Tese_ICS_ Cláudia Valle dos Santos

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DO EFEITO DOS EXTRATOS AQUOSO E METANÓLICO
ORIUNDOS DE FOLHAS DA SCHNINUS TEREBINTHIFOLIUS, RADDI
(AROEIRA)
SOBRE
CULTURAS
DE
ESPLENÓCITOS
DE
CAMUNDONGOS ISOGÊNICOS BALB/C E CBA E SOBRE A
BACTÉRIA CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS.
CLÁUDIA VALLE CABRAL DIAS DOS SANTOS
Salvador – Bahia
2
2010
CLÁUDIA VALLE CABRAL DIAS DOS SANTOS
Avaliação do efeito dos extratos aquoso e metanólico oriundos de
folhas da Schninus terebinthifolius, Raddi (Aroeira) sobre culturas
de esplenócitos de camundongos isogênicos BALB/c e CBA e
sobre a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis.
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Imunologia do Instituto de
Ciências da Saúde da Universidade Federal
da Bahia, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Imunologia.
Orientador: Prof. Dr. Roberto José Meyer do Nascimento.
Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Erlon Araújo Rodrigues.
Salvador – Bahia
3
2010
Ficha catalográfica
Biblioteca Prof. Penildon Silva – ICS – UFBA
SANTOS C. V. C.
108 f.; 17 il.
Avaliação do efeito dos extratos aquoso e metanólico da Schninus
terebinthifolius, Raddi (Aroeira) sobre culturas de esplenócitos
murinos e sobre a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis.
Cláudia Valle Cabral Dias dos Santos - Salvador, 2010.
Orientadores: Prof. Dr. Roberto José Meyer Nascimento.
Prof. Dr. Luiz Erlon Araújo Rodrigues.
Tese (doutorado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde,
Programa de Pós-Graduação em Imunologia, 2010.
1. Polifenóis. 2. Schinus terebinthifolius, Raddi.
3. Aroeira. 4. Corynebacterium pseudotuberculosis.
I. Nascimento, Roberto José Meyer. II. Rodrigues, Luiz Erlon Araújo.
III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde.
IV. Título.
4
“CONFIA AO SENHOR TUAS OBRAS E
TERÃO ÊXITOS OS TEUS PROJETOS.”
(Provérbios: 16, 3)
5
A minha mãe Raimunda do Valle Cabral Dias dos Santos
força tão poderosa e luz em minha vida.
6
AGRADECIMENTOS
Ao Senhor Deus, meu Pastor em todas as horas, eterno e indefinível, pela
oportunidade de viver enriquecedoras experiências e o aprendizado de que
“Tudo posso, Naquele que me Fortalece”
Aos Magnânimos Professores, Dr. Roberto Meyer e Dr. Luiz Erlon Araújo
Rodrigues... não existem vocábulos que possam expressar meu agradecimento
e orgulho em tê-los na orientação deste trabalho...
A André Nascimento Santos, ex-aluno e agora amigo, pela colaboração
preciosa e apoio.
Aos examinadores da banca, pelo auxílio na conclusão desta etapa.
Aos professores, pesquisadores, funcionários, estudantes e amigos do
Laboratório de Pesquisas Básicas da Escola Bahiana de Medicina e Saúde
Pública, que forneceram apoio, amizade e assistência incondicional.
Aos professores, pesquisadores, estudantes e funcionários do Laboratório de
Imunologia e Biologia Molecular, do Instituto de Ciências da Saúde, UFBA que
participaram com atenção, zelo e eficiência neste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia da UFBA pela agradável
convivência ao longo desses anos e em especial a amiga Dilcéia, incansável
colaboradora sempre.
Aos meus alunos e amigos das Universidades, pelo carinho e incentivo em
todos os momentos.
Ao expressar meus sinceros agradecimentos às pessoas que contribuíram, seja
no plano pessoal ou no profissional, para a conclusão desta etapa de minha
vida acadêmica, seria impossível listar a todos, porquanto não haveria espaço
disponível. Assim, aqui vão minhas escusas por aqueles nomes que omiti!
Muito obrigada a todos!
7
“O problema não consiste em saber se os animais podem raciocinar, tão pouco se
podem falar ou não; o verdadeiro problema é este: podem eles sofrer?”
Jeremy Bentham, 1789
Aos animais de experimentação
que contribuíram involuntariamente
para a ampliação de meus conhecimentos,
minha respeitosa homenagem.
8
POEMA EM LINHA RETA
Nunca conheci quem tivesse levado porrada.
Todos os meus conhecidos têm sido campeões em tudo.
E eu, tantas vezes reles, tantas vezes porco, tantas vezes vil,
Eu tantas vezes irrespondivelmente parasita,
Indesculpavelmente sujo,
Eu, que tantas vezes não tenho tido paciência para tomar banho,
Eu, que tantas vezes tenho sido ridículo, absurdo,
Que tenho enrolado os pés publicamente nos tapetes das etiquetas,
Que tenho sido grotesco, mesquinho, submisso e arrogante,
Que tenho sido enxovalhado e calado,
Que quando não tenho calado, tenho sido mais ridículo ainda;
Eu, que tenho sido cômico às criadas de hotel,
Eu, que tenho sentido o piscar de olhos dos moços de fretes,
Eu, que tenho feito vergonhas financeiras, pedido emprestado sem pagar,
Eu, que, quando a hora do soco surgiu, me tenho agachado
Para fora da possibilidade do soco;
Eu, que tenho sofrido a angústia das pequenas coisas ridículas,
Eu verifico que não tenho par nisto tudo neste mundo.
Toda a gente que eu conheço e que fala comigo
Nunca teve um ato ridículo, nunca sofreu enxovalho,
Nunca foi senão príncipe - todos eles príncipes - na vida...
Quem me dera ouvir de alguém a voz humana
Que confessasse não um pecado, mas uma infâmia;
Que contasse, não uma violência, mas uma cobardia!
Não, são todos o Ideal, se os oiço e me falam.
Quem há neste largo mundo que me confesse que uma vez foi vil?
Ó Príncipes, meus irmãos,
Arre, estou farto de Semideuses!
Onde é que há gente no mundo?
Então sou só eu que é vil e errôneo nesta terra?
Poderão as mulheres não os terem amado,
Podem ter sido traídos - mas ridículos nunca!
E eu, que tenho sido ridículo sem ter sido traído,
Como posso eu falar com os meus superiores sem titubear?
Vil no sentido mesquinho e infame da vileza.
Álvaro de Campos/Fernando Pessoa
9
RESUMO
O Brasil possui grande diversidade genética vegetal. O uso de plantas com
finalidades terapêuticas se perpetuou na história da civilização e chegou até os
nossos dias amplamente difundido. A Schinus terebinthifolius (Raddi), conhecida por
Aroeira, pertence a família Anacardiaceae, de grande plasticidade ecológica
ocorrendo em quase todo o território brasileiro. É um dos espécimes mais utilizados
na medicina popular da região Nordeste do país. Já foram isolados de várias de suas
partes, diversos metabólitos secundários, a exemplo de terpenos, lectinas,
saponinas, taninos, compostos fenólicos, flavonóides e alcalóides. Seus constituintes
químicos exibem amplo espectro de atividades biológicas tais como ação
antibacteriana, antiviral, antifúngica, anti-inflamatória, anticarcinogênica, antihipertensiva e hipolipidêmica. A Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente
etiológico da linfadenite caseosa em caprinos e ovinos, enfermidade de alta
prevalência na região Nordeste do Brasil acarretando danos para o criador através
da desvalorização das peles, perda de peso e óbito do animal. Neste trabalho foram
produzidos extratos aquoso e metanólico obtidos de folhas da Schinus
terebinthifolius (Raddi) e analisados seus efeitos no crescimento in vitro de cepas
virulentas e atenuadas da Corynebacterium pseudotuberculosis e sobre a
proliferação in vitro de esplenócitos de camundongos (Mus musculus). O extrato
metanólico foi testado nas concentrações de 2.000, 1500, 1000, 500, 250, 100 e 10
μg/dL, durante 48 horas. Nas quatro primeiras, houve produção de halos de inibição
do crescimento do microorganismo de diâmetros variados, demonstrando poder
microbicida do extrato da S. terebinthifolius nas concentrações citadas. Os
esplenócitos expostos as concentrações de 100, 200 e 500 μg/dL, durante 24 e 72
horas, apresentaram acentuada proliferação celular. A viabilidade, crescimento e
ativação celular foi estudada pelo método do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5difeniltetrazolio (MTT). Verificamos que a proliferação significativa observada pela
contagem celular foi acompanhada de um bom desempenho pelo teste do MTT,
assim como pela análise da atividade da enzima lactato desidrogenase. A atividade
do compartimento lisossômico, assim como a dosagem de proteínas totais,
demonstrou valores estatisticamente significantes com 24 e 72 horas de exposição
sobre o crescimento celular , principalmente na concentração de 500 μg/dL de fenóis
totais. Ao que parece, o aumento da atividade enzimática lisossômica aconteceu pela
alta proliferação celular desencadeada pelos extratos da aroeira, de modo similar aos
valores encontrados da ação da lactato desidrogenase, bem como a dosagem
protéica. Foram medidos os níveis de IFN-gama, IL-2, IL-12, IL-17 e TNF-alfa e IL-6,
IL-10, IL-13 e não houve diferença significativa entre os tratamentos, tempo ou
linhagem murina. Todos os resultados revelam alta capacidade mitogênica dos
extratos de aroeira com preservação da viabilidade celular.
Palavras-chave: Schinus terebinthifolius, aroeira, fitoterapia, proliferação celular,
Corynebacterium pseudotuberculosis.
10
ABSTRACT
Brazil has high vegetal genetic diversity. The use of plants for therapeutic purposes
has been perpetuated in the history of civilization and even to our days widespread.
The Schinus terebinthifolius (Raddi), popularly known as Aroeira , belongs to the
Anacardiaceae family, has great ecological plasticity occurring in almost all of
Brazilian territory. It is one of most specimens used in folk medicine in the Northeast
of the country. Several secondary metabolites have been isolated from its parts, such
as terpenes, lectins, saponins, tannins, phenolic compounds, alkaloids and
flavonoids. Its chemical constituents exhibit broad spectrum of biological activities
such as antibacterial, antiviral, antifungal, anti-inflammatory, anticarcinogenic,
antihypertensive and hypolipidemic. The Corynebacterium pseudotuberculosis is the
etiologic agent of the caseous lymphadenitis in goat and sheep, with high prevalence
at the Brazilian north-eastern and which causes damage to the creator through the
devaluation of skins, weight loss and death of the animal. This work evaluated the
effects of aqueous and methanolic extracts from leaves of aroeira plant (Schinus
terebinthifolius, Raddi) on the in vitro growth of virulent and attenuated strains of
Corynebacterium pseudotuberculosis and on the in vitro proliferation of splenocytes
from mice exposed to different concentrations and time. The methanolic extract was
tested in the concentrations of 2.000, 1.500, 1.000, 500, 250, 100 and 10 μg/dL,
during 48 hours. The four first concentrations have inhibited the bacterium growth,
producing halos of decreasing diameters. The others ones did not have such effect.
The results demonstrate that the growth of the bacillus was inhibited by the extract of
the S. terebinthifolius on the cited concentrations. The splenocytes exposed to
concentrations of 100, 200 and 500 mg / dL for 24 and 72 hours, showed marked cell
proliferation. The viability, growth and cell activation was studied by the method of
bromide 3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difeniltetrazolio (MTT). We found that the
observed significant proliferation by cell count was accompanied by a good
performance by the MTT test, as well by the analysis of activity of the enzyme lactate
dehydrogenase.The activity of the lysosomal compartment, as well as determination
of total protein, showed statistically significant values at 24 and 72 hours of exposure
on cell growth, especially at a concentration of 500 mg / dL of total phenols. It seems
that the increased lysosomal enzyme activity occurred by high cell proliferation
triggered by the extracts of the plant, similar to the values found from the action of
lactate dehydrogenase, as well as determination of protein. They measured levels of
IFN-gamma, IL-2, IL-12, IL-17 and TNF-alpha and IL-6, IL-10, IL-13 and there was no
significant difference between treatments, time or murine strain. The results showed
high mitogenic capacity of the plant extract with preservation of cell viability.
Keywords: Schinus terebinthifolius, phytotherapy, cell proliferation, Corynebacterium
pseudotuberculosis.
11
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 01
Efeito do extrato metanólico de aroeira sobre bactérias da cepa atenuada T1.
Figura 02
Ação do extrato metanólico de aroeira sobre bactérias da cepa virulenta VD57.
Tabela 1
Valores das médias e desvios-padrões dos testes de susceptibilidade após exposição das duas cepas da
Corynebacterium pseudotuberculosis, durante 48h ao extrato metanólico da aroeira (Schinus terebinthifolius, Raddi). 69
Figura 03
Figura 04
Figura 05
Tabela 02
68
69
Contagem de esplenócitos murinos da linhagem BALB/c após 24 e 72 horas de exposição aos extratos aquoso e
metanólico da Schinus terenbintifolius, Raddi (Aroeira). Cont Neg – controle negativo; Cont Pos – controle positivo; A
71
100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato aquoso; M 100, M 200, M 500 –
concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
Contagem de esplenócitos murinos da linhagem CBA após 24 e 72 horas de exposição aos extratos aquoso e
72
metanólico da Schinus terebinthifolius, Raddi (Aroeira).
Curva de crescimento celular de esplenócitos de camundongos da linhagem isogênica BALB/c após 24 e 72 horas
75
de exposição aos extratos aquoso e metanólico da Schinus terebinthifolius, Raddi (Aroeira).
Estudo do ciclo celular de esplenócitos murinos após exp. 24h ext. aquoso da S. terebinthifolius (Raddi).
76
Tabela 03
Estudo do ciclo celular de esplenócitos murinos sem exposição aos extratos da S. terebinthifolius (Raddi).
Figura 06
Histograma - controle com células de baço de camundongo CBA sem exposição aos extratos da Schinus
77
terebinthifolius, Raddi (Aroeira) e após 24 horas de cultivo. Células contadas versus intensidade de fluorescência.
Histograma - esplenócitos de camundongo, após exposição, durante 24 horas, à concentração de 500 μg/dL do
77
extrato aquoso da Schinus terebinthifolius, Raddi (Aroeira). Células contadas versus intensidade de fluorescência.
Ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT)
Cont Neg – controle negativo; Cont Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em 79
μg/dL do extrato aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
Figura 07
Figura 08
Figura 09
Figura 10
Figura 11
Figura I
(apêndice)
76
Dosagem da atividade da enzima lactato desidrogenase.
Cont Neg – controle negativo; Cont Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em 80
μg/dL do extrato aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
Efeito das diferentes concentrações de plifenóis contidos nos extratos aquoso e metanólico da aroeira sobre a
atividade lisossômica de esplenócitos murinos.
82
Cont Neg – controle negativo; Cont Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em
μg/dL do extrato aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
Quantificação das proteínas totais.
Cont Neg – controle negativo; Cont Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em 83
μg/dL do extrato aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
Estruturas dos fluorocromos ficoeritrina (PE) e 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC).
107
12
Figura II
(apêndice)
Figura III
(apêndice)
Estruturas dos polifenóis apigenina, quercetina e eriodictiol.
107
Citometria de fluxo: nas três primeiras imagens observamos esplenócitos de camundongos expostos ao extrato
metanólico da aroeira sem marcação com anticorpos monoclonais conjugados aos fluorocromos. Na última, temos
células de baço murino sem terem sido expostas ao extrato e marcadas com os monoclonais conjugados aos 108
fluorocromos. Distingue-se facilmente as populações de linfócitos T CD3, CD4 e células que não pertencem a
nenhum dos grupos descritos
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
API Coryne
BHI
Célula NK
D.O.
ELISA
LDH
Th1
Th2
IFN-γ
IL-2
IL-3
IL-4
IL-12
IL-17
TNF-α
IL-6
IL-10
IL-13
kDa
M
PBS
pH
PLD
PWM
MHC
T CD4
T CD8
Kit para identificação bioquímica de bactérias
Infusão de cérebro-coração (Brain- Heart Infusion)
Célula Matadora Natural (Natural Killer)
Densidade óptica
Ensaio imunoenzimático (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)
Lactato desidrogenase
Linfócito ou célula T de perfil tipo 1 (T helper cell 1)
Linfócito ou célula T de perfil tipo 2 (T helper cell 2)
Interferon gama
Interleucina 2
Interleucina 3
Interleucina 4
Interleucina 12
Interleucina 17
Fator de necrose tumoral alfa (Tumor Necrosis Factor)
Interleucina 16
Interleucina 10
Interleucina 13
Quilo Dalton (Kilo Dalton)
Molar
Tampão salina fosfato (Phosphate Buffer Saline)
Potencial hidrogeniônico
Fosfolipase D
Pokeweed
Complexo Principal de Histocompatibilidade
Linfócito ou célula T CD4+
Linfócito ou célula T CD8+
13
SUMÁRIO
01. INTRODUÇÃO
15
02. REVISÃO DE LITERATURA
17
2.1. Plantas medicinais
17
2.2. Farmacognosia e fitoterapia
20
2.3. Etnofarmacologia
22
2.4. A flora brasileira
24
2.5. Os princípios ativos de plantas medicinais
25
2.6. A planta, Schinus terebinthifolius, Raddi.
35
2.6.1. A aroeira e sua utilização no Brasil
41
2.6.2. . Compostos ativos extraídos da Schinus terebinthifolius, Raddi.
45
2.7. A resposta imune
49
2.8. A Corynebacterium pseudotuberculosis e a linfadenite caseosa
54
03. JUSTIFICATIVA
59
04. HIPÓTESE
60
05. OBJETIVOS
61
5.1. Objetivo geral
61
5.2. Objetivos específicos
61
06. MATERIAL E MÉTODOS
62
6.1. Obtenção dos extratos de Schinus terebinthifolius (Raddi)
62
6.2. Cultivo do bacilo Corynebacterium pseudotuberculosis
63
6.3. Cultivo de esplenócitos murinos
64
14
6.4. Curva de crescimento
64
6.5. Estudo do ciclo celular
65
6.6. Teste do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)
65
6.7. Dosagem da lactato desidrogenase (LDH)
66
6.8. Determinação da atividade lisossômica
66
6.9. Dosagem de proteínas totais
66
6.10. Quantificação de citocinas.
66
07. RESULTADOS E DISCUSSÃO
68
08. CONSIDERAÇÕES FINAIS
86
09. REFERÊNCIAS
87
10. APÊNDICE
106
10.1. Autofluorescência
106
15
01. INTRODUÇÃO
O uso de espécies vegetais com fins de tratamento e cura de doenças se
perpetuou na história da civilização e chegou até os nossos dias, sendo amplamente
utilizado por grande parte da população mundial. Dados da Organização Mundial da
Saúde (OMS) mostram que 80% da população mundial já usaram algum tipo de
erva, na busca de alívio de alguma sintomatologia desagradável (CORRÊA et al.,
2008). O número de fitomedicamentos vem aumentando em todo o mundo e essa é
a realidade também no Brasil. Inúmeras plantas têm sido a opção terapêutica para
uma parcela crescente da população brasileira, rural e urbana.
Os vegetais produzem uma grande variedade de compostos químicos, dentre
eles, terpenos, lectinas, saponinas, compostos fenólicos, flavonóides e alcalóides.
Seus princípios ativos exibem amplo espectro de atividades biológicas, dentre elas:
ação
anticarcinogênica,
antibacteriana,
antiviral,
antifúngica,
antiinflamatória,
antiulcerogênica, anti-hipertensiva e hipolipidêmica (QUEIRES & RODRIGUES,
1998; AHERNE, O’BRIEN, 1999; DJURIC et al., 2001; JOHANN et al., 2010).
A aroeira (Schinus terebinthifolius, Raddi) pertence à família Anacardiaceae e
pode ser encontrada em quase todo o território nacional. São atribuídas inúmeras
qualidades medicinais à planta (BAGGIO, 1988). Segundo QUEIRES & RODRIGUES
(1998) a S. terebinthifolius (Raddi) é uma excelente fonte de polifenóis, isolados na
forma de extrato aquoso, com potencial para emprego terapêutico de doenças
microbianas, parasitárias e tumorais em humanos, animais e plantas.
16
A criação de caprinos e ovinos é uma das principais atividades econômicas de
pequenos produtores, principalmente na região Nordeste do Brasil. Esta atividade é
muito afetada pela linfadenite caseosa, popularmente conhecida como “mal do
caroço”, de grande prevalência em caprinos na Bahia, acarretando danos para o
criador através da desvalorização das peles, do emagrecimento do animal, podendo
levá-lo ao óbito. O prejuízo causado no estado da Bahia é avaliado em cerca de
quatro milhões de reais por ano. Devido à importância financeira da caprinocultura
regional, esta patologia tem sido alvo de muitos estudos e revisões por parte de
diversos autores (DORELLA et al., 2006).
No presente estudo buscou-se produzir extratos aquoso e metanólico da S.
terebinthifolius
(Raddi)
e
analisar
seus
efeitos
em
duas
linhagens
de
Corynebacterium pseudotuberculosis e sobre a proliferação de esplenócitos in vitro
de camundongos (Mus musculus).
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas dispostas
na Lei Nº 11.794, de 08 de outubro de 2008 e regulamentada pelo Decreto Nº 6.899,
de 15 de julho de 2009. O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de
Ética no Uso de Animais (CEUA) da Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública,
processo nº 05/09.
17
02. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Plantas medicinais
Os produtos naturais são utilizados pela humanidade, desde tempos remotos,
procurando alívio e cura de doenças pela ingestão de raízes, folhas ou ervas inteiras.
É provável que o emprego de plantas como medicamento seja tão antigo quanto a
própria espécie humana. Arqueólogos encontraram partes de plantas tidas como
medicinais em túmulos pré-históricos (período que antecede a invenção da escrita e
que ocorreu aproximadamente em 4.000 a.C.). Estudos realizados na Tanzânia, com
chimpanzés, mostraram que estes ingeriam folhas de certas plantas, em jejum, para
se livrarem de vermes intestinais (MIGUEL & MIGUEL, 2000). O ser humano obtém
do reino vegetal, além de alimentos, matéria-prima para construção de habitações,
utensílios para ataque e defesa, objetos de manifestações religiosas e culturais e
substâncias que visam a melhoria da saúde, entre outros.
Durante o desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental verificou-se
exemplos da utilização de recursos naturais na medicina, no controle de pragas e em
mecanismos de defesa, merecendo destaque as civilizações Egípcia, Greco-romana
e Chinesa. A medicina tradicional chinesa se desenvolveu de maneira tão
significativa e eficaz que até hoje muitas espécies e preparados vegetais medicinais
são estudados objetivando a compreensão do mecanismo de ação e isolamento dos
princípios ativos (VIEGAS et al., 2006)
Muitos venenos também foram descobertos no reino vegetal e utilizados para
defesa, caça ou na execução de prisioneiros e suicídios, a exemplo do filósofo
18
Sócrates, que ingeriu bebida preparada a base de cicuta contendo o alcalóide
coniína, denominado “veneno de Hemlock” (Conium maculatum) na Antiga Grécia,
em 399 a.C. Lívia, a esposa do Imperador Romano Augusto, eliminava seus
adversários políticos oferecendo banquetes e adicionava aos alimentos beladona,
fonte do alcalóide atropina. A Rainha Cleópatra utilizava extratos de Hyoscianus
níger, fonte de atropina, para dilatar suas pupilas e parecer mais sedutora aos seus
rivais na corte (SIMÕES et al., 2003).
O estudo das plantas medicinais estagnou-se por um longo período na Idade
Média, onde a ascensão do Império Romano e o fortalecimento da Igreja Católica
desempenharam forte influencia sobre o conhecimento existente na época, inclusive
o de plantas. Os trabalhos dos filósofos gregos foram perdidos ou esquecidos, para
serem parcialmente recuperados somente no início do século XVI (PHILLIPSON,
2001). Alguns mosteiros europeus mantiveram viva a literatura medicinal, mas fora
desses locais, propagava o folclore com rituais de cura místicos. Durante seu
processo de evolução, a arte de curar recebeu enorme impulso dos alquimistas,
dentre os quais, se destacava Paracelso que lançou as bases da medicina natural e
foi um dos principais responsáveis pelo avanço da terapêutica no século XVI.
(CORRÊA et al., 2008). No fim do século XVIII, a análise de plantas medicinais se
fortaleceu com a consolidação da Química como ciência moderna, e os princípios
ativos passaram a ser isolados dos vegetais. Estabelecia-se então, o paradigma
ocidental, que apenas um único composto ativo apresenta os efeitos farmacológicos
definidos (YUNES & CALIXTO, 2001).
19
As plantas medicinais são utilizadas pela medicina atual (fitoterapia) e suas
propriedades são estudadas em laboratórios de pesquisa de Universidades ou em
empresas farmacêuticas, a fim de isolar o princípio ativo e assim, produzir novos
fármacos. Alguns exemplos são: camomila, Camellia sinensis (chá verde), boldo-dochile, alecrim, alho, arnica, arruda, cânfora, capim-limão, carqueja, erva-cidreira,
funcho, gengibre, ginseng, hortelã, jaborandi, jojoba, louro, malva, salsa, sálvia,
estévia e urucum.
As plantas, no universo das religiões de influência africana, apresentam
grande valor por serem utilizadas para propósitos ritualísticos, indispensáveis ao
funcionamento dos cultos, a “liturgia das folhas”, além do uso medicinal e ornamental
pelas comunidades dos terreiros (VERGER, 1995; PIRES et al., 2009).
YUNES et al., (2001) analisaram a necessidade de uma política nacional
definida e comprometida com o desenvolvimento da indústria farmacêutica de
fitoterápicos. SIMÕES & SCHENKEL (2002) observaram aumento do interesse na
imprensa nacional quanto às potencialidades de exploração da biodiversidade
brasileira. Após uma série de sugestões apresentadas por diferentes segmentos da
sociedade foi estabelecida uma legislação para a área de fitoterápicos com a Portaria
nº 06 do Serviço de Vigilância Sanitária, de 31/01/1995. Apesar disso, os autores
percebem dificuldades de interação universidade/empresa. Dentre os objetivos dessa
aproximação, destacam-se um aumento da geração de empregos, incluindo a mãode-obra qualificada originada das pós-graduações e a formação de uma nova
mentalidade
que
estabeleceria
o
uso
sustentável
dos
recursos
naturais
20
proporcionando desenvolvimento sócio-econômico aliado ao indispensável respeito
aos ecossistemas do país.
Segundo TOMAZZONI et al., (2006), o emprego de plantas com fins
terapêuticos, sem orientação apropriada, é fator de preocupação que deve ser
considerado por profissionais do setor de saúde, bem como aqueles envolvidos na
educação para a saúde, devido a incidência de espécies com registro de toxicidade e
contra-indicações de uso.
Assim como as plantas são remédios eficazes, o risco de intoxicação causada
pela sua utilização inadequada deve ser sempre levado em consideração. A
sociedade e as instituições governamentais apóiam a fitoterapia por considerá-la
uma prática de medicina tradicional. Contudo, seu uso requer a identificação e a
classificação botânica correta para evitar erros relacionados aos princípios ativos,
que podem alternar de planta a planta em função da biodiversidade, do código
genético, das condições climáticas, mudanças sazonais, além de fatores como índice
pluviométrico, luminosidade e condições do solo (VALE, 2002; FRANÇA et al., 2008;
FUKUMASU et al., 2008).
2.2. Farmacognosia e fitoterapia
A farmacognosia é um dos mais antigos ramos da farmacologia e tem como
alvo os princípios ativos naturais, sejam animais ou vegetais. O termo deriva de duas
palavras gregas [pharmakon] ou droga e [gnosis] ou conhecimento. Pode ser definida
como o estudo do uso, da produção, da história, do armazenamento e
comercialização, além da identificação, avaliação e isolamento de princípios ativos,
21
inativos ou derivados de vegetais e animais. É dividida em fitoterapia, ramo que
utiliza drogas de origem vegetal para o tratamento de doenças, e a opoterapia, onde
se manipula substâncias de origem animal para a mesma finalidade (SIMÕES et al.,
2003)
Pedáneo Dioscórides, médico e escritor grego-romano, é
considerado o
fundador da farmacognosia através de sua obra De materia medica, a principal fonte
de informação sobre drogas medicinais desde o século I até o século XVIII. De
materia medica possui cinco livros onde são descritas cerca de 600 plantas, 35
fármacos de origem animal e 90 de origem mineral, dos quais só cerca de 130 já
apareciam no Corpus hippocraticum, o conjunto das obras atribuídas a Hipócrates, e
100 ainda são considerados como tendo atividade farmacológica. A sua influência foi
enorme até o século XVIII, existindo inúmeras traduções do grego para um grande
número de línguas. A obra de
Dioscórides possui essencialmente um caráter
empírico porém, ele procurou desenvolver um método para observar e classificar os
fármacos, testando-os clinicamente. Durante o Renascimento, a coleção despertou
renovado interesse e estudos por vários autores. A versão latina da De materia
medica foi impressa em 1478 (RIDDLE, 1985).
JAKI et al., (2008) exploraram a variabilidade de respostas biológicas pela
perspectiva de pureza de amostra. Eles analisaram a atividade do triterpeno ácido
ursólico contra o Mycobacterium pseudotuberculosis e observaram que o aumento
do grau de pureza do composto anulava sua atividade antibacteriana. Desse modo,
introduziram o conceito recente de relação pureza/atividade de produtos naturais
22
para aperfeiçoar as descobertas de novas drogas e investigar a sinergia de
compostos considerados não puros.
2.3. Etnofarmacologia
Etnofarmacologia é a ciência que estuda o conhecimento popular sobre
fármacos de determinado grupo étnico ou social, relacionado a sistemas tradicionais
de medicina. É a principal estratégia para o desenvolvimento de novas drogas a
partir de plantas, onde são examinadas as informações e propriedades alegadas
pela população usuária.
O profundo conhecimento do arsenal químico da natureza, pelos povos
primitivos e indígenas pode ser considerado fator fundamental para descobrimento
de substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo. A convivência e o
aprendizado com os mais diferentes grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições
para o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais, do conhecimento da
relação íntima entre a estrutura química de um determinado composto e suas
propriedades biológicas e das inter-relações animais/plantas. Neste sentido, a
natureza forneceu muitos modelos moleculares que fundamentaram estudos de
relação estrutura-atividade e inspiraram o desenvolvimento da síntese orgânica
clássica. Vários são os exemplos que poderiam ilustrar este extenso e fascinante
assunto (VIEGAS et al., 2006).
De acordo com HOSTETTMANN et al.,(2003), os curares eram drogas obtidas
de diversas espécies de Strychnos e Chondodendron americanas e africanas
utilizadas pelos índios para produzir flechas envenenadas para caça, pesca e
23
guerras. A primeira planta de curare identificada foi coletada no Suriname e descrita,
em 1783 por Schreber, como Toxicaria americana, tendo sido posteriormente
classificada como Strychnos guianensis. Somente no século XIX, Boehm isolou o
principal constituinte ativo do curare americano (Chondrodendron tomentosum), o
alcalóide tubocurarina. O curare foi também responsável pelo início dos estudos
sobre a relação entre estrutura química e atividade biológica (SAR) tendo sido, nesta
área, o primeiro trabalho publicado sobre SAR em Química Farmacêutica, datado de
1869.
Outro exemplo marcante de produtos naturais que causaram grande impacto
na humanidade, e que de certa forma modificou o comportamento do homem
moderno, foi a descoberta das substâncias alucinógenas. Os povos antigos
utilizavam largamente rapés e bebidas psicotrópicas em práticas religiosas e
mágicas. A morfina é um alcalóide natural extraído da planta Papaver somniferum,
vulgarmente designada “Papoila do Oriente”, e o ópio é o suco obtido do bulbo da
planta. Os Sumerianos, uma das civilizações mais antigas que se tem conhecimento,
já utilizavam a flor da papoila para preparar o ópio, há cerca de 4.000 anos a.C.
Existem relatos na mitologia grega atribuindo ao ópio o simbolismo de Morfeu, o
deus do sonho. As primeiras referências ao uso do ópio já se encontravam nos
escritos de Teofrasto, filósofo grego, no século III a.C. e Homero indica o seu uso por
Helena de Tróia, não só para anular as dores, como também para melhorar o humor
(KLOCKGETHER-RADKE, 2002; NORN et al., 2005). Em 1803, François Derosne
descreveu o "sal de ópio", iniciando os primeiros estudos sobre a constituição
química desta substância. No ano seguinte na França, Armand Séguin isolou o seu
24
constituinte majoritário, a morfina, e Sertürner publicou seus trabalhos sobre o
principium somniferum, tendo sido os pioneiros na busca pela utilização de
substâncias naturais na forma pura. O ópio também produz outros alcalóides com
propriedades biológicas como a codeína (antitussígeno), a tebaína (antagonista da
morfina), a narcotina (antitussígeno e espasmolítico) e a papaverina (espasmolítico).
A grande eficácia da morfina como analgésico foi reconhecida após a invenção da
seringa hipodérmica (1853) e foi largamente utilizada pelas tropas dos Estados
Unidos durante a Guerra de Secessão, entre 1861 e 1865 (HOSTETTMANN et al.,
2003; DUARTE, 2005).
2.4. A flora brasileira
O Brasil possui grande diversidade genética vegetal, contando com mais de
55.000 espécies catalogadas, de um total mundial estimado aproximadamnente em
550.000. Cerca de dois terços destas espécies se encontram nos trópicos, e calculase que o Brasil detenha cerca de 75% de todas as espécies florestais nas suas duas
principais formações, a Floresta Tropical Atlântica e a Floresta Amazônica (GUERRA
et al., 1998).
A história do Brasil está intimamente ligada ao comércio de produtos naturais,
as especiarias, os quais determinaram as várias disputas de posse da nova terra e,
por fim, a colonização portuguesa. Além dos remédios naturais usados na
terapêutica médica, é preciso mencionar o corante de cor vermelha extraído da
árvore do pau-brasil (Caesalpinia echinata), o principal produto de exportação da
colônia durante mais de dois séculos. O produto era utilizado para tingimento de
25
roupas e como tinta de escrever, propriedades que já eram conhecidas e utilizadas
nas Índias Orientais desde a Idade Média. Até o final do século XIX somente os
corantes naturais eram disponíveis, tornando estes produtos valiosos e de enorme
interesse dos colonizadores. Neste sentido, além do pau-brasil, que foi extraído de
forma predatória do nosso território até quase sua extinção, muitos outros produtos
despertaram interesse por parte dos europeus que aportaram na terra recémdescoberta. A morina obtida de Chlorophora tinctoria, foi outro corante natural
exportado para a Europa, permanecendo em destaque no comércio até o
desenvolvimento da química das anilinas na Alemanha e, até hoje, é utilizada como
indicador de açúcares em cromatografia em camada delgada (PINTO et al., 2002).
Os índios da bacia Amazônica usavam a planta curare, Strychnos toxifera, donde se
extrai a tubocurarina, no preparo de flechas e dardos envenenados empregados para
caça e em tempos de guerra (VIEGAS et al., 2006).
Em um país biologicamente rico, pesquisas com plantas medicinais devem ser
incentivadas, pois elas podem levar à reorganização das estruturas de uso dos
recursos naturais e à elevação do produto interno bruto (PIB), visto que há grande
tendência mundial de aumento na utilização de fitoterápicos (BRASIL, 1998;
GUARIM-NETO & MORAIS, 2003).
2.5. Os princípios ativos de plantas medicinais
As plantas produzem uma grande variedade de compostos químicos, os quais
são divididos em dois grupos, metabólitos primários e secundários. O metabolismo
primário é considerado como uma serie de processos envolvidos na manutenção
26
fundamental da sobrevivência e do desenvolvimento, enquanto o metabolismo
secundário consiste num sistema com importante função para a sobrevivência e
competição no ambiente. Plantas elaboram uma grande variedade de produtos e
muitos deles estão envolvidos em conferir vantagens seletivas contra ataques
microbianos. Avanços na tecnologia molecular conduzem ao melhor entendimento
dos mecanismos enzimáticos envolvidos nas complexas vias de biossíntese desses
produtos. A engenharia das vias metabólicas dos produtos naturais tornou-se uma
estratégia para aumentar a resistência da planta às doenças (DIXON, 2001).
Os produtos do metabolismo primário são essencialmente sacarídeos
formados pela fotossíntese. Os metabólitos secundários são compostos químicos
não necessários para a existência imediata da célula, mas servem como vantagem
evolucionária para a sua sobrevivência e reprodução. Eles cumprem variadas
funções como, por exemplo, atrair insetos para transferir-lhes o pólen ou a animais
para que estes possam consumir seus frutos e assim disseminar as sementes;
podem
agir
como
pesticidas
naturais
de
defesa
contra
herbívoros
ou
microorganismos patogênicos, além de agentes alelopáticos, responsáveis por
favorecer a competição com outros vegetais. Estes compostos também são
sintetizados em resposta a dano teciduais, proteção para a luz ultravioleta e outros
agentes físicos agressivos. Além disso, os produtos secundários das plantas
compreendem substâncias possuidoras de aplicabilidade em animais e seres
humanos devido aos efeitos terapêuticos. Aproximadamente 100.000 metabólitos já
são conhecidos, com cerca de 4.000 novos que estão sendo descobertos a cada ano
(VERPOORTE, 2000).
27
Os três grupos de metabólitos secundários mais importantes em plantas são
os terpenos, os compostos fenólicos e os alcalóides. Terpenos são compostos
orgânicos, voláteis, derivados de uma unidade de cinco átomos de carbono, o
isopreno (2-metil-1-3 butadieno). A maioria contém 10,15, 20 ou 30 átomos de
carbono e estão bastante presentes nos óleos essenciais, a exemplo de limoneno
(obtido do óleo de limão ou laranja), selineno (do aipo), o pineno (do óleo de
terebentina) e carotenos, presentes em quase todas as plantas verdes que podem
ser convertidos em vitamina A no organismo humano (CARLO et al., 1999).
Os compostos fenólicos representam uma grande variedade de substâncias
químicas que possuem um ou mais grupos fenólicos. Polifenóis são caracterizados
por várias hidroxilas ligadas a um anel aromático, sendo mais ácidos que os alcoois
e mais facilmente oxidado. Normalmente são sólidos, cristalinos, tóxicos, cáusticos e
pouco solúveis em água (CORRÊA et al., 2008).
Os polifenoís constituem uma importante classe de moléculas amplamente
presentes no reino vegetal. Sintetizados como mecanismo de defesa dos vegetais,
protege os frutos contra os efeitos deletérios causados pela radiação ultravioleta e
infecções microbianas. Entre os polifenóis, o grupo dos flavonóides ou bioflavonóides
compreende aproximadamente 4.000 compostos fenólicos, de baixo peso molecular,
encontrados em plantas vasculadas que geram a coloração de muitos frutos, flores e
folhas. Participam da dieta humana como constituintes do vinho, suco de frutas, chá,
café e todos os componentes de origem vegetal, em proporções que chegam a
alcançar 1g nas 24 horas (CARLO et al., 1999; HAVSTEEN, 2002).
28
Segundo RODRIGUES (2004), em 1936, Szent-Györgyi e Rusznyák extraíram
do pimentão e limão, uma substância cristalina, de cor amarela, muito eficaz na
contenção de determinadas hemorragias capilares, tanto no homem como na cobaia.
A partir dessas observações, a citrina (isolada do limão), a rutina (do trigo) e a
esculina (da castanha), apigenina, quercetina, quercitrina, mircetina e outros. Os
flavonóides, foram agrupados como vitaminas P, cuja designação deriva de
“permeabilidade capilar”. Caracterizam-se por conterem um núcleo trimérico
heterocíclico com dois anéis benzênicos, conectados por uma cadeia de três átomos
de carbono e uma ponte de oxigênio. (QUEIRES & RODRIGUES, 1998; JOHANN et
al., 2010).
Alcalóides são substâncias básicas nitrogenadas, de origem vegetal, pouco
solúveis em água e dotados de uma estrutura complexa onde os átomos de
nitrogênio são parte de um anel heterocíclico da molécula. Morfina, nicotina e
atropina são exemplos de alcalóides usados com fins terapêuticos (UCKO, 1992;
CARLO et al., 1999; HAVSTEEN, 2002; RODRIGUES, 2004).
COSTA et al., (2007) revisaram os resultados fitoquímicos e farmacológicos
realizados com o diterpeno trans-desidrocrotonina (DCTN) isolado da Croton
cajucara. No estado do Pará, as folhas e cascas do caule desta planta são utilizadas
na forma de chá ou pílula, no combate a diabetes, diarréia, malária, febre, problemas
estomacais, inflamação do fígado, rins, vesícula e no controle de índices elevados de
colesterol. Estudos isolaram os diterpenos trans-desidrocrotonina (DCTN), transcrotonina (CTN), cis-cajucarina B, trans-cajucarina B, cajucarina A, cajucarinolida,
isocajucarinolida, isosacacarina e o triterpeno ácido acetilaleuritólico. A partir do
29
metabólito secundário mais importante, o DCTN, foram descritas atividades
hipoglicêmica, antigenotóxica (envolvendo mutações e desenvolvimento de câncer),
hipolipidêmica, antiulcerogênica, antiinflamatória, antiestrogênica e sobre o sistema
cardiovascular.
Existem metabólitos secundários que têm estruturas ou origem similar aos
primários, exercendo funções semelhantes, como por exemplo, o ácido caurenóico e
o ácido abiético, ambos formados por uma seqüência de reações enzimáticas
semelhantes. O ácido caurenóico é considerado um metabólico primário porque é um
intermediário essencial na síntese de giberelinas (hormônio); o ácido abiético é um
componente da resina de alguns grupos de Fabaceae e Pinaceae, sendo portanto
um metabólito secundário. A lignina é um polímero estrutural essencial da madeira e
é o segundo composto mais abundante nas plantas depois da celulose, considerado
mais um metabólito secundário que primário, pois para as plantas não vasculares, a
lignina não é um composto essencial na sua sobrevivência (DIXON, 2001; ZHOU et
al., 2008).
Os taninos são compostos fenólicos do metabolismo secundário vegetal. São
responsáveis pela adstringência das plantas. Dividem-se em dois grupos, as
proantocianidinas, que são os taninos condensados, responsáveis pela adstringência
e precipitação de proteínas e os taninos hidrolisáveis. São bastante empregados na
medicina tradicional no tratamento de feridas, queimaduras e inflamações (FUNARI
& FERRO, 2006).
Os hormônios são compostos orgânicos que promovem, inibem ou modificam
os processos fisiológicos de um organismo, tais como crescimento, diferenciação e
30
desenvolvimento. O ergosterol é a molécula precursora dos esteróides vegetais, que
estruturalmente
são
perhidrofenantreno.
isoprenóides
O
cíclicos
com
brassinoesteróide, entre
um
anel
do
outras funções,
ciclopentano
promove
o
alongamento do caule (ALMEIDA, 1993).
As saponinas são glicosídeos de esteróides ou terpenos policíclicos, que
estruturalmente possuem uma parte lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra
hidrofílica (carboidratos), que determina a propriedade de redução da tensão
superficial da água, característica de sua ação emulsificante. A palavra saponina
provém do fato de liberarem espuma quando misturadas com água à semelhança do
sabão. A capacidade das saponinas de interagir com esteróis, presentes na
membrana plasmática de eritrócitos, aumenta a permeabilidade da membrana,
permitindo a entrada de íons e água para o interior das células resultando na ruptura
das mesmas e liberação de hemoglobina. As propriedades tensoativa e hemolítica
não são comuns a todas as saponinas e, portanto, não podem ser usadas para
definir esse grupo de compostos (KARABALIEV & KOCHEV, 2003; SIMÕES et al.,
2003).
Resina é uma secreção formada especialmente em canais de algumas
plantas. As resinas cicatrizam feridas da planta, matam insetos e fungos, e permitem
que a planta elimine acetatos desnecessários. As que são obtidas de exudações
naturais são formadas por diferentes ácidos, chamados “ácidos da resina”, que se
dissolvem em solução alcalina formando "sabões de resina". Estão relacionadas aos
terpenos, com os quais ocorrem nas plantas e dos quais são produtos da oxidação.
As resinas, quando flexíveis, são conhecidas como "óleo-resinas", e quando contêm
31
ácido benzóico são chamadas bálsamos. Outros produtos resinosos estão em suas
condições naturais misturadas com a goma ou substâncias mucilaginosas e
conhecidas como resinas de goma. A concepção geral de uma resina é um corpo
não cristalino, insolúvel na água e solúvel em álcool, óleos essenciais e éter. Uma
resina típica é uma massa translúcida, de cor amarela fraca ou marrom, nãoperfumada ou tendo somente um odor ligeiro de terebentina. As que são
transparentes e duras (copals, dammars, mastic e sandarach) são usadas
principalmente para vernizes e cimento; enquanto as mais macias e flexíveis
(terebentina, copaíba) e as resinas de goma que contêm óleos essenciais
(assafétida, gamboge, mirra e escamônio) são usadas para finalidades terapêuticas
e incenso (ALMEIDA, 1993;
SIMÕES et al, 2003; CORRÊA, 2008; LORENZI &
ABREU MATOS, 2008).
No passado, os químicos estudavam plantas consagradas pelo uso popular,
geralmente incorporadas à farmacopéia da época. Devido à importância das plantas,
a Química e a Medicina passaram a ter uma estreita relação, o que permitiu um
rápido desenvolvimento de seus campos específicos. Desta forma, muitas
substâncias ativas foram conhecidas e introduzidas na terapêutica, permanecendo
até hoje como medicamentos. O avanço em importância da ciência e da tecnologia
trouxe profundas mudanças sociais e comerciais, culminando com a Revolução
Industrial, ocorrida no século XIX (HOSTETTMANN et al., 2003).
Talvez o marco mais importante para o desenvolvimento dos fármacos a partir
de produtos naturais de plantas tenha sido o descobrimento dos salicilatos obtidos do
salgueiro (Salix alba). Em 1757, o reverendo Edward Stone provou o sabor amargo
32
das cascas do salgueiro e associou-o ao sabor dos extratos de Cinchona. Este fato
aguçou sua curiosidade e imaginação, e o levou a comunicar o fato a Real
Sociedade, seis anos mais tarde, os resultados de suas observações clínicas
mostrando as propriedades analgésicas e antipiréticas do extrato daquela planta.
Cinqüenta anos mais tarde, França e Alemanha rivalizavam-se na busca pelo
princípio ativo do S. alba e, em 1828, no Instituto de Farmacologia de Munique,
Johann Buchner isolou uma pequena quantidade de salicina. Vários outros cientistas
empenharam-se em melhorar os rendimentos e a qualidade da salicina obtida do
extrato natural até que, em 1860, Hermann Kolbe e seus alunos sintetizaram o ácido
salicílico e seu sal sódico a partir do fenol; em 1874, Friedrich von Heyden, um de
seus alunos, estabeleceu a primeira grande fábrica destinada à produção de
salicilatos (WEISSMANN, 1991; YUNES & CALIXTO, 2001).
Em 1898, Felix Hofmann pesquisando a cura para a artrite que afligia seu pai,
que era sensível aos efeitos colaterais do salicilato de sódio, descobriu o ácido acetilsalicílico (AAS) menos ácido que o ácido salicílico, mas mantendo a propriedade
analgésica desejada (VIEGAS, et al., 2006). As propriedades terapêuticas do AAS
levaram os laboratórios de pesquisa da Bayer a elegerem o AAS como um novo
produto a ser lançado no mercado para competir com os salicilatos naturais, o que
ocorreu a partir de 1897 sob o nome de Aspirina. Após mais de 100 anos de sua
descoberta, o AAS continua sendo alvo de inúmeras pesquisas sobre sua aplicação
terapêutica como analgésico e antiinflamatório, atuando no controle da febre, na
artrite reumatóide e na inibição da agregação plaquetária (JACK, 1997; YUNES &
CALIXTO, 2001).
33
Outro exemplo significativo do uso de plantas para a produção de fármacos é
representado pelo trabalho de Russel E. Marker, que em 1937 sintetizou
progesterona a partir de saponinas isoladas de um cactus mexicano popularmente
denominado “cabeza de negro” (Dioscorea macrostachya, Benth), que contém
diosgenina (LEHMANN et al.,1973). Esta pesquisa colaborou na descoberta
subseqüente da pílula contraceptiva feminina.
MASQUELIER (1959) já citava que componentes fenólicos presentes em uvas
e no vinho eram responsáveis pelos seus efeitos antimicrobianos. PUUPPONENPIMIÄ et al., (2001), testaram as propriedades antimicrobianas de compostos
fenólicos isolados de frutos e notaram a inibição do crescimento de bactérias Gramnegativas, mas não em Gram-positivas e concluíram que espécies diferentes de
bactérias exibem sensibilidades diferentes aos compostos fenólicos.
Os produtos naturais vêm recuperando espaço e importância na indústria
farmacêutica como fonte inspiradora de novos padrões moleculares bioativos. Na
Europa, a fitoterapia já é parte da medicina tradicional, sendo que extratos de plantas
e componentes ativos, além de produtos medicinais acabados, estão descritos em
muitas farmacopéias. Exemplos marcantes da importância da fitoterapia de origem
oriental são os extratos de ginseng e de Hypericum, o fitoterápico TMPZ-2 (extrato
de Ligusticum chuanxiong, utilizado no tratamento da angina), Crategus bu-wang
(anticolesterolêmico). O Ginkgo biloba utilizado no controle de problemas vasculares
cerebrais, de memória e com propriedades neuroprotetoras ilustra um exemplo de
fitoterápico de sucesso. Do extrato da erva-de-São-João (Hypericum perforatum), foi
isolada a hipericina utilizada como antidepressivo. Aparentemente, as propriedades
34
atribuídas a este extrato devem-se à hiperforina, que compreende uma mistura de
tautômeros. Dentre os quimioterápicos para o câncer, a vimblastina e a vincristina,
extraídas de Catharantus roseus, o etoposídeo, o teniposídeo e o taxol são
importantes fármacos introduzidos na terapêutica nos últimos 20 anos, fundamentais
para o renascimento do interesse nos produtos naturais por parte da indústria
farmacêutica (NEWMAN et al., 2000; SIMÕES & SCHENKEL, 2002; NEWMAN et al.,
2003; LORENZI & ABREU MATOS, 2008).
As oportunidades para a identificação de produtos com possível utilização
econômica aumentam com a diversidade das espécies. Um exemplo elucidativo é o
do C. roseus, originário de Madagascar. As vendas das drogas antileucêmicas,
vincristina e vinblastina, derivadas desta planta, atingem valores anuais de US$ 200
milhões (GUERRA et al., 1998).
VAQUERO et al. (2007) investigaram atividades de compostos fenólicos puros
e polifenóis de diferentes tipos de vinhos contra patógenos. Foi observado que
bactérias exibiram sensibilidades diferentes a concentrações variadas de compostos
fenólicos. Todas as amostras de vinho tinto exibiram ação antimicrobiana e maior
inibição quando a concentração do vinho aumentava. Vinhos brancos não foram
eficazes contra os microrganismos, indicando que os compostos fenólicos presentes
nos vinhos tintos são os responsáveis pela atividade biológica verificada.
Foi estudado o impacto dos polifenois presentes no vinho tinto no nível de
produtos de peroxidação citotóxica lipídica na fase posprandial em seres humanos.
Os resultados sugerem que os polifenois do vinho e os provenientes da alimentação
35
exercem ação benéfica por absorção e inibição desses produtos, a exemplo da
lipotoxina malondialdeído (MDA) (GORELIK et al., 2008).
CORREIA et al., (2006) descreveram aspectos da
família Anacardiaceae
associando com a presença e distribuição de metabólitos secundários e suas
atividades biológicas, com ênfase nos lipídeos fenólicos, flavonóides e triterpenos
que são encontrados nesta família.
CRAGG et al., (1997) indicaram que aproximadamente 25% das prescrições
dispensadas nos Estados Unidos durante os últimos 25 anos estavam relacionadas a
medicamentos que continham princípios ativos de origem natural ou semi-sintética,
normalmente
oriundos
de
plantas
superiores;
cerca
de
13%
relativas
a
medicamentos de fontes microbianas e 2,7% de origem animal.
Os princípios ativos dos produtos naturais são produzidos por biossínteses
utilizando enzimas, moléculas com propriedades catalíticas. O discernimento
estrutural dos mecanismos enzimáticos contribuirá para a elucidação dessas vias
anabólicas
e
seus
biocatalisadores.
A
biotecnologia
pode
gerar
grandes
oportunidades na exploração dessa área, integrando a bioquímica, a bioinformática e
as ferramentas biomoleculares (ZHOU et al., 2008).
2.6. A planta, Schinus terebinthifolius, Raddi.
A S. terebinthifolius (Raddi) pertence a família Anacardiaceae, representada
por 76 gêneros subdivididos em cinco tribos: anacardieae, dobineae, rhoeae,
semecarpeae e spondiadeae. Já foram catalogadas cerca de 600 espécies da família
conhecidas por serem frutíferas, apresentarem madeira de boa qualidade e pelas
36
propriedades terapêuticas de algumas árvores (CORREIA et al., 2006). Possui
diversos nomes populares a exemplo de aroeira-vermelha, aroeira da praia, aroeiramansa, aroeira-branca, aroeira-do-sertão, araguariba, aroeira brasileira, cabuy,
cambuy, aroeira do brejo, bálsamo, corneíba, aroeira-pimenteira, árvore-da-pimenta
e fruto-de-sabiá. Na França é conhecida como poivrier d´Amerique, e nos Estados
Unidos é chamada Califórnia peper tree. Seus frutos são utilizados na Flórida para
decoração de Natal, o que lhe conferiu a denominação de Christmas-berry (PIOCORRÊA, 1984; LORENZI, 1998).
A aroeira é uma árvore de pequeno a médio porte, capaz de alcançar de 5 a 9
metros de altura. Seu caule é levemente tortuoso e a casca escura e fissurada. As
folhas medem de 8 a 12 centímetros de comprimento, com 7 a 13 folíolos verdes,
elípticos com nervuras claras. É um vegetal dióico, isto é, existem árvores fêmeas e
árvores machos. As flores são pequenas, branco-esverdeadas, dispostas em
inflorescências axilares e terminais do tipo rácemo, e são muito atrativas para
abelhas. Os frutos são pequenas drupas, esféricas, rosadas a avermelhadas, que
servem como condimento e alimentam as aves silvestres (LORENZI, 1998;
QUEIRES, 2004).
No passado, foi utilizada pelos jesuítas que, com sua resina, preparavam o
“Bálsamo das Missões”, famoso no Brasil e no exterior. A planta possui importância
econômica por possuir propriedades comerciais e fitoquímicas (ALMEIDA, 1993).
De grande plasticidade ecológica, ocorre em quase todo o território brasileiro
sendo encontrada no nordeste, cerrados, chegando ao Rio Grande do Sul e estendose à Argentina e Paraguai. Serve a diversos usos, tais como lenha, carvão, cercas
37
vivas, forragem para caprinos, alimentos para aves silvestres, pólen para abelhas,
arborização de pastos, ornamentação e medicina doméstica. Contém óleos
essenciais amplamente distribuídos nas suas partes vegetais, tais como folhas,
frutos e tronco, em teores e composições variáveis. È nativa da América Tropical,
introduzida em vários países do mundo com fins ornamentais, sendo considerada
uma “praga vegetal”, em alguns países, por ser muito invasiva. A espécie destaca-se
ecologicamente em programas de reflorestamentos ambientais, recuperação de
áreas degradadas, em projetos de reposição de mata ciliar e estabilização de dunas
(EWE, 2001; LENZI & ORTH, 2004; KONAR et al., 2009; STEVENS & BECKAGE,
2009).
A incorporação de práticas sustentáveis de uso e exploração dos recursos
advindos da biodiversidade pode se tornar um diferencial capaz de gerar vantagens
competitivas. Pesquisas vêm sendo desenvolvidas considerando a necessidade da
prospecção de novas substâncias vegetais passíveis de utilização no controle de
insetos. A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRABA) do Estado de
Rondônia, objetivando avaliar o efeito do óleo essencial de folhas de S.
terebinthifolius sobre insetos adultos de Acanthoscelides obtectus e Zabrotes
subfasciatus, considerados pragas que atacam os grãos de feijão armazenados e
popularmente conhecidos como caruncho, gorgulho ou bicho-do-feijão. Foi analisada
a mortalidade dos invertebrados frente a diversas diluições do produto com 24 e 48
horas de exposição. Os resultados evidenciaram a atividade inseticida do óleo
essencial, sugerindo seu potencial no controle dos insetos estudados (SANTOS et
al., 2007).
38
As cascas e folhas secas da aroeira são utilizadas contra febres, infecções do
sistema urinário (cistites e uretrites), diarréias, blenorragia, orquites crônicas, tosse e
bronquite, higiene íntima, pós-parto, complicações menstruais com excesso de
sangramento, gripes, inflamações e infecções em geral. O chá das cascas é
recomendado para curar diarréia e hemoptise e também em banhos contra dor
ciática, gota, reumatismo e erisipela. Da casca são descritas propriedades
depurativas; as folhas possuem ação diurética e antimicrobiana. O óleo essencial é
rico
em
monoterpenos,
responsáveis
por
várias
propriedades
biológicas,
especialmente a ação antimicrobiana contra bactérias, vírus e fungos de plantas e
animais, além de atividade repelente contra moscas e outros insetos. O produto é
indicado também para tumores e possui ação regeneradora dos tecidos, por isso
utilizado em escaras, queimaduras e problemas de pele. Todos os órgãos do vegetal
são utilizados de forma tópica como cicatrizante e anti-séptico, no caso de fraturas
expostas, feridas e lesões orais. Externamente, o óleo essencial é usado na forma de
loções, géis ou sabonetes para coceiras, acnes, manchas e limpeza da pele. Devido
ao alto teor de tanino, é empregada nos curtumes para curtir peles e couros. As
folhas maduras passam por forrageiras. No Peru, a aroeira é utilizada após
fermentação para se fazer vinagre e bebida alcoólica. Em diversas partes do vegetal
foram identificadas a presença de alquilfenóis, substâncias formadas por um
grupamento fenólico ligado a uma cadeia carbônica com propriedades surfactantes.
Os alquilfenóis podem causar dermatite atópica, por esta razão, o uso de
preparações de aroeira deve ser revestido de cautela devido a possibilidade de
reações alérgicas de pele e mucosas em pessoas sensíveis (BAGGIO, 1988;
39
GUERRA et al., 2000; SIMÕES et al., 2003; CORREIA et al., 2006; CIAGRI/USP,
2010; JOHANN et al., 2007; CORRÊA et al., 2008).
SOARES et al., em 2006, determinaram que o extrato alcoólico da aroeira
apresentou significativa capacidade de inibir o crescimento, in vitro, de várias
espécies de bactérias do gênero Streptococcus e, principalmente, do Staphilococus
aureus. Estudos com extratos de S. terebinthifolius revelaram ação contra
Enterococcus faecalis (COSTA et al., 2010), Staphylococcus aureus (LIMA et al.,
2006a), Candida albicans (SCHMOURLO et al., 2005), além de terem demonstrado
atividade anti-radicalar em ensaios de peroxidação lipídica (VELÁSQUEZ et al.,
2003).
A
cicatrização
é
evento
biológico
complexo
envolvendo
inflamação,
quimiotaxia, proliferação celular, diferenciação e remodelação. COUTINHO et al.,
(2006) investigaram o efeito de extrato hidroalcoólico de S.terebinthifolius na
cicatrização de anastomoses no cólon ascendente em ratos e observaram um efeito
favorável da planta, em nível microscópico, neste processo. No entanto, estudos
analisando o processo de cicatrização após cirurgias abdominais em ratos, usando
extratos desta mesma espécie, verificaram que não houve alteração nas
cicatrizações de feridas cirúrgicas (NUNES Jr. et al., 2006; SANTOS et al., 2006). Já
LUCENA et al, (2006) constataram que o uso de extrato hidroalcoólico de aroeira
mostrou efeito cicatrizante favorável nas cistotomias em ratos.
AMORIM & SANTOS (2003) relataram que o gel vaginal de aroeira é efetivo e
seguro para o tratamento da vaginose bacteriana, sugerindo também potenciais
efeitos benéficos na flora vaginal.
Em 2007, AGRA et al., realizaram uma
40
investigação etnomedicinal nos estados no Nordeste Brasileiro, registrando 483
plantas com propriedades bioativas; 466 usadas com fins medicinais e somente 27
apresentaram toxicidade. O estudo determinou que produtos oriundos das folhas e
da entrecasca da S. terebinthifolius são usados, pela população da região, em
inflamações de ovários, em úlceras e outras finalidades terapêuticas.
A semente do fruto da aroeira é considerada uma especiaria, sendo muito
popular na França, chamada poivre-rose (pimenta-rosa) onde é utilizada na
ornamentação e tempero de preparações culinárias. Seu sabor é levemente picante
e adocicado (CERUKS et al., 2007). Segundo estudo do Banco de Desenvolvimento
do Espírito Santo S/A (BANDES, 2008) atualmente, o componente que oferece
maiores possibilidades de geração de renda e crescimento sustentável é aquele
utilizado na culinária. A S. terebinthifolius, além de apresentar folhas aromáticas,
permite o beneficiamento de seus pequenos frutos, do que resulta a pimenta-rosa. A
demanda por este produto tem sido crescente em feiras e casas especializadas do
Rio de Janeiro. A Brazilian Peppertrade Board, empresa especializada em
especiarias, informou em junho de 2007, que o mercado de pimenta-rosa vem
apresentando uma tendência de alta, por causa das más condições meteorológicas
das ilhas do Oceano Índico, maior fornecedora ao mercado europeu. A produção de
pimenta-rosa gera subprodutos que também podem ser comercializados, a exemplo
do óleo essencial, empregado nas indústrias de flavorização de carnes e lingüiças e
na de cosméticos.
41
2.6.1. A aroeira e sua utilização no Brasil
A aroeira tem uma tradição importante na medicina popular brasileira,
principalmente no Nordeste, sendo uma das plantas de uso mais freqüente e antigo
entre a população.
Segundo OLIVEIRA & SÁ (2009), no Estado do Ceará, o Projeto Farmácias
Vivas idealizado pelo Prof. Francisco José de Abreu Matos em 1983, consta de
plantas medicinais com eficácia e segurança terapêuticas comprovadas. O projeto
deu origem, em 1997, ao Programa Estadual de Fitoterapia, atualmente designado
de Núcleo de Fitoterápicos da Secretaria da Saúde do Estado do Ceará e produz
medicamentos a partir de plantas medicinais cultivadas em farmácias vivas. O
Núcleo distribui medicamentos fitoterápicos para hospitais e unidades da rede
estadual de saúde e mantém o Horto de Plantas Medicinais e a Oficina Farmacêutica
para preparação de fitoterápicos. Também presta apoio técnico-científico e faz
capacitação de pessoal para promover a fitoterapia em Saúde Pública no estado com
a implantação de farmácias vivas em 28 municípios. O povo já sabia e a ciência só
confirmou. As mudas das plantas mais usadas na medicina popular são repassadas
para cerca de 50 Farmácias Vivas no Ceará, uma retribuição aos ensinamentos
colhidos em aldeias, quilombos, junto a rezadeiras e aos moradores mais antigos do
interior.
A Água Rabelo é um medicamento fitoterápico composto, que apresenta como
componentes três plantas medicinais de nossa flora, a aroeira (S. terebinthifolius), a
hortelã (Peltodon radicans) e o eucalipto (Eucaliptus globulus) cujo potencial
farmacológico e terapêutico traduz a multiplicidade de ação do produto. Sua fórmula
42
possui 121 anos e foi desenvolvida pelo farmacêutico Antônio José Rabelo, fundador
do Laboratório Rabelo LTDA, em 1889, empresa de capital exclusivamente brasileiro,
pioneira na produção de fitoterápicos com princípios ativos conjugados. Atualmente,
o Laboratório Rabelo está situado na região metropolitana de João Pessoa, capital
da Paraíba e tem como principal local de atuação, o mercado nordestino, onde se
apresenta consolidado e já tradicional em várias gerações de consumidores. A
empresa destaca-se como o maior laboratório de fitoterápicos daquele estado. A
aroeira possui ação cicatrizante e é utilizada em inflamações urinárias e uterinas com
lavagens internas e banhos de assento. Por suas atividades antiinflamatória e
cicatrizante, seu uso tópico é indicado em hemorróidas, ferimentos na pele,
inflamações
de
mucosas
a
exemplo
da
gengiva
e
garganta
(http://www.aguarabelo.com.br). Em 2007, MEDEIROS et al., avaliaram
a
propriedade antiinflamatória deste medicamento fitoterápico. Para tal, foram
utilizadas as técnicas de edema de orelha em camundongos induzido por 12-Otetradecanoilforbol 13-acetato (TPA) ou capsaicina e o edema de pata de rato
induzido por carragenina. O produto, na dose de 26 mL/kg, inibiu tanto edema de
orelha induzido por TPA como por capsaicina. Os resultados demonstraram que o
medicamento fitoterápico brasileiro apresentou propriedades antiinflamatórias e a
melhor dose foi aquela que é usada pela população.
Outro exemplo de produto fitoterápico cuja produção demonstra caráter
empreendedor é o do Elixir Sanativo, fabricado desde 1888, pelo Laboratório
Pernambucano LAPERLI. O Estado de Pernambuco é o maior e mais importante
centro produtor de medicamentos do Norte e Nordeste, possuindo posição de
43
destaque no ranking da indústria farmacêutica nacional. Ainda assim, poucos
remédios, a exemplo do Sanativo, são encontrados com facilidade no Centro-Sul. A
direção do LAPERLI, que possui estrutura familiar, trabalha para reposicionar ainda
mais a marca no mercado com o lançamento de novas versões do remédio como o
sabonete Sanativo, anti-séptico e bactericida. O Elixir Sanativo é a imagem do
“remédio da família” bastante valorizado pela população nordestina. É um produto
fitoterápico composto de uso tradicional na região Nordeste do Brasil. Este
medicamento sob a forma de extrato fluido é indicado no tratamento de feridas,
queimaduras, gastrites, úlceras gastroduodenais, hemorragias, inflamações de
garganta e de tecidos epiteliais lesionados. Sua fórmula é constituída por 20% de
angico (Piptadenia colubrina, Benth); que possui ação hemostática e cicatrizante;
20% de aroeira (S. terebinthifolius, Raddi); usada em processos inflamatórios e
infecciosos; 1;7% de camapu (Physalis angulata, Linn); empregada por sua atividade
balsâmica e analgésica e 1;7% de mandacaru (Cereus peruvianus, Miller); com o
qual procura-se a assepsia das regiões afetadas. Visando observar a eficácia e
segurança do uso da associação destas espécies vegetais, foram realizados testes
de atividade cicatrizante no modelo de ferida aberta em dorso de rato utilizando o
Elixir Sanativo a 4% sob a forma de spray além de análises da toxicidade aguda por
via oral. Os resultados mostraram uma diminuição no tempo requerido para a
completa reepitelização da área lesionada e, na administração oral de até 5g/kg não
produziu morte nos animais. Os perfis hematológicos e bioquímicos permaneceram
dentro da faixa de referência para a espécie. A análise histológica dos diferentes
órgãos não revelou alterações. O conjunto dos resultados permitiu concluir que o
44
fitoterápico possui significativa propriedade cicatrizante em tecidos epiteliais
lesionados e baixo grau de toxicidade em ratos Wistar (LIMA et al., 2006b). No ano
de 2008, PESSOA avaliou o tratamento da alveolite de extração dental em ratos
machos cuidados com o Elixir Sanativo, através de exame histológico com
microscopia óptica. Os resultados demonstraram que o fitoterápico contribuiu para
que o processo de cicatrização fosse o mais próximo possível dos padrões de
normalidade, ou seja, mais semelhante ao processo de cicatrização do alvéolo
quando sem a infecção dental.
Cirurgiões-dentistas prescrevem infusões realizadas com a entrecasca da
planta para gargarejos e bochechos após cirurgias bucomaxilares (LANZONNI,
2007).
SAWAYA, em 2006, estudou a composição química da própolis brasileira.
Seguindo indicações de apicultores sobre plantas visitadas por abelhas nativas do
país Tetragonisca angustula, popularmente chamada de jataí. Apenas uma delas, a
S. terebinthifolius
apresentou alguns dos componentes encontrados na própolis
desta abrelha sendo, portanto, produzidos extratos metanólicos com suas flores,
frutos e folhas individualmente. Realizada análise por espectrofotometria de massas,
foram encontrados vários íons em comum entre partes do vegetal e da própolis que
permitiram indicar esta planta como uma fonte importante da própolis da jataí. Devido
a ampla distribuição geográfica da aroeira, foi observado que ela é a fonte vegetal de
própolis
nas regiões sul, sudeste e nordeste do Brasil. Dentre os compostos
encontrados,
os
ácidos
masticadienóico
e
hidroximasticadienóico
possuem
45
importantes propriedades farmacológicas por serem inibidores da fosfolipase A2,
podendo ser usados para o controle de processos inflamatórios.
A aroeira vem sendo mencionada em estudos relacionados com as religiões
afrobrasileiras. O uso de plantas sagradas atende aos aspectos litúrgicos das casasde-santo possuindo um caráter etnofarmacobotânico. A espécie S. terebinthifolius foi
identificada e seu uso observado com finalidades medicinais e litúrgicas, na forma de
banhos, defumadores, benzeduras e rezas pelos pais-de-santo, além de erveiros que
trabalham em feiras livres (VERGER, 1995; MAIOLI-AZEVEDO & FONSECAKRUEL, 2007; PIRES et al., 2009).
2.6.2. Compostos ativos extraídos da Schinus terebinthifolius, Raddi.
Do seu óleo essencial, já foram identificados mono e sesquiterpenos (em teor
de 1% para as folhas e 5% para os frutos), além de taninos, resinas, alcalóides,
flavonóides, saponinas, esteróides e triterpenos. Para as sementes é citado um teor
de óleo fixo da ordem de 14%. (ALMEIDA, 1993). O produto contém, dentre outros
compostos, cis-sabinol, p-cimeno, limoneno, simiarenol, alfa e beta-pineno, deltacaroteno, terebintona, eschinol, ácido masticadienóico, ácido hidroximasticadienóico,
sitosterol, baruenona, ácido terebentifólico, quercetina e kaemferol (SAWAYA, 2006;
JOHANN et al., 2010).
QUEIRES (2004) estudou o efeito antiproliferativo de extrato da S.
terebinthifolius sobre células de câncer de próstata humano, verificando efeito
inibidor da proliferação celular, com indução à morte das células cancerígenas.
Também foram isoladas 12 substâncias a partir de seu extrato: rutina, quercetina,
46
quercetina
glicosilada,
quercitrina,
isoquercitrina,
kaempferol,
ácido
quínico,
apigenina, ácido caféico, ácido cítrico e resveratrol.
Na análise, por espectroscopia de massas e cromatografia gasosa do óleo
essencial obtido de suas folhas, GUNDIDZA et al., (2009)
identificaram como
constituintes majoritários: sabineno, α-pineno, β-pineno, terpineno-4-ol, trans-βocimeno e mirceno. O produto exibiu propriedades contra os patógenos: Yersinia
enterocolitica,
Pseudomonas
aeruginosa,
Escherichia
coli,
Acinetobacter
calcoaceticus, Bacillus subtilis e Klebsielia pneumoniae.
EL-MASSRY et al., (2009) prepararam um óleo essencial e dois extratos
(diclorometanólico e etanólico) de folhas da aroeira cultivadas no Egito e observaram
que o óleo continha 4,97% de monoterpenos, 56,96% de sesquiterpenos, 34,37%
de monoterpenos oxigenados e 3,32% de sesquiterpenos oxigenados. Os principais
elementos encontrados no óleo foram cis-β-terpineol, (E)-cariofileno, β-cedreno e
citronela. Os compostos fenólicos identificados no extrato etanólico foram ácido
caféico, ácido coumarico e ácido siríngico. A atividade antioxidante deste extrato foi
superior tanto ao óleo quanto ao extrato diclorometanólico. Já este último exibiu o
maior efeito antimicrobiano, seguido da fração etanólica e do óleo essencial.
LIMA et al., (2006a) analisaram quimicamente extratos em etanol e em hexano
da casca do tronco e das folhas da S. terebinthifolius detectando a presença de
fenóis, triterpenos, antraquinonas, flavonóides, leucoantocianinas e esteróides livres.
LIMA et al, (2006b) realizaram uma triagem fitoquímica com o fitoterápico Elixir
Sanativo que contém S. terebinthifolius além de outros vegetais. O estudo revelou a
presença majoritária de taninos e, em menor intensidade, flavonóides, esteróides e
47
açúcares. Os taninos são compostos fenólicos do metabolismo secundário vegetal,
sendo amplamente empregados na medicina tradicional no tratamento de feridas,
queimaduras e inflamações. O poder anti-séptico dos taninos pode ser explicado por
sua capacidade de precipitar as proteínas das células superficiais das mucosas dos
tecidos,
formando
uma
camada
protetora
(complexo
tanino-proteína
e/ou
polissacarídeo) sobre a pele ou mucosa danificada, impedindo, assim o
desenvolvimento de microrganismos. Embora o efeito cicatrizante possa ser atribuído
aos taninos, não se deve descartar a participação de flavonóides na recuperação de
tecidos, uma vez que estes possuem atividade antiinflamatória, analgésica,
cicatrizante, antimicrobiana e antioxidante.
A presença de taninos na dieta de animais experimentais tem sido descrita na
literatura como causadora de redução do consumo de alimento, da taxa de
crescimento e da eficiência nutricional. VALLET et al. (1994) observaram que ratos
alimentados com dieta rica em tanino, de sementes de uva, tiveram redução no
ganho de massa corporal e na digestão de proteínas.
VIANA (2002) isolou e caracterizou lectinas da casca da S. terebinthifolius.
Lectinas formam uma classe de glicoproteínas amplamente difundidas en a natureza,
encontradas em seres unicelulares, pluricelulares, animais e vegetais, que possuam
pelo menos um sítio de ligação reversível a um mono ou oligossacarídeo, sem
apresentar função catalítica e de origem não-imunológica. Elas aglutinam células e
precipitam polissacarídeos, glicoproteínas ou glicolipídeos. O termo lectina, do latim
lectus que significa “selecionado”, inicialmente referiu-se à habilidade de algumas
moléculas ligarem-se seletivamente e reversivelmente a carboidratos da superfície
48
celular aglutinando eritrócitos. A palavra “aglutinina” é utilizada como sinônimo de
lectina porque se refere a capacidade de aglutinar células. Elas podem ser
agrupadas de acordo com os monossacarídeos pelos quais apresentam afinidade.
Desse modo, existem as lectinas ligantes de D-galactose/N-acetil-D-galactosamina,
as ligantes de D-glicose/manose e as que se ligam a L-fucose (PEUMANS & VAN
DAMME, 1998; COELHO & SILVA, 2000). Nos vegetais, possuem diversas funções,
entre elas, o transporte de carboidratos, estocagem e mobilização de proteínas e
glicídios, alongamento da parede celular e ação defensiva contra fungos, bactérias,
vírus e insetos (PEUMANS & VAN DAMME, 1998; RATANAPO et al., 2001).
Estudos fitoquímicos e biológicos efetuados com espécies do gênero Schinus
descrevem a ocorrência de terpenóides e ácidos graxos em S. molle e em S.
terebinthifolius. Dentre os terpenóides, dois triterpenos isolados de S. terebinthifolius
foram caracterizados como inibidores específicos da fosfolipase A2 (JAIN et al.,
1995).
DEGÁSPARI et al., (2005) analisaram a atividade antimicrobiana de extratos
aquoso e alcoólico obtidos de frutos da aroeira, diretamente ligados à quantidade de
compostos fenólicos existentes nestes. Pelos testes, verificou-se que o extrato
alcoólico apresentou efeito inibitório sobre o crescimento de Staphylococcus aureus
e Bacillus cereus, já o extrato aquoso não apresentou efeito inibitório sobre o
crescimento dos microrganismos testados. O extrato alcoólico mostrou-se com
quantidade significativa da flavona apigenina, além de ácido elágico, ao passo que
no extrato aquoso foi observada a presença da flavanona naringina.
49
Um estudo fitoquímico do extrato em etanol das folhas de S. terebinthifolius
com potencial anti-radicalar foi realizado e conduziu ao isolamento dos compostos
fenólicos: galato de etila, miricetrina, quercitrina, galato de metila e miricetina
(CERUKS et al., 2007).
O extrato de aroeira contém catecóis, taninos, terpenos, flavonóides e
saponina. Sobre os flavonóides já foi descrito potencial mutagênico e propriedade
antioxidante. A mutagenicidade de alguns flavonóides está associada com a
formação de espécies reativas do oxigênio e parece depender do número e posição
dos grupos hidroxilas. CARVALHO et al., (2003) avaliaram um extrato da casca do
tronco da planta em ensaios bacterianos para determinar seu potencial genotóxico.
Os resultados indicaram que a solução produziu mutações e lesões no DNA das
bactérias e que o estresse oxidativo pode ter sido responsável pela genotoxidade.
Em vista dos achados, é importante analisar o potencial mutagênico dos produtos
fitoterapêuticos comerciais, inclusive a legislação brasileira exige testes de atividade
mutagênica para registrar esses medicamentos.
2.7. A resposta imune
Em 2002, VIANA isolou e caracterizou parcialmente lectinas da casca da S.
terebinthifolius observando produção de óxido nítrico, liberação de peróxido de
hidrogênio por macrófagos e baixa atividade mitogênica sobre linfócitos de
camundongos suíços, indicando futuras perspectivas de sua aplicação em
biotecnologia. A ligação de lectinas às células pode gerar diversas atividades
50
biológicas, a exemplo de estimulação mitogênica de linfócitos T humanos (PAJIC et
al., 2002),
As propriedades antioxidantes dos flavonóides, pela atuação como captadores
de espécies reativas de oxigênio, podem ser benéficas a saúde, pelo fato de
prevenirem a oxidação das lipoproteínas de densidade baixa (LDL) (ARAÚJO et al.,
2005).
Dentre as funções dos macrófagos estão a fagocitose de partículas estranhas,
recrutamento de leucócitos, reparo de tecidos, produção de citocinas e compostos
intermediários de oxigênio, peróxido de hidrogênio (H 2O2) e óxido nítrico, produzido
durante a conversão da L-arginina em L-citrulina pela atividade catalítica da óxido
nítrico sintase. A sintase induzível de óxido nítrico é uma isoforma desta enzima
ausente nos macrófagos em repouso, podendo ser induzida quando são estimulados
com lipopolissacarídeo (LPS) ou interferon-gama
-gama). O óxido nítrico
possui efeitos citostático e citotóxico contra células tumorais, micróbios, vírus,
bactérias e protozoários, sendo uma molécula regulatória importante (ABBAS et al.,
2003) O peróxido de hidrogênio, produzido por células inflamatórias ativadas,
também atua na toxicidade intra e extracelular, em diferentes tipos de células
(MOREIRA et al., 2001). O oxigênio molecular e seus radicais são os reagentes mais
importantes na bioquímica dos radicais livres nas células aeróbicas. O termo
“espécies reativas de oxigênio” inclui os radicais livres contendo oxigênio, como o
ânion superóxido (O2-), o radical hidroxila (HO-), o radical peroxila (ROO-) e espécies
não radicalares como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Esses grupos químicos
reativos podem causar danos celulares ao reagirem com lipídeos, proteínas,
51
carboidratos e ácidos nucléicos, estando envolvidos no processo de envelhecimento
e em muitas desordens biológicas, incluindo inflamações crônicas, problemas
respiratórios, doenças neuro-degenerativas, doenças auto-imunes, carcinogênese e
mutagênese. Para alguns compostos fenólicos, como ácido clorogênico, ácido
caféico, ácido ferúlico e seus ésteres com esteróis e triterpenos têm sido relatadas
atividades antioxidantes, sugerindo que doenças causadas pelas reações oxidativas
em sistemas biológicos poderiam ser retardadas pela ingestão de antioxidantes
naturais encontrados em plantas e na dieta (ANDRADE et al., 1999; AL-MAMARY et
al., 2002; SIMÕES et al., 2003 ; CHANWITHEESUK et al., 2005 ; TUNG et al., 2007).
Citocinas e fatores de crescimento são reguladores importantes da resposta
imune, reações inflamatórias, angiogênese, apoptose e proliferação celular. GU, et
al., (2009) investigaram a estabilidade e reprodutibilidade temporal de um painel de
citocinas e fatores de crescimento, em soros de mulheres pré e posmenopausadas
utilizando a tecnologia Luminex xMap de múltiplas dosagens. Observaram que 16
dentre os 41 marcadores medidos, entre eles, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12,
IL-1 e TNF-alfa, mostraram sensibilidade e reprodutibilidade suficientes ao longo de
dois anos, sugerindo que a avaliação pelo Luminex pode ser realizada em amostras
congeladas coletadas para estudos prospectivos.
Estudos realizados com Mangifera indica (Linn), planta tradicionalmente usada
na medicina popular da Índia relatam suas atividades antiviral, antibacteriana e
antiinflamatória. Os efeitos de seu extrato sobre componentes da resposta imune
humoral e celular em camundongos foram investigados e o principal componente
identificado foi a mangiferina, além de polifenóis, terpenóides, esteróides, ácidos
52
graxos e microelementos. O produto demonstrou efeito imunoestimulatório dosedependente, promovendo aumento do título de anticorpos, sugerindo ser uma droga
promissora por suas propriedades imunológicas (MAKARE et al., 2001).
Citocinas e fatores de crescimento são reguladores importantes da resposta
imune, reações inflamatórias, angiogênese, apoptose e proliferação celular.
GU, et al., (2009) investigaram a estabilidade e reprodutibilidade temporal de
um painel de citocinas e fatores de crescimento, em soros de mulheres pré e
posmenopausadas utilizando a tecnologia Luminex xMap de múltiplas dosagens.
Observaram que 16 dentre os 41 marcadores medidos, entre eles, IL-1, IL-2, IL-4, IL5, IL-6, IL-10, IL-12, e TNF-alfa, mostraram sensibilidade e reprodutibilidade
suficientes ao longo de dois anos, sugerindo que a avaliação pelo Luminex pode ser
realizada em amostras congeladas coletadas para estudos prospectivos.
CERQUEIRA-LIMA et al., (2010) examinaram os efeitos de um extrato total da
Cissampelos sympodialis, de uma fração dos alcalóides totais e de um extrato de
warifteina purificada, em modelo experimental de alergia respiratória murina induzida
por extrato do ácaro Blomia tropicalis. A sensibilização com o ácaro aumentou a
atividade das peroxidades eosinofílicas indicando degranulação dessas células. O
tratamento com as três frações reduziu a densidade de células inflamatórias
(eosinófilos) e a atividade da peroxidase eosinofílica no fluido broncoalveolar assim
como os níveis de IL-5 e IL-13, sendo que quando foi usado o extrato total, os
resultados foram estatisticamente mais significantes comparados com as frações de
alcalóides totais e o alcalóide puro (warifteina). Os resultados demonstram o
potencial dessa planta como um novo agente no tratamento da asma.
53
A atividade antialérgica de extrato de S. terebinthifolius foi investigada por
CAVALHER-MACHADO et al., (2008). A análise por HPLC revelou que os principais
componentes aromáticos isolados foram o ácido gálico,
metil-galato e 1,2,3,4,6-
pentagaloilglicose. O tratamento oral prévio com o extrato total e suas frações
isoladas, inibiu o edema induzido provocado por inoculação de histamina em patas
de camundongos suíços, prevenindo a degranulação de mastócitos. O prétratamento com o extrato também inibiu significativamente o acúmulo de eosinófilos
e leucócitos totais na cavidade pleural 24 horas após injeção intratoráxica de
ovoalbumina. Foi observada diminuição, no lavado pleural, dos níveis das
quimiocinas CCL11/eotaxina (que em conjunto com IL-5 induz liberação de
eosinófilos da medula óssea para o sangue) e CCL5/RANTES (proteína com
quimiotaxia por monócitos).
A atividade de extratos metanólicos oriundos de 20 plantas, utilizadas na
medicina tradicional brasileira, contra as formas promastigotas da Leishmania
amazonensis e Leishmania chagasi, além dos fungos Candida albicans e
Cryptococcus neoformans foi investigada. As frações oriundas das plantas Vernonia
polyanthes e Ocimum gratissimum foram ativas contra L. amazonensis e L. chagasi
respectivamente. Em relação à atividade antifúngica, as espécies Bixa orellana, O.
gratissimum e Syzygium cumini exibiram melhor resposta contra o C. neoformans .
Os extratos de S. terebinthifolius, O. gratissimum, Cajanus cajan e Piper aduncum
apresentaram efeitos mais efetivos na defesa contra C. albicans. A atividade
biológica dos extratos de várias partes dos vegetais testados parecem ter ocorridos
devido a presença de metabólitos secundários tais como os flavonóides, identificados
54
em 92% das amostras, alcalóides (88%), tanino (83%), triterpenos (67%),
antraquinonas (42%), esteróides (33%) e saponinas (25%). O mecanismo de ação de
alguns alcalóides poderia ser atribuído a sua habilidade de intercalar com o DNA do
microrganismo; enquanto a propriedade antimicrobiana dos taninos pode estar
relacionada a sua capacidade de inativar adesões microbianas, enzimas e proteínas
de transporte (BRAGA et al., 2007).
2.8. A Corynebacterium pseudotuberculosis e a linfadenite caseosa
A caprino-ovinocultura é uma atividade rural de grande importância para o
Brasil, principalmente para os pequenos e médios produtores da região Nordeste,
particularmente da zona semi-árida, pois os rebanhos de pequenos ruminantes
constituem as principais fontes econômicas e nutricionais dessa população. Também
exercem uma função social de elevada importância, devido à fixação do homem no
campo, contribuindo, assim, para a diminuição do êxodo rural (DORELLA et al,
2006). Entre as doenças que acometem os rebanhos caprinos e ovinos, nesta e em
outras regiões brasileiras, com alta prevalência, está a linfadenite caseosa, doença
crônica
infecciosa
cujo
agente
etiológico
é
a
bactéria
Corynebacterium
pseudotuberculosis (SEYFFERT et al, 2009).
A linfadenite caseosa dos caprinos e ovinos é considerada uma doença
infectocontagiosa crônica, cujas manifestações clínicas são caracterizadas por
caseação necrótica dos linfonodos. Os abscessos podem ser superficiais ou internos
com lesões de vísceras. Após penetrar no hospedeiro, a C. pseudotuberculosis é
transportada pelas vias linfáticas aferentes aos linfonodos regionais, nos quais os
55
granulomas característicos são formados. Os sinais clínicos só são observados com
a presença de granulomas externos. Pode acometer outros animais domésticos,
causando, por exemplo, a dermatite ulcerativa em equinos e a linfangite ulcerativa
em bovinos (AYERS, 1977; DORELLA et al, 2006)
A formação de granulomas em linfonodos e vísceras atua como um
mecanismo de defesa do hospedeiro a fim de limitar a disseminação do patógeno.
Sua transmissão se dá principalmente através da pele, pelo contato de animais
hígidos com fômites contaminados no ambiente, bem como através de um animal
infectado portador de abscesso que evolue até a supuração transmitindo então para
um exemplar sadio (MOURA-COSTA et al, 2008).
O microorganismo tem sido identificado em países com grandes criações de
pequenos ruminantes como Austrália, Nova Zelândia, Argentina, África do Sul e
Estados Unidos e em países da Comunidade Européia (STING et al., 1998).
No Brasil já foi isolada e caracterizada no interior da Bahia e em outros
Estados Nordestinos (MOURA-COSTA et al., 1973). O Nordeste brasileiro concentra
aproximadamente 90% do rebanho caprino e 40% do rebanho ovino nacional,
entretanto, a região possui alta prevalência de linfadenite caseosa, resultando em
importantes prejuízos econômicos.
A alta incidência da enfermidade na região
Nordeste se deve ao tipo de vegetação encontrada, no bioma caatinga, a qual é
caracterizada pela presença de pequenas árvores, arbustos e ervas espinhosas,
que, se contaminados com o microrganismo, ao serem consumidos pelos animais
e/ou entrarem em contato com as suas peles, provocam ferimentos que servem
como porta de entrada para a bactéria (NANIAN et al., 1985).
56
Os abscessos provocam danos na pele e a condenação da carne, gerando
problemas ao comércio exterior. A infecção também causa mastite, diminuindo a
produção de leite. Em Israel, YERUHAM et al., (2004) descreveram surto de
linfadenite em rebanho bovino causando tanto
lesões na pele quanto mastite,
resultando em acentuada perda econômica.
A infecção no homem, apesar de baixa freqüencia, pode ocorrer pelo contato
manual com material purulento procedente de granulomas e, ocasionalmente, pela
ingestão do leite de animais com mastite. Apresenta também caráter ocupacional
acometendo médicos veterinários, criadores, tratadores e açougueiros (MILLS et al.,
1997; PEEL et al., 1997). Diversos ensaios imunoenzimáticos e avaliação de
antígenos somáticos e secretados assim como genes da bactéria foram descritos
objetivando melhorias no diagnóstico e desenvolvimento de vacina contra a
enfermidade (CARMINATI et al., 2003; VALE, 2005; D´AFONSECA et al., 2008).
O
gênero
Corynebacterium
pertence
ao
grupo
supragenérico
dos
actinomicetes, que também incluem o gênero Mycobacterium, Nocardia e
Rhodococcus. O microrganismo C. pseudotuberculosis foi isolado em 1888 por
Nocard. No ano de 1894, foi descrito detalhadamente por Preizs, observando sua
semelhança com o bacilo da difteria. A nomenclatura atual foi adotada em 1948 na 6ª
edição do Bergey’s Manual. Sinônimos para Corynebacterium pseudotuberculosis
são:
Baccilus
pseudotuberculosis
ovis,
Baccilus
pseudotuberculosis,
Corynebacterium ovis (MOURA-COSTA, 2002a; DORELLA et al., 2006).
É um bacilo Gram-positivo curto e irregular com aspecto cocóide. Pode se
mostrar isolado, em grupamentos irregulares ou em paliçada. É uma bactéria não-
57
capsulada, anaeróbia facultativa, fermentativa e não forma esporos. Exigente do
ponto de vista nutricional, cresce bem em meios enriquecidos com agar-sangue, BHI
(infusão de coração e cérebro) ou soro animal (BATTEY, 1986). Em 2002b, MOURACOSTA et al., descreveram um meio de cultura sintético quimicamente definido para
o crescimento da bactéria, capaz de permitir uma melhor caracterização das funções
biológicas e imunológicas das proteínas secretadas pela C. pseudotuberculosis.
Bioquimicamente, caracteriza-se pela produção de catalase e urease, redução
de nitrato a nitrito e fermentação de carboidratos, a exemplo da maltose, manose,
glicose, galactose (variável), sem produção de gás. Não fermenta lactose, não tem
atividade proteolítica, não hidrolisa a gelatina, nem digere a caseína.
Já foram descritos alguns fatores de virulência como agentes da patogenia.
Um exemplo é a camada lipídica localizada na face externa da parede, cuja
composição assemelha-se ao ácido micólico encontrado no gênero Mycobacterium e
que teria uma ação letal sobre macrófagos (HARD, 1975). Outro fator importante é a
atividade da enzima fosfatidilcolina fosfatidohidrolase ou fosfolipase D, que hidrolisa
a esfingomielina, componente importante da membrana, em colina e ceramida
fosfato. Sendo considerada uma exotoxina, sua ação compromete as células do
epitélio
vascular,
aumentando
a
permeabilidade
capilar,
e
favorecendo
a
disseminação do microorganismo a partir do local inicial da infecção (CARNE &
ONON, 1978; BARKDALE et al., 1981).
Por ser uma bactéria intracelular facultativa, a resposta mediada por células se
constitui uma importante arma do hospedeiro para combater a infecção. Dessa
58
forma, o perfil de células Th1 é responsável pela indução da produção de citocinas
essenciais para o controle da doença.
Proteínas secretadas têm demonstrado exercer papel na indução de uma
resposta celular protetora (PAULE et. al., 2004; MOURA-COSTA et. al., 2008). Em
2005, MEYER et al., observaram que antígenos secretados e somáticos
apresentaram diferenças na capacidade de indução de resposta celular através da
quantificação de IFN-gama.
Em 2008, ABREU et al, avaliaram o perfil de sensibilidade in vitro de 31
isolados de C. pseudotuberculosis de caprinos e ovinos de quatro municípios do
sertão de Pernambo, Brasil. Para a realização dos antibiogramas utilizou-se a técnica
de difusão em discos. Foi verificado que 87,1% dos isolados foram resistentes a
novobiocina; 80,6% a neomicina; 41,9% a gentamicina; 19,3%, a lincomicina; 16%, a
ampicilina, orbifloxacina e penicilina; 12,9%, a sulfa-trimetoprim; 6,4%, a cefazolina,
norfloxacina e amoxicilina; 3,2% a ciprofloxacina, cloranfenicol e tetraciclina. Com
exceção de uma linhagem, todas as demais apresentaram algum grau de resistência
múltipla, sendo 16% multirresistentes a aproximadamente 50% dos antimicrobianos
testados. Os autores inferem que existe variação no perfil de sensibilidade desta
bactéria a antimicrobianos na região, reforçando que o sucesso da terapia
antimicrobiana contra o agente deve ser preconizada com base em testes de
sensibilidades (antibiograma), no intuito de alcançar melhor efetividade.
59
03. JUSTIFICATIVA
A natureza proporciona aos animais, e em particular, ao ser humano, uma
enorme variedade de plantas com valores medicinais. Sua utilização na prevenção e
tratamento de doenças está associado à história da nossa própria espécie.
Informações oriundas de observações populares das diversas potencialidades de
plantas medicinais contribuíram para estudos sobre suas propriedades terapêuticas.
Em todo o mundo, principalmente na América do Sul e na Ásia, “plantas que curam”
são frequentemente indicadas, e até mesmo prescritas, mesmo que seus
constituintes
químicos
não
sejam
completamente
conhecidos.
A
Schinus
terebinthifolius, Raddi (aroeira) é encontrada em quase todo o território brasileiro.
Estudos diversos relatam seu potencial para emprego terapêutico em doenças
microbianas, parasitárias e tumores.
A Corynebacterium pseudotuberculosis é o bacilo causador da linfadenite
caseosa em caprinos e ovinos, doença infectocontagiosa crônica caracterizada
clinicamente por abscessos dos linfonodos e responsável por grande prejuízo à
economia do Nordeste Brasileiro, detentor do maior rebanho caprino do país.
Este trabalho pretende contribuir com novas informações visando o aumento
dos conhecimentos na área, além de obter recursos que possam ser úteis na
aplicação de biotecnologia, contribuindo para melhorar a efetividade do uso de
biofármacos pela população.
60
04. HIPÓTESE
Os extratos, aquoso e metanólico, oriundos de folhas da Schinus
terebinthifolius, Raddi (aroeira) possuem ação microbicida, in vitro, sobre o bacilo
Corynebacterium pseudotuberculosis além de possuírem efeitos estimulatórios in
vitro sobre células esplênicas de camundongos (Mus musculus) das linhagens
isogênicas BALB/c e CBA.
61
05. OBJETIVOS
5.1. Objetivo geral
▪ Estudar os efeitos de extratos obtidos de folhas da Schinus terebinthifolius, Raddi
(aroeira) sobre
a
susceptibilidade
in
vitro
do
bacilo
Corynebacterium
pseudotuberculosis e sobre a proliferação de esplenócitos in vitro de camundongos
(Mus musculus).
5.2. Objetivos específicos
▪ Produzir extratos, aquoso e metanólico, obtidos de folhas da S. terebinthifolius.
▪ Investigar, in vitro, as propriedades antibacterianas dos extratos em concentrações
que variam de 10 a 2.000 μg/dL de fenóis totais, em cepas virulentas e atenuadas da
C. pseudotuberculosis após 48 horas de exposição.
▪ Analisar a resposta in vitro de esplenócitos de camundongos (Mus musculus) das
linhagens isogênicas BALB/c e CBA, após exposição aos extratos de aroeira, em
diferentes tempos e concentrações.
▪ Observar o perfil de citocinas produzidas pelas células do baço submetidas a 24 e
72 horas de exposição aos extratos, em concentrações variadas.
62
06. MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção dos extratos de Schinus terebinthifolius (Raddi). As folhas foram
selecionadas, lavadas e secadas em estufa a 60ºC até apresentarem peso
constante. A seguir, trituradas e acondicionadas em sacos plásticos, sob pressão
negativa, mantidos a – 20ºC, até as subseqüentes análises. Para a promoção do
extrato aquoso, em dez gramas de folhas trituradas foi adicionado 40 mL de água
destilada a 100ºC sob agitação constante durante 15 minutos e, após filtração e
centrifugação (8000g, 10 minutos) o sobrenadante foi transferido para ampola de
decantação com 80 mL de clorofórmio sob agitação por 5 minutos. A fração
clorofórmica foi desprezada e a fração aquosa reduzida a um quinto do volume
inicial, em evaporador rotatório a 70°C sobre pressão negativa. O extrato aquoso
(EA) resultante foi filtrado sob vácuo usando membranas esterilizadas (5μm) e
congelado a 70ºC negativos. No preparo da fração metanólica, para cada grama de
folha triturada, foram utilizados 10 mL de metanol, em uma primeira extração a
quente, em banho-maria a 60ºC, sob agitação durante 10 minutos. Após filtração, o
volume total foi reduzido a 25% do inicial, em evaporador rotatório aquecido a 70ºC,
sobre pressão negativa. O extrato metanólico (EM) resultante foi esterilizado e
estocado nas mesmas do primeiro (QUEIRES et al., 2006). A concentração dos
fenóis totais foi dosada utilizando-se o reagente de Folin segundo a técnica descrita
por QUEIRES e RODRIGUES, 1998. Os extratos, aquoso e metanólico, secos e
63
obtidos a partir de um militro de cada solução concentrada, foram pesados, diluídos
em água destilada e diluídos para obtenção das diferentes concentrações utilizadas.
Cultivo do bacilo Corynebacterium pseudotuberculosis. Nas amostras-controle
foi utilizado metanol diluído em água destilada a 50% v/v. Para as culturas da
bactéria foram utilizadas as cepas T1, atenuada e a VD57, virulenta, isoladas de
abscessos de caprinos com linfadenite caseosa e mantidas na coleção do setor de
Microbiologia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia,
identificadas como Corynebacterium pseudotuberculosis pelo sistema API Coryne
(Biomérieux, França). Elas foram cultivadas em balão de vidro contendo caldo BHI
(brain-heart infusion), conservadas em estuda bacteriológica a 37 oC em aerobiose.
Foram repicadas em intervalos de 48 horas até obtenção de crescimento satisfatório.
Foi utilizada alça de Drigansky, adicionando-se um volume de 500 microlitros do
meio líquido para a repicagem no meio sólido por placa (MOURA-COSTA et al.,
2002b). Foram utilizadas 40 placas contendo meio sólido ágar-BHI, distribuídas com
as cepas e o extrato. Em todas as placas foram colocados discos de papel de filtro,
com 6 mm de diâmetro e um volume de 10 microlitros do extrato de aroeira nas
concentrações de 2.000, 1.500, 1.000, 500, 250, 100 e 10 μg/dL de fenóis totais e
incubadas durante 48 horas.
O crescimento “in vitro” da bactéria foi expresso pela média  desvio-padrão, tendo
sido realizada análise de variância e teste de Tukey. As diferenças entre o controle e
as
diferentes
concentrações
dos
significativas com valores de p<0,05.
extratos
vegetais
foram
estatisticamente
64
Cultivo de esplenócitos murinos. Dez camundongos da linhagem BALB/c e outros
dez da linhagem CBA foram sacrificados por deslocamento cervical e os baços
removidos assepticamente. Os esplenócitos foram obtidos por divulsão em meio
RPMI 1640 (Sigma Chemical Company, St. Louis) mantidos no mesmo meio.
Retirada alíquota de 40 microlitros (μL) para contagem pela técnica de bioimpedância
elétrica em contador de células CelM CC-530. As células foram cultivadas em
concentração de 106/mL, em placas de 24 poços contendo meio de cultura RPMI, pH
7,2 suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Gibco, Brasil) e 1% de uma
associação de estreptomicina e penicilina (Gibco, Brasil). Aos poços foram
adicionados os extratos aquoso ou metanólico nas concentrações de 500, 200 e 100
μg/dL de fenóis totais; preparado poço do controle positivo contendo o mitógeno
pokeweed (PWM, Sigma) na concentração de 2,5 μg/mL, e o controle negativo
preparado apenas com células. As placas foram incubadas em estufa com 5% CO 2 a
37oC por 24 e 72h. Após o período de incubação, o conteúdo dos poços foi coletado,
lavado com solução de tampão fosfato (PBS). As células foram contadas e os
sobrenadantes identificados e armazenados em freezer a - 70oC.
Curva de crescimento. Foi estabelecida curva para verificação da velocidade de
proliferação dos esplenócitos de camundongos BALB/c durante 24 e 72 horas de
cultivo e exposição aos extratos aquoso e metanólico da aroeira.
65
Estudo do ciclo celular.
Células de camundongo CBA oriundas dos poços do
grupo controle e as tratadas com a fração aquosa da aroeira, durante 24h foram
lavadas, centrifugadas, incorporadas com iodeto de propídio (10 μg/mL) e RNAse A
(100 mg/mL), incubadas na ausência de luz durante 30 minutos, expostas por 4
minutos a radiação ultravioleta, acrescentada solução salina de PBS com 20% de
Triton-X100, iodeto de propídio (10 μg/mL), mais uma vez, na mesma concentração
e, por fim realizada leitura no citômetro de fluxo para análise das fases G1, S, G2 e
M do ciclo celular.
Teste
do
brometo
de
3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio
(MTT).
Esplenócitos de dez camundongos BALB/c foram utilizados para análise de
viabilidade celular. As células foram cultivados em placas de 96 poços e expostas
aos extratos aquoso ou metanólico da planta; após o período de exposição, as
amostras foram incubadas com 1mg de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5difeniltetrazólio (Sigma M2128) por mililitro de meio RPMI puro. As placas foram
mantidas por 24 h em estufa a 37° C e 5% de CO 2. Após este período, foi
acrescentada solução de lise contendo propanol-HCl 8% (v/v) em cada poço. A
leitura da densidade óptica das soluções foi realizada após 24 horas, em
espectrofotômetro ajustado em 570 nm de comprimento de onda. O valor da média
das absorvâncias das células tratadas menos a absorvância do branco foi dividido
pelo valor da média das absorvâncias das amostras do controle negativo menos a
absorvância do branco. O branco foi representado pela absorvância do poço vazio.
66
Dosagem da lactato desidrogenase (LDH). A oxidação da L-lactato pela enzima Llactato: NAD oxidoredutase (EC 1.1.1.27) gera piruvato e uma molécula de
nicotinamida adenina dinucleotídio reduzida (NAD reduzido). Reações sucessivas de
oxidorredução da coenzima geram um complexo cuja coloração é medida
espectrofotometricamente.
Determinação da atividade lisossômica. A determinação da atividade lisossômica
foi determinada nos sobrenadantes do meio de cultura das células e permite avaliar
as condições físico-químicas relacionadas com a estabilidade das membranas
(RODRIGUES et al., 1998). Para isso, foi realizada a medida da atividade da enzima
ortofosfórico monoéster fosfohidrolase (EC 3.1.3.2) ou fosfatase ácida, de acordo
com a técnica de Bassey-Lowry modificada, em culturas incubadas com diferentes
concentrações da S. terebinthifolius. .
Dosagem de proteínas totais. A determinação de proteínas totais foi efetuada pela
técnica de Folin-Biureto descrita por KOMSA-PENKOVA et al., (1996).
Quantificação de citocinas. Os níveis de interferon-gama (IFN-gama), interleucina2 (IL-2), interleucina-12 (IL-12), interleucina-17 (IL-17), fator de necrose tumoral-alfa
(TNF-alfa), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) e interleucina-13 (IL-13) dos
sobrenadantes armazenados a 70oC negativos foram determinados pelo Bio-Plex Pro
Assays (Bio-Rad Laboratories Incorporation, USA) usando o Luminex System. Uma
diluição seriada da solução- padrão de cada citocina foi feita e, em placa específica
67
do sistema, distribuídos o anticorpo de captura, os padrões e os sobrenadantes das
amostras. A seguir foram realizadas etapas de incubação, lavagem, adição do
anticorpo
de
detecção,
incubação,
lavagem,
acréscimo
da
solução
de
streptavidina/ficoeritrina, incubação e realização da leitura no aparelho. Os dados
foram analisados pelo Bio-Plex Manager Software. As concentrações de citocinas
nas amostras foram calculadas a partir das curvas-padrão geradas pelo sistema com
os resultados expressos em picogramas por mililitro (pg/mL). O método combina
princípios do ensaio imunoenzimático de captura sanduíche com técnica baseada em
fluorescência de esferas (beads fluorescence) permitindo análises múltiplas de até
cem citocinas ou fatores de crescimento diferentes em um único poço, utilizando
volume de apenas cinquenta microlitros de sobrenadantes de culturas celulares.
Análise estatística.
Todas as avaliações dos dados foram realizadas com análise de variância e teste
pos hoc de Tukey com o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS,
versão 13.0 para Windows). A média foi selecionada como medida de tendência
central para comparar a magnitude das variações das amostras. Resultados com
valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
68
07. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O extrato metanólico revelou atividade microbicida, em ambas as cepas, nas
concentrações de 2.000, 1.500, 1.000 e 500 μg/dL após 48h de exposição. Também
foram avaliadas as concentrações de 250, 100 e 10 μg/dL, porém não apresentaram
atividade antibacteriana nas duas linhagens avaliadas. As Figuras 1 e 2 mostram,
respectivamente, uma placa do teste de crescimento da cepa atenuada T1 com o
extrato metanólico e, o mesmo teste, com a cepa virulenta VD57. A Tabela 1 resume
os resultados expressos como médias e desvios-padrões dos diâmetros dos halos de
inibição para as duas cepas bacterianas.
Figura 1. Efeito do extrato metanólico da aroeira (Schinus terebinthifolius, Raddi) sobre o
crescimento da Corynebacterium pseudotuberculosis, cepa atenuada T1.
69
Figura 2. Ação do extrato metanólico de aroeira (Schinus terebinthifolius, Raddi) sobre o
crescimento da Corynebacterium pseudotuberculosis, cepa virulenta VD57.
Diâmetro dos halos de inibição (mm)
Concentrações
do extrato
metanólico
Cepa T1
Cepa VD57
Média
Desviopadrão
Média
Desviopadrão
---
---
---
---
2.000 μg/mL
10.8
 0,45
10,75
0,5
1.500 μg/mL
10,2
 0,45
9,5
0,58
1.000 μg/mL
8,4
 0, 55
7,75
0,5
500 μg/mL
7,0
 0,1
7,0
 0,1
Controle
negativo
(metanol 50%)
Tabela 1. Valores das médias e desvios-padrões dos testes de crescimento após exposição das
duas cepas da C. pseudotuberculosis, durante 48h ao extrato metanólico da S. terebinthifolius.
70
PUUPPONEN-PIMIÄ et al., (2001), testaram as propriedades antimicrobianas de
compostos fenólicos isolados de frutos e notaram a inibição do crescimento de
bactérias Gram-negativas, mas não de Gram-positivas e concluíram que espécies
diferentes de bactérias exibem sensibilidades diferentes aos compostos fenólicos.
DEGÁSPARI et al., (2005) analisaram a atividade antimicrobiana de extratos aquoso
e alcoólico obtidos de frutos da aroeira. A fração alcoólica apresentou efeito inibitório
sobre o crescimento de Staphylococcus aureus e Bacillus cereus e mostrou-se com
quantidade significativa da flavona apigenina e ácido elágico. A fração aquosa não
demonstrou ação antimicrobiana e nela foi observada a presença da flavanona
naringina. SOARES et al., (2006) avaliaram que o extrato alcoólico da aroeira
(Schinus terebinthifolius, Raddi) apresentou significativa capacidade de inibir o
crescimento, in vitro, de várias espécies de bactérias do gênero Streptococcus e,
principalmente, do Staphilococus aureus. Em 2008, ABREU et al, avaliaram a
sensibilidade in vitro de 31 amostras de Corynebacterium pseudotuberculosis
isoladas de caprinos e ovinos em Pernambuco, Brasil a antibióticos variados. Foi
verificado que 87,1% dos isolados foram resistentes a novobiocina; 80,6% a
neomicina; 41,9% a gentamicina; 19,3%, a lincomicina; 16%, a ampicilina,
orbifloxacina e penicilina; e percentuais menores a sulfa-trimetoprim, cefazolina,
norfloxacina, amoxicilina, ciprofloxacina, cloranfenicol e tetraciclina. Com exceção de
uma linhagem, todas as demais apresentaram algum grau de resistência múltipla aos
diversos
quimioterápicos,
demonstrando
que
existe
variação
no
perfil
de
sensibilidade da bactéria. COSTA et al., (2010) concluiu que extratos etanólicos da
71
aroeira-da-praia
(Schinus
terebinthifolius)
e
da
aroeia-do-sertão
(Astronium
urundeuva) apresentaram atividade contra o Enterococcus faecalis.
O efeito dos extratos aquoso e metanólico sobre a proliferação de esplenócitos
murinos in vitro pode ser observado nas figuras 03 e 04. Os valores entre os
diferentes tipos de tratamento e controles foram significativos com p<0,05.
72h
50
0
M
20
0
M
10
0
M
00
A5
00
A2
00
A1
Co
nt
Po
s
Ne
g
5000
4000
3000
2000
1000
0
Co
nt
Células por uL meio
24h
Tratamento BALB/c
Figura 3: Contagem de esplenócitos murinos da linhagem BALB/c após 24 e 72 horas de exposição
aos extratos aquoso e metanólico da S. terebinthifolius, Raddi (Aroeira).
Cont Neg – controle negativo; Cont Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de
fenóis totais em μg/dL do extrato aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em
μg/dL do extrato metanólico. Os valores entre os diferentes tipos de tratamento e controles foram
significativos. Os dados representam a média ± dp (ANOVA seguida de teste de Tukey; p<0,05).
72
72h
50
0
M
20
0
M
10
0
M
00
A5
00
A2
00
A1
Po
s
Co
nt
Ne
g
4000
3000
2000
1000
0
Co
nt
Células por uL meio
24h
Tratamento CBA
Figura 4: Contagem de esplenócitos murinos da linhagem CBA após 24 e 72 horas de exposição aos
extratos aquoso e metanólico da S. terebinthifolius, Raddi (Aroeira). Cont Neg – controle negativo;
Cont Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato
aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico. Os
valores entre os diferentes tipos de tratamento e controles foram significativos. Os dados representam
a média ± dp (ANOVA seguida de teste de Tukey; p<0,05).
A capacidade de indução da proliferação dos extratos da aroeira pode ter origem na
presença de lectinas, já isoladas da Schinu. terebinthifolius por VIANA, em 2002. Em
1960, Peter Nowell na Universidade da Pensilvânia demonstrou que a lectina da
Phaseolus vulgaris, conhecida como fitohemaglutinina (PHA) possuía a habilidade de
estimular linfócitos. Posteriormente, outras lectinas tiveram esta propriedade
confirmada. Da Phytolacca americana foi extraída a lectina comercializada sob o
nome de pokeweed mitogen (PWM). Da Canavalia ensiformis foi isolada a
concanavalina A (Con-A) que, ao contrário da fitohemaglutinina, pode ter sua
atividade inibida por baixas concentrações de monossacarídeos, por exemplo,
manose, sugerindo que a estimulação resultou da ligação da lectina a carboidratos
73
da superfície celular dos linfócitos (SHARON & LIS, 1987). A ligação de lectinas às
células pode gerar diversas atividades biológicas, a exemplo de estimulação
mitogênica de linfócitos T humanos (PAJIC et al., 2002), produção de óxido nítrico
por macrófagos (ANDRADE et al., 1999), liberação de peróxido de hidrogênio por
neutrófilos (TIMOSHENKO et al., 1995),
aglutinação de eritrócitos (COELHO &
SILVA, 2000), antiinflamatória (ASSREUY et al., 1999), antifúngica (FREIRE et al.,
2002), hipotensiva (WANG et al., 1996) e antitumoral (ELSASSER–BEILE et al.,
2001). A estimulação in vitro de linfócitos por mitógenos supostamente mimetiza a
estimulação específica por antígenos. Con-A é mitogênica para linfócitos T humanos
e murinos e o PWM estimula células T e B humanas (JANEWAY et al., 2004).
Evidências indicam que a ligação das lectinas mitogênicas aos linfócitos T acontece
através de dois efeitos diferentes e independentes. O primeiro é a indução da
formação de receptores funcionais para interleucina-2; o segundo relaciona-se com a
produção de fator de crescimento, que ativa a proliferação de células. Existem
lectinas que podem ativar apenas a resposta inicial dos linfócitos, enquanto que as
lectinas mitogênicas possuem a habilidade de induzir a produção e secreção de
interleucina-2 (SHARON & LIS, 1987).
BARBOSA et al. (2001), relataram que
lectinas extraídas das leguminosas Canavalia brasiliensis, Dioclea violacea e Dioclea
grandiflora apresentaram alta capacidade de estimular células T de linfonodos de
camundongos BALB/c, estímulo maior que o mitógeno concanavalina A. Elas
também induziram apoptose, inflamação e necrose venosa endotelial. Segundo
BARRAL-NETTO et al. (1992), essas mesmas lectinas induziram proliferação e
74
produção de interferon-gama em cultura de células mononucleares de sangue
periférico em seres humanos.
Neste trabalho, a observação de que o pokeweed utilizado nos controles
positivos não demonstrou atividade de proliferação celular coincide com os achados
de GARFIN et al, (1978). Estes autores observaram que os mitógenos de linfócitos T
fitohemaglutinina (PHA) e concanavalina-A (Con-A); de linfócitos B lipopolisacarídeos
bacterianos (LPS) e o estimulador de ambos os linfócitos T e B, o pokeweed (PWM)
não foram capazes de gerar ativação de células de camundongos C57B1 e BALB/c
do grupo controle (não inoculados) nem nos esplenócitos de animais infectados com
o agente da doença de scrapie (paraplexia enzoótica dos ovinos). Produtos naturais
vêm sendo usados como agentes imunomoduladores permitindo que a função do
sistema imune seja modificada por estimulação ou supressão. ZANDONAI et al.,
(2010) avaliaram extratos das plantas medicinais: Calophyllum brasiliense, Ipomoea
pes-caprae, Matayba elaeagnoides, Maytenus robusta, Rubus imperialis e Vernonia
scorpioides sobre o desenvolvimento de esplenóctos de camundongos. Os extratos
metanólicos das três primeiras plantas mostraram indução dose-dependente de
proliferação celular. Em contraste, os extratos dos vegetais restantes revelaram
percentual negativo de crescimento sugerindo inibição da proliferação das células
murinas.
75
Foi produzido um gráfico para verificação da proliferação das células murinas
após exposição de 24 e 72 horas aos extratos aquosos e metanólico da aroeira, que
pode ser observado na figura 05.
Figura 5: Curva de crescimento de esplenócitos de camundongos da linhagem isogênica BALB/c
após 24 e 72 horas de exposição aos extratos aquoso e metanólico da S. terebinthifolius, Raddi
(Aroeira). O controle positivo é representado por células expostas ao mitógeno pokeweed (PWM). O
controle negativo contém as células sem nenhum tipo de tratamento.
76
A comparação do ciclo celular entre o experimento controle e as amostras
tratadas com extrato aquoso da aroeira demonstra aumento das fases do ciclo,
estando de acordo com os achados de proliferação e o teste do brometo de 3-(4,5dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio. Os valores podem ser avaliados nas tabelas 02
e 03, e nas figuras 06 e 07.
Fases do ciclo celular
100
Extrato aquoso
Concentração de fenóis totais em μg/dL
200
G0/G1
48,55%
59,32%
63,87%
S
8,22%
5,17%
1,44%
G2/M
33,11%
25,01%
26,83%
Total
100%
100%
100%
500
Tabela 2: Estudo do ciclo celular de esplenócitos de camundongo, após exposição durante 24 horas
ao extrato aquoso da S. terebinthifolius, Raddi (Aroeira).
Fases do ciclo celular
Experimento controle
G0/G1
54,32%
S
23,33%
G2/M
22,35%
Total
100%
Tabela 3: Estudo do ciclo celular de esplenócitos de camundongo sem exposição aos extratos da S.
terebinthifolius, (controle) e após 24 horas de cultivo.
77
Figura 6: Histograma do experimento controle contendo células de baço de camundongo CBA sem
exposição aos extratos da S. terebinthifolius, Raddi (Aroeira) e após 24 horas de cultivo. Células
contadas versus intensidade de fluorescência.
Figura 7: Histograma de esplenócitos de camundongo, após exposição, durante 24 horas, à
concentração de 500 μg/dL do extrato aquoso da S. terebinthifolius, Raddi (Aroeira). Células contadas
versus intensidade de fluorescência.
78
A determinação da viabilidade, crescimento e ativação celular foi estudada
pelo método do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT),
composto de coloração amarela que, ao ser incubado em células viáveis, é
convertido pelas enzimas dehidrogenases mitocondriais a um composto de cor
violácea formado por cristais de formazan. A técnica é baseada na capacidade que
as células metabolicamente ativas têm de reduzir sais de tetrazólio a derivados
formazólicos de coloração púrpura, insolúveis em água. Para este processo ocorrer é
necessária a participação de mitocôndrias funcionais e, portanto de células viáveis. É
uma dosagem colorimétrica, cuja intensidade da coloração final é proporcional ao
número de células viáveis (ISSA et al., 2004; FERRARI, 2008; PERES et al., 2008).
Verificamos que a proliferação significativa observada pela contagem celular
foi acompanhada de um bom desempenho pelo teste do MTT, com tratamento
estatístico mostrando valores de p<0,05 altamente significativos entre o controle
negativo em relação às células tratadas com aroeira, conforme a figura 08.
79
MTT
14
Crescimento
em número
de vezes
comparado ao
controle negativo
12
10
8
6
4
2
0cont −
24h
72h
+ A 100
A 200
A500
M200
M100
M500
Tratamento
Figura 8: Ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Cont Neg –
controle negativo; Cont Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais
em μg/dL do extrato aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do
extrato metanólico.
A análise estatística da atividade da enzima lactato desidrogenase revela um
valor significativo (p<0,05) entre os tratamentos, com 24 e 72 horas de exposição
apenas com extrato metanólico na concentração de 500 μg/dL de fenóis totais em
relação aos demais. Apesar desta observação em relação a amostra M 500, parece
que o aumento da dosagem da atividade enzimática nesta amostra, aconteceu por
instabilidades de membranas originárias, aparentemente, pelo excesso de células
nestes poços (figura 09), gerando maior competição entre elas nas concentrações
mais altas.
Atividade da LDH (UI/L)
80
800
700
600
500
24h
400
72h
300
200
100
50
0
M
20
0
M
10
0
M
50
0
A
20
0
A
10
0
A
os
Co
nt
P
Co
nt
N
eg
0
Tratamento
Figura 9: Dosagem da atividade da enzima lactato desidrogenase. Cont Neg – controle negativo; Cont
Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato
aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
Este microambiente populoso gera entre outros fatores, diminuição da nutrição
e consequentemente maior desgaste celular diminuindo as condições boas para o
crescimento
e sobrevivência dos esplenócitos cultivados. Segundo ISSA et al.,
(2004) a análise da enzima lactato desidrogenase (EC 1.1.1. 27) é utilizada para
observação da integridade de membrana e viabilidade celular em resposta à
exposição a compostos farmacêuticos, químicos e ambientais. A citotoxicidade é
determinada pela avaliação dos danos à membrana. A quantidade de lactato
desidrogenase (LHD) liberada das células danificadas para o sobrenadante de
cultura celular é inversamente proporcional à viabilidade celular.
81
A avaliação do metabolismo lisossômico em resposta à exposição de
compostos diversos pode ser medida pelos níveis de fosfatase ácida (EC 3.1.3.2)
marcador funcional da atividade do compartimento lisossômico (DAVIES et al., 1974 ;
RACHER et al., 1990 ; REZZANI et al., 2002; CAVIEDES-BUCHELI et al., 2006; JIN
et al., 2007). Macrófagos peritoneais de camundongos expostos a polissacarídeos da
parede celular de streptococcus (PPG) apresentaram modificações morfológicas e
bioquímicas. As células aumentaram de tamanho além de elevar os níveis de
proteínas. A exposição ao PPG por 24 horas não alterou
significativamente os
valores de LDH; com 72 h houve aumento significante. Ocorreu elevação dos níveis
de hidrolases ácidas, incluindo as fosfatases lissosomais. Altas doses de PPG
causaram aumento na liberação de hidrolases para o meio extracelular sem
detecção de perda de viabilidade celular (DAVIES et al., 1974). Na determinação da
atividade
do
compartimento
lisossômico
(figura
10),
observamos
valores
estatisticamente significantes (p<0,05) nos tratamentos com 24 e 72 horas de
exposição, principalmente entre os extratos metanólico e aquoso na concentração de
500 μg/dL de fenóis totais em relação aos demais, e principalmente aos controles.
Apesar
dos achados, em relação a amostra M 500, parece que o aumento da
atividade enzimática aconteceu pela alta proliferação celular desencadeada pelos
extratos da aroeira, de modo similar aos valores encontrados da atividade da LDH.
Os componentes do compartimento lisossômico são lisossomos primários, vesículas
auto e heterofágicas, lisossomos secundários (fagossomos) e corpúsculos residuais.
Lisossomos são orgânulos multifuncionais responsáveis pela degradação de todos
82
os componentes celulares e macromoléculas que derivam do espaço extracelular via
endocitose. São compostos por diversas enzimas hidrolíticas tais quais lípases,
glicosidases, nucleases, proteases e fosfatases, sendo as fosfatases ácidas
utilizadas como marcadores enzimáticos da atividade lisossomal. Desse modo, sua
função primária está envolvida nos mecanismos de defesa da célula e também na
proteção contra agentes tóxicos e infecções (CUERVO & DICE, 2000). Modificações
físico-químicas que levam a perda da integridade de membranas dos diversos
componentes do compartimento lisossômico são associadas com disfunção celular,
doenças inflamatórias e degenerativas, além de apoptose e morte celular (VAN
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24h
50
0
M
20
0
M
M
10
0
00
A5
00
A2
00
A1
os
Co
nt
P
eg
72h
Co
nt
N
Atividade das fosfatases ácidas
(UI/L)
NIEROP et al., 2006).
Tratamento
Figura 10: Efeito das diferentes concentrações de plifenóis contidos nos extratos aquoso e metanólico
da aroeira sobre a atividade lisossômica de esplenócitos murinos. Cont Neg – controle negativo; Cont
Pos – controle positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato
aquoso; M 100, M 200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
83
Os valores em microgramas por mililitro de concentração protéica total das
amostras podem ser visualizados na figura 11. Na análise estatística valores
significantes com p<0,05 se revelaram principalmente com o uso do extrato
metanólico na concentração de 500 μg/dL de fenóis totais em relação aos demais.
Essa medida permitiu observar a proliferação celular baseada no aumento protéico
350
300
250
200
24h
150
72h
100
50
50
0
M
20
0
M
M
10
0
00
A5
00
A2
00
A1
os
Co
nt
P
eg
0
Co
nt
N
Concentração protéica (ug/mL)
nas amostras.
Tratamento
Figura 11: Quantificação das proteínas totais. Cont Neg – controle negativo; Cont Pos – controle
positivo; A 100, A 200, A 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato aquoso; M 100, M
200, M 500 – concentração de fenóis totais em μg/dL do extrato metanólico.
84
Os níveis de cinco citocinas com padrão de resposta Th-1 (IFN-gama, IL-2, IL12, IL-17 e TNF-alfa) e de três com modelo Th-2 (IL-6, IL-10, IL-13) foram medidos.
Na análise estatística, não houve diferença significativa entre os tratamentos, tempo
ou linhagem murina. Nas condições deste experimento, a ausência de significância
pode ter ocorrido devido à grande variabilidade de respostas entre os grupos,
gerando desvios padrões elevados. Citocinas e fatores de crescimento são
reguladores importantes da resposta imune, reações inflamatórias, angiogênese,
apoptose e proliferação celular. Interferon-gama (IFN-gama) é uma citocina que
promove a modulação da resposta imune pelo controle da expressão das moléculas
do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classes I e II por diversos tipos
de células, ativação e regulação da diferenciação de fagócitos induzindo a expressão
de moléculas co-estimulatórias e a produção de produtos microbicidas como radicais
de oxigênio e óxido nítrico, possuindo também a capacidade de regular a ativação e
a diferenciação das células T CD4+, tornando esta citocina um componente chave no
curso da resposta imune (MEYER et al., 2005). A molécula induz macrófagos a
produzirem óxido nítrico devido à ação da enzima óxido nítrico sintetase, processo
conhecido como via clássica de ativação (ABBAS et al., 2003; WYNN, 2004). A
interleucina-10 (IL-10) foi originalmente descrita como uma citocina produzida por
células Th2 e mediadora de efeitos anti-inflamatórios, atuando primariamente em
células fagocíticas e em células apresentadoras de antígenos, inibindo a transcrição
e a produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF e IL-12, a expressão do
MHC de classe II e de moléculas co-estimulatórias, bem como a produção de
intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio (MOORE et al., 2001). Esta citocina
85
previne apoptose mediada pelo TNF-alfa sobre macrófagos infectados por
Mycobacterium tuberculosis, possibilitando, a manutenção da infecção crônica
(ROJAS et al., 1999). Muitos estudos experimentais e clínicos têm demonstrado que
a produção de IL-10 in vivo durante a infecção por patógenos intracelulares
representa um mecanismo regulatório para prevenir respostas inflamatórias
sistêmicas patogênicas. Estudos em diversos modelos murinos vêm demonstrando
que a IL-10 além de regular a atividade das citocinas do perfil Th1 como IFN-gama,
também regula a formação de fibrose (granuloma) mediada por citocinas do perfil
Th2 como IL-4. Nessa regulação do granuloma a IL-10 interage com as citocinas do
perfil Th1 como IFN-gama suprimindo a deposição de colágeno (WINN, 2004).
86
08. CONSIDERAÇÕES FINAIS
▪ A formação de halos de inibição do crescimento das cepas T01 e VD57 de
Corynebacterium pseudotuberculosis evidencia efeito microbicida dos princípios
ativos presentes no extrato metanólico da Schinus terebinthifolius, Raddi (Aroeira),
nas concentrações de 2.000, 1.500, 1.000 e 500 μg/dL após 48 horas de exposição;
▪ Os extratos, aquoso e metanólico, obtidos de folhas da S. terebinthifolius possuem
atividade estimulatória sobre a proliferação de esplenócitos de camundongos (Mus
musculus) das linhagens isogênicas CBA e BALB/c, nas concentrações de 100, 200
e 500 μg/dL de fenóis totais e após 24 e 72 horas de exposição;
▪ Os extratos de aroeira não interferem na estabilidade e viabilidade celular;
▪ A dosagem das atividades enzimáticas da LDH e fosfatases ácidas não sustenta a
idéia vigente, na maioria dos trabalhos científicos, de que a elevação destas é sinal
de degradação celular;
▪ Os extratos revelam aumento da fase do ciclo celular preparatória para a mitose, de
modo dose-dependente; fato este que pode explicar sua capacidade proliferativa;
▪ A dosagem de citocinas não foi capaz de permitir análise satisfatória do perfil da
resposta imune de esplenócitos murinos submetidos à presença de extratos de
aroeira.
▪ A autofluorescência dos polifenóis é um fenômeno restritivo para avaliações
diversas por técnicas que necessitem do uso de fluorocromos, a exemplo da
citometria de fluxo.
87
09. REFERÊNCIAS
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10. APÊNDICE
10.1. AUTOFLUORESCÊNCIA
Na autofluorescência biológica as células contêm moléculas, que se tornam
fluorescentes quando animado por radiação de comprimento de onda adequado.
Esta emissão de fluorescência, decorrentes de fluoróforos endógenos, é uma
propriedade intrínseca das células e é chamado de auto-fluorescência deve ser
diferenciado de sinais fluorescentes obtidos após adição de marcadores exógenos. A
fluorescência natural ocorre devido a substâncias como aminoácidos aromáticos,
flavina, porfirinas e clorofila. Em tecidos, a matriz extracelular, muitas vezes contribui
para a emissão de fluorescência mais do que o componente celular, devido ao
colágeno e a elastina.
A autofluorescência pode ser um problema em algumas
técnicas, tais quais a microscopia de fluorescência e depende da fluorescência de
outras substâncias que o fluoróforo de interesse ocorrendo aumento do sinal de
fundo ou background (MANSFIELD, et al.,2005; MONICI, 2005).
MOSIMAN et al., (1997) comentam sobre como a autofluorescência afeta a
sensibilidade de ensaios em citometria de fluxo, interferindo com a detecção de baixo
nível de fluorescência específica. Os autores testaram, com sucesso o produto azul
de trypan para reduzir a autofluorescência intracelular.
Neste trabalho a autofluorescência dos polifenóis presentes nos extratos de
aroeira impossibilitaram a análise fenotípica de populações celulares utilizando
anticorpos
monoclonais
anti
CD-3,
anti
CD-4
e
anti
CD-8
conjugados,
respectivamente aos fluorocromos PE-Cy5, FITC e PE por citometria de fluxo, além
107
da técnica de imunocitoquímica utilizada com anticorpos conjugados com
fluorocromos. Foram testados os métodos de diluição, banho de ultrasom e azul de
tripan, porém todos sem sucesso.
Nas figuras A e B podemos observar as semelhanças estruturais desses
cromógenos com alguns polifenóis isolados da aroeira.
Ficoeritrina (PE)
5-isotiocianato de fluoresceína (FITC)
Figura I: Estruturas dos fluorocromos ficoeritrina (PE) e 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC).
Apigenina
Quercetina
Figura II: Estruturas dos polifenóis apigenina, quercetina e eriodictiol.
Eriodictiol
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Figura III: Citometria de fluxo: nas três primeiras imagens observamos esplenócitos de camundongos
expostos ao extrato metanólico da aroeira sem marcação com anticorpos monoclonais conjugados
aos fluorocromos. Na última, temos células de baço murino sem terem sido expostas ao extrato e
marcadas com os monoclonais conjugados aos fluorocromos. Distinguem-se facilmente as
populações de linfócitos T CD3, CD4 e células que não pertencem a nenhum dos grupos descritos.