comparação de metodologias eletroforéticas no - Feis

COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS ELETROFORÉTICAS NO
ESTUDO DE HEMOGLOBINAS ANÔMALAS
Gelaleti, G. B.1*; Oliveira, G. M. G.1; Da Silva, D. G.1
* [email protected]
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
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Introdução
As hemoglobinas (Hb) são proteínas conjugadas, formadas por cadeias polipeptídicas que,
esquematicamente, são representadas por: α (alfa), β (beta), γ (gama) e δ (delta). A associação
entre estas cadeias caracteriza os três tipos de hemoglobinas normais, sendo que, os pares de
cadeias α2 e β2 constituem a Hb A1, presente no sangue na proporção de 96 a 98%; os pares de
cadeias α2 e δ2 formam a Hb A2, presente em níveis próximos de 1 a 3% e ainda, a associação dos
pares α2 e γ2 originam a Hb Fetal, que após o quinto mês de idade estabiliza em níveis máximos de
1%. (VALLADA, 2002).
As Hb anormais apresentam alterações envolvendo mutações que produzem substituições
de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas, que conferem à molécula mudanças nas suas
características físico-químicas, podendo ocorrer na superfície da molécula produzindo Hb anormais
estáveis, na porção interna produzindo as Hb instáveis, nas histidinas proximais ou distais do
grupo heme resultando as Hb M, ou ainda, na fusão das cadeias beta e delta originando as Hb
Lepore. Outros tipos de alterações afetam o aspecto quantitativo das Hb A1, Hb A2 e Hb F, nas
quais se observa síntese parcial de uma das cadeias polipeptídicas e aumento relativo da outra;
nesse grupo enquadram-se as talassemias alfa e beta e persistência hereditária de Hb F.
(VALLADA, 2002).
A caracterização inicial das diferentes Hb anormais envolve desde a quantificação e
qualificação morfológica dos eritrócitos, índices hematimétricos, técnicas que atestam alterações
físico-químicas da molécula e eletroforeses diferenciais de hemoglobinas. (VALLADA, 2002).
Dentre as técnicas mais utilizadas para o diagnóstico das diferentes alterações na molécula
de Hb, a eletroforese está enquadrada dentre as análises mais versáteis e facilmente aplicáveis
(LOPES, 1984), uma vez que, possibilita o estudo da variação genética. Esta técnica consiste na
migração de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em
um campo elétrico; as diferentes mobilidades eletroforéticas das hemoglobinas anormais são
originadas por alteração de carga elétrica, causada por substituições de aminoácidos diferentes
nas cadeias formadoras das moléculas.
A técnica da corrida eletroforética é utilizada para a qualificação e quantificação de
hemoglobinas normais e grande parte das anormais (BONINI-DOMINGOS, 2006); pode ser
utilizada em extratos variados, tais como, papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de
celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros (AYALA, 1978).
No presente trabalho objetivou-se detectar as diferentes resoluções de bandas com solução
hemoglobínica em substrato de poliacrilamida em tampão Tris-Glicina, comparando-as com outros
substratos validados nas literaturas.
Material e Métodos
Foram realizadas corridas eletroforéticas de amostras sanguíneas de indivíduos residentes
no município de Três Lagoas/MS, de ambos os sexos e de qualquer origem étnica ou social,
provenientes de diferentes subpopulações, incluindo doadores de sangue do Hemonúcleo de Três
Lagoas, estudantes universitários, gestantes da Clínica da Mulher de Três Lagoas e portadores de
anemia a esclarecer. As amostras de sangue foram coletadas em frascos estéreis com EDTA a
5%, após assinatura do participante ou de seu responsável, de um Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido, de acordo com a orientação do Comitê de Ética da UFMS, e encaminhadas ao
Laboratório de Genética Médica da UFMS. Foram submetidas a testes seletivos, incluindo análise
da morfologia eritrocitária (Bonini, 1993), resistência globular osmótica (Método de Silvestrone &
Bianco, 1975), teste de solubilidade SICKLE-ID (Louderback et al, 1974), e eletroforese em gel de
poliacrilamida com tampão Tris-Glicina em pH alcalino (8,0); os testes confirmatórios consistiram
no uso de eletroforese em gel de poliacrilamida em pH ácido (6,2) e neutro (7,0).
Resultados
Durante o período de agosto de 2005 a julho de 2008, 963 amostras de hemolisado das
populações que compõem a casuística foram submetidas aos testes descritos e à corrida
eletroforética em gel de poliacrilamida com tampão Tris-Glicina em pH alcalino, ácido e neutro.
Desse total, 807 tiveram seus diagnósticos confirmados: 686 (85,0%) apresentaram perfil
hemoglobínico normal e 121 (15,0%) apresentaram mutações que alteraram a estrutura das
cadeias globínicas, modificando sua mobilidade eletroforética, entre elas HbS, HbC, HbLepore, βTal e HbF. (Figuras 1a e1b).
Comparando as corridas realizadas em gel de poliacrilamida com os demais tipos de
eletroforeses de diferentes substratos presentes na literatura (fitas de acetato de celulose e gel de
agarose), percebe-se nitidamente uma resolução superior às empregadas rotineiramente nos
laboratórios (Figura 2 e 3).
Figura 1a. Corrida em poliacrilamida em tampão Tris-Glicina
Fonte: Laboratório de Genética Médica / UFMS
Figura 2. Corrida em acetato de celulose
Fonte: Laboratório de Hemoglobinas e Genética das
Doenças Hematológicas / IBILCE
Figura 1b. Corrida em poliacrilamida em tampão Tris-Glicina
Fonte: Laboratório de Genética Médica / UFMS
Figura 3. Corrida em gel de agarose
Fonte: Laboratório de Hemoglobinas e Genética das
Doenças Hematológicas / IBILCE
Discussão e Conclusões
A eletroforese de hemoglobina é provavelmente o método laboratorial mais útil para
separação e medição de hemoglobinas normais e algumas anormais. Por meio da eletroforese,
são separados diferentes tipos de Hb formando uma série de bandas distintamente pigmentadas
em determinado substrato. Os resultados são, então, comparados com aqueles de uma amostra
normal.
Dentre as técnicas utilizadas nas corridas eletroforéticas, as fitas de acetato de celulose, os
géis de agarose e de poliacrilamida são os mais empregados em procedimentos laboratoriais;
todos apresentam resultados diagnósticos semelhantes e o que os diferencia são modificações na
metodologia aplicada e tempo de corrida.
Comparando as metodologias citadas, a principal diferença entre as três corridas analisadas
é a preparação do hemolisado aplicado na corrida, onde lisa-se a membrana das hemácias para
obtenção da solução de Hb; este hemolisado pode ser “rápido”, com saponina, utilizado na corrida
em fitas de acetato de celulose e gel de agarose, ou com clorofórmio, utilizado na corrida em gel
de poliacrilamida (NAOUM, 1990); validando as duas técnicas, sabe-se que na solução de Hb
preparada com clorofórmio obtêm-se uma solução mais pura de hemoglobina, já no hemolisado
rápido observa-se resquícios de membrana, implicando na baixa resolução das bandas.
Outra diferença entre as três técnicas avaliadas é o tempo de corrida, uma vez que, em fitas
de acetato e gel de agarose espera-se em torno de 30 minutos a uma hora para a finalização do
processo, enquanto com o gel de poliacrilamida, espera-se de cinco a seis horas para obter uma
corrida homogênea. Observa-se nas figuras apresentadas nos resultados, a diferença na resolução
de bandas entre as técnicas; apesar das corridas em fitas de acetato e gel de agarose serem mais
rápidas e menos custosas, elas não oferecem um resultado plenamente satisfatório.
Diante do exposto, defende-se a corrida eletroforética em gel de poliacrilamida com tampão
Tris-Glicina utilizada nas técnicas de análise das Hb anormais no laboratório de Genética Médica
da UFMS, como o método mais confiável e preciso na resolução das bandas normais e anormais,
mesmo sendo mais custoso, demorado e exigente no manuseio da técnica (WALKER & RAPLEY,
1999).
Considera-se ainda, que a técnica utilizada no estudo é vista como um método pré-
molecular, devido a seu alto poder de resolução em análises protéicas e ainda a possibilidade de
quantificação das cadeias polipeptídicas na corrida.
Referências
AYALA, F. J.; The mechanisms of evolution. In: EVOLUTION. San Francisco, Scientific
American, 1978. p.14-27.
BONINI-DOMINGOS, C. R.; Prevenção da hemoglobinopatias no Brasil, diversidade
genética e metodologia laboratorial. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) – Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista. São José do Rio Preto,
1993.
BONINI-DOMINGOS, C. R.; Metodologias Laboratoriais para o Diagnóstico de
Hemoglobinopatias e Talassemias. Ed. HN, São José do Rio Preto – SP, 2006.
LOUDERBACK, A.L.; YOUHNE, Y.; FONTANA, A.; NATLAND, M. – Clinical evaluation of a
rapid screening test for sickle-cell trait (S_) and sickle-cell anemia (SS). Clin. Chem., 20:761,
1974.
LOPES, C. R.; Estudos sobre as relações filogenéticas entre algumas espécies de
Coffea. Tese – professor – Unesp, p. 169, Botucatu, 1984.
NAOUM, P. C.; Eletroforese, técnicas e diagnósticos. São Paulo: Santos, p. 174, 1990.
VALLADA, E. P.; Manual de Técnicas Hematológicas. Ed. Atheneu, São Paulo, Rio de
Janeiro, Ribeirão Preto, Belo Horizonte, 2002.
SILVESTRONI, E.; BIANCO, I.; Screening for microcytemia in Italy: analysis of data
collected in the past 30 years. Am. J. Hum. Genet., v. 27, p. 198, 1975.
WALKER, M. R.; RAPLEY, R.; Guia de rotas na tecnologia do gene. São Paulo: Atheneu
Editora, p. 334, 1999.