PT 105420

(11) Número de Publicação:
PT 105420
(51) Classificação Internacional:
C12G 1/10 (2006)
(12) FASCÍCULO DE PATENTE DE INVENÇÃO
(22) Data de pedido: 2010.12.09
(73) Titular(es):
(30) Prioridade(s):
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO
DOURO
EDIFÍCIO DA BIBLIOTECA CENTRAL, QUINTA
DE PRADOS
5001-801 VILA REAL
PT
UNIVERSIDADE DO MINHO
LARGO DO PAÇO
4704-553 BRAGA
PT
(43) Data de publicação do pedido: 2012.06.11
(72) Inventor(es):
ALICE MARIA CORREIA VILELA MOURA
PT
MARIA ARLETE MENDES FAIA
PT
MANUELA CORTE REAL
PT
DORIT SCHULLER
PT
(74) Mandatário:
ANABELA TEIXEIRA DE CARVALHO
EDIFICIO OCEANUS - AVENIDA DA BOAVISTA
3211- 1° ANDAR SALA 2.1 PORTO
4100-137 PORTO
PT
(54) Epígrafe: APLICAÇÃO DE LEVEDURAS VÍNICAS IMOBILIZADAS EM CAMADA DUPLA DE ALGINATOQUITOSANO PARA REMOÇÃO DA ACIDEZ VOLÁTIL EM MOSTOS E VINHOS
(57) Resumo: PROCESSO DE REMOÇÃO DA ACIDEZ VOLÁTIL DE MOSTOS E VINHOS CARACTERIZADO POR
COLOCAR EM CONTACTO A AMOSTRA DE MOSTOS/VINHOS A TRATAR COM LEVEDURA VÍNICAS
SACCHAROMYCES CEREVISIAE - IMOBILIZADAS NUMA MATRIZ DE DUPLA CAMADA DE ALGINATOQUITOSANO. AS ESTIRPES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, PODEM SER UTILIZADAS NA FORMA LIVRE
OU IMOBILIZADAS EM ESFERAS DE DUPLA CAMADA DE ALGINATO-QUITOSANO.
R E S U M O
“Aplicação de leveduras vínicas imobilizadas em camada
dupla de alginato-quitosano para remoção da acidez volátil
em mostos e vinhos”
Processo de remoção da acidez volátil de mostos e vinhos
caracterizado
por
colocar
em
contacto
a
amostra
de
mostos/vinhos a tratar com levedura vínicas – Saccharomyces
cerevisiae - imobilizadas numa matriz de dupla camada de
alginato-quitosano.
cerevisiae,
imobilizadas
quitosano.
podem
em
As
ser
esferas
estirpes
utilizadas
de
dupla
de
na
Saccharomyces
forma
camada
de
livre
ou
alginato-
D E S C R I Ç Ã O
“Aplicação de leveduras vínicas imobilizadas em camada
dupla de alginato-quitosano para remoção da acidez volátil
em mostos e vinhos”
Domínio da Invenção
A
presente
invenção
diz
respeito
à
redução
da
acidez
volátil de mostos e vinhos com acidez volátil elevada,
utilizando leveduras vínicas (Saccharomyces cerevisiae).
O processo de desacidificação pode aplicar-se no mosto e/ou
durante a vinificação ou directamente no vinho.
As leveduras, isto é estirpes de Saccharomyces cerevisiae,
podem ser utilizadas na forma livre ou imobilizadas em
esferas de dupla camada de alginato-quitosano. Contudo, a
utilização
de
significativamente
leveduras
a
imobilizadas
eficiência
do
processo
aumenta
de
remoção
biológica, ou zimológica, do ácido acético.
Antecedentes da invenção
O vinho é uma bebida alcoólica obtida por fermentação do
mosto de uva. O vinho é constituído fundamentalmente por
água (componente maioritário), álcool etílico, e por outros
componentes, dos quais se destacam os ácidos orgânicos:
málico, tartárico, cítrico, acético, propanóico, carbónico
entre outros. Alguns ácidos, como o tartárico, o málico e o
cítrico não são arrastados pelo vapor de água e constituem
a
acidez
butanóico
fixa.
são
Outros,
voláteis
como
e
são
o
acético,
responsáveis
propanóico
pela
e
acidez
volátil. Os ácidos voláteis são produzidos pelas reacções
bioquímicas que ocorrem durante a fermentação e a maturação
do vinho. A acidez volátil é um indicador da qualidade do
1
vinho e pode ser definida como o conjunto de ácidos gordos
da série acética que se encontram no vinho, quer no estado
livre quer no estado salificado, cujo limite legal é de 1,2
g/L, expressa em ácido acético (OIV, 2010).
O ácido acético pode aparecer nos vinhos por actividade das
leveduras durante a fermentação alcoólica e por actividade
metabólica das bactérias do ácido láctico e bactérias do
ácido acético.
A presença de ácido acético nos vinhos tem sido sugerida
como uma das causas envolvidas no amuo de fermentações
vinárias (Boulton et al., 1996). Por outro lado, mesmo
noutras situações em que não ocorrem amuos de fermentação,
as concentrações de ácido acético podem exceder os limites
legais. Tal facto torna o vinho impróprio para consumo e
traduz-se em prejuízos económicos para o produtor. Neste
contexto a remoção de ácido acético de mostos ou vinhos é
um aspecto relevante para a indústria vinícola.
Diversas
metodologias,
com
o
objectivo
de
diminuir
a
excessiva acidez volátil dos vinhos têm sido propostas,
tais como:
o Processo 1- Estabilização microbiológica do vinho com
acidez
volátil
elevada,
seguido
de
loteamento
com
outros vinhos;
o Processo
2-
Utilização
de
processos
como
osmose
inversa e nanofiltração(Fugelsang e Edwards 2007);
o Processo 3- Remoção zimológica do ácido acético por
refermentação do vinho ácido (Ribéreau-Gayon et al.
1975; Ribéreau-Gayon et al. 2006).
A
primeira
abordagem
(Processo
1)
baseia-se
na
estabilização microbiológica do vinho, com acidez volátil
elevada, que é então misturado com outros vinhos com baixo
teor em ácido acético. No entanto, o vinho resultante,
geralmente, tem reduzido valor comercial (Zoecklein et al.
2
1995).
volátil
Alternativamente,
pode
ser
o
vendido
vinho
para
com
fins
excessiva
de
acidez
destilação
para
obtenção de etanol, alternativa que também apresenta perdas
económicas para o produtor.
A osmose inversa e a nanofiltração (Processo 2) podem ser
usadas para a desacidificação de vinhos com acidez volátil
elevada, porém, estas alternativas utilizadas em conjunto,
ou separadamente, envolvem a necessidade da aquisição de
equipamento dispendioso nem sempre ao alcance das pequenas
e médias empresas vitivinícolas.
Várias
abordagens
têm
sido
desenvolvidas
para
a
desacidificação biológica de vinhos ácidos, com o objectivo
de obter vinhos com um bom equilíbrio entre os teores de
açúcar
e
de
ácidos,
mas
todas
elas
estão
limitadas
à
remoção do ácido málico e não contemplam a remoção do ácido
acético (Bony et al. 1997; Husnik et al. 2006; Husnik et
al. 2007; Main et al. 2007; Silva et al. 2003; Sousa et al.
1993; Volschenk et al., 1997).
Já existe uma estirpe de levedura geneticamente modificada
que diminui substancialmente a quantidade de ácido acético
em vinhos com elevada acidez volátil (Remize et al., 2000).
No entanto, devido à polémica que existe na Europa sobre o
uso
de
microrganismos
geneticamente
modificados
para
a
produção de alimentos, não é possível utilizar a estirpe
descrita para vinificação ou processos de desacidificação
ou bio-redução (Schuller e Casal, 2005; Schuller, 2010).
Alternativamente,
concentrações
excessivamente
altas
de
ácido acético (superiores ao limite legal de 1,2 g/L) podem
ser
removidas
dos
vinhos
por
refermentação
do
mesmo
(Processo 3) (Riberéau-Gayon et al., 1975). Neste processo,
denominado de “remostagem”, um terço de vinho com acidez
volátil elevada é misturado com dois terços de uvas recémesmagadas ou de bagaço residual obtido do final de uma
3
fermentação alcoólica (polpa restante, após a drenagem do
vinho recém-feito). Esta abordagem empírica reduz a acidez
volátil da mistura de valores próximos de 0,73 g/L de ácido
acético para valores dentro de uma faixa de cerca de 0,37
g/L de ácido acético. É também um processo de baixo custo,
no entanto, o risco de resultados finais inesperados e
efeitos prejudiciais sobre a fermentação é bastante alto,
uma
vez
que
(microbiota
a
diversidade
indígena)
é,
de
em
leveduras
grande
envolvidas
parte,
variável
(Zoecklein et al., 1995).
A imobilização de células por aprisionamento em matrizes de
alginato de cálcio é uma técnica que tem recebido atenção
crescente e com variadas aplicações (Ciani 1995; Silva et
al, 2003).
Vinhos
de
elevada
qualidade
foram
já
obtidos
por
co-
fermentação de células imobilizada de Candida stellata com
células
livres
de
Saccharomyces
(Ciano
cerevisiae
e
Ferraro, 1998).
Foram, também, já submetidas várias patentes que visam a
utilização de leveduras imobilizadas, quer em matriz de
alginato
de
cálcio
alginato
ou
outro
contendo
agente
uma
ou
várias
imobilizador
(Nos
camadas
de
documentos:
US5070019A – “Produção de bebidas alcoólicas por leveduras
imobilizadas em esferas de alginato de cálcio”; WO9713850A1
–
“Método
de
imobilização
em
alginato
de
cálcio”;
WO2004/070026A1 – Produção de esferas com Kappa carrageenan
para produção de cerveja em contínuo; WO2004/090128A1 –
“Método para imobilização de microrganismos (leveduras ou
bactérias) com o objectivo de os utilizar na preparação de
bebidas fermentadas como vinhos tranquilos, cerveja, vinhos
espumantes,
bebidas
gasosas
e
álcool
etílico)”,
quer
noutros suportes físicos de aprisionamento como é o caso do
4
documento
US2001/0019731A
–
“Produção
de
licores
com
leveduras imobilizadas num bio-reactor”.
O
documento
Na
Patente
Nrº
WO2004/090128A1
descreve
a
utilização de uma matriz de imobilização de dupla camada
alginato-alginato
enquanto
que
na
presente
invenção
a
matriz de imobilização é uma dupla camada de alginatoquitosano. Esta diferença está também presente em relação
aos outros processos de imobilização mencionados.
Assim,
na
presente
invenção
utilizam-se
células
de
Saccharomyces cerevisiae imobilizadas numa matriz de dupla
camada
de
alginato-quitosano,
para
a
redução
da
acidez
volátil de mostos e vinhos. Para este efeito, a eficiência
de remoção de ácido acético de mostos e vinhos contendo
diferentes
concentrações
imobilizadas
avaliada.
de
de
ácido
Saccharomyces
Verificámos
que
as
acético
com
células
cerevisiae
foi
também
células
imobilizadas
apresentam maior tolerância ao etanol, em comparação com as
células livres permitindo que as células imobilizadas em
dupla
camada
de
alginato-quitosano
removem
mais
eficientemente o ácido acético de vinhos com valores de
acidez volátil de 1,1 a 1,7 g/L de ácido acético, um teor
em etanol até 12,5%; e valores de pH entre 3.50 e 3,12
(Vilela-Moura
et
al.,
2010a).
Estes
resultados
são
consistentes com trabalhos anteriores que indicam uma maior
resistência das células imobilizadas ao etanol (Norton et
al., 1995) e ao stress imposto pelo meio ácido (Hansen et
al., 2002). Este método facilita ainda a separação das
leveduras do vinho tratado após terminado o processo de
bio-redução do ácido acético.
A presente invenção permite uma remoção da acidez volátil
mais
eficiente
e
mais
económica,
constituindo
uma
alternativa aos outros métodos descritos e que contribui
5
para melhorar, significativamente, a qualidade dos vinhos
com níveis excessivos de acidez volátil.
Descrição Geral
O excesso de ácido acético nos vinhos torna-os impróprios
para consumo o que se traduz em prejuízos económicos para o
produtor. Neste contexto, a remoção de ácido acético de
mostos ou vinhos é um aspecto relevante para a indústria
vinícola.
Diversas
metodologias,
com
o
objectivo
de
diminuir
a
excessiva acidez volátil dos vinhos têm sido propostas. No
entanto, o vinho resultante, geralmente, tem reduzido valor
comercial o que também apresenta perdas económicas para o
produtor.
A imobilização de células por aprisionamento em matrizes de
alginato de cálcio é uma técnica que tem recebido atenção
crescente na indústria do vinho e de bebidas alcoólicas.
A presente invenção descreve um processo de redução da
acidez volátil excessiva de mostos e vinhos, permitindo
melhorar significativamente a qualidade global dos vinhos
de uma forma barata, simples e eficiente.
A utilização de células de S. cerevisiae imobilizadas numa
matriz
de
dupla
camada
de
alginato-quitosano,
reduz
surpreendentemente a acidez volátil de vinhos. Para este
efeito, a eficiência de remoção de ácido acético de vinhos
contendo
diferentes
células
imobilizadas
avaliada.
levedura
concentrações
Verificou-se
em
dupla
de
que
camada
de
ácido
Saccharomyces
as
de
células
acético
cerevisiae
imobilizadas
alginato-quitosano
com
foi
de
removem
eficientemente o ácido acético de vinhos com valores de
acidez volátil de 1,1 a 1,7 g/L de ácido acético, teor em
etanol até 12,5% e valores de pH entre 3.5 e 3,12.
6
Sumário
Um
dos
objectivos
da
presente
invenção
é
descrever
um
processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos
que possa ser aplicado directamente no mosto/vinho ácido,
sem a necessidade de adição de mosto ou bagaço, ou de
qualquer outra fonte de açúcar.
A presente invenção descreve um processo de redução da
acidez volátil de mostos e vinhos que compreende o contacto
da amostra de mosto/vinho a tratar com levedura vínicas –
Saccharomyces
-
cerevisiae
imobilizadas
numa
matriz
de
dupla camada de alginato-quitosano, de preferência a matriz
dupla pode apresentar-se na forma de esferas.
Numa
realização
acidez
volátil
preferencial
de
mostos
do
e
processo
vinhos,
a
de
redução
da
imobilização
de
leveduras vínicas pode incluir os seguintes passos:
- aclimatização prévia das referidas leveduras vínicas
às condições stressantes em termos de percentagem de
etanol ou concentração de ácido acético ou
pH;
- centrifugação e re-suspensão das células numa solução
aquosa de alginato de cálcio, de preferência a
2%
p/v;
- formação das esferas por gelificação ionotrópica com
solução
de
previamente
alginato
de
refrigerada
a
cálcio,
de
4ºC,
onde
preferência
permanecem
durante 0,5-1,5 h, de preferência 1h;
- transferência
das
esferas
para
uma
solução
de
quitosano 1% (p/v) durante 20-48 h de preferência 24
h a 20-25ºC com agitação orbital;
- lavagem
das
esferas,
de
preferência
com
água
destilada estéril.
7
Numa realização mais preferencial do processo de redução da
acidez volátil de mostos e vinhos a levedura pode estar
sujeita
a
pelo
menos
um
das
seguintes
condições
stressantes:
Numa
-
percentagem de etanol até 15 %;
-
concentração de ácido acético até 2 g/L;
-
pH inferior a 4 ;
realização
ainda
mais
preferencial
do
processo
de
redução da acidez volátil de mostos e vinhos este deve ser
efetuado
por
levedura(s)
vínica(s)
de
Saccharomyces
cerevisiae.
Numa outra realização ainda mais preferencial do processo
de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, os valores
de acidez volátil do vinho/mosto a tratar podem variar de
0,5-2 g/L, de preferência 1,1 a 1,7 g/L de ácido acético.
Numa
outra
realização
outra
ainda
mais
preferencial
do
processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, o
teor de álcool do vinho a tratar poder atingir valores até
10-20%, de preferência 12,5%-14%.
Numa
outra
realização
outra
ainda
mais
preferencial
do
processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, o
pH do vinho/mosto a tratar pode variar até pH 4 inclusive,
de preferência de 3,12-3,54.
Breve descrição das figuras
Figura 1 - Imagens de microscopia electrónica de varrimento
(SEM) de células de S. cerevisiae, imobilizadas em esferas
de
dupla
camada
de
alginato-quitosano:
I)
Esfera
com
8
alginato 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v) (140x); II) Esfera
com alginato 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v) (1000X); III)
Esfera com alginato de 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v)
(5000X); IV) Distribuição de células no interior da esfera
com
alginato
de
2%
(p/v)
e
quitosano
1,0%
(w/v),
após
desacidificação de um vinho a pH 3,12 (10000x); V) Camada
externa de uma esfera após desacidificação de um vinho a pH
3,12
(5000X);
VI)
Camada
externa
de
uma
esfera
após
desacidificação de um vinho a pH 3,5 (4000X).
Descrição detalhada da invenção
A presente invenção diz assim respeito a um uso inovador
para um processo de redução da acidez volátil de mostos e
vinhos,
utilizando
imobilizadas
em
estirpes
esferas
de
de
leveduras
dupla
camada
comerciais,
de
alginato-
quitosano, como prática enológica para corrigir os mostos
ou
vinhos
com
excessiva
acidez
volátil.
Esta
nova
utilização fornece uma base eficiente e barata de redução
da acidez volátil de mostos e vinhos, uma alternativa aos
métodos
actualmente
disponíveis
e
que
contribui
para
melhorar, significativamente, a qualidade dos vinhos com
níveis excessivos de acidez volátil.
O processo descrito pode ser aplicado directamente no vinho
ácido, sem necessidade de adição de mosto ou bagaço, ou de
qualquer outra fonte de açúcar.
Numa abordagem de pesquisa de leveduras mais adequadas para
um
processo
de
desacidificação
biológica
de
vinhos
com
acidez volátil elevada, 135 isolados e nove estirpes de
Saccharomyces
cerevisiae
comerciais
foram
caracterizadas
quanto à sua capacidade de utilização simultânea da glucose
e do ácido acético.
9
As
estirpes
mais
promissoras
foram
avaliadas
em
meio
sintético contendo vinhos com acidez volátil elevada que
foram suplementados com alta concentração de glucose/baixa
concentração
em
glucose/alta
forma
concentração
simular
início
da
etanol
a
uma
ou
em
baixa
etanol.
refermentação
fermentação
de
um
alcoólica
concentração
Pretendia-se
vinho
ou
com
com
em
desta
uvas
o
do
bagaço
residual de um vinho acabado, respectivamente. As leveduras
testadas removeram mais de 80% do ácido acético do meio em
condições laboratoriais e removeram entre 40 a 50% do ácido
acético em mostos-vinho brancos e mais de de 50-70% do
ácido
acético
mostos-vinho
tintos
à
escala
piloto.
A
capacidade de redução da acidez volátil de mostos e vinhos
foi também avaliada em condições muito stressantes impostas
pela combinação de etanol, ácido acético e SO2.
As
leveduras
S.
cerevisiae
testadas
reduziram
eficientemente a acidez volátil (entre 80% e 50%) de vinhos
ácidos, sem a adição de qualquer fonte de açúcar (mosto ou
bagaço) com concentrações iniciais de ácido acético até 1,0
g/L e concentrações de etanol não superiores a 11% (v/v).
No entanto, o poder anti-oxidante e efeito anti-séptico de
dióxido de enxofre (SO2) em concentrações de 95-170 mg/L
inibiu a redução da acidez volátil. A redução da acidez
volátil
vinho,
induziu
tais
como
a
formação
acetato
de
de
compostos
isoamilo
aromáticos
(aroma
a
no
banana)
hexanoato de etilo (aromas a maçã e ou abacaxi), entre
outros.
Para aumentar a eficiência do processo de redução da acidez
volátil
de
mostos
e
vinhos
utilizámos
a
levedura
imobilizada. Verificou-se que a imobilização das células
(8,0 x107 células/mL) em dupla camada de alginato/quitosano
(2:1 p/v) resultou na redução de 40-45% do ácido acético ao
fim de 72 horas num vinho com uma acidez volátil inicial de
10
1,1 g/L, um teor alcoólico de 12,5% (v/v) e um valor de pH
de 3,12.
4.0
x
107
cel/mL
8.0 x 107 cel/mL
Vinhos
48h
Vinho(A)
Açúcar
72h
48h
72h
Glucose %
Glucose %
Glucose %
Glucose %
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
acético %
acético %
acético %
acético %
CFU mL -1
CFU mL -1
CFU mL -1
CFU mL -1
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
17.9 ± 1.2
21.6 ± 2.3
25.7 ± 1.6
28.1 ± 3.2
4.4x103 ±
3.5x104 ±
5.6x103 ±
6.7x104
1.4x102*
7.1x102*
2.8x102*
±1.4x103*
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
24.8 ± 9.7
27.3 ± 5.1
31.1 ± 3.4
42.9 ± 2.4
(0.0 ± 0.0)
(0.0 ± 0.0)
(0.0 ± 0.0)
(0.0 ± 0.0)
n.d.
n.d.
26.4 ± 2.7
34.0 ± 3.3
(0.0 ± 0.0)
(0.0 ± 0.0)
residual
1.12 g/L
Ácido
acético
1.1 g/L
Etanol
12.5%
(v/v)
pH 3.50
Vinho(B)
Açúcar
residual
1.12 g/L
Ácido
acético
1.1 g/L
Etanol
12.5%
(v/v)
pH 3.12
Vinho (C)
Açúcar
residual
1.12 g/L
Ácido
acético
1.3 g/L
Etanol
12.5%
(v/v)
pH 3.12
11
Vinho (D)
Açúcar
n.d.
n.d.
25.9 ± 0.1
32.7 ± 4.4
(0.0 ± 0.0)
(0.0 ± 0.0)
n.d.
n.d.
21.7 ± 0.3
26.0 ± 0.8
(0.0 ± 0.0)
(0.0 ± 0.0)
residual
1.12 g/L
Ácido
acético
1.5 g/L
Etanol
12.5%
(v/v)
pH 3.12
Vinho(E)
Açúcar
residual
1.12 g/L
Ácido
acético
1.7 g/L
Etanol
12.5%
(v/v)
pH 3.12
* Ocorrência de floculação das células.
Tabela 1 - Consumo percentual de glucose e de ácido acético
(%) e número de células no vinho (CFU/mL) após 48 e 72
horas de redução da acidez volátil de mostos e vinhos por
Saccharomyces
cerevisiae
alginato-quitosano
imobilizada
(2:1%,
p/v)
para
em
dupla
duas
camada
de
concentrações
celulares no alginato (4.0 x 107 e 8.0x107 células/mL). Os
ensaios foram realizados em condições de aerobiose-limitada
(230 mL de vinho colocado em frascos erlenmeyer de 250 mL
de capacidade, devidamente tapados) à temperatura de 25ºC.
A percentagem de remoção está dependente da concentração
celular (concentração de células na matriz de alginatoquitosano - Tabela 1) e para a mesma concentração celular 8,0 x107 células/mL - também está dependente do valor de
ácido
acético
inicial
do
vinho.
Assim,
para
um
valor
inicial de 1,3 g/l verificou-se uma percentagem de remoção
de 30-40%; para um valor de 1,5 g/L – 25-40% e para um
12
valor de ácido acético inicial de 1,7 g/L verificou-se uma
percentagem de remoção de 25-35% (Tabela 1).
A integridade das esferas depende do pH do meio, tendo-se
verificado que a pH 3,5 ocorria libertação de células para
o
exterior
(Tabela
1),
isto
é,
a
membrana
externa
de
quitosano perdia alguma integridade. No entanto, as células
floculavam, o que permitia o seu rápido depósito no fundo
do reactor (frasco erlenmeyer) mantendo-se, o vinho, com um
aspecto límpido.
Para avaliação da integridade das esferas de dupla camada
de
alginato-quitosano
8.0x107
células/mL,
com
uma
antes
concentração
e
após
o
celular
processo
de
de
desacidificação, procedeu-se ao seu estudo por microscopia
electrónica de varrimento (SEM). A análise foi realizada
num microscópio eletrónico de varrimento Philips-FEI/Quanta
400.
Verificou-se que as esferas tinham uma forma elipsoidal e
um diâmetro médio de 1,0 - 2,0 mm (Figura 1 - I), forma e
tamanho semelhantes ao relatado por outros autores (Briggs
et al., 2004). As esferas mostraram ainda uma superfície
bastante
homogénea
(Figura
1
-
II).
Alguns
poros
extrusivos, com um diâmetro médio de 5 µm, aparecem na
camada
externa
libertação
esferas
de
de
gás
(Figura
1
quitosano,
provavelmente
durante
o
-
III).
II
e
processo
As
de
devido
formação
células
à
das
mostram-se
regularmente distribuídas pela camada interna de alginato,
após a sua utilização (processo de desacidificação) (Figura
1 - IV). Após 168 horas de desacidificação num vinho a pH
3,5, a camada externa de quitosano perde alguma integridade
(Figura 1 - VI), enquanto a um valor de pH mais baixo 3,12, a integridade da camada externa foi mantida (Figura 1
- V).
13
A
utilização
de
leveduras
imobilizadas
em
alginato-
quitosano permite aumentar a tolerância ao ácido acético,
ao etanol e a valores de pH mais baixos. Apresenta ainda a
vantagem de permitir uma rápida separação da levedura do
vinho, após o processo de redução da acidez volátil de
mostos e vinhos, obtendo-se no final um vinho limpo, sem
turvação.
Apresentam-se de seguida algumas realizações preferenciais
da invenção não sendo contudo restritivas do seu âmbito de
protecção.
Exemplo 1
Redução
da
acidez
volátil
de
um
vinho
com
uma
acidez
volátil de 1,1 g/L de ácido acético, 12.5% (v/v) de etanol
e pH 3.12.
A levedura S. cerevisiae utilizada foi mantida a -80 ºC em
tubos de crio-preservação contendo caldo de YPD (glicose 2%
p/v,
peptona
1%
p/v
e
extrato
de
levedura
0,5%
p/v)
suplementado com glicerol (30% v/v).
Antes de cada utilização, a estirpe foi semeada em placas
de YPD (glicose 2% p/v, peptona 1% p/v, extrato de levedura
0,5% p/v e agar 2% p/v) e incubada durante 48 horas a 25
ºC.
A seguir, uma pré-cultura foi cultivada durante 12 horas em
100 mL do vinho com elevada acidez volátil a 25 ºC e 120
rpm.
Este
procedimento
permitiu
uma
aclimatização
das
células ao meio, neste caso o vinho ácido, onde iriam ser
posteriormente incubadas após imobilização.
Em alternativa, as células podem ser incubadas em meio
mineral mínimo (van Uden, 1962) com um teor de etanol,
ácido acético e pH semelhante ao do vinho a testar.
14
As células foram centrifugadas (5500 rpm a 4 ºC durante 10
min.) e re-suspendidas numa solução aquosa de alginato de
cálcio
a
(2%,
p/v
-
Sigma
Aldrich,
ref.71238,
preferencialmente). Foi utilizada uma concentração celular
de 8.0x107 células/mL na solução de alginato.
O alginato, com a suspensão de células, foi colocado numa
seringa de plástico de 10 ml e gotejado, a uma altura de 10
cm, para dentro de um frasco com 300 ml de uma solução de
CaCl2 (0.18M -.Sigma Aldrich, ref C1016, preferencialmente)
previamente esterilizada por filtração (Millipore 0,22 µm
de tamanho de poro, preferencialmente) e refrigerada a 4
ºC. As pequenas gotas, à medida que caiam eram mantidas em
suspensão na solução de CaCl2 por agitação magnética (100
rpm).
As
esferas
ionotrópica
formadas
do
(gotas
alginato
com
obtidas
o
por
cálcio)
gelificação
permaneceram
na
solução de CaCl2 por uma hora (4 ºC) e foram seguidamente
transferidos para um Erlenmeyer (1000 mL) com 250 mL de
quitosano de baixo peso molecular (1%, p/v - Sigma Aldrich,
ref.448869, preferencialmente) onde foram incubadas durante
24 horas a 25 ºC com agitação orbital (100 rpm).
Finalmente, as esferas foram lavadas duas vezes com água
destilada estéril e transferidas para balões erlenmeyer de
250 mL, utilizando cerca de 100 esferas para 230 mL de
vinho com acidez volátil elevada a testar.
Os
balões
erlenmeyer
foram
colocados
numa
câmara
de
volátil
de
crescimento, a 25 ºC, com agitação (100 rpm).
Durante
o
processo
de
de
redução
da
acidez
mostos e vinhos foi necessário retirar amostras de 24 em 24
horas para monitorização do teor em ácido acético, etanol
(utilizando-se testes (kits) enzimáticos - Enzytec, SCIL
Diagnostics,
Viernheim,
Alemanha,
preferencialmente)
e
número de células no meio (monitorização da integridade das
15
esferas) por espalhamento de 100 µL da amostra (vinho) em
meio de cultura YPD (descrito anteriormente).
Resultados:
Ao fim de 48, 72 e 168 horas verificou-se que o decréscimo
da acidez volátil era de 31.1±3.4%, 42.9±2.4% e 61.8±0.9%,
respectivamente.
O vinho final (às 168 horas) apresentava um teor alcoólico
de
11,8%
(v/v),
diminuição
de
tendo-se
0,7%
(v/v)
verificado,
em
etanol.
portanto,
uma
Verificou-se
um
acentuado decréscimo na acidez volátil, de 1,1 g/L (valor
inicial) para 0,42 g/L (valor final, às 168 horas)
Característica
química
Vinho não
Vinho após o
tratado
tratamento
(1)
Métodos
analíticos
utilizados
(CEE
2676/90)*
SO2 livre (mg/L)
4,8
0.0±0.0
Método de Ripper
SO2 total (mg/L)
70,5
71,05±3,44
Método de Ripper
1,1
0,42±0,1
Acidez volátil
(g/L
de
N.º
ácido
Destilação
com
Cazenave-Ferré
acético)
de
o
seguida
titulação
com
fenolftaleína
Açúcar
residual
1,12
n.d.
Método de Lane-Eynon
5,55
5,10±0,00
(g/L)
Acidez total
(g/L
ácido
Titulação
com
azul
de
bromotimol
tartárico)
pH
Grau
alcoólico
3,12
2,95±0,05
12,5
11,8±0,1
Potencimétrico
Destilação
%,etanol (v/v)
*
CEE
N.º
2676/90
–
Jornal
oficial
das
Comunidades
Europeias, 33, 3.10.1990. (ISSN 0257 – 7771)
(1)- Os valores apresentados são a média de 3 ensaios por
vinho.
16
Tabela 2 - Características do vinho do Exemplo 1, antes e
após 168 horas (7 dias) de processo de redução da acidez
volátil de mostos e vinhos.
Não ocorreu libertação de células durante o processo de
redução da acidez volátil de mostos e vinhos.
Exemplo 2
Redução
da
acidez
volátil
de
um
vinho
com
uma
acidez
volátil de 1,5 g/L de ácido acético, 12.5% (v/v) de etanol
e pH 3.15.
Todos
os
procedimentos
descritos
no
Exemplo
utilizados
1,
que
foram
serve
semelhantes
como
exemplo
aos
para
qualquer tipo de vinho.
Resultados:
Ao fim de 48, 72 e 168 horas verificou-se que o decréscimo
da acidez volátil era de 25.9±0.1 %, 32.7±4.4 % e 50.0±4.0
%, respectivamente.
O vinho final (às 168 horas) apresentava um teor alcoólico
de
11,3%
diminuição
(v/v),
de
tendo-se
1,2%
(v/v)
verificado,
em
etanol.
portanto,
uma
Verificou-se
um
acentuado decréscimo na acidez volátil, de 1,5 g/L (valor
inicial) para 0,75 g/L (valor final, às 168 horas).
Característica
química
SO2 livre
Vinho antes
Vinho após o
do
tratamento (1)
tratamento
Métodos
utilizados
analíticos
(CEE
N.º
2676/90)*
4,8
0.0±0.0
Método de Ripper
70,5
75,56±1.41
Método de Ripper
1,5
0,75±0,1
(mg/L)
SO2 total
(mg/L)
Acidez volátil
Destilação
com
o
17
(g/L de ácido
Cazenave-Ferré seguida de
acético)
titulação
com
fenolftaleína
Açúcar
1,12
n.d.
Método de Lane-Eynon
5,55
6,32±0,03
residual (g/L)
Acidez total
(g/L
Titulação
ácido
com
azul
de
bromotimol
tartárico)
pH
3,15
2,63±0,01
Potencimétrico
Grau alcoólico
12,5
11,3± 0,1
Destilação
%,etanol (v/v)
*
CEE
N.º
2676/90
–
Jornal
oficial
das
Comunidades
Europeias, 33, 3.10.1990. (ISSN 0257 – 7771)
(1)- Os valores apresentados são a média de 3 repetições
para cada vinho testado.
Tabela 3 - Características do vinho do Exemplo 2, antes e
após 168 horas (7 dias) de processo de redução da acidez
volátil de mostos e vinhos
Não ocorreu libertação de células durante o processo de
redução da acidez volátil de mostos e vinhos.
A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum
restrita às realizações descritas neste documento e uma
pessoa
com
conhecimentos
muitas
possibilidades
de
médios
da
modificação
área
da
poderá
mesma
prever
sem
se
afastar da ideia geral da invenção, tal como definido nas
reivindicações.
As realizações acima descritas são todas combinadas entre
si de forma trivial.
18
As
seguintes
reivindicações
definem
adicionalmente
realizações preferenciais da presente invenção.
Lisboa, 12 de Abril de 2012
19
4. Processo de acordo com as reivindicações anteriores
caracterizado por, a levedura estar sujeita a pelo
menos um das seguintes condições stressantes:
a. percentagem de etanol até 15 %;
b. concentração de ácido acético até 2 g/L;
c. pH inferior a 4.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações
anteriores
caracterizado
pela
redução
da
acidez
volátil de mostos e vinhos ser efetuada por leveduras
vínicas de Saccharomyces cerevisiae.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações
anteriores
caracterizado
por,
os
valores
de
acidez
volátil do vinho/mosto de vinho a tratar, variarem de
0,5-2 g/L, de preferência de 1,1 a 1,7 g/L de ácido
acético.
7. Processo
de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações anteriores caracterizado por, o teor de
álcool do vinho/mosto de vinho a tratar poder atingir
valores até 10-20%, de preferência 12,5%-14%.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações
anteriores caracterizado por o pH do vinho/mosto de
uva a tratar variar até 4 inclusive, de preferência de
3,12-3,54.
Lisboa, 12 de Abril de 2012
2
R E I V I N D I C A Ç Õ E S
1. Processo de redução da acidez volátil de mostos e
vinhos
é
caracterizado
por
colocar
em
contacto
a
amostra de mostos/vinhos a tratar com levedura vínicas
– Saccharomyces cerevisiae - imobilizadas numa matriz
de dupla camada de alginato-quitosano.
2. Processo
de
acordo
com
a
reivindicação
anterior
caracterizado por a referida matriz dupla ser na forma
de esferas.
3. Processo de acordo com as reivindicações anteriores
caracterizado por, a imobilização de leveduras vínicas
na matriz de dupla camada estar compreendida pelos
seguintes passos:
a. aclimatização
vínicas
prévia
às
das
referidas
condições
desacidificação
em
leveduras
stressantes
termos
de
percentagem
etanol ou concentração de ácido acético ou
b. centrifugação
solução
e
re-suspensão
aquosa
preferência a
de
das
alginato
da
pH;
células
de
de
numa
cálcio,
de
2% p/v;
c. formação das esferas por gelificação ionotrópica
com solução de alginato de cálcio, de preferencia
previamente refrigerada a 4ºC, onde permanecem
durante 0,5-1,5 h, de preferência 1h;
d. transferência
das
esferas
para
uma
solução
de
quitosano 1% (p/v) durante 20-48 h de preferência
24 h a 20-25ºC com agitação orbital;
e. lavagem das esferas.
1