carbono e nitrogênio na biomassa microbiana em latossolo amarelo

III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
DIVERSIDADE DE RIZÓBIOS DA REGIÃO SEMIÁRIDA DE PERNAMBUCO CAPAZES
DE NODULAR A LEUCENA (Leucaena leucocefala)
Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos(1); Carlos Maristane de Andrade Santos(2); Ildja Viviane de
Queiroz (3); Ana Dolores Santiago de Freitas(4).
(1)
Zootecnista;Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Agronomia Núcleo de Fixação Biológica de Nitrogênio nos
Trópicos, Av. Dom Manoel de Medeiros s/n , CEP, 52171-900 ufrpe.br (E-mail: [email protected].
Resumo – A utilização de recursos naturais para combater a degradação ambiental, que reduz a
fertilidade do solo, vem sendo um meio economicamente eficiente, logo que, a recuperação se torna mais
rápida na utilização de leguminosas tropicais capazes de nodular com uma ampla faixa de rizóbios fixando
biológicamente o Nitrogênio (FBN). Com a finalidade de obter uma coleção de rizóbios nativos de solos
Pernambuco capazes de nodular a leucena (Leucaena leucocephala) e de estuda a sua diversidade
morfofisiológica, foi conduzido um experimento em casa de vegetação usando amostras de solos coletadas
em Pesqueira e Serra Talhada, na região semiárida e em Goiana na zona da mata. As plantas forma colhidas
aos 120 dias após o plantio, os nódulos foram retirados das raízes, contados, pesados para a obtenção da
biomassa fresca e armazenados em vidros contendo sílica gel até o momento do isolamento em meio YMA
contendo vermelho do congo, seguindo a purificação e caracterização morfofisiológica em meio YMA com
azul de bromotimol. Obteve-se uma coleção com 67 isolados de rizóbio, com características
morfofisiológicas bastante diversificadas. A cobertura vegetal determinou a efetividade e a competitividade
dos rizóbios nativos em nodular, a leucena. A área com plantio de feijão e com vegetação nativa,
proporcionou maior número e maior biomassa de nódulos. As áreas sem vegetação proporcionaram os
menores valores para todos os parâmetros estudados. Entretanto, apresentaram, junto com a área com
plantio de atriplex, a maior riqueza de grupos morfofisiológicos.
Palavras-Chave: Caracterização, leguminosa arbórea, nodulação.
INTRODUÇÃO
No semiárido nordestino a intensificação do uso do solo e diminuição da cobertura vegetal nativa
favorece a degradação dos recursos naturais e a diminuição da fertilidade do solo ocasionada pela erosão,
exportação de nutrientes pela colheita dos produtos agrícolas e consumo de forragem pelos animais
(MENEZES E SAMPAIO, 2002).
A introdução de leguminosas florestais associadas a bactérias fixadoras do nitrogênio para a
recuperação de áreas degradadas é uma prática promissora, pois plantas associadas a estes microrganismos
simbióticos estão mais aptas a colonizar áreas degradadas, pois apresentam uma estratégia nutricional muito
superior às outras plantas, através da fixação biológica de nitrogênio (FBN), que transforma N2 em NH4,
reduzindo, consideravelmente, os custos da recuperação de áreas impactadas (SAMPAIO et al, 1995).
III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
O sucesso para otimizar a FBN depende da seleção e espeficidade simbiótica na interação rizóbio e
planta e neste contesto a Leucena (Leucaena leucocephala) é uma leguminosa capaz de formar nódulos
radiculares e de fixar nitrogênio de forma eficiente com uma ampla faixa de rizóbios.(FRANCO e
HUNGRIA, 1993).
As características morfofisiológicas dos rizóbios em meio de cultura YMA, têm sido usadas para a
identificação de grupos taxonômicos, prevendo uma boa aproximação em nível de gênero. Estes descritores
podem indicar diferenças fisiológicas importantes entre microrganismos, que podem ser detectadas
posteriormente mediante estudos mais refinados (Martins et al 1997; Santos, 2001).
O conceito de diversidade de espécie refere-se à variedade de espécies de organismos vivos de uma
determinada comunidade, habitat ou região, podendo ser avaliado por meio de componentes como: (1)
riqueza das espécies, baseada na abundância numérica de uma determinada área geográfica, região ou
comunidade; (2) equitabilidade ou uniformidade, baseada no padrão de distribuição de indivíduos entre as
espécies, sendo proporcional a diversidade, exceto se houver co-dominância de espécie, e (3) grau de
dominância, que se refere à dominância de uma ou mais espécies numa determinada comunidade, habitat ou
região (Odum,1988).
Essa diversidade pode ser medida por intermédio de índices matemáticos, que levam em
consideração informações relacionadas à avaliação das características culturais do rizóbio. Alguns índices,
como os de diversidade de Shannon-Weaver (1948) e de Simpson (1949), de riqueza, de Margalef (1958) e
Pielou, fornecem informações importantes acerca do padrão da distribuição de espécies microbianas dentro
do ecossistema (Kennedy, 1999). Esses índices são ferramentas poderosas para o estudo da diversidade
microbiana, permitindo uma avaliação da dinâmica da comunidade frente a diferentes manejos. Neste
sentido, a diversidade tem sido citada como um indicador adequado para avaliar a qualidade do solo e a
conservação de um ecossistema (Ovreas e Torsvik, 1998).
O objetivo do presente trabalho foi obter uma coleção de rizóbios nativos de Pernambuco, capazes de
nodular plantas de leucena (Leucaena leucocephala). e estimar a diversidade dos grupos morfofisiológicos
dos rizóbios obtidos
MATERIAL E MÉTODOS
Foi conduzido um experimento em casa de vegetação com solos amostrados em 5 pontos, sendo 4 da
região o semi árida e 1 da Zona da Mata do Estado de Pernambuco. Três pontos foram amostrados no
município de Pesqueira, com diferentes coberturas vegetais (sem cobertura vegetal, sob plantio de Atriplex e
sob plantio de feijão caupi, e outro no município de Serra Talhada sob vegetação nativa e herbácea, todos na
região semi árida. Já a quinta amostra foi coletada na estação experimental de Itapirema no município de
Goiana, localizado na Zona da Mata. Usou-se a cultivar de Leucena K8, como planta-isca, para a obtenção
III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
dos isolados de rizóbios nativos. O experimento foi inteiramente cazualizado constando de cinco tipos de
solos e três repetições.
As sementes foram mergulhadas em solução de ácido sulfúrico concentrado durante 20 minutos, para
quebra a dormência e posteriormente foram lavadas e semeadas vaso com solo (6 sementes por vaso), 10
dias após a germinação realizou-se um desbaste deixando 3 plantas por vaso. Antes do plantio das sementes
o solo foi peneirado (peneira 0,2 cm) para uniformização da granulometria, bem homogeneizado, colocados
em vasos (1 kg/vaso) na proporção de 1:1:1, (solo, areia autoclavada e vermiculita) e em seguida foram
realizadas as análises dos atributos químicos e físicos de acordo com a Embrapa (1997) (Tabelas 1 e 2
respectivamente).
As plantas foram colhidas ao 120 dias após o plantio e a parte aérea foi separada das raízes e levada
a secar em estufa a 60ºC, para a obtenção da biomassa seca. Todos os nódulos foram retirados e colocados
em tubos de ensaio contendo sílica gel para desidratação e preservados até o momento do isolamento dos
rizóbios. Os nódulos escolhidos para o isolamento foram reidratados e desinfestados superficialmente com
álcool 70% GL por 2 minutos e, em seguida, com hipoclorito de sódio a 2% por 3 minuto e lavados por 7
vezes consecutivas em água destilada e esterilizada. Em seguida foram pressionados com uma pinça sobre o
meio 79 (Fred & Waksman, 1928) com manitol, ágar e vermelho do congo, distribuído em placa de Petri.
Após o isolamento, as placas foram incubadas a 28°C por uma semana ou mais até o aparecimento das
colônias. Posteriormente as colônias foram purificadas e caracterizadas no mesmo meio, com o indicador
azul de bromotimol com pH 6,8.
As características morfofisiológicas observadas foram: mudança do pH do meio após crescimento
(avaliada pela alteração de cor do indicador); tempo de crescimento (em dias) de colônias isoladas; diâmetro
das colônias (em milímetros), a transparência, forma, borda, consistência e aparência do muco (avaliação
visual comparativa).
Após a caracterização os dados foram codificados utilizando o programa NtsysPC versão 2.0 (Sokal
e Rohlf, 1997). Para o agrupamento que só aceita informações binárias, os resultados foram codificados de
acordo com a (Tabela 3), utilizando distância taxonômica entre as espécies, analisadas pelo algoritmo
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Aritmetic Average) e a matriz de similaridade de Jaccard. Uma
vez construída a matriz obteve-se a árvore filogenética com a finalidade de separar os grupos de isolados
com maiores similaridades.
Codificação: Após a caracterização morfofisiológicos os dados foram codificados (Tabela 4) visando
à utilização do programa NtsysPC para o agrupamento que só aceita informações binárias.
Uma vez agrupados foram calculados os índices de diversidades dos isolados através do Software
para estimativa da diversidade e riqueza de espécies, DivEs v2.0 (Rodrigues, 2007). Foram calculados os
índices de:
Diversidade de Shanon-Wiener (1948) H' = - ∑ pi Log pi
III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
Onde: pi é a proporção da espécie em relação ao número total de espécimes (isolados) encontrados nos
levantamentos realizados.
Diversidade de Margalef (1958)
α=
s–1
Log N
Onde: s é o número de espécies amostradas; N é o número total de indivíduos em todas as espécies. O índice
de Margalef é muito próximo dos índices de Gleason e Menhinick.
Diversidade e Dominância de Simpson (1949)
Já a diversidade é dada pela equação:
ls =
∑ ni (ni - 1)
N (N - 1)
Ds = l - ls
Onde: ni é o número de indivíduos de cada espécies; N é o número total de indivíduos.
O índice de equitabilidade de Pielou (J`) Expressa a relação entre a diversidade real e a diversidade
máxima teórica. É uma medida de uniformidade da comunidade. É expresso pela fórmula: J` = H`/H`max.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi obtida uma coleção com 67 isolados de rizóbio, com características morfofisiológicaa de acordo
com A Tabela 4, apresenta todas as características, onde podemos observar que todos os isolados obtidos
apresentaram crescimento rápido, 27 crescera em apenas 1 dia. Divergindo do gênero Bradyrhizobium sp.
que nodula a maioria das leguminosas tropicais, sendo inclusive, a capaz de nodular a leucena e que tem
crescimento lento. Entretanto, as outras características encontram-se a de acordo com esse gênero uma vez
que mais de 50% apresentaram reação de pH em meio de cultura de neutra a alcalina e apenas 23
desenvolveram pH ácido; 60 apresentaram a cor da colônia branca e só 7 apresentaram cor amarela e 50
apresentaram pouco muco. Essas características necessitam uma complementação com estudos de biologia
molecular, para que possamos encontrar um consenso.
A cobertura vegetal determinou a efetividade e a competitividade dos rizóbios nativos para nodular,
as plantas leucena. A área com plantio de feijão e com vegetação nativa, proporcionou maior número e maior
biomassa de nódulos, esse resultado está de acordo com Franco e Hungria, 1993, que observaram que a
leucena pode ser nodulada por rizóbios provenientes de feijão. As áreas sem vegetação proporcionaram os
menores valores para todos os parâmetros estudados Tabela 3. Resultados semelhantes foram encontrados
por Silva (2007) e Silva (2008) trabalhando com amendoim e feijão caupi, respectivamente.
III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
Tabela 1. Características químicas e físicas na camada de 0-20 cm, dos solos de Pesqueira sem cobertura
vegetal (Área 1), sob plantio de atriplex (Área 2), sob plantio de feijão caupi (Área 3); e Serra Talhada sob
vegetação hiperxerofila (Área 4). 1CS (cátion solúveis); 2Extração por Mehllich-1.
Local de origem das
amostras de solo
pH (1:2,5)
H2O
Área 01 Pesqueira
Área 02 Pesqueira
Área 03 Pesqueira
Área 04 Serra Talhada
Área 05 Goiana
7,68
8,08
6,3
7,41
6,0
COMPLEXO SORTIVO
--------------------cmolc/dm3-------------------- mg/dm3
Ca++ Al+3 H+ Mg++
Na+
K+
P
(solúvel)
0,578
0,203
0,104
0,123
0,111
(solúvel)
0
0
0
0
0
-
0,458
0,146
0,034
0,042
0,021
1,259
2,127
0,145
0,007
0,018
0,273
0,301
0,246
0,584
0,063
86,625
47,500
28,625
184,250
6,750
Tabela 2. Atributos físicos dos solos utilizados no experimento, de acordo com os limites
estabelecidos por Richards (1969).
RAS1
PST2
CE3
CLASSIFICAÇÃO
(%)
(dS.m-1 25º C)
DO SOLO
Área 1
19
7,5
2,8
Sódico
Área 2
67
11
20,5
Salino-sódico
Área 3
1
<1
0,4
Normal
Área 4
<1
*
0,4
Normal
1
CE = condutividade elétrica da pasta de saturação
PST = Percentual de Sódio Trocável
3
RAS = Relação de Adsorção de Sódio
2
Tabela 3. Número nódulos, Biomassa fresca dos nódulos, Biomassa fresca da parte aérea e Biomassa seca da
parte aérea de Leucena (Leucaena leucocephala) cultivada em solos da região semi-árida e da Zona da Mata
de Pernambuco.
Áreas
Pesqueira
(s/vegetação)
Pesqueira (com
plantio Atriplex)
Pesqueira (com
plantio feijão)
Serra Talhada
(vegetação nativa)
Goiana (sem
vegetação)
Biomassa fresca
Biomassa seca
da parte aérea
(g)
Nº de nódulos
Biomassa fresca
dos nódulos (g)
da parte aérea (g)
25
0,440
5,438
1,767
32
0,405
11,332
3,716
37
0,868
8,008
2,6
34
0,771
5,744
1,983
11
0,184
2,049
0,734
Média de 3 repetições
III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
Tabela 4. Caracterização Morfofisiológica dos isolados obtidos de nódulos de Leucena(Leucaena
leucocephala) cultivada em solos da região semi-árida e da Zona da Mata de Pernambuco.
Características
Nº de isolados
Características
Nº de isolados
Características
estudadas
Encontradas
Encontrados
Encontradas
Encontrados
Dia
1 dia
27
2 a 3 dias
40
Tamanho
Punt. 1 e 2 mm
66
> 3 mm
1
Forma
Circular
67
Não circular
-
Borda
Regular
60
Irregular
7
Homogênea
46
Heterogênea
21
Cor
Branca
60
Amarela
7
pH
Ácido
23
Neutro ou alcalino
46
Transparência
Opaco
66
Transparente
1
Sem elevação
9
Com elevação
58
Presença
54
Ausência
13
Pouca
50
17
Faixa de alça
Quando retorna
29
Elasticidade
Sem elasticidade
49
Média e muita
Quando permanece
limpa
Com elasticidade
Colônia
Elevação
Muco
Quantidade
38
18
As características morfofisiológicas apresentadas por rizóbios de clima tropical que parecem estar
relacionadas com estratégias de sobrevivência às condições ambientais dos locais de onde foram isolados
(Martins, et al., 2003; Santos, et al., 2007). Apesar da leucena ter sido considerada como uma planta de
ampla faixa hospedeira por Hungria e Franco , 1993, neste trabalhos esta planta mostrou-se bastante restrita e
com é a leguminosa de uma maneira geral, quem seleciona o rizóbio com o qual ela irá nodular, os solos sob
cultivo de feijão-caupi e sob vegetação de leguminosas nativas reduziram o rizóbio capaz de nodular a
leucena.
A Figura 1 revela que os solos amostrados no município de Pesqueira, sem cobertura vegetal e sob
plantio de Atriplex apresentaram maior abundância relativa e maior riqueza de grupos morfofisiológicos do
que nas áreas com plantio de feijão caupi e vegetação nativa. Esses dados diferem dos encontrados por
Bezerra, 2009 trabalhando com feijão caupi, que observou que retirada da vegetação nativa e introdução de
monoculturas provocaram uma diminuição na diversidade de rizóbios capazes de nodular o feijão caupi, fato
que não ocrreu com a leuceana.
As áreas sem cobertura vegetal e com plantio de atriplex apresentaram os maiores índices de diversidade e de
riqueza de acordo com os índices de Shannon e Margalef. Não houve dominância de grupos e a uniformidade foi
igual para todos os grupos morfofisiológicos de rizóbios capazes de nodular a leucena, revelados pelos
índices de Simpson e Pielou.
III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
Shannon
Índices de Diversidade
6,0000
M rgalef
Simpson
Pielou
4,0000
2,0000
et
al
)
tu
ra
co
be
r
(S
em
G
oi
an
a
ve
g
Se
r
ra
Ta
lh
ad
a(
so
b
(so
b
Pe
sq
ue
ira
ve
g
e
na
tiv
a
et
aç
ão
de
pl
an
tio
pl
an
tio
(so
b
Pe
sq
ue
ira
h.
..
up
i)
ca
A
de
tu
ra
co
be
r
(S
em
Pe
sq
ue
ira
fe
ijã
o
tri
p
ve
g
le
x)
et
al
)
0,0000
FIGURA 1. Diversidade de rizóbios de leucena em solos da região semi árida de Pernambuco com
diferentes coberturas vegetais.
CONCLUSÕES
1.
Todos os rizóbio isolados de leucena cultivada em solos da região semiárida de Pernambuco
apresentaram crescimento rápido e reação de pH neutra ou alcalina e produtoras de muco em quantidades
variadas.
2.
O manejo do solo influenciou na nodulação e a diversidade de grupos rizóbios capazes de
nodular a de leucena.
3.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPq q a FACEPE.
REFERÊNCIAS
BEZERRA, R,V, Biodiversidade e efetividade de rizóbios nativos de solos do semi-árido de pernambuco em
caupi (Vigna unguiculata L. Walp) Dissertação de Mestrado – Universidade Federal Rural de Pernambuco
(UFRPE), Recife, 63p. 2009.
CAMPELLO, E. F. C., FRANCO, A. A. Estratégia de recuperação de áreas degradadas. Seropédica:
Embrapa Agrobiologia, 2001. 18p
III SIMPÓSIO DE MUDANÇAS CLIMÁTICAS E DESERTIFICAÇÃO NO
SEMIÁRIDO BRASILEIRO
“Experiências de Mitigação e Adaptação”
CARVALHO, F. G.; STAMFORD, N. P. Fixação do N2 em leucena (Leucaena leucocephala) em solo da
região semi-árida brasileira submetido à salinização. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG,
v. 23, p. 237-243, 1999.
CARVALHO, S. R.; ALMEIDA, D. L.; ARONOVICH, S.; FILHO, S. T.C.; DIAS, P. F.; FRANCO A.A.
Recuperação de áreas degradados do Estado do Rio de Janeiro. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, nov.
1998. 14p. (Documento 76, ISSN 0104 6187).
COSTA, N.L..; BENDAHAN, A.B.; GIANLUPPI,V. P.; RIBEIRO, S. M.; BRAGA. R.M. Leucena:
características agronômicas, produtividade e e manejo em Roraima COMUNICADO TÉCNICO Nº 14 1-7,
2008
EMBRAPA. Manual de Métodos de Análise de Solos. Rio de Janeiro: EMBRAPA 1997. 212p.
FRED, E.B. & WAKSMAN, S.A. Laboratory manual of general mibiology w ith special reference to the
microrganisms of the soil New York: Mcgraw-Hill Book Company, New York, 145p., 1928.
HUNGRIA, M.; FRANCO, A. A. Effects of high temperatures on nodulation and N 2 fixation by Phaseolus
vulgaris L. Plant and Soil, Dordrecht, v. 149, n. 1, p. 95-102, 1993.
KENNEDY, A. C. Bacterial diversity in agroecosystems. Agriculture, Ecosystems and Environment,
Amsterdam, v. 74, n. 1, p. 65-76. 1999.
MARGALEF, R. (1958). Information theory in ecology. Gen. Systems. 3: 36-71.
MARTINS, L.M..V. Neves, M.C.P. & Rumjanek, N.G. Growth characteristics and symbiotic efficiency of
rizobia isolated from cowpea nodules of the noeth-east of Brazil. Soil Biology and Biochemistry, Elmsford,
v.29, n.5/6, p.1005-1010, 1997.
MENEZES, R.S.C.; SAMPAIO, E.V.S.B. Simulação dos fluxos e balanços de fósforo em uma unidade de
produção agrícola familiar no semi-árido paraibano. In: Silveira, L.M., Petersen, P., Sabourin, E. (Org.)
Agricultura familiar e agroecologia no semi-árido: avanços a partir do Agreste da Paraíba. Rio de Janeiro,
RJ, 2002, p. 249-260.
ODUM, E. P. Populações em comunidades. In: Odum, E.P., eds, Ecologia. São Paulo: Guanabara Koogan,
p.258-272. . 1988.
OVREAS, L.; TORSVIK, V. Microbial diversity and community in two different agricultural soil
communities. Microbial Ecology, v.36, p.303-315. 1998.
SAMPAIO, EVSB.; SALCEDO, IH.; SILVA,VMALVES, GDM. Capacidade de suprimento de N e resposta
a fertilização de 20 solos de Pernambuco. Revista Brasileira de Ciências do Solo, Campinas v. 20, p. 269-279,
1995.
SANTOS, C. E. R. S. Diversidade de rizóbio nativo da região Nordeste do Brasil capaz de nodular
amendoim (Arachis hypogaea), Stylosanthes e Aeschynomene. 2001. 178f. Tese (Doutorado) - Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. 2001.
SHANON, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Syst. Techn. J. 27: 379-423, 623-656. 1948.
SILVA, M. F. Efetividade da inoculação com Bradyrhizobium spp. em amendoim cultivado em solo da Zona
da Mata de Pernambuco. Dissertação de Mestrado – Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
Recife, 56p. 2007.
SIQUEIRA, J. O.; FRANCO, A. A. Biotecnologia do solo: Fundamentos e perspectivas. Brasília: MEC /
ESAL / FAEPE / ABEAS, 1988. 236 p.
SOKAL, R.R.; ROHLF, J.F. Biometry: The principles and practice of statistics in biological research. 3. ed.
New York: W. H. Freeman and Company, 1997. 850p.