade (IAL), crescimento a 42°C, utilização do citrato, OF-glicose, produção de oxidase, urease, hidrólise da bile-esculina, testes de descarboxilação (lisina, ornitina e arginina) e OF-lactose a 10%. A avaliação da susceptibilidade do A. baumannii foi realizada por disco-difusão e pelo E-test® (polimixina com MIC ≥ 4 µg/ml para resistência) (ANVISA 2004a; CLSI 2009 apud Godoy 2012). As amostras dos pacientes das UTIs 1 e 2 foram enviadas para o laboratório próprio do hospital, que utilizou o equipamento Vitek II (sistema automatizado) para identificação da bactéria pela provas: DP-300, p-cumarico, controle de crescimento, acetamida, esculina, indican vegetal, manitol, xilose, rafinose, sorbitol, H 2S, sacarose, inositol, adonitol, raminose, L-arabinose, fermentação de ONPG, glicose (fermentativa), testes de descarboxilação (lisina, ornitina e arginina). A determinação da susceptibilidade do A. baumannii foi realizada para os seguintes antimicrobianos: piperacilina/tazobactam, imipenem, ceftazidima, meropenem, amicacina, ampicilina/sulbactam, gentamicina, ciprofloxacina, levofloxacina, polimixina B/colistina, tetraciclina, tigeciclina e cefepima. Todos os laboratórios seguiram os padrões de susceptibilidade recomendados pelo Clinical and Laboratorial Standards Institute 2009 (CLSI 2009 apud Godoy 2012). Após os testes, confirmação e isolamento, as amostras de A. baumannii foram encaminhadas para o Laboratório de Bacteriologia Molecular do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP)-UFG e armazenadas em freezer -80°C. 36 4.4 TESTE DE VIABILIDADE DE Acinetobacter baumannii As amostras mantidas no freezer -80°C foram reativadas em meio de cultura sólido TSA (Tryptic Soy Agar) e incubadas por um período aproximado de 16 horas a uma temperatura de 37°C. Após incubação, o crescimento foi analisado microscopicamente pela coloração de Gram, onde observou-se cocobacilos Gramnegativos, como esperado para confirmar a pureza das culturas de A. baumannii. Com a confirmação, uma colônia isolada da placa com TSA foi repicada em meio caldo TSB (Tryptic Soy Broth) e incubada nas mesmas condições supracitadas. Após crescimento foram realizadas duas etapas, onde parte da cultura foi transferida para um criotubo contendo glicerol 20%, na concentração de 1:1 (500 µL de cultura em 500 µL de glicerol 20%) e armazenada em freezer -20°C. Na segunda etapa, foi realizada a extração de DNA. 4.5 EXTRAÇÃO DE DNA CROMOSSOMAL O DNA cromossomal foi extraído segundo a técnica de van Soolingen et al. (1994) com pequenas adaptações. Primeiramente, transferiu-se 1,5 mL de cultura bacteriana crescida para cada tubo de 1,5 mL tipo Eppendorf previamente identificado com a respectiva amostra, sendo o mesmo centrifugado a 5000 g por 5 minutos, a 14°C. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido no vortex. Nos mesmos tubos, foram adicionados 400µL de tampão TE, seguido de 6 µL de lisozima (20mg/mL) e 1µL de enzima RNAse (10mg/mL) em cada. A solução foi levada ao banho-maria a 37°C por 1,5 horas. Transcorrido este tempo, foi acrescentado 70µL de dodecil sulfato de sódio (10%) e 12 µL de proteinase K (20mg/mL). O sistema foi então incubado por 10 minutos a 56°C. Posteriormente, adicionou-se 100µL de NaCl 5,0 M e 80µL de solução CTAB/NaCl (10% CTAB, 0,73 M NaCl). A solução foi agitada lentamente até ficar com aspecto leitoso, sendo incubada por 10 minutos a 65°C. Posteriormente, acrescentou-se 650 µL de clorofil (clorofórmio/álcool isoamílico, 25:1, v/v), seguido de leve agitação por 30 segundos. A solução foi centrifugada por 12000 g por 5 minutos a 10°C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo identificado, e adicionou-se 400µL de isopropanol gelado e então o sistema foi homogeneizado e incubado a -20°C por 24 horas. 37 Após o tempo necessário, as amostras foram centrifugadas a 18.000g, a 4°C por 20 minutos. Realizou-se a lavagem com 1mL de álcool etílico a 70% gelado e deixou-se secar à temperatura ambiente por 30 minutos. O DNA extraído foi ressuspendido em 50 µL de água ultrapura MiliQ e estocado a -20°C. 4.6 EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL Para extração do DNA plasmidial utilizou-se o método de lise alcalina de Birnboimand Doly (1979), com pequenas adaptações. Foi transferido 1,5 mL de cultura bacteriana crescida para tubos tipo Eppendorf, previamente identificados com as respectivas amostras, sendo os mesmos centrifugados a 5000 g por 10 minutos a 10°C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido com 210 µL da solução I (150 mM TrisHCl, 10mM EDTA pH 8.0), posteriormente foi adicionando ao mix da solução 1 µL de RNAse por amostra e em seguida foi homogeneizado em um vortex. Em seguida foi adicionado 210 µL da solução II (200 mM NaOH, 1% SDS), misturados por inversão dos tubos e incubados a temperatura ambiente por 5 minutos. Transcorrido o tempo, foi adicionado 280 µL da solução III (acetato de sódio 3M, ácido Acético 2M, pH 4,8-5,0), misturados imediatamente 10 vezes por inversão dos tubos e centrifugados a 12000 g por 10 minutos a 10°C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo previamente identificado ao qual adicionou-se 560 µL de isopropanol gelado, o qual foi homogeneizado por inversão dos tubos e incubados por 10 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12000 g por 15 minutos a 10°C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado com 500 µL de etanol a 70% gelado. O DNA extraído foi ressuspendido em 30 µL água ultrapura MiliQ e estocado a -20°C. 4.7 TESTE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM POLIESTIRENO A formação de biofilme foi analisada de acordo com o método de Tendolkar et al. (2004) com pequenas alterações. Os isolados armazenados em freezer-20°C foram reativados em caldo TSB e incubados a 36°C sob agitação por 16 horas. As cepas A. baumannii ATCC 19606 e Escherichia coli HB 101 foram usadas como controles positivo e negativo, respectivamente, sendo cultivadas sob as mesmas condições. 38 Após crescimento, a densidade das culturas bacterianas foi ajustada com a escala 0,5 de McFarland, o que corresponde a um número aproximado de 1,5 x 10 8 bactérias. Em uma placa de poliestireno de 96 poços de fundo chato foram pipetados 270 µL de meio LB (Luria Bertani) diluído em água destilada para ¼ mais glicose a 0,2% (LB¼-Gli) nos poços das linhas horizontais de A-G. Nos poços da linha horizontal H foram pipetados 300 µL de LB¼-Gli, os quais foram usados para a leitura do BRANCO. Foram pipetados 30 µL da cultura ajustada de cada isolado, em réplicas de 4, obtendo uma diluição da cultura bacteriana em 1:10. Nas fileiras horizontais F e G foram pipetados 30 µL das culturas ajustadas controles positivo e negativo para a formação de biofilme, respectivamente. A placa foi acondicionada em câmara úmida e incubada a 29°C por 22 horas. A figura 10 ilustra a distribuição dos isolados em placa de microtitulação. Figura 10. Esquema representando a distribuição dos isolados e a disposição dos controles positivo e negativo e do branco. Compreendido o período da incubação, foi determinado o crescimento bacteriano através da leitura da placa em leitor de ELISA em OD 405nm. Em seguida, a placa foi lavada cuidadosamente por 3 vezes com PBS 1X estéril usando pipeta multicanal, invertida sobre papel toalha e deixada secar por 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente foram adicionados 300µL de corante cristal violeta a 0,2% em água a cada poço e a placa foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente que, depois 39 de aspirado o CV, cada poço foi lavado cuidadosamente 3 vezes com PBS 1X. Após aspirar todo o PBS, foi adicionado 300µL de etanol-acetona (80:20, v/v) e feita leitura em OD595nm. As leituras obtidas nas OD 405 e 595 foram subtraídas pelo branco de cada ensaio. A formação de biofilme determinada pela leitura a 595nm foi corrigida pelo crescimento da cultura observada a 405nm, calculando-se a razão dos valores obtidos (OD595-BRANCO / OD405-BRANCO). Os valores obtidos foram usados para se determinar a média e o desvio padrão (dp) de cada amostra. A comparação estatística entre os valores encontrados foi feita pelo teste t de student, e foram considerados valores significativamente diferentes quando p<0,05. Cada experimento foi repetido três vezes independentemente. Para classificar os isolados como formadores de biofilme foram aceitos os resultados em que o isolado apresentou uma média superior ao do controle negativo, onde os valores do dp de ambos não se encontravam. Com base nestes resultados, foi possível afirmar se o isolado formava maior, menor ou a mesma quantidade de biofilme que o controle positivo, ao comparar a média do isolado em relação ao controle positivo. Os isolados não-formadores de biofilme receberam esta classificação quando, ao comparar as médias, os isolados apresentaram valores inferiores ao do controle negativo ou tiveram o encontro entre os valores do dp. O experimento de cada placa foi validado quando, pela comparação estatística do teste t do controle positivo em relação ao controle negativo, o resultado foi inferior a 0,05. Os formadores de biofilme foram classificados de acordo com a intensidade da formação do biofilme em forte, moderado e fraco, utilizando a média obtida do quociente das leituras em leitor de ELISA (OD595BRANCO/OD405-BRANCO) nos três plaqueamentos e aplicadas à estatística descritiva QUARTIS. Os valores a seguir foram atribuídos para a determinação de biofilme: MÉDIA dos quocientes das ODs < 0,96 = FRACO 0,96 < MÉDIA dos quocientes das ODs < 1,92 = MODERADO 1,92 < MÉDIA dos quocientes das ODs = FORTE 4.8 IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA A presença dos DNAs extraídos foi verificada em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídeo (0,5 µg/mL), visualizadas em fotodocumentador. Foram realizadas PCRs usando oligonucleotídeos iniciadores para blaPER-1 (Poirel et al. 2005), 40 blaOXA-23, blaOXA-40, blaOXA-51, blaOXA-58 e ISAba1 (Sohrabi et al. 2012), cujas sequências estão apresentadas na tabela 3. Os sistemas de PCR foram preparados para um volume final de 20µL, onde em tubos de 0,2mL foram adicionados 20 ηg de DNA, Tampão Green GoTaq (Promega), 0,47 µM de cada oligonucleotídeo iniciador específico, 250 µM de cada dNTP, e 1U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen). Tabela 3. Oligonucleotídeos usados para detecção de blaPER-1, β-lactamases do tipo OXA e ISAba1 em Acinetobacter baumannii. Primers blaPER-1 F blaPER-1 R OXA-23 F OXA-23 R OXA-40 F OXA-40 R OXA-51 F OXA-51 R OXA-58 F OXA-58 R ISAba1 F ISAba1 R Tamanho do produto (pb) 924 1.057 825 641 453 451 Sequência (5’ - 3’) ATGAATGTCATTATAAAAGC AATTTGGGCTTAGGGCAGAA GATGTGTCATAGTATTCGTCGT TCACAACAACTAAAAGCACTGT ATGAAAAAATTTATACTTCCTATATTCAGC TTAAATGATTCCAAGATTTTCTAGC AACAAGCGCTATTTTTATTTCAG CCCATCCCCAACCACTTTT AGTATTGGGGCTTGTGCT AACTTCCGTGCCTATTTG CATTGGCATTAAACTGAGGAGAAA TTGGAAATGGGGAAAACGAA Temperatura de anelamento (°C) 55 50 50 50 49 50 4.8.1 Identificação do gene blaPER-1 O termociclador modelo MJ96G (Biocycler) foi programado de acordo com Vahaboglu et al. (1995), com algumas alterações, para uma desnaturação inicial de 95ºC por 4 min, seguido por 30 ciclos de desnaturação (90ºC, 30 seg), anelamento (55ºC, 40 seg) e extensão (72ºC, 1 min), com extensão final de 72ºC por 5 min. Os produtos das PCRs foram analisados em gel de agarose 1,5% contendo brometo de etídeo (0,5μg/mL) e visualizados em fotodocumentador. O marcador utilizado foi 1Kb plus DNA Ladder (Invitrogen). Para avaliar a correlação entre formação de biofilme bacteriano e presença do gene blaPER-1, utilizou-se o teste de correlação e o teste exato de Fisher. 4.8.2 Identificação dos genes OXA e ISAba1 O termociclador modelo MJ96G (Biocycler) foi programado para uma desnaturação inicial de 94°C por 4 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação (92°C, 1 min), anelamento (temperatura de acordo com o oligonucleotídeo usado, ver tabela 3, 1 min) e extensão (72°C, 1 min), com extensão final de 72°C por 5 min. Isolados que 41 apresentaram presença de qualquer um dos genes OXA pesquisados, foram reanalisados quanto a associação entre ISAba1 e OXA-23, OXA-51 e OXA-58 em A. baumannii. Para tanto os pares de oligonucleotídeos usados, foram uma combinação do ISAba1 forward com um dos oligonucleotídeos reverse para OXA-23, OXA-51 e OXA58. Os produtos das PCRs foram analisados em gel de agarose 1,5%, contendo brometo de etídeo (0,5μg/mL) e visualizados em fotodocumentador. Os marcadores utilizados foram 1Kb plus DNA Ladder (Invitrogen), 1Kb Ladder DNA marker (Axygen) e 100bp Ladder DNA marker (Axygen). 42 5 RESULTADOS Este estudo é complementar ao trabalho de Godoy (2012), onde no período de junho a dezembro de 2010 foram coletados espécimes biológicos em pacientes hospitalizados em cinco UTIs de quatro hospitais. Dentre as amostras analisadas, 71 culturas coletadas de 57 pacientes foram positivas para Acinetobacter baumannii, totalizando 10 pacientes com mais de uma amostra positiva. 5.1 FORMAÇÃO DE BIOFILME Os isolados foram submetidos ao teste de formação de biofilme em placa de poliestireno de 96 poços onde, dos 71 isolados clínicos, 57 foram classificados como formadores de biofilme e 14 foram classificados como não-formadores de biofilme. Entre os formadores de biofilme, 10% (6/57) foram classificados como fortes (>1,9), 10% (6/57) como moderados (1,9>0,95) e 79% (45/57) como fracos (<0,95). 5.2 GENE blaPER-1 Foram consideradas amostras positivas para o gene blaPER-1 aquelas onde seus produtos obtidos por PCR apresentaram tamanho esperado de 924 pares de bases (pb). Dentre os 71 isolados clínicos, o gene blaPER-1 foi detectado em 21 isolados. 5.3 RELAÇÃO DO GENE blaPER-1 COM A FORMAÇÃO DE BIOFILME A relação entre a presença do gene blaPER-1 com a formação de biofilme pode ser observada na tabela 4. Nesta, percebe-se que 45 amostras capazes de formarem biofilme não contêm o gene blaPER-1. 43 Tabela 4. Relação entre presença do gene blaPER-1 com a formação de biofilme bacteriano. Não Formação de Formação de Biofilme Presença do gene blaPER-1 Ausência do gene blaPER-1 Total Total Biofilme 12 09 21 45 05 50 57 14 71 Relacionando a presença do gene blaPER-1 com a intensidade de formação de biofilme, o gene blaPER-1 foi detectado em 33% (2/6) dos isolados que formaram biofilmes moderados e 22% (10/45) dos isolados que formaram biofilmes fracos. O gene não foi detectado nos isolados classificados como fortes formadores de biofilme (tabela 5). Tabela 5. Relação entre a intensidade da formação de biofilme e a presença do gene blaPER-1. BIOFILME FORTE MODERADO FRACO Nº de Isolados 6 6 45 Presença de blaPER-1 0 2 10 Considerando os resultados obtidos na tabela 4, foram aplicados os teste de correlação obtendo valor de r igual a -0,34 e o teste de Fisher, obtendo valor de p igual a 0,0025. 5.4 AMPLIFICAÇÃO DOS GENES OXA E ISAba1 Ao investigar a presença dos genes β-lactamases do tipo OXA, o gene OXA-51 foi encontrado em todas as amostras. Das 71 amostras, 43 (61%) possuíam o OXA-23, e 19 (27%) possuíam o OXA-58. A coexistência de 2 e 3 genes OXA diferentes foi observada 41% e 20% do isolados analisados, respectivamente. Nenhum isolado apresentou amplificação para o gene OXA-40. O elemento de inserção ISAba1 foi detectado em 72% (51/71) dos isolados. 44 Ao comparar os resultados com os testes de sensibilidade realizados em trabalho precursor (Godoy 2012), foi observado que 96% (68/71) dos isolados expressaram resistência a algum dos antibióticos testados e 76% (53/70) dos isolados foram resistentes ao imipenem. O teste de sensibilidade para o imipenem não foi realizado em 01 isolado. Os resultados dos testes mostraram que a menor taxa de resistência foi percebida contra polimixina B/colistina (10%) e tigeciclina (8%). Dos isolados sensíveis ao imipenem, 41% (7/17) apresentaram somente o OXA-51 e em 53% (9/17) foi detectado o gene ISAba1 à montante do gene OXA, onde dois isolados apresentaram os genes OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + ISAba1/OXA-58 e ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + OXA-58, os quais estão classificados como fraco e moderado formadores de biofilme, respectivamente. Em contrapartida, dos 53 isolados que expressaram resistência ao imipenem, 24% (13) possuíam somente OXA51 + ISAba1/OXA-23, 23% (12) possuíam somente ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA23 e 19% (10) possuíam somente OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + OXA-58. A tabela 6 mostra a distribuição de genes β-lactamases do tipo OXA em isolados de A. baumannii na resistência aos antibióticos, onde 756% (53/70) apresentaram resistência ao imipenem e 60% (42/70) dos isolados se destacaram na resistência multidrogas ao imipenem, meropenem, cefepima, ceftazidima, ciprofloxacina e piperacilina/tazobactam, dentre os demais carbapenêmicos testados. Nenhum isolado resistente aos antibióticos supracitados apresentou ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-58 ou ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + ISAba1/OXA-58. 45 Tabela 6. Distribuição de genes β-lactamases do tipo OXA em isolados Acinetobacter baumannii com perfil de resistência aos antimicrobianos relacionados. Resistência ao Resistência ao IPM IPM, MER, CPX, CAZ, CFPM, PIP/TAZ Sensibilidade ao IPM 10 (19%) 9 (21%) 7 (41%) Somente ISAba1/OXA-51 3 (6%) 3 (7%) 3 (18%) OXA-51 + OXA-23 1 (2%) 0 0 OXA51 + OXA-58 1 (2%) 0 1 (6%) ISAba1/OXA-51 + OXA-58 1 (2%) 0 0 ISAba1/OXA-51 + OXA-23 2 (4%) 2 (5%) 0 OXA-51 + OXA-58 + ISAba1/OXA23 10 (19%) 10 (24%) 1 (6%) OXA-51 + ISAba1/OXA-23 13 (24%) 8 (19%) 1 (6%) OXA-51 + ISAba1/OXA-58 0 0 1 (6%) OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + ISAba1/OXA-58 0 0 2 (12%) 12 (23%) 10 (24%) 0 0 0 1 (6%) 53 (100%) 42 (100%) 17 (100%) Alelos OXA Somente OXA-51 ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + OXA-58 TOTAL Dos 51 isolados em que o gene ISAba1 foi detectado, 78% (40/51) estavam associados ao gene OXA-23, 45% (23/51) ao gene OXA-51 e 8% (4/51) ao gene OXA58 (tabela 7). A resistência à cefepima, ceftazidima, ciprofloxacina, imipenem e meropenem foi observada em 82% (33/40) dos isolados com ISAba1/OXA-23 e em 74% (17/23) dos isolados com ISAba1/OXA-51. Já os isolados com ISAba1/OXA-58 apresentaram sensibilidade ao imipenem e meropenem. Três isolados expressaram resistência a todos os antimicrobianos testados, onde os isolados ABs09 amplificou somente para ISAba1/OXA-51, ABs10 amplificou somente para OXA-51 e o ABs15 amplificou somente para OXA-51 e ISAba1/OXA-23. Em contrapartida, um isolado foi sensível a todos os antibióticos testados, amplificando somente para OXA-51. As tabelas 7 e 8 mostram o perfil de resistência dos isolados a diferentes antimicrobianos e presença de genes β-lactamases do tipo OXA. A tabela 8 relaciona na 46 exclusividade dos genes OXA-51 e ISAba1/OXA-51. Nos isolados em que o gene OXA-58 foi detectado, houve a presença de um ou mais genes OXA. Tabela 7. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii na presença de genes β-lactamases do tipo OXA. OXA-51 (n=71)* ISAba1/ OXA-51 (n=23)* OXA-23 (n=43)* ISAba1/ OXA-23 (n=40)* OXA-58 (n=19)* ISAba1/ OXA-58 (n=4)* AMI 19 (27%) 3 (13%) 10 (23%) 10 (25%) 9 (47%) 3 (75%) AMP/SUL 44 (62%) 17 (74%) 31 (72%) 29 (72%) 11 (58%) 0 CFPM 68 (96%) 23 (100%) 42 (98%) 39 (98%) 13 (68%) 4 (100%) CAZ 66 (93%) 23 (100%) 42 (98%) 39 (98%) 13 (68%) 4 (100%) CPX 65 (91%) 22 (96%) 40 (93%) 37 (92%) 17 (90%) 4 (100%) GEN 39 (55%) 13 (56%) 23 (54%) 22 (55%) 9 (47%) 2 (50%) IPM 53 (75%) 18 (78%) 38 (88%) 35 (88%) 12 (63%) 0 LVX 31 (44%) 10 (43%) 19 (44%) 18 (45%) 11 (58%) 4 (100%) MER 53 (75%) 18 (78%) 38 (88%) 35 (88%) 12 (63%) 0 PIP/TAZ 50 (70%) 20 (87%) 33 (77%) 31 (78%) 11 (58%) 1 (25%) POL 7 (9%) 3 (13%) 4 (9%) 4 (10%) 0 0 TET 34 (48%) 7 (30%) 22 (51%) 21 (52%) 12 (63%) 3 (75%) TGC 6 (8%) 2 (9%) 4 (9%) 4 (10%) 0 0 *n representa o número de isolados positivos para o gene OXA ou ISAba1/OXA Tabela 8. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii aos β-lactâmicos na presença ou não do elemento ISAba1 à frente do gene OXA-51. OXA-51 (n=17) ISAba1/ OXA-51 (n=6) Cefepima 15 (88%) 6 (100%) Ceftazidima 14 (82%) 6 (100%) Imipenem 10 (59%) 3 (50%) Meropenem 10 (59%) 3 (50%) Antibióticos 47 5.5 RESISTÊNCIA E FORMAÇÃO DE BIOFILME Com base no teste de sensibilidade realizado com os 71 isolados, 68 apresentaram resistência a algum dos antibióticos testados. Dos 57 isolados formadores de biofilme, 55 apresentaram resistência a algum dos antibióticos e 2 foram sensíveis a todos os antibióticos. Dos isolados formadores de biofilme que apresentaram resistência, 100% (55/55) expressaram resistência à cefepima, seguido de 96% (53/55) para ceftazidima e ciprofloxacina, e 76% (42/55) para imipenem e meropenem. Observa-se, na tabela 9, que os isolados formadores de biofilme apresentaram maior resistência contra a cefepima, ceftazidima e ciprofloxacina, seguido do imipenem e meropenem. A menor resistência (9%) foi observada para tigeciclina, seguido da polimixina B/colistina (10%). Tabela 9. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados de Acinetobacter baumannii, em porcentagem (%). RESISTÊNCIA ANTIBIÓTICOS Isolados formadores de biofilme (n=57) Isolados não- Resistência de formadores de todos os biofilme isolados (n=14) (n=71) Amicacina 30 14 27 Ampicilina/Sulbactam 66 43 62 Cefepima 96 93 96 Ceftazidima 93 93 93 Ciprofloxacina 93 86 91 Gentamicina 58 43 55 Imipenem 74 78 75 Levofloxacina 47 28 44 Meropenem 74 78 75 Piperacilina/Tazobactam 74 57 70 Polimixina B/Colistina 10 7 10 Tetraciclina 51 36 48 Tigeciclina 9 7 8 48 A tabela 10 mostra o padrão de resistência multidroga dos isolados formadores de biofilme, onde 5% apresentaram resistência a todos os antibióticos testados. Dos 57 isolados formadores de biofilme, 74% (42) expressaram resistência contra o imipenem e meropenem. Tabela 10. Padrão de resistência multidrogas de formadores e não formadores de biofilme. Formadores de biofilme que apresentaram resistência (n=55) Não formadores de biofilme que apresentaram resistência (n=13) Todos antibióticos testados 3 (5%) 0 AMI, AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, GEN, IPM, LVX, MER, PIP/TAZ, POL, TET 5 (9%) 0 AMI, AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, GEN, IPM, LVX, MER, PIP/TAZ, TET 8 (14%) 1 (8%) AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, GEN, IPM, MER, PIP/TAZ 21 (38%) 4 (31%) AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, IPM, MER, PIP/TAZ 34 (62%) 6 (46%) CFPM, CAZ, CPX, IPM, MER, PIP/TAZ 36 (65%) 7 (54%) CFPM, CAZ, CPX, IPM, MER 41 (74%) 10 (77%) Perfil de Resistência Dados clínicos indicam atividade microbiana altamente eficaz das polimixinas e tigeciclinas contra isolados A. baumannii. Dentre os isolados classificados como formadores de biofilme, 10% (6/57) e 9% (5/57) expressaram resistência às polimixinas e tigeciclinas, respectivamente. Dentre os não-formadores de biofilme, somente um isolado expressou resistência aos antimicrobianos mencionados. 5.6 RELAÇÃO ENTRE A RESISTÊNCIA E O GENE blaPER-1 Todos os 21 isolados que possuíam o gene blaPER-1 (tabela 4) expressaram resistência à cefepima (tabela 11). A resistência à ceftazidima e imipenem também foi comparada, onde 95% (20/21) e 90% (19/21) dos isolados com o gene expressaram resistência, respectivamente. A resistência concomitante à cefepima, ceftazidima e imipenem foi observada em 19 isolados (90%) que possuíam o gene blaPER-1. Dois isolados foram sensíveis ao imipenem, sendo 01 sensível também à ceftazidima. A 49 sensibilidade concomitante aos três antibióticos mencionados foi observada em apenas 3 isolados, e nenhum possuía o gene blaPER-1. Tabela 11. Relação entre a presença do gene blaPER-1 e a resistência à cefepima. Resistência à Sensibilidade à cefepima cefepima Presença do gene blaPER-1 21 0 21 Ausência do gene blaPER-1 47 03 50 Total 68 03 71 Total Vale destacar que não houve relação entre a presença do gene blaPER-1 e os óbitos dos pacientes, uma vez que dentre os 21 pacientes infectados com A. baumannii carregando o gene blaPER-1, 76% (16/21) foram a óbito, enquanto que o índice de óbitos entre os pacientes infectados por A. baumannii não-produtora de blaPER-1 foi de 60% (30/50). 50 6 DISCUSSÃO As infecções por A. baumannii representam um desafio médico global. São patógenos oportunistas e são, particularmente, bem sucedidos em colonizar e persistir no ambiente hospitalar. São capazes de resistir à dessecação e sobreviver em superfícies inanimadas por anos (Jain & Danziger 2004; Jeong et al. 2006; Dijkshoorn et al. 2007). O interesse por este organismo tem crescido rapidamente devido ao aparecimento de isolados MDR, alguns dos quais são PDR aos agentes antimicrobianos (Prashanth & Badrinath 2004; Van Looveren & Goossens 2004; Dijkshoorn et al. 2007;). Ele também está entre as causas mais comuns de infecção nosocomial relacionada a dispositivos médicos, sendo resultado da capacidade do organismo de resistir à desinfecção química e física, muitas vezes formando biofilme. A formação de biofilme tem sido uma característica chave na patogenicidade, especialmente em relação às infecções na linha intravascular e pneumonia associada à ventilação mecânica. Geralmente duas propriedades são frequentemente associadas com a produção de biofilme: o aumento da síntese de exopolissacarídeo (EPS) e o desenvolvimento de resistência aos antibióticos (Costerton et al. 1999). Assim, as infecções devidas às bactérias que formam biofilme são um problema clínico tenaz. Optamos por investigar a capacidade de formação de biofilme em poliestireno por isolados clínicos de A. baumannii e a resistência a múltiplas drogas entre elas, assim como a presença de genes relacionados com a formação de biofilme e resistência a antimicrobianos, a saber: blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-58 e a sequência de inserção ISAba1. Para a identificação do produto do gene blaPER-1, das 71 amostras analisadas, 21 mostraram positivas para o gene blaPER-1. Destas, 12 apresentaram formação de biofilme. No presente estudo, o método quantitativo para formação de biofilme mostrou 6 (7,5%) isolados como fortes formadores de biofilme, porém na ausência do gene blaPER-1. O resultado de Fisher revela que há diferença estatística entre os grupos, admitindo-se pelo teste de correlação que existe uma correlação negativa entre a presença do gene blaPER-1 e a formação de biofilme, sugerindo que o gene tem efeito inibidor na formação de biofilme, sendo aceita a possibilidade de que outros fatores estão mais fortemente associados com a formação de biofilme dos mesmos, tais como a 51 presença de pili, estruturas semelhantes à fímbrias, OmpA (proteínas de membrana externa) e proteínas que se ligam à fibronectina, conhecidas como FBPs (fibronectinbinding proteins), as quais facilitam a adesão e invasão bacteriana em células hospedeiras (Gohl et al. 2006; Lee et al. 2006; Gaddy et al. 2009; Henderson et al. 2011). Sechi et al. (2004) e Rao et al. (2008), relacionam a produção de blaPER-1 com a aderência bacteriana, mas não com a formação do biofilme. No entanto, Lee et al. (2008) mostraram em seus resultados que os isolados que possuem esse gene, apresentam capacidade altamente significativa para adesão e formação de biofilme, quando comparado aos isolados que não carregavam o gene. Em relação à resistência, todos os isolados que amplificaram para o gene blaPER-1 apresentaram resistência contra a cefepima, compartilhando de resultados semelhantes apresentados por Yong et al. (2003). Observa-se, portanto, que a presença do gene blaPER-1 estava associada a multirresistência às drogas testadas neste trabalho, uma vez que a sensibilidade concomitante à cefepima, ceftazidima e imipenem foi observada somente na ausência do gene blaPER-1 (Tabela 11). Os isolados formadores de biofilme expressaram resistência à cefepima, ceftazidima, ciprofloxacina, imipenem e meropenem. Em relação aos não-formadores de biofilme, nosso estudo detectou resistência altamente significativa aos mesmos antibióticos. O aumento da resistência em isolados não-formadores de biofilme também foi relatado por Rao et al. (2008). Esta característica pode estar associada à presença de genes que promovem a resistência, bem como a ação de mecanismos não-enzimáticos como super-expressão de bombas de efluxo, alteração de porinas e impermeabilidade da membrana (Gur et al. 2008). A seleção apropriada do antibiótico para o tratamento de infecções associadas ao biofilme, assim como a simples presença de A. baumannii, é extremamente importante. Os carbapenêmicos têm sido as drogas de escolha para o tratamento de infecções causadas por este organismo (Quale et al. 2003), mas a resistência aos mesmos tem se tornado comum, diminuindo as opções terapêuticas existentes (Sohrabi et al. 2012). Neste estudo, 75% (53/71) dos isolados foram resistentes ao imipenem e meropenem, sendo estes os antibióticos mais comumente prescritos nos hospitais. Além disso, a alta porcentagem de resistência também foi observada à ciprofloxacina (91%). Em concordância com outros estudos, foi observado que dos seis isolados classificados como fortes formadores de biofilme, 67% (4/6) apresentaram resistência a quase 60% dos antibióticos testados (Siroy et al. 2006; Rodriguez-Bano et al. 2008). Assim, 52 adquirir a capacidade de formar biofilme torna-se uma boa estratégia para aumentar a sobrevivência e persistência sob condições de estresse, por exemplo, durante a invasão hospedeiro ou após o tratamento antibiótico (Rao et al. 2008). Como consequência do desenvolvimento de biofilme, afirma-se que a capacidade de Acinetobacter para a transferência de genes é horizontal, facilitando a disseminação de resistência aos antibióticos nessas micro-comunidades (Lee et al. 2008). No entanto, ainda não se sabe muito sobre o mecanismo que desencadeia o desenvolvimento de biofilme em A. baumannii (Lee et al. 2008). O gene OXA-51 foi detectado nos 71 isolados, corroborando com estudos que sugerem a presença do gene em todos os isolados de A. baumannii, uma vez que o gene OXA-51 é intrínseco à espécie (Heritier et al. 2005; Turton et al. 2006b; Sohrabi et al. 2012). Surtos por isolados de CRAB produtores de OXA-23 têm sido relatado em diversos países, sendo encontrado disseminado em todo o mundo (Mugnier et al. 2010). Nos estudos conduzidos por Mak et al. (2009), Zhou et al. (2007) e Figueiredo et al. (2011), 87,5%, 94% e 75% dos isolados resistentes ao imipenem tinham o gene OXA-23, respectivamente. Neste estudo, 72% (38/53) dos isolados resistentes ao imipenem possuíam o gene em questão. Não foi detectada a presença do gene OXA-40 dentre os isolados analisados, concordando com os resultados apresentados por Sohrabi et al. (2012) realizado no noroeste do Irã, onde apenas em 1 em cada 100 isolados foi detectado o gene. A alta prevalência deste gene tem sido relatada em países da Europa (Quinteira et al. 2007; Ruiz et al. 2007). O único achado deste gene no Brasil foi relatado em um estudo conduzido por Werneck et al. (2011a), onde OXA-40 foi detectado no único isolado de A. baumannii avaliado no estudo. Dos 71 isolados investigados, 27% apresentaram o gene OXA-58. Estes achados apresentam maior porcentagem de isolados com o gene do que os resultados apresentados por Sohrabi et al. (2012), Feizabadi et al. (2008) e Taherikalani et al. (2009), com 3,6%, 9% e 9%, respectivamente. Os isolados avaliados naqueles estudos foram provenientes do Irã e, portanto, pode ser que exista uma relação geográfica. No entanto, é equivalente aos resultados apresentados por Ruiz et al. (2007) na Espanha e Vahaboglu et al. (2006) na Turquia, com 19% e 17% dos isolados contendo o gene OXA-58, respectivamente. Figueiredo et al. (2011) detectou OXA-58 em 1 isolado, de um total de 20 isolados estudados no Rio de Janeiro. 53 Recentemente uma sequência de inserção chamada ISAba1 foi identificada em A. baumannii (Corvec et al. 2003) e associada com a super-expressão de genes de resistência como AmpC, OXA-23 e OXA-51, que conferem resistência aos carbapenêmicos (Corvec et al. 2003; Corvec et al. 2007; Turton et al. 2006a). A amplificação por PCR neste estudo detectou a presença de ISAba1 em 72% dos isolados. Este resultado está de acordo com outros estudos em que ISAba1 foi encontrado na maioria do isolados, como por exemplo, Ruiz et al. (2007), Turton et al. (2006a) e Sohrabi et al. (2012) que detectaram ISAba1 em 74,7%, 84% e 90% dos isolados provenientes da Espanha, Reino Unido e Irã, respectivamente. Neste estudo, os resultados revelaram ainda que a maioria, ou seja, 57% (39/68) dos isolados de A. baumannii resistentes a algum dos antibióticos testados tinham ISAba1 à montante do gene OXA-23. Dos isolados resistentes ao imipenem, 77% (41/53) possuíam o gene ISAba1 à montante do gene OXA, cujo resultado é similar aos estudos conduzidos por Mak et al. (2009), Turton et al. (2006a) e Zhou et al. (2007), onde 52,6%, 86% e 94% de isolados A. baumannii resistentes ao imipenem tinham ISAba1, respectivamente. Ainda em relação aos isolados resistentes ao imipenem, 66% (35/53) tiveram o gene ISAba1 à montante do gene OXA-23, similar ao resultado apresentado por Sohabi et al. (2012), com 74,2%. Estes resultados indicam que ISAba1 quando associado ao gene OXA-23 pode estar envolvido na resistência ao imipenem. Vale destacar que a associação entre ISAba1 e o gene OXA-58 não resultou em resistência ao imipenem. Dos 43 isolados que continham o gene OXA-23, 93% (40/43) possuíam o gene ISAba1 à montante deste gene. Zhou et al. (2007) e Turton et al. (2006a) relataram que 97,5% e 100% dos isolados com OXA-23 continham o gene ISAba1 à montante do OXA-23. Turton et al.(2006a) relataram que dentre os 20 isolados que possuíam somente OXA-51, 8 apresentaram ISAba1 associado ao gene e expressando resistência ao imipenem ou meropenem, concluindo que a expressão do gene OXA-51 é baixa na maioria dos casos. Sohrabi et al. (2012) relatou que enquanto 3 isolados que foram resistentes ao imipenem tinham ISAba1 à montante de OXA-51, somente 1 isolado com apenas OXA-51 expressou resistência ao imipenem, sugerindo que a presença do gene OXA-51 sozinho não é suficiente para expressar resistência contra os antibióticos carbapenêmicos. Neste estudo, a presença isolada do gene OXA-51, ou associada ao ISAba1 (6), foi identificada em 23 isolados. Dentre eles, 56% (13/23) dos isolados 54 foram resistentes ao imipenem e meropenem, onde 23% (3/13) apresentaram a sequência de inserção ISAba1 à montante do gene. Percebe-se, portanto, que estes achados indicam uma discordância com os resultados apresentados por Turton et al. (2006a) e Sohrabi et al. (2012), pois a resistência ao imipenem e meropenem foi expressa em 10 isolados que possuíam somente o gene OXA-51. Este resultado sugere a presença de outros genes β-lactamases do tipo OXA que não foram pesquisados neste estudo, explicando a resistência ao imipenem dos isolados contendo somente o gene OXA-51. Este estudo detectou, através da amplificação por PCR, a presença de ISAba1 à montante do OXA-58 em 4 isolados, porém em 3 isolados o elemento de inserção estava presente também à montante do gene OXA-23 ou OXA-51. Em um foi detectado ISAba1/OXA-51 e no outro foi detectado OXA-51 e ISAba1/OXA-23. Todos os quatro isolados foram sensíveis ao imipenem. Sohrabi et al. (2012) relatam não ter encontrado ISAba1 à montante do gene OXA-58 nos dois isolados onde OXA-58 foi detectado. Em estudo realizado no sul do Brasil, Gusatti et al. (2012) relatou encontrar a sequência de inserção ISAba1 localizada à montante do gene OXA-58 (Gusatti et al. 2012). Observou-se que a resistência em isolados contendo ISAba1 associado a algum dos genes OXA foi significativa, sugerindo que ISAba1 é importante na expressão destes genes. A facilidade em superexpressar genes com este elemento móvel pode ser de grande vantagem, proporcionando um mecanismo para expressar os genes somente quando existe uma vantagem seletiva para o fazer. A presença de ISAba1 reflete em A. baumannii, de modo que o organismo se ligue rapidamente ao DNA, dando-lhe uma maleabilidade que pode contribuir muito para o seu sucesso (Turton et al. 2006a). 55 7 CONCLUSÕES Este estudo revelou, pela primeira vez, a ocorrência do gene blaPER-1 em isolados de A. baumannii no Brasil e o primeiro relato do gene OXA-58 e da sequência de inserção ISAba1 em isolados de Acinetobacter baumannii no Estado de Goiás. A maioria dos isolados clínicos de A. baumannii analisados possuiam capacidade para formação de biofilme, porém, neste estudo, a correlação entre a presença do gene blaPER-1 e a capacidade de formar biofilme foi negativa, uma vez que a detecção do gene foi maior nos isolados que apresentaram fraca formação de biofilme, sendo também detectado na maioria dos isolados não-formadores de biofilme. Foi observada resistência à cefepima, ceftazidima, ciprofloxacina, imipenem e meropenem em isolados formadores de biofilme. Porém, o mesmo foi observado em isolados não-formadores de biofilme, sugerindo que essa resistência esteja relacionada à presença do gene blaPER-1 nesses isolados. Os genes OXA-51, OXA-23, OXA-58 e ISAba1 foram detectados em alguns isolados de Acinetobacter baumannii, sendo maior a prevalência do OXA-23, uma vez que o OXA-51 é um gene intrínseco à espécie. A sequência de inserção ISAba1 foi detectada na maioria dos isolados que apresentaram algum dos genes OXA e a resistência concomitante à cefepima, ceftazidima, imipenem e meropenem foi mais prevalente entre os isolados que possuíam o gene ISAba1. 56 REFERÊNCIAS Abbo A, Navon-Venezia S, Hammer-Muntz O, Krichali T, Siegman-Igra Y, Carmeli Y 2005. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Emerging infectious diseases, 11, 22-29. Afzal-Shah M, Woodford N, Livermore DM 2001. Characterization of OXA-25, OXA26, and OXA-27, molecular class D beta-lactamases associated with carbapenem resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy, 45, 583-588. ANVISA. Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde [serial on the Internet], 2004a 04 de setembro de 2012 [cited:[1-93 p.]. Available from: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia.asp. ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Edição Comemorativa para o IX Congresso Brasileiro de Controle de Infecção e Epidemiologia Hospitalar. Agência Nacional de Vigilância Sanitária [serial on the Internet], 2004b:[381 p.]. Anwar H, van Biesen T, Dasgupta M, Lam K, Costerton JW 1989. Interaction of biofilm bacteria with antibiotics in a novel in vitro chemostat system. Antimicrobial agents and chemotherapy, 33, 1824-1826. Bagge N, Ciofu O, Skovgaard LT, Hoiby N 2000. Rapid development in vitro and in vivo of resistance to ceftazidime in biofilm-growing Pseudomonas aeruginosa due to chromosomal beta-lactamase. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica, 108, 589-600. Bauernfeind A, Stemplinger I, Jungwirth R, Mangold P, Amann S, Akalin E, Ang O, Bal C, Casellas JM 1996. Characterization of beta-lactamase gene blaPER-2, which encodes an extended-spectrum class A beta-lactamase. Antimicrobial agents and chemotherapy, 40, 616-620. Baumann P, Doudoroff M, Stanier RY 1968. A study of the Moraxella group. II. Oxidative-negative species (genus Acinetobacter). Journal of bacteriology, 95, 1520-1541. 57 Bergogne-Berezin E, Towner KJ 1996. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clinical microbiology reviews, 9, 148-165. Bertini A, Poirel L, Bernabeu S, Fortini D, Villa L, Nordmann P, Carattoli A 2007. Multicopy blaOXA-58 gene as a source of high-level resistance to carbapenems in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy, 51, 23242328. Birnboim HC, Doly J 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids research, 7, 1513-1523. Bogaerts P, Cuzon G, Naas T, Bauraing C, Deplano A, Lissoir B, Nordmann P, Glupczynski Y 2008. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates expressing the blaOXA-23 gene associated with ISAba4 in Belgium. Antimicrobial agents and chemotherapy, 52, 4205-4206. Bogaerts P, Naas T, Wybo I, Bauraing C, Soetens O, Pierard D, Nordmann P, Glupczynski Y 2006. Outbreak of infection by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the carbapenemase OXA-58 in Belgium. Journal of clinical microbiology, 44, 4189-4192. Bouvet PJM, Grimont PAD 1986. Taxonomy of the Genus Acinetobacter with the Recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov. Acinetobacter haemolyticus sp. nov. Acinetobacter johnsonii sp. nov. and Acinetobacter junii sp. nov. and Emended Descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwofii. Int J Syst Bacteriol, 36, 228-240. Brink A, Moolman J, da Silva MC, Botha M 2007. Antimicrobial susceptibility profile of selected bacteraemic pathogens from private institutions in South Africa. South African medical journal = Suid-Afrikaanse tydskrif vir geneeskunde, 97, 273-279. Brisou J, Prevot AR 1954. [Studies on bacterial taxonomy. X. The revision of species under Acromobacter group]. Annales de l'Institut Pasteur, 86, 722-728. Brooun A, Liu S, Lewis K 2000. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial agents and chemotherapy, 44, 640-646. Brown S, Young HK, Amyes SG 2005. Characterisation of OXA-51, a novel class D carbapenemase found in genetically unrelated clinical strains of Acinetobacter baumannii from Argentina. Clinical microbiology and infection : the official 58 publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 11, 15-23. Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA 1995. A functional classification scheme for betalactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrobial agents and chemotherapy, 39, 1211-1233. Carvalho KR, Carvalho-Assef AP, Peirano G, Santos LC, Pereira MJ, Asensi MD 2009. Dissemination of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii genotypes carrying bla(OXA-23) collected from hospitals in Rio de Janeiro, Brazil. International journal of antimicrobial agents, 34, 25-28. Christiaen SE, Brackman G, Nelis HJ, Coenye T 2011. Isolation and identification of quorum quenching bacteria from environmental samples. Journal of microbiological methods, 87, 213-219. Claeys G, Verschraegen G, de Baere T, Vaneechoutte M 2000. PER-1 beta-lactamaseproducing Pseudomonas aeruginosa in an intensive care unit. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 45, 924-925. Cochran WL, McFeters GA, Stewart PS 2000. Reduced susceptibility of thin Pseudomonas aeruginosa biofilms to hydrogen peroxide and monochloramine. Journal of applied microbiology, 88, 22-30. Coelho JM, Turton JF, Kaufmann ME, Glover J, Woodford N, Warner M, Palepou MF, Pike R, Pitt TL, Patel BC, Livermore DM 2006. Occurrence of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii clones at multiple hospitals in London and Southeast England. Journal of clinical microbiology, 44, 3623-3627. Corvec S, Caroff N, Espaze E, Giraudeau C, Drugeon H, Reynaud A 2003. AmpC cephalosporinase hyperproduction in Acinetobacter baumannii clinical strains. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 52, 629-635. Corvec S, Poirel L, Naas T, Drugeon H, Nordmann P 2007. Genetics and expression of the carbapenem-hydrolyzing oxacillinase gene blaOXA-23 in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy, 51, 1530-1533. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP 1999. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, 284, 1318-1322. D'Arezzo S, Capone A, Petrosillo N, Visca P, Ballardini M, Bartolini S, Bordi E, Di Stefano A, Galie M, Minniti R, Meledandri M, Pacciani L, Parisi G, Prignano G, Santini C, Valmarin M, Venditti M, Ziantoni S 2009. Epidemic multidrugresistant Acinetobacter baumannii related to European clonal types I and II in 59 Rome (Italy). Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 15, 347-357. Da Silva G, Dijkshoorn L, van der Reijden T, van Strijen B, Duarte A 2007. Identification of widespread, closely related Acinetobacter baumannii isolates in Portugal as a subgroup of European clone II. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 13, 190-195. Dalla-Costa LM, Coelho JM, Souza HA, Castro ME, Stier CJ, Bragagnolo KL, ReaNeto A, Penteado-Filho SR, Livermore DM, Woodford N 2003. Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme in Curitiba, Brazil. Journal of clinical microbiology, 41, 3403-3406. Danel F, Hall LM, Gur D, Akalin HE, Livermore DM 1995. Transferable production of PER-1 beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 35, 281-294. Das JR, Bhakoo M, Jones MV, Gilbert P 1998. Changes in the biocide susceptibility of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli cells associated with rapid attachment to plastic surfaces. Journal of applied microbiology, 84, 852-858. Davis KA, Moran KA, McAllister CK, Gray PJ 2005. Multidrug-resistant Acinetobacter extremity infections in soldiers. Emerging infectious diseases, 11, 1218-1224. de Beer D, Stoodley P, Roe F, Lewandowski Z 1994. Effects of biofilm structures on oxygen distribution and mass transport. Biotechnology and bioengineering, 43, 1131-1138. de Breij A, Dijkshoorn L, Lagendijk E, van der Meer J, Koster A, Bloemberg G, Wolterbeek R, van den Broek P, Nibbering P 2010. Do biofilm formation and interactions with human cells explain the clinical success of Acinetobacter baumannii? PloS one, 5, e10732. De Champs C, Chanal C, Sirot D, Baraduc R, Romaszko JP, Bonnet R, Plaidy A, Boyer M, Carroy E, Gbadamassi MC, Laluque S, Oules O, Poupart MC, Villemain M, Sirot J 2004. Frequency and diversity of Class A extended-spectrum betalactamases in hospitals of the Auvergne, France: a 2 year prospective study. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 54, 634-639. Dijkshoorn L, Nemec A, Seifert H 2007. An increasing threat in hospitals: multidrugresistant Acinetobacter baumannii. Nature reviews. Microbiology, 5, 939-951. 60 Docquier JD, Luzzaro F, Amicosante G, Toniolo A, Rossolini GM 2001. Multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa producing PER-1 extended-spectrum serinebeta-lactamase and VIM-2 metallo-beta-lactamase. Emerging infectious diseases, 7, 910-911. Durand ML, Calderwood SB, Weber DJ, Miller SI, Southwick FS, Caviness VS, Jr., Swartz MN 1993. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England journal of medicine, 328, 21-28. Feizabadi MM, Fathollahzadeh B, Taherikalani M, Rasoolinejad M, Sadeghifard N, Aligholi M, Soroush S, Mohammadi-Yegane S 2008. Antimicrobial susceptibility patterns and distribution of blaOXA genes among Acinetobacter spp. Isolated from patients at Tehran hospitals. Japanese journal of infectious diseases, 61, 274-278. Fernandez-Cuenca F, Martinez-Martinez L, Conejo MC, Ayala JA, Perea EJ, Pascual A 2003. Relationship between beta-lactamase production, outer membrane protein and penicillin-binding protein profiles on the activity of carbapenems against clinical isolates of Acinetobacter baumannii. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 51, 565-574. Figueiredo DQ, Santos KR, Pereira EM, Schuenck RP, Mendonca-Souza CR, Teixeira LM, Mondino SS 2011. First report of the bla(OXA-58) gene in a clinical isolate of Acinetobacter baumannii in Rio de Janeiro, Brazil. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 106, 368-370. Figueiredo S, Poirel L, Papa A, Koulourida V, Nordmann P 2009. Overexpression of the naturally occurring blaOXA-51 gene in Acinetobacter baumannii mediated by novel insertion sequence ISAba9. Antimicrobial agents and chemotherapy, 53, 4045-4047. Fournier PE, Richet H 2006. The epidemiology and control of Acinetobacter baumannii in health care facilities. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 42, 692-699. Gaddy JA, Actis LA 2009. Regulation of Acinetobacter baumannii biofilm formation. Future microbiology, 4, 273-278. Gaddy JA, Tomaras AP, Actis LA 2009. The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA protein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and in the interaction of this pathogen with eukaryotic cells. Infection and immunity, 77, 3150-3160. 61 Gales AC, Jones RN, Sader HS 2006. Global assessment of the antimicrobial activity of polymyxin B against 54 731 clinical isolates of Gram-negative bacilli: report from the SENTRY antimicrobial surveillance programme (2001-2004). Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 12, 315-321. Gerner-Smidt P, Tjernberg I, Ursing J 1991. Reliability of phenotypic tests for identification of Acinetobacter species. Journal of clinical microbiology, 29, 277282. Ghigo JM 2003. Are there biofilm-specific physiological pathways beyond a reasonable doubt? Research in microbiology, 154, 1-8. Giamarellou H, Antoniadou A, Kanellakopoulou K 2008. Acinetobacter baumannii: a universal threat to public health? International journal of antimicrobial agents, 32, 106-119. Godoy CSM 2012. Infecções por Acinetobacter baumannii em adultos admitidos em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) de Goiânia e Aparecida de Goiânia.Dissertação, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 71 pp. Gohl O, Friedrich A, Hoppert M, Averhoff B 2006. The thin pili of Acinetobacter sp. strain BD413 mediate adhesion to biotic and abiotic surfaces. Applied and environmental microbiology, 72, 1394-1401. Gordon CA, Hodges NA, Marriott C 1988. Antibiotic interaction and diffusion through alginate and exopolysaccharide of cystic fibrosis-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 22, 667-674. Goto T, Nakame Y, Nishida M, Ohi Y 1999. In vitro bactericidal activities of betalactamases, amikacin, and fluoroquinolones against Pseudomonas aeruginosa biofilm in artificial urine. Urology, 53, 1058-1062. Griffith ME, Ceremuga JM, Ellis MW, Guymon CH, Hospenthal DR, Murray CK 2006. Acinetobacter skin colonization of US Army Soldiers. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America, 27, 659-661. Gur D, Korten V, Unal S, Deshpande LM, Castanheira M 2008. Increasing carbapenem resistance due to the clonal dissemination of oxacillinase (OXA-23 and OXA-58)producing Acinetobacter baumannii: report from the Turkish SENTRY Program sites. Journal of medical microbiology, 57, 1529-1532. 62 Gusatti CS, Bertholdo LM, Otton LM, Marchetti DP, Ferreira AE, Corção G 2012. Fist occurrence of blaOXA-58 in Acinetobacter baumannii isolated from a clinical sample in southern Brazil. Braz J Microbiol, 243-246. Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P 2004. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature reviews. Microbiology, 2, 95-108. Henderson B, Nair S, Pallas J, Williams MA 2011. Fibronectin: a multidomain host adhesin targeted by bacterial fibronectin-binding proteins. FEMS microbiology reviews, 35, 147-200. Heritier C, Poirel L, Fournier PE, Claverie JM, Raoult D, Nordmann P 2005. Characterization of the naturally occurring oxacillinase of Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy, 49, 4174-4179. Hou TW, Yin XL, Jiang CY, Wang ZH, Chen QK, Chen X, Li W, Bai Y 2007. [Microbiology and clinical analysis of six cases of hospital-acquired pneumonia caused by Acinetobacter baumannii]. Zhonghua jie he he hu xi za zhi = Zhonghua jiehe he huxi zazhi = Chinese journal of tuberculosis and respiratory diseases, 30, 35-39. Hu WS, Yao SM, Fung CP, Hsieh YP, Liu CP, Lin JF 2007. An OXA-66/OXA-51-like carbapenemase and possibly an efflux pump are associated with resistance to imipenem in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy, 51, 3844-3852. Iacono M, Villa L, Fortini D, Bordoni R, Imperi F, Bonnal RJ, Sicheritz-Ponten T, De Bellis G, Visca P, Cassone A, Carattoli A 2008. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial agents and chemotherapy, 52, 26162625. Iregbu KC, Ogunsola FT, Odugbemi TO 2002. Infections caused by Acinetobacter species and their susceptibility to 14 antibiotics in Lagos University Teaching Hospital, Lagos. West African journal of medicine, 21, 226-229. Jain R, Danziger LH 2004. Multidrug-resistant Acinetobacter infections: an emerging challenge to clinicians. The Annals of pharmacotherapy, 38, 1449-1459. Jayaraman A, Wood TK 2008. Bacterial quorum sensing: signals, circuits, and implications for biofilms and disease. Annual review of biomedical engineering, 10, 145-167. 63 Jeong SH, Bae IK, Kwon SB, Lee K, Yong D, Woo GJ, Lee JH, Jung HI, Jang SJ, Sung KH, Lee SH 2005. Investigation of a nosocomial outbreak of Acinetobacter baumannii producing PER-1 extended-spectrum beta-lactamase in an intensive care unit. The Journal of hospital infection, 59, 242-248. Jeong SH, Bae IK, Park KO, An YJ, Sohn SG, Jang SJ, Sung KH, Yang KS, Lee K, Young D, Lee SH 2006. Outbreaks of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii producing carbapenemases in Korea. J Microbiol, 44, 423-431. Joly-Guillou ML 2005. Clinical impact and pathogenicity of Acinetobacter. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 11, 868-873. Jones RN, Deshpande L, Fritsche TR, Sader HS 2004. Determination of epidemic clonality among multidrug-resistant strains of Acinetobacter spp. and Pseudomonas aeruginosa in the MYSTIC Programme (USA, 1999-2003). Diagnostic microbiology and infectious disease, 49, 211-216. Kaper JB, Sperandio V 2005. Bacterial cell-to-cell signaling in the gastrointestinal tract. Infection and immunity, 73, 3197-3209. Kiffer C, Hsiung A, Oplustil C, Sampaio J, Sakagami E, Turner P, Mendes C 2005. Antimicrobial susceptibility of Gram-negative bacteria in Brazilian hospitals: the MYSTIC Program Brazil 2003. The Brazilian journal of infectious diseases : an official publication of the Brazilian Society of Infectious Diseases, 9, 216-224. Ko KS, Suh JY, Kwon KT, Jung SI, Park KH, Kang CI, Chung DR, Peck KR, Song JH 2007. High rates of resistance to colistin and polymyxin B in subgroups of Acinetobacter baumannii isolates from Korea. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 60, 1163-1167. Kolayli F, Gacar G, Karadenizli A, Sanic A, Vahaboglu H 2005. PER-1 is still widespread in Turkish hospitals among Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. FEMS microbiology letters, 249, 241-245. Kumon H, Tomochika K, Matunaga T, Ogawa M, Ohmori H 1994. A sandwich cup method for the penetration assay of antimicrobial agents through Pseudomonas exopolysaccharides. Microbiology and immunology, 38, 615-619. Landman D, Bratu S, Kochar S, Panwar M, Trehan M, Doymaz M, Quale J 2007. Evolution of antimicrobial resistance among Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 60, 78-82. 64 Lautrop H 1974. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD. Lee HW, Koh YM, Kim J, Lee JC, Lee YC, Seol SY, Cho DT 2008. Capacity of multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii to form biofilm and adhere to epithelial cell surfaces. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 14, 49-54. Lee JC, Koerten H, van den Broek P, Beekhuizen H, Wolterbeek R, van den Barselaar M, van der Reijden T, van der Meer J, van de Gevel J, Dijkshoorn L 2006. Adherence of Acinetobacter baumannii strains to human bronchial epithelial cells. Research in microbiology, 157, 360-366. Lessel EF 1971. Subcommittee on nomenclature of Moraxella and allied bacteria. Int J Syst Bacteriol, 21, 213-214. Loehfelm TW, Luke NR, Campagnari AA 2008. Identification and characterization of an Acinetobacter baumannii biofilm-associated protein. Journal of bacteriology, 190, 1036-1044. Lolans K, Rice TW, Munoz-Price LS, Quinn JP 2006. Multicity outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates producing the carbapenemase OXA-40. Antimicrobial agents and chemotherapy, 50, 2941-2945. Mah TF, O'Toole GA 2001. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology, 9, 34-39. Mak JK, Kim MJ, Pham J, Tapsall J, White PA 2009. Antibiotic resistance determinants in nosocomial strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 63, 47-54. Marais E, de Jong G, Ferraz V, Maloba B, Duse AG 2004. Interhospital transfer of panresistant Acinetobacter strains in Johannesburg, South Africa. American journal of infection control, 32, 278-281. Martins AF, Kuchenbecker R, Sukiennik T, Boff R, Reiter KC, Lutz L, Machado AB, Barth AL 2009. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme: dissemination in Southern Brazil. Infection, 37, 474-476. Maslow JN, Glaze T, Adams P, Lataillade M 2005. Concurrent outbreak of multidrugresistant and susceptible subclones of Acinetobacter baumannii affecting different wards of a single hospital. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America, 26, 69-75. 65 Melchior MB, Vaarkamp H, Fink-Gremmels J 2006. Biofilms: a role in recurrent mastitis infections? Vet J, 171, 398-407. Miro E, Mirelis B, Navarro F, Rivera A, Mesa RJ, Roig MC, Gomez L, Coll P 2005. Surveillance of extended-spectrum beta-lactamases from clinical samples and faecal carriers in Barcelona, Spain. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 56, 1152-1155. Mohamed JA, Huang DB 2007. Biofilm formation by enterococci. Journal of medical microbiology, 56, 1581-1588. Mugnier P, Poirel L, Pitout M, Nordmann P 2008. Carbapenem-resistant and OXA-23producing Acinetobacter baumannii isolates in the United Arab Emirates. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 14, 879-882. Mugnier PD, Poirel L, Naas T, Nordmann P 2010. Worldwide dissemination of the blaOXA-23 carbapenemase gene of Acinetobacter baumannii. Emerging infectious diseases, 16, 35-40. Munoz-Price LS, Weinstein RA 2008. Acinetobacter infection. The New England journal of medicine, 358, 1271-1281. Murray CK, Roop SA, Hospenthal DR, Dooley DP, Wenner K, Hammock J, Taufen N, Gourdine E 2006. Bacteriology of war wounds at the time of injury. Military medicine, 171, 826-829. Naas T, Coignard B, Carbonne A, Blanckaert K, Bajolet O, Bernet C, Verdeil X, Astagneau P, Desenclos JC, Nordmann P 2006. VEB-1 Extended-spectrum betalactamase-producing Acinetobacter baumannii, France. Emerging infectious diseases, 12, 1214-1222. Naas T, Kernbaum S, Allali S, Nordmann P 2007a. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii, Russia. Emerging infectious diseases, 13, 669-671. Naas T, Levy M, Hirschauer C, Marchandin H, Nordmann P 2005. Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the carbapenemase OXA-23 in a tertiary care hospital of Papeete, French Polynesia. Journal of clinical microbiology, 43, 4826-4829. Naas T, Nordmann P, Heidt A 2007b. Intercountry transfer of PER-1 extendedspectrum beta-lactamase-producing Acinetobacter baumannii from Romania. International journal of antimicrobial agents, 29, 226-228. 66 Nadell CD, Xavier JB, Foster KR 2009. The sociobiology of biofilms. FEMS microbiology reviews, 33, 206-224. Navon-Venezia S, Leavitt A, Carmeli Y 2007. High tigecycline resistance in multidrugresistant Acinetobacter baumannii. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 59, 772-774. Nejjari N, Zerhouni F, Bouharrou A, Habzi A, Najdi T, Lahbabi M, Benomar S 2003. [Nosocomial infections caused by Acinetobacter: experience in a neonatal care unit in Casablanca]. La Tunisie medicale, 81, 121-125. Nemec A, Musilek M, Sedo O, De Baere T, Maixnerova M, van der Reijden TJ, Zdrahal Z, Vaneechoutte M, Dijkshoorn L 2010. Acinetobacter bereziniae sp. nov. and Acinetobacter guillouiae sp. nov., to accommodate Acinetobacter genomic species 10 and 11, respectively. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 60, 896-903. Nichols WW, Dorrington SM, Slack MP, Walmsley HL 1988. Inhibition of tobramycin diffusion by binding to alginate. Antimicrobial agents and chemotherapy, 32, 518523. Nordmann P, Naas T 1994. Sequence analysis of PER-1 extended-spectrum betalactamase from Pseudomonas aeruginosa and comparison with class A betalactamases. Antimicrobial agents and chemotherapy, 38, 104-114. Nordmann P, Poirel L 2002. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 8, 321-331. Nucleo E, Steffanoni L, Fugazza G, Migliavacca R, Giacobone E, Navarra A, Pagani L, Landini P 2009. Growth in glucose-based medium and exposure to subinhibitory concentrations of imipenem induce biofilm formation in a multidrug-resistant clinical isolate of Acinetobacter baumannii. BMC microbiology, 9, 270. Opazo A, Dominguez M, Bello H, Amyes SG, Gonzalez-Rocha G 2012. OXA-type carbapenemases in Acinetobacter baumannii in South America. Journal of infection in developing countries, 6, 311-316. Paterson DL, Bonomo RA 2005. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clinical microbiology reviews, 18, 657-686. Peleg AY, Bell JM, Hofmeyr A, Wiese P 2006a. Inter-country transfer of Gramnegative organisms carrying the VIM-4 and OXA-58 carbapenem-hydrolysing enzymes. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 57, 794-795. 67 Peleg AY, Franklin C, Bell JM, Spelman DW 2006b. Emergence of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii recovered from blood cultures in Australia. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America, 27, 759-761. Peleg AY, Seifert H, Paterson DL 2008. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clinical microbiology reviews, 21, 538-582. Perez F, Hujer AM, Hujer KM, Decker BK, Rather PN, Bonomo RA 2007. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy, 51, 3471-3484. Picão RC 2009. Estudo das β-lactamases envolvidas na resistência às cefalosporinas de amplo espectro em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa Tese, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo 122 pp. Playford EG, Craig JC, Iredell JR 2007. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in intensive care unit patients: risk factors for acquisition, infection and their consequences. The Journal of hospital infection, 65, 204-211. Poirel L, Cabanne L, Vahaboglu H, Nordmann P 2005. Genetic environment and expression of the extended-spectrum beta-lactamase blaPER-1 gene in gramnegative bacteria. Antimicrobial agents and chemotherapy, 49, 1708-1713. Poirel L, Naas T, Nordmann P 2010. Diversity, epidemiology, and genetics of class D beta-lactamases. Antimicrobial agents and chemotherapy, 54, 24-38. Poirel L, Nordmann P 2006a. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 12, 826-836. Poirel L, Nordmann P 2006b. Genetic structures at the origin of acquisition and expression of the carbapenem-hydrolyzing oxacillinase gene blaOXA-58 in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy, 50, 14421448. Prashanth K, Badrinath S 2004. In vitro susceptibility pattern of Acinetobacter species to commonly used cephalosporins, quinolones, and aminoglycosides. Indian journal of medical microbiology, 22, 97-103. Prigent-Combaret C, Vidal O, Dorel C, Lejeune P 1999. Abiotic surface sensing and biofilm-dependent regulation of gene expression in Escherichia coli. Journal of bacteriology, 181, 5993-6002. 68 Quale J, Bratu S, Landman D, Heddurshetti R 2003. Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii endemic in New York City. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 37, 214-220. Quinteira S, Grosso F, Ramos H, Peixe L 2007. Molecular epidemiology of imipenemresistant Acinetobacter haemolyticus and Acinetobacter baumannii isolates carrying plasmid-mediated OXA-40 from a Portuguese hospital. Antimicrobial agents and chemotherapy, 51, 3465-3466. Rao RS, Karthika RU, Singh SP, Shashikala P, Kanungo R, Jayachandran S, Prashanth K 2008. Correlation between biofilm production and multiple drug resistance in imipenem resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Indian journal of medical microbiology, 26, 333-337. Riley TV, Webb SA, Cadwallader H, Briggs BD, Christiansen L, Bowman RA 1996. Outbreak of gentamicin-resistant Acinetobacter baumanii in an intensive care unit: clinical, epidemiological and microbiological features. Pathology, 28, 359363. Roberts SA, Findlay R, Lang SD 2001. Investigation of an outbreak of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii in an intensive care burns unit. The Journal of hospital infection, 48, 228-232. Rodriguez-Bano J, Marti S, Soto S, Fernandez-Cuenca F, Cisneros JM, Pachon J, Pascual A, Martinez-Martinez L, McQueary C, Actis LA, Vila J 2008. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: associated features and clinical implications. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 14, 276-278. Rossau R, Landschoot AV, Gillis M, Ley JD 1991. Taxonomy of Moraxellaceae fam. nov., a New Bacterial Family To Accommodate the Genera Moraxella, Acinetobacter, and Psychrobacter and Related Organisms. Int J Syst Bacteriol, 41, 310-319. Ruiz M, Marti S, Fernandez-Cuenca F, Pascual A, Vila J 2007. High prevalence of carbapenem-hydrolysing oxacillinases in epidemiologically related and unrelated Acinetobacter baumannii clinical isolates in Spain. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 13, 1192-1198. 69 Schimith Bier KE, Luiz SO, Scheffer MC, Gales AC, Paganini MC, Nascimento AJ, Carignano E, Dalla Costa LM 2010. Temporal evolution of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in Curitiba, southern Brazil. American journal of infection control, 38, 308-314. Schulte B, Goerke C, Weyrich P, Grobner S, Bahrs C, Wolz C, Autenrieth IB, Borgmann S 2005. Clonal spread of meropenem-resistant Acinetobacter baumannii strains in hospitals in the Mediterranean region and transmission to South-west Germany. The Journal of hospital infection, 61, 356-357. Scott P, Deye G, Srinivasan A, Murray C, Moran K, Hulten E, Fishbain J, Craft D, Riddell S, Lindler L, Mancuso J, Milstrey E, Bautista CT, Patel J, Ewell A, Hamilton T, Gaddy C, Tenney M, Christopher G, Petersen K, Endy T, Petruccelli B 2007. An outbreak of multidrug-resistant Acinetobacter baumanniicalcoaceticus complex infection in the US military health care system associated with military operations in Iraq. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 44, 1577-1584. Sechi LA, Karadenizli A, Deriu A, Zanetti S, Kolayli F, Balikci E, Vahaboglu H 2004. PER-1 type beta-lactamase production in Acinetobacter baumannii is related to cell adhesion. Medical science monitor : international medical journal of experimental and clinical research, 10, BR180-184. Segal H, Garny S, Elisha BG 2005. Is IS(ABA-1) customized for Acinetobacter? FEMS microbiology letters, 243, 425-429. Shahcheraghi F, Abbasalipour M, Feizabadi M, Ebrahimipour G, Akbari N 2011. Isolation and genetic characterization of metallo-beta-lactamase and carbapenamase producing strains of Acinetobacter baumannii from patients at Tehran hospitals. Iranian journal of microbiology, 3, 68-74. Shannon O, Morgelin M, Rasmussen M 2010. Platelet activation and biofilm formation by Aerococcus urinae, an endocarditis-causing pathogen. Infection and immunity, 78, 4268-4275. Shigeta M, Tanaka G, Komatsuzawa H, Sugai M, Suginaka H, Usui T 1997. Permeation of antimicrobial agents through Pseudomonas aeruginosa biofilms: a simple method. Chemotherapy, 43, 340-345. Singh R, Paul D, Jain RK 2006. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in microbiology, 14, 389-397. 70 Siroy A, Cosette P, Seyer D, Lemaitre-Guillier C, Vallenet D, Van Dorsselaer A, Boyer-Mariotte S, Jouenne T, De E 2006. Global comparison of the membrane subproteomes between a multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain and a reference strain. Journal of proteome research, 5, 3385-3398. Skerman VBD, McGowan V, Sneath PHA 1980. Approved list of bacterial names. Int J Syst Bacteriol, 30, 225-420. Smani Y, McConnell MJ, Pachon J 2012. Role of fibronectin in the adhesion of Acinetobacter baumannii to host cells. PloS one, 7, e33073. Sohrabi N, Farajnia S, Akhi MT, Nahaei MR, Naghili B, Peymani A, Amiri Z, Rezaee MA, Saeedi N 2012. Prevalence of OXA-Type beta-Lactamases Among Acinetobacter baumannii Isolates from Northwest of Iran. Microb Drug Resist, 18, 385-389. Stewart PS 1996. Theoretical aspects of antibiotic diffusion into microbial biofilms. Antimicrobial agents and chemotherapy, 40, 2517-2522. Stewart PS 1998. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnology and bioengineering, 59, 261-272. Stewart PS, Costerton JW 2001. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet, 358, 135-138. SVS. Secretaria de Vigilância em Saúde. Ministério da Saúde.Clipping 06 a 08 de março de 2010 2010:[292 p.]. Tack KJ, Sabath LD 1985. Increased minimum inhibitory concentrations with anaerobiasis for tobramycin, gentamicin, and amikacin, compared to latamoxef, piperacillin, chloramphenicol, and clindamycin. Chemotherapy, 31, 204-210. Taherikalani M, Fatolahzadeh B, Emaneini M, Soroush S, Feizabadi MM 2009. Distribution of different carbapenem resistant clones of Acinetobacter baumannii in Tehran hospitals. The new microbiologica, 32, 265-271. Takagi EH, Lincopan N, Cassettari VC, Passadore LF, Mamizuka EM, Martinez MB 2009. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii outbreak at University Hospital. Braz J Microbiol, 40, 339-341. Tendolkar PM, Baghdayan AS, Gilmore MS, Shankar N 2004. Enterococcal surface protein, Esp, enhances biofilm formation by Enterococcus faecalis. Infection and immunity, 72, 6032-6039. 71 Tiwari V, Vashistt J, Kapil A, Moganty RR 2012. Comparative Proteomics of Inner Membrane Fraction from Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii with a Reference Strain. PloS one, 7, e39451. Tognim MC, Andrade SS, Silbert S, Gales AC, Jones RN, Sader HS 2004. Resistance trends of Acinetobacter spp. in Latin America and characterization of international dissemination of multi-drug resistant strains: five-year report of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. International journal of infectious diseases : IJID : official publication of the International Society for Infectious Diseases, 8, 284-291. Tomaras AP, Dorsey CW, Edelmann RE, Actis LA 2003. Attachment to and biofilm formation on abiotic surfaces by Acinetobacter baumannii: involvement of a novel chaperone-usher pili assembly system. Microbiology, 149, 3473-3484. Tuomanen E, Cozens R, Tosch W, Zak O, Tomasz A 1986. The rate of killing of Escherichia coli by beta-lactam antibiotics is strictly proportional to the rate of bacterial growth. Journal of general microbiology, 132, 1297-1304. Turrini RN, Santo AH 2002. [Nosocomial infection and multiple causes of death]. Jornal de pediatria, 78, 485-490. Turton JF, Kaufmann ME, Warner M, Coelho J, Dijkshoorn L, van der Reijden T, Pitt TL 2004. A prevalent, multiresistant clone of Acinetobacter baumannii in Southeast England. The Journal of hospital infection, 58, 170-179. Turton JF, Ward ME, Woodford N, Kaufmann ME, Pike R, Livermore DM, Pitt TL 2006a. The role of ISAba1 in expression of OXA carbapenemase genes in Acinetobacter baumannii. FEMS microbiology letters, 258, 72-77. Turton JF, Woodford N, Glover J, Yarde S, Kaufmann ME, Pitt TL 2006b. Identification of Acinetobacter baumannii by detection of the blaOXA-51-like carbapenemase gene intrinsic to this species. Journal of clinical microbiology, 44, 2974-2976. Vahaboglu H, Budak F, Kasap M, Gacar G, Torol S, Karadenizli A, Kolayli F, Eroglu C 2006. High prevalence of OXA-51-type class D beta-lactamases among ceftazidime-resistant clinical isolates of Acinetobacter spp.: co-existence with OXA-58 in multiple centres. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 58, 537542. Vahaboglu H, Hall LM, Mulazimoglu L, Dodanli S, Yildirim I, Livermore DM 1995. Resistance to extended-spectrum cephalosporins, caused by PER-1 beta72 lactamase, in Salmonella typhimurium from Istanbul, Turkey. Journal of medical microbiology, 43, 294-299. Vahaboglu H, Ozturk R, Aygun G, Coskunkan F, Yaman A, Kaygusuz A, Leblebicioglu H, Balik I, Aydin K, Otkun M 1997. Widespread detection of PER1-type extended-spectrum beta-lactamases among nosocomial Acinetobacter and Pseudomonas aeruginosa isolates in Turkey: a nationwide multicenter study. Antimicrobial agents and chemotherapy, 41, 2265-2269. Valenzuela JK, Thomas L, Partridge SR, van der Reijden T, Dijkshoorn L, Iredell J 2007. Horizontal gene transfer in a polyclonal outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of clinical microbiology, 45, 453-460. van den Broek PJ, Arends J, Bernards AT, De Brauwer E, Mascini EM, van der Reijden TJ, Spanjaard L, Thewessen EA, van der Zee A, van Zeijl JH, Dijkshoorn L 2006. Epidemiology of multiple Acinetobacter outbreaks in The Netherlands during the period 1999-2001. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 12, 837843. Van Looveren M, Goossens H 2004. Antimicrobial resistance of Acinetobacter spp. in Europe. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 10, 684-704. van Soolingen D, de Haas PE, Hermans PW, van Embden JD 1994. DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis. Methods in enzymology, 235, 196-205. Vidal R, Dominguez M, Urrutia H, Bello H, Garcia A, Gonzalez G, Zemelman R 1997. Effect of imipenem and sulbactam on sessile cells of Acinetobacter baumannii growing in biofilm. Microbios, 91, 79-87. Vila J, Ruiz J, Navia M, Becerril B, Garcia I, Perea S, Lopez-Hernandez I, Alamo I, Ballester F, Planes AM, Martinez-Beltran J, de Anta TJ 1999. Spread of amikacin resistance in Acinetobacter baumannii strains isolated in Spain due to an epidemic strain. Journal of clinical microbiology, 37, 758-761. Villegas MV, Hartstein AI 2003. Acinetobacter outbreaks, 1977-2000. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America, 24, 284-295. Walsh C 2000. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature, 406, 775-781. 73 Werneck JS, Picao RC, Carvalhaes CG, Cardoso JP, Gales AC 2011a. OXA-72producing Acinetobacter baumannii in Brazil: a case report. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 66, 452-454. Werneck JS, Picao RC, Girardello R, Cayo R, Marguti V, Dalla-Costa L, Gales AC, Antonio CS, Neves PR, Medeiros M, Mamizuka EM, Elmor de Araujo MR, Lincopan N 2011b. Low prevalence of blaOXA-143 in private hospitals in Brazil. Antimicrobial agents and chemotherapy, 55, 4494-4495; author reply 4495. Williams I, Venables WA, Lloyd D, Paul F, Critchley I 1997. The effects of adherence to silicone surfaces on antibiotic susceptibility in Staphylococcus aureus. Microbiology, 143 ( Pt 7), 2407-2413. Williams JD 1999. Beta-lactamases and beta-lactamase inhibitors. International journal of antimicrobial agents, 12 Suppl 1, S3-7; discussion S26-27. Woodford N, Ellington MJ, Coelho JM, Turton JF, Ward ME, Brown S, Amyes SG, Livermore DM 2006. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. International journal of antimicrobial agents, 27, 351-353. Wroblewska MM, Sawicka-Grzelak A, Marchel H, Luczak M, Sivan A 2008. Biofilm production by clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated from patients hospitalized in two tertiary care hospitals. FEMS immunology and medical microbiology, 53, 140-144. Xu KD, McFeters GA, Stewart PS 2000. Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology, 146 ( Pt 3), 547-549. Yamano Y, Nishikawa T, Fujimura T, Yutsudou T, Tsuji M, Miwa H 2006. Occurrence of PER-1 producing clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Japan and their susceptibility to doripenem. The Journal of antibiotics, 59, 791-796. Yong D, Shin JH, Kim S, Lim Y, Yum JH, Lee K, Chong Y, Bauernfeind A 2003. High prevalence of PER-1 extended-spectrum beta-lactamase-producing Acinetobacter spp. in Korea. Antimicrobial agents and chemotherapy, 47, 1749-1751. Zarrilli R, Crispino M, Bagattini M, Barretta E, Di Popolo A, Triassi M, Villari P 2004. Molecular epidemiology of sequential outbreaks of Acinetobacter baumannii in an intensive care unit shows the emergence of carbapenem resistance. Journal of clinical microbiology, 42, 946-953. Zhou H, Pi BR, Yang Q, Yu YS, Chen YG, Li LJ, Zheng SS 2007. Dissemination of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii strains carrying the ISAba1 74 blaOXA-23 genes in a Chinese hospital. Journal of medical microbiology, 56, 1076-1080. 75 ANEXOS Anexo 1. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa 76 Anexo 2. Manuscrito Acinetobacter baumannii PRODUTORES DE blaPER-1 ISOLADOS DE PACIENTES DE UTIS DE GOIÂNIA E SUA CORRELAÇÃO COM A FORMAÇÃO DE BIOFILME E RESISTÊNCIA MULTIDROGAS NA PRESENÇA DE GENES TIPO OXA Autores: Suellen Rocha Araújo Castilho a Cássia Silva de Miranda Godoy a, b Adriana Oliveira Guilarde a Ana Paula Junqueira-Kipnis a André Kipnis a a b Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás Hospital de Doenças Tropicais / Hospital Anuar Auad 77 Acinetobacter baumannii PRODUTORES DE blaPER-1 ISOLADOS DE PACIENTES DE UTIS DE GOIÂNIA E SUA CORRELAÇÃO COM A FORMAÇÃO DE BIOFILME E RESISTÊNCIA MULTIDROGAS NA PRESENÇA DE GENES TIPO OXA blaPER01 Producing Acinetobacter baumannii isolates form patients at ICUs of Goiania and correlation between biofilm formation and multidrug resistance in the presence of OXA genes. Abstract Background: Gram negative bacilli are one of the major causes of nosocomial infections worldwide. Among them, non-fermenting Gram Negative bacilli play a considerable part. Acinetobacter baumannii is one of the main representatives of this group. Purpose: To investigate by a quantitative method the biofilm formation and to examine the correlation between biofilm and antibiotic resistance among clinical isolates of A. baumannii. The association between biofilm formation and presence of extended spectrum β-lactamases blaPER-1, as well as correlation between biofilm and presence of OXA-type genes to understand the antibiotic resistance among isolates were also analyzed. Methods: A total of 71 clinical isolates of A. baumannii were subjected to identification testing by Gram staining and biochemical tests, and drug susceptibility testing by disc diffusion. The biofilm production was done by quantitative method in microtitre plate assay. The presence of blaPER-1 and OXA-type genes was detected by PCR. Results: In our study, 29% of the isolates presented blaPER-1 gene, and all of them were resistant to cefepime. The concomitant resistance to cefepime, ceftazidime, ciprofloxacin, and imipenem was observed in 81% of the blaPER-1 positive isolates. Fifty seven of the 71 isolates were able to form biofilm. Almost 60% of the blaPER-1 positive isolates formed biofilm. Also, most of the isolates (90%) that did not have blaPER-1 formed biofilm. The majority of the isolates that were capable of forming biofilm also presented resistance to several classes of antimicrobial drugs. Among the 55 isolates biofilm producers that were resistant to some antibiotics, 20% had only the OXA-51 gene, 62% had OXA-23 gene, 56% had ISAba1/OXA-23, 40% had ISAba1/OXA-51, 24% had OXA-58 and 5% had ISAba1/OXA-58. Conclusion: The blaPER-1 gene promotes resistance to cefepime, but the presence of this gene was not related to the biofilm formation among the isolates evaluated. This study detected a high percentage of ISAba1/OXA-23 producers isolates among the biofilm formation, suggesting that the antibiotic resistance of isolates in question also relates to the expression of these genes. Resumo Bacilos Gram-negativos são uma das principais causas de infecções hospitalares em todo o mundo. Entre eles, os bacilos Gram-negativos não fermentadores desempenham um papel considerável. O Acinetobacter baumannii é um dos principais representantes desse grupo. Objetivo: Investigar por método quantitativo a formação de biofilme e examinar a correlação entre biofilme e resistência antimicrobiana entre os isolados clínicos de A. baumannii. Foi verificado também a associação entre biofilme e a presença da β-lactamase de espectro estendido blaPER-1, bem como a correlação entre 78 biofilme e a presença de genes do tipo OXA a fim de compreender a resistência multidrogas entre os isolados. Métodos: Um total de 71 isolados clínicos de A. baumannii foram submetidos a testes de identificação por coloração de Gram e provas bioquímicas, e susceptibilidade microbiana pelo método de disco difusão. A produção de biofilme foi feita pelo método quantitativo em placa de microtitulação. A presença de blaPER-1 e dos genes tipo OXA foram detectados por PCR. Resultados: Em nosso estudo, 29% dos isolados apresentaram o gene blaPER-1, e todos eles foram resistentes à cefepima. A resistência concomitante à cepepima, ceftazidima, ciprofloxacina e imipenem foi observada em 81% dos isolados positivos para blaPER-1. Para formação de biofilme, 57 dos 71 isolados foram capazes de formar biofilme. Quase 60% dos isolados blaPER-1 positivos formaram biofilme. No entanto, a maioria dos isolados (90%) que não tinham blaPER-1, também formaram biofilme. A maioria dos isolados que foram capazes de formar biofilme também apresentaram resistência à várias classes de antimicrobianos. Dentre os 55 isolados formadores de biofilme que apresentaram resistência a algum antibiótico, 20% possuíam apenas o gene OXA-51, 62% possuíam OXA-23, 56% possuíam ISAba1/OXA-23, 40% possuíam ISAba1/OXA-51, 24% possuíam OXA-58 e 5% possuíam ISAba1/OXA-58. Conclusão: O gene blaPER-1 promove resistência à cefepima, porém a presença deste gene não está relacionada com a formação de biofilme dentre os isolados avaliados. Este estudo apresenta uma alta porcentagem de isolados produtores de ISAba1/OXA-23 entre os formadores de biofilme, sugerindo que a resistência antimicrobiana dos isolados em questão também esteja relacionada com a expressão destes genes. 79
