MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO

MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Mestrado em Biologia Celular e Molecular
DIVERSIDADE GENOTÍPICA DE Trypanosoma cruzi EM PACIENTES
ACOMETIDOS COM A DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA EM UMA COORTE DO
BRASIL
ÍCARO RODRIGUES DOS SANTOS
Rio de Janeiro
Julho de 2015
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
ÍCARO RODRIGUES DOS SANTOS
Estudo da diversidade genotípica de Trypanosoma cruzi em pacientes acometidos
com a doença de Chagas crônica em uma coorte do Brasil
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo
Cruz como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Ciências
Orientador: Dr. Otacilio da Cruz Moreira
RIO DE JANEIRO
2015
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTOR: ÍCARO RODRIGUES DOS SANTOS
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENOTÍPICA DE Trypanosoma cruzi EM PACIENTES
ACOMETIDOS COM A DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA EM UMA COORTE DO
BRASIL
ORIENTADOR: Dr. OTACILIO DA CRUZ MOREIRA
Aprovada em: _____/_____/_____
EXAMINADORES:
Profa. Dra. Joseli Lannes-Vieira - Presidente
Profa. Dra. Mariana Caldas Waghabi
Prof. Dr.
Roberto Magalhães Saraiva
Profa. Dra. Suzete Araujo Silveira Gomes (Suplente)
Profa. Dra. Ana Carolina Ramos Guimarães (Suplente)
Prof. Dr.
André Luiz Rodrigues Roque (Revisor)
Rio de Janeiro, 01 de julho de 2015
iii
“Aut viam inveniam aut faciam”
Ou encontro o caminho ou eu mesmo o abrirei.
Aníbal
iv
AGRADECIMENTOS
À Joana D’arc Madeira, minha mãe, por tudo. Sei dos sacrifícios que fez para que eu
chegasse até aqui. Não mediu esforços e sempre me incentivou. Obrigado também
por ser orgulhar de mim.
À Marcela Madeira, minha irmã, por ter pedido um irmão. Se não fosse por isso,
talvez eu nem estivesse aqui. Apesar de nossas diferenças sempre quis o melhor
para mim.
À minha tia, Helenira Madeira, por cortar as minhas primeiras unhas e guardá-las no
dicionário. Sempre disse que minha inteligência veio desse ato. Não sabemos se é
verdade, mas o que importa é a intenção. Acreditou e torceu por mim toda a minha
vida.
Aos meus primos, Fagner Vinícius, Caroline Cristine, Igor e Mikael, por me
permitirem
acompanhar
o
crescimento
de
vocês,
fazendo
com
que
eu
desenvolvesse responsabilidade enquanto passávamos bons momentos juntos.
Espero que eu tenha ensinado algo que cada um de vocês possa levar para a vida.
Ao Ramiro Balzana, meu tio de coração, por ficar feliz só de beber uma cerveja
comigo.
À Monique Guimarães por ser a melhor cunhada que alguém poderia ter.
À Cordolina Madeira, minha avó, apesar de não estar mais entre nós, sua presença
se faz constante. Seu legado vive em cada um de seus descendentes. Além disso,
juro que aprendi a fazer os seus biscoitos de polvilho e passarei a receita adiante
para os seus bisnetos.
À Kelly Menezes por todos esses anos como minha melhor amiga, parceira,
confidente, conselheira e comadre. Obrigado por fazer parte da minha vida e por ser
a extensão da minha família. É a minha torcida organizada e, se fosse um time de
futebol, jogaria em todas as posições por mim.
v
Ao Luan Figueiredo, meu melhor amigo, por me amar quando eu menos mereci.
Além de fazer de mim uma pessoa melhor em cada momento. “A nós. Não há
ninguém como nós.”
Ao Erick Braga por ser um dos meus melhores amigos há tanto tempo que já faz
parte da família e por se inspirar em mim. Sabe que te levarei para sempre comigo e
farei o possível para sempre responder às suas expectativas.
À Mayra Veríssimo, minha comadre, por todos os momentos divertidos e histórias
que compartilhamos além de ter trazido o meu afilhado ao mundo.
Ao Gustavo Veríssimo, meu afilhado querido, por me escolher como seu padrinho e
por olhar o mundo com esses olhos que se maravilham com tudo.
Aos Josinaldo e Cristiane Oliveira por toda a sua amizade e gentileza. Sem falar de
prepararem o meu lanche favorito sempre caprichado.
Aos Luis, Lúcia e Pedro Gastoldi por me considerarem parte da família e por todo o
carinho que têm por mim.
Ao Gabriel Barssi, meu amigo mais do que querido, por conseguir me fazer sorrir e
ter crises de risos como ninguém jamais conseguirá. Obrigado por tornar os dias
melhores. Não bastasse tudo isso, minha defesa ainda foi marcada no dia do seu
aniversário.
Ao Alexandre Carvalho, meu tão estimado amigo, por ser a epítome do que gosto no
mundo, por me presentear com o seu sorriso constante e por sorrir com a alma.
Além do mais, por se preocupar e torcer mais por mim do que eu mesmo.
À Thamires Benício e à Perla Pereira, minhas amigas desde o tempo da faculdade,
por me apoiarem sempre e torcerem por mim como eu torço por vocês.
À Aline Caseca, minha primeira orientadora, por me apresentar à ciência e enxergar
o potencial em mim que eu nunca tinha visto. Minha primeira base científica.
vi
À Mariângela Ziccardi por ter o maior coração do mundo e pelo bom humor
infindável. Minha segunda base científica.
Ao meu orientador, Otacilio Moreira, por sempre estar presente, me fornecendo toda
a base para trabalhar, discutindo meticulosamente cada resultado encontrado,
sugerindo uma solução plausível para cada dificuldade, me fazendo compreender
cada passo de todo esse processo. Além de me orientar não só para ser um aluno
melhor, mas também uma pessoa melhor. Minha terceira e última base científica.
Obrigado por realmente me orientar.
À Constança Britto, chefe do nosso laboratório, por me receber tão bem e vibrar com
os nossos resultados.
À Tatiana Araújo por acreditar em mim até de olhos fechados e por me ajudar
quando precisei. Sem a sua amizade, eu talvez nem tivesse passado pela entrevista
do processo seletivo.
À Myllena Melo, minha segunda autora favorita e amiga, mesmo quando estiver do
outro lado do mundo vai estar sempre comigo. Obrigado por tudo e mais um pouco.
Aos meus amigos do laboratório. Paula Finamore, por ter nascido Paula e ter feito
cada dia mais alegre, mesmo os mais tristes. Hanna Condelo, por cada conversa,
seja durante um café ou nas nossas idas para casa, onde construímos uma amizade
quase tão doce quanto o seu chocotone. Maria Carolina Peçanha, por ter deixado eu
te abraçar todos os dias mesmo com todas as suas ameaças. Ronald Martins, por
todas as vezes que tentou dominar o mundo comigo. Leticia Souza, por adoçar os
meus dias com seu carinho por mim e cada chocolate. Natália Lins, por cada chute
que me impulsionou para frente.
Ao Bernardo Pereira por cada diálogo, desde assuntos gerais até minhas dúvidas
científicas ao longo do processo, sempre bem disposto e gentil.
À Marianne Rocha por ser a minha parceira em tudo nesses dois anos, me ofereceu
a sua amizade e até a sua família. Não tenho como agradecer por isso.
vii
Aos Geovane Lopes e André Borges pelo carinho, amizade e boas conversas.
À Carla Pereira, minha acessora favorita, pelo carinho e presença sempre
constantes.
À Fernanda Vasconcelos por ser a melhor secretária do mundo! Sempre com um
sorriso no rosto e disposta a ajudar. Impossível não te levar para as nossas vidas.
Ao revisor, André Roque, pelo cuidado e atenção com o meu trabalho além das
ótimas sugestões.
À banca, Joseli Lannes-Vieira, Mariana Waghabi e Roberto Saraiva, por suas
excelentes sugestões e correções além de todo o cuidado ao ler o meu trabalho.
Aos pacientes por se voluntariarem ao estudo. Sem eles nada disso seria possível.
Aos colaboradores do INI por fornecerem as amostras e auxiliarem na análise dos
dados.
À PGBCM, englobando todos os funcionários, pela qualidade do ensino e suporte
que me foi dado.
À FIOCRUZ, em especial ao IOC, por me permitir fazer parte de tudo isso.
Por fim, gostaria de agradecer aos que não foram citados, mas que de alguma forma
estiveram presentes e ajudaram durante o processo.
viii
“Somente sonhos são as asas do coração
Que ninguém poderá roubar.”
Hiroaki Matsuzawa e Nobuo Yamada
ix
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENOTÍPICA DE Trypanosoma cruzi EM PACIENTES
ACOMETIDOS COM A DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA EM UMA COORTE DO
BRASIL
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Ícaro Rodrigues dos Santos
A doença de Chagas constitui um grande problema de saúde pública em diversos
países da América Latina. Atualmente, estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas
estejam infectadas e 75 a 90 milhões estejam expostas à doença. O Trypanosoma
cruzi, seu agente etiológico, é representado por um conjunto de populações que
circulam em hospedeiros mamíferos e insetos vetores, apresentando grande
heterogeneidade de comportamento biológico e variações na sensibilidade a drogas
e prognóstico da doença. Assim, um grande desafio vem sendo identificar
marcadores genéticos dos isolados capazes de reuni-los em grupos discretos,
visando sua caracterização do ponto de vista epidemiológico e de patogenia. Neste
trabalho, utilizamos metodologias baseadas em PCR convencional e PCR em
Tempo Real (qPCR) para realizar a quantificação da carga parasitária e tipagem
molecular do parasito diretamente de amostras sanguíneas de pacientes portadores
da doença de Chagas crônica. Para isso, foram selecionados 65 pacientes com
sorologia positiva para T. cruzi, apresentando ou não a forma cardíaca da doença, e
92 indivíduos com sorologia negativa, todos atendidos no ambulatório do Instituto
Nacional de Infectologia Evandro Chagas, provenientes de diferentes regiões do
Brasil. As amostras foram coletadas antes de qualquer tratamento e codificadas,
para a realização de um estudo simples cego. A extração de DNA foi realizada a
partir das amostras de sangue preservadas em Guanidina-EDTA, seguida da
quantificação da carga parasitária por qPCR, em uma reação em multiplex, com um
alvo para o DNA nuclear satélite de T. cruzi e um alvo para o gene da RNAse P
humana, como um controle interno. Dos 157 indivíduos, 64 se mostraram positivos
por qPCR. A mediana da carga parasitária de todos os pacientes positivos foi de
2,293 Eq. par./mL, com a carga variando entre 0,06 e 153,7 Eq. par./mL. Em
paralelo, realizamos a genotipagem do parasito a partir das amostras de sangue,
baseado em uma metodologia desenvolvida a partir de dois algoritmos préexistentes. Nossos resultados reforçam o conhecimento epidemiológico das DTUs
de T. cruzi no Brasil, ao encontrar pacientes infectados por TcII e TcVI, indicando,
ainda, que a área de transmissão de TcIII e TcV pode estar sendo subestimada.
Além disso, foi observada uma associação entre TcV e TcVI com a manifestação
cardíaca da doença. Em conjunto, nossos dados apontam a avaliação da carga
parasitária e identificação do supbtipo do parasito como potenciais biomarcadores
para a progressão da doença de Chagas.
x
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
STUDY OF GENOTYPIC DIVERSITY OF Trypanosoma cruzi IN PATIENTS WITH
CHRONIC CHAGAS DISEASE IN A COHORT FROM BRAZIL
ABSTRACT
Ícaro Rodrigues dos Santos
Chagas disease is a major public health problem in many Latin American countries.
Currently, an estimated 6 to 7 million people are infected and 75 million to 90 million
are exposed to the disease. Trypanosoma cruzi, the etiological agent is represented
by a set of populations which circulate in mammalian hosts and insect vectors,
presenting highly heterogeneous biological behavior as well as changes in drug
sensitivity and prognosis of the disease. Thus, a major challenge is to identify genetic
markers of isolates able to bring them into discrete groups, for their characterization
from an epidemiological point of view and pathogenesis. In this study, we used
conventional PCR based methodologies and Real-Time PCR (qPCR) to perform the
quantification of parasite load and molecular typing of the parasite directly from blood
samples of patients with chronic Chagas disease. Therefore, we selected 65 patients
with positive serology for T. cruzi, with cardiac symptons or not, and 92 with negative
serology, all of them were patients from National Institute of Infectology Evandro
Chagas (INI), from different regions of Brazil. The samples were collected prior to any
treatment and codified for realization of a single-blind study. DNA extraction was
taken from blood samples preserved in Guanidine-EDTA, followed by quantification
of the parasite load by qPCR, in a multiplex reaction, with a target for nuclear satellite
DNA of T. cruzi and a target for human RNAse P gene, as an internal control. From
the 157 patients, 64 proved positive by qPCR. The parasite load median from all
positive patients was 2.293 Par. Eq./mL, with the load ranging between 0.06 and
153.7 Par. Eq./mL. In parallel, we conducted the parasite genotyping from the blood
samples, based on a methodology developed from two pre-existing algorithms. Our
results reinforce the epidemiological knowledge of T. cruzi DTUs in Brazil, from the
observation of several infected patients with TcII and TcVI, also indicating that TcIII
and TcV transmission area may be underestimated. Moreover, an association
between TcV and TcVI with cardiac symptons was observed. Taken together, our
data point to the evaluation of the parasitic load and the identification of parasite
genotype as potential biomarkers for the progression of Chagas disease.
xi
ÍNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO
1.1. Epidemiologia da doença de Chagas
1.2. O Trypanosoma cruzi
1.2.1. Ciclo biológico
1.2.2. Genoma
1.2.3. Diversidade genética
1.3. As Unidades de Tipagem Discretas (DTUs) de T. cruzi
1.3.1. Evolução das DTUs
1.3.2. Epidemiologia e patologia das DTUs
1.4. Aspectos clínicos da doença de Chagas
1.4.1 Fase aguda
1.4.2. Fase crônica
1.4.3. Forma cardíaca
1.4.4. Forma digestiva
1.4.5. Forma cardiodigestiva
1
5
5
8
10
14
14
17
21
21
22
22
23
24
1.5. Diagnóstico
1.5.1. Diagnóstico molecular
24
27
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
2.2. Objetivos específicos
30
30
30
3. METODOLOGIA
31
3.1. Casuísticas e recrutamento dos pacientes portadores de doença de
Chagas
31
3.2. Aspectos éticos
31
3.3. Cultivo de células
31
3.4. Coleta e preparo das amostras de sangue
32
3.5. Extração de DNA
32
3.6. Tipagem molecular de T. cruzi de amostras de sangue
33
3.7. Eletroforese em gel de agarose
34
3.8. Sequenciamento dos produtos
35
3.9. Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR)
35
3.10. Análise estatística
38
4. RESULTADOS
4.1. Descrição da população de estudo
4.2. Avaliação da carga parasitária
4.3. Tipagem molecular
4.3.1. Genotipagem em amostras de cultura de T. cruzi
4.3.2. Sequenciamento dos produtos
4.3.3. Limite de detecção
xii
39
39
41
46
46
48
49
4.3.4. Tipagem molecular de amostras de pacientes
4.3.5. Distribuição geográfica das DTUs
4.3.6. Comparação entre forma clínica e DTUs de T. cruzi
4.3.7. Comparação entre genótipo de T. cruzi e a carga parasitária
53
57
58
59
5. DISCUSSÃO
60
6. CONCLUSÕES
68
7. PERSPECTIVAS
69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
70
8. ANEXO
8.1. Termo de consentimento
8.2. Parecer comitê de ética
88
89
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1: Número estimado de imigrantes em países não endêmicos
3
Figura 1.2: Ciclo biológico do T. cruzi
7
Figura 1.3: Representação esquemática do lócus do Spliced Leader de T.
cruzi
12
Figura 1.4: Organização esquemática do cístron de rDNA de T. cruzi
13
Figura 1.5. Esquema da evolução de T. cruzi – Modelo “Duas Hibridizações”
16
Figura 1.6: Diagrama representando o modelo “Três Ancestrais” proposto
para as cepas de T. cruzi
17
Figura 1.7: Distribuição geográfica aproximada das DTUs de T. cruzi nos
ciclos de transmissão doméstico e silvestre, e manifestações clínicas
20
Figura 1.8. Evolução sorológica e parasitológica durante a infecção aguda e
crônica da doença de Chagas.
26
Figura 3.1. Algoritmo para caracterização molecular das DTUs de T. cruzi
baseada em três marcadores
32
Figura 3.2. Diluição da curva padrão
37
Figura 4.1. Relação entre faixa etária e sorologia para T. cruzi da população
estudada
40
Figura 4.2: Curva padrão com 6 pontos da diluição de DNA de T. cruzi
41
Figura 4.3: Curvas de amplificação do ensaio de qPCR – sistema TaqMan
para o alvo DNA satélite de T. cruzi
41
Figura 4.4. Comparação da reprodutibilidade da quantificação da carga
parasitária por qPCR de amostras distintas do mesmo paciente
40
Figura 4.5. Carga parasitária do total de pacientes com sorologia positiva
anti-T. cruzi
43
Figura 4.6. Correlação entre carga parasitária de pacientes soropositivos
com diferentes formas clínicas
44
Figura 4.7. Comparação entre carga parasitária e gênero dos pacientes
45
Figura 4.8:Tipagem molecular de Trypanosoma cruzi em amostras de cultivo
47
Figura 4.9. Limite de detecção da tipagem molecular para a região
intergênica I e II do Spliced Leader, em sangue artificialmente contaminado
com T. cruzi
50
Figura 4.10. Limite de detecção da tipagem molecular para o gene da
xiv
subunidade ribossomal 24S-α
α, em sangue artificialmente contaminado com
T. cruzi
51
Figura 4.11. Limite de detecção da tipagem molecular para o alvo no
fragmento nuclear A10, em sangue artificialmente contaminado com T. cruzi
52
Figura 4.12. Gel representativo da tipagem molecular de Trypanosoma cruzi
em amostras de pacientes portadores da doença de Chagas
52
Figura 4.13. Distribuição geográfica das DTUs
57
Figura 4.14: Comparação entre manifestação da doença e o genótipo de T.
cruzi
58
Figura 4.15. Relação entre carga parasitária e DTU
xv
59
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1. Condições de PCR para a tipagem molecular
34
Tabela 4.1. Resultados eletrocardiográficos dos pacientes
39
Tabela 4.2. Naturalidade dos indivíduos com sorologia positiva para T. cruzi
40
Tabela 4.3. Sensibilidade e especificidade clínicas da PCR em tempo real
45
Tabela 4.4. Alinhamento BLASTn (banco de dados NCBI) das sequências de
DNA dos produtos de PCR, para cada alvo de genotipagem
48
Tabela 4.5. Comparação entre a tipagem molecular de T. cruzi nas duas
amostras de sangue dos pacientes com sorologia positiva
55
xvi
Lista de siglas e abreviaturas
µL: microlitro
BHI: brain heart infusion
CCC: cardiomiopatia chagásica crônica
Ct: ciclo threshold
DNA: ácido desoxirribonucléico
DTU: Unidade Discreta de Tipagem (Discret Typing Unit)
ECG: eletrocardiograma
EDTA: ácido etilenodietildinitritotetracético
ELISA: Ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (enzyme-linked immunosorbent
assay)
Eq. Par./mL: Equivalentes de parasito por mililitro
Fiocruz: Fundação Oswaldo Cruz
g/L: grama por litro
GEB: Guanidine EDTA blood, sangue lisado em guanidina-EDTA
Guanidina-HCL: cloridrato de guanidina
h: hora
IFI: imunofluorescência indireta
Ig: imunoglobulina
INI: Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas
IOC: Instituto Oswaldo Cruz
ITS: espaçadores transcritos internos
kDNA: DNA do cinetoplasto
LOD: Limite de Detecção
LQ: Limite de Quantificação
M: molar
Mb: megabase
xvii
mL: mililitro
MLEE: eletroforese enzimática multilocus (multilocus enzyme electroforesis)
mM: milimolar
mRNA: ácido ribonucléico mensageiro
NA: alterações cardíacas não avaliadas
NaCl: cloreto de sódio
NTC: Negative template control, controle negativo
ºC: graus celsius
pb: pares de bases
PBS: tampão fosfato salino (phosphate buffer saline)
PCR: reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)
PCR-LSSP: Low stringency single specific primer
PFGE: eletroforese de campo pulsátil (pulse field gel electrophoresis)
pH: potencial hidrogeniônico
p= probabilidade de significância
qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa ou em tempo real
RAPD: Análises de DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente
RNA: ácido ribonucléico
RPM: rotação por minuto
rRNA: ácido ribonucléico ribossômico
SL: Spliced Leader
SSR-PCR: PCR de primer ancorado em Sequência Simples Repetida
T. cruzi: Trypanosoma cruzi
TBE: tampão feito com base trizma, ácido bórico e EDTA
TcI-VI: Trypanosoma cruzi I-VI, seis grupos do parasito, DTUs
TDR-WHO: Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases
TNF: Fator de necrose tumoral
xviii
WHO: World Health Organization
xix
1.
INTRODUÇÃO
A infecção humana tripanossomíase americana é denominada doença de
Chagas em reconhecimento a Carlos Ribeiro Justiniano Chagas quem a descobriu
em 1909 (Chagas, 1909), e apresenta uma ampla área endêmica que se estende do
sul dos Estados Unidos até a patagônia argentina, encontrada principalmente nas
Américas Central e do Sul, afetando primariamente populações rurais pobres. Além
disso, é considerada a mais importante infecção parasitária na América Latina com
sérias consequências para saúde pública e economias nacionais (Coura, 2005).
1.1.
Epidemiologia da doença de Chagas
A doença de Chagas é uma zoonose complexa causada pelo protozoário
Trypanosoma cruzi, transmitido principalmente através das fezes contaminadas de
insetos triatomíneos durante o repasto sanguíneo. Outras formas de transmissão do
parasito incluem transfusão de sangue, congênita (ocorrendo em até 10% das
mulheres grávidas infectadas) e oral – através da ingestão de alimentos e bebidas
contaminados com formas tripomastigotas de T. cruzi. Além das formas citadas
anteriormente, mesmo ocorrendo em menor freqüência, podem ser citados o
transplante de órgãos e os acidentes laboratoriais (Prata, 2001; WHO 2015). A
transfusão de sangue e o transplante de órgãos são as vias primárias de infecção
em países onde não ocorre transmissão vetorial (Schmunis, 2007).
Os vetores, principalmente os insetos hematófagos, pertencentes ao filo
Arthropoda, subfilo Hexapoda, ordem Hemiptera, família Reduviidae e subfamília
Triatominae, que engloba os gêneros Triatoma, Panstrongylus e Rhodnius, além de
outros 12 gêneros, têm transmitido a infecção entre animais por quase 10 milhões
de anos. Mais de 150 espécies de triatomíneos e mais de 100 espécies de
mamíferos, majoritariamente espécies silvestres, mantém a infecção de T. cruzi na
natureza (Coura & Viñas, 2010). No Brasil, 52 espécies de triatomíneos foram
descritos, mas poucas têm importância epidemiológica particular, enquanto as
outras espécies são silvestres e mantém o ciclo natural apenas com animais
silvestres (Coura & Dias, 2009). Há mais de 100 espécies que servem de
reservatório de T. cruzi e foram descritas entre marsupiais, morcegos, carnívoros,
roedores e primatas não-humanos. Entre os reservatórios domésticos, é importante
1
ressaltar o potencial de cachorros, gatos, ratos domésticos, camundongos e
porquinhos-da-índia, em países onde eles são criados em casa. Outros animais,
como suínos e caprinos, também foram encontrados infectados. Pássaros, répteis e
peixes não se tornam infectados por terem “lisinas” que destroem T. cruzi (Coura &
Dias, 2009).
A doença de Chagas, que era inicialmente uma enzootia silvestre, foi
transformada em uma zoonose quando o homem invadiu o ecótopo selvagem e
ocupou o espaço físico, podendo ter alcançado o ápice através de sua ação
predatória de desmatar para agricultura, criação de gado, a abertura de rotas para
transporte (ferrovias e rodovias), deslocando os animais silvestres e construindo
casas. Deste modo, os triatomíneos, principalmente Triatoma infestans, se
adaptaram às áreas ao redor e dentro de domicílios humanos, se alimentando do
sangue de animais domésticos e de humanos, na América do Sul. Assim, três ciclos
intercomunicantes se estabeleceram: silvestre, peridoméstico e doméstico. Na
natureza, T. cruzi mantém seus três ciclos. O ciclo doméstico é mantido por meio de
triatomíneos que costumam habitar áreas domiciliares, que transmitem a infecção de
animais domésticos para humanos e entre humanos também. Seu ciclo silvestre é
enzoótico e mantido por triatomíneos e animais silvestres, enquanto o ciclo
peridoméstico é originado do ciclo silvestre e mantém a infecção entre animais
domésticos em áreas ao redor de moradias humanas através de triatomíneos
peridomésticos e, ocasionalmente, através de trocas com o ciclo silvestre (Coura,
2007; Coura & Dias, 2009).
Estima-se que cerca de 6 a 7 milhões de pessoas estejam infectadas em todo
o mundo e 75 a 90 milhões estejam expostas à infecção pelo parasito (WHO, 2015;
Coura & Dias, 2009), mais comumente na América Latina, onde a doença de
Chagas é endêmica. A doença é principalmente encontrada em áreas endêmicas de
21 países da América Latina (Argentina, Belize, Bolívia, Brasil, Chile, Colômbia,
Costa Rica, Equador, El Salvador, Guatemala, Guiana, Guiana Francesa, Honduras,
México, Nicarágua, Panamá, Paraguai, Peru, Suriname, Venezuela e Uruguai).
Atualmente, as maiores prevalências de doença de Chagas foram reportadas
na Bolívia (6,8 %), Argentina (4,1 %), El Salvador (3,4 %), Honduras (3,1 %) e
Paraguai (2,5 %). De qualquer modo, dois países remanescentes com prevalência
de quase 1% (Brasil e México), juntos com a Argentina, são o lar de quase 60% de
todas as pessoas infectadas com T. cruzi na América Latina (Rassi Jr e cols., 2010).
2
A doença de Chagas autóctone transmitida pelo vetor nos EUA é rara,
presumivelmente devido às melhores condições de moradia e aos vetores menos
eficientes, apesar de que muitas infecções provavelmente não são detectadas. Os
dois principais vetores nos Estados Unidos (Triatoma sanguisuga e Triatoma
gerstaeckeri) mostram diferentes hábitos alimentares e freqüentemente defecam 30
minutos ou mais depois do repasto, tornando-os de certa forma ineficientes em
transmissão através das fezes contaminadas para hospedeiros (Kribs-Zaleta, 2010).
De qualquer modo, o grande fluxo de imigrantes provenientes de países
endêmicos indica que a doença de Chagas está se tornando um problema de saúde
importante nos EUA, Canadá e em muitas partes da Europa e do Pacífico oriental,
onde um aumento no número de indivíduos infectados foi identificado (Schmunis,
2007; Guerri-Guttenberg e cols., 2008; Bern & Montgomery, 2009; Gascon e cols.,
2009). Assim, a prevalência de infecção crônica por T. cruzi nos EUA têm
aumentado substancialmente nos últimos 20 anos, devido ao grande número de
imigrantes de países endêmicos (Kirchhoff & Rassi Jr, 2011). Estima-se que vivem
nos EUA mais de 300 mil indivíduos (principalmente, oriundos do México) infectados
com T. cruzi (Bern & Montgomery, 2009). A Espanha tem o segundo maior número
de imigrantes infectados, estimado entre 47 e 67 mil, com a maior parte originada do
Equador, Argentina, Bolívia e Peru (Gascon e cols., 2009).
Figura 1.1. Número estimado de imigrantes em países não endêmicos. Adaptado de
Rassi Jr, 2010
3
Desde 1990, programas de controle de vetores na América Latina (como a
Iniciativa para Controle/Eliminação da Doença de Chagas do Cone Sul, Iniciativa
para Controle/Eliminação da Doença de Chagas do Pacto Andino e Iniciativa para
Controle/Eliminação da Doença de Chagas da América Central) levaram a reduções
substanciais na transmissão por vetores domésticos. Além disso, a triagem
compulsória dos bancos de sangue tem reduzido substancialmente novos casos de
infecção e diminuído a ocorrência da doença de Chagas na América Latina
(Moncayo, 2003; WHO, 2015). A transmissão de T. cruzi pelo principal vetor
domiciliar, T. infestans, foi dada como interrompida no Uruguai em 1997, Chile em
1999, Brasil em 2006 e alguns países da América Central, El Salvador, Guatemala,
Honduras e Nicarágua (2009-2010), (WHO, 2012).
Dentre as recomendações de prevenção e controle da doença de Chagas, se
encontram: uso de inseticidas em residências e em áreas ao redor, melhorias das
moradias para prevenir a infestação de vetores, medidas de prevenção pessoais
como telas em volta das camas, boas práticas de higiene na preparação de
alimento, transporte, armazenamento e consumo, triagem de bancos de sangue,
teste de doadores e recebedores de órgãos, tecidos ou células, e triagem de recém
nascidos e outros filhos de mães infectadas para providenciar diagnóstico e
tratamento precoce (WHO, 2015).
De acordo com a legislação federal, vários países endêmicos estão
atualmente executando a triagem para T. cruzi em doações de sangue com
cobertura de quase 100% na maioria dos países endêmicos (Rassi jr e cols., 2012;
Moncayo, 2003), e o número de amostras de sangue infectadas diminuiu
substancialmente em todos os países da América Latina (Schmunis, 1991; WHO,
2002). Apenas na Colômbia, o custo anual de cuidados médicos para todos os
pacientes com a doença foi estimado ser de quase US$ 267 milhões. De acordo
com a OMS, a pulverização de inseticidas para o controle de vetores custaria por
volta de US$ 5 milhões anualmente (WHO, 2013). Estas medidas têm contribuído
para a redução da incidência de novos casos (700 mil por ano em 1990 contra
41200 por ano em 2006) e o número de mortes por doença de Chagas (cerca de 50
mil por ano contra 12 500 por ano (Moncayo & Silveira, 2009).
Países não-endêmicos com amplas populações de imigrantes começaram a
estabelecer intervenções para prevenir infecção de T. cruzi associada à transfusão.
A triagem de sangue para doação nos EUA começou em 2007, e atualmente cobre a
maior parte do suprimento de sangue. Cerca de 1 em 28 000 doadores
4
apresentavam infecção por T. cruzi. Com isso, mais de 1400 doadores infectados
foram identificados e proibidos permanentemente de doar (Kirchhoff & Rassi Jr,
2011). A legislação européia também impede que pessoas com um histórico de
doença de Chagas doem sangue.
O risco de transmissão vetorial ainda existe, devido ao fato do protozoário
circular entre outras espécies de triatomíneos, considerados vetores secundários, e
diversos mamíferos, em vários ambientes silvestres onde há atividade humana
(Oliveira Filho, 1999). Além disso, vários surtos de infecção por via oral, geralmente
relacionados à presença de vetores e reservatórios infectados pelo parasito nas
proximidades, têm sido registrados (Valente, 2005; Steindel e cols., 2007; Nobrega e
cols., 2009). Atualmente, a via oral pode ser considerada a principal via de
transmissão em novos casos de doença de Chagas no Brasil.
1.2.
O Trypanosoma cruzi
T. cruzi é um protozoário do filo Sarcomastigophora, subfilo Mastigophora, classe
Zoomastigophora, ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae. Nesta família
encontramos flagelados com 1 flagelo que se origina de uma invaginação, conhecida
como bolsa flagelar e normalmente contém uma estrutura paraflagelar, além de uma
estrutura proeminente, conhecida como cinetoplasto, que corresponde a uma
condensação de DNA localizado no interior dessa mitocôndria única e ramificada por
todo o corpo do protozoário (Rey, 2008). Em seu ciclo de vida, o T. cruzi possui três
formas evolutivas diferenciadas morfologicamente pela posição e emergência do
flagelo (Brener, 1997).
1.2.1. Ciclo biológico
O ciclo de vida do T. cruzi é complexo, apresentando variações morfológicas
e funcionais durante seu desenvolvimento em insetos vetores e hospedeiros
mamíferos, com alternância entre estágios que sofrem divisão binária e formas não
replicativas e infectantes (Brener, 1971; 1973). O inseto triatomíneo se torna
infectado no ato do repasto sanguíneo, através da ingestão de sangue de animais
ou humanos que tenham parasitos circulantes (forma tripomastigota sanguínea –
forma alongada com o cinetoplasto localizado na região distal em relação ao longo
5
flagelo, além da presença de uma membrana ondulante). Uma vez ingeridos, muitos
dos tripomastigotas são lisados no estômago do inseto (Castro e cols., 2007). No
trato digestivo dos triatomíneos, os tripomastigotas sobreviventes se diferenciam em
epimastigotas (forma multiplicativa – forma alongada com o cinetoplasto localizado
entre o núcleo e o flagelo – forma mais comum a ser cultivada em laboratório), estes
migram para o intestino onde eles se dividem intensamente e aderem às
membranas perimicrovilares que são secretadas pelas células intestinais do intestino
posterior (Alves e cols., 2007; Nogueira e cols., 2007). O processo de adesão de
epimastigotas
às
membranas
perimicrovilares
envolve
a
participação
de
glicoconjugados expostos na superfície (Alves e cols., 2007). Este passo de adesão
parece ser importante para engatilhar o processo de diferenciação dos
epimastigostas não infectivos em tripomastigotas altamente infectivos (conhecidos
como tripomastigotas metacíclicos) na porção final do intestino do hospedeiro
invertebrado, em um processo conhecido como metaciclogênese (Contreras e cols.,
1993, De Souza e cols., 2010).
Nas regiões mais posteriores do intestino e do reto, muitos epimastigotas
destacados da superfície intestinal e diferenciados em forma tripomastigota
metacíclica, são liberados juntos com fezes e urina (Garcia e cols., 2007) após o
repasto sanguíneo. A infecção nos mamíferos tem início quando estes entram em
contato com as fezes e urina contaminadas de triatomíneos. Esse contato ocorre
através da mucosa ou injúria tecidual, que pode ser pré-existente ou resultante da
picada do inseto. O parasito não penetra a pele intacta, somente infectando o
hospedeiro via mucosa ou ferimentos na pele (Contreras e cols., 1993, De Souza e
cols., 2010), além de poder ser adquirido por via oral.
Uma vez no hospedeiro vertebrado, os tripomastigotas metacíclicos invadem
as células na local do inóculo (podendo invadir diferentes tipos celulares incluindo
macrófagos,
fibroblastos
ou
células
epiteliais,
entre
outras)
através
do
reconhecimento entre o parasito e as células do hospedeiro em um processo que
envolve uma grande variedade de moléculas presentes em ambas as células,
iniciando o ciclo de vida intracelular do T. cruzi. As formas metacíclicas, ao
penetrarem nas células do hospedeiro, irão induzir a formação de um vacúolo
endocítico denominado como vacúolo parasitóforo, residindo no interior desse. Esse
vacúolo é um produto não só da entrada do parasito na célula, mas também da
fusão de lisossomos recrutados pela célula hospedeira. Estas fusões são
importantes para tornar o pH do vacúolo acidificado, o que será importante para a
6
diferenciação de formas longas e finas em arredondadas com flagelo curto,
característica das formas amastigotas, e produção de enzimas pelo parasito que
levarão à lise da membrana do vacúolo parasitóforo (Carvalho & De Souza, 1989).
Assim, estas formas amastigotas entram em contato direto com as organelas da
célula hospedeira (De Souza e cols., 2010).
Os amastigotas se proliferam intracelularmente por fissão binária até a célula
ficar repleta dessas formas. Depois, esses amastigotas se diferenciam em
tripomastigotas, que são as principais formas liberadas no tecido ou na corrente
sanguínea após a ruptura da célula. Os tripomastigotas sanguíneos podem então
invadir novas células localizadas no sítio de infecção ou podem atingir a via linfática
e sanguínea, e potencialmente atingir diferentes tecidos do hospedeiro, invadindo os
mais diversos tipos celulares, em especial células musculares (cardíaca, lisa e
esquelética) e ganglionares, ou serem ingeridas por insetos triatomíneos durante o
repasto sanguíneo, fechando o ciclo (De Souza e cols., 2010).
Figura 1.2. Ciclo biológico do T. cruzi. 1. Inseto triatomíneo faz o repasto
sanguíneo (passando os tripomastigotas metacíclicos nas fezes, tripomastigotas
entram na ferida da picada ou membranas da mucosa, como a conjuntiva. 2.
7
Tripomastigotas penetram várias células no local da picada. No interior das células,
se diferenciam em amastigotas. 3. Amastigostas se multiplicam por fissão binária
nas células dos tecidos infectados. 4. Amastigotas intracelulares se diferenciam em
tripomastigotas, então irrompem da célula e entram na corrente sanguínea. 5.
Podem infectar outras células e se diferenciar em amastigostas intracelulares em
novos locais de infecção. Manifestações clínicas podem resultar deste ciclo infectivo.
6. Inseto triatomíneo realiza o repasto sanguíneo (tripomastigotas ingeridos). 7.
Epimastigotas no intestino. 8. Multiplicação no intestino. 9. Tripomastigotas
metacíclicos no reto. (Adaptado de http://www.cdc.gov/parasites/chagas/biology.html)
1.2.2. Genoma
O T. cruzi possui dois genomas distintos, situados em dois compartimentos
celulares bem definidos: o núcleo e a mitocôndria, da mesma forma que ocorre em
outros eucariotos (Klingbeil & Shapiro, 2009). Em tripanossomatídeos, existe uma
única e grande mitocôndria que contém uma região especializada, denominada de
cinetoplasto, onde se encontra o DNA mitocondrial, também chamado de DNA do
cinetoplasto ou kDNA. No T. cruzi, o DNA mitocondrial compreende cerca de 20 a
25% do DNA total da célula e está organizado em uma rede complexa de moléculas
circulares concatenadas, compostas por 10 a 20 mil cópias de minicírculos (de 1.400
pares de base, cada), que codificam para RNAs pequenos (RNAs guia). Estes
participam do processo de edição dos transcritos pelo maxicírculo, e entre 20 e 50
cópias de maxicírculos (com tamanho aproximado de 40.000 pares de bases),
codificam para proteínas da cadeia de transporte de elétrons e RNA ribossômico
mitocondrial (Verlag & Verlag, 2001).
O minicírculo contém quatro regiões de sequência conservada intercaladas
por quatro regiões de sequência variável. Estas últimas apresentam alta taxa de
mutação, que confere grande diversidade entre os minicírculos dos isolados de T.
cruzi (Degrave e cols., 1988). Nas regiões de sequência conservada, observa-se a
ocorrência de blocos de sequências conservadas ou mini repeats, utilizadas como
molde para o desenho de oligos iniciadores em processos moleculares de detecção
e tipagem de T. cruzi, estudos laboratoriais, diagnósticos, clínicos e epidemiológicos
(Sturm e cols., 1989).
Em 2005, a sequência completa do genoma do clone CL Brener de T. cruzi foi
obtida por um consórcio internacional, juntamente com os dados do genoma de dois
8
outros tripanossomatídeos causadores de importantes doenças tropicais, o
Trypanosoma brucei e a Leishmania major (El-Sayed e cols., 2005). Naquela
oportunidade, foram identificados pares de alelos para metade dos genes de CL
Brener. A anotação da seqüência completa do genoma, que possui entre 106,4 e
110,7 Mb e apresenta um conteúdo de G+C de 51%, indicou a existência de 22.570
genes codificando proteínas, sendo que destes, 12.570 representam pares de
alelos. Deste total (cerca de 12.000 genes), foi possível determinar a função de
50.8% com base na literatura e em resultados de similaridade com proteínas já
caracterizadas ou na presença de domínios funcionais característicos (El-Sayed e
cols., 2005).
O genoma nuclear de T. cruzi é formado por sequências repetitivas tais como
retrotransposons, repetições subteloméricas e genes das famílias de moléculas de
superfície. Estes genes incluem os que codificam trans-sialidases, mucinas,
proteínas associadas à mucinas (MASP) e a glicoproteína de superfície gp63. As
moléculas de superfície compreendem a maior parte das famílias gênicas codantes,
representando 18% do total dos genes que codificam proteínas no genoma do
parasito (El-Sayed e cols., 2005). Muitas dessas sequências estão organizadas em
tandem. Esses agrupamentos podem estar distribuídos em diferentes cromossomos,
e o número de cópias de repetição pode variar de um agrupamento para outro. No
genoma do T. cruzi, estão arranjados em tandem os micro e minissatélites, os genes
do rRNAs, os genes da sequência líder (spliced-leader) e dos mRNAs de tubulina,
amastina, calmodulina, entre outros (Beckman & Weber, 1992, Ajioka & Swindle,
1993; Teixeira e cols., 1994). Devido a essa grande variedade de sequências
repetidas, este genoma demonstra ser de grande plasticidade (Clayton, 2002).
Apesar do número exato de cromossomos na espécie não ter sido ainda
definido, uma vez que esses não se condensam durante a divisão celular (De
Souza, 2002), a forma de se estipular o número e tamanho dos cromossomos é
através de análises de eletroforese de campo pulsátil (pulse field gel electrophoresis
- PFGE). Utilizando essa técnica em vários isolados, seguida de hibridação com
seqüências teloméricas e sondas de genes conservados, chegou-se à conclusão de
que se trata de um genoma diplóide com um número estimado entre 20 e 40
cromossomos homólogos que apresentam tamanhos muito diferentes, variando
entre 0,45 Mb e 3,5 Mb (Cano e cols, 1995; Porcile e cols., 2003; Brance e cols.,
2006; Teixeira e cols., 2006).
9
Genes de protozoários cinetoplastídeos são essencialmente livres de íntrons,
os quais foram identificados em apenas quatro genes. São predominantemente
arranjados em unidades longas policistrônicas, transcritas constitutivamente, que
incluem vários genes organizados em tandem os quais, em geral, não são
funcionalmente relacionados (Tschudi & Ullu 1988; Kramer, 2012) e não apresentam
o mesmo padrão de regulação (Tschudi & Ullu, 1988; Clayton, 2002). As unidades
policistrônicas
são
subsequentemente
processadas
e
produzem
mRNAs
monocistrônicos maduros, sendo acoplados nas reações de trans-splicing a uma
pequena sequência de spliced-leader de 39 nucleotídeos à extremidade 5’, e
poliadenilação na extremidade 3’. A forma incomum de organização do genoma
pode ter evoluído para permitir ao parasito ter um genoma muito denso (em relação
aos genes) e reduzir o tempo de ciclo celular, representando uma vantagem para o
organismo (Kramer, 2012).
1.2.3. Diversidade genética
O T. cruzi é representado por um conjunto de populações, denominados
isolados ou cepas, que circulam em hospedeiros mamíferos e insetos vetores,
apresentando grande heterogeneidade de comportamento biológico como, por
exemplo, diferentes níveis de patogenicidade para animais experimentais e
humanos, além de variações na sensibilidade a drogas e prognóstico da doença
(Macedo & Pena, 1998; Campbell e cols., 2004), assim como sua complexidade ecoepidemiológica (Miles e cols., 2009). A doença também apresenta diversidade em
sua apresentação clínica, que vai desde a forma indeterminada até cardíaca e/ou
digestiva (WHO, 2015, Rassi e cols., 2010). Assim, um grande desafio para a
comunidade científica vem sendo identificar marcadores genéticos dos isolados
capazes de reuni-los em grupos discretos, visando sua caracterização do ponto de
vista epidemiológico e de patogenia.
O primeiro método experimental que demonstrou a extensão da diversidade
genética de T. cruzi foi a análise de variantes eletroforéticas de enzimas celulares
(isoenzimas). Baseando-se na variabilidade de seis loci (Miles e cols.1978, Miles,
1980) foi proposta a existência de 3 grupos isoenzimáticos (zimodemas 1, 2 e 3,
representados Z1, Z2 e Z3, respectivamente) de T. cruzi. Estudos epidemiológicos
demonstraram que Z1 e Z3 eram associados com o ciclo silvestre e 2 com o ciclo de
transmissão doméstica (Miles e cols., 1978; Miles, 1980, Barret e cols., 1980).
10
O primeiro estudo do polimorfismo de DNA em T. cruzi foi publicado em 1980
por Morel e cols., que descrevia a tipagem dos minicírculos de kDNA através dos
polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). Populações de
parasitos mostrando padrões de restrição de kDNA idênticos ou muito similares
foram chamados de esquizodemas. Combinados com experimentos de clonagem,
analises de restrição de kDNA demonstraram pela primeira vez que isolados de T.
cruzi poderiam conter dois ou mais clones distintos (Morel e cols., 1980).
Uma forma alternativa e sensível para estudar o porlimorfismo do kDNA é o
método de PCR-LSSP (Low Stringency Single Specific Primer) (Vago e cols.,
1996a). Nesta técnica, um DNA previamente purificado é submetido à PCR
utilizando um único primer específico sob condições de estringência muito baixas. O
primer hibridiza especificamente à sua região complementar e também à múltiplos
sítios não específicos dentro do fragmento, em uma forma dependente da
sequência. Desta forma, é produzido um conjunto altamente complexo de produtos
de reação que podem ser resolvidos por eletroforese, para gerar ‘assinaturas
gênicas’ (Pena e cols. 1994, Pena & Simpson, 1996). A PCR-LSSP foi aplicada de
forma bem sucedida ao fragmento de DNA variável de ~330 pb dos minicírculos do
kDNA de T. cruzi para produzir as ‘assinaturas gênicas’, permitindo, pela primeira
vez, apresentar o perfil de parasitos nos tecidos de pacientes cronicamente
infectados (Vago e cols.1996b).
A técnica RAPD (Análises de DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)
baseada em PCR é a menos usada, mas intimamente relacionada à PCR de primer
ancorado em Sequência Simples Repetida (SSR-PCR), que providenciou uma busca
sensível por perfil de T. cruzi e ferramentas úteis para estabelecer um
relacionamento genético entre os isolados (Dias Neto e cols. 1993, Steindel e cols.
1993, Tibayrenc e cols. 1993, Oliveira e cols. 1997, Brisse e cols. 2000a). Padrões
de bandas específicos para cepas e complexos foram evidenciados para diferentes
populações de T. cruzi, apesar de nenhuma relação com aspectos clínicos ter sido
encontrada (Oliveira, 1997). Em outro estudo, foi definido um marcador molecular,
desenvolvendo primers alvejando a sequência do fragmento A10-e isolado por
RAPD a partir do clone CL Brener (Brisse e cols., 2000b).
O spliced leader (figura 1.3) é codificado em blocos de unidades repetidas em
tandem, os genes do mini exon (ME). Alinhamento comparativo de diferentes cepas
de T. cruzi mostrou a presença de regiões de sequências altamente conservadas de
39 pb (os éxons), regiões similares de 73 pb com mais de 98% de identidade
11
(correspondendo aos íntrons) e regiões intergênicas divergentes (menos de 59% de
similaridade), (Murthy e cols. 1992, Souto e cols. 1996). Pelo uso de PCR multilocus
foi possível agrupar as cepas de T. cruzi em dois grupos de acordo com os produtos
amplificados. Cepas que apresentavam produtos de 300 pb eram designados como
pertencentes ao grupo 1 (T. cruzi II) e aqueles que apresentavam produtos com 350
pb eram designados como pertencentes ao grupo 2 (T. cruzi I), (Souto e cols. 1996).
Figura 1.3. Representação esquemática do lócus do Spliced Leader (SL) de
T. cruzi. O SL é organizado em unidades repetidas em tandem no qual a região do
éxon PE é conservada em todos os cinetoplastídeos (caixas pretas). Regiões de
íntrons são indicadas pelas caixas cinza e o espaçador não transcrito é
representado pela conexão em linha preta. A tipagem por SL é baseada em PCR
usando iniciadores para sítios específicos na região do espaçador (Extraído de
Macedo e cols., 2004).
Em tripanossomas, o cístron ribossomal exibe uma organização singular,
representado na figura 1.4. Ambas as subunidade maior (24S) e subunidade menor
(18S) são consideravelmente maiores do que o rRNA das espécies eucariotas
típicas. Particularmente interessante é a 24S, que contém 2 componentes RNAs
com alto peso molecular (24Sα/24Sβ) e seis componentes RNAs com baixo peso
molecular (S1-S6) (Leon e cols., 1978; Hernandez e cols., 1990; Arruda e cols.,
1990). O cístron de rDNA é constituído de sequências repetidas, nas quais as
regiões codificantes das 18S e 24S são separadas por dois espaçadores internos
transcritos (ITS). O ITS1 separa a região codificante da subunidade 18S do rDNA
5.8S, e o ITS2 separa a sequência de rDNA 5.8S do rDNA 24S. Comparações entre
o gene rRNA 24sα de T. cruzi e de outros tripanossomatídeos mostrou alta
homologia, exceto por regiões discretas. O domínio mais divergente (D7) é um
segmento de cerca de 100 pb localizado na extremidade 3’ do gene de T. cruzi
12
(Arruda e cols. 1990, Souto & Zingales 1993). Inicialmente, a amplificação por PCR
da sequência do domínio D7 revelou um dimorfismo quando o DNA de diferentes
isolados de T. cruzi foi usado (Souto & Zingales, 1993). Três diferentes grupos ou
linhagens de isolados de T. cruzi poderiam ser detectados. Isolados da linhagem 1
apresentavam produtos de 125 pb e outro grupo (linhagem 2) apresentavem um
produto de 110 pb. Um terceiro grupo apresentando ambos os produtos de PCR e
denotando grupo ½ (Souto e cols. 1996).
Figura 1.4. Organização esquemática do cístron de rDNA de T. cruzi. A
subunidade pequena (18S) está indicada pela caixa cinza e a subunidade grande
(24S) por caixas negras. O cístron do rDNA é constituído de sequências repetidas,
onde as regiões codificantes do 24S e 18S são separadas por dois espaçadores
transcritos internos (ITS). O ITS 1 separa a região codificante da subunidade 18S e
a sequência do rDNA 5.8S, e o ITS 2 separa rDNA 5.8S do rDNA 24S. A tipagem do
rDNA é realizada utilizando iniciadores que amplificam uma região dimórfica na
extremidade 3’ do gene do rDNA 24Sα (Extraído de Macedo e cols., 2004).
A descoberta dos microssatélites (repetições polimórficas em tandem de
motivos simples de 2-6 bases de comprimento) em T. cruzi providenciou uma nova
ferramenta para a análise da estrutura populacional do parasito (Oliveira e cols.
1998). Estes marcadores de DNA são extremamente polimórficos e estão dispersos
através de genoma nuclear do parasito. As análises de microssatélite de diferentes
cepas e clones de T. cruzi constituíram um teste simples de triagem para estimar se
uma cepa de T. cruzi é uma população monoclonal ou policlonal (Oliveira e cols.
1998; Macedo e cols. 2001).
Em 1999, a comunidade científica, em consenso, reuniu os isolados de T.
cruzi em dois grupos principais com características epidemiológicas particulares e
13
estes passaram a ser denominados grupos T. cruzi I e T. cruzi II, depois de sua
caracterização utilizando eletroforese enzimática multilocus (multilocus enzyme
electroforesis – MLEE) e DNA polimórfico de amplificação aleatória (RAPD) ou loci
genético como genes mini éxon e rDNA 24Sα (Anonymous, 1999). Após 10 anos do
primeiro consenso, a nomenclatura sub-específica de T. cruzi foi revisada. Esta nova
revisão inclui seis Unidades de Tipagem Discretas (DTUs) – T. cruzi I a VI –
baseadas em diferentes marcadores moleculares e características biológicas do
parasito (Zingales e cols., 2009; Zingales e cols., 2012). Os conceitos de DTUs e
evolução clonal foram estabelecidos no contexto da pesquisa relacionada à modelo
de evolução em T. cruzi (Tibayrenc e cols., 1986). Foi definido por Tibayrenc, em
1998, que DTU seria um conjunto de unidades populacionais que são geneticamente
mais relacionadas entre si do que para qualquer outra unidade, e que são
identificáveis por marcadores moleculares ou imunológicos comuns, constituindo
unidades
confiáveis
para
análise
de
epidemiologia
molecular
e
estudos
experimentais de evolução.
Apesar da descoberta de diversos marcadores moleculares com o passar dos
anos, não é possível utilizar apenas um deles para a resolução completa das DTUs.
Com isso, a tipagem molecular multilocus se apresenta como a forma mais segura e
confiável até o presente momento (Zingales e cols., 2012).
1.3 As Unidades de Tipagem Discretas (DTUs) de T. cruzi
1.3.1. Evolução das DTUs
As cepas de T. cruzi formam um complexo de populações multiclonais que
diferem em suas características genéticas (Andrade e Magalhães, 1997). Como
mencionado anteriormente, o T. cruzi é predominantemente diplóide (El-Sayed e
cols., 2005) e o seu método de replicação celular se dá através de fissão binária.
Sob o modelo clonal, novas DTUs surgem do acúmulo de mutações discretas não
afetadas por eventos raros de trocas genéticas (Zingales e cols., 2012).
Análises de diversos marcadores moleculares demonstraram que as
populações do parasito poderiam ser agrupadas em grupos distintos, alguns
permitiam a divisão em até quatro grupos, mas sempre houve a necessidade de
usar mais de um marcador para uma melhor distinção. Principalmente devido às
similaridades entre grupos híbridos (TcV e TcVI), que se encontravam dentro de
14
mais de um grupo ao usar certos marcadores, reforçando, assim, sua
heterozigosidade (Chapman e cols., 1984; Souto e cols., 1996; Barnabé e cols.,
2000; Machado e Ayala, 2001; Diosque, 2003; Sturm e cols., 2003; Rozas e cols.,
2008; Lewis e cols., 2011; Yeo e cols., 2011).
A atual estrutura da população de T. cruzi revela o fato de que dois distintos
eventos de hibridização separados por períodos de evolução clonal ocorreram.
Possivelmente, ocorreu o inicio da evolução clonal de duas linhagens (DTUs
ancestrais I e II) a partir de um ancestral comum (DTU universal). O primeiro evento
de hibridização teria sido uma fusão entre as DTUs ancestrais, resultando em uma
“progênie híbrida” na qual poderiam ser formados alelos em mosaico (ancestral
comum de III e IV). A eventual perda de heterozigosidade desta progênie teria sido
seguida por uma evolução clonal independente para formar as DTUs III e IV, se
apoiando no fato de que estas duas DTUs compartilham muitos SNPs, esse evento
teria ocorrido quase que simultaneamente. Um segundo evento de hibridização entre
DTU II e III teria gerado as DTUs V e VI (Figura 1.5). Neste evento, foi mantida a
heterozigosidade das duas DTUs, talvez para servir como uma vantagem adaptativa,
bem como ao aumentar o espectro de hospedeiros ou aprimorar a invasão celular,
particularmente em genes envolvidos na interação parasito-hospedeiro. A fusão das
DTUs gera a oportunidade para a formação de um “alelo aperfeiçoado”, por
exemplo,
em
genes
que
codificam
proteínas
de
expressão
constitutiva
(housekeepings) que são requisitadas em aspectos gerais do metabolismo celular:
as DTUs de T. cruzi sofrem uma fusão genética resultando na criação de uma DTU
heterozigota com um genoma aneuplóide ou poliplóide, como aconteceu com as
DTUs V e VI; a recombinação ocorre entre alelos de heterozigotos, resultando em
sequências mosaicas; conversão de genes homogeniza loci; perda de cromossomo
restaura diploidia resultando em organismo diploide homozigoto, como as DTUs II e
IV. A ordem destes eventos não está fixa e poderia variar para diferentes loci
(Westenberger e cols., 2005).
15
Figura 1.5. Esquema da evolução dos grupos de T. cruzi – Modelo “Duas
Hibridizações”. Caixas representam os grupos existentes e seus progenitores
ancestrais. As linhas conectando as caixas representam períodos de reprodução
clonal. Flechas representam contribuições de várias DTUs para formar novas
populações híbridas. De um genótipo ancestral universal comum, dois genótipos
diferentes comuns surgiram que são representadas atualmente como as DTUs I e II.
Populações destas DTUs subsequentemente hibridizaram para produzir as DTUs III
e IV. Uma segunda hibridização entre as populações das DTUs II e III resultaram
nas populações das DTUs V e VI (Adaptado de Westenberger e cols., 2005).
Em outro modelo, “Três Ancestrais” (Freitas, 2006), é proposto o seguinte
cenário para a evolução das populações de T. cruzi: em um passado distante
existiam no mínimo 3 clados ancestrais determinados como T. cruzi I, II e III,
associando, também, com os resultados encontrados nos estudos de isoenzimas
desenvolvido por Miles e colaboradores (1978). Provavelmente, T. cruzi II e III
tiveram seus nichos ecológicos sobrepostos, definindo assim as condições
necessárias para uma hibridização pudesse ocorrer. No mínimo, dois eventos de
hibridização distintos teriam produzido progênies viáveis. Em ambos os eventos, o
doador citoplasmático para o resultado identificado por análises mitocondriais, seria
T. cruzi III, derivando híbridos heterozigotos divididos em dois grupos diferentes,
DTUs V e VI, demonstrando esse parentesco das cepas híbridas através das
reconstituições de haplótipo (figura 1.6).
16
Figura 1.6. Diagrama representando o modelo “Três Ancestrais” proposto para
as cepas de T. cruzi. Retângulos indicam as DTUs diferentes. Fusão de duas
células e troca genética é indicada pelas formas ovais com contribuição parental
indicada pelas flechas vermelhas (Retirado de Zingales, 2012, adaptado de Freitas
2006).
1.3.2. Epidemiologia e patologia das DTUs
Desde a descoberta da doença em 1909, a heterogeneidade das cepas do
parasito tem sido considerada como um fator importante em diferentes
apresentações clínicas da doença. Em 1971, Zigman Brener publicou um trabalho
ressaltando
apresentando
a
influência
diferenças
de
cepas
diferentes
morfológicas,
potencial
em
infecção
experimental,
de
infecção
das
células
hospedeiras, sensibilidade aos mecanismos efetores do sistema imune, bem como
os níveis, ascendência, declínio e picos de parasitemia encontrados, observando
esses padrões por cinco anos de estudo e incentivando uma gama de trabalhos
nesta área.
Estudos de comportamento biológico e relação parasito-hospedeiro têm
ajudado a compreender a importância de diferentes subtipos do parasito na
17
determinação das manifestações clínico-patológicas da doença de Chagas. As
cepas de T. cruzi representam subespécies baseadas em características intrínsecas
como a composição antigênica (Andrade e cols., 1981), morfologia (Brener, 1965),
susceptibilidade à quimioterapia (Brener e cols., 1976; Andrade e cols., 1985),
padrões de isoenzimas (Miles e cols., 1978; Miles, 1980) e perfis genômicos de
kDNA (Morel e cols., 1980), Para a identificação dos isolados, também foram
considerados a relação parasito-hospedeiro, onde alguns estudos extensivos de
características biológicas de isolados e perfil histopatológico em animais
experimentais trouxeram a oportunidade de agrupá-las (Andrade, 1974, Andrade e
Magalhães,
1997),
discriminando
alguns
fenótipos
comportamentais
e
morfobiológicos de T. cruzi em modelos murinos, utilizando critérios como virulência
(capacidade de multiplicação no hospedeiro) e patogenicidade (habilidade de
produzir lesões teciduais e respostas imunológicas). Nestes estudos, foram
relacionados os 3 fenótipos encontrados, denominados biodemas, com
alguns
grupos de T. cruzi definidos por marcadores moleculares, como zimodemas I, II e III.
A distribuição das DTUs em diferentes áreas endêmicas é importante para
demonstrar sua influência nas manifestações locais da doença de Chagas. Deste
modo, diversos trabalhos se dedicam a realizar comparações epidemiológicas com a
patologia apresentada pelos indivíduos infectados (Figura 1.7).
TcI é a mais abundante e amplamente dispersa entre todas as DTUs nas
Américas. Sua distribuição geográfica corresponde à dispersão dos triatomíneos
pelo continente americano e pode estar associada com os ciclos silvestre e
doméstico. A infecção humana com TcI está concentrada no norte da América do
Sul e na América Central e está associada com cardiomiopatia chagásica. Há
apenas alguns casos discrepantes de infecção e doença no sul da bacia amazônica
(Coura,
2007;
Zingales
e
cols,
2012;).
Em
infecções
experimentais
em
camundongos, os isolados compreendidos neste grupo se mostraram como isolados
de baixa multiplicação com picos de parasitemia altos e tardios, de cerca de 20 a 30
dias após a infecção, e mortalidade tardia, geralmente a partir de 30 dias depois da
infecção; predominância de formas largas e miotropismo, com envolvimento nos
músculo esquelético e miocárdio (Andrade, 1974, Monteiro e cols., 2013; Pereira e
cols., 2014), incluindo sinais de cardiomiopatia moderada em camundongos C57B/6
(Pereira e cols., 2014).
TcII é encontrada predominantemente nas regiões central e sul da América do
Sul – no Brasil é encontrada nas regiões sul, sudeste, centro-oeste e nordeste – mas
18
sua verdadeira extensão ainda não está clara. Dentro de sua principal distribuição
geográfica, TcII está associada com manifestações cardíacas, e concomitantes
megaesôfago e megacólon podem estar presentes. Essa DTU tem sido isolada
principalmente dos ciclos de transmissão doméstica (Miles e cols., 1981; Fernandes
e cols., 1999; Zingales e cols., 1999; Lisboa e cols., 2007). As cepas
correspondentes à DTU II em infecção experimental em modelo murino se
apresentaram com baixa multiplicação e picos irregulares de parasitemia, cerca de
12 a 20 dias depois da infecção, quando a mortalidade alcança o máximo;
predominância
de
formas
largas,
miotropismo,
com
envolvimento
predominantemente cardíaco (Brener, 1971; Andrade, 1974; Franco e cols, 2003;
Rodrigues e cols., 2013; Sales-Campos e cols., 2014).
TcIII é frequentemente associada com o ciclo silvestre no Brasil e em países
adjacentes. Infecções humanas documentadas são raras. TcIII silvestre é associada
com o nicho terrestre e com Dasypus novemcinctus, sobre um vasto alcance do
oeste da Venezuela ate o Chaco argentino (Llewellyn e cols., 2009; Marcili e cols.,
2009). Tc III também é isolada ocasionalmente de cães domésticos (Chapman e
cols., 1984; Cardinal e cols., 2008). Em 2007, Coura reportou alguns casos de
infecção aguda causados por TcIII na região amazônica.
TcIV está associada com o ciclo silvestre no norte da América do Sul e na
região amazônica, ocorrendo com certa frequência em humanos, é a causa
secundária de doença de Chagas na Venezuela (Miles e cols., 1981; Coura, 2007;
Zingales e cols., 2012). Recentemente, Meza e cols. (2014) demonstraram o
potencial de uma cepa pertencente ao grupo TcIV em camundongos, onde foi visto
um nível baixo de parasitemia, além de baixa mortalidade, enquanto Monteiro e
colaboradores
(2013)
apresentaram
resultados
diametralmente
opostos,
demonstrando que os resultados em infecção experimental devem ser avaliados
cautelosamente, principalmente devido à heterogeneidade dentro de cada DTU.
Tc V e VI são duas DTUs híbridas similares, associadas com doença de
Chagas nas regiões central e sul da América do Sul. Isolados de ciclo silvestre são
virtualmente desconhecidos (Zingales e cols., 2012). Quando a patogenia da DTU V
é analisada através de infecção experimental em camundongos, as cepas se
apresentam com rápida multiplicação, parasitemia máxima e mortalidade de 7 a 11
dias depois da infecção; predominância de formas mais delgadas e tropismo por
macrófagos durante a fase inicial da infecção. Alterações neurais são mais
19
frequentes e intensas nas infecções deste tipo (Brener, 1971; Andrade, 1974; Franco
e cols, 2003; Rodrigues e cols., 2013; Sales-Campos e cols., 2014).
Embora haja uma tendência em apontar barreiras para a distribuição dos
genótipos de T. cruzi, este processo deve ser analisado de forma dinâmica, uma vez
que as características dos ciclos doméstico e silvestre do parasito estão cada vez
mais próximas. Com isso, existe a possibilidade da epidemiologia das DTUs estar
sendo subestimada na área endêmica da doença de Chagas.
DTU
Manifestação
TcI
Cardiomiopatia
clínica
TcII
TcIII
TcIV
TcV
TcVI
Cardiomiopatia
Casos agudos,
Dados clínicos
Cardiomiopatia
Cardiomiopatia
Megassíndrome
dados clínicos
desconhecidos
Megassíndorme
Megassíndrome
desconhecidos
Figura 1.7. Distribuição geográfica aproximada das DTUs de T. cruzi nos ciclos
de transmissão doméstico e silvestre, e manifestações clínicas (Modificado de
zingales, 2012)
20
1.4. Aspectos Clínicos da doença de Chagas
Doença de Chagas ocorre em duas fases: aguda e crônica. A fase inicial da
infecção ou fase aguda pode durar de 4 a 8 semanas, quando gradativamente se
instala a fase crônica, que persiste por toda a vida do portador (Laranja e cols.,
1956; WHO, 2002).
1.4.1. Fase aguda
Na maioria dos indivíduos, independente do mecanismo de transmissão, a
doença de Chagas aguda é assintomática, provavelmente devido à carga parasitária
razoavelmente pequena (Rassi Jr e cols., 2010, Kirchhoff & Rassi Jr., 2011). Os
sintomas se desenvolvem por volta de 8 a 10 dias depois da invasão pelos
parasitos, ou entre 20 e 40 dias depois da transfusão de sangue infectado com T.
cruzi, incluindo febre prolongada, alargamento desconfortável do fígado, baço e
linfonodos, e edema subcutâneo (localizado ou generalizado). No caso da
transmissão vetorial clássica, pode haver sinais da porta de entrada do T. cruzi,
reconhecida pelo chagoma desenvolvido na pele, que seria uma área endurecida
eritematosa e inchada, enquanto a entrada por meio das membranas da mucosa
ocular produz o sinal de Romaña, o clássico achado na doença de Chagas aguda,
que consiste de um edema indolor unilateral da pálpebra e tecidos perioculares.
A infecção inicial no local de entrada do parasito é caracterizada pela
presença de tripomastigotas infectivos em leucócitos e células dos tecidos
subcutâneos, e pelo desenvolvimento de edema intersticial, infiltração linfocitária, e
hiperplasia reativa de linfonodos adjacentes. Depois da disseminação através do
sistema linfático e da corrente sanguínea, parasitos se concentram principalmente
nos músculos (incluindo o miocárdio) e células ganglionares. Nessa fase, o indivíduo
pode apresentar manifestações sistêmicas, tais como: edema localizado ou
generalizado, aumento de linfonodos, alterações exantemáticas, esplenomegalia,
hepatomegalia, comprometimento cardíaco e manifestações nervosas (Prata, 2001;
Rassi Jr e cols., 2012)
A ocorrência de mortes em pacientes na fase aguda é baixa (< 5 - 10% dos
casos sintomáticos) sendo resultante além da miocardite grave, a meningoencefalite
grave (apesar de ser rara), ou ambas. Apesar de ser rara, a insuficiência cardíaca é
21
a principal causa das mortes na fase aguda da doença (Prata, 2001; WHO, 2002;
Rassi Jr e cols., 2010; Kirchhoff & Rassi Jr., 2011;;,).
1.4.2. Fase crônica
A fase crônica começa de 2 a 3 meses depois da infecção inicial, quando as
manifestações clínicas da fase aguda (se presentes) serão resolvidas em
virtualmente todos os indivíduos infectados, mesmo se a infecção não tiver sido
tratada com drogas tripanossomicidas (Rassi Jr e cols., 2010). A maior parte dos
indivíduos (60 - 70% da população infectada) desenvolverá a forma indeterminada
da doença de Chagas crônica caracterizada pela presença de sorologia específica e
ausência de manifestações clínicas, isto é, sem anormalidades eletrocardiográficas
e/ou radiológicas no coração, esôfago ou cólon. Essa fase pode persistir por alguns
meses até uma vida inteira (WHO, 2002).
1.4.3. Forma cardíaca
Os pacientes remanescentes (30 a 40%) irão desenvolver uma forma clínica
aparente – cardíaca (20 a 30%), digestiva (10 a 15%, principalmente megaesôfago e
megacólon) ou cardiodigestiva – geralmente 10 a 30 anos depois da infecção inicial
(Prata, 2001; Marin-Neto e cols., 1999; 2010; Rassi e cols., 2000, 2010).
A cardiopatia chagásica crônica é caracterizada, do ponto de vista
anatomopatológico, por áreas de infecçao que acarretam em fibrose que substituem
o tecido muscular cardíaco, gerando a destruição das fibras do coração, do sistema
nervoso autônomo simpático e parassimpático e pela presença de um exsudato
inflamatório ativo e progressivo. Além disso, observa-se cardiomegalia e alteração
do tecido muscular cardíaco. Aneurisma apical do ventrículo esquerdo é frequente e,
em certos casos, pode ocorrer tromboembolia e sinais de congestão passiva (Rassi
Jr e cols., 2012).
Somente eletrocardiograma (ECG) pode mostrar bradicardia sinusal, bloqueio
atrioventricular de primeiro grau (distúrbio de condução elétrica através do nó
atrioventricular), QRS de baixa voltagem (picos baixos, associado à fibrose) ou
mudanças primárias de ondas T. Uma radiografia do tórax pode mostrar graus
variáveis de cardiomegalia e QT prolongado é indicador de prognóstico. A repetição
22
do ECG e radiografia do tórax é crucial para a detecção destas anormalidades
(Rassi e cols., 2000).
A disfunção ventricular é destacada como o principal marcador prognóstico.
De acordo com a I Diretriz latino-americana para o diagnóstico e tratamento da
cardiopatia chagásica, a Sociedade Brasileira de Cardiologia recomenda a
realização do ecocardiograma, dada a sua ampla disponibilidade nos dias atuais,
como parte da avaliação inicial de pacientes com sorologia positiva, e sempre que
houver mudanças no quadro clínico ou eletrocardiográfico. Esta avaliação auxilia a
classificar os pacientes crônicos entre as seguintes categorias, de acordo com a
gravidade das manifestações: forma indeterminada (tipo A) - Pacientes sob risco de
desenvolver insuficiência cardíaca congestiva (ICC). Possuem sorologia positiva,
não têm cardiopatia estrutural ou sintomas de ICC. Também não têm alterações
digestivas. Forma cardíaca sem disfunção ventricular (B1) - Pacientes com
cardiopatia
estrutural,
Evidenciada
por
alterações
eletrocardiográficas
ou
ecocardiográficas, mas com função ventricular global normal e sem sinais e
sintomas atuais ou prévios de ICC. Forma cardíaca com disfunção ventricular: (B2)Pacientes com cardiopatia estrutural, caracterizada por disfunção ventricular global,
mas sem sinais e sintomas prévios ou atuais de ICC, (C) - Pacientes com disfunção
ventricular e com sintomas prévios ou atuais de ICC. (New York Heart Association I,
II, III ou IV) e (D) - Pacientes com sintomas refratários de ICC em repouso, apesar
de tratamento clínico otimizado, necessitando intervenções especializadas (SBC,
2011).
A morte cardíaca súbita associada à doença arrítmicaé responsável por
quase dois terços de todas as mortes em doença de Chagas cardíaca, seguida por
insuficiência cardíaca refratária (25-30%) e tromboembolismo (10-15%) (Rassi Jr e
cols., 2010).
1.4.4. Forma digestiva
A forma digestiva da doença de Chagas é caracterizada por alterações nas
funções motoras, secretoras e de absorção do esôfago e trato gastrintestinal (Rassi
Jr. e cols., 2010). Lesões do sistema nervoso entérico são cruciais na patogênese
das megassíndromes digestivas de Chagas. A estrutura mais frequentemente
afetada é o plexo mioentérico, que é localizado entre as camadas musculares
cardíaca e longitudinal do trato digestivo. Denervação ocorre em graus variáveis,
23
irregular e não continua, e provavelmente depende dos fatores do hospedeiro e do
parasito. O esôfago e o cólon distal, devido a sua fisiologia, são os segmentos
frequentemente mais comprometidos. A denervação leva à perda de coordenação
motora e acalasia dos esfíncteres, dificultando estes segmentos de se esvaziar de
materiais
semissólidos,
assim
causando
dilatação;
este
é
o
mecanismo
fisiopatológico desenvolvido no megaesôfago e megacólon chagásicos.
O exame radiológico é essencial para confirmar o diagnóstico e estágio da
doença a partir das características morfofuncionais do esôfago, diferenciando em
quatro grupos, sendo decisivo para a seleção da terapia adequada (Rassi Jr. e cols.,
2010).
Segundo Dias (2000), um dos fatores que constitui a gênese das diferenças
regionais na prevalência da forma digestiva da doença de Chagas, está
provavelmente relacionado às diferenças nas cepas/DTUs do parasito. Esta
apresentação clínica predomina no Brasil central e Chile e ainda não foi identificada
na Venezuela e América Central (Miles e cols., 2009; Zingales e cols., 2012).
1.4.5. Forma cardiodigestiva
A forma cardiodigestiva é uma combinação de doença cardíaca com
megaesôfago ou megacólon, ou ambos. Na maior parte dos países, o
desenvolvimento de megaesôfago geralmente precede o acometimento do coração
e doença do cólon, mas a prevalência exata da forma de cardiodigestiva não é
conhecida (Rassi Jr e cols., 2012).
1.5. Diagnóstico
O diagnóstico da infecção aguda é baseado na detecção direta do parasito. O
exame microscópico do sangue não coagulado fresco ou a camada leucocitária é a
maneira mais simples de ver tripomastigotas móveis. Parasitos também podem ser
vistos em esfregaços corados com Giemsa ou por gota espessa (Rassi Jr e cols.,
2010; Kirchhoff & Rassi Jr., 2011). Microhematócrito pode ser utilizado para o
mesmo propósito, e é o método de escolha para a identificação da infecção
congênita, devido à sua sensibilidade e à pequena quantidade de sangue
necessária. O exame microscópico do sangue do cordão umbilical ou sangue
24
periférico do recém-nascido por esta técnica é fortemente recomendado durante o
primeiro mês de vida.
O teste sorológico não é útil no diagnóstico de doença de Chagas aguda.
Embora a detecção de anticorpos anti-T. cruzi imunoglobulina M (IgM) poderia ser
utilizada (ver Fig. 1.8A), ensaios sorológicos IgM são pouco específicos (Rassi Jr e
cols., 2010; Kirchhoff & Rassi Jr., 2011).
Na fase crônica, devido à baixa e, provavelmente, intermitente parasitemia, o
diagnóstico baseia-se na detecção sorológica de anticorpos imunoglobulina G
específica (IgG) que se ligam ao T. cruzi (ver Fig. 1.8A). Ensaio imunoadsorvente
ligado à enzima (ELISA), imunofluorescência indireta (IFI) e hemaglutinação indireta
são os métodos mais comuns utilizados. Dois resultados positivos a partir de
qualquer um dessas três técnicas convencionais são recomendados para um
diagnóstico final (Ministério da Saúde, 2005). A Figura 1.8 mostra o perfil da
evolução sorológica e parasitológica durante as fases aguda e crônica da doença de
Chagas, em função da administração ou ausência de quimioterapia específica antiT. cruzi (extraído de Rassi Jr e cols., 2012).
25
Figura 1.8. Evolução sorológica e parasitológica durante a infecção
aguda e crônica da doença de Chagas. (A) Pacientes não-tratados. Uma a duas
semanas após a infecção com T. cruzi, indivíduos apresentam a fase aguda com
duração aproximada de até 2 meses. Essa fase da doença é caracterizada por
intensa parasitemia, altos níveis de imunoglobulinas IgM anti- T. cruzi e aumento dos
níveis de imunoglobulinas G (IgG). Com o término da infecção aguda, a parasitemia
reduz significativamente em função do aumento de imunoglobulinas IgG, as quais
atingem um nível elevado que pode persistir por toda a fase crônica da infecção. (B)
Pacientes tratados e curados. A cura na fase aguda é acompanhada por
negativação da parasitemia, observada imediatamente após o tratamento etiológico.
A negativação da sorologia pós-tratamento ocorre após cerca de 1 ano para doença
26
de Chagas congênita, e após 3 a 5 anos nos casos de transmissão vetorial.
Pacientes tratados e não curados apresentam uma resposta similar àquela dos
pacientes não tratados. Fonte: Adaptado de Rassi Jr e cols., 2012.
A baixa parasitemia durante a fase crônica resulta em que hemocultura e
xenodiagnóstico apresentem baixa sensibilidade para a detecção do parasito. No
entanto, estes métodos podem ser utilizados para confirmar o diagnóstico em casos
de resultados duvidosos para identificar falhas no tratamento em centros
especializados quando PCR não está disponível (Rassi Jr e cols., 2010; Kirchhoff &
Rassi Jr., 2011).
A avaliação inicial de um paciente recém-diagnosticado com infecção crônica
por T. cruzi inclui um histórico médico completo e exame físico, e um ECG em
repouso (Rassi Jr e cols., 2010). Pacientes assintomáticos com ECG normal têm um
prognóstico favorável e devem ser acompanhados anualmente ou semestralmente.
Pacientes com alterações eletrocardiográficas compatíveis com cardiomiopatia
chagásica devem ser submetidos a uma avaliação cardiológica de rotina, incluindo
um monitoramento Holter ambulatorial de 24 horas (juntamente com um teste de
exercício sempre que possível) para detectar arritmias e avaliar a capacidade
funcional, radiografia de tórax e ecocardiograma bidimensional para avaliar a função
ventricular, e outros testes cardiológicos como indicados. Os resultados desses
testes devem ser usados para estratificar pacientes individuais por risco e
implementar terapia apropriada (Rassi Jr e cols., 2006, 2007, 2009). A ingestão de
bário e enema são indicados para pacientes com sintomas da forma digestiva.
1.5.1. Diagnóstico molecular
Apesar de seu pouco uso no diagnóstico de rotina, a PCR tem maior
sensibilidade do que os outros métodos parasitológicos e, portanto, poderia ser útil
para confirmar o diagnóstico em casos de sorologia inconclusiva e como método
auxiliar para monitorar o tratamento. PCR pode identificar a falha do tratamento pela
detecção positiva de DNA de T. cruzi, mas não o sucesso do tratamento, porque os
resultados negativos de PCR, mesmo repetidas, não indicam necessariamente a
cura parasitológica. Na melhor das hipóteses, estes resultados indicam a ausência
de DNA do parasito no momento do teste (Rassi Jr e cols., 2010; Kirchhoff & Rassi
Jr., 2011).
27
Recentemente, pesquisadores reconheceram a necessidade de padronizar e
validar ensaios baseados em PCR para o diagnóstico e gerenciamento entre
laboratórios e países (Schijman e cols., 2011).
A PCR quantitativa (qPCR) faz o monitoramento em tempo real da reação, ou
seja, conforme a amplificação está ocorrendo, ocorre uma emissão de fluorescência
das que é medida a cada ciclo da reação, onde a intensidade da mesma atua como
um indicador da quantidade de amplicons (produtos de PCR) produzida. A
implementação de ensaios de PCR quantitativa para determinar a carga parasitária
e acompanhar a evolução pós-tratamento poderia ser particularmente útil como um
indicador da resposta terapêutica durante o quadro prolongado da doença de
Chagas (Vallejo and Reyes, 2005; Marin-Neto e cols., 2009). Métodos de PCR em
tempo real mostraram bons resultados para quantificação acurada da carga de T.
cruzi em amostras de sangue periférico de pacientes infectados (Piron e cols., 2007;
Duffy e cols., 2009; Moreira e cols., 2013).
De modo geral, o verdadeiro potencial de PCR em tempo real foi reconhecida
em situações pelas quais técnicas baseadas em PCR foram propostas, como em
infecção congênitas (Schijman e cols., 2003; Burgos e cols., 2007), monitoramento
da parasitemia acompanhando o tratamento etiológico (Russomando e cols, 1998;
Britto e cols., 2001; revisado por Britto, 2009), detecção precoce de relapsos após o
transplante do coração (Burgos e cols., 2010; Maldonado e cols., 2004) e outras
circunstâncias imunossupressoras (Burgos e cols., 2005, 2008; de Freitas e cols.,
2011).
Atualmente, esforços têm sido feitos para padronizar qPCR para a
quantificação de T. cruzi em amostras sanguíneas. Seguindo as recomendações do
workshop internacional promovido pela PAHO/WHO em 2011, Duffy e cols. (2013)
reportaram a performance analítica de qPCR multiplex para a quantificação de DNA
satélite de T. cruzi em amostras de sangue. Eles observaram uma extensão
dinâmica (linearidade) de 1 a 105 Eq. Par./mL para um isolado de TcI (Silvio X10) e
0,17 a 105 Eq. Par./mL para um isolado de TcVI (CL Brener). Em adição, para o
isolado CL Brener, foi observado um Limite de Detecção (LOD) e Limite de
Quantificação (LQ) de 0,6979 e 1,531 Eq. Par./mL, respectivamente, em reações
utilizando DNA obtido de amostras de sangue não-fervido.
O estudo da patogênese da Doença de Chagas ainda possui muitas lacunas.
As características intrínsecas às diferentes subpopulações de T. cruzi, ou o
28
somatório delas, parecem interferir na patogênese da Doença de Chagas. A
utilização de metodologias que possibilitam medir a carga parasitária e genotipar os
subtipos de T. cruzi em amostras sanguíneas de indivíduos infectados permitiria
descrever com maior precisão o estado clínico desses indivíduos, além de ser de
grande utilidade na avaliação de prognóstico. Assim, neste estudo, utilizamos PCR
em Tempo Real, empregando a tecnologia TaqMan em um sistema multiplex com
alvo na sequência satélite do DNA nuclear de T. cruzi e como controle interno o
gene da enzima RNAse P humana, no esforço de realizar a quantificação da carga
parasitária, além de um sistema de genotipagem multilocus intra-específica de T.
cruzi recomendado por um consenso internacional (Zingales e cols., 2009), para
contribuir com uma acurada caracterização molecular de isolados, possibilitando a
identificação de genótipos diretamente de amostras sanguíneas de pacientes
crônicos buscando identificar correlações entre DTUs infectivas, carga parasitária e
apresentação clínica da doença de Chagas.
29
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral do Trabalho
Avaliar a carga parasitária e genotipagem de T. cruzi como biomarcadores
da doença de Chagas, a partir de sangue periférico de pacientes portadores da
doença de Chagas Crônica, procurando estudar uma possível correlação entre as
subpopulações do parasito, a parasitemia e o prognóstico da doença.
2.2. Objetivos Específicos
•
Realizar o diagnóstico molecular e avaliar a carga parasitária em amostras de
sangue periférico dos pacientes portadores da doença de Chagas crônica, por
PCR em tempo real;
•
Padronizar a tipagem molecular de T. cruzi por PCR multilocus, a partir de
amostras de cultura, amostras reconstituídas e de sangue de pacientes
crônicos, de acordo com o recomendado pelo consenso para a genotipagem
de T. cruzi;
•
Genotipar o T. cruzi diretamente a partir do DNA extraído das amostras de
sangue dos pacientes positivos pela PCR em Tempo Real;
•
Correlacionar os dados obtidos nos itens acima com idade, sexo,
sintomatologia e área endêmica de origem, visando observar a possível
relação entre carga parasitária e DTU na Doença de Chagas.
30
3. METODOLOGIA
3.1. Causística e recrutamento dos pacientes portadores de doença de Chagas
Os pacientes atendidos no ambulatório do Instituto Nacional de Infectologia
Evandro Chagas (INI) foram recrutados, assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido (anexo 8.1) anterior à coleta das amostras de sangue. Todas as
amostras foram coletadas antes de qualquer tratamento. As amostras foram
submetidas a dois exames sorológicos, imunofluorescência indireta (IFI) e ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), antes de seu encaminhamento para o
Laboratório de Biologia Molecular e Doenças Endêmicas – IOC-FIOCRUZ. O estudo
foi simples cego, onde os pesquisadores não tiveram acesso aos dados ou critérios
de seleção dos pacientes, incluindo resultados sorológicos ou de ECG, até o término
dos experimentos de diagnóstico molecular. Ao final do estudo, foi revelado que 65
indivíduos possuíam sorologia positiva para T. cruzi, e 92 eram soronegativos. Do
total de 157 indivíduos, 71 apresentavam alguma alteração eletrocardiográfica.
3.2.
Aspectos éticos:
As amostras de sangue de pacientes que foram utilizadas são referentes ao
Projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da
Fundação Oswaldo Cruz (CEP IPEC 007/2007) (anexo 8.2).
3.3.
Cultivo de células:
Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi obtidas da Coleção de
Protozoários do IOC (ColProt), pertencentes a subpopulações classificadas entre as
DTUs I a VI, como as cepas Dm28c (TcI), Y (TcII), INPA 3663 (TcIII), INPA 4167
(TcIV), e CL (TcVI) foram mantidas em cultura axênica em meio BHI (“Brain Heart
Infusion”) a 28°C. O clone Bug2149 (TcV) foi gentilmente cedido pela Prof. Dra.
Bianca Zingales. As passagens foram realizadas no 7° dia de crescimento (1,0 mL
de células + 1,0 mL de soro fetal bovino + 400 µL de Hemina (0,004 g/mL) + 7,6 mL
de BHI), recolhidas por centrifugação (3000 xg por 10'), lavadas em PBS (Tampão
fosfato salino: NaCl 8,5 g/L, Na2HPO4.2H2O 1,55 g/L, NaH2PO4.H2O 0,23 g/L, pH
7,2), ressuspensas em 500 µL de PBS e contadas em Câmara de Neubauer.
31
3.4.
Coleta e preparo das amostras de sangue
Os voluntários participantes desse estudo consentiram em doar 10 mL de
sangue venoso, que foi coletado em tubo Vacuntainer (BD) contendo apenas EDTA
e adicionado imediatamente ao mesmo volume (1:1) de solução de lise contendo
cloridrato de guanidina 6M (Guanidina-HCl) e ácido etilenodietildinitritotetracético
(EDTA) 0,2M/pH=8,0 (Avila e cols., 1991). O lisado de sangue foi dividido em dois
tubos identificados com diferentes códigos. As amostras foram armazenadas a 4ºC
até o encaminhamento ao Laboratório de Biologia Molecular e Doenças Endêmicas
do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) para a realização da metodologia molecular de
detecção e tipagem do parasito.
As amostras foram fervidas em banho-maria a 100°C durante 15 minutos,
como padronizado por Britto e cols. (1993) e mantidas em temperatura ambiente.
Após 24 h, as amostras foram submetidas à extração de DNA ou estocadas a 4°C
até o momento da extração.
3.5.
Extração de DNA
O DNA foi extraído de 300 µL de lisado de sangue previamente preparado,
como citado anteriormente. A purificação do DNA total foi realizada em colunas de
sílica, utilizando o Kit “QiAamp DNA Mini Kit” (QIAGEN), seguindo o protocolo do
fabricante, com as modificações descritas a seguir.
Foram pipetados 30 µL de proteinase K no fundo de um microtubo de 1,5 mL,
acrescentados 300 µL de amostra (sangue previamente preparado, como citado
anteriormente ou obtida da cultura de células) e 200 µL de Tampão de lise AL,
homogeneizando por 15 segundos manualmente. Em seguida, incubados à 56ºC por
10 minutos. Após esse tempo, foram adicionados 200 µL de etanol (96-100%) à
amostra e, novamente, homogeneizados manualmente, por 15 segundos. O
conteúdo foi aplicado cuidadosamente na coluna do kit e centrifugado a 6000 ×g
(8000 RPMs) por 1 minuto, seguido do descarte o tubo coletor contendo o filtrado.
Um novo tubo coletor de 2 mL foi acoplado à coluna e adicionados 500 µL de
tampão de lavagem AW1 e centrifugado a 6000 ×g (8000 RPMs) por 1 minuto.
Acoplados à outro tubo coletor de 2 mL, descartando o tubo coletor contendo o
filtrado, foram adicionados 500 µL de tampão de lavagem AW2 e centrifugados a
32
20000 ×g (14000 RPMs) por 3 minutos. Em seguida, descartando o tubo coletor
contendo o filtrado, a coluna foi acoplada a um microtubo eppendorf de 1,5 mL e
centrifugada a 20000 ×g (14000 RPMs) por 3 minutos, para eliminar qualquer
possível resíduo de tampão AW2. Para eluir o DNA, a coluna foi acoplada a um
microtubo eppendorf de 1,5 mL e foram adicionados 100 µL de tampão de eluição
AE, incubados à temperatura ambiente (15-25 ºC) por 10 minutos e centrifugados a
6000 ×g (8000 RPMs) por 1 minuto. O DNA obtido foi estocado à -20°C até ser
utilizado.
3.6.
Tipagem molecular do T. cruzi em DNA extraído de amostras de sangue
A caracterização molecular do T. cruzi em DTUs foi realizada seguindo
metodologias descritas em Burgos e col. (2007) e Ramirez e col. (2010), baseadas
em reações de PCR convencional multilocus (tabela 3.1). A identificação
subsequente dos genótipos se baseia no conjunto dos perfis dos produtos de PCR
apresentados para cada alvo, utilizando os seguintes marcadores moleculares
(como ilustrado na figura 3.1.): A região intergênica do gene do Spliced Leader
utilizando os iniciadores TCC, TC1 e TC2 (descrito por Souto e cols., 1996,
adaptado por Marcet e cols., 2006) diferenciando Tc I (350 pb), Tc II, V e VI (300 pb)
e Tc III e IV (não são amplificados). O domínio variável D7 do gene da subunidade
24Sα do RNA ribossomal, utilizando os iniciadores D75, D76 e D71 em semi-nested
PCR, para distinguir Tc II e VI (140 pb), Tc III (125 pb), Tc IV (140/145 pb) e Tc V
(125 ou 125+140 pb) (Brisse e cols., 2000a). A região do fragmento nuclear A10
utilizando, em semi-nested, os iniciadores Pr1, P6 e Pr3 (Brisse e cols., 2000b) para
diferenciar Tc II (690/580 pb) e Tc VI (630/525 pb). As reações de amplificação
foram preparadas em um volume total de 25 µL. Esta reação consistiu de 12,5 µL de
GoTaq® Green Master Mix (GoTaq® DNA polimerase, tampão pH 8,5, dATp 400
µM, dGTP 400 µM, dCTP 400 µM, dTTP 400 µM e MgCl2 3 mM), 1,25 µL de cada
primer (solução estoque: 25 µM para o alvo SL-IR, 10 µM para os demais alvos), 5
µL de H2O e 5 µL de DNA.
.
33
Tabela 3.1. Condições de PCR para a tipagem molecular.
Alvo
Iniciadore
s
Sequência
Concentração
SL-IR I e II
24Sa-rDNA
Primeira
rodada
Segunda
rodada
Fragmento
A10
Primeira
rodada
Segunda
rodada
TCC
TC2
TC1
CCCCCCTCCCAGGCCACACTG
CCTGCAGGCACACGTGTGTG
TCCGCCACCTCCTTCGGGCC
2 µM
2 µM
2 µM
D76
D75
GGTTCTCTGTTGCCCCTTTT
GCAGATCTTGGTTGGCGTAG
0,5 µM
0,5 µM
D76
D71
GGTTCTCTGTTGCCCCTTTT
AAGGTGCGTCGACAGTGTGG
0,5 µM
0,5 µM
Pr1
P6
CCGCTAAGCAGTTCTGTCCATA
GTGATCGCAGGAAACGTGA
0,5 µM
0,5 µM
Pr1
Pr3
CCGCTAAGCAGTTCTGTCCATA
CGTGGCATGGGGTAATAAAGCA
0,5 µM
0,5 µM
Termociclagem
D
94°C/1’
94°C/30’’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
A
67°C/1’
65°C/1’
63°C/1’
61°C/1’
60°C/1’
57°C/1’
55°C/1’
58°C/1’
E
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
C
5
5
5
30
5
5
5
35
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
60°C/1’
57°C/1’
55°C/1’
58°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
72°C/1’
5
5
5
35
D: desnaturação, A: anelamento, E: extensão, C: ciclos.
Figura 3.1. Algoritmo para caracterização molecular das DTUs de T. cruzi baseada
em três marcadores.
3.7.
Eletroforese em gel de agarose
Os ensaios de eletroforese foram realizados em cuba horizontal, empregando
géis de agarose a 2,5% (Agarose [Sigma]+ LM SIEVE Agarose [BioAmerica]),
proporção 1:1), preparados em TBE 1X [0,089 M Trizma base; 0,088 M Ácido
Bórico; 0,0027 M EDTA, pH=8]. Alíquotas de 25 ou 30 µL dos produtos da PCR
foram aplicadas no gel. A eletroforese foi conduzida por 2,5 horas a 80 V. O peso
molecular dos produtos de PCR foi determinado em comparação aos marcadores de
34
peso molecular de 50 bp ou 100 pb (DNA Ladder- Invitrogen Life Technologies®)
incluído nos géis. Os produtos de PCR foram visualizados sob luz ultravioleta, após
coloração dos géis com corante Nancy-520® (Sigma Life Science) [5 µg/mL]. Todos
os géis foram analisados e as imagens registradas através de um sistema
fotográfico de documentação em gel - UVP Bioimaging Systems (Upland, CA, USA).
3.8.
Sequenciamento dos produtos
Para a confirmação da genotipagem, alguns produtos de PCR obtidos foram
purificados utilizando o kit GenElute™ PCR Clean-Up (Sigma-Aldrich), seguindo o
protocolo do fabricante. Os DNAs foram então sequenciados em um sequenciador
de DNA automatizado Applied Biosystems ABI Prism 3730, na Plataforma de
Sequenciamento de DNA (PDTIS-Fiocruz), utilizando o kit ABI PRISM BigDye®
Terminator 146 v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer Applied 147
Biosystems Division), seguindo as instruções do fabricante e utilizando 3,2 pmol dos
oligonucleotídeos utilizados nas reações de PCR e 6,5 µL de produto. As sequências
de nucleotídeos obtidas foram alinhadas com as sequências dos respectivos genes
de referência utilizando o software MEGA 4.0 (Clustal W).
3.9.
Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR )
A parasitemia dos pacientes foi quantificada através de ensaios de PCR em
Tempo Real multiplex, baseado na tecnologia TaqMan (Applied Biosystems) que
padronizamos no Laboratório de Biologia Molecular e Doenças Endêmicas do
IOC/FIOCRUZ (Moreira e cols., 2013). Para a quantificação da carga parasitária de
T. cruzi presente nos lisados de sangue (Guanidine EDTA Blood - GEB), foram
realizados ensaios de PCR em tempo real com um alvo direcionado para o DNA
nuclear satélite de T. cruzi e um alvo para o gene da RNAse P humana, como um
controle interno da reação. Para tal, foram selecionados os iniciadores e sonda para
as sequências repetidas do DNA nuclear satélite de T. cruzi: Cruzi 1 (5’- AST CGG
CTG ATC GTT TTC GA- 3´) e Cruzi 2 (5´- AAT TCC TCC AAG CAG CGG ATA- 3´),
que amplificam um fragmento de 166 pares de base, e a sonda TaqMan Cruzi 3 (5’FAM CAC ACA CTG GAC ACC AA-3’MGB), conforme descrito por Piron e cols.
(2007). Para o alvo RNAse P, foi utilizado o kit TaqMan Human RNase P detection
35
reagent (Life Technologies). Para permitir a realização do ensaio em multiplex, a
sonda TaqMan para RNase P foi marcada com o repórter 5’-VIC e o quencher 3’TAMRA. As concentrações finais dos reagentes foram: 1 X TaqMan Universal
Master Mix (Life Technologies); 0,5X reagente de detecção da RNase P; 300 nM dos
iniciadores Cruzi 1 e Cruzi 2; 100 nM sonda TaqMan (Cruzi 3), 2 µL de DNA, em um
volume final de 20 µL de reação.
As amostras foram amplificadas em termociclador ABI Prism 7500 Fast (Life
Technologies, Foster City, CA), nas seguintes condições de ciclagem térmica: um
passo de 2 minutos a 50°C, seguido de uma etapa de 10 minutos a 95°C e 40 ciclos
de amplificação (15 segundos a 95°C e 1 minuto a 58°C).
Foram realizados ensaios de quantificação absoluta, onde em cada placa de
PCR em tempo real foi inserida uma curva padrão de DNA extraído de lisado de
sangue humano (comprovadamente livre de infecção por T. cruzi) em guanidinaEDTA (GEB), contaminado artificialmente com epimastigotas de T. cruzi, cepa CL
Brener. Para tal, alíquotas de 300 µL de GEB foram contaminadas artificialmente
com 105 epimastigotas de T. cruzi/mL, seguido da extração de DNA, conforme o
protocolo descrito no item 3.5. A curva padrão foi construída a partir de diluições
seriadas do DNA obtido acima, com fator 1:10 e 1:2, atingindo concentrações que
variaram de 104 a 0,5 equivalentes de parasito/mL. Como diluente, foi utilizado um
pool de DNA humano, extraído de 8 alíquotas de 300 µL de GEB não contaminado,
seguindo a mesma metodologia. DNA do GEB contaminado com T. cruzi foi diluído
em série em um pool do DNA do GEB não contaminado (10 µL DNA de GEB
contaminado + 90 µL DNA de GEB não contaminado, exceto pelo último ponto da
curva, de 0,5 equivalentes a parasita/mL: 50 µL DNA de GEB contaminado (100
equivalentes de parasito/mL) + 50 µL GEB não contaminado), para obter as
seguintes concentrações: 104, 103, 102, 101, 100, 0,5 parasitos/mL (figura 3.2). Cada
diluição foi correspondente a um ponto que compôs a curva padrão para
quantificação absoluta da parasitemia dos pacientes deste estudo. A curva padrão
foi incluída em todos os ensaios quantitativos, em duplicatas para cada ponto da
curva.
36
Figura 3.2. Diluição da curva padrão.
Todas as amostras foram quantificadas em duplicatas e todas as placas de
ensaios de qPCR contiveram controles positivos (DNA extraído de GEB contendo
0,5 parasito/µL), e controles negativos (NTC: Negative Template control - 5 µL água
ultrapura, e Controle negativo para T. cruzi: 5 µL DNA extraído a partir de 200 µL de
lisado de sangue de indivíduo comprovadamente não infectado).
Para a análise dos resultados, as amostras foram consideradas válidas
quando o controle interno (gene humano da RNase P) foi amplificado com um valor
de Ct (Threshold cycle) estatisticamente semelhante aos Cts obtidos para todas as
demais amostras extraídas em paralelo. As amostras com valores de Ct para a
RNAse P que foram diferentes dos demais (outliers) foram descartadas e
reextraídas. Foi considerada positiva qualquer amostra cujas respectivas curvas de
amplificação para o alvo T. cruzi, em duplicata, tenham ultrapassado o threshold
(definido em 0,02). Além disso, as amostras na mesma placa de PCR foram
consideradas apenas se os controles negativos (NTC) da reação de PCR e de
extração de DNA apresentassem resultado de fato negativo. Nos casos em que
controle negativo apresentou um resultado positivo, todo o experimento foi repetido.
37
3.10 Análises estatísticas:
Os experimentos foram feitos em duplicatas. Os dados foram expressados com
medianas aritiméticas. Teste-T ou teste Mann-Whitney foram usados para avaliar a
significância das diferenças observadas, de acordo com a análise prévia de
normalidade dos dados. Um valor p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente
significante. Todas as análises foram executadas com GraphPad Prism 5 (GraphPad
Software, Inc.)
38
4. RESULTADOS
4.1. Descrição da população de estudo
A população estudada foi constituída por 157 indivíduos recrutados no serviço do
ambulatório do INI. Destes, 92 apresentaram sorologia negativa para T. cruzi e 65
com sorologia positiva. Dentre os 36 indivíduos soropositivos que foram submetidos
ao exame ECG, 72,2% apresentaram a forma cardíaca da doença, enquanto 29
pacientes não foram avaliados. No grupo dos pacientes soronegativos, 51,1 %
apresentavam alterações cardíacas, e quatro não foram avaliados (Tabela 4.1).
Tabela 4.1. Resultados eletrocardiográficos dos pacientes. Através das análises
feitas por eletrocardiograma, os pacientes foram divididos em dois grupos, com
forma cardíaca e sem forma cardíaca.
Sorologia
Alteração
cardíaca
Sem alteração
cardíaca
Total
Positiva
Negativa
n (%)
n (%)
45 (51,1)
26 (72,2)
43 (48,9)
10 (27,8)
88
36
Através dos dados obtidos dos pacientes, realizamos uma análise segmentar da
origem, faixa etária e gênero dos indivíduos. Desta forma, dentre os pacientes
soropositivos, não houve grande diferença entre os gêneros, sendo 31 indivíduos do
gênero feminino e 30 pertencentes ao masculino, tendo 4 com gênero não
informado. Através da estratificação da faixa etária, identificamos que a maior parte
dos indivíduos se encontra na faixa entre 40 e 69 anos (79,4%), sendo 34,9 % acima
dos 60 anos (figura 4.1).
39
Figura 4.1. Relação entre faixa etária e sorologia para T. cruzi da população
estudada. Gráfico demonstrando a variação da faixa etária apresentada pelos
pacientes deste estudo, indicando uma ocorrência maior entre 40 e 69 anos.
Em relação à naturalidade dos pacientes, a maioria é advinda da região
nordeste do Brasil, principalmente Bahia (23,1%) e Ceará (18,5%), uma parcela da
região sudeste (MG e RJ) e alguns da região centro-oeste e sul (Tabela 4.2). Neste
estudo, não houve a participação de nenhum paciente da região norte do Brasil. É
importante ressaltar, ainda, que a maior parte dos participantes mora ou morou em
área rural.
Tabela 4.2. Naturalidade dos indivíduos com sorologia positiva para T. cruzi.
Estado
BA
CE
MG
AL
PB
PE
RJ
NA
GO
RN
RS
SE
Números de soropositivos
15
12
10
6
6
4
4
4
1
1
1
1
40
%
23,1
18,5
15,4
9,2
9,2
6,2
6,2
6,2
1,5
1,5
1,5
1,5
4.2.
Avaliação da carga parasitária
A figura 4.2 demonstra um exemplo de curva padrão construída a partir de DNA
extraído de lisado de sangue humano em guanidina-EDTA (GEB), contaminado
artificialmente com epimastigotas de T. cruzi, da cepa CL Brener e diluído em DNA
humano. Cada quadrado vermelho representando um ponto da curva padrão. Na
figura 4.3 estão representadas curvas de amplificação (amplification plot) geradas
pelo equipamento ABI Prism 7500 durante os ensaios de quantificação.
Eq. Par./mL
Figura 4.2: Curva padrão com 6 pontos da diluição de DNA de T. cruzi (CL
Brener) em sangue contendo guanidina-EDTA para a verificação do desempenho de
amplificação pelo sistema TaqMan, através da avaliação dos parâmetros da curva
padrão: Eficiência 104,5% e R2:=0,99.
Ciclo
Figura 4.3: Curvas de amplificação do ensaio de qPCR – sistema TaqMan para
o alvo DNA satélite de T. cruzi. Eixo X: número de ciclos; Eixo Y: fluorescência
normalizada e descontada da linha de base (∆Rn). A linha horizontal no gráfico (em
vermelho) corresponde ao Threshold, estipulado arbitrariamente em 0,02 em todos
os ensaios.
41
Todas as amostras de pacientes coletadas foram avaliadas quantitativamente
para o diagnóstico molecular e a estimativa da carga parasitária. Ainda, as amostras
foram validadas pelo uso do controle interno, o gene humano da RNase P, utilizado
em multiplex no sistema TaqMan de qPCR.
Dos 157 pacientes, 64 se mostraram positivos por qPCR, sendo 35 entre os que
apresentaram sorologia positiva, duas amostras de cada paciente tiveram suas
cargas parasitárias avaliadas e comparadas, apresentando valores aproximados
(figura 4.4). A mediana da carga parasitária de todos os pacientes com sorologia
positiva foi de 3,12 Eq. par./mL, apresentando um intervalo interquartil de 1,55 a
14,86, com a carga variando entre 0,0,23 e 153,7 Eq. par./mL, onde a maioria dos
pacientes apresentou uma carga abaixo de 10 eq. par./mL (figura 4.5). A
comparação da parasitemia entre os pacientes com ou sem manifestação cardíaca,
não apresentou diferença estatisticamente significativa (P < 0.0884), mas
apresentou diferenças entre as medianas demonstradas, onde uma mediana de 2,46
(1,49-8,87) para pacientes cardíacos e 14,86 (2,53-19,38) para pacientes sem forma
cardíaca aparente, bem como uma mediana de 4,038 para pacientes que não
tiveram manifestações clínicas avaliadas (figura 4.6).
As análises das cargas parasitárias das amostras soronegativas, mas que
possuíram resultado da PCR em Tempo Real positivo, indicaram uma mediana de
0,94 Eq. Par/mL, com a carga variando entre 0,06 e 13,52 Eq. Par./mL. Pacientes
com alterações cardíacas apresentaram uma mediana de 1,10 Eq. Par/mL de suas
cargas parasitárias, enquanto aqueles sem alterações aparentes no coração tiveram
um valor de 0,76 Eq. Par./mL em sua mediana e, apenas um paciente soronegativo
não foi examinado por ECG, apresentando uma carga de 13,52 Eq. Par./mL.
42
Figura 4.4. Comparação da reprodutibilidade da quantificação da carga
parasitária por qPCR de amostras distintas do mesmo paciente. As amostras
foram divididas em duas durante a coleta, extraídas e quantificadas separadamente
por qPCR com alvos para DNA satélite de T. cruzi e RNase P como controle interno.
O gráfico representa a comparação entre suas quantificações apresentando uma
boa reprodutibilidade da técnica. A linha horizontal pontilhada apresenta o limite de
quantificação da técnica.
Figura 4.5. Carga parasitária do total dos pacientes com sorologia positiva
anti-T. cruzi. A carga parasitária dos pacientes foi quantificada por PCR em tempo
real e os valores apresentados representam a media das duas amostras sanguíneas
43
obtidas para cada paciente. A linha horizontal representa a mediana dos valores de
carga parasitária. A linha horizontal pontilhada apresenta o limite de quantificação da
técnica.
Figura 4.6. Correlação entre carga parasitária de pacientes soropositivos com
diferentes formas clínicas. A carga parasitária dos pacientes foi quantificada por
PCR em tempo real e os valores apresentados representam a media das duas
amostras sanguíneas obtidas para cada paciente. A linha horizontal representa a
mediana dos valores de carga parasitária dentro de cada grupo. NA: alterações
cardíacas não avaliadas. A linha horizontal pontilhada apresenta o limite de
quantificação da técnica.
Ao buscar relação entre a carga parasitária e o sexo do paciente, a distribuição
da carga entre os gêneros foi estatisticamente semelhante (P=0,4589). Entretanto,
foi possível observar uma mediana de 4,758 eq. par./mL (1,391-15,10) para o sexo
feminino e 2,558 eq. par./mL (1,576-7,685) para indivíduos infectados do sexo
masculino (figura 4.7). O gênero de três pacientes não foi informado.
44
Figura 4.7. Comparação entre carga parasitária e gênero dos pacientes. A partir
dos dados obtidos na quantificação da carga parasitária, foi feita a comparação entre
as cargas apresentadas com o gênero dos pacientes. A linha horizontal representa a
mediana dos valores. A linha horizontal pontilhada apresenta o limite de
quantificação da técnica.
Para comparar a sensibilidade e especificidade clínicas para o diagnóstico
molecular por PCR em tempo real a partir de amostras de sangue, a sorologia foi
considerada como padrão ouro (tabela 4.3). A positividade da qPCR apresentou
58,8 % de sensibilidade e 60,9 % de especificidade.
Tabela 4.3. Sensibilidade e especificidade clínicas da PCR em tempo real
Sorologia+
Sorologian
%
n
%
qPCR+
40
58,8
36
39,1
qPCR28
41,2
56
60,9
Total
68
92
45
4.3. Tipagem molecular
4.3.1. Genotipagem em amostras de cultura de T. cruzi
A tipagem molecular foi realizada utilizando um algoritmo de marcadores
moleculares criado a partir da combinação de dois algoritmos já publicados (Burgos
e cols., 2010; Ramirez e cols., 2010). Para padronizar este algoritmo, inicialmente
realizamos a genotipagem em epimastigotas obtidos de cultura axênica, utilizando
cepas/clones de referência. Os marcadores moleculares foram avaliados nos
seguintes isolados: Dm28c (DTU I), Y (DTU II), 3663 (DTU III), 4167 (DTU IV),
Bug2149 (DTU V) e CL (DTU VI). Estas foram distinguidas através da análise do
perfil dos fragmentos obtidos e visualizados em gel de agarose (figura 4.8). Para a
região intergênica do Spliced Leader (SL-IR I e II) foi possível distinguir a DTU I, que
apresentou uma banda de 350 pb, e as DTUs II, V e VI, que apresentaram uma
banda de 300 pb, enquanto a cepa 4167 (DTU IV) não apresentou amplificação.
Utilizando uma PCR semi-nested para a subunidade ribossomal 24S-α, foi possível
distinguir DTU V, que apresentou uma banda de 125 pb, de DTU II e VI, que
apresentaram banda em torno de 140 pb, além disso, a DTU III apresentou um perfil
de 125 pb, mas pode ser diferenciada analisando-a em conjunto com o primeiro
marcador molecular. Para discriminar a DTU II (580 pb) da VI (525 pb) foi utilizada
uma PCR semi-nested para a região A10. Em todas as PCRs, não foram
observadas bandas equivalentes aos tamanhos esperados, para amostras de
sangue não infectado (controles negativos).
46
Figura 4.8: Tipagem molecular de Trypanosoma cruzi em amostras de cultivo.
A. Região intergênica I e II do Spliced Leader (SL-IR-I e II), M: marcado de peso
molecular de 50 pb. Amostras: 1: contole negativo; 2: T. cruzi Dm28c; 3: T. cruzi Y;
4: T. cruzi 4167; 5: branco. B. Gene da subunidade ribossomal 24S-α, M: marcado
de peso molecular de 50 pb. Amostras: 1: Branco; 2: controle negativo; 3: T. cruzi Y;
4: T. cruzi
3663; 5: Bug2149; 6: T. cruzi
CL. C. Fragmento nuclear A10. M:
marcador molecular de 100 pb, 1: Branco, 2: T. cruzi Y, 3: T. cruzi CL, 4: controle
negativo.
47
4.3.2. Sequenciamento dos produtos
Foi feito o seqüenciamento de DNA do produto amplificado dos alvos
supracitados, para a comprovação de especificidade das bandas observadas nas
PCRs. Todas as sequências foram submetidas ao BLASTn e confirmadas com
cobertura e identidade próximas de 100%, bem como um E-value abaixo de 5 em
todas (tabela 4.4).
Tabela.4.4. Alinhamento BLASTn (banco de dados NCBI) das sequências de
DNA dos produtos de PCR, para cada alvo de genotipagem
Cepas
DTU
N° acesso
no NCBI
Descrição
Query
cover
Identidade
E
value
Região intergênica I e II do Spliced Leader (SL-IR-I e II)
Dm28c
I
EF626693.1
Y
II
U57984.1
Sequência TransSplicedLeaderMini-exon de
Trypanosoma cruzi, região repetida
Gene SplicedLeader de
Trypanosoma cruzi cepa CL,
sequência repetida
100%
100%
4e-13
100%
95%
1e100
97%
95%
3e-54
98%
93%
4e-85
100%
96%
1e-91
100%
88%
1e-21
100%
99%
3e-26
100%
99%
1e-38
Gene da subunidade ribossomal 24S-α
α
Gene RNA ribossômico 24S Alpha
de Trypanosoma cruzi, sequência
parcial
Gene RNA ribossômico 24S Alpha
de Trypanosoma cruzi, sequência
parcial
Y
II
GQ303145.1
3663
III
GQ303145.1
Bug2149
V
GQ303145.1
CL
VI
GQ303145.1
Gene RNA ribossômico 24S Alpha
de Trypanosoma cruzi, sequência
parcial
Fragmento A10e de Trypanosoma
cruzi cepa CL Brener
Trypanosoma cruzi 24S alpha
ribosomal RNA gene,
partialsequence
Fragmento nuclear A10
Y
II
AJ133198.1
CL
VI
EF394303.1
Trypanosoma cruzi isolate PAH265
RAPD marker A10 fragment
48
4.3.3. Limite de detecção da tipagem molecular
Para avaliar a sensibilidade da técnica e, assim, sua posterior aplicabilidade
ao genotipar T. cruzi de amostras de sangue de pacientes crônicos, foi feita a
tipagem molecular em sangue humano artificialmente contaminado com T. cruzi,
utilizando seis cepas/clones (Dm28c, Y, 3663, 4167, Bug2149 e CL) em
concentrações de 104 até 0,5 eq. par./mL. O clone Dm28c apresentou o perfil de 350
pb para o marcador molecular utilizando o Spliced Leader, o que é esperado para as
cepas pertencentes ao TcI. Enquanto, a cepa Y com um perfil de 300 pb,
correspondente ao perfil encontrado nas cepas do grupo TcII. Quando avaliadas
para a região 24Sα do RNA ribossomal, as cepas correspondentes à TcII, TcIV e
TcVI (Y, 4167 e CL, respectivamente) apresentaram uma banda de 140 pb. Nesse
mesmo experimento, foi observado o perfil de 125 pb apresentado pelas exemplares
de TcIII (3663) e TcV (Bug2149). O resultado apresentado para o fragmento nuclear
A10 possibilitou diferenciar TcII de TcVI, com 580 pb e 525 pb, respectivamente.
Através da análise dos produtos obtidos nas reações descritas acima, foi visto que
as diferentes amostras, quando analisadas por todos os marcadores, apresentaram
um perfil global diferente. Sendo possível identificá-las e diferenciá-las como DTUs,
além de apresentar uma alta sensibilidade, principalmente os dois primeiros
marcadores, os quais todas as cepas apresentaram perfil de banda mesmo em
amostras com 0,5 eq. par./mL, apesar de que o marcador para o fragmento A10
amplificou bandas com perfis distintos nas concentrações de 1 e 0,5 eq. par./mL
(figuras 4.9, 4.10 e 4.11).
49
Figura 4.9. Limite de detecção da tipagem molecular para a região
intergênica I e II do Spliced Leader, em sangue artificialmente contaminado
com T. cruzi.Cada curva representa uma cepa/clone de T. cruzi contendo de 104 a
0,5 equivalentes de parasito/mL. Poços 1-6: Dm28c, 7-12: Y, M: marcador molecular
de 100 pb.
50
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tc II
Tc III
Tc IV
140 pb
125 pb
M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Tc V
Tc VI
140 pb
125 pb
Figura 4.10. Limite de detecção da tipagem molecular para o gene da
subunidade ribossomal 24S-α
α, em sangue artificialmente contaminado com T.
cruzi. Cada curva representa uma cepa/clone de T. cruzi contendo de 104 a 0,5
equivalentes de parasito/mL. Poços 1-6: Y, 7-12: 3663, 13-18: 4167, 19-24:
Bug2149, 25-30: Cl , 31: Branco.
51
M 1
2
3
4 5
6
7
8 9 10 11 12 13
Tc VI
Tc II
580 pb
530 pb
Figura 4.11. Limite de detecção da tipagem molecular para o alvo no fragmento
nuclear A10, em sangue artificialmente contaminado com T. cruzi. Cada curva
representa uma cepa de T. cruzi contendo de 104 a 0,5 equivalentes de parasito/mL.
Poços 1-6: Y, 7-13: CL, 13: Branco, M: marcador molecular de 100 pb.
52
4.3.4. Tipagem molecular de T. cruzi em amostras de pacientes portadores da
doença de Chagas
Todas as amostras com resultado positivo em qPCR foram submetidas à
tipagem molecular, utilizando os marcadores do algoritmo apresentado. Para o
primeiro alvo, região intergênica I e II do Spliced Leader, todas as amostras positivas
foram testadas, e as que apresentaram um perfil de banda de 300 pb foram
consideradas TcII/V/VI, as que não amplificaram poderiam ser TcIII ou IV. Nenhuma
amostra amplificou com uma banda de 350 pb, o que indicaria Tc I (figura 4.12).
Ao utilizar o segundo marcador, região da subunidade ribossomal 24Sa,
pudemos distinguir TcII e VI (140 pb) de TcIII (125 pb) e TcV (125 pb).
Para
algumas amostras, não foi possível observar nenhuma amplificação para este alvo.
Porém, como elas haviam amplificado com uma banda de 300 pb para o alvo SL-IR I
e II, foram denominadas como Tc II/V/VI.
O marcador do fragmento nuclear A10 foi utilizado para diferenciar TcII de
TcVI, apresentando bandas de 580 pb e 525 pb, respectivamente. Mais uma vez,
amostras que amplificaram para os dois marcadores anteriores com perfil de DTU II
ou VI, mas não para o fragmento A 10, foram denominadas como Tc II/VI.
Figura 4.12. Gel representativo da tipagem molecular de Trypanosoma cruzi em
amostras de pacientes portadores da doença de Chagas. A. Região intergênica
do Spliced Leader (SL-IR I e II). M, marcador de peso molecular 50 pb, 1-18:
Amostras de pacientes, 2: 357, 3: 374, 4: 375, 5: 377, 6: 391, 7: 393, 8: 394, 9: 412,
10: 420, 11: 421, 12: 425, 13: 451, 14: 453, 15: 483, 16: 488, 17: 500, 18: 353, 19:
53
branco; 19: controle Tc I, 20: controle Tc II. B. Região do gene da subunidade 24Sα. M: marcador molecular de 100 pb, 1: Branco, 2-20: Amostras de pacientes; 2: 35,
3: 41, 4: 44, 5: 59, 6: 70, 7: 78, 8: 91, 9: 105, 10: 111, 11: 116, 12: 125, 13: 147, 14:
219, 15: 224, 16: 235, 17: 277, 18: 377, 19: 391, 20: 393, 21: controle Tc II, 22:
controle Tc III. C. Região correspondente ao Fragmento nuclear A 10. M:
marcador molecular de 100 pb, 1-19: Amostras de pacientes; 1: 495, 2: 103, 3: 482,
4: 18, 5: 212, 6: 318, 7: 219, 8: 423, 9: 248, 10: 494, 11: 134, 12: 239, 13: 49, 14:
330, 15: 47, 16: 480, 17: 17, 18: 444, 19: 412, 20: Branco, 21: controle Tc II; 22:
controle Tc VI, M: Padrão de 100 pb.
As duas amostras de cada paciente foram avaliadas por tipagem molecular e
somente chegamos a uma conclusão após a análise de ambos os resultados (tabela
4.5). Dos 64 pacientes genotipados, apenas 4 apresentaram algum resultado
discrepante. Porém, em alguns casos, só foi possível realizar a genotipagem em
uma das duas amostras. Quanto às DTUs encontradas, a mais abundante foi TcVI
(37,5%), além da ocorrência de TcV (10,9%), TcII (9,3%) e, pela primeira vez
descrita em um paciente crônico, TcIII (1,6%). Interessantemente, encontramos
algumas coinfecções, sendo oito casos de TcII+VI (12,5%), além de um caso de
TcIII+V (1,6%) e um último caso de TcV+VI (1,6%). Entretanto, em alguns casos,
não conseguimos distinguir totalmente qual DTU estava presente (23,4%).
Os genótipos encontrados entre os pacientes soropositivos foram TcII (3
pacientes), TcV (2 pacientes), TcVI (10 pacientes), TcII+VI (4 pacientes), TcIII+VI (1
paciente), TcII/VI (3 pacientes) e TcII/V/VI (1 paciente). Enquanto que entre as
amostras dos pacientes soronegativos identificamos os seguintes genótipos de T.
cruzi: TcIII (1 paciente), TcV (5 pacientes), TcVI (9 pacientes), TcII+VI (2 pacientes),
TcV+VI (1 paciente), TcII/VI+V (1 paciente) e TcII/V/VI (4 pacientes).
54
Tabela 4.5. Comparação entre a tipagem molecular de T. cruzi nas duas
amostras de sangue dos pacientes com sorologia positiva.
Paciente
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
27
Amostras
259
26
482
18
495
103
83
34
375
489
463
334
212
318
480
444
219
423
107
197
134
353
17
342
200
307
431
286
202
238
388
484
150
498
320
485
434
245
452
50
54
284
374
104
78
105
261
110
243
415
302
228
II
X
X
X
X
X
X
III
V
VI
II/VI
II/V/VI
Resultado
II
II
II
X
II
X
X
II
II
X
X
X
X
X
X
X
II/VI
II/VI
X
X
II+VI
X
X
X
II+VI
II+VI
X
X
X
X
X
II+VI
II+VI
X
X
III+VI
X
V
X
X
V
X
X
X
X
X
X
X
X
VI
VI
VI
VI
X
X
55
II/V/VI
II/VI
X
X
X
X
II/V/VI
II/VI
X
X
II/V/VI
VI
Paciente
28
29
30
31
32
33
34
35
Amostras
450
476
377
411
91
171
126
325
391
198
483
442
116
361
231
258
II
III
V
VI
II/VI
VI
X
X
X
X
X
X
56
Resultado
VI
X
X
X
II/V/VI
VI
VI
VI
VI
VI
VI
4.3.5. Distribuição geográfica das DTUs
Sendo as duas mais encontradas nos pacientes, as DTUs II e VI foram as
mais dispersas em relação à naturalidade dos pacientes, estando presentes em seis
e sete estados, respectivamente (figura 4.13). Interessantemente, dois casos de
TcV foram identificados na Bahia. Além disso, alguns pacientes apresentaram
infecção mista, aqueles advindos de quatro estados (AL, CE, PB e RJ), TcII+VI e,
outros dois apresentaram TcIII+VI e TcV+VI (BA e RJ, respectivamente).
Figura 4.13. Distribuição geográfica das DTUs de T. cruzi. Correlacionando a
naturalidade dos pacientes com o resultado da tipagem molecular, foi possível traçar
um mapa de distribuição. O número de pacientes que foi apresentado por cada DTU
está indicado dentro dos heptágonos.
57
4.3.6. Comparação entre forma clínica e DTUs de T. cruzi.
Devido à diversidade da apresentação clínica avaliada entre os pacientes
crônicos (com ou sem manifestação cardíaca aparente), buscamos comparar as
DTUs encontradas circulante no sangue periférico do paciente à manifestação da
doença. Embora o número de pacientes seja pequeno, entre os dados obtidos foi
possível identificar, entre as amostras de pacientes com sorologia positiva, a
prevalência da forma cardíaca nas DTUs V, onde 2 pacientes apresentavam
alteração cardíaca, e VI, com 8 pacientes com a forma cardíaca e 2 sem forma
cardíaca aparente, enquanto o contrário foi visto nos infectados por TcII, 1 e 2
pacientes, forma cardíaca aparente e não parente, respectivamente (figura 4.14).
Além disso, aqueles coinfectados com TcII e TcVI apresentaram o mesmo número
entre forma cardíaca e indeterminada, 2 pacientes em cada grupo.
Pacientes com sorologia negativa apresentaram resultados similares, onde
aqueles identificados com TcV, 3 possuiam alguma alteração cardíaca e 2 não. O
mesmo foi visto para TcVI, pois 7 desses pacientes apresentavam alteração
eletrocardiográfica em seus corações e 2 não. Enquanto foi visto o mesmo número
de pacientes com ou sem alteração para àqueles infectados por TcII+VI (1 para
cada). Três pacientes infectados com TcIII, TcV+VI e TcII/VI+V, respectivamente,
não apresentavam qualquer alteração cardíaca aparente e, entre os infectados por
TcII/V/VI, dois apresentavam alterações e dois não.
Figura 4.14: Comparação entre manifestação da doença e o genótipo de
T. cruzi entre os pacientes soropositivos
58
4.3.7. Comparação entre o genótipo de T. cruzi e a carga parasitária.
Com o objetivo de verificar se existe uma relação entre o isolado de T. cruzi e
a carga parasitária nos pacientes crônicos, foi feita uma comparação entre as cargas
parasitárias e as DTUs do parasito. A figura 4.15 mostra o resultado obtido,
observando que o os pacientes infectados por TcII apresentaram cargas parasitárias
mais altas, seja em uma infecção simples ou mista, que foram significativamente
distintas dos pacientes infectados com TcV ou TcVI. Não obstante, os pacientes
que apresentaram infecção por TcVI tiveram as cargas mais diversas, incluindo a
carga mais elevada encontrada nesse estudo e uma mediana apresentando um
valor intermediário. Interessante ressaltar que os pacientes com infecções mistas
pelas TcII+VI apresentaram uma mediana com valor intermediário entre TcII e TcVI,
separadamente. Quando comparamos a carga parasitária com manifestação
cardíaca para cada genótipo, os indivíduos infectados com TcVI que apresentavam
alterações cardíacas possuiam uma carga parasitária bastante variável, enquanto
que aqueles com TcV possuiam uma carga parasitária menor, em relação às outras
DTUs. Interessante ressaltar que uma proporção menor de indivíduos com forma
cardíaca, em relação aos sem alteração, foi vista quando em coinfecção por TcII e
TcVI. Nenhuma comparação entre suas cargas apresentou diferença significativa.
Figura 4.15. Relação entre carga parasitária e DTU. Símbolos em preto: pacientes
sem manifestações cardíacas. Símbolos em vermelho: pacientes com manifestações
cardíacas. Símbolos brancos: pacientes não avaliados por ECG,
59
5. DISCUSSÃO
Em virtude das pobres perspectivas de tratamento e ausência de intervenção
imune contra a infecção aprovada para uso humano, a Doença de Chagas
representa, ainda hoje, um sério problema na saúde pública em várias regiões das
Américas e Europa. Nesse sentido, a busca de métodos acurados para o
diagnóstico molecular, quantificação da carga parasitária e tipagem molecular do
parasito ainda se mostra um grande desafio. É bastante provável que a diversidade
genética do T. cruzi deva interferir na patogênese da Doença de Chagas. Porém, até
o presente momento, poucas comparações foram realizadas para suportar esta
premissa. Neste estudo, buscamos utilizar um sistema de genotipagem multilocus
intra-específica de T. cruzi recomendado por um consenso internacional (Zingales e
cols., 2009), para contribuir com uma acurada caracterização molecular de isolados,
possibilitando a identificação de genótipos diretamente de amostras sanguíneas de
pacientes crônicos. A genotipagem de populações de T. cruzi oriundas de pacientes
pode fornecer informações relevantes acerca da correlação entre os principais
subgrupos de T. cruzi e aspectos clínicos da infecção. Com isso, estaremos
fornecendo novas informações para um maior entendimento da complexidade e
dinâmica da diversidade do parasito na história natural da doença de Chagas
humana.
Alterações eletrocardiográficas em indivíduos com sorologia positiva para a
doença de Chagas precedem ao aparecimento de outros sintomas, como
anormalidades ao exame físico e ao estudo radiológico do tórax (Marques e cols.,
2006). Devido à fácil execução e ao baixo custo, o ECG é o exame mais difundido e
executado na prática clínica, além de ser um método não invasivo, reprodutível e de
grande acurácia para o diagnóstico (Rassi Jr e cols, 2012). Os pacientes deste
estudo, que fazem parte da coorte atendida no ambulatório do Instituto Nacional de
Infectologia da Fundação Oswaldo Cruz, no Rio de Janeiro, foram submetidos ao
exame ECG, onde mais de 70% apresentaram a forma cardíaca da doença.
Em relação à naturalidade dos pacientes, a maioria é advinda da região
nordeste do Brasil, uma parcela da região sudeste e alguns da região centro-oeste e
sul, como mostrado na tabela 4.2. Importante ressaltar, ainda, que a maior parte
mora ou morou em região rural. Conforme mostrado por Zingales e cols. (2012), os
60
estados de origem da maior parte da população de estudo estão dentro da área de
ciclo de transmissão doméstica vetorial para, pelo menos, duas DTUs, embora
acredita-se que possa existir um quadro epidemiológico subestimado, devido à falta
de tipagem molecular do parasito em pacientes infectados. Recentemente, foi
publicada uma revisão sobre a prevalência da doença de Chagas no Brasil, baseada
em estudos publicados de 1980 até 2012 (Martins-Melo e cols., 2014) incluindo
alguns dos estados apontados nesse estudo (como CE, BA, PE, PA, MG e GO), o
que corrobora com o nosso estudo. Além disso, nossos dados ampliam essa visão,
apresentando casos de infecção por T. cruzi nos estados de AL e RJ. Apesar do
controle da transmissão através do principal vetor, uma considerável prevalência da
doença de Chagas ainda é observada em algumas áreas no Brasil, com declínio nas
últimas décadas. Estudos baseados na sistemática da população em níveis
regionais e nacional são necessários para prover estimativas acuradas, identificar
áreas de alto ricos e para planejar e acessar medidas de controle sistemáticas no
Brasil (Martins-Melo e cols., 2014).
Ao comparar o número dos indivíduos infectados de cada gênero, não
observamos diferença, onde 34 dos pacientes soropositivos eram do sexo feminino
e 32 do sexo masculino. Deste modo, nossos dados corroboram com o que foi
apresentado por Costa-Junior e Maia (2009), que mostrou que homens e mulheres
apresentam probabilidades semelhantes para desenvolver doenças. Quando
buscamos comparar as idades no grupo de pacientes com sorologia positiva para T.
cruzi, identificamos que a maior parte dos indivíduos se encontra na faixa entre 40 e
69 anos, sendo um terço destes acima dos 60 anos. Isto foi similar ao encontrado
por outros autores em que a faixa etária foi em torno de 46,9 +/- 10,1 anos (Gomes e
cols., 2000; Costa e cols., 2009). Com isso, podemos deduzir que menos casos
novos estão ocorrendo e que a população infectada está envelhecendo, assim como
apontado por Martins-Melo e cols. (2014), o que é reflexo do controle vetorial
aplicado com sucesso desde 2006 no Brasil (WHO, 2012). Porém, não foi possível
identificar alguma relação entre a idade e o sexo com o fato do indivíduo estar
infectado por T. cruzi, o que também foi encontrado nos dados de Melo e cols.
(2009), apontando que outros fatores possam ser mais influentes em relação à
doença de Chagas.
Este trabalho corresponde a um estudo simples cego, realizado com
pacientes portadores de doença de Chagas crônica que não receberam o tratamento
etiológico, e apresentavam ou não manifestações cardíacas aparentes. De cada
61
paciente, foi retirada uma alíquota de 10 mL de sangue venoso, que foi dividida em
duas partes idênticas, para a realização dos ensaios moleculares em duplicata e
comparação dos resultados.
Com o DNA obtido das amostras de sangue dos pacientes, foram realizados ensaios
para a quantificação da carga parasitária e genotipagem do parasito. Inicialmente,
observamos que as cargas parasitárias variaram de 0,06 e 153,7 Eq. par./mL, com
mediana de 3,01 Eq. par./mL para os soropositivos e 0,94 q. par./mL para os
soropositovos, sendo que a maioria dos pacientes apresentou uma carga abaixo de
10 eq. par./mL (figura 4.4 e 4.5). Isto está de acordo com dados existentes na
literatura (Moreira e cols., 2013), que mostram a baixa carga parasitária de pacientes
do Brasil. De maneira geral, as cargas estimadas para o par de amostras de sangue
correspondente ao mesmo paciente foram concordantes (p=0.5798), indicando
umaboa precisão desta técnica (figura 4.4). Mesmo assim, algumas amostras
apresentaram uma variação entre as quantificações da primeira e segunda alíquota.
Tendo em vista que o sangue coletado foi dividido em duas alíquotas logo após a
coleta, e considerando a elevada viscosidade deste tecido, é possível que a carga
parasitária não tenha sido dividida homogeneamente entre as duas alíquotas, o que
justificaria tais discrepâncias.
Em nosso estudo, obtivemos uma sensibilidade de 58,8% e uma
especificidade de 60,9%, para o diagnóstico molecular realizado pela PCR em
Tempo Real, quando comparado aos testes sorológicos. Utilizando os mesmos
oligonucleotídeos utilizados em nosso estudo (cruzi1/cruzi2 e a sonda TaqMan
cruzi3), Duffy e cols. (2009) reportaram valores de sensibilidade entre 60,3 e 100%
para a detecção de T. cruzi em amostras de sangue de pacientes advindos de
diferentes áreas geográficas (Venezuela, Cochabamba e regiões norte e sul da
Argentina), infectados por vias de transmissão diferentes (infecção oral, doença de
Chagas crônica e recém-nascidos de mães com doença de Chagas crônica), e
apresentando diferentes medianas da carga parasitária (2,75-691,8 eq. par/mL). Em
outro estudo, Fitzwater e cols., (2008) obtiveram 60,1%, 46,5% e 40% de
sensibilidade para diagnóstico molecular a partir de amostras de coágulo, capa de
leucócitos e sangue total, respectivamente, em ensaios de PCR convencional
utilizando os primers 121/122. Isto sugere que vários fatores possam influenciar a
sensibilidade da PCR, como o alvo molecular, as metodologias para extrair o DNA e
até mesmo o genótipo do parasito.
62
Para aumentar a sensibilidade da PCR, é recomendado que se coletem
maiores volumes de sangue e/ou mais de uma amostra, para aumentar a
probabilidade da detecção de, pelo menos, um parasito (Castro e cols., 2002; Duffy
e cols., 2009; Juqueira e cols., 1996). No nosso estudo, foi feita uma coleta em um
único momento, que foi dividida em dois tubos, em um volume equivalente à metade
do que é sugerido na maioria dos estudos. Isto pode ter contribuído para a reduzida
sensibilidade encontrada. Além disso, deve-se levar em consideração o número
baixo e intermitente de parasitos circulantes durante a fase crônica, levando a
momentos não favoráveis de coleta de sangue. Alguns pesquisadores sugerem que
a área endêmica onde o paciente vive interfere no diagnóstico molecular, devido a
diferenças de cepas de T. cruzi presentes na região, que podem influenciar na
quantidade de parasitos circulantes na hora da coleta de sangue (Basquiera e cols.,
2003; Junqueira e cols., 1996; Miyamoto e cols., 2006). Contudo, os resultados de
sorologia negativa e PCR em Tempo Real positiva encontrados neste estudo
também sugerem a necessidade de uma reavaliação dos testes sorológicos
realizados anteriormente.
Ao analisar as cargas parasitárias de acordo com a presença ou ausência de
manifestação cardíaca da doença (figura 4.6), observamos diferenças estatísticas,
além disso, a mediana dos pacientes sem forma cardíaca aparente tenha sido cerca
de seis vezes mais elevada do que aquela apresentada pelos pacientes com forma
cardíaca. Diferentes do que foiencontrado por Melo e cols. (2015), onde apesar da
mediana das cargas serem levemente diferentes, não apresentavam diferenças
estatísticas. O envolvimento cardíaco na doença de Chagas é um dos principais
mecanismos responsáveis pela elevada morbidade e mortalidade. Ainda, a carga
parasitária é sugerida como um dos fatores influente para a progressão do quadro
clínico da doença (Nóbrega e cols., 2014; Rassi Jr e cols., 2012). Nossos resultados
sutilmente apontaram para uma possível relação inversamente proporcional entre
carga parasitária e progressão clínica (figura 4.6), mas acreditamos que para uma
avaliação mais acurada, seria preciso uma coorte com um número maior de
indivíduos. Entretanto, é possível, ainda, que outros fatores não analisados nesse
estudo possam ter algum envolvimento neste resultado. Um dos fatores poderia ser
o tropismo tecidual do parasito. Para os pacientes com manifestação cardíaca,
poderia estar ocorrendo um acúmulo do parasito no coração, acarretando em uma
diminuição da carga parasitária no sangue periférico.
63
Ao buscar relação entre a carga parasitária e o sexo do paciente, nao
identificamos qualquer diferença significativa. Estudos experimentais indicam
diferenças na suscetibilidade entre machos e fêmeas, onde os camundongos
machos são mais suscetíveis à evolução dos sinais para cardiomiopatia grave,
enquanto fêmeas tendem a apresentar sinais de cardiomiopatia moderada, apesar
de que em outros estudos isso não é visto (Hauschhuka, 1947; Araújo-Jorge e cols.,
1992). Por ter um número aproximado entre os indivíduos com forma cardíaca
aparente ou não em ambos os sexos, talvez não tenha sido possível correlacionar a
suscetibilidade à manifestação cardíaca. Deste modo, decidimos comparar as
cargas parasitárias entre os sexos dos pacientes, onde identificamos uma mediana
ligeiramente superior nos pacientes do sexo masculino, entre os pacientes
soronegativos, enquanto o oposto foi visto entre os soropositivos.
A tipagem molecular foi realizada utilizando um algoritmo de marcadores
moleculares desenvolvidos a partir da combinação de dois algoritmos já publicados
(Burgos e cols., 2010; Ramirez e cols., 2010). A caracterização molecular deste
estudo foi feita a partir de DNA extraído diretamente das amostras de sangue dos
pacientes, para evitar uma possível seleção de cepas durante o isolamento do
parasito, o que poderia, por exemplo, mascarar infecções mistas dos pacientes.
Como mostrado por Moreira e cols. (2013), a carga parasitária dos pacientes com
cardiomiopatia chagásica crônica do Brasil, foi cerca de 20 vezes menor quando
comparada com pacientes nas mesmas condições da Argentina e Colômbia.
Sugerindo a necessidade de um protocolo otimizado para a tipagem molecular a
partir de amostras de sangue com carga parasitária muito baixa, uma vez que os
protocolos mais utilizados na atualidade foram desenvolvidos e aplicados em outros
países da América Latina, incluindo os dois países supracitados. Assim, avaliamos
inicialmente a tipagem molecular para parasitos de cultura (Figura 4.8), e
investigamos o limite de detecção para cada alvo, a partir de amostras de sangue
humano artificialmente contaminado com T. cruzi (figuras 4.9, 4.10 e 4.11),
utilizando cepas de referência para cada DTU. Observamos que foi possível detectar
a banda de tamanho esperado para a maioria das amostras, mesmo na
concentração de 0,5 Eq. Par/mL, valor que representa uma carga parasitária
condizente com as encontradas em pacientes crônicos brasileiros e com o limite de
detecção da qPCR. Contudo, para o alvo no fragmento nuclear A10, que diferencia
entre TcII e Tc VI, houve uma maior dificuldade em observar amplificação da banda
esperada, para todas as concentrações testadas. Mesmo assim, em conjunto, este
64
algoritmo apresentou-se apto a ser aplicado para a tipagem molecular de T. cruzi a
partir de amostras de sangue periférico dos pacientes crônicos. Dos 65 pacientes
analisados, foi possível chegar a algum resultado de genotipagem em todos. Além
disso, foi possível obter a identificação precisa da DTU presente nas amostras de
sangue de 76,6% dos pacientes.
Para concluir a tipagem molecular, as duas amostras foram analisadas
individualmente para cada paciente. As DTUs mais encontradas foram TcVI, TcV e
TcII (com ocorrência de 37,5%, 10,9% e 9,3%, respectivamente – dados relativos à
tabela 4.5). A alta prevalência de TcII e TcVI está de acordo com a literatura, que
aponta a distribuição de Tc II no ciclo doméstico, do nordeste ao sul do Brasil, e de
TcVI em toda a região sudeste e sul, incluindo a região centro-oeste (Zingales e
cols. 2012), o mapa da figura 4.13 demonstra a distribuição geográfica das DTUs
encontradas neste estudo. Foi possível identificar casos de infecção mista entre a
população de estudo, apresentando 12,5% para coinfecção com as DTUs II e VI.
Esses
casos
possivelmente
ocorreram
devido
à
interseção
das
áreas
epidemiológicas destas duas DTUs, ou à subestimação desta distribuição. Outra
observação importante foi a presença de TcIII em um paciente soronegativo do
estado da Paraíba e uma coinfecção de TcIII-VI em um paciente soropositivo do
estado da Bahia, sendo essa uma DTU predominantemente encontrada no ciclo
silvestre de transmissão. Até o presente momento, não existiam dados sobre a
infecção crônica causada por TcIII, apenas a identificação de infecção aguda havia
sido relatada (Coura, 2007).
Interessante ressaltar que casos de infecção humana por TcV em pacientes
do Brasil não haviam sido apontados até o presente momento. Mas, em nosso
estudo, encontramos sete pacientes que tinham infecção com a DTU V de T. cruzi (2
soropositivos e 5 soronegativos), além de dois casos de infecção mista envolvendo
este subtipo do parasito em pacientes soronegativos. Esse resultado indica que a
área de transmissão doméstica de TcV pode ser mais ampla do que é conhecido,
ressaltando a importância desta que é a principal DTU correlacionada à infecção por
T. cruzi no Chaco Argentino e Bolívia (Monje-Rumi e cols., 2015). Mais uma vez,
nossos dados mostram uma possível subestimação da distribuição geográfica dos
genótipos de T. cruzi nas áreas endêmicas.
A identificação de diversos pacientes com coinfecção por duas DTUs
diferentes ressalta a importância da tipagem molecular diretamente do sangue,
quando comparado com metodologias clássicas de isolamento do parasito, como
65
também foi apontado em outros estudos (Monje-Rumi e cols., 2015; Bosseno e cols.,
2000). Entretanto, em alguns casos, não conseguimos distinguir totalmente qual
DTU estava presente (23,4%). Mesmo assim, este foi um resultado ligeiramente
mais sensível do que o publicado por Cura e cols. (2012) que não conseguiram
genotipar 27% das amostras de sangue de pacientes de várias regiões da Argentina.
Essa falta de amplificação ocorreu provavelmente devido à carga parasitária abaixo
do limite de detecção dos procedimentos utilizados.
Ao buscar na literatura, todas as DTUs são encontradas em humanos e
quatro delas são associadas à cardiomiopatia, enquanto as TcIII e TcIV continuam
com dados clínicos desconhecidos (revisado pro Zingales e cols., 2012). Devido à
possibilidade de presença ou ausência de manifestação clínica aparente entre os
pacientes crônicos, buscamos correlacionar a ocorrência da forma cardíaca ao
genótipo do parasito. Para as DTUs V e VI, foi possível identificar um número maior
de pacientes soropositivos com a forma cardíaca (2 e 8 pacientes, respectivamente)
do que sem alteração cardíaca aparente, nenhum e 2 pacientes, respectivamente.
Ainda, para a DTU II, o contrário foi observado (1 e 2 pacientes para as respectivas
manifestações aparentes ou não). Contudo, vale ressaltar que foi observado um
número igual de pacientes entre os grupos com manifestação cardíaca aparente ou
não, coinfectados com TcII e TcVI, sendo 2 pacientes em cada. O mesmo perfil foi
visto nos pacientes com sorologia negativa.
Análises da correlação entre carga parasitária e as diferentes DTUs em
modelos de infecção experimental para doença de Chagas demonstraram que cepas
pertencentes à DTU VI tinham uma alta parasitemia e alto índice de mortalidade,
enquanto cepas de TcII apresentavam mortalidade e parasitemia moderadas
(Brener, 1971; Andrade, 1974; Franco e cols, 2003; Rodrigues e cols., 2013; SalesCampos e cols., 2014). Outros estudos avaliaram os efeitos da coinfecção por DTUs
diferentes na sobrevivência e parasitemia de camundongos, onde a carga parasitária
era moderada em infecções mistas quando comparada com infecções simples das
mesmas cepas (Rodrigues e cols., 2013; Sales-Campos e cols., 2014). Deste modo,
buscamos correlacionar as cargas encontradas com os resultados da tipagem
molecular, onde pacientes com a DTU II de T. cruzi apresentaram a maior mediana
de carga parasitária do estudo, quando comparada às demais DTUs (Figura 4.15),
ao contrário do observado com animais de experimentação. Não obstante, pacientes
que foram identificados coinfectados por TcII e VI, apresentaram uma mediana
intermediária entre os valores encontrados entre as infecções para os distintos
66
subtipos, de acordo com o observado experimentalmente por Rodrigues e cols.
(2013). Uma das possíveis explicações seria que a ativação do sistema imune para
dois exemplares de grupos diferentes do mesmo parasito possa acarretar em uma
reação cruzada, favorecendo um crescimento moderado de ambos. Um dos fatores
constitutivos do sistema imune com participação dúbia é o TNF (Fator de Necrose
Tumoral), que desenvolve um papel no controle de crescimento do parasito em
inflamação aguda, mas que pode ser mediador direto da patogênese do dano do
tecido cardíaco (Rodrigues e cols., 2013; Kroll-Palhares e cols., 2008), além de ser
detectável em pacientes com CCC (D’Avila Reis e cols, 1993).
Em conclusão, nossos experimentos reforçam o conhecimento epidemiológico
das DTUs de T. cruzi no Brasil ao encontrar diversos pacientes infectados por TcII e
TcVI, indicando, ainda, que a área de transmissão de TcV pode estar sendo
subestimada. Não obstante, identificamos os primeiros casos de infecção crônica
por TcIII, em dois pacientes da região Nordeste, um no estado da Paraíba e um na
Bahia (em infecção mista TcIII + TcVI). Além do mais, foi mostrada uma associação
maior entre TcV e TcVI com manifestação cardíaca do que entre as outras DTUs,
enquanto uma carga mediana mais elevada foi mais associada ao indivíduos
infectados por TcII. Levando isso em consideração, a inclusão de novos pacientes
deverá ser feita para que se possa concluir com maior segurança o papel da carga
parasitária e das DTUs do parasito como biomarcadores para o prognóstico da
doença de Chagas.
67
6. CONCLUSÕES
• A idade e o gênero dos pacientes não influenciaram na carga
parasitária e/ou na manifestação clínica da doença de Chagas;
• Foi possível padronizar um algoritmo de genotipagem para pacientes
crônicos brasileiros, apresentando um limite de detecção de 0,5 Eq.
Par/mL para tipagem de todas as DTUs;
• Os genótipos TcII e TcVI foram os encontrados com maior frequência
no grupo de pacientes avaliados. Além disso, foram identificados dois
casos de pacientes infectados com TcV e um caso de infecção crônica
por TcIII;
• Diversos estados brasileiros apresentaram infecção em pacientes com
mais de um tipo de DTU, seja em infecções simples ou mistas;
• Observamos uma maior ocorrência da manifestação cardíaca em
pacientes infectados com TcV e TcVI, e um relação inversa naqueles
infectados por TcII;
• A carga parasitária encontrada demonstrou que pode haver uma
relação com o subtipo do parasito, uma vez que os infectados por TcII
apresentaram uma mediana acima dos infectados com outras DTUs.
68
7. PERSPECTIVAS
• Aumentar a coorte de pacientes estudados para uma avaliação mais
acurada das diferenças encontradas;
• Inclusão de pacientes com manifestações clínicas digestivas da doença
de Chagas, para um estudo mais completo, investigando a correlação
com a carga parasitária e as DTUs encontradas;
• Realizar
uma
avaliação
clínica
mais
completa
dos
pacientes
pertencentes a este estudo, visando agrupá-los de acordo com os
níveis de gravidade das manifestações cardíacas, seguindo os critérios
recomendados pela Sociedade Brasileira de Cardiologia.
69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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87
8.ANEXO
8.1. Termo de consentimento
88
89
8.2 Parecer comitê de ética
90
91
92