Regulação da resposta imune como alvo de intervenção terapêutica
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Regulação da resposta imune como alvo de intervenção terapêutica na cardiomiopatia chagásica crônica experimental ISABELA RESENDE PEREIRA RIO DE JANEIRO 2015 52 INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular ISABELA RESENDE PEREIRA Regulação da resposta imune como alvo de intervenção terapêutica na cardiomiopatia chagásica crônica experimental Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Celular e Molecular Orientadora: Dra. Joseli Lannes-Vieira RIO DE JANEIRO 2015 ii iii INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular ISABELA RESENDE PEREIRA Regulação da resposta imune como alvo de intervenção terapêutica na cardiomiopatia chagásica crônica experimental ORIENTADORA: Dra. Joseli Lannes-Vieira EXAMINADORES: Prof. Dra. Tania Cremonini de Araujo-Jorge (Presidente) Prof. Dr. Edecio Cunha-Neto (Membro) Prof. Dra. Andrea Henriques Pons (Membro/Revisora) Prof. Dra. Solange Lisboa de Castro (Suplente) Prof. Dra. Regina Coeli dos Santos Goldenberg (Suplente) Rio de Janeiro, 09 de julho de 2015 iv “Posso, tudo posso Naquele que me fortalece Nada e ninguém no mundo vai me fazer desistir Quero, tudo quero, sem medo entregar meus projetos Deixar-me guiar nos caminhos que Deus desejou pra mim e ali estar Vou perseguir tudo aquilo que Deus já escolheu pra mim Vou persistir, e mesmo nas marcas daquela dor Do que ficou, vou me lembrar E realizar o sonho mais lindo que Deus sonhou Em meu lugar estar na espera de um novo que vai chegar Vou persistir, continuar a esperar e crer E mesmo quando a visão se turva e o coração só chora Mas na alma, há certeza da vitória”. Compositor: Celina Borges v Dedico este trabalho... À minha família, Meu pai Ormeu, minha mãe Silvia e meu irmão Eduardo, tesouros da minha vida. Agradeço a vocês por tudo que fizeram e ainda têm feito por mim. Agradeço por estarem sempre ao meu lado apoiando as minhas decisões. A vocês, minha eterna gratidão. vi Agradecimentos Nestes oito anos no Laboratório de Biologia das Interações muitas foram as pessoas que, de inúmeras maneiras, contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho, transformando-o numa experiência prazerosa e intensa de formação científica e trabalho intelectual. A experiência da pós-graduação não somente trouxe para mim conhecimento científico-acadêmico, como também levo comigo exemplos de determinação, eficiência, compromisso, paciência e confiança no futuro. Esta tese de doutoramento reflete o trabalho de formação que começou na iniciação científica, passou pelo mestrado e hoje, de forma madura, completa um ciclo de conhecimento e abre caminhos e possibilidades para novas conquistas. Dessa forma gostaria de agradecer a todos que me auxiliaram nesta caminhada. "Se consegui ver mais longe é porque estava aos ombros de gigantes" Sir Isaac Newton Primeiramente agradeço a Deus, que iluminou meus caminhos e me ajudou a vencer mais uma etapa em minha vida. À minha orientadora, Dra. Joseli Lannes-Vieira, pela dedicação, ensinamentos, confiança, apoio e orientação ao longo de todos estes anos. Toda minha admiração e respeito. Aos pesquisadores do Laboratório de Biologia das Interações, Danielle, Daniel, Verônica e Andrea, que sempre tiveram dispostos a ajudar e ensinar. Aos colegas de laboratório Rafael Rodrigues, Rhaíssa, Leonardo, Ellen, Laura, Lucia Helena, Dina, Isabela Forasteiro, Jéssica, Thaís e todos que por aqui passaram e deixaram um pouco de si. Obrigada pelo companheirismo e agradáveis momentos de convivência. À veterinária e doutoranda Glaucia Vilar pelas análises eletrocardiográficas e todo o suporte em experimentação animal. Ao Dr. Otacilio Moreira e a todos do Laboratório de Biologia Molecular e Doenças Endêmicas, que sempre me receberam muito bem, me auxiliaram e discutiram comigo os resultados de PCR. Às tecnologistas Cynthia Casabulho e Daniela Beghini pelo carinho e prontidão com que sempre me ajudaram no citômetro de fluxo. À fofíssima Isalira Peroba Ramos, pela colaboração nas análises ecocardiográficas. vii Aos profissionais do CECAL/Fiocruz, Biotérios de Experimentação do IOC/Fiocruz e das plataformas, que permitiram o uso de animais e equipamentos indispensáveis à realização deste trabalho. À toda minha família por todo carinho, apoio e estímulo de sempre. Ao meu noivo Bernardo por todo amor, cumplicidade, carinho, compreensão e paciência. Às companheiras de casa Magna, Milena, Juliana, Brenda e Letícia pelas palavras amigas, choros, brigadeiros e risadas. À Marina, que me adotou e apresentou o Rio de Janeiro. Você é muito especial. À grande amiga carioca Alessandra, vou te levar por toda a vida. À Lucilene, Joseane e todos os colegas do Pavilhão Cardoso Fontes por cada cafezinho, favorzinho e mimo que me fizeram sentir querida. Aos funcionários e colegas da Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Agradeço aos membros da banca examinadora e suplentes, por aceitarem o convite e, em especial, à Dra. Andrea Henriques Pons por rever meu trabalho, discutir e me estimular cientificamente. Ao IOC, FAPERJ e CNPq pelo apoio financeiro. Principalmente, agradeço ao prêmio Doutorado-Bolsa Nota 10 que muito me estimulou. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. Obrigada! viii Resumo A doença de Chagas (DC) é uma infecção causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi que afeta milhões de pessoas principalmente na América latina. Na fase aguda, a resposta imune associada à inflamação cardíaca pode levar ao controle do parasito. No entanto, em cerca de 30% dos pacientes o processo inflamatório pode persistir resultando em cardiomiopatia chagásica crônica (CCC). A CCC é caracterizada pela persistência do parasito, inflamação e fibrose progressiva com alterações elétricas e funcionais. No tecido cardíaco afetado, a presença de citocinas inflamatórias e quimiocinas pode dirigir a migração dos leucócitos que contribui para a formação do infiltrado inflamatório. Neste trabalho desafiamos a hipótese de que a regulação da resposta imune na fase crônica da DC é uma alternativa para estimular a imunidade protetora, interromper a progressão e, até mesmo, reverter a CCC. Inicialmente, descrevemos dois modelos experimentais, C3H/He e C57/BL6, infectados pela cepa Colombiana do T. cruzi. Estes reproduziram aspectos da DC crônica, apresentando diferentes níveis de lesão cardíaca em paralelo às alterações imunológicas, podendo ser classificados, respectivamente, como portadores de CCC grave e moderada. Estes modelos experimentais foram usados nos trabalhos seguintes. A gravidade da CCC foi associada com a intensidade do parasitismo cardíaco, ao aumento dos níveis séricos do fator de necrose tumoral (TNF) e de óxido nítrico (NO). Como prova de conceito, administramos o fármaco anti-TNF Infliximab na fase crônica da infecção pelo T. cruzi e observamos que não há alteração na carga parasitária tecidual, mas ocorre o reposicionamento da resposta imune com redução dos níveis séricos e expressão de TNF e de seu receptor 1 (TNFR1) no tecido cardíaco, aumento da frequência de células expressando IL-10 no baço, diminuição da atividade citotóxica de células T CD8+ e melhora da função elétrica. A patologia da CCC é proposta estar associada à persistência do parasito e ao desequilíbrio da resposta imune do hospedeiro, favorecendo a inflamação crônica não benéfica que leva à lesão cardíaca. Assim, utilizando o imunorregulador pentoxifilina (PTX) nos modelos de CCC moderada e grave, observamos melhora na função elétrica, com redução da atividade da enzima CK-MB (biomarcador de lesão de cardiomiócitos) no soro, menor distância entre as placas de conexina 43 (Cx43) e redução do depósito de fibronectina no tecido cardíaco. A terapia com PTX reduziu a frequência de células T CD8+ que expressam marcadores de ativação e migração no baço, a ativação das células endoteliais dos vasos sanguíneos e a intensidade da miocardite. Embora a produção de interferon (IFN)γ tenha sido preservada sistemicamente e no tecido cardíaco, a terapia com PTX reduziu o número de células perforina (Pfn)+ neste tecido. PTX associada à droga tripanossomicida benznidazol, diminuiu a carga parasitária, a miocardite, a expressão de TNF, TNFR1 e a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) no tecido cardíaco e os níveis séricos de NO. De forma importante, a terapia combinada sustentou a melhora na função elétrica 30 dias após o final da terapia. Por último, usamos como estratégia de modulação da resposta imune na infecção cronica pelo T. cruzi a vacina terapêutica em um protocolo homólogo de indução-reforço com adenovírus recombinante transportando as sequências codificadoras da proteína-2 da superfície de amastigota e a trans-sialidase (rAdVax). Os camundongos vacinados apresentaram menos lesão cardíaca e anormalidades elétricas. A imunoterapia com rAdVax redirecionou a resposta imune específica, aumentando a freqüência de células T CD8+ produtoras de IFNγ e diminuindo a freqüência de células T CD8+ citotóxicas em camundongos cronicamente infectados pelo T. cruzi. Além disso, rAdVax reduziu o número de células Pfn+, mas preservou o número de células de IFNγ+ no tecido cardíaco. A imunoterapia com rAdVax reduziu os níveis séricos de NO e a expressão de iNOS no tecido cardíaco. Nossos dados suportam que a fisiopatogenia da DC é sustentada por persistência do parasito e por desregulação da resposta imune. Visto que atualmente os tratamentos disponíveis apenas mitigam os sintomas da CCC, as intervenções aqui propostas parecem ser alternativas viáveis para redirecionar a resposta imune para um perfil protetor visando um melhor prognóstico para os pacientes. ix Abstract Chagas disease (CD) is an infection caused by a flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, which affects millions of people especially in Latin America. In the acute phase, immune response associated with heart inflammation can lead to parasite control. However, in about 30% of patients, the inflammatory process may persist resulting in chronic chagasic cardiomyopathy (CCC). This condition is characterized by parasite persistence, inflammation and progressive fibrosis with electrical and functional changes. In the affected cardiac tissue, the presence of inflammatory cytokines and chemokines can drive leukocyte migration that contributes to the establishment of inflammatory infiltrates. In this work, we challenge the hypothesis that regulation of the immune response in the chronic phase of CD is an alternative to stimulate protective immunity, stop progression and even reverse CCC. Initially, we describe two experimental models, C3H/He and C57BL/6, infected with the Colombian T. cruzi strain. These models reproduced aspects of chronic CD, featuring different degrees of cardiac injury parallel to immunological changes, being classified, respectively, as severe and moderate CCC. These experimental models were used to challenge our hypothesis. CCC severity was associated with the intensity of cardiac parasitism and increased levels of tumor necrosis factor (TNF) and nitric oxide (NO) in the serum. As proof of concept, we administered the anti-TNF Infliximab in the chronic phase of T. cruzi infection. There was no change in tissue parasite load, but we observed repositioning in the immune response with reduced TNF levels in the serum and expression of TNF and its receptor 1 (TNFR1) in the cardiac tissue, increase in the frequency of cells expressing IL-10 in the spleen, reduction in the CD8 cytotoxic activity and improvement in electrical function. The CCC pathology is proposed to be associated with parasite persistence and immunological unbalance, favouring the non-beneficial chronic inflammation that leads to heart damage. Thus, using the immunoregulatory agent pentoxifylline (PTX) in CCC models, mild and severe, we noted an improvement in the cardiac function, reduced CK-MB (cardiomyocyte injury biomarker) activity in the serum and decreased fibronectin deposition and connexin 43 (Cx43) loss and disorganization in the cardiac tissue. PTX therapy decreased the frequency of CD8+ T cells expressing activation and migration markers in the spleen, the activation of the endothelial cells of blood vessels and the intensity of myocarditis. Although the production of interferon (IFN)γ has been preserved systemically and in the cardiac tissue, PTX therapy reduced the number of perforin (Pfn)+ cells in this tissue. Further, PTX associated with the trypanocidal drug benznidazole, decreased parasite load, myocarditis, and the expression of TNF, TNFR1 and the inducible nitric oxide synthase enzyme (iNOS) in the heart, as well as NO levels in the serum. Importantly, the combined therapy sustained the improvement in electrical function 30 days after the end of the therapy. Finally, we used as strategy of modulation the immune response in chronic T. cruzi infection the therapeutic vaccine in a homologous prime-boost protocol with recombinant adenovirus carrying the coding sequences of the amastigote surface protein-2 and trans-sialidase (rAdVax). The vaccinated mice had less heart damage and electrical abnormalities. Immunotherapy with rAdVax redirected specific immune response, increasing the frequency of CD8+ T cells producing IFNγ and decreasing the frequency of cytotoxic CD8+ T cells in mice chronically infected with T. cruzi. Further, rAdVax reduced the number of Pfn+ cells, but preserved the number of IFNγ+ cells in the heart tissue. Moreover, the rAdVax immunotherapy reduced the serum levels of NO and iNOS expression in the cardiac tissue. Thus, our data support that the pathogenesis of CD is sustained by parasite persistence and deregulation of the immune response. Presently, available treatments only mitigate the symptoms of CCC. Therefore, the interventions proposed in our study appear to be feasible to redirect the immune response to a protective profile aiming a better prognosis for CD patients. x Lista de abreviaturas AP-1 Proteína ativadora 1 APC ASP2 Célula apresentadora de antígeno Proteína da superfície das formas amastigotas do T. cruzi BENEFIT BENznidazole Evaluation For Interrupting Trypanosomiasis AkT Proteína quinase B Btk Proteína tirosina quinase de Bruton Bz Benznidazol CAM Molécula de adesão celular CCC Cardiomiopatia chagásica crônica CCR Receptor de quimiocina CD62L L- selectina c-FLIP Proteína inibidora de FLICE c-IAP-1 Proteína inibidora da apoptose CK-MB Isoenzima MB da creatina quinase CTL Linfócito T citotóxico CTLA-4 Antígeno 4 de linfócito T citotóxico Cx43 Conexina 43 DC Doença de Chagas dpi Dias pós-infecção ERK quinase reguladora de sinal extracelular ETK Proteína tirosina quinase epitelial/endotelial FADD Proteína com domínio de morte associado à Fas FEVE Fração de ejeção do ventrículo esquerdo FLICE Enzima conversora de IL-1β FADD-like FN Fibronectina xi GPI Glicosil-fosfatidil-inositol ICAM-1 Molécula de adesão intercelular do tipo 1 (CD54) ICC Insuficiência cardíaca congestiva IFNγ Interferon-γ IgG Imunoglobulina da classe G IL Interleucina iNOS Óxido nítrico sintase induzível IRAK Receptor de IL-1 associado à quinase 1 IκB Inibidor do kappa B JNK Quinase c-Jun N-terminal LFA-1 Antígeno funcional do tipo 1 presente em leucócitos (CD11a/CD18) LPS Lipopolissacarídeo MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno Met-RANTES Antagonista parcial de CCL5/RANTES, RANTES humano recombinante com uma metionina na porção aminoterminal MHC Complexo principal de histocompatibilidade MyD88 Gene de resposta primária à diferenciação mielóide (88) NF-κB Fator de transcrição nuclear kappa B NK Células natural killer NO Óxido nítrico OMS Organização mundial de saúde OPAS Organização Pan-Americana da Saúde PAMPS Padrão molecular associado a patógeno Pfn Proteína formadora de poro (perforina) PLAD Domínio de associação prévia ao ligante PRRs Receptores de reconhecimento de padrões PTX Pentoxifilina xii rAd Adenovírus recombinante rAdVax Vacina de adenovírus recombinante transportando as sequências codificadoras da proteína-2 da superfície de amastigota e a trans-sialidase RIP-1 Proteína de interação com o receptor quinase 1 RNS Espécies reativas de nitrogênio ROS Espécies reativas de oxigênio SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida SODD Silenciadores do domínio de morte TACE Enzima conversora de TNF TAP-1 Transportador associado a processamento de antígenos TCR Receptor de antígeno de célula T TGF-β Fator transformador de crescimento β TLR Receptor do tipo Toll TNF Fator de necrose tumoral TNFR1/p55 Receptor 1 de TNF TNFR2/p75 Receptor 2 de TNF TRADD Proteína do domínio de morte associada ao receptor de TNF TRAF Fator associado ao receptor de TNF PI3K Fosfatidilinositol 3 quinase Treg Célula T reguladora TS Trans-sialidase VCAM-1 Molécula de adesão celular expressa pelo endotélio vascular (CD106) xiii Índice Resumo......................................................................................................... IX Abstract........................................................................................................ X Lista De Abreviaturas.................................................................................. XI Índice............................................................................................................ XIV Introdução.................................................................................................... 1 Revisão de Literatura................................................................................... 4 Justificativa.................................................................................................. 40 Objetivo Geral.............................................................................................. 41 Objetivos Específicos................................................................................... 41 Artigo I......................................................................................................... 42 Artigo II....................................................................................................... 53 Artigo III...................................................................................................... 72 Artigo IV...................................................................................................... 101 Artigo V....................................................................................................... 121 Discussão...................................................................................................... 153 Conclusões.................................................................................................... 174 Perspectivas.................................................................................................. 175 Referências................................................................................................... 176 Anexos.......................................................................................................... 203 xiv 1. Introdução ___________________________________________________________________________________ A doença de Chagas (DC) é uma doença tropical negligenciada, causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, capaz de levar o indivíduo a uma condição crônica limitante (Rassi et al., 2010). Nas últimas décadas vimos a globalização da DC, devido principalmente ao fluxo migratório de pessoas infectadas para áreas não endêmicas, com alto número de portadores principalmente nos Estados Unidos e Europa (WHO, 2014). Dados recentes da Organização Mundial da Saúde mostram que aproximadamente 7-8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi e cerca de 25 milhões estão expostas ao risco de contaminação (WHO, 2014). A cardiomiopatia chagásica crônica (CCC), principal causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes da DC, é caracterizada por persistência do parasito, inflamação e fibrose progressiva com remodelamento do miocárdio e da vascularização, que comumente causa insuficiência cardíaca (IC) (Rassi et al., 2010). Devido a falta de tratamento específico e eficaz contra a doença, a CCC é tratada de forma semelhante a outras síndromes de IC (Rassi et al., 2010). Atualmente, um dos grandes desafios é encontrar terapia efetiva para os pacientes de DC, em especial àqueles da forma cardíaca da fase crônica. A patogenia da CCC é proposta estar relacionada a alterações miocárdicas dependentes da persistência do parasito e da resposta imunológica (Marin-Neto et al., 2007). Na fase aguda da infecção pelo T. cruzi,a resposta imune essencial ao controle do parasito no tecido cardíaco está relacionada à geração de inflamação, que regride na maioria dos pacientes. Contudo, em cerca de 30% dos pacientes a inflamação persiste, levando à doença crônica. Acredita-se que as alterações na fase crônica sejam consequências de mecanismos multifatoriais relacionados tanto ao parasito quanto ao hospedeiro vertebrado. Entre os fatores relacionados ao parasito, o tamanho do inóculo, a variabilidade das linhagens, o tropismo tecidual e a antigenicidade são aspectos relevantes; quanto ao hospedeiro, é importante ressaltar, especialmente, as características imunológicas e genéticas (Vago et al., 2000; Dutra et al., 2009). De fato, é bem aceito que a ausência de manifestações clínicas na DC está associada à habilidade do indivíduo em controlar a resposta imune desencadeada pela infecção e que resulta no controle do parasitismo, mas que também pode contribuir para os danos inflamatórios, característicos da doença (Brener & Gazzinelli, 1997). 52 1 A citocina fator de necrose tumoral (TNF) se encontra em níveis aumentados no soro na infecção pelo T. cruzi (Perez-Fuentes et al., 2003; Ferreira et al., 2003; Talvani et al., 2004). Esta citocina é proposta atuar no controle da replicação do parasito na fase aguda, via indução da produção de óxido nítrico (NO), principalmente por macrófagos ativados (Aliberti et al., 2001). Entretanto, níveis plasmáticos de TNF estão correlacionados ao grau de disfunção cardíaca em portadores da CCC (Ferreira et al., 2003; Talvani et al., 2004). Assim, especula-se que inicialmente TNF teria função protetora na infecção pelo T. cruzi, porém seus elevados níveis nos soros dos pacientes permitiriam a perpetuação do infiltrado inflamatório e o exacerbado processo oxidativo, resultando na CCC (Perez-Fuentes et al., 2003). A participação de TNF na patogênese da CCC não está elucidada (Lannes-Vieira et al., 2011). No presente trabalho, nos perguntamos se TNF seria um fator chave na patogenia da DC, alimentando o desequilíbrio imunológico e este contribuindo para as lesões cardíacas. Um dos entraves para o entendimento da patogenia da DC é a não existência de modelo experimental que reproduza aspectos parasitológicos, imunológicos e clínicos da CCC, de forma simultânea e associada. Assim, antes de abordarmos nossa primeira proposta, estabelecemos modelos experimentais que atendessem esta lacuna. A importância das células T na DC está apoiada tanto nos achados que demonstram a sua resposta in vitro como nos dados que evidenciam a presença dessas células no infiltrado inflamatório no miocárdio de pacientes com CCC (Higuchi et al., 1993). A alta frequência de células T CD4+ e CD8+ efetoras, secretoras de altos níveis de citocinas inflamatórias, como TNF e interferon gama (IFNγ), e redução na frequência de células com perfil regulador e baixa produção de interleucina (IL)-10 foram encontradas em pacientes com CCC. Por outro lado, os pacientes com a forma indeterminada da DC, além de apresentarem células ativadas produzindo citocinas inflamatórias, possuem também aumento na frequência de células reguladoras e alta produção de IL-10 (Gomes et al., 2003; 2005; Araujo et al., 2007; Cunha-Neto et al., 2009). Independente de sua importância para a resistência do hospedeiro à infecção pelo T. cruzi (Padilla et al., 2009), as células T CD8+ ganharam atenção especial por serem o principal componente da miocardite aguda (Sun et al., 1993) e crônica (dos Santos et al., 2001) na infecção experimental pelo T. cruzi e em pacientes com CCC (Higuchi et al., 1993; 1997; Reis et al., 1993). Recentemente, mostramos que na fase crônica as células T CD8+IFNγ+ exercem um papel benéfico, enquanto que as células T CD8+perforina 2 (Pfn)+ participam da lesão cardíaca induzida pelo T. cruzi (Silverio et al., 2012). Neste trabalho, propusemos que uma terapêutica adequada poderia interferir com as populações distintas de células T CD8+ melhorando a lesão cardíaca na fase crônica da infecção pelo T. cruzi, o que abordaremos neste trabalho de tese. É possível especular que o desenvolvimento de lesões cardíacas na DC seja consequência da longa e complexa relação entre persistência do parasito e mecanismos homeostáticos mal-adaptados do hospedeiro, levando a alterações patogênicas (PerezFuentes et al., 2003). Este trabalho de tese tem como hipótese que a interação entre o parasito e o sistema imune seja responsável pelos danos teciduais nas células infectadas, favorecendo a persistência da inflamação e a fibrose cardíaca, levando a alterações elétricas e funcionais ao longo dos anos. Então, regular a resposta imune na fase crônica da DC pode ser uma alternativa, ao reposicionar a resposta imune desbalanceada e estimular a imunidade protetora, visando interromper a progressão e, até mesmo, reverter a CCC. Assim, com este trabalho objetivamos: (i) estabelecer modelo experimental que reproduza aspectos parasitológicos, imunológicos e clínicos da CCC, de forma simultânea e associada; (ii) contribuir para o entendimento de mecanismos celulares e moleculares envolvidos na patogenia e progressão da CCC experimental, esclarecendo a participação de moléculas chave nestes processos; e (iii) propor desenhos de estratégias de intervenção racional (usando fármacos imunorreguladores, droga tripanossomicida e vacina) que preservem a resposta imune protetora e o controle do parasitismo, que resolvam ou pelo menos mitiguem a inflamação crônica, potencialmente envolvida na geração de fibrose e disfunção cardíaca. Assim, visamos contribuir para alicerçar o caminho para a compreensão da patogênese da DC e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas racionais e potencialmente aplicáveis aos portadores da DC. 3 2. Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________ 2.1 Panorama das doenças cardíacas Doença cardíaca é um termo geral para designar diversas condições médicas crônicas ou agudas que afetam um ou mais componentes do coração. No início do século XX, as doenças cardíacas eram responsáveis por menos de 10% das mortes em todo o mundo, enquanto no início do século XXI já são responsáveis por quase 50% das mortes nos países desenvolvidos e 25% em países em desenvolvimento. Apesar do grande avanço ocorrido na segunda metade do século em termos de fisiologia cardíaca, dos meios para diagnóstico e para o tratamento das doenças cardíacas, sua incidência alcançou proporções epidêmicas e permanece como a principal causa de morte no mundo (Ministério da Saúde 2006). Um estudo de 2006 sobre projeções de mortalidade em nível global mostrou que no período de 2002-2030 as doenças cardiovasculares serão as maiores responsáveis por mortes no mundo (Mathers & Loncar 2006). No Brasil, em 2002, as doenças que atingem o coração representaram 31% do total de mortes, superando em mais de duas vezes a segunda causa, as neoplasias. As doenças cardíacas ainda são responsáveis por alta frequência de internações, ocasionando elevados custos médicos e socioeconômicos (Documento do Banco Mundial 2005; DATASUS 2009). No ano de 2003, o maior custo nas internações pagas pelo SUS correspondeu às doenças cardiovasculares (20% do total), dentre as quais a IC é a principal causa de internação (Carvalho et al., 2008; Moura et al., 2011). A IC é uma síndrome clínica complexa de caráter sistêmico e mau prognóstico. É definida como disfunção cardíaca que ocasiona inadequado suprimento sanguíneo para atender as necessidades metabólicas tissulares, na presença de retorno venoso normal, ou fazê-lo somente com elevadas pressões de enchimento. No Brasil, a principal etiologia da IC é a cardiopatia isquêmica crônica associada à hipertensão arterial. Também podem levar à IC, alterações nas válvulas cardíacas, níveis não controlados de pressão arterial, inflamações do músculo cardíaco, doença de Chagas e outras causas (Bocchi et al., 2009). 4 2.2 Doença de Chagas Em abril de 1909, Carlos Chagas comunicou ao mundo científico a descoberta de uma nova doença humana, que denominou tripanossomíase americana (Chagas, 1909), posteriormente chamada DC. O agente etiológico da doença, o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, e seu vetor, os triatomíneos, também haviam sido identificados por ele, ao final de 1908. A descoberta de Chagas, considerada única na história da medicina, constitui um marco decisivo na história da ciência e da saúde brasileira. Por determinar uma condição inflamatória crônica, cuja patogenia é amplamente questionada e que pode impossibilitar o indivíduo de exercer suas atividades, esta doença tem grande importância no âmbito da saúde pública. Hoje, mesmo após mais de cem anos de sua descoberta, a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) e a Organização Mundial da Saúde (OMS) estimam que 7-8 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas pelo T. cruzi e 10-14 mil mortes por ano são causadas pela DC (Rassi Jr et al., 2012; Salvatella, 2013; WHO 2014). Há ainda a questão importante que se refere à migração das populações latinas para outras partes do mundo, levando à globalização da DC, que deixa de ser uma doença exclusivamente de países pobres (Rassi et al., 2010; Bonney, 2014). A DC também é importante devido ao fardo econômico que gera (Lee et al., 2013). A mortalidade precoce e substancial invalidez causada por esta doença, que muitas vezes acomete a população em idade mais produtiva, adultos jovens, resulta em uma perda econômica significativa (FrancoParedes et al., 2007). Nos países latino-americanos, a DC é uma das doenças mais onerosas das chamadas "doenças tropicais negligenciadas" e à medida que a doença se expande para além da América Latina, há uma preocupação crescente no que diz respeito ao seu fardo econômico global (Lee et al., 2013). 2.3 Ciclo evolutivo do parasito e formas de transmissão da doença O T. cruzi é um protozoário digenético, hemoflagelado da ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae, que apresenta diversas formas evolutivas em seu ciclo biológico, sendo encontradas em organismos vertebrados ou no inseto vetor. No homem e em outros vertebrados, o parasito apresenta-se sob a forma tripomastigota no sangue periférico e a forma amastigota intracelular em todos os tecidos. O parasito se multiplica 5 apenas na forma intracelular por divisão binária. No inseto vetor, o desenvolvimento do T. cruzi é extracelular e se processa no trato gastrointestinal, no qual são encontradas formas epimastigotas, que se dividem, e tripomastigotas metacíclicas infecciosas. Estes são depositados com as fezes e urina na pele do hospedeiro vertebrado na ocasião da picada. A picada dos triatomíneos não é dolorosa, sendo facilitada por propriedades anestésicas e anticoagulantes da saliva do inseto. No entanto, pode ser pruriginosa e provocar fortes reações alérgicas. Em condições normais, os triatomíneos têm atividade noturna e exercem sua hematofagia à noite, atraídos pela temperatura da pele e pelo teor superficial de CO2 dos mamíferos. Desta forma, picam principalmente o rosto das pessoas adormecidas (daí o nome de barbeiro). Quando um triatomíneo deposita as fezes e urina na pele lesionada ou mucosa do hospedeiro vertebrado, as formas tripomastigotas metacíclicas penetram ativamente em células do sistema fagocítico mononuclear e se diferenciam em amastigotas; estas se multiplicam intensamente e diferenciam para formas tripomastigotas. Em seguida, estas formas rompem a célula hospedeira e caem na corrente sanguínea. As formas tripomastigotas penetram em células vizinhas ou mais distantes (musculares ou nervosas, por exemplo), diferenciamse em amastigotas e repetem o ciclo. Quando o triatomíneo suga o sangue contaminado do hospedeiro vertebrado ocorre diferenciação das formas tripomastigotas sanguíneas em formas epimastigotas no estômago do barbeiro, estas se multiplicam intensamente por divisão binária no intestino. Em seguida, há a diferenciação em formas tripomastigotas metacíclicas na ampola retal, as quais são liberadas e são capazes de infectar os hospedeiros vertebrados (Figura 1) (Brenner & Andrade, 1979; de Souza et al., 2008). Normalmente, um barbeiro se torna capaz de transmitir formas infectantes 20 dias após o repasto contaminante e pode permanecer assim durante um ano, que é aproximadamente o tempo de vida do inseto. No peri-domicílio o triatomíneo abriga-se nas imperfeições das casas de pau-apique e das construções e justifica a relação direta entre pobreza e o risco de infecção (Miles, 2003). No Brasil, apesar do sucesso no controle do principal vetor (Triatoma infestans), vetores autóctones começam a ter importância epidemiológica, como o T. brasiliensis. Atualmente, o controle e eliminação de populações domésticas de triatomíneos possui duas estratégias de efeito, que são o uso de inseticidas de ação residual e a melhora das habitações. Apesar da redução da transmissão vetorial, no Brasil, novas formas de infecção começam a se tornar epidemiologicamente 6 importantes, como a infecção oral por alimentos contaminados por insetos ou suas excretas e/ou fragmentos contendo o parasito. Considerada esporádica e circunstancial em humanos, tem se tornado frequente na região amazônica e está relacionada à ocorrência de surtos recentes de fase aguda da doença em diversos estados brasileiros, principalmente na Região Norte (Ianni & Mady, 2005). Essa é uma via natural de disseminação do T. cruzi entre os animais no ciclo silvestre, que se alimentam de insetos (Dias, 2006). Outro meio de transmissão relevante da DC é a transmissão congênita (OPAS, 2007). Ocorre principalmente por via transplacentária, tanto na fase aguda quanto na fase crônica da infecção, podendo ocorrer em qualquer período da gestação. Também pode ocorrer no canal do parto, através do contato de mucosas do feto com o sangue da mãe contaminado pelo T. cruzi (Gontijo et al, 2009). Além disso, o transplante de órgãos e a transfusão de sangue também são formas de transmissão da DC, que podem ocorrer quando não há triagem nos bancos de órgão e sangue (Silva, 2010; Moraes-Souza, 2011). Acidentalmente, a transmissão também pode ocorrer pelo contato do parasito com alguma lesão na pele, mucosa oral ou auto-inoculação, principalmente por indivíduos que trabalham em laboratório manipulando o parasito no sangue de animais, fezes de triatomíneos, material de pacientes ou vetores infectados. Diante destas situações, faz-se importante ressaltar a necessidade das medidas de biossegurança (Neves et al., 2005; Cimermam, 2008; Dias, 2011). Novos desafios surgem para as próximas décadas visando à manutenção do controle da DC, tais como: (i) a vigilância epidemiológica (entomológica e sorológica) e dos bancos de sangue, (ii) a busca de métodos de diagnóstico para a fase crônica e de novas drogas tripanossomicidas, (iii) a atenção integral aos pacientes, particularmente às crianças e mulheres em idade fértil, mas também aos pacientes cronicamente infectados (Lannes-Vieira et al., 2010). 7 Figura 1: O ciclo biológico do T. cruzi. O T. cruzi é naturalmente transmitido pelo inseto hemíptero (barbeiro) da família Reduviidae. Durante o repasto sanguíneo, o inseto deposita na pele do hospedeiro vertebrado as fezes contendo a forma infectante do parasito (1). Em seguida, a forma tripomastigota metacíclica alcança o tecido subjacente e a corrente sanguínea do hospedeiro através da picada do inseto, pelo espalhamento até áreas lesionadas ou pelas mucosas. Nos hospedeiros mamíferos, formas tripomastigotas penetram em células locais (2) e se diferenciam em amastigotas; que são formas intracelulares e reprodutivas do parasita (3). Ocorre uma nova diferenciação para forma infectante tripomastigota sanguínea (4) causando o rompimento da célula e liberação dos parasitos na circulação (5). Estes podem invadir novas células, ficar no sangue (6) ou colonizar outros tecidos. Os hemípteros são infectados quando ingerem formas tripomastigotas durante o seu repasto sanguíneo (7). No hospedeiro invertebrado, as formas tripomastigotas ingeridas evoluem para as formas epimastigotas (8), as quais se multiplicam intensamente ao longo do intestino médio do inseto (9) e ao atingirem a ampola retal diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicos (10), que são formas infectantes para o hospedeiro mamífero (Criação Coletiva do LBI/IOC). 2.4 Patogenia da doença de Chagas A DC caracteriza-se por apresentar duas fases clínicas: a fase aguda e a fase crônica. A fase aguda ocorre logo após a infecção, sendo caracterizada pela presença de parasitos circulantes no sangue periférico, resultado da replicação do parasito nos tecidos alvo da infecção. Nos tecidos é possível detectar o parasito sob a forma de ninhos de amastigotas. Nesta fase, nos tecidos alvos da infecção encontram-se intensos infiltrados inflamatórios. Na fase aguda, em grande parte dos indivíduos a doença é 8 assintomática ou a sintomatologia pode passar despercebida. Porém, parte dos pacientes pode apresentar inflamação no tecido cardíaco (miocardite) com alterações elétricas transitórias, e/ou no sistema nervoso central (meningoencefalite), que é grave em indivíduos imunocomprometidos ou crianças (Silva et al., 2010; Sanches et al., 2014). A inflamação tecidual tende a diminuir após a fase aguda da infecção (Andrade, 2000; Rassi Jr et al., 2010; Silva et al., 2010). Passada esta fase (com duração de 1-3 meses), a doença entra na fase crônica, caracterizada por níveis sub-patentes de parasitos no sangue e raros ninhos de formas amastigotas nos tecidos, sendo antígenos e material genético do parasito detectados no tecido cardíaco e sangue por técnicas de imunoistoquímica ou biologia molecular, respectivamente (Reis et al., 1993; Jones et al.,1993; Moreira et al., 2013). A fase crônica apresenta as seguintes formas: indeterminada, cardíaca, digestiva e cardio/digestiva (ou mista) (Rassi et al., 2012). A forma indeterminada é a forma da DC mais frequente em estudos populacionais em zonas endêmicas (Dias, 2007). Após quatro a dez semanas de infecção, inicia-se a forma indeterminada da fase crônica, caracterizada pela positividade sorológica e/ou parasitológica, ausência de manifestações clínicas, eletrocardiográficas ou radiológicas próprias da doença (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, 2005). Enquanto alguns pacientes permanecem nessa forma indefinidamente, outros, geralmente após intervalo de 20 a 30 anos, evoluem para alguma das formas crônicas determinadas da doença, com surgimento de evidências de comprometimento cardíaco e/ou digestivo (Rassi et al., 2012). A forma cardíaca é caracterizada pela presença de infiltrados inflamatórios, lesão nas fibras cardíacas e consequente remodelamento do tecido e fibrose, associados à disfunção cardíaca crônica. Com o progresso da lesão tecidual ocorrem alterações cardíacas, como a perda do tônus muscular, arritmias, dilatação do coração, aneurisma apical, diminuição da fração de ejeção e IC (Laranja et al., 1953; Higuchi et al., 2003; Rassi et al., 2012). Já a forma digestiva é caracterizada por alterações na secreção gástrica, motilidade, absorção e, nos casos mais graves, pelo aumento do tubo digestório em consequência de alterações nos plexos nervosos, principalmente no plexo mioentérico, sendo o megaesôfago e o megacólon as formas mais comuns (Andrade et al., 1983; Brener & Krettli, 1990; Meneghelli, 2004). 9 2.5 Cardiomiopatia chagásica crônica A CCC é essencialmente uma miocardiopatia dilatada em que inflamação crônica persistente provoca destruição tecidual progressiva e fibrose extensa no coração (Marin-Neto et al., 2007). A destruição das fibras miocárdicas pelo processo inflamatório e a sua substituição por tecido fibroso atinge um limite crítico, fazendo com que os ventrículos se remodelem frente à perda gradativa dos elementos contráteis. Inicialmente, no remodelamento ventricular ocorre hipertrofia das fibras íntegras e, posteriormente, dilatação da cavidade ventricular. Essa hipertrofia extrínseca restaura temporariamente o volume sistólico já comprometido, mas a dinâmica do processo leva à dilatação cardíaca crescente, com perda progressiva da capacidade de ejeção ventricular em virtude da evolução da miocardite e da sobrecarga mecânica. Nos estágios mais avançados, além do componente sistólico, também se intensifica um componente de restrição diastólica, devido à grande dilatação e enrijecimento cardíacos pela fibrose (Acquatella et al., 2007). Contribuem ainda para o agravamento da cardiopatia, as arritmias ventriculares complexas, o tromboembolismo pulmonar repetido e a insuficiência das válvulas mitral e tricúspide (Dias & Coura, 1997; MarinNeto et al., 2007). Com base em evidências de ordem experimental e clínica firmadas recentemente, existe um consenso de que a essência da patogenia da CCC resida em uma inflamação diretamente dependente da persistência parasitária e que esta, por sua vez, desempenhe um papel no desenvolvimento e progressão da CCC (Higuchi et al., 2003; Zacks, 2005; Biolo, 2010). As células T são o tipo predominante de células em lesões inflamatórias na CCC (Reis et al., 1993). Além disso, citocinas reguladoras e próinflamatórias, como as IL-10, IL-4, IL-6, IFNγ, TNF e o fator de transformação do crescimento beta (TGF-β), têm sido encontradas no sangue periférico de pacientes crônicos com a forma indeterminada e com a forma cardíaca da DC (Vitelli-Avelar et al., 2008; Perez et al., 2011). Outro ponto importante é que a progressão da gravidade da CCC está associada ao aumento no dano oxidativo particularmente às proteínas, lipídios cardíacos e às mitocôndrias (Wen, 2004; Oliveira, 2007). Vários estudos têm sugerido que alterações na atividade da cadeia respiratória mitocondrial, principalmente complexo I (NADH-ubiquitonaoxiredutase) e III (ubiquinol-citocromo c redutase), estejam relacionadas com a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies 10 reativas de nitrogênio (RNS) no coração de portadores da DC, contribuindo para o dano oxidativo (Wen, 2004; Oliveira, 2007). Desta forma, é de suma importância entender os mecanismos moleculares que controlam a geração e progressão da CCC, para que assim possamos desenhar estratégias de intervenção racional que levem ao controle do parasitismo, de forma dissociada da inflamação potencialmente envolvida na geração de fibrose e disfunção cardíaca (Lannes-Vieira 2003; Marino et al. 2004). 2.6 Resposta imunológica na infecção pelo T. cruzi 2.6.1 Aspectos gerais Na infecção pelo T. cruzi há mobilização de diversos mecanismos efetores do sistema imune, havendo a ativação de células e moléculas relacionados à imunidade inata e à imunidade adquirida ao longo das fases da doença. Consequentemente, o parasito passa a ser continuamente alvo do sistema imune e tem sua multiplicação reduzida nos tecidos do hospedeiro. No entanto, a persistência deste parasito leva à atividade prolongada do sistema imune, podendo culminar no aparecimento de lesões teciduais e, eventualmente, em alterações funcionais musculares e nervosas características da DC (Rassi et al., 2010; Marin-Neto et al., 2007). As células e mecanismos efetores do sistema imune seriam então responsáveis, tanto pelo controle da multiplicação do parasito nos tecidos como pelas lesões locais resultantes da atividade anti-parasitária. 2.6.2 Imunidade inata e adaptativa Diversos mecanismos efetores humorais e celulares estão envolvidos na resposta imune do hospedeiro frente à infecção pelo T. cruzi (Junqueira et al., 2010). O reconhecimento imune inato depende de um número ilimitado de receptores. Esses receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) estão envolvidos na identificação de padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs) (Abbas & Lichtman, 2002). Dentre os diversos PRRs, proteínas transmembrana denominadas de receptores do tipo Toll (TLR) são os mais bem estudados. Membros dessa família reconhecem componentes essenciais dos mais variados microorganismos (Tarleton, 2007). Diferentes grupos identificaram moléculas no T. cruzi que atuam como agonistas dos 11 receptores TLR, induzindo a produção de NO e a secreção de citocinas e quimiocinas em células de linhagem monocítica (revisado em Rodrigues et al., 2012). Dentre essas moléculas destacam-se as âncoras de glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), as GPI ligadas covalentemente às glicoproteínas semelhantes a mucinas, as GPI-mucinas, e a enzima trans-sialidase (TS) (Gazzinelli & Denkers, 2006; Tarleton, 2007). A ativação dos TLR utiliza principalmente a via de transdução de sinal que consiste no recrutamento de várias proteínas intracelulares (MyD88, IRAK e TRAF-6) que vão desencadear as vias Jun-N-terminal quinase (JNK), e quinases que regulam sinal extracelular (ERK) da cascata MAP quinase (MAPK), envolvidas na ativação dos fatores de transcrição AP-1 (proteína ativadora 1) e NF-κB (fator nuclear κB), favorecendo a expressão de genes envolvidos na resposta inflamatória (Abbas & Lichtman, 2002; Kawai & Akira, 2011). O NF-κB é um fator de transcrição, ativado em resposta a sinais incluindo o CD3 associado ao receptor de antígenos de células T (TCR), essencial na síntese de citocinas (Abbas & Lichtman, 2002; Kawai & Akira, 2011). O fator de transcrição NF-κB é importante na transcrição de muitos genes em vários tipos de células, particularmente nas células do sistema imune (Abbas & Lichtman, 2002; Kawai & Akira, 2011). A ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs) via os TLRs 2, 4 e 6 leva à indução de genes de citocinas pró-inflamatórias tais como o TNF, o IFNγ e a IL-12 (Campos & Gazzinelli, 2004). A imunidade inata apresenta componentes clássicos, como as células dendríticas, macrófagos e células natural killer (NK), que têm um papel crucial na imunidade parasitária e principalmente anti-T. cruzi (Junqueira et al., 2010). As células NK são de grande importância na imunidade inata contra o T. cruzi, limitando o crescimento parasitário e promovendo o desenvolvimento da imunidade adquirida (Scott & Trinchieri, 1995). Além disso, a invasão de macrófagos leva à secreção de IL-12, que ativa as células NK a produzirem IFNγ (Aliberti et al., 1996), que atua reciprocamente sobre macrófagos ativando-os para a atividade microbicida (Gazzineli et al., 1992). A citocina pró-inflamatória TNF, produzida por macrófagos durante a infecção pelo T. cruzi, participa dessa interação de forma sinérgica tanto com IL-12 como com IFNγ (Muñoz-Fernandez et al., 1992). Os macrófagos ativados produzem altos níveis de citocinas pró-inflamatórias e produtos microbicidas, como: peróxido de hidrogênio (H2O2), peroxinitrito (ONOO-) e NO. Contudo, apesar de extensas investigações experimentais, o mecanismo usado pelo 12 macrófago ativado para eliminar o T. cruzi ainda não é totalmente entendido (Fabrino et al., 2011). A produção de grandes quantidades de NO, através da NO sintase induzível (iNOS) pelos macrófagos, é proposta como uma das principais vias para a morte do parasito (Silva et al., 2003; Fabrino et al., 2010). Entretanto, tem sido demonstrado que nem a produção de NO nem iNOS (Cummings & Tarleton, 2004; Marinho et al., 2007) são essenciais para o controle in vivo do T. cruzi em camundongos. Ao analisar os infiltrados inflamatórios do tecido cardíaco de pacientes da DC, é possível observar grande quantidade de células T CD4+ e T CD8+, com predomínio das células CD8+ (relação aproximada de 2:1 - CD8+:CD4+) (Higuchi et al., 1993). Nas diferentes formas da fase crônica, indeterminada, cardíaca e digestiva foi observado que o maior percentual de células T CD8+ estava associado às formas mais graves da DC (Vitelli-Avelar et al., 2005). O predomínio destas células no tecido cardíaco é proposto estar relacionado à expressão de moléculas de adesão celular (CAMs) (Dos Santos et al., 2001, Lannes-Vieira 2003). Estas são glicoproteínas expressas na superfície celular, importantes no processo de migração, sendo responsáveis pela adesão firme de linfócitos circulantes no sangue periférico com células do endotélio. No endotélio vascular adjacente ao tecido em situação de infecção ou injúria, alguns mediadores induzem a expressão de CAMs, assim o tecido torna-se permissivo à interação com células inflamatórias (Sigmoundsdottir & Butcher, 2008). Michailowsky e colaboradores (2004) demonstraram a importância da molécula de adesão intercelular do tipo 1 (ICAM-1) na formação da miocardite chagásica. Camundongos geneticamente deficientes em ICAM-1 (icam1-/-) foram altamente susceptíveis à infecção pelo T. cruzi. Neste modelo, o elevado parasitismo estava associado à diminuição do número de células T inflamatórias (CD4+ e CD8+) no tecido cardíaco, suportando que ICAM-1 desempenha um papel crucial no recrutamento de linfócitos T para o tecido cardíaco, estando pelo menos parte das células que migram na dependência de ICAM-1 envolvidas no controle do parasito e na susceptibilidade do hospedeiro durante a infecção pelo T. cruzi. Em relação aos receptores de quimiocinas, as células T (CD4+ e CD8+) e monócitos do sangue periférico de pacientes de DC apresentam frequência aumentada de CCR5 (Gomes et al., 2005). De modo interessante, as células inflamatórias presentes no tecido cardíaco, bem como nas células T CD8+ do sangue periférico de camundongos infectados pelo T. cruzi, expressam maior frequência de CCR5 (Marino et al., 2004; 13 Machado et al., 2005; Medeiros et al., 2009). O tratamento com Met-RANTES ("regulated on activation normal T cell expressed and secreted"), antagonista parcial que se liga aos receptores CCR1 e CCR5 em camundongos (Proudfoot et al.,1999), controla a formação da miocardite, diminuindo o recrutamento de células T CD4+ e CD8+, sem alterar o parasitismo cardíaco, resultando no aumento da sobrevida dos animais. Assim, o tratamento com Met-RANTES demonstrou que o influxo massivo de células inflamatórias, em especial as CCR5+, para o tecido cardíaco não é crucial para a resposta anti-T. cruzi (Marino et al., 2004; Medeiros et al., 2009). Vários trabalhos têm mostrado o papel não somente das células T CD8+, que serão melhor exploradas a diante, mas também das células T CD4+ e das células B, no aumento da sobrevida, assim como no controle do parasitismo durante a infecção chagásica (Tarleton, 1990; Kumar & Tarleton, 1998; Padilla et al., 2009). Alguns trabalhos sugerem que linfócitos T-CD4+ constituam as principais populações celulares envolvidas no perfil regulador em pacientes com forma indeterminada da DC. Além disso, verificou-se que monócitos e linfócitos T CD4+ também determinam o perfil inflamatório em indivíduos com cardiomiopatia, uma vez que apresentaram maior frequência de TNF (Vitelli-Avelar et al., 2008). Uma subpopulação de células T (CD4+CD25+FoxP3+) com capacidade reguladora (Treg) tem sido descrita como uma classe de células que regula a resposta imune, tendo a capacidade de controlar resposta imune excessiva a patógenos ou a antígenos próprios (Sakaguchi et al., 2010). Dados da literatura já mostraram que pacientes com a forma indeterminada da DC apresentam maior percentual de células CD4+CD25highFoxP3+ produtoras de IL-10, enquanto que pacientes cardiopatas apresentaram maior percentual de células CD4+CD25highFoxP3+ expressando CTLA-4 (antígeno 4 de linfócito T citotóxico). Estes dados sugerem que as células Treg podem ter um papel na resposta imune contra a infecção pelo T. cruzi, embora com efeitos distintos em pacientes com as diferentes formas da doença (Araújo et al., 2007). Um estudo na fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi mostrou que a inativação das células CD4+ CD25+ leva a um pequeno aumento da resistência à infecção pela cepa Colombiana do T. cruzi e que a maior resistência foi associada a uma maior ativação das células CD4+ e à produção de IFNγ (Sales-Junior et al., 2008). Por outro lado, os autores não observaram nenhum papel significativo para estas células na patogenia da CCC experimental. De fato, os caminhos que levam à regulação da resposta imune na infecção pelo T. cruzi não estão totalmente elucidados. Especula-se 14 que a expansão de células Treg possa ser benéfica durante a fase crônica da doença por limitar o dano tecidual, suprimindo a atividade das células T efetoras, mantendo o indivíduo na forma indeterminada da DC, entretanto os mecanismos pelos quais isso acontece necessitam ser esclarecidos (Martins et al., 2004). O CTLA-4 é um receptor co-estimulátório negativo que se liga ao CD80 e CD86 (Salomon & Bluestone, 2001). O bloqueio de CTLA-4 com anticorpos aumentou a produção de IFNγ e NO por esplenócitos e aumentou a resistência à infecção pelo T. cruzi (Martins et al., 2004). Por outro lado, a co-estimulação com CTLA-4 reduz a resposta imune do hospedeiro a infecções, uma vez que CTLA-4 pode reduzir a ativação de células T (Salomon & Bluestone, 2001). Nas populações de linfócitos T clássicos (CD4+ e CD8+) provenientes de pacientes com cardiomiopatia dilatada observou-se uma expressão elevada de CTLA-4 intracelular, enquanto que a expressão de superfície dessa molécula foi baixa (Souza et al., 2007). Esses autores sugeriram que pacientes com CCC apresentam uma deficiência na expressão membranar dessa molécula. Nesse mesmo trabalho foi observado um aumento da expressão de CTLA-4 nos pacientes com a forma indeterminada, especialmente nos linfócitos T CD8+. Anticorpos anti-CTLA-4 já foram propostos para o tratamento de cânceres (Kwek et al., 2012). Recentemente, foi mostrado que o bloqueio de CTLA-4 durante a vacinação terapêutica com uma cepa atenuada do T. cruzi (CL) expressando NY-ESO-1 (antígeno expresso em uma variedade de tumores como melanomas, câncer de pulmão e próstata - neste caso o T. cruzi serviria como um vetor vacinal) em um modelo experimental de melanoma (células B16-NY-ESO-1 injetadas via subcutânea) aumentou a frequência de células T CD8+ específicas produtoras de IFNγ e promoveu a migração de linfócitos efetores para o tumor controlando o seu crescimento, propondo esta estratégia para estimular a resposta imune específica (dos Santos et al., 2014). Em suma, a resposta imune tem sido alvo de diversos estudos na infecção pelo T. cruzi. É proposto que a resistência à infecção esteja relacionada a uma resposta aguda pró-inflamatória que contém os parasitos. Entretanto, com a persistência do parasito, há manutenção dessa robusta atividade pró-inflamatória, que está associada à evolução para a forma crônica grave da DC (Dutra et al., 2009; Perez et al., 2011). Neste sentido, faz-se necessário o entendimento da relação controle do parasito/inflamação a fim de identificar alvos terapêuticos para a interferência neste sistema e possível melhora no quadro clínico. 15 2.6.3 Células T CD8 Visto que o T. cruzi é um parasito intracelular, a resposta mediada por células, principalmente relacionada à ativação dos linfócitos T CD8+ é um evento fundamental no combate à infecção. Os primeiros dados que apontaram para a participação dos linfócitos T CD8+ na imunoproteção contra o T. cruzi foram observados em camundongos desprovidos de linfócitos T (por timectomia neonatal, por inativação por anticorpos anti-CD4 ou anti-CD8 ou geneticamente modificados). Estes dados mostram que ambas as populações, CD4+ e CD8+, são essenciais para o controle da parasitemia e sobrevivência do hospedeiro nas fases aguda e crônica da infecção (Rottenberg et al., 1993; Tarleton et al., 1994; Cotta-de-Almeida et al., 1997). Ainda, a ausência de células T CD8+ em camundongos mutantes para o gene da β2-microglobulina resultou no aumento da susceptibilidade à infecção (Tarleton et al., 1992), sugerindo que estas células possuem papel central no controle da resposta imune da DC. Devido à habilidade dos linfócitos T CD8+ secretar diversas citocinas e atuar diretamente em células-alvo infectadas (Harty & Badovinac, 2002), estas células têm sido relacionadas tanto à resistência ao parasito quanto com a patogenicidade da DC (Lannes-Viera, 2003). A demonstração de que células CD8+ predominam em sítios inflamatórios no coração de portadores da DC (Higuchi et al., 1993; Reis et al., 1993) sugere a participação dessas células na lesão cardíaca da fase crônica. Em termos efetores, os linfócitos T CD8+ podem conter a infecção por inúmeros mecanismos, incluindo a secreção de citocinas, o que induz a produção de atividades microbicidas na célula hospedeira, e também por atividades citotóxicas por meio da secreção de Pfn e granzimas, assim como a ativação da via Fas/FasL (CD95/CD95L) (Martin & Tarleton, 2004). Embora os mecanismos de indução de morte pela liberação de grânulos citotóxicos sejam bastante estudados, ainda não existe um modelo definido de como a combinação Pfn/granzima age nas células. A maior parte dos trabalhos mostra que é a Pfn que “entrega” as granzimas para célula alvo, mas como isto ocorre é ainda um grande debate na literatura. Trapani & Smyth (2002) revisaram diferentes modelos propostos no mecanismo de morte por células com atividade citotóxica. A hipótese inicial é de que a Pfn polimeriza formando um poro na membrana plasmática da célula alvo por onde passam as granzimas. No entanto, os autores ressaltam o fato de que os poros formados (15nm) podem ser pequenos demais para a passagem de moléculas 16 grandes como as granzimas. O paradigma foi questionado quando foram publicados trabalhos mostrando que a Granzima B pode ser endocitada mesmo na ausência de perforina (Froelich et al., 1996; Shi et al., 1997). A partir destes dados, Froelich e colaboradores (1996) sugeriram que a Pfn age na membrana do endossoma e contribui para a liberação da granzima dentro da célula. Pipkin e Lieberman (2007), por outro lado, propuseram um modelo híbrido, no qual a Pfn forma poros na membrana que leva ao influxo de Ca+. Este efeito, por sua vez, induz reparo na membrana celular que termina por englobar as granzimas, que são reconhecidas pelo receptor manose-6fosfato da célula-alvo. Os autores sugerem também que a liberação da granzima deste endossoma é mediada por Pfn, mas como isto acontece ainda não está elucidado. Juntas, Pfn e granzimas, terminam por induzir morte celular dependente de caspase na célulaalvo, mas também foram mostradas levar à morte na ausência de caspases ativas (revisto em Trapani & Smyth, 2002). Sugere-se que a maior contribuição das células T CD8+ para o combate à infecção seja a produção de IFNγ, surpreendentemente mais relevante do que a sua atividade citotóxica (Martin & Tarleton, 2004). Como descrito anteriormente, o efeito protetor do IFNγ na infecção pelo T. cruzi está relacionado principalmente à sua capacidade de induzir a produção de IL-12, TNF e, em especial, NO pelos macrófagos. Vários estudos mostram que o IFNγ também é capaz de induzir a produção de NO em células musculares, alvo da infecção pelo T. cruzi (Muñoz-Fernandez et al., 1992; Grazzinelli et al., 1992; Machado et al., 2000; Fichera el al., 2004). A importância do IFNγ no controle da infecção foi estabelecida por experimentos nos quais a neutralização por meio do tratamento in vivo com anticorpos monoclonais (Cardillo et al., 1996) ou a deleção gênica (Martins et al., 1999) do IFNγ aumentou a parasitemia e o parasitismo. Em resumo, populações distintas de células T CD8+ podem coexistir durante o curso da infecção e desempenhar diferentes funções. Dados recentes do nosso grupo mostram que enquanto as células T CD8+ específicas (que reconhecem o peptídeo H2Kb/VNHRFTLV+ ASP2 do T. cruzi) do baço e sangue periférico de camundongos infectados pelo T. cruzi são predominantemente Pfn-IFNγ+, no tecido cardíaco existe um predomínio de células T CD8+Pfn+IFNγ-. Estas células apresentam um comportamento migratório diferencial, favorecendo o acúmulo das células Pfn+ no tecido cardíaco, reforçando sua participação na lesão cardíaca (Silverio et al., 2012). A 17 participação das células T CD8+ na infecção pelo T. cruzi não está totalmente elucidada, sendo necessários maiores estudos tendo como alvo esta população celular tanto em modelos murinos como em pacientes, acreditando que, assim, novas estratégias terapêuticas sejam propostas com o objetivo de melhorar a qualidade da resposta de linfócitos T CD8+ antígeno específicas e com isso prevenir as alterações cardíacas. 2.6.4 Citocinas A ativação do sistema imune é importante no controle da carga parasitária, por outro lado, pode levar ao dano tecidual e contribuir para o aparecimento das manifestações crônicas graves observadas em alguns portadores da DC (Bahia-Oliveira et al., 1998; Gomes et al., 2003). Dentre os vários fatores imunológicos que têm sido demonstrados como importantes para o desenvolvimento da forma grave da DC, destacamos a ativação dos leucócitos e consequente produção e secreção de citocinas. As citocinas são moléculas solúveis, produzidas e secretadas como produtos celulares em resposta a patógenos e outros estímulos. Elas medeiam e regulam a resposta imune por meio de ligações a receptores específicos e podem atuar de forma autócrina, parácrina ou sistêmica (Abbas & Lichtman, 2002). Estas moléculas estão envolvidas, tanto na resistência quanto nos mecanismos relacionados à patologia da DC (Silva et al., 1992; Abrahamsohn & Coffman, 1995; Samudio et al., 1998) e também à gravidade de outras cardiopatias (Oikonomou et al., 2011). Dentre as diversas citocinas estudadas na infecção pelo T. cruzi, o IFNγ tem sido associado tanto em modelos experimentais (Silva et al., 1992; Samudio et al., 1998) quanto em humanos com a resistência do hospedeiro à infecção (Bahia-Oliveira et al., 1998, 2000). O IFNγ pode desempenhar papel protetor no desenvolvimento da patologia chagásica e, em conjunto com uma quimioterapia específica, o IFNγ pode levar à eliminação do parasito em pacientes na fase aguda da infecção (Bahia-Oliveira et al., 1998). De forma interessante, a frequência de células T CD8+ produtoras de IFNγ específicas para T. cruzi foi inversamente correlacionada com a gravidade da DC (Albareda et al., 2006). Por outro lado, Gomes e colaboradores (2003) demonstraram que pacientes com a forma grave da CCC apresentam intensa resposta imune contra o parasito, com altas frequências de células CD4+ expressando IFNγ e baixas frequências de células CD4+ expressando IL-10, quando comparados com portadores da forma indeterminada da doença. Estes dados sugerem que altos níveis de IFNγ podem estar 18 associados à patologia da forma cardíaca grave (Gomes et al., 2003). Mais tarde, Guedes e colaboradores (2009), utilizando modelo canino de infecção pelo T. cruzi, mostraram que a alta produção de IFNγ e TNF e a baixa produção de IL-10 na fase aguda estão associadas à CCC. Anos mais tarde, camundongos com diferentes susceptibilidades à infecção pela cepa Colombiana do T. cruzi, C3H/HeSnJ (100% de mortalidade, parasitismo descontrolado) e C57BL/6J (<10% de mortalidade, parasitismo controlado), foram sistematicamente comparados e exibiram diferentes frequências de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IL-10+ e IFNγ+IL-10+ no tecido cardíaco. Estes dados sugeriram que a IL-10 proveniente de linfócitos T duplo produtores (IFNγ/IL-10) ou simples produtores (IL-10) poderia impedir a intensa resposta inflamatória e parasitemia observada nos camundongos C3H/HeSnJ infectados pelo T. cruzi (Roffê et al., 2012). O TNF foi mostrado apresentar papel protetor no controle dos parasitos e na sobrevivência dos camundongos na fase aguda da infecção pelo T. cruzi (Lima et al., 1997), por outro lado apresentou efeitos deletérios na resposta do hospedeiro na fase crônica (Perez-Fuentes et al., 2003). Sua participação na patogenia da CCC ainda não está completamente elucidada (Lannes-Vieira et al., 2011). Em associação com o IFNγ, TNF induz atividade microbicida em macrófagos (Gazzineli et al., 1992). Contudo, níveis plasmáticos de TNF estão correlacionados ao grau de disfunção cardíaca em portadores da CCC (Ferreira et al., 2003; Talvani et al., 2004). Assim, especula-se que inicialmente TNF teria função protetora na infecção pelo T. cruzi, porém seus elevados níveis nos soros dos pacientes permitiriam a perpetuação do infiltrado inflamatório e o exacerbado processo oxidativo, contribuindo para a CCC (Perez-Fuentes et al., 2003; Lannes-Vieira et al., 2011). Citocinas como IL-4, IL-10 e TGF-β exibem importante papel regulador na infecção pelo T. cruzi, inibindo in vitro a produção de NO e a atividade tripanossomicida de macrófagos infectados e ativados por TNF e IFNγ (Gazzineli et al., 1992; Roffê et al., 2012). A presença de células IL-4+ no tecido cardíaco foi relacionada à presença de pseudocistos do T. cruzi em pacientes com CCC grave (Higuchi et al.,1997, Reis et al.,1997), sugerindo que a IL-4 participe da disseminação do parasito. Em suporte a esta ideia, animais deficientes em IL-4 exibiram redução de parasitismo e mortalidade na fase aguda da infecção (Michailowisky et al., 2001). Sendo IL-4 um importante fator fibrinogênico (Huaux et al., 2003) e estando a fibrose associada à 19 disfunção cardíaca na infecção pelo T. cruzi (Higuchi et al., 2003, Marino et al., 2003), poderíamos pensar que IL-4 contribui para a fibrose na infecção chagásica. Contudo, a ausência de IL-4 foi associada à pronunciada inflamação e fibrose na infecção crônica (Soares et al., 2001), sugerindo que outros fatores contribuam para a fibrose na infecção chagásica, podendo ser TGF-β um destes fatores (Waghabi et al., 2002). TGF-β é a principal citocina associada a fibrose. Tanto o TGF-β quanto a citocina anti-inflamatória ou reguladora IL-10 modulam de forma seletiva a expressão de quimiocinas induzidas pela infecção pelo T. cruzi (Aliberti et al., 2001), levando ao questionamento se IL-10 e TGF- β participariam também do controle do influxo de células para o tecido cardíaco. De fato, o uso de um inibidor da via de sinalização do TGF-β (SB431542) mostrou que camundongos infectados com a cepa Y do T. cruzi quando tratados na fase aguda da infecção apresentaram maior sobrevivência, menor parasitemia e menos lesão cardíaca (analisada sob a forma de ECG e biomarcadores enzimáticos) (Waghabi et al., 2009). Anos mais tarde, estes dados foram reforçados como uso de um outro inibidor da via de sinalização do TGF-β (GW788388) que, no mesmo modelo experimental (camundongos Swiss infectados com a cepa Y do T. cruzi), mostrou ser eficiente em aumentar a sobrevivência dos camundongos infectados, reduzir a parasitemia, e, no tecido cardíaco, diminuir a fibrose e aumentar a expressão das placas de conexina-43 (Cx43) (Oliveira et al., 2012). Estes dados sugerem que a modulação de citocinas do perfil regulador também pode ser alvo terapêutico da DC. A IL-17 é conhecida como uma citocina pró-inflamatória produzida principalmente por células T CD4+ (Weaver et al., 2006), tem papel chave na resposta inflamatória em infecções bacterianas e fúngicas, sendo importante na proteção do hospedeiro contra a infecção pelo T. cruzi na fase aguda (Miyazaki et al., 2010). Células mononucleares isoladas do sangue periférico de pacientes com diferentes graus de CCC revelaram que pacientes sem CCC/com CCC leve apresentam alta frequência de células CD3+CD4+IL-17+, quando comparados com os pacientes com CCC moderada e grave (Guedes et al., 2012). Recentemente, a alta expressão de IL-17 foi associada a melhor função cardíaca (dado pelo aumento na fração de ejeção do ventrículo esquerdo FEVE) em portadores da CCC (Magalhães et al., 2013), sugerindo que IL- 17 pode ser um fator de proteção para lesão no miocárdio. Em outro estudo, a IL-17 se mostrou aumentada em pacientes com a forma cardíaca da DC (Pérez et al., 2011), revelando que os dados da literatura são controversos e que a IL-17 precisa ser melhor estudada na 20 infecção pelo T. cruzi. Outro aspecto importante na imunopatogenia da CCC diz respeito à participação da IL-1β. Postula-se, a partir de estudos em modelos experimentais, que essa citocina seja um mediador primário da hipertrofia de cardiomiócitos induzida na infecção pelo T. cruzi (Petersen et al., 2005), tendo papel primordial na CCC. Com base nos aspectos imunológicos, a fase crônica da infecção pelo T. cruzi pode ser caracterizada pelo (des)balanço entre o acúmulo de eficiente resposta imune (inata e adaptativa) e a presença de poucos parasitos no tecido do hospedeiro (Dos Reis et al., 1993; Higuchi et al., 1993; Jones et al., 1993), que mantém o sistema constantemente ativado, favorecendo o aparecimento das manifestações clínicas graves da doença na fase crônica (Figura 2) (Dutra et al., 2009). Portanto, interferir racionalmente nesse circuito pode ser a chave para um bom prognóstico da doença. 2.7 TNF e sua sinalização O TNF é sintetizado por diversos tipos celulares, tais como macrófagos, células dendríticas, linfócitos T e cardiomiócitos, como uma proteína homotrimérica transmembranar de 26 kDa (Tracey et al., 2008), sendo um importante regulador da imunidade e inflamação, bem como da diferenciação e da morte celular (Clark, 2007). TNF é sintetizado em resposta à inflamação, infecção ou injúria e subsequentemente clivado por uma metaloproteinase, a TNF- convertase (TACE) que libera o peptídeo solúvel de 17 kDa. A citocina TNF é um potente mediador inflamatório e tem sua atividade biológica reconhecida pelas células através dos receptores p55/TNFR1 (CD120a) e p75/TNFR2 (CD120b), ambos estão presentes na maioria dos tipos de células e tecidos e participam de processos biológicos agindo de forma conjunta ou distinta (Brockhaus et al., 1990; Hohmann et al., 1990; Lewis et al., 1991; Tartaglia & Goeddel, 1992; Curtin & Cotter, 2002). Estes receptores apresentam homologia em suas regiões extracelulares, contendo em suas estruturas sequências ricas em cisteína que formam os domínios de ligação do TNF, mas diferem em seus domínios intracelulares (Bradley et al., 1995). A afinidade de ambos os receptores para o TNF solúvel é semelhante, porém o TNF de membrana pode interagir preferencialmente com TNFR2 (Waters et al., 2013). Existem ainda os receptores solúveis de TNF (sTNFR), que 21 possuem a mesma estrutura que o receptor de membrana e apresentam função biológica de captar TNF solúvel e posteriormente liberá-lo, e, assim, controlar a sua biodisponibilidade. Os receptores TNFR1 e TNFR2 não são apenas receptores de TNF, mas também de outros membros da superfamília TNF, como a linfotoxina (LTA) (MacEwan, 2002; Ruddle et al., 2014). A B Figura 2: Citocinas e populações celulares envolvidas na geração de proteção e patogenicidade na fase crônica da doença de Chagas. Pouco tempo após a infecção pelo Trypanosoma cruzi a parasitemia é controlada e os pacientes entram na fase crônica da doença. Nesta fase, as respostas imunes diferenciadas podem ser a chave que permite definir o estabelecimento de um quadro mais regulado que controla o parasito (A- forma indeterminada) vs uma resposta desregulada que continua a controlar o parasito mas leva a patologia (B- formas cardíaca e digestiva). A interação inicial entre o parasito e o hospedeiro é fundamental no estabelecimento do controle efetivo da parasitemia e ao mesmo tempo é crítico na formação de citocinas, que vão orquestrar a ativação e diferenciação de populações de células T reguladoras e efetoras. Dependendo do equilíbrio entre as subpopulações de células T biologicamente ativas a resposta global será bem sucedida em manter a forma clínica indeterminada ou progredir para as formas mais graves (cardíacas ou digestivas). As células T estão presentes em todas as formas clínicas produzindo citocinas inflamatórias e reguladoras, no entanto estudos recentes demonstraram diferenças entre as formas clínicas em termos de produção relativa de citocinas inflamatórias (TNF e IFNγ) e expressão de moléculas reguladoras (IL-10 e CTLA-4). Além disso, vários outros fatores influenciam na progressão diferencial dos indivíduos nas formas clínicas da doença de Chagas, incluindo a cepa do parasito, a carga inoculada, fatores ambientais tais como experiências imunológicas anteriores, nutrição e genética do hospedeiro. Modificado de Dutra et al., 2009. 22 O TNF induz proliferação, diferenciação celular e inflamação através da ativação de proteínas quinases e fosfatases, tendo como vias sinalizadoras conhecidas a JNK/AP1, P38MAPK e NF-κB, sendo a última preferencialmente envolvida com ativação de respostas inflamatórias (MacEwan et al., 2002). Na ausência do ligante, o domínio citoplasmático de TNFR1 está associado com uma proteína silenciadora do domínio de morte (SODD) (Figura 3). A ligação do TNF ao receptor promove mudanças conformacionais neste, que induzem a dissociação da SODD e, por conseguinte, a exposição dos domínios de morte, que podem recrutar as moléculas TRADD (proteína do domínio de morte associada ao receptor de TNF), sua principal via de sinalização (Ihnatko et al., 2007). A TRADD inicia a sinalização associando-se a RIP-1 (proteína de interação com receptor quinase 1) e a TRAF-2 (fator associado ao receptor de TNF-2), formando o complexo I que se destaca do TNFR1 após a internalização do receptor (Bradley, 2008). Antes de separar-se do receptor, esta estrutura mobiliza a via de NF-κB, através da ativação de IKK (IκB quinase), um complexo formado por duas subunidades, uma catalítica (IKK-α) e uma reguladora (IKK-β), que leva à fosforilação de IκB-α, que pode servir de sinal para a posterior ubiquitinação e degradação desta proteína. Este evento libera o NF-κB, anteriormente retido no citoplasma pela associação com IκB-α, o que permite sua translocação para o núcleo, onde poderá regular a transcrição de diversos genes (Figura 3). Em paralelo com a sua atuação em NF-kB, o TNFR1 pode ativar outras proteínas como MAP3Ks, iniciando cascatas de sinalização que conduzem à ativação de JNK e p38 MAP quinase que, por sua vez, influenciam decisões de morte ou sobrevivência celular (Figura 3) (Kassardjian & Kreydiyyeh, 2008). O TNFR2 não possui domínio de morte em sua porção citoplasmática e por isso, assim que é ativado, recruta TRAF-2, que se associa à TRAF-1, formando um complexo heterodimérico capaz de ativar a via de NF-κB (Figura 3) (Bradley, 2008). As moléculas c-IAP-1 e c-IAP-2 (proteínas inibidoras da apoptose) juntam-se a esse complexo após a indução de sua transcrição por NF-κB e atuam bloqueando a atividade da caspase-8 e inibindo a apoptose celular (Ihnatko & Kubes, 2007). O TNFR2 pode sinalizar independentemente de TRAF, ativando uma proteína tirosina quinase citosólica pertencente à família tirosina quinase de Bruton (Btk) (Pan et al., 2002), conhecida em seres humanos como tirosina quinase epitelial/endotelial (ETK). Etk é um novo regulador de junções celulares epiteliais e medeia a indução da via 23 fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K) - proteína quinase B (Akt) por TNFR2 (Figura 3). A sinalização mediada por TNFR2 também ativa vias pró-apoptóticas através da cooperação com TNFR1 pelo fenômeno de “passagem de ligante”, no qual a ativação inicial de TNFR2 leva à depleção de TRAF-2 do citoplasma, indisponibilizando esta molécula para a montagem do complexo I do TNFR1 e, assim, comprometendo a posterior indução das vias de NF-κB e JNK por esse receptor (Wicovsky et al., 2009). Esta interação entre os receptores de TNF parece afetar não apenas TNFR1 e TNFR2 uma vez que a ativação da apoptose por FasL em macrófagos foi inibida pela deleção dos receptores de TNF (Takada et al., 2007). Quando TNFR1 e TNFR2 são ativados simultaneamente, TNFR2 induz a degradação de TRAF2, evitando assim a ligação de cIAP1 e cIAP2 para TNFR1, portanto, aumentando a capacidade pró-apoptótica deste receptor. Este fenômeno pode ser encarado como uma situação em que o equilíbrio quantitativo entre os sinais pró- e anti-apoptóticos desencadeados pelo TNF irão determinar se o resultado final será morte ou sobrevivência celular. Neste sentido, fazem-se necessários novos estudos relacionados à degradação de TRAF2, o seu papel na ativação do NF-kB e no desencadeamento de vias de morte celular (Cabal-Hierro & Lazo 2012). A sinalização via TNF atua de diversas formas na regulação da liberação de citocinas e quimiocinas que são responsáveis por mediar grande parte dos fenômenos imunológicos (MacEwan et al., 2002). Desta forma, o TNF apresenta sinalização complexa, com ampla variedade de funções celulares dentro do organismo. 2.7.1 TNF nas cardiopatias Inicialmente, pensava-se que a produção de TNF era exclusivamente realizada por monócitos e macrófagos quando adequadamente estimulados (Beyaer et al., 1999). Entretanto, os cardiomiócitos expressam tanto o TNF quanto seus receptores (TorreAmione et al., 1995) e a expressão gênica e proteica de TNF já foi mostrada na fibra muscular esquelética humana (Saghizadeh et al.,1996). Estes dados indicam que a mesma pode produzir TNF e esta citocina pode atuar de maneira autócrina e parácrina, em quantidade suficiente para mediar uma série de alterações morfológicas e funcionais no tecido (Larsen et al., 2002; Spate et al., 2004). 24 A B Figura 3: Vias de sinalização de TNF. TNF sinaliza através dos receptores TNFR1 e TNFR2 para ativar vias de sinalização distintas e que se sobrepõem mediando os diversos efeitos celulares desta citocina. (A) Após TNF se ligar a seu receptor TNFR1 ocorre a formação do complexo I contendo importantes proteínas adaptadoras TRADD, TRAF2, RIP e FADD. Estas proteínas recrutarão enzimas (por exemplo, caspase-8, MAP3K e IKK), que estimulam a apoptose e a ativação de AP-1 e NF -κB. (B) TNFR2 não possui domínio de morte intracelular, a ligação do TNF provoca trimerização do TNFR2, permitindo a sua interação direta com a TRAF2. TRAF2 interage com TRAF1, TRAF3, cIAP-1 e cIAP -2, resultando na ativação de fatores de transcrição NF-κB ou AP-1, através da ativação do complexo IKK e degradação de IκB, respectivamente, ou a ativação de JNK e MAP3K. TNFR2 pode ativar a enzima tirosina quinase endotelial/epitelial (ETK), independentemente de TRAF2. ETK ativa medeia interação com o receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) através da fosforilação recíproca, resultando na ativação da via angiogénica de fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K)-Akt. Modificado de Waters et al., 2013. Os níveis circulantes de TNF estão elevados em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva (ICC) grave (Levine et al., 1990) e o coração humano não infartado não expressa TNF, enquanto que o coração humano em estágio final de IC expressa grandes quantidades desta proteína (Mann et al., 1996). No entanto, se o TNF tem efeitos deletérios sobre a função do cardiomiócito, esta é uma questão controversa. A administração intravenosa de TNF foi associada com o desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada (Hegewisch et al., 1990). Valores aumentados de TNF e de seus receptores solúveis estão associados ao maior índice de mortalidade em pacientes com 25 ICC (Mann, 2001). Por outro lado, camundongos deficientes em receptores de TNF apresentaram maiores níveis de apoptose quando submetidos ao infarto isquêmico (Kurrelmeyer et al., 2000). Este trabalho concluiu que a sinalização por TNF resulta em sinais citoprotetores, que impedem a apoptose de cardiomiócitos após o infarto isquêmico. De fato, aparentemente o TNF e sua sinalização via ativação de seus receptores tem um papel ambivalente na isquemia miocárdica e proteção contra a mesma. O excesso de expressão de TNF e subsequente ativação do TNFR1 nos cardiomiócitos gera um estímulo que induz disfunção contrátil, hipertrofia, fibrose e morte celular, enquanto que uma menor concentração de TNF e subsequente ativação do TNFR2 nos cardiomiócitos gera um estímulo protetor (Kleinbongard et al., 2011). Tendo em vista este papel aparentemente controverso da sinalização por TNF nas cardiopatias, numerosos ensaios clínicos têm sido realizados para estudar os efeitos da inibição do TNF na ICC (Deswal et al 1999; Bozkurt et al. 2000; Coletta et al. 2002; Anker & Coats, 2002; Chung et al., 2003). Os receptores solúveis sTNFR1 e sTNFR2 também têm uma importante participação nas cardiopatias e já foram mostrados estarem aumentados na cardiopatia isquêmica, havendo uma correlação inversa com a FEVE (Rivera et al., 2006). O sTNFR1 é apresentado, por alguns autores, como marcador de mortalidade superior a FEVE em pacientes com ICC (Herrmann et al., 2012). Além disso, tem sido encontrada relação entre o aumento plasmático e urinário desses receptores solúveis com a classe funcional de ICC de acordo com a classificação da New York Heart Association (NYHA) (Brockhaus et al., 1997; MacEwan et al., 2002; Rivera et al., 2004). Apesar de nos últimos anos a maioria dos estudos sobre IC ter se concentrado nas citocinas pró-inflamatórias, atualmente as citocinas anti-inflamatórias, em especial a IL-10, têm se destacado e podem ter um papel importante na fisiopatologia das cardiopatias (Stumpf et al., 2003; Amir et al., 2010). Em pacientes com IC e, principalmente, nos casos de disfunção ventricular esquerda, uma diminuição na concentração plasmática de IL-10 tem sido relatada e correlacionada positivamente com uma piora na FEVE (Kaur et al., 2006). Além disso, a utilização da relação da produção de IL-10 e TNF (diminuição da razão IL-10/TNF) tem sido relacionada com o grau de disfunção ventricular (Kaur et al., 2006). 26 2.7.2 TNF na infecção pelo T. cruzi A produção de TNF é diretamente induzida pelo T. cruzi e seus antígenos, envolvendo mecanismos dependentes do fator de transcrição NF-κB (Ropert et al., 2002). Neste cenário, outras moléculas do parasito, incluindo as tGPI mucinas e DNA, estimulam a produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, envolvendo a via mediada por TLR2 e dependente de MyD88 (Almeida & Gazzinelli, 2001; Shoda et al., 2001). O TNF atuando via TNFR1 desempenha papel crítico na resistência à infecção aguda, controlando a captura do parasito e a produção de NO e quimiocinas (Aliberti et al., 2001). Altos níveis séricos de TNF estão correlacionados à disfunção cardíaca em pacientes crônicos da DC (Ferreira et al., 2003; Pérez-Fuentes et al., 2003; Talvani et al., 2004). Contudo, estudos de polimorfismo gênico de TNF em pacientes não foram conclusivos, suportando (Rodriguez-Perez et al.,2005) ou não (Beraun et al.,1998) a associação do genótipo TNF-308G/A (alta produção de TNF). Recentemente, Pissetti e colaboradores (2011) estudaram os SNPs -308G/A e -238G/A da região promotora do gene TNF em uma população brasileira do estado de Minas Gerais e não observaram qualquer associação significativa entre esses SNPs e as formas clínicas crônicas da DC. Resultados semelhantes foram encontrados por Drigo e colaboradores (2007) ao avaliarem o papel do SNP -308G/A do gene de TNF entre indivíduos assintomáticos e portadores de CCC (agrupados de acordo com o grau de disfunção do ventrículo esquerdo). Neste caso, os autores não observaram associação entre o polimorfismo e o desenvolvimento de doença cardíaca ou progressão para formas graves da CCC. Por outro lado, Criado e colaboradores (2012) ao analisarem o SNP -308G/A do gene TNF em uma coorte colombiana encontraram uma frequência elevada do alelo A nos portadores de CCC. Este dado foi estatisticamente significativo quando comparado com a frequência do mesmo alelo nos indivíduos assintomáticos. Nesta mesma linha, um estudo brasileiro envolvendo 42 pacientes portadores da DC com fração de ejeção ventricular ≤ 40%, mostrou que os pacientes que expressam o alelo -308G/A têm uma menor sobrevivência quando comparados aos pacientes com outros alelos (Drigo et al., 2006). Este aparente paradoxo reforça a necessidade de maiores estudos envolvendo a participação dos polimorfismos do gene de TNF na patogenia da DC. As concentrações de TNF estão aumentadas no soro de camundongos infectados pelo T. cruzi (Starobinas et al., 1991) e é implicado na perda de peso observada na 27 infecção aguda (Truyens et al.,1995). A administração de TNF a animais infectados pelo T. cruzi aumentou a taxa de mortalidade dos mesmos (Black et al., 1989). De modo interessante, o TNF atua como segundo sinal para a indução da atividade microbicida por macrófagos ativados por IFNγ (Silva et al., 1995; Aliberti et al., 2001). TNF também está envolvido na indução da expressão de iNOS em cardiomiócitos infectados, que desencadeia a produção de NO, proposto desempenhar papel essencial na resposta imune contra o T. cruzi (Machado et al., 2000). Contudo, há questionamentos quanto a participação de NO na infecção pelo T. cruzi, havendo evidências de que a produção excessiva de NO causa alterações patológicas no tecido cardíaco, uma vez que este tecido tem um sistema muito eficiente de controle dos níveis de ROS (Huang et al., 1999; Chandra et al., 2002; Silva et al., 2003). Na fase aguda da infecção pelo T. cruzi, o TNF e a via TNFR1 são importantes para o controle do parasito, mas a sinalização TNF/TNFR1 também está envolvida na lesão miocárdica, controlando a deposição de fibronectina (FN) e a expressão de Cx43, relevantes para a integridade cardíaca (Kroll-Palhares et al., 2008). Além disso, já foi mostrado que a infecção de animais tnfr1-/- pelo T. cruzi leva ao aumento da parasitemia e redução da sobrevivência dos animais, enquanto animais tnfr2-/- apresentam resposta imune semelhante aos animais imunocompetentes infectados (Aliberti, et al., 2001). O TNFR1 está envolvido no desenvolvimento da esplenomegalia induzida pelo T. cruzi (Kroll-Palhares et al., 2008), que tem sido associada à ativação policlonal de células B e T (Minoprio, 2001), especialmente células T CD8+ (dos Santos et al., 2001; Tzelepis et al., 2007), principais componentes da miocardite chagásica (Higuchi et al., 1993; Reis et al., 1993; dos Santos et al., 2001). Curiosamente, camundongos tnfr1-/- quando infectados pelo T. cruzi apresentaram redução da miocardite, marcada principalmente pela redução do número de células T CD8+, quando comparados aos camundongos imunocompetentes infectados. Esta redução de células CD8+ foi correlacionada com diminuição da frequência de células CD8+CD44+CD62Llow/- com perfil de ativação/memória no sangue e retenção desse subconjunto de células no baço (KrollPalhares et al., 2008). Estes dados indicam que a sinalização via TNF/TNFR1 não é essencial para a plena diferenciação desse subconjunto de células T, como indicado pela expressão de marcadores de ativação/memória CD44 e CD62L, mas de alguma forma controla a compartimentalização das células T CD8+ na infecção pelo T. cruzi. 28 Assim, estes resultados sugerem que a desregulação na produção de TNF bem como sua sinalização via TNFR1 participem da evolução da CCC. Com isso, torna-se importante entender os mecanismos pelos quais esta citocina participa da patogenia da miocardite chagásica crônica, modulando os processos que envolvem a migração de células para o tecido cardíaco, o balanço pró/anti-inflamatório sistêmico, bem como a ativação das subpopulações de células T CD8+ e o reflexo na funcionalidade cardíaca. 2.7.3 Estratégias de bloqueio de TNF Uma vez conhecida a associação entre a ativação inflamatória e a ICC, seria coerente procurar potenciais alvos terapêuticos que modulem essa inflamação. Nos últimos anos tivemos a expansão das opções terapêuticas principalmente para as doenças autoimunes (que também apresentam um importante componente inflamatório) com o desenvolvimento de terapias direcionadas especificamente para mediadores inflamatórios (Tracey et al., 2008; Tanaka et al., 2014). Tendo em vista o papel do TNF na gênese e perpetuação da inflamação, o seu antagonismo poderia reduzir o processo de remodelamento, melhorar a função ventricular e reduzir a mortalidade. Os estudos que buscaram antagonizar o TNF apresentaram, todavia, resultados não muito animadores. O estudo "Anti-TNF Therapy Against Congestive Heart Failure" (ATTACH) randomizou pacientes para receber placebo ou infliximab (Remicade, Schering-Plough - Figura 4), um anticorpo monoclonal quimérico (humano-murino) que se liga com alta afinidade a formas solúveis e transmembranares do TNF, mas não à LTA. Os pacientes que receberam infliximab não apresentaram diferença significativa na incidência do desfecho primário (um escore composto que visava avaliar a mudança no perfil clínico em 14 semanas). Além disso, apesar de haver uma redução nos níveis de proteína C reativa (PCR) e IL-6, a incidência de morte ou hospitalização foi significativamente maior no grupo que recebeu a terapia anti-TNF na dose de 10 mg/kg (Chung et al., 2003). O ensaio clínico "Randomized Etanercept Worldwide Evaluation" (RENEWAL) avaliou o uso do etanercept em dois sub-estudos: o "Research into Etanercept Cytokine Antagonism in Ventricular Dysfunction" (RECOVER) e o "Randomized Etanercept North American Strategy to Study Antagonism of Cytokines" (RENAISSANCE). O etanercept (Enbrel, Wyeth - Figura 4) é um dímero de uma proteína quimérica obtida por engenharia 29 genética pela fusão do domínio de ligação extracelular do TNFR2/p75 com o domínio Fc da IgG1 humana. Este componente Fc contém as regiões CH2 e CH3, mas não possui a região CH1 da IgG. O etanercept inibe a ligação do TNF e da LTA aos receptores de TNF na superfície celular, tornando o TNF biológico indisponível e impedindo as respostas celulares mediadas por esta citocina (Kapadia et al., 1995; Kubota et al., 2000). Assim como no ATTACH, a terapia anti-TNF mostrou-se ineficaz, pois não houve diferença significativa na incidência de morte ou hospitalização entre os grupos eternacept e placebo (Mann et al., 2004). Dentre as possíveis razões para a falha da terapia anti-TNF, foram apontados: o possível efeito tóxico direto dos antagonistas; uma possível potencialização do efeito do TNF; uma dose não adequada; o fato de que os antagonistas não conseguem bloquear completamente o processo inflamatório ou que o aumento de citocinas poderia ser um mecanismo apenas adaptativo (Chung et al., 2003; Mann et al., 2004). Alguns estudos sugeriram que níveis fisiológicos (baixos níveis) de TNF podem conferir efeito citoprotetor ao tecido cardíaco durante a lesão isquêmica aguda (Nakano et al., 1998; Kurrelmeyer et al., 2000). Além disso, o TNF pode desempenhar um papel adaptativo, reforçando a produção de NO vascular e, portanto, influenciando no fluxo de sangue periférico em pacientes com ICC (Katz et al., 1994, Sugamori et al., 2002). Desta forma, níveis fisiológicos de TNF poderiam desempenhar um papel importante na regeneração e reparação tecidual (Mann, 2002). Assim, é possível que terapias anti-TNF possam diminuir TNF abaixo dos níveis fisiológicos necessários para o reparo do miocárdio. Também devemos lembrar que a resposta inflamatória à ICC está associada com outras citocinas como a IL-6 e IL-1, que têm propriedades de sinalização similares ao TNF e são produzidas por cardiomiócitos durante a ICC (Gullestad & Aukrust, 2005). Apesar do insucesso dos grandes ensaios clínicos (ATTACH, RENEWAL eRENAISSANCE) que avaliaram a ação de antagonistas específicos do TNF, novos fármacos invadem o mercado com a proposta de bloquear TNF e tratar principalmente as doenças autoimunes (Tracey et al., 2008). O adalimumab (Humira, AbbVie - Figura 4) é um anticorpo monoclonal recombinante 100% humanizado com eficácia similar ao infliximab para o tratamento de doenças como artrite reumatoide, psoríase e doença de Crohn (Tracey et al., 2008). Entretanto ainda não existem ensaios clínicos envolvendo o uso deste fármaco em pacientes cardiopatas. 30 C B A Figura 4. Agentes anti-TNF. Moléculas anti- fator de necrose tumoral (TNF) ligam-se ao TNF para neutralizar sua atividade. Infliximab e adalimumab são anticorpos monoclonais. (A) Infliximab é uma quimera camundongo/humano, que une as regiões variáveis de um anticorpo de camundongo com a região constante de IgG1 humana; e (C) adalimumab é um anticorpo IgG1 humano. (B) Etanercept é uma proteína de fusão dimérica que junta o receptor p75 de TNF humano com o domínio Fc de IgG1 humano. Modificado de Russo & Polosa 2005. Alguns estudos que utilizaram agentes anti-inflamatórios e imunomoduladores inespecíficos mostraram-se promissores. Um estudo que avaliou em pacientes com IC os efeitos da talidomida, conhecida por propriedades anti-inflamatórias e antioncogenéticas, a talidomida promoveu aumento significativo da FEVE e redução significativa dos níveis de TNF plasmático após seis semanas de tratamento (Gullestad et al., 2002). Um outro ensaio clínico randomizado avaliou em pacientes com IC isquêmica a ação da pentoxifilina (PTX), uma metilxantina que tem como principal ação o bloqueio das enzimas fosfodiesterases. A PTX tem metabolismo predominantemente hepático, sendo inicialmente utilizada em pacientes com claudicação intermitente e doença vascular periférica (Frampton & Brogden , 1995). O uso do medicamento para este fim se justificava pela ação de relaxamento da musculatura vascular (Kamphuis et al., 1994) e alterações da deformidade eritrocitária mostrada no início dos trabalhos com o fármaco (Angelkort et al., 1979). Entretanto, após sua utilização com este intuito, foi observado também que o medicamento possuía propriedades anti-inflamatórias e imunomoduladoras importantes, com os primeiros estudos nesta linha demonstrando seus efeitos sobre a redução da migração de neutrófilos e hiperreatividade leucocitária (Mandell et al., 1988, De Prost et al., 1990). Estes estudos também demonstraram que seu principal efeito anti-inflamatório se dava sobre a resposta do tipo Th1, sendo o fármaco considerado um agente supressor da 31 produção do TNF (Coimbra et al., 2004). Em cardiopatias, o principal uso da medicação foi no tratamento da ICC. Desde o primeiro trabalho em 1998, vários autores demonstraram que o uso da PTX melhorou a função sistólica de pacientes com ICC avançada, com melhora dos sintomas clínicos e redução da inflamação sistêmica medida pela redução dos níveis plasmáticos de TNF, proteína C reativa e pró-BNP (Sliwa et al., 1998; Skudicky et al., 2001; Sliwa et al., 2002; Sliwa et al., 2004). Concomitante aos estudos avaliando a disfunção ventricular, a PTX também demonstrou um bom perfil anti-inflamatório em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca, nos quais o uso de circulação extracorpórea promove uma ativação importante da resposta inflamatória (Boldt et al., 2001). Coletivamente, esses ensaios mostraram que a terapia com PTX em cardiopatias não infecciosas parece resultar em uma melhora dos sintomas clínicos, não necessariamente em associação com a redução da concentração de TNF circulante, mas com efeitos significativos na funcionalidade cardíaca (Skudicky et al., 2001). Na infecção pelo T. cruzi, o bloqueio de TNF na CCC experimental se mostrou aparentemente contraditório. O tratamento com infliximab reduziu a inflamação por células CD8+ e o dano cardíaco na infecção aguda (Kroll-Palhares et al., 2008) e a inflamação por células CD8+ na fase crônica (Pérez et al., 2009). Por outro lado, o uso de etanercept foi prejudicial à função cardíaca na fase crônica da infecção, sem interferir na alta expressão de mRNA codificando TNF no tecido cardíaco (Bilate et al., 2007). Este aparente paradoxo realça a necessidade de compreensão dos modos de ação e os fatores limitantes das ferramentas terapêuticas que visam modular a ação de TNF (Wong et al. 2008). Dados do nosso laboratório sugerem que os efeitos prejudiciais de TNF na infecção pelo T. cruzi podem ser determinados pela quantidade e duração da produção de TNF. Assim, a redução (mas não a completa abolição) da produção de TNF ou da sua ação biológica pode ter um efeito benéfico por manter sob controle a disseminação do parasito. Em paralelo, interfere reduzindo o desenvolvimento da miocardite e lesões durante a infecção pelo T. cruzi (Lannes-Vieira et al., 2011). 2.8 Tratamento da infecção pelo T. cruzi O tratamento etiológico da DC continua o mesmo desde a década de 70, sendo parcialmente ineficaz, devido à resistência parcial de algumas cepas ou a fatores intrínsecos ao hospedeiro. Uma das dificuldades para o controle da eficácia de uma droga tripanossomicida é o critério de cura, ou seja, ter métodos que permitam medir 32 com segurança a eficácia do fármaco. Outro problema é a diversidade genética do parasito. Entre inúmeras drogas testadas, duas têm sido usadas com cautela e acompanhamento criterioso, obtendo bons resultados na fase aguda da infecção, o benznidazol (Bz - inicialmente produzido pela Roche como Rochagan ou Radanil e atualmente produzido pela LAFAPE, PE, Brasil e pelo laboratório argentino ELEA com o nome de Abarax®) e o nifurtimox (produzido pela Bayer Health Care, com o nome comercial de Lampit). O Bz (Figura 5) é uma droga nitroheterocíclica (N-benzil-2-nitroimidazole-1acetamida) introduzido na terapêutica da DC em 1967. É considerado mais efetivo que o nifurtimox, porém, apresenta moderada toxicidade. O Bz possui uma consistente capacidade anti-protozoário, conseguindo eliminar os parasitas nas formas sanguíneas e teciduais, se administrado na dose certa e durante o período de dois meses na fase aguda da DC (Oliveira et al, 2008; Bezzera, 2012). O modo de ação do Bz pode envolver ligação covalente ou outras interações de intermediários nitroredutores com componentes do parasito ou ainda ligações ao DNA, lipídios e proteínas (Coura & Castro 2002). O nifurtimox (Figura 5), 3-metil-4 (5’-nitrofurfurilidenamino)- tetraidro (1,4)tiazina-1-1-dióxido, tem como efeito a inibição do desenvolvimento intracelular do parasito. Atua bem contra as formas sanguíneas e parcialmente contra as formas teciduais. É administrado oralmente por três meses sob a forma de comprimido, sendo mais bem tolerado por pacientes jovens (Cimerman, 2008; Neves et al, 2005; Rey, 2008). Tais medicamentos mostram sua eficácia se administrados imediatamente após a infecção, ou seja, na fase aguda. O tratamento também é indicado para pessoas onde a infecção foi reativada, por exemplo, por imunossupressão, para crianças com infecção congênita e para pacientes durante o início da fase crônica (WHO, 2010). Estas estratégias terapêuticas têm como desvantagens o fato de serem eficazes quando adotadas na fase aguda ou crônica recente da doença e serem tóxicas para uma parcela dos pacientes, com efeitos colaterais que torna necessária, muitas vezes, a interrupção do tratamento (Rassi Jr et al., 2010). Em 2004 iniciou-se o estudo BENEFIT, que visa analisar se o tratamento com Bz, nas doses habituais (5-10 mg/Kg/dia) modifica ou não a evolução da CCC. Esse estudo envolve Brasil, Argentina e Colômbia, tendo previsão de acompanhamento de 3 mil pacientes portadores da fase crônica da DC com 33 cardiopatia instalada (grau funcional de I a III da New York Heart Association). Ao final do estudo espera-se ser possível definir o real papel do tratamento com Bz na fase crônica da DC (Marin-Neto et al., 2009). Apesar dos vários efeitos colaterais que o uso do Bz acarreta aos pacientes que estão sendo tratados pela DC, esta é a droga ainda indicada pelos médicos como o fármaco de linha de frente (Mejia et al., 2012). A terapêutica da DC prossegue parcialmente ineficaz, apesar do real progresso alcançado nas últimas décadas. Diversas drogas vêm sendo estudadas (Menezes et al., 2011), porém, nenhuma consegue eliminar a infecção pelo T. cruzi, ou seja, promover a cura estéril em definitivo. Figura 5: Estrutúra química das drogas usadas no tratamento etiológico da doença de Chagas: nifurtimox e benznidazol. Modificado de Patterson et al., 2014. O tratamento sintomático da forma cardíaca é feito como em outras cardiopatias, usando cardiotônicos, diuréticos, vasodilatadores, betabloqueadores, implante de marcapasso ou transplante cardíaco (nos casos graves de IC). Nas formas digestivas são indicadas dietas, laxativos, enemas ou cirurgia. Outras possibilidades de tratamento das sintomatologias de fase crônica estão em teste, como a terapia celular, que se mostrou benéfica melhorando a fibrose e inflamação cardíaca em modelos experimentais (Soares et al., 2004) e o uso de células-tronco (administração intracoronariana) em pacientes com IC chagásica, que se mostrou eficaz melhorando a qualidade de vida e capacidade funcional dos pacientes nos 2 meses após o tratamento (Vilas-Boas et al., 2006), entretanto esses resultados não se reproduziram na coorte de Goiás (de Souza et al., 2014). Também, a injeção intracoronariana de células mononucleares derivadas da medula óssea não melhorou a FEVE ou a qualidade de vida dos pacientes com CCC (Ribeiro dos Santos et al., 2012), o que sugere a necessidade de mais estudos na área. Além disso, existe a proposta do uso de imunomoduladores sozinhos ou em associação 34 com drogas tripanossomicidas, objetivando regular mecanismos patogênicos de forma associada ou não ao controle do parasito na CCC (Lannes-Vieira, 2003; Lannes-Vieira et al., 2010). No futuro, possivelmente, em analogia à hanseníase, SIDA e tuberculose (Simon et al., 2006; Nahid et al., 2006), teremos uma terapia combinada mais efetiva e mais racional para a infecção pelo T. cruzi. Por se tratar de uma doença debilitante e incurável, a DC constitui ainda hoje, em um Brasil com baixa transmissão vetorial, um grave problema de saúde pública, especialmente pelo tratamento dos pacientes já infectados no passado. A pesquisa de novos fármacos com maior eficácia na fase crônica da infecção, e menor toxicidade ao paciente, não representa o interesse dos laboratórios de medicamentos. Das mais de mil novas entidades químicas que entraram no mercado farmacêutico entre 1975 e 1999, apenas 16 eram indicadas para o tratamento de doenças tropicais e tuberculose (Trouiller et al., 2002). Entretanto, há várias classes de drogas aprovadas para uso em outras enfermidades e com atividade comprovada contra o T. cruzi, que poderiam ser desenvolvidas para o tratamento da DC (Rodriguez-Morales, 2005). Por isso, mesmo após mais de cem anos da descoberta de Carlos Chagas, a DC ainda representa um desafio à saúde pública no Brasil e em outras áreas endêmicas, pois conta com uma patogenia complexa, medidas profiláticas e terapias parcialmente efetivas e ainda com entraves político-econômicos que a tornam negligenciada frente às outras enfermidades que assolam o planeta (Lannes-Vieira et al., 2010). 2.9 Vacina Recentemente foi demonstrado que, do ponto de vista econômico, é interessante o desenvolvimento de uma vacina contra a DC na América Latina, mesmo em regiões de baixo risco de infecção e baixa eficiência vacinal (Lee et al., 2010). Várias formas de imunização têm sido testadas, seja com cepas atenuadas, frações ou formas inativadas do T. cruzi, usando parasitos semelhantes, proteína recombinante e vacina de DNA ou vírus recombinantes expressando epítopos do T. cruzi (Paiva et al., 1999; De Alencar et al., 2009; Boscardin et al., 2003; Vasconcelos et al., 2004; Machado et al., 2006; Aparicio-Burgos et al., 2015). Inicialmente, a infecção residual decorrente da imunização com parasitos vivos (Basombrio et al., 1982; Paiva et al., 1999) impulsionou a elaboração de vacinas 35 compostas por parasitos mortos ou vivos atenuados. A avirulência do parasito era produzida pelo tratamento prévio com agentes atenuantes químicos, radiação, ou passagens seriadas em cultura, mas objetivando preservar sua imunogenicidade (Bhatia et al., 2004). A proteção oferecida pelas vacinas com parasitos atenuados ou mortos foi semelhante à oferecida pela imunização com formas vivas do T. cruzi, observada por maior sobrevida e menor parasitemia nos camundongos vacinados (Basombrio et al., 1987). Então, novos modelos de imunização começaram a ser aplicados, visando expor antígenos intracelulares do T. cruzi a partir da lise celular, o que contribuiu para os estudos de imunogenicidade e compreensão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, com a evolução das técnicas laboratoriais, tornou-se possível selecionar proteínas de frações do parasito, bem como epítopos imunogênicos contidos em uma determinada proteína e testar a capacidade destas em gerar proteção. Atualmente, os candidatos que mais se destacam são: as proteínas cruzipaína, TS proteínas de superfície de formas amastigotas, proteína Rod paraflagelar, entre outros (Cazorla et al., 2009). A proteína de superfície de amastigota (ASP)-2, que é importante na manutenção da infecção crônica (Boscardin et al., 2003; Vasconcelos et al., 2004), e a TS, uma enzima das formas tripomastigotas que catalisa a transferência do ácido siálico de glicoproteínas do hospedeiro para moléculas receptoras na membrana do parasito (Schenkman et al 1994), pertencem à mesma família de genes e foram descritas como proteínas altamente imunodominantes (Low et al., 1998; Myahira et al., 2005; Araujo et al., 2005). Inúmeros grupos vêm testando em diferentes protocolos e linhagens de camundongos o uso de proteína recombinante, vacina de DNA ou vírus recombinantes expressando epítopos ou genes da família TS com o intuito de obter uma resposta imune protetora contra a infecção pelo T. cruzi (Garg e Tarleton, 2002; De Alencar et al., 2009; Boscardin et al., 2003; Vasconcelos et al., 2004; Machado et al., 2006). A administração profilática de preparações vacinais contendo ASP2 e TS suscitou resposta imune humoral e celular, além de impactar na melhora da parasitemia e sobrevivência dos camundongos vacinados (Machado et al., 2006; Haolla et al., 2009, de Alencar et al., 2009; Barbosa et al., 2013). Por exemplo, a vacinação de camundongos C57BL/6 (H-2b) usando o adenovírus recombinante tipo 5 (rAd5) carreando sequências de ASP (rAdASP2), TS (rAdTS), ou ambas (rAdASP+rAdTS) mostrou que somente a última foi capaz de gerar proteção frente ao desafio com a cepa Y do T. cruzi (Machado et al., 36 2006). Estes dados foram corroborados em camundongos A/Sn (H-2a) (Haolla et al., 2009). Outra alternativa seria a vacina de DNA, que se baseia na inclusão de genes que codificam proteínas antigênicas aos plasmídeos. Estes são inoculados no organismo do hospedeiro e fagocitados por células apresentadoras de antígenos e células dendríticas. Dessa forma, o plasmídeo se interioriza na célula e utiliza o aparato celular do hospedeiro para transcrever e traduzir a proteína imunogênica que estimulará respostas imunes específicas. Em experimentos com plasmídeos de DNA contendo genes que codificam as proteínas cruzipaína (Schnapp et al., 2002) e o antígeno de superfície de tripomastigotas-1 (a ASP-240) (Wizel et al., 1998) produziram imunidade parcial, sem produzir imunidade estéril. Outra estratégia usada foi o protocolo heterólogo usando DNA plasmidial no prime (indução) e o rAd5 carreando sequências de ASP2 no boost (reforço). Esta proposta vacinal estimulou resposta imune protetora, com o aumento na frequência de células T CD8+ de memória específicas para T. cruzi (Rigato et al., 2011). A imunização com proteínas recombinantes de protozoários semelhantes ao T. cruzi, por exemplo, o Trypanosoma rangeli, que não é patogênico para o homem, também é um candidato vacinal para a DC. Camundongos imunizados com o T. rangeli fixado com glutaraldeído apresentaram ativação de células B e T que foram capazes de reconhecer antígenos de T. cruzi e ainda controlaram a parasitemia, reduziram a mortalidade e as lesões histopatológicas após desafio com o T. cruzi (Basso et al., 2004; Basso et al., 2008). Recentemente, foi testada a eficácia de uma vacina de DNA (prime) e T. rangeli inativado (boost) em modelo canino da DC, mostrando redução na parasitemia, no infiltrado inflamatório do tecido cardíaco e preservação da função cardíaca após desafio com a cepa SylvioX10/4 (Aparicio-Burgos et al., 2015). Paralelamente aos esforços na identificação de candidatos à vacina, muitos adjuvantes foram testados na modulação de imunidade protetora. Além do objetivo de melhorar diretamente a eficácia das vacinas, propôs-se a administração conjunta dos adjuvantes para estimular uma resposta imune eficaz no controle do parasito (Tarleton 2005). Atualmente, os esforços na busca por uma vacina efetiva contra a infecção continuam expressivos (Dumonteil et al., 2012). Entretanto, e infelizmente, não se dispõe ainda de nenhuma vacina, seja de uso veterinário ou de uso humano, que assegure proteção. Esforços futuros são necessários na identificação de sistemas de vacinação eficientes, adjuvantes e regimes de vacinação para aumentar as respostas 37 protetoras a já conhecidos e novos candidatos vacinais. Dada a complexidade do genoma do parasito, os vários estágios do ciclo evolutivo nos hospedeiros e as variações das cepas, é essencial que se empreguem esforços na escolha de candidatos apropriados à vacina. 2.10 Controle e prevenção O controle da transmissão constitui-se na estratégia básica de superação da DC, priorizam-se o controle do inseto vetor, sobretudo os presentes no domicilio e peridomicílio, e a prevenção da transmissão transfusional e vertical. A forma de prevenção da DC mais eficiente na América Latina é sem dúvida o controle do vetor. No final do ano de 2006 o Brasil foi declarado área livre de transmissão pelo principal vetor da DC, o Triatoma infestans, uma vez que dos doze estados onde ainda havia registros de transmissão vetorial até a década de 90, em dez deles a transmissão já havia sido interrompida e nos dois estados restantes o trabalho de controle químico do vetor encontrava-se bastante avançado (WHO 2010). Os programas de controle da DC mostraram ser efetivos em reduzir a incidência da infecção e resultaram num custo econômico muito menor para prevenção, quando comparado ao despendido no tratamento da doença crônica. Além do controle químico, outras medidas contra o vetor são pertinentes. A melhoria das habitações é primordial, uma vez que casas de alvenaria sem frestas, limpas e arejadas, por si mesmas já oferecem grande resistência à colonização triatomínica, (Dias, 1991). A triagem do sangue também é necessária para evitar a transmissão da doença por transfusão sanguínea e transplante de órgãos (WHO, 2010). Medidas como a seleção apropriada de doadores de sangue, o uso de testes sensíveis de triagem e a aplicação de um sistema de garantia de qualidade mantêm a segurança dos bancos de sangue. O uso de testes de diagnóstico moleculares avançados, mais precisos e sensíveis tem reduzido grandemente o risco da aquisição da DC transmitida por sangue infectado (Teixeira et al., 2006). Outro fator importante é a migração de pessoas infectadas pelo T. cruzi, já que indivíduos de áreas endêmicas têm migrado para alguns lugares, tais como Estados Unidos da América, Canadá, Austrália, Japão e países europeus, isso tem representado uma ameaça para os países onde a transmissão da DC pelos triatomíneos não ocorre, tornando a DC um problema de ordem mundial (Rassi et al., 2010; Bonney 2014). 38 Segundo a OMS (2010) as metas de controle principais são a eliminação da transmissão e o acesso à assistência médica para a população infectada e doente. Uma maneira de prevenir a DC é sem dúvida a educação para a saúde, a ser realizada de modo permanente nas áreas endêmicas: melhoria das habitações, reconhecer a doença e suas formas de transmissão, manejar de forma adequada o peridomicílio, reconhecer, capturar e notificar triatomíneos são objetivos importantes a serem perseguidos nas práticas políticas, escolares e comunitárias (Lannes-Vieira et al., 2010). 39 3. Justificativa ___________________________________________________________________________________ Diante da importância da DC, com cerca de 7-8 milhões de pessoas cronicamente infectadas, das elevadas taxas de morbidade e mortalidade, sobretudo na CCC, e a ausência de terapia efetiva, justificam-se estudos que visem aprofundar o entendimento dos fatores que estão envolvidos na patogenia da doença, na busca de alvos terapêuticos e possíveis biomarcadores relacionados à progressão para as formas sintomáticas e evolução das mesmas. Assumimos que componentes celulares (como as células T CD8+) e moleculares (como as citocinas e quimiocinas) do hospedeiro estão envolvidos na resistência à infecção pelo T. cruzi, bem como em processos patogênicos. Considerando que a complexa resposta imunológica do hospedeiro constitui fator chave nas diferentes manifestações clínicas da DC crônica, a modulação desta resposta, bem como a busca de estratégias terapêuticas racionais e a caracterização de modelos experimentais adequados ao estudo são abordagens de extrema relevância no âmbito da saúde pública em DC. Diante do exposto, o presente trabalho traz a validação de modelos experimentais para o estudo da CCC, a participação da citocina TNF e seu receptor TNFR1 na resposta imune frente à infecção crônica, propostas de tratamento e o desenvolvimento de uma vacina terapêutica. 40 4. Objetivo geral ___________________________________________________________________________________ Caracterizar a participação de células e moléculas chave da resposta imunológica na patogênese da cardiomiopatia chagásica crônica experimental, visando desenvolver uma terapia para esta patologia. Objetivos específicos: 1. Propor modelos experimentais que reproduzam aspectos da cardiomiopatia chagásica humana. 2. Investigar a participação da sinalização TNF/TNFR1 sobre os diferentes perfis de células T CD8+ (inflamatório – IFNγ+; citotóxico – perforina+) e na geração da lesão cardíaca na infecção crônica experimental pelo T. cruzi. 3. Analisar os efeitos de diferentes terapias imunorreguladoras sobre a lesão e a funcionalidade cardíaca, procurando identificar componentes-chave da imunopatogenia da cardiomiopatia chagásica crônica. 4. Propor novas estratégias terapêuticas, usando imunorreguladores, droga tripanossomicida e vacina, visando melhor prognóstico da CCC. 41 ARTIGO I O uso de modelos animais para o entendimento da patogenia da infecção pelo Trypanosoma cruzi vem desde o artigo original de Carlos Chagas. Ao longo desses mais de cem anos de estudos, hamsters, ratos, cães, coelhos, macacos, camundongos e outros, foram utilizados para o estudo da infecção experimental e alguns aspectos das fases aguda e crônica da infecção humana foram reproduzidos nestes. No entanto, um dos maiores problemas para o entendimento e sistematização dos dados existentes na literatura sobre a imunobiologia da infecção e imunopatogenia da doença de Chagas (DC) é o fato de não haver um modelo comum, eleito pela maioria dos grupos que trabalham na área e cujos resultados encontrados sejam transponíveis para humanos. Aqui, descrevemos a infecção crônica experimental com a cepa Colombiana do T. cruzi (Tipo 1) em duas linhagens isogênicas de camundongos (C3H/He e C57BL/6). Ambas reproduzem aspectos da fase crônica da DC humana, tais como: parasitemia subpatente, infiltrado inflamatório, fibrose e redução e desorganização da expressão de conexina 43 no tecido cardíaco. Aumento da atividade da isoenzima MB da creatina quinase (CKMB) no soro, bem como elevados níveis séricos do fator de necrose tumoral (TNF) e óxido nítrico (NO). Em paralelo a estes achados, observamos alterações elétricas tais como arritmias e bloqueios atrioventriculares. Por fim, confrontando a infecção nas duas linhagens, segundo os parâmetros analisados, os animais C3H/He desenvolvem patologia mais grave, quando comparados ao modelo C57BL/6. Logo, neste artigo caracterizamos a infecção crônica experimental sob vários parâmetros em duas linhagens distintas, nos permitindo adotá-los no estudo da fisiopatogenia da doença, na busca de biomarcadores de progressão e também no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para a cardiomiopatia chagásica crônica. 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 ARTIGO II Dados da literatura sustentam que a fase crônica da doença de Chagas (DC) possui uma complexa patogenia. Fatores chave que levem às diferentes formas da doença, bem como à progressão desta, ainda não estão completamente elucidados. A cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) é caracterizada por miocardite difusa, com destruição das fibras cardíacas e substituição por fibrose cicatricial, associada ao infiltrado inflamatório composto por linfócitos T e macrófagos. Estas células inflamatórias têm sido implicadas no processo de destruição do tecido cardíaco. Alguns trabalhos também propõem o envolvimento das citocinas inflamatórias na patogênese da CCC. A infecção pelo T. cruzi e seus antígenos induzem a produção do fator de necrose tumoral (TNF), envolvendo mecanismos dependentes do fator de transcrição nuclear-κB. O TNF é uma citocina multifuncional, medeia atividade microbicida de macrófagos e, ao nível tecidual, inflamação aguda e crônica. TNF foi identificado por imunoistoquímica no tecido cardíaco de cardiopatas na DC e altos níveis séricos desta citocina estão correlacionados à disfunção cardíaca. Dados da literatura suportam que TNF participe da evolução da CCC, tornando-se importante entender os mecanismos pelos quais esta citocina atua na patogênese desta. Usamos como estratégia o bloqueio da citocina TNF (com o anticorpo monoclonal quimérico infliximab) em camundongos C57BL/6 cronicamente infectados pelo T. cruzi (Artigo I). O uso do infliximab não reativou a parasitemia, mas reposicionou a resposta imune reduzindo a frequência de células com o perfil inflamatório e aumentando a proporção de células com perfil regulador. Além disso, a terapia antiTNF diminuiu a atividade citotóxica, mas conservou a produção de IFNγ por células T CD8+ específicas (VNHRFTLV) no baço e reduziu o número de células perforina+ no tecido cardíaco. A terapia com o infliximab também melhorou a função elétrica nos camundongos infectados e ainda reduziu a fibrose no tecido cardíaco. Logo, concluímos que o TNF é componente chave na patogênese da DC sustentando o desequilíbrio imunológico que contribui para as alterações cardíacas. Esses dados nos levam a propor que TNF pode ser alvo de terapias para a forma cardíaca da doença, visando melhor prognóstico. 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 ARTIGO III A cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) está associada à miocardite com componente inflamatório enriquecido em células CD8+, fibrose e alterações cardíacas estruturais e elétricas. Na infecção pelo T. cruzi as alterações nos perfis de memória e ativação das células T CD8+ foram anteriormente descritas. Recentemente, descrevemos a participação antagônica de diferentes perfis de células T CD8+ na patogênese da CCC (IFNγ+, protetor; Pfn+, deletério). No presente trabalho, visamos elaborar uma proposta terapêutica que interfira nas anormalidades destas células vislumbrando um melhor prognóstico para a CCC. A pentoxifilina (PTX), um derivado da metilxantina, apresenta efeito imunorregulador, anti-tumoral e cardioprotetor. No presente estudo, utilizamos um modelo experimental de CCC moderada (Artigo I) para averiguar os efeitos reguladores da terapia com PTX sobre as células T CD8+ e na progressão ou reversão da forma cardíaca da doença de Chagas (DC). Verificamos que a PTX não tem ação sobre o T. cruzi, não alterando a carga parasitária, que se mantém em baixos níveis mesmo após o tratamento. Entretanto, a terapia com PTX reduziu: (i) a frequência de células T CD8+ no baço que expressam receptores de TNF, marcadores de ativação e de migração celular; (ii) a ativação das células endoteliais dos vasos sanguíneos; e (iii) a intensidade da inflamação no tecido cardíaco. Embora a produção de IFNγ tenha sido conservada sistemicamente e no tecido cardíaco, a terapia com PTX reduziu o número de células Pfn+ presentes neste tecido. De maneira importante, a terapia com PTX diminuiu significativamente a lesão cardíaca e melhorou a função elétrica, tanto na CCC moderada quanto na grave (modelos descritos no Artigo I). Ainda, os camundongos tratados com PTX apresentaram diminuição da dilatação dos ventrículos e aumento da fração de ejeção do ventrículo esquerdo, quando comparados aos animais injetados com salina. Estes resultados demonstram que o tratamento com a PTX na fase crônica da infecção pelo T. cruzi reposiciona a resposta de células T CD8+ e impede o desenvolvimento da CCC grave, fazendo deste fármaco um potencial adjuvante no tratamento da forma cardíaca da DC, sugerindo que ele possa ser usado sozinho e levando a proposta de seu uso em associação ao tratamento etiológico. 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 ARTIGO IV A hipótese consensual propõe que a patogênese da cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) é dependente da persistência do T. cruzi e que este, ou seus antígenos, induzem resposta inflamatória desregulada. Acredita-se que pelo menos parte das manifestações clínicas da doença de Chagas (DC) sejam consequências da resposta imune dirigida ao parasita, que contribuiriam para lesões teciduais. Então, seria racional propor uma terapia efetiva que iniba a fibrose e a disfunção cardíaca em associação ao controle do agente etiológico, o T. cruzi, possibilitando assim um melhor prognóstico aos pacientes. Neste sentido, a terapia combinada surge como uma alternativa para o tratamento da DC. O benznidazol (Bz) é a principal droga disponível para tratar a DC e, embora não haja nenhuma evidência científica sólida sobre o seu uso na fase crônica da infecção, em modelos experimentais o tratamento com Bz na fase aguda impediu o desenvolvimento de CCC grave. Como anteriormente mostrado, a pentoxifilina (PTX) exibiu efeitos cardioprotetores em ensaios clínicos envolvendo pacientes com insuficiência cardíaca crônica e melhorou aspectos críticos da CCC experimental reposicionando a resposta de células T CD8+ (Artigo III), principal componente da inflamação cardíaca. Isto nos levou a propor que a combinação de Bz a esta terapia que modula a inflamação crônica não benéfica possa ser uma estratégia terapêutica para o tratamento da CCC. Então, neste trabalho mostramos que a terapia combinada PTX-Bz reduziu a expressão de TNF, do receptor 1 de TNF (TNFR1/p55) e da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) no coração, assim como as concentrações de TNFR1 solúvel e óxido nítrico (NO) no soro. Além disso, a terapia PTX-Bz diminuiu inflamação, fibrose e carga parasitária no tecido cardíaco e reverteu as alterações elétricas, mantendo este efeito mesmo após 30 dias do final da terapia. Portanto, Bz combinado a PTX controla o parasito, regenera a lesão cardíaca e melhora a função elétrica, tornando esta uma estratégia viável para o tratamento da forma cardíaca da DC. 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 ARTIGO V A infecção pelo T. cruzi induz resposta imune humoral e celular que desempenham papel vital no controle do crescimento do parasito. Contudo, em cerca de 30% dos pacientes a inflamação se torna progressiva, resultando em doença crônica caracterizada por miocardite associada à fibrose e à disfunção cardíaca. Todavia, a persistência do parasito associada a mecanismos homeostáticos mal-adaptados, como os processos oxidantes/antioxidantes e o balanço entre as citocinas pró-inflamatórias/antiinflamatórias/quimioatraentes são propostos estar criticamente envolvidos na progressão da cardiomiopatia chagásica crônica (CCC). Assim, além de métodos imunoprofiláticos, novas drogas tripanossomicidas e métodos que contribuam para o resgate da função cardíaca (Artigo III), é plausível propor o desenvolvimento de uma vacina que estimule a imunidade protetora e previna a progressão da CCC. Neste sentido, utilizamos a estratégia do protocolo homólogo prime-boost com o adenovírus recombinante (rAd) carreando sequências codificadoras da proteína de superfície de amastigota-2 (ASP2) e trans-sialidase (TS) do T. cruzi. A vacinação profilática com rAdASP2 + rAdTS (rAdVax ) induziu a produção de anticorpos, reduziu o parasitismo cardíaco na fase aguda e as alterações elétricas na fase crônica da infecção. A imunoterapia com rAdVax reduziu a resposta ao estímulo policlonal, mas preservou a imunidade específica mediada por IFNγ e diminuiu a frequência de células T CD8+ potencialmente citotóxicas. Além disso, rAdVax reverteu as alterações elétricas, reduziu as alterações histopatológicas e aumentou a sobrevida dos animais. Assim, a imunoterapia com adenovírus recombinante surge como uma um candidato vacinal capaz de reprogramar a resposta imunológica, sendo uma alternativa racional para interromper a progressão e reverter a lesão cardíaca na DC crônica. 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 5. Discussão ___________________________________________________________________________________ Embora os mecanismos exatos associados com o desenvolvimento da patologia na DC não estejam totalmente esclarecidos, a participação do sistema imunológico do hospedeiro parece estar evidente. Postula-se que a interação entre o parasito e mediadores do sistema imune seja o principal fator responsável pelos danos teciduais nas células infectadas, favorecendo a persistência da inflamação cardíaca e da fibrose reparativa subsequente, levando à perda funcional do órgão ao longo dos anos. É proposto que as formas crônicas da DC resultam de mecanismos imunológicos multifatoriais e a resposta imune desregulada associada à imparidade na rede de citocinas tem sido apontada como um dos fatores determinantes na gravidade da doença. No presente estudo, desafiamos a hipótese de que a modulação e reprogramação da resposta imune na fase crônica da DC, na presença ou não de terapia tripanossomicida coadjuvante, seja uma alternativa para estimular a imunidade protetora, interromper a progressão e, até mesmo, reverter a CCC, tornando esta uma estratégia terapeutica a ser explorada. O estabelecimento de modelos experimentais que reflitam a doença humana e estudos para o tratamento específico das diferentes formas da DC fazem-se necessários. Aqui, nossos dados mostraram que tanto a linhagem de camundongos C3H/He quanto a C57BL/6 quando infectadas com baixo inóculo da cepa Colombiana de “Discrete Typing Units” (DTU) Tipo I do T. cruzi (Zingales et al., 2012) sobreviveram à infecção aguda e desenvolveram uma fase crônica com miocardite e parasitismo persistente, corroborando dados anteriores (Talvani et al., 2000; dos Santos et al., 2001; Medeiros et al., 2009; Silverio et al., 2010; Silverio et al., 2012). Todos os camundongos sobreviventes apresentaram níveis elevados de TNF no soro, confirmando a observação prévia de aumento da expressão de TNF mRNA e proteína no tecido cardíaco dos camundongos (Talvani et al., 2000; Santos et al., 2001; Medeiros et al., 2009), reproduzindo os resultados em pacientes (Ferreira et al., 2003; Perez-Fuentes et al., 2003; Talvani et al., 2004). Durante a infecção aguda, sozinho ou em associação com outras citocinas, TNF é proposto participar do controle da replicação do parasito através da produção de NO por macrófagos (Aliberti et al., 1999) e cardiomiócitos (Machado et al., 2000). Em nosso estudo, o NO também se encontra aumentado no soro dos camundongos C3H/He e C57BL/6 infectados em paralelo à gravidade das alterações 153 elétricas e lesões cardíacas. Anteriormente, foi mostrado que altos níveis de NO estão associados com a gravidade da lesão cardíaca e anormalidades elétricas em macacos rhesus cronicamente infectados pela cepa Colombiana do T. cruzi (Carvalho et al., 2012). Além disso, trazemos evidências de que ambos os modelos de CCC apresentam miocardite, aumento de deposição de FN, perda de expressão de Cx43, aumento da atividade sérica de CK-MB e alterações eletrocardiográficas, características da forma cardíaca crônica da infecção pelo T. cruzi (Marin-Neto et al., 2007; Andrade et al., 1989; Garcia et al., 2005; Medeiros et al., 2009; Waghabi et al., 2009; Silverio et al., 2010). Curiosamente, os camundongos infectados da linhagem C3H/He exibem uma miocardite mais intensa, confirmado em nosso trabalho posterior (Daliry et al., 2014), maior parasitismo, maiores níveis de TNF e NO e significativamente maior perda de Cx43, bem como anormalidades de ECG mais graves, quando em comparação com camundongos infectados da linhagem C57BL/6. Estes modelos cobrem parte da gama de anormalidades descritas para portadores da forma cardíaca da DC crônica (Rocha et al., 2007; Marin -Neto et al., 2009; Waghabi et al., 2009; Anis Rassi Jr et al., 2010). Assim, eles podem ser explorados em estudos de patogênese da CCC, busca de biomarcadores e testes de novas drogas tripanossomicidas e estratégias terapêuticas para a DC. No presente trabalho exploramos estes modelos para o teste de nossas hipóteses. Uma provável combinação da composição genética do hospedeiro e do parasito, além do sistema imune do hospedeiro e o ambiente, podem contribuir para a determinação da forma clínica da DC (Dutra et al., 2005). Variações ou polimorfismos em um único nucleotídeo na sequência do DNA (single nucleotide polymorphism- SNP) podem regular a maneira como indivíduos desenvolvem doenças e respondem a patógenos, drogas, vacinas e outros agentes. O papel da variabilidade genética do hospedeiro desperta interesses no estudo da suscetibilidade à infecção, em relação à sua gravidade, sua progressão e as taxas de infecção em nível populacional (Segal et al., 2003). Vários trabalhos estudando diferentes genes candidatos têm sido realizados. Polimorfismos em citocinas é um deles, com o objetivo de obter uma associação com o desenvolvimento da infecção e/ou com a progressão para a CCC. Entre os pacientes portadores de CCC grave, o alelo -308G/A que confere alta produção de TNF mostrou associação com a redução na sobrevida (Drigo et al., 2006). Em contra partida, em um trabalho posterior, o mesmo grupo não observou associação entre o polimorfismo (SNP -308G/A do gene de TNF) e o desenvolvimento de doença cardíaca (Drigo et al., 2007). 154 Estudos conduzidos com outras doenças cardiológicas não infecciosas, como a doença arterial coronariana e a síndrome coronariana aguda, não conseguiram demonstrar associação entre o SNP -308G/A do gene TNF e a suscetibilidade a essas doenças do coração, apesar de ambas também serem doenças crônicas inflamatórias, onde o TNF já foi previamente relacionado com seu acometimento (Babu et al., 2012; Bezerra, 2013; Chu et al., 2012). Já o polimorfismo na posição -238 do gene do TNF mostrou ter influencia na susceptibilidade para a infecção juntamente com o aumento da produção sérica de TNF, mas não mostrou associação com as formas clínicas da DC (Pissetti et al., 2011). O gene da IL-10 na posição -1082 é altamente polimórfico e o alelo A leva a produção reduzida de IL-10, tendo sido associando com a forma cardíaca da DC (Costa et al., 2009). Outro estudo avaliando o polimorfismo da IL-10, não somente o -1082 G/A, mas também o -819 C/T e -592 C/A, não encontrou significância estatística, mas sugere que fator genético na produção da IL-10 pode influenciar a susceptibilidade e a forma clínica na doença (Flórez et al., 2011). Existem controvérsias na relação entre certos polimorfismos de gene de citocinas, que merecem ser melhor explorados. Em relação ao parasito, o T. cruzi possui genótipos e fenótipos diversificados (Miles et al. 2009; Guhl & Ramírez 2011; Zingales et al., 2012), caracterizados e compreendidos consensualmente em seis distintas DTUs TcI - TcVI (Zingales et al., 2009). Vago e colaboradores (2000) demonstraram a variabilidade genética do parasita como sendo um dos fatores determinantes da forma digestiva ou cardíaca da DC. A correlação das DTUs com a forma clínica da DC crônica é circunstancial, mas não comprovada, em muitos casos pela ocorrência de infecções mistas e a complexa interação do parasito com a resposta imune do hospedeiro (Urbina 2010; Zingales et al., 2012). Aqui, utilizamos a cepa Colombiana (TcI), que é um importante agente de infecção humana na Amazônia, Região Andina, América Central e México. Apresentações clínicas incluem miocardiopatia chagásica e casos graves de meningoencefalite em hospedeiros imunocomprometidos (Zingales et al., 2014). Anteriormente, Federici (1964) utilizando uma cepa de T. cruzi (Colombiana) isolada de um paciente na Colômbia e injetada em camundongos C3H/He, mostrou que os mesmos apresentaram pico de parasitemia após o dia 30 de infecção, inflamação e fibrose cardíaca, características semelhantes a DC humana (Higuchi et al., 2003) e reproduzidas experimentalmente por nosso grupo (Artigo I). Sendo a infecção pelo T. cruzi uma desordem multifatorial, diferentes modelos genéticos experimentais são potentes 155 ferramentas para identificar moléculas chave na patogenia da doença e direcionar novas estratégias de intervenção na doença. O progressivo processo de lesão tecidual e disfunção cardíaca característica da DC crônica resulta de um conjunto de mecanismos celulares e moleculares ainda não esclarecidos. Evidências, como a presença de TNF no tecido cardíaco e em órgãos linfóides de animais aguda e cronicamente infectados (Talvani et al., 2000; dos Santos et al., 2001) e no tecido cardíaco de pacientes portadores da CCC (Reis et al., 1993; Reis et al., 1997), indicaram que esta citocina pudesse contribuir para alterações fisiopatológicas durante a infecção pelo T. cruzi. Um possível envolvimento do TNF na fisiopatogenia da CCC foi trazido pelos trabalhos demonstrando correlação positiva entre níveis de TNF e disfunção cardíaca, indicada pela diminuição da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) (Ferreira et al., 2003; Pérez-Fuentes et al., 2003; Talvain et al., 2004). O nível elevado de TNF em pacientes com doenças cardíacas despertou interesse dos pesquisadores em investigar o efeito das terapias anti-TNF nas doenças cardíacas e também na CCC. Alguns estudos mostram que a utilização de terapia anti-TNF (anticorpo monoclonal infliximab) nas fases aguda (Kroll-Palhares et al., 2008) e crônica (Perez et al., 2009) da infecção pelo T. cruzi foi benéfico na redução dos danos ao coração, reduzindo em especial a miocardite por célula CD8+. O estudo de Perez e colaboradores (2009) mostra que o efeito benéfico de anti-TNF na miocardite foi associado a redução da expressão de mRNA de TNF no tecido cardíaco. Por outro lado, um único estudo utilizando o etarnecept (TNFR2 solúvel), como proposta para bloqueio da ação de TNF, em hamsters infectados pelo T. cruzi sugeriu piora na CCC experimental com alterações ecocardiográficas e redução de sobrevivência (Bilate et al., 2007). Contudo, não houve redução do mRNA de TNF no ventrículo esquerdo. Este aparente paradoxo enfatiza a necessidade de se compreender os mecanismos de ação dos fármacos bem como o papel do TNF e os fatores limitantes das novas ferramentas terapêuticas que o tem como alvo (Wong et al. 2008). Neste sentido, nós mostramos que o uso da terapia anti-TNF usando infliximab na fase crônica da infecção pelo T. cruzi não reativa a parasitemia nem exacerba o parasitismo já controlado. Além disso, a terapia imunorreguladora melhora as alterações eletrocardiográficas e reduz os danos ao tecido cardíaco. Em paralelo à redução da expressão de mRNA de TNF no tecido cardíaco e dos baixos níveis séricos de TNF, a terapia com infliximab reposicionou a resposta imune favorecendo a expressão de IL-10, reduzindo a atividade citotóxica de 156 células T CD8+ parasito específicas, enquanto a produção de IFNγ manteve-se preservada. A frequência de células CD4+ e CD8+ esplênicas expressando o receptor 1 de TNF (TNFR1) foi reduzida. Além disso, nos camundongos tratados com infliximab houve redução no número de células CD8+ infiltrando o tecido cardíaco, bem como o número de células Pfn+, entretanto o número de células IFNγ+ não foi alterado. Anteriormente, a terapia com anti-TNF (infliximab) foi associada à redução do número de células T de memória efetora (CD8+CCR7-CD45RA+) que expressam perforina e granulisina na infecção por Mycobacterium tuberculosis (Miller & Ernst, 2009). Na infecção pelo T. cruzi, a presença de células Pfn+ na inflamação cardíaca, provavelmente sustentada por TNF (uma vez que tratando com anti-TNF as mesmas diminuem), é peça-chave na patogênese da CCC (Silverio et al., 2012). Após a infecção, o próprio TNF pode desencadear e/ou manter o circuito inflamatório sistêmico e cardíaco não benéficos, o que pode contribuir para a patogênese da CCC, trazendo a citocina TNF como um ponto central no desequilíbrio imunológico relacionado à forma cardíaca da DC. Na CCC, o infiltrado inflamatório cardíaco é composto principalmente de células mononucleares, em especial os linfócitos T CD8+ (Higuchi et al., 1997), reproduzido experimentalmente em camundongos infectados com a cepa Colombiana do T. cruzi (dos Santos et al., 2001; Silverio et al., 2010; Silverio et al., 2012). Anteriormente propusemos que uma ferramenta terapêutica adequada poderia interferir com as subpopulações distintas de células T CD8+ melhorando a lesão cardíaca (Silverio et al., 2012) e, como vimos anteriormente, essa modulação pode ser dependente da (ou apenas ter uma alça na) regulação de TNF/TNFR1. Então, lançamos mão da PTX, um agente imunorregulador não esteróide com efeitos hemorreológicos que tem sido usado em uma gama de doenças infecciosas, vasculares e condições inflamatórias inibindo a síntese de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF, (Windmeier & Gressner 1997; Rauchhaus, 2000; Martín et al., 2003). Em doenças parasitárias PTX já foi sugerida como adjuvante para o tratamento de leishmaniose cutânea e malária (Lessa et al., 2001; Báfica et al., 2003; Muniz-Junqueira, 2007). É importante salientar que este é o primeiro estudo usando a PTX para o tratamento da fase crônica da infecção pelo T. cruzi. Anteriormente, PTX foi utilizada na fase aguda da DC e mostrou uma redução na extensão das áreas de necrose e do número de células TNF+ no baço (Andrade et al., 2008), porém nenhum outro efeito benéfico foi relatado 157 em relação à sobrevivência (todos os animais de todos os grupos estavam mortos de 1213 dpi), sobretudo não foi avaliado o efeito da PTX em relação à função cardíaca, principal alvo de interesse nesta infecção (Lannes-Vieira et al., 2009, Rassi Jr. et al., 2010). Em ambos os modelos experimentais de CCC, moderada (C57BL/6) e grave (C3H/He), a administração de PTX teve um efeito benéfico não só em diminuir a progressão da CCC, mas também revertendo as alterações já instaladas, restaurando a condução elétrica do coração. PTX foi previamente mostrada ter efeitos benéficos na falha cardíaca isquêmica aumentando a FEVE em pacientes (Sliwa et al., 2004). No nosso estudo vimos que a infecção de camundongos C57BL/6 com a cepa Colombiana do T. cruzi leva a dilatação das câmaras do coração, com aumento de massa e perda de FEVE. Assim, o tratamento destes animais com PTX reduziu as áreas ventriculares e aumentou a FEVE mostrando o efeito benéfico de PTX em uma condição diferente das outras já estudadas (no caso, uma cardiopatia de natureza inflamatória e parasitária). No presente trabalho, a terapia com PTX apresentou excelentes resultados, reduzindo a distância entre as Cx43, diminuindo fibrose e os níveis de atividade de CKMB no soro em animais de ambos os modelos de CCC. Mais importante, nem a administração de anti-TNF (infliximab), nem de a de PTX influenciaram no parasitismo cardíaco, mas melhoraram a função cardíaca e a condução elétrica nos camundongos revertendo significativamente o dano cardíaco já instalado, suportando que a inflamação persistente associada à lesão cardíaca (Freitas et al., 2005) é dissociada da resposta imunológica eficaz que contribui para o controle dos parasitos (Marino et al., 2004; Medeiros et al., 2009). Na CCC existe a busca por terapias efetivas, como o uso do antagonista parcial de CCR1/CCR5 - o MetRANTES - em modelos experimentais, já mostrou ser capaz de reduzir a deposição de FN no tecido cardíaco nas fases aguda e crônica da infecção pelo T. cruzi (Marino et al., 2004, Medeiros et al., 2009), algo também mostrado no tratamento com a droga tripanossomicida Bz (Andrade et al., 1991). O uso de MetRANTES na fase crônica também levou à redução dos níveis da atividade de CK-MB no soro e à preservação das fibras cardíacas, com distribuição regular das Cx43 (Medeiros et al., 2009) no tecido cardíaco dos camundongos infectados pelo T. cruzi. No modelo de infecção in vitro de células musculares cardíacas cultivadas em monocamada, o uso de Amiodarona, um fármaco antiarrítmico indicado para pacientes com sintomatologia cardíaca da DC e que apresenta propriedades antiT. cruzi (Benaim et al., 2006), também restaurou a expressão de Cx43 nos 158 cardiomiócitos e ainda restabeleceu a contratilidade espontânea destas células (Adesse et al., 2011). Camundongos A/J infectados com a cepa Brazil do T. cruzi e tratados na fase aguda com o inibidor da enzima conversora de angiotensina, captopril, apresentaram redução da fibrose e inflamação cardíaca, sem alteração do parasitismo (Leon et al., 2003). Outro fármaco já no mercado, a sinvastatina, que além dos efeitos nos níveis de colesterol apresenta propriedades anti-inflamatórias, também já foi testada em modelos murinos (Silva et al., 2012) e caninos (Melo et al., 2011) de infecção pelo T. cruzi mostrando ser capaz de diminuir o infiltrado inflamatório no tecido cardíaco. Recentemente, ao estudar pacientes com a forma cardíaca da DC em uma coorte do estado de Pernambuco mostramos que pacientes tratados com cardioprotetores (inibidores de ECA e outros) apresentam redução dos níveis séricos de TNF, quando comparados aos que não fazem uso deste tipo de fármaco (Marinho et al., em preparação). Juntos, estes trabalhos buscam uma alternativa viável para o tratamento da CCC, visando uma melhora dos sintomas clínicos e principalmente uma maior qualidade de vida para o paciente cardiopata. A esplenomegalia é caracterizada pela persistente ativação policlonal de células T e B no baço (Minoprio et al., 1986). Esta está presente na infecção pelo T. cruzi, tanto na fase aguda (Kierszenbaum & Hayes, 1980) quanto na fase crônica (Pereira et al., 1999) da infecção e tem como resultado o aumento da quantidade de células ativadas do baço. A terapia com PTX reduziu significativamente o peso relativo do baço, indicando que os animais tratados não apresentaram a esplenomegalia intensa como os animais não tratados (NT) ou que receberam o veículo do tratamento (salina). Esses dados corroboram dados anteriores (Kroll-Palhares et al., 2008), que mostram que a esplenomegalia na infecção pelo T. cruzi está associada à sinalização TNF/TNFR1, uma vez que PTX reduziu a expressão de TNFR1 (mas não alterou a expressão de TNF) no tecido cardíaco e a frequência de células T CD8+ expressando este receptor. Anteriormente, a administração de PTX foi mostrada reduzir a expressão de TNFR1 em hepatócitos (Mahmoud et al., 2012), indicando que este efeito não se restringe particularmente a um tipo celular. Em pacientes com DC, as células T CD8+ mostram fenótipos anormais de ativação marcados por baixa expressão de CD8 e TCR (Albareda et al., 2006). Embora em camundongos cronicamente infectados com a cepa Colombiana não foram detectadas alterações na frequência de células T CD8+ esplênicas e na densidade de moléculas de CD8 na superfície das células, a baixa 159 modulação na expressão do TCRαβ em células T CD8+ foi notada, corroborando dados anteriores (Grisotto et al., 2001). Em camundongos tratados com PTX a frequência de células expressando TCR e a densidade de TCRαβ na membrana celular foram restauradas para intensidades semelhantes aos camundongos controles não infectados. Nas células T naïve, o complexo TCR é constitutivamente internalizado e rapidamente volta para a superfície celular. No entanto, por um processo molecular ainda não completamente compreendido, a estimulação antigênica aumenta a retenção/degradação do TCR baixando a densidade do mesmo na superfície celular em associação com a função efetora reduzida (Jang et al., 2003; James et al., 2010). Portanto, na infecção crônica pelo T. cruzi a terapia com PTX pode interferir com o processamento do TCR e restaurar a capacidade de células T CD8+ para responder aos sinais de ativação, mas isto deve ser melhor explorado. As células T CD8+ tem um importante papel na resistência à infecção pelo T. cruzi (Rodrigues et al., 2003). Portadores de DC apresentam aumento significativo na frequência de células T CD8+ com perfil de memória/efetora (CD45RACCR7-), suportando um estímulo contínuo por antígenos dos parasitos (Albareda et al., 2006). De forma semelhante, o aumento da frequência de células T CD8+ com perfil de memória/efetora (CD45RA-CCR7-) foi detectado em camundongos C57BL/6 cronicamente infectados pelo T. cruzi. A terapia com PTX não interferiu com a frequência destas células, suportando que os animais tratados são potencialmente propensos a controlar patógenos invasores (Sallusto et al., 1999). Por outro lado, a terapia com PTX restaurou o compartimento de células T CD8+ naive (CD45RA+CCR7+), restaurando potencialmente a homeostase e permitindo a resposta imune a novos estímulos. Durante a infecção crônica pelo T. cruzi há um aumento significativo na frequência de células CD8+ com o fenótipo de ativação, ou seja, células expressando CD44+CD62L-, corroborando dados anteriores mostrando este efeito durante a infecção aguda (Paiva et al., 1999). A terapia com PTX diminuiu a frequência de células CD8+ expressando CD44+CD62L- e aumentou a frequência de células CD8+ CD44-CD62L+. Portanto, PTX interferiu com o perfil de memória/ativação das células esplênicas. Na CCC, os infiltrados inflamatórios no tecido cardíaco são compostos principalmente por células mononucleares, em especial linfócitos T CD8+ (Higuchi et al., 1997), e não estão diretamente relacionados à intensidade do parasitismo, diante da escassez de parasitas, mas aparentemente com a persistência destes, como reproduzido 160 nos camundongos infectados com a cepa Colombiana do T. cruzi (dos Santos et al., 2001, Medeiros et al., 2009, Silverio et al., 2012). Neste trabalho, mostramos que a terapia com PTX alterou significativamente o número e a composição de células inflamatórias no tecido cardíaco. Considerando o possível papel dos distintos perfis de células T produtoras de IFN e Pfn, respectivamente, no controle do T. cruzi e nos danos ao tecido cardíaco (Michailowsky et al., 2001; Silverio et al., 2010; Silverio et al., 2012) e as ferramentas imunológicas disponíveis (peptídeos imunodominantes H2-Kb restrito ao antígeno ASP2 do T. cruzi e camundongos imunodeficientes com background B6), adotamos o modelo de CCC moderada (C57BL/6) para explorar o efeito das diferentes estratégias terapêuticas sobre essas células. Analisamos a influência de PTX na resposta imune sistêmica específica do parasito e a composição diferencial de células inflamatórias infiltrantes no tecido cardíaco. Os nossos resultados mostraram que os camundongos cronicamente infectados tratados com PTX mantiveram o status de IFNγ produzido por células CD8+ que reconhecem o peptideo imunodominante H-2Kb ASP2 VNHRFTLV. Um número reduzido de células Pfn+ foi detectado no coração dos camundongos tratados, enquanto que o número de células de IFNγ+ manteve-se inalterado quando comparado aos camundongos infectados controles, dados semelhantes à terapia com infliximab. Considerando o papel funcional das células inflamatórias que infiltram o tecido cardíaco, há uma boa correlação entre o número de células IFNy+ e células T CD8+ de portadores de DC que apresentam controle dos parasitos (Reis et al., 1997). Por outro lado, as células infiltrantes Pfn+, provavelmente a maioria delas células T CD8+ que atuam como CTL, estão relacionadas aos danos no tecido cardíaco durante a CCC experimental (Silverio et al., 2010; Silverio et al., 2012). De maneira interessante, os estudos em pacientes com CCC grave mostraram que a presença de células expressando granzima A, um outro componente da maquinaria lítica de células de CD8+ com atividade citotóxica, nas lesões do tecido cardíaco (Reis et al., 1993). Além disso, camundongos deficientes em Pfn apresentaram menor atividade de CK-MB no soro e redução na perda de expressão de Cx43, paralelo à diminuição das anormalidades elétricas (Silverio et al., 2010). As células CD8+Pfn+ já foram mostradas ter maior capacidade de migrar para o tecido cardíaco, uma vez que co-expressam alta frequência de CCR5+LFA-1+ como consequência, lesioná-lo (Silverio et al., 2012). Na infecção pelo T. cruzi há aumento na frequência de células T CD8+CCR5+LFA-1+ no baço (Medeiros et al., 2009), o tratamento com PTX reduz a freqüência destas células, 161 potencialmente capazes de migrar para o tecido cardíaco, além de tornar esse tecido menos permissivo à entrada destas células, uma vez que reduz a expressão de ICAM-1, ligante de LFA-1, no endodélio. Um trabalho anterior demonstrou, em modelo de injúria pulmonar, o efeito benéfico de PTX reduzindo a expressão de ICAM-1 no tecido alvo da injúria, o pulmão (Zhang et al., 2010). Assim, estes dados podem explicar o menor número de células inflamatórias no tecido cardíaco e também a redução do número de células Pfn+ neste sítio e, consequentemente, menos lesão. Consensualmente, a persistência do parasito e a desregulação da resposta imune contribuem para a patogenia da CCC (Lannes-Vieira et al., 2009, Dutra et al., 2009). A terapia com Bz (100 mg/kg/dia), iniciada na infecção aguda impediu as anormalidades elétricas na fase crônica (Garcia et al., 2005). Como a terapia com PTX mostrou-se benéfica na CCC, mas o parasitismo persistiu, elaboramos uma terapia combinada usando PTX com dose sub-ótima (25 mg/kg/dia) de Bz, para minimizar possíveis efeitos colaterais (Guedes et al., 2011). A terapia combinada pode ser uma valiosa alternativa para melhoria da eficácia terapêutica, uma vez que: (i) permite o uso de pelo menos dois compostos que podem atuar sobre diferentes elementos celulares e vias metabólicas; (ii) pode reduzir as concentrações das drogas e o número de doses, contribuindo assim para a diminuição dos efeitos tóxicos; (iii) pode minimizar o risco de resistência às drogas (Vivas et al., 2008). Durante a infecção crônica, Bz deverá desempenhar seu papel tripanossomicida bem como dar suporte ao controle do desbalanço imunológico, uma vez que já foi descrito ter atividades imunomoduladoras (Ronco et al., 2011). Embora as terapias com PTX, Bz e Bz+PTX tenham melhorado e até mesmo revertido os aspectos da CCC, a única terapia que sustentou a reversão nas alterações eletrocardiográficas após a interrupção do tratamento foi a associação das drogas PTX+Bz, enfatizando a complexidade dos fatores que contribuem para a CCC. Em contraste com a PTX, que não teve nenhum efeito, Bz reduziu a carga parasitária no tecido cardíaco e a parasitemia. Entretanto, na terapia associada (PTX+Bz), vimos que PTX não interferiu com a eficácia de Bz em controlar os parasitos. Ainda, os camundongos tratados com Bz e PTX+Bz apresentaram redução na expressão de mRNA de TNF no coração e diminuição dos níveis de NOx e sTNFR1 no soro. Então especulamos que Bz complementa os efeitos da PTX quer por controlar diretamente o T. cruzi ou agindo de forma indireta, pois além do seu papel adjuvante na resposta imunológica efetora em matar o parasita, Bz pode atuar como um imunomodulador, por 162 exemplo, através da diminuição da expressão do fator de transcrição NF-kB, que é fundamental para a produção de TNF (Ronco et al., 2011). De forma importante, TNF favorece a infecção pelo T. cruzi (Pinto et al., 2011). Assim, a redução da expressão de TNF por Bz também pode interferir neste circuito em que TNF alimenta o parasitismo. A gravidade da DC foi associada com níveis elevados de NO (Pérez-Fuentes et al., 2007) e NO tem sido implicado na lesão cardíaca em macacos e camundongos (Carvalho et al., 2012) infectados pelo T. cruzi. Embora, NO seja um agente tripanossomicida na infecção aguda (Silva et al., 2003), sua redução durante a infecção crônica, particularmente após a terapia PTX+Bz, não altera o controle dos parasitos. Em 2012, Paiva e colaboradores mostraram que o estresse oxidativo contribui para a persistência do parasito nas células do hospedeiro e mais recentemente mostrou-se que TNF e NO favorecem a infecção de astrócitos pelo T. cruzi (Silva et al., 2015). Neste caso, o uso de anti-oxidantes pode ser benéfico. Os mecanismos subjacentes a melhoria da condição do coração após a terapia PTX+Bz permanecem incertos. É possível que os efeitos positivos desta terapia combinada sejam devido a intervenção em um circuito não benéfico desencadeada por um aumento de TNF na infecção pelo T. cruzi, o qual pode promover a expressão de TNFR1 e o TNF sinalizando via TNFR1 são combustíveis para a produção de NO. Assim, a terapia combinada seria uma proposta para interferir racionalmente neste circuito, com o objetivo de melhorar o prognóstico da CCC. Terapias combinadas não são novidade, infecções crônicas como a tuberculose (Nahid et al., 2006), a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) (Simon et al., 2006), a malária (Ngasala et al., 2011) e tripanossomíase africana (Priotto et al., 2009) já adotam esta estratégia em seus tratamentos. Na infecção pelo T. cruzi o uso concomitante de uma ou mais drogas vem sendo proposto, quer seja usando drogas com alvo no parasito (Ribeiro et al., 2009), quer seja usando drogas com diferentes alvos, como parasito e sistema imunológico (Lannes-Vieira et al., 2010), para minimizar os efeitos colaterais e otimizar o tratamento. A combinação de cetoconazol e Bz foi testada para tratar camundongos infectados com diferentes cepas do T. cruzi (cepa CL, Y e Colombiana) mostrando ser somente efetivo (teste parasitológico e sorológico) para as cepas CL e Y (Araújo et al., 2000). Clomipramina e alopurinol foram utilizados para o tratamento da infecção aguda experimental pelo T. cruzi impedindo a evolução da cardiopatia crônica (Rivarola et al., 2001). Recentemente, clomipramina foi associada a 163 Bz para o tratamento de fase aguda em camundongos Swiss infectados com a cepa Tulahuen do T. cruzi reduzindo a mortalidade, a parasitemia e o infiltrado inflamatório no tecido cardíaco (Strauss et al., 2013). Além disso, Bz e posaconazol foram administrados individualmente ou em combinação em modelo murino de infecção aguda, mostrando que o curto tratamento (7 dias) a combinação de drogas tem mais eficácia em reduzir a parasitemia que as drogas usadas isoladamente (Diniz et al., 2013), ressaltando a importância de se estudar terapias combinadas. A fibrose é um marco da CCC (Andrade et al., 1989; Andrade et al., 1991; Marino et al., 2003). Um efeito marcante observado nas terapias com PTX, Bz e PTX+Bz foi a redução da deposição de FN. Essa possível reversão da fibrose no tecido cardíaco já fora descrita na terapia com Bz e MK-436 (3-(1-methyl-5-nitroimidazol-2yl)-3a,4,5,6,7,7a-hexahydro1,2-benzisoxazole) na fase crônica da infecção pelas cepas 21SF e Colombiana do T. cruzi (Andrade et al., 1991), o que revelou ser a fibrose cardíaca induzida pela infecção pelo T. cruzi um processo reversível. A PTX é um dos vários agentes que tem sido estudado como terapia potencial antifibrogênica. Estudos in vitro realizados em fibroblastos dérmicos sugerem que a PTX pode exercer um efeito antifibrogênico, reduzindo a proliferação celular, diminuindo a síntese de componentes da matriz extracelular (incluindo colágeno tipo I, colágeno tipo III, e glicosaminoglicanos), e aumentando a atividade da colagenase (Berman & Duncan, 1989; Duncan et al., 1995). O que nos leva a especular que PTX (sozinha ou combinada a Bz) pode estar, de fato, revertendo a fibrose em nossos modelos de CCC, visto que este fármaco já mostrou possuir propriedades antifibrogênicas em outros modelos, como de fibrose hepática in vitro (Windmeier & Gressner, 1996) e in vivo (Peterson, 1993). Tanto Bz quanto PTX, sozinhos ou combinados, reduziram a expressão de TNFR1 no tecido cardíaco. Embora TNFR1 participe do controle do T. cruzi durante a infecção aguda (Aliberti et al., 2001), a ausência de TNFR1 na fase crônica não interferiu com o controle do parasito. TNF, atuando em TNFR1, mas não em TNFR2, agrava a insuficiência cardíaca induzida por ligação coronariana em modelos experimentais (Hamid et al., 2009). Na cardiopatia experimental induzida por angiotensina II, TNFR1 contribuiu para a fibrose cardíaca, aumentando a expressão de mRNA para colágeno tipo I e III no tecido cardíaco (Duerrschmid et al., 2013). Diante de nossos dados e da literatura, TNF atuando via TNFR1 parece estar relacionado à perda da expressão de Cx43 e ao depósito de matriz extracelular (fibrose). Receptores 164 solúveis do TNF podem ser poderosos preditores de mortaliadade em pacientes com IC (Rauchhaus et al., 2000; Deswal et al., 2001). Além disso, esses receptores já foram mostrados refletir a manifestação sistêmica da gravidade da IC congestiva em pacientes (Nozaki et al., 1997), o que demonstra a importância da identificação e possivelmente modulação destes receptores em doenças cardíacas em geral. Considerando que a doença isquêmica cardíaca é a principal causa de mortalidade no Brasil e no mundo, e que a sua prevalência está aumentando, é importante aprofundar o estudo acerca dos biomarcadores laboratoriais úteis na avaliação diagnóstica e na estratificação de risco, por exemplo para o infarto agudo do miocárdio. Neste sentido, vários marcadores têm apresentado eficácia na detecção da necrose, isquemia, inflamação e disfunção cardíaca, dentre eles a troponina, mioglobina, CK-MB, proteína C reativa, peptídeo natriurético tipo B, moléculas de adesão e até mesmo as citocinas, como IL-6 e TNF (revisado em Silva & Moresco, 2011). Biomarcadores também são potencialmente úteis para avaliar a eficácia do tratamento e progressão da DC. Recentemente, vários marcadores de prognóstico e progressão para T. cruzi foram descobertos e descritos, incluindo moléculas do parasito, como as tGPI-mucinas, e moléculas do sistema imune do hospedeiro, como IFNγ e IL-10, mas apenas alguns deles foram avaliadas após tratamento específico (revisado em Pinazo et al., 2015). O ECO permite quantificar a lesão miocárdica com grande potencial para avaliação da morbidade e do prognóstico dos pacientes com DC. Esse método complementar permite melhor estratificação de risco, com impacto no manejo clínico da CCC (Nunes et al., 2010). Estudos prévios registraram anormalidade precoce do relaxamento ventricular esquerdo em portadores da DC (Barros et al., 2001; Caeiro et al., 1985). O acúmulo de fibras colágenas intersticial na CCC pode, inicialmente, determinar alterações no relaxamento ventricular e, progressivamente, reduzir a complacência miocárdica causando aumento da pressão atrial esquerda. A disfunção diastólica causa estiramento dos cardiomiócitos, levando ao remodelamento ventricular e intensa ativação neuro-hormonal (Barbosa et al., 2007). Esses fatores contribuem para a evolução desfavorável da CCC. Assim, a disfunção diastólica é um importante marcador de gravidade da DC (Nunes et al., 2009; 2010). No conhecimento da história natural da DC, alterações no ECG precedem o aparecimento de sintomas (Garzon et al., 1994). Estudando anormalidades no ECG e sua relação com função ventricular sistólica (volumes ventriculares e FE pela angiografia) na DC, observa-se uma relação entre a 165 diminuição da função sistólica ventricular esquerda com a progressão e associação de anormalidades no ECG, como arritmias ventriculares (Casado et al., 1990). Sendo o ECO e o ECG técnicas não invasivas, estas se mostram potentes ferramentas para o diagnóstico e acompanhamento dos pacientes com DC. Em relação a DC há necessidade de se encontrar drogas eficientes e menos tóxicas para agir especificamente contra o patógeno (Coura & Castro, 2002). Vários estudos observacionais têm mostrado que os pacientes crônicos submetidos ao tratamento antiparasitário com Bz, embora não obtenham a cura parasitológica, tiveram uma redução significativa na ocorrência de alterações eletrocardiográficas e menor frequência de piora na sua condição clínica (Viotti & Vigliano 2007). Entretanto, Bz possui algumas limitações como efeitos colaterais indesejáveis, longo protocolo de tratamento e eficácia limitada (Dias & Dessoy 2009; Becerra et al., 2012). A busca por novos compostos para o tratamento da DC é estimulada. Fármacos para seu tratamento não são do interesse das indústrias farmacêuticas, estando na raiz do problema o elevado custo dos investimentos e a falta de um mercado potencial. Nos últimos 25 anos, apenas 1% de todos os medicamentos desenvolvidos foi para tratar alguma doença negligenciada (Chirac & Torreele, 2006). Aparentemente, os inibidores da biossíntese de ergosterol são os candidatos mais promissores para novos tratamentos da DC (Urbina, 2009). O D0870 (Zeneca Pharmaceuticals, Macclesfield, UK) e o SCH56592 (posaconazol, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA), com atividade inibitória seletiva na biossíntese de novos esteróides no parasito mostraram-se ativos contra cepas do T. cruzi resistentes a Bz e nifurtimox e mantiveram sua atividade mesmo em hospedeiros imunossuprimidos (Urbina, 2002). Entre camundongos tratados com D0870, verificou-se cura parasitológica em 70% a 90%, além de uma menor incidência de morte (Urbina et al, 1996; Molina et al., 2000). O DO870 foi capaz de curar 70% a 100% de camundongos infectados na fase aguda com várias cepas do T. cruzi, incluindo a Colombiana, ao passo que, na fase crônica, a taxa de cura parasitológica foi de 30% a 45%. O Posaconazol, um análogo do itraconazol, pode eliminar seletivamente amastigotas intracelulares do T. cruzi em cultura de cardiomiócitos e permite a completa reorganização do citoesqueleto da célula hospedeira e do aparelho contrátil (Silva et al., 2006). Recentemente, posaconazol se mostrou eficiente no tratamento de paciente com a forma crônica da DC (Pinazo et al., 2010). Está previsto um estudo clínico de fase II com o Pozaconazol na Espanha, 166 financiado pela Merck & Co (Buckner e Navabi., 2010). O ravuconazol é outro triazol com potente atividade antifúngica in vitro e in vivo, sendo comparável ou superior a outros triazóis, como o posaconazol. A atividade do ravuconazol na dose de 15mg/Kg na infecção experimental aguda causada por diferentes cepas do T. cruzi resistentes a nitrofurano e nitroimidazol, foi capaz de induzir cura parasitológica em todos os animais infectados com a cepa CL e em 58% dos animais infectados com cepa Y; em animais infectados com a cepa Colombiana, não houve cura. Outro triazol, o cetoconazol, suprimiu a parasitemia entre animais infectados com cepas CL e Y, porém, em camundongos infectados com a cepa Colombiana, a parasitemia reincidiu em 35 dias (Urbina et al , 2003). Uma série de estudos clínicos randomizados (BENEFIT, TRAENA, CHAGAZOL, STOP CHAGAS, E1224, revisados em Urbina et al., 2014) foram lançados na última década para avaliar a segurança e eficácia do Bz e dois inibidores da biossíntese do ergosterol, posaconazol e ravuconazol. Os primeiros resultados indicam que Bz é eficaz na indução de uma redução acentuada e prolongada no nível dos parasitos circulantes na maioria dos pacientes, mas os efeitos adversos podem levar ao abandono do tratamento em 10-20% dos casos. Inibidores da biossíntese do ergosterol são melhor tolerados, mas sua eficácia na duração da dose de tratamento utilizado nos estudos iniciais foi significativamente menor. As terapias combinadas emergem como perspectiva promissora, mas a falta de biomarcadores validados de resposta ao tratamento etiológico e eventuais curas parasitológicas em pacientes crônicos continuam a ser um desafio (Urbina et al., 2014). Apesar da potente atividade contra o T. cruzi dos inibidores da biossíntese do ergosterol e da ausência de resistência cruzada com as drogas utilizadas correntemente, a resposta ao tratamento é extremamente variável entre diferentes cepas do parasito (Guedes et al., 2004, Toledo et al., 2003, Molina et al., 2000, Diniz et al., 2010). Além disso, mesmo alguns compostos como o Posaconazol e o E1224, uma pró-droga do Ravuconazol já estarem em estudos clínicos o alto custo e a complexidade de produção são fatores limitantes na utilização desses compostos no tratamento humano (Urbina, 2009). Aqui, mostramos que mesmo usando 1/4 da dose recomendada de Bz, a carga parasitária (T. cruzi, cepa Colombiana) foi reduzida e as alterações elétricas, como arritmias e bloqueios átrio ventriculares, melhoradas, atestando a eficiência do uso de Bz na fase crônica da infecção experimental. 167 O desenvolvimento de novas terapias ou até mesmo o melhoramento das existentes e ainda uma vacina eficaz é um importante passo para a saúde pública em DC. Uma série de grupos está avançando no desenvolvimento de vacinas baseadas no uso do parasito atenuado, proteína purificada, proteína recombinante, DNA e, mais recentemente, bactérias deficientes na replicação e vetores virais recombinantes para reduzir parasitismo, inflamação aguda do coração e miocardite crônica (Paiva et al., 1999; Garg & Tarleton 2002; Dumonteil et al., 2004; Cazorla et al., 2009; Nogueira et al., 2011; Dumonteil et al., 2012; Gupta et al., 2013). Dois antígenos promissores de T. cruzi utilizados como candidatos vacinais são a proteína 2 de superfície de amastigota (ASP2) (Garg et al., 2002) e a trans-sialidase (TS) (Schenkman et al., 1994). A proteína ASP2, epítopo VNHRFTLV, é um membro da conservada família de proteínas trans-sialidases (Low et al., 1998). Mostrou-se imunodominante após a infecção de camundongos C57BL/6 com parasitos de diferentes cepas (Tzelepis et al., 2008) e foi descrita ter potente atividade indutora de CTL (Low et al., 1998). A ASP2 foi utilizada em preparações de vacina de DNA ou de proteína recombinante (Boscardin et al., 2003; Vasconcelos et al., 2004) e incorporada em adenovírus (Machado et al., 2006) mostrando serem capazes de induzir resposta específica de células T citotóxicas, reduzir parasitemia e aumentar sobrevivência. Recentemente, o nosso grupo demonstrou por ensaio ELISPOT que o número de células específicas para o peptídeo ASP2 VNHRFTLV produtoras de IFNγ e com atividade CTL foi mantido elevado, mesmo com a redução da parasitemia na infecção crônica pela cepa Colombiana do T. cruzi (Silverio et al., 2012). Já as TS compõem uma família de proteínas codificadas por mais de 1.400 genes e estão ligadas, em sua maioria, à membrana do parasita através de âncoras de GPI (El-Sayed et al., 2005; Freitas et al., 2011). Freire-de-Lima et al. (2010) demonstraram que o T. cruzi utiliza a TS para manipular a sialilação de células T CD8+ permitindo o escape do parasita do sistema imune e o estabelecimento da infecção no hospedeiro. Essas enzimas atuam especificamente removendo resíduos de ácido siálico ligados na posição α-2,3 de glicoproteínas, glicolipídeos e oligossacarídeos do hospedeiro, transferindo-os para moléculas aceptoras localizadas na superfície do parasita (Freire-de-Lima et al., 2010). Como uma mudança fisiológica, após a ativação, os linfócitos T CD8+ são desializados, aumentando a sua atividade efetora por modular a acessibilidade de seus receptores às moléculas de MHC de classe I (Moody et al., 2001; Daniels et al., 2001; Moody et al., 2003). No entanto, durante a infecção, o 168 T. cruzi utiliza a TS para resializar a superfície das células T CD8+, o que dificulta a interação antígeno-célula efetora, enfraquecendo a resposta imune celular (Freire-DeLima et al., 2010). Experimentos vacinais (vacina de DNA) em camundongo mostraram que TS induz resposta celular (mediadas por células T tanto CD4+ quanto CD8+) e humoral (Rodrigues et al., 1999). Aqui usamos o adenovírus recombinante humano tipo 5 (rAdHu5) transportando sequências dos antígenos de T. cruzi ASP2 e TS. A vacinação usando vetores virais recombinantes tem se tornado uma estratégia promissora para a indução de imunidade mediada por células T contra agentes infecciosos intracelulares (Miyahira, 2005). Estes vetores vacinais caracterizam-se pela alta capacidade de infecção, imunogenicidade e servem como veículos para endereçamento vacinal, tornando os antígenos disponíveis para a maquinaria intracelular de processamento antigênico e subsequente apresentação e consequentemente ativação de diferentes tipos celulares (Rocha et al., 2004). Recentemente, um ensaio clínico de fase 1 realizado na China testou os efeitos de uma vacina composta por diferentes concentrações (baixa e alta) de rAdHu5 expressando glicoproteínas do vírus Ebola Zaire 2014 em pacientes saudáveis. Uma única dose (alta concentração) da vacina foi capaz de induzir produção de anticorpos anti-glicoproteína e resposta específica de células T produtoras de IFNγ contra o vírus Ebola em 14 dias pós-imunização, mostrando que esta preparação foi segura (uma vez que nenhum efeito adverso significativo foi observado) e imunogênica (Zhu et al., 2015). A administração de rAdVax (rAdASP2 + rAdTS) em um protocolo de imunização profilática induziu imunogenicidade, resposta de células T CD8 específicas com atividade citotóxica e produtoras de IFNγ, além de reduzir o parasitismo cardíaco na fase aguda e as anormalidades elétricas na fase crônica. Diferentes estratégias já foram testadas para melhorar a resposta imune e sobrevivência na DC. Em estudo de Alencar e colaboradores (2009), camundongos A/Sn foram imunizados (com uma ou duas doses) com o rAdHu5 expressando ASP2 e duas semanas após a última dose de imunização os camundongos foram desafiados com 150 tripomastigotas sanguíneos da cepa Y do T. cruzi. O pico da parasitemia foi maior nos camundongos imunizados com uma dose da vacina, quando comparado àqueles que receberam duas doses. A sobrevivência também diferiu significativamente entre os grupos de camundongos imunizados com duas doses de AdASP2 em comparação com os animais injetados apenas uma vez (P < 0,001), indicando que a imunidade protetora nos camundongos que 169 receberam a dose de reforço foi elevada. Machado e colaboradores (2006) demonstraram que duas imunizações sequenciais com o rAdHu5 expressando ASP2 e TS foram capazes de reduzir significativamente a parasitemia e melhorar a sobrevivência dos camundongos vacinados, quando eles foram desafiados com a cepa Y do T. cruzi. Estes dados nos encorajaram a testar o protocolo homólogo de indução e reforço (prime-boost) como estratégia profilática e terapêutica para retardar a progressão da doença. Este trabalho foi o primeiro a propor uma vacina terapêutica para a CCC. Na vacinação terapêutica observamos o aumento da sobrevida e redução das anormalidades elétricas após o prime (análise de 160 dpi) e boost (análise em 180 e 230 dpi). Na pósterapia os camundongos apresentaram menos lesão cardíaca, refletido pela redução na deposição de FN, menor distancia entre as Cx43 e atividade sérica de CK-MB; e ainda apresentaram menores anormalidades elétricas em comparação com os camundongos analisados na pré-terapia. Em relação a resposta imune, a vacinação terapêutica com rAdVax (i) preservou a imunidade específica mediada por IFNγ, mas reduziu a resposta a estímulos policlonais (anti-CD3 mais anti-CD28) e (ii) diminuiu a frequência de células T CD8+CD107a+. Além disso, a terapia com rAdVax reposicionou a resposta imune no tecido cardíaco, reduzido o número de células Pfn+, preservando o número de células IFNγ+, que tiveram a expressão de seu mRNA aumentado. O efeito benéfico da imunoterapia com rAdVax pode residir na relação favorável entre IFNγ/Pfn. Ainda no tecido cardíaco, a vacinação com rAdVax reduziu a expressão de mRNA de iNOS e baixou os níveis de NO no soro. iNOS/NO têm sido implicados na lesão cardíaca em macacos e camundongos infectados com T. cruzi (Carvalho et al., 2012) e associado com a gravidade da DC (Pérez-Fuentes et al., 2007). Imunizações sequenciais são questionadas quanto ao risco de que os anticorpos anti-vetor gerados após a primeira dose podem neutralizar o vetor quando ele é usado na dose reforço e, consequentemente, a resposta imune seria dificultada. Contudo, recentemente, uma vacina para tuberculose utilizando o rAdHu5 expressando um antígeno dominante do M. tuberculosis (Ag85A - AdHu5Ag85A) demonstrou ser segura e fortemente imunogênica. Não houve correlação entre anticorpos IgG antirAdHu5 preexistentes e anticorpos neutralizantes ou entre a magnitude da ativação de células T induzidas pela vacina e os títulos de anticorpos neutralizantes rAdHu5 préexistentes (Smaill et al., 2013). Além disso, os anticorpos neutralizantes pré-existentes 170 não afetaram a imunogenicidade de uma vacina contra a malária baseada no uso de rAdHu5 (Tamminga et al., 2011). No presente trabalho, a dose de reforço foi importante para reduzir significativamente os níveis de NOx no soro, paralelamente, os camundongos que receberam duas doses de rAdVax apresentaram redução do dano cardíaco, anormalidades elétricas de menor gravidade e maior sobrevivência. Isto nos sugere que o protocolo homólogo prime-boost usando rAdVax pode ser uma alternativa racional para reprogramar a resposta imune e recuperar a lesão tecidual e funcionalidade cardíaca na DC crônica. Parcerias à nível mundial tem unido esforços para a elaboração de uma vacina efetiva para da DC (Dumonteil et al., 2013). Recentemente, uma vacina de DNA codificando os antígenos TSA-1 e TC24 do T. cruzi foi testada num modelo canino de infecção aguda. Os cães foram imunizados com duas doses de 500 g de vacina de DNA, com duas semanas de intervalo entre as mesmas, em seguida foram infectados por T. cruzi (cepa SylvioX10) duas semanas após a segunda dose da vacina. Um outro grupo de cães foi infectado e tratado com a vacina nos dias 15 e 30 pós infecção. Ambos os protocolos de vacinação preventiva e terapêutica na fase aguda reduziram significativamente a parasitemia, inflamação cardíaca e carga parasitária no tecido cardíaco e ainda mantiveram os níveis de IG anti-T. cruzi. Na vacina terapêutica foi observado um aumento dos níveis séricos de IFNγ, entretanto outras alterações imunológicas não foram abordadas e ainda as alterações eletrocardiográficas não foram estatisticamente significativas, provavelmente devido ao pequeno número de animais. Porém os dados prévios levaram os autores a sugerir que esta vacina de DNA codificando os antígenos TSA-1 e Tc24 pode ser um candidato à vacina veterinária (Quijano-Hernández et al., 2013). Uma outra estratégia de vacina profilática foi testada em camundongos C57BL/6 imunizados com vacina de DNA contendo TcG2/TcG4 (proteínas altamente conservadas entre as cepas do T. cruzi) em um protocolo DNA prime/proteína-boost. Os camundongos foram desafiados com a cepa Sylvio X10/4 do T. cruzi em 120 ou 180 dias pós-vacinação. A vacina reduziu em 2-3 vezes a carga parasitária e forneceu imunidade anti-T. cruzi a longo prazo, uma vez que induziu uma potente atividade nas células T citotóxicas e estimulou predominantemente o fenótipo de células T CD8+ de memória efetora (CD44+CD62L-), capaz de responder ao desafio com o T. cruzi 4-6 meses após o boost com rápida expansão de um fenótipo de células poli-funcionais (CD107a+IFNγ+Pfn+), que levou a redução da carga parasitária no tecido 171 (Gupta & Garg et al., 2015), porém a integridade e a função cardíaca não foram exploradas neste trabalho. Tantas intervenções variáveis podem gerar certo grau de ceticismo para o eventual desenvolvimento e produção de uma vacina contra a DC. Entretanto, alguns desses problemas podem ser mais acadêmicos que práticos e não necessariamente precisam ser resolvidos antes que uma vacina efetiva seja alcançada (Brener & Camargo et al., 1982). Ironicamente, há menos conhecimento acerca do genoma e proteoma do Schistosoma mansoni, causador da esquistossomose, e do Ancylostoma duodenale, causador da ancilostomose, em que há estudos clínicos da vacina em humanos em andamento, do que para a maioria das outras infecções em que nenhum estudo humano está em andamento, como a DC, demonstrando que o conhecimento técnico não é o fator limitante (Hotez & Ferris, 2006). Outro problema enfrentado pelas vacinas são os movimentos de resistência à vacinação. Com pouca ou nenhuma informação baseada em evidências científicas, ativistas anti-vacinas têm tentado influenciar toda uma geração de pais com medos e dúvidas sobre vacinas. As vacinas já foram associadas a todo tipo de problema, o autismo é um exemplo bem conhecido, uma vez que suas causas diretas não estão claras. A despeito da histeria e da cobertura da mídia, não há provas ligando as vacinas em uso a patologias. Na verdade, evidências epidemiológicas mostram que as vacinas evitam uma grande quantidade de doenças e mortes no mundo (Shelby & Ernst, 2013). Os benefícios de uma vacina potencial para T. cruzi em comparação com a utilização de agentes quimioterapêuticos padrão incluem toxicidade reduzida, permitindo a utilização expandida em pacientes crônicos e os doentes com comorbidades, uso potencial durante a gravidez para prevenir a transmissão congênita, uma maior proteção contra complicações cardíacas, e remoção de barreiras de tratamento associados com o esforço e custo de administrar tratamentos repetidos de drogas. A DC faz parte do grupo de doenças infecciosas consideradas “extremamente negligenciadas”, afetando milhões de pessoas em toda a América Latina. Embora recentes avanços tenham sido alcançados no controle da transmissão vetorial e transfusional, ainda existem problemas críticos, incluindo um tratamento efetivo para os casos crônicos da doença. Após quase um século do descobrimento da DC e, apesar do grande volume de trabalhos científicos envolvendo a biologia, imunologia e genética do T. cruzi, ainda não foi possível desenvolver novas e eficazes ferramentas terapêuticas 172 para as pessoas afetadas em diferentes pontos do globo. Aqui, voltamos nosso olhar para os casos crônicos da doença, em especial para o acometimento cardíaco. Desenvolvemos modelos experimentais que reproduziram aspectos críticos da CCC e que serviram de ferramenta para nossas perguntas. Em todos os trabalhos utilizamos o modelo de CCC moderada, que nos permite estudar a regeneração e também a evolução para a CCC grave. Nosso alvo é propor um tratamento para aqueles pacientes portadores da forma cardíaca cujo estadiamento do comprometimento miocárdico na CCC encontra-se nos grupos A-C (segundo a classificação do Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005), para que não progridam clinicamente e até mesmo obtenham reversão das alterações instaladas. Assim como o Consenso, vislumbramos a melhora da qualidade de vida e da sobrevida dos pacientes. Neste trabalho trouxemos várias alternativas para o tratamento da DC crônica, que vão de agentes imunorreguladores, passado pela quimioterapia, terapia combinada e chegando até a vacina, mostrando que é possível interferir racionalmente com os fatores não benéficos da DC e que a resposta imune é chave neste contexto. Como comparado por Hotez e colaboradores em 2012, a SIDA e a DC são duas condições crônicas causadas por patógenos sanguíneos que requerem tratamento caro e de longo prazo, para a qual não há cura ou vacina preventiva eficaz. Ambas as doenças afetam grande número de pessoas e produzem um fardo social e econômico substancial. Atualmente, o número de pessoas infectadas com o T. cruzi na América do Sul é estimado em mais de cinco vezes o número de pessoas infectadas com o HIV na mesma região; no entanto, o número global de infecções por HIV é maior do que o número de indivíduos infectados com T. cruzi (Rassi et al., 2010; Mahy et al., 2014). Ambas as doenças apresentam riscos de infecção para os destinatários de transfusão de sangue e doação de órgãos e aos filhos de mães infectadas não tratadas. Além disso, ambas as doenças são altamente estigmatizadas e afetam desproporcionalmente as pessoas que vivem na pobreza e não têm condições de buscar apoio médico e social necessário para manter a melhor qualidade de vida possível nestas condições. Estas comparações fazemse necessárias para aumentar a conscientização sobre a gravidade da DC e a necessidade de buscar alternativas para o controle da mesma. O futuro sucesso na luta contra a DC é dependente de uma gestão eficaz de focos infecciosos emergentes, manutenção de elevados níveis de consciência pública, interesse governamental no controle da doença, ferramentas terapêuticas, diagnóstico e vigilância. Lições aprendidas a partir dos 173 últimos 100 anos de luta contra a infecção pelo T. cruzi devem ser continuamente aplicadas e melhoradas para se obter um progresso contínuo e até mesmo chegar a eliminar a DC. 6. Conclusões ___________________________________________________________________________________ Neste estudo descrevemos dois modelos experimentais de CCC, um moderado (C57BL/6) e outro grave (C3H/He), que reproduzem aspectos relevantes da doença de Chagas. Mostramos que o desequilíbrio imunológico é ponto chave na manutenção da lesão cardíaca na infecção crônica pelo T. cruzi e que interferir neste ponto é benéfico no tratamento da CCC. Trazemos evidências de que TNF/TNFR1 não é crucial para o controle do parasito na fase crônica da infecção pelo T. cruzi, mas participa do mecanismo patogênico da lesão cardíaca. Na infecção crônica pelo T. cruzi os diferentes perfis de células T CD8+ (IFNγ – inflamatório / Pfn – citotóxico) são passíveis de modulação via tratamento farmacológico. Os nossos dados demonstram que interferir na inflamação e no agente etiológico da doença (terapia combinada) é uma estratégia terapêutica eficaz visando a não progressão ou, mesmo, a reversão da forma cardíaca crônica da DC. Propomos uma vacina terapêutica, como uma alternativa para reposicionar o status imunológico e, consequentemente, melhorar e/ou reverter aspectos patológicos que contribuem para a CCC. Juntos, os trabalhos mostram que é possível interferir na inflamação crônica não benéfica e manter o controle dos parasitos, seja usando fármacos imunorreguladores, seja usando vacina, associado ou não à droga tripanossomicida. Isto abre caminhos e possibilidades para o tratamento de fase crônica de pacientes com DC. 174 7. Perspectivas ___________________________________________________________________________________ Este trabalho trouxe as seguintes perspectivas: Caracterizar a participação da via de sinalização de TNF (TNFR1 e TNFR2) na patogenia da CCC experimental, estudando os mecanismos moleculares (vias: NFκB, PI3K/AKT, AMPK e mTOR) pelos quais TNF e seus receptores levariam à formação de lesão das células cardíacas e à cardiomiopatia chagásica crônica. Estudar os efeitos da inibição/ativação das vias NFκB, PI3K/AKT, AMPK e mTOR na expressão de TNF, seus receptores e as consequências biológicas para as células T CD8+ (proliferação, expressão de marcadores de memória/ativação/senescência, expressão de IFNγ e Pfn e padrão de migração celular), associando às alterações histológicas e funcionais cardíacas. Dar continuidade ao estudo da imunoterapia com rAdVax testando o protocolo experimental em outros modelos de infecção pelo T. cruzi (ex.: modelo canino), com o objetivo de termos uma vacina veterinária para a DC visando impactar o ciclo peridoméstico de transmissão da DC. Contribuir para a identificação dos alvos moleculares associados à patogenia da CCC, de modo a propor novas estratégias terapêuticas, incluindo a multiterapia com dois ou mais alvos terapêuticos, abordando o tripé sustentador da CCC (o parasito, a desregulação imunológica e as alterações cardíacas), com a finalidade de melhorar o prognóstico dos portadores da forma cardíaca crônica da DC. 175 8. Referências ___________________________________________________________________________________ Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. Imunologia Celular e Molecular. 4ª ed. Rio de Janeiro: Revinter, 2002. Abrahamsohn IA, Coffman RL. Cytokine and nitric oxide regulation of the immunosuppression in Trypanosoma cruzi infection. 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Anexos ___________________________________________________________________________________ 203 Durante a realização desta tese, participei das seguintes publicações: Navarro IC, Ferreira FM, Nakaya HI, Baron MA, Vilar-Pereira G, Pereira IR, Silva AM, Real JM, De Brito T, Chevillard C, Lannes-Vieira J, Kalil J, Cunha-Neto E, Ferreira LR. MicroRNA Transcriptome Profiling in Heart of Trypanosoma cruziInfected Mice: Parasitological and Cardiological Outcomes. PLoS Negl Trop Dis. 2015 Jun 18;9(6):e0003828. Daliry A, Pereira IR, Pereira-Junior PP, Ramos IP, Vilar-Pereira G, Silvares RR, Lannes-Vieira J, Campos De Carvalho AC. Levels of circulating anti-muscarinic and anti-adrenergic antibodies and their effect on cardiac arrhythmias and dysautonomia in murine models of Chagas disease. Parasitology. 2014 Nov;141(13):1769-78. Vilar-Pereira G, Silva AA, Pereira IR, Silva RR, Moreira OC, de Almeida LR, de Souza AS, Rocha MS, Lannes-Vieira J. 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