universidade estadual de santa cruz programa de pós

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
BACTÉRIAS FIXADORAS DE NITROGÊNIO SIMBIONTES DOS NÓDULOS
DE Inga vera Willd. (LEGUMINOSAE- MIMOSOIDEAE)
Mestranda: Hellen R. Martins dos Santos
Orientador: Eduardo Gross
O nitrogênio é considerado elemento essencial para os organismos vivos, pois juntamente com o
carbono, oxigênio e hidrogênio, está presente na composição das mais importantes biomoléculas, tais
como ATP, NADH, NADPH, clorofila, proteínas e inúmeras enzimas [1,2]. A fixação do nitrogênio
atmosférico em amônia e posteriormente em compostos orgânicos é uma parte crucial no ciclo do
nitrogênio. A nitrogenase, enzima responsável por essa fixação, tem uma ampla distribuição taxonômica
em organismos procariotos (bactérias e arqueobactérias), mas está confinada a um limitado número de
espécies. Entre estas, os rizóbios, bactérias fixadoras de nitrogênio simbiontes que formam estruturas
hipertróficas (nódulos) nas raízes das leguminosas, são conhecidos como os maiores contribuintes para
esse processo. Estes microssimbiontes são um grupo de -Proteobacterias aeróbicas obrigatórias sem
endósporos, que possuem a enzima nitrogenase e na simbiose com as leguminosas cedem a amônia e
absorvem fotossintatos da planta hospedeira, estabelecendo assim uma relação mutualística [3]. A
nitrogenase parece estar organizada em um cluster no cromossomo ou em plasmídeo dependendo da
espécie bacteriana, com diversos genes denominados de nif ( nitrogen fixation ) responsável por
codificar proteínas envolvidas diretamente no processo da redução do N [4]. Além dos genes nif, em
certos diazotrófos tem sido observado que outros genes tais como o fix e o nod que codificam proteínas
que indiretamente desempenham função essencial na nodulação, tais como a regulação ao nível de
metabolismo geral de compostos nitrogenados, sensoriamento e sinalização do nível de N celular,
transporte de elétrons para a nitrogenase e até o estabelecimento da interação planta-bactéria. Do ponto de
vista agronômico, ecológico e econômico, a simbiose entre rizóbios e leguminosas é muito importante por
poder dispensar parcial ou totalmente a utilização de fertilizantes nitrogenados, contribuindo assim para a
nutrição da planta e aumento do N2 disponível no solo. A diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio
é bastante ampla, elas podem ser do tipo simbiontes mutualísticas, como rizóbios, Frankia e
Burkholderia, ou de vida livre, como cianobactérias, Beijerinckia e Clostridium. Algumas espécies de
vida livre são freqüentemente encontradas em associação com raízes de plantas e, devido à sua habilidade
de interferir na morfologia das raízes e crescimento das plantas, podem ser consideradas rizobactérias
promotoras de crescimento de plantas (RPCPs) [5]. As bactérias fixadoras de nitrogênio não pertencem a
um único grupo filogenético. Segundo classificação a partir do seqüenciamento de RNA ribossômico [6],
existem bactérias fixadoras de nitrogênio em proteobactérias, cianobactérias, bactérias Gram positivas e
bactérias verdes enxofradas. As alfa e betaproteobactérias podem se associar com as raízes de plantas da
família Leguminosae (Fabaceae). As leguminosas são, geralmente, dividida em três subfamílias:
Caesalpinoideae, Mimosoideae e Papilionoideae, as quais diferem bastante em relação ao hábito de
crescimento de suas espécies, assim como na capacidade de formar simbiose com bactérias fixadoras de
nitrogênio. Essas plantas apresentam uma grande diversidade anatômica e morfológica de seus nódulos,
mas basicamente, eles podem ser classificados em dois tipos: os determinados e os indeterminados, os
quais diferem anatomicamente, dentre outras características, pela presença de um meristema permanente
no ápice do nódulo, nesse caso, classificado como indeterminado. Os diferentes tipos de nódulos
geralmente estão relacionados com a tribo a qual a planta pertence [5]. Devido à importância ecológica e
econômica dos rizóbios e com o surgimento e aplicação de novas técnicas moleculares, esses
microrganismos têm sido intensivamente estudados durante a última década. Poucas espécies de
leguminosas arbóreas que ocorrem no estado da Bahia foram estudadas quanto a sua nodulação e seus
rizóbios simbiontes, representando assim um potencial inexplorado, devido ao desconhecimento de suas
características silviculturais, sua produtividade e, denotadamente, sua habilidade em associar-se a
bactérias fixadoras de N2, necessitando de estudos mais detalhados sobre as espécies bacterianas
envolvidas nesse processo. Espécies arbóreas como o gênero Inga, que ocorrem no bioma Mata Atlântica
e nas cabrucas do sul da Bahia, representam um pouco desse potencial ainda a ser descoberto. Assim
sendo, o presente estudo teve o objetivo de estudar a diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio
presente nos nódulos da leguminosa arbórea Inga vera Willd. (Leguminosae Mimosoideae). Para isso
nódulos das raízes de 12 árvores desta espécie foram coletados, cortados e utilizados para isolar as
bactérias do seu interior. Estas foram crescidas em meio de cultura 79 [8] e a morfologia de suas colônias
avaliada. O DNA cromossômico dos rizóbios foi extraído e as regiões que codificam o 16S rDNA e o
gene recA amplificadas e seqüenciadas. As seqüências confirmadas nas direções 3´ e 5´ foram submetidas
ao banco de genes para buscar alinhamentos significativos, a similaridade/dissimilaridade genética entre
os isolados foi medida pelo coeficiente de Jaccard e dendrogramas foram obtidos pelo método de
agrupamento UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetical averages). Os isolados de
bactérias foram incorporados ao Banco de Rizóbios da UESC, podendo servir de inóculo para uma
diversidade de leguminosas arbóreas. Segundo a morfologia das colônias crescidas em meio de cultura,
foram selecionados 83 isolados de bactérias. A grande maioria (91%) das colônias bacterianas isoladas
apresentou coloração amarela, brilhante, com bordas inteiras, com produção de mucopolissacarídeos e
tiveram crescimento relativamente rápido (6 10 dias). Uma menor parte das colônias possuía cor branca,
crescimento lento, forma circular com bordas lisas e com a capacidade de alcalinizar o meio, produzindo
pouco ou nenhum muco. Os 83 isolados analisados tiveram o DNA genômico extraído com sucesso e
tiveram a sua seqüência do gene 16S rDNA e recA amplificada. O resultado mostrou a presença de
seqüências com aproximadamente 1400 pb, sendo que a molécula completa de 16S rDNA contém cerca
de 1540 pb de nucleotídeos e seqüências do gene recA com 880 pb. As seqüências foram então
submetidas à comparação com o banco de dados GenBank através da ferramenta Blastn (NCBI) a qual
permitiu serem reconhecidos os gêneros bacterianos. Todos os isolados submetidos apresentaram um grau
de similaridade superior a 98% com as seqüências do GenBank. Foi identificado um gênero classicamente
conhecido como sendo nodulífero e fixador de nitrogênio, pertencente à Classe Alfa Proteobacteria:
Rhizobium e outro Burkholderia, pertencente à Classe Beta Proteobacteria, que fora previamente incluído
no gênero Pseudomonas, mas que recentemente, além de terem sido separados de Pseudomonas, foram
descobertos como sendo simbiontes de leguminosas [9]. Os demais gêneros identificados correspondiam
a Paenebacillus e Bacillus (Classe Bacilli), comumente encontrados em associação com os tecidos
vegetais, visto que estes gêneros possuem muitas espécies reconhecidamente envolvidas nos processos de
crescimento vegetal. O estudo da diversidade de bactérias nos nódulos de Inga vera, revelado neste
trabalho, mostrou que grande parte dos nódulos eram colonizados por e
proteobactérias. Esse é o
primeiro relato de Burkholderia (betarizóbio) nodulando uma espécie de leguminosa arbórea da Tribo
Ingeae. Esse foi um passo inicial na identificação dos agentes responsáveis pela FBN simbiótica nessa
espécie e na medida em que pesquisas aplicadas forem realizadas, seus resultados poderão ser
direcionados para a aplicação na restauração florestal ou para o estabelecimento de Sistemas
Agroflorestais (SAFs). O uso desta biotecnologia para mitigar os impactos ambientais, inclusive os
causados pelas atividades agrícolas, deveria ser, em última análise, o principal interesse e verdadeiro
papel da aplicação da FBN.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
[1] Miflin, B.J.,Lea, P.J.The pathway of nitrogen assimilation in plants. Phytochemistry, New York,
v.15, 1976.
[2] Harper, J.E. Nitrogen metabolism. In: BOOTE, K.J.,BENNETT. J.M., SINCLAIR, T.R., et al
Physiology and determination of crop yield. Madison: ASA/CSSA/SSSA, 1994.
[3] Moreira, F.M.S. & Siqueira, J.O.. Microbiologia e bioquímica do solo. Editora UFLA: 2002.
[4] Sprent, J. I.. Nodulation in Legumes. Kew: Royal Botanic Gardens, 2001.
[5] Baldani, J. I.; Baldani, V. L. D. History on the biological nitrogen fixation research in
graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience. Anais da Academia Brasileira de
Ciências, v.77, 2005.
[6] Woese, C. R. Bacterial evolution. Microbiological Reviews, v. 51, 1987.
[7] Sprent, J.I. Legume trees and shrubs in the tropics: N2 fixation in perspective. Soil Biology and
Biochemistry, v. 27, 1995.
[8] Fred, E.B. & Waskman, S.A. 1928. Yeast extract-manitol agar. Laboratory Manual of General Microbiology.
New York: McGraw-Hill.
[9] Vieira, R. F., Diversidade e Taxonomia de Rizóbio, p.174. In: Silveira, A. P. D., Freitas, S. S. Microbiota do
Solo e Qualidade Ambiental, Campinas: Instituto Agronômico. 2007, p.312.