desenvolvimento de filmes à base de quitosana para

DESENVOLVIMENTO DE FILMES À BASE DE QUITOSANA
PARA LIBERAÇÃO TÓPICA PROLONGADA DE
NITROFURAL: SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA
Kátia S. C. R. dos Santos1,3*, Jivaldo R. Matos2 , Elizabeth I. Ferreira3
1*
Departamento de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – DFAR/UFRN, Natal-RN –
[email protected]
2
Instituto de Química da Universidade de São Paulo – IQ/USP, Cidade Universitária, São Paulo-SP
3
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo – FCF/USP, Cidade Universitária, São Paulo-SP
A quitosana, polissacarídeo natural obtido pela desacetilação parcial ou total da quitina, é um copolímero linear
composto por monômeros de N-acetilglicosamina e glicosamina com ligação β(1→4). Devido às suas propriedades
biológicas (como biocompatibilidade, baixa toxicidade, atividade antimicrobiana e coagulante) a quitosana é
amplamente explorada na indústria farmacêutica para a produção de comprimidos, géis, nanopartículas e filmes. O
objetivo deste trabalho é desenvolver filmes para a liberação tópica prolongada de nitrofural (NF), pela síntese do
respectivo pró-fármaco polimérico. O fármaco é incorporado à matriz polimérica por meio de ligações do tipo éster e a
cisão dessas ligações pela ação de esterases cutâneas não-específicas conduz perfil de liberação potencialmente
prolongada da NF. Esses filmes podem ser aplicados para acelerar a cicatrização de feridas, constituir barreira física
para evitar a perda de umidade natural da pele e contaminação microbiana secundária, além de tratar lesões cutâneas
provocadas por microrganismos suscetíveis ao NF, cujo espectro microbiano é somado ao espectro da própria quitosana
Palavras-chave: filmes, quitosana, nitrofural, pró-fármaco, liberação prolongada.
Development of chitosan-based films for prolonged topical delivery of nitrofurazone: synthesis and chemical
characterization.
Chitosan, a natural polysaccharide obtained from partial or total deacetylation of chitin, is a linear copolymer composed
by β(1→4) linked N-acetyl glucosamine and glucosamine monomers. Due to its biological properties (such as
biocompatibility, low toxicity, antimicrobial activity and haemostatic effect) chitosan has been widely explored in
pharmaceutical industry to produce tablets, gels, nanoparticles and films. The aim of this work is to develop films for
prolonged topical drug delivery of nitrofurazone (NF), by polymeric prodrug design. The drug is conjugated to the
polymeric matrix by means of ester linkages and the cleavage of these esters by catalysis of non-specific cutaneous
esterases assures the prolonged drug delivery of NF. These films could be applied to accelerate wound healing, to be
physical barrier to prevent either loss of natural skin humidity and secondary microbial contamination, besides treating
skin injuries caused by susceptible microorganisms of NF, which has its microbial spectrum added to that of chitosan.
Keywords: films, chitosan, nitrofurazone, prodrug, prolonged release.
Introdução
Estudos recentes demonstram que lesões cutâneas têm o processo de cicatrização acelerado
quando tratados com curativos modernos, tais como membranas, filmes e hidrogéis1,2. Em pacientes
queimados, nos quais o processo de reepitelização é mais crítico, já existem substitutos temporários
da pele, quer de origem animal (membrana amniótica3), quer de origem sintética, como derivados
do poliuretano (Tegaderm®, Opsite®, Epigard ® e Biobrane®)4. Além da facilidade de administração
por aposição sobre a área lesada, filmes e membranas funcionam como uma barreira física, que
impede a desidratação do tecido e a infecção secundária da lesão por microrganismos oportunistas.
Há, ainda, relatos de diminuição da dor local4. Entretanto, quando os filmes são empregados como
matrizes de liberação de fármacos, o espectro de ação antimicrobiano do fármaco selecionado,
somado à capacidade cicatrizante dos filmes, amplia o leque de aplicação terapêutica do novo
derivado, ainda mais quando se consegue perfil de liberação prolongado do fármaco ao longo do
tempo de contato com a pele. Com vistas a esse objetivo, este trabalho se propõe a desenvolver
filmes de quitosana para liberação prolongada de nitrofural por meio do planejamento e síntese do
respectivo pró-fármaco polimérico.
A latenciação de fármacos a matrizes poliméricas visa, via de regra, à obtenção de formas de
ação prolongada e toxicidade diminuída. No entanto, dependendo do tipo de polímero e da ligação
com o composto desejado, pode-se conferir seletividade de ação5-7. Os polímeros, para serem
empregados como agentes transportadores de fármacos, devem possuir determinadas características,
como inocuidade, ausência de imunogenicidade, ser biodegradáveis e apresentar estabilidade
suficiente da ligação entre o fármaco e a matriz polimérica até a liberação do composto ativo no
compartimento alvo desejado8, especialmente se se destina ao uso interno.
A quitosana, polissacarídeo linear formado por monômeros de N-acetilglicosamina e
glicosamina, tem sido vastamente explorada na indústria farmacêutica por apresentar
biocompatibilidade, biodegradabilidade, baixa toxicidade, bioadesividade, capacidade de adsorção,
propriedade filmogênica, efeito hemostásico na coagulação sanguínea, além de apresentar espectro
de ação contra bactérias, fungos e virus9-17. Por suas propriedades aplicáveis no campo
farmacêutico, a quitosana foi escolhida como transportador polimérico.
O nitrofural (NF), anteriormente conhecido como nitrofurazona, corresponde à
semicarbazida do nitrofuraldeído18. O espectro de ação do NF abrange microrganismos como
Staphylococcus aureus, Streptococcus spp, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Aerobacter
aerogenes e Proteus spp19. Além destes, foi relatado que o NF tem amplo espectro de atividade
contra variedade de organismos Gram-positivos e Gram-negativos, incluindo algumas espécies e
linhagens de Alcaligenes faecalis, Bacillus anthracis, Corynebacterium, Erysipelothrix insidiosa,
Gardnerella vaginalis, Klebsiella pneumoniae, Moraxella lacunata, Neisseria, Paracolobactrum,
Serratia marcescens, Salmonella, Shigella 20. Considerando os tipos de doenças de pele que essas
bactérias podem causar, o NF pode ser empregado topicamente para o tratamento de lesões de pele
diversas, como furúnculo, carbúnculo, impetigo, foliculite, impetigo, erisipela, abcessos cutâneos
diversos18-21, tratamento de queimaduras de 2º e 3º graus4,19,20 e profilaxia contra infecções
secundárias em regiões suscetíveis, como cortes cirúrgicos19,20. Estudos sobre a síntese de prófármacos seletivos para tratamento de doença de Chagas demonstrou que NF possui atividade
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contra o protozoário Trypanosoma cruzi, assim como seu intermediário de síntese, o
hidroximetilnitrofural (NFOH), que foi mais ativo que NF e benznidazol22,23 (fármaco
comercialmente disponível no Brasil para tratar doença de Chagas) e 4 vezes menos mutagênico
que o NF24.
Uma vez produzidos os filmes de quitosana com NF latenciado à matriz polimérica, a
liberação prolongada do fármaco é garantida pela ação das esterases cutâneas inespecíficas, cuja
presença na pele já foi evidenciada em vários estudos26-29, e é fundamental para catalisar a cisão das
ligações do tipo éster e conseqüente liberação do fármaco da sua forma latente.
Experimental
Síntese do hidroximetilnitrofural (NFOH)22,23,25
Reagem-se 5 mmol de NF com 18 mL de formaldeído, em presença de 5 mmol de carbonato
de potássio e 10 mL de água desionizada. A reação permanece à temperatura ambiente, sob
agitação, durante 48 h, sendo acompanhada por cromatografia em camada delgada (CCD) (fase
móvel clorofórmio:metanol:ácido acético, 85:10:5, v/v/v). Finda a reação, o produto é filtrado e
lavado várias vezes com metanol para remoção do excesso de formaldeído.
Síntese do hemissuccinato de hidroximetilnitrofural (SCNFOH)22,25
Reagem-se 2 mmol de NFOH com 2 mmol anidrido succínico em meio composto por 10 mL
de tetraidrofurano e 2 gotas de solução aquosa de ácido sulfúrico a 20% (v/v). A reação permanece
à temperatura ambiente, sob agitação, durante 3 h, sendo acompanhada por CCD (fase móvel
clorofórmio:metanol:ácido acético, 85:10:5, v/v/v). Em seguida, o solvente é rotaevaporado a 40 oC,
sob pressão reduzida. O produto obtido deve ser, então, lavado várias vezes com água desionizada a
0 oC para remoção do excesso de ácido succínico.
Síntese do pró-fármaco polimérico de quitosana e hemissuccinato de hidroximetilnitrofural
(Q-SCNFOH)25
Numa solução de ácido acético a 1%, solubiliza-se a quitosana a 2% e transferem-se 15 mL
dessa solução, que equivalem a 1,86 mmol de quitosana, para um balão de fundo redondo.
Adicionam-se, então, 0,31 mmol de SCNFOH, seguidos de 2 gotas de solução aquosa de ácido
sulfúrico a 20%. O sistema é protegido da luz e mantido sob temperatura ambiente e agitação
constante por 48 h. A mistura reacional é transferida para membrana de acetato de celulose (12000
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Da) e dializada contra água desionizada por 72 h, com sucessivas trocas do meio de diálise, e
liofilizada para obtenção do polímero seco.
Preparação dos filmes com o pró-fármaco polimérico25,30
O pró-fármaco polimérico seco é dissolvido, a 1%, em solução aquosa de ácido acético
também a 1 a 2%. A evaporação do solvente é feita em câmara termostatizada a 45 oC, durante,
aproximadamente, 20 h. Para neutralização, os filmes são imersos em solução aquosa de hidróxido
de sódio a 1 a 5%, por 8 a 16 h. O excesso de álcalis é removido por sucessivas lavagens com água
desionizada.
Análises e equipamentos
As análises de RMN 1 H e
13
C foram realizadas em espectrofotômetro Bruker ADPX 300
MHz, empregando dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) para solubilização dos derivados de NF
e água deuterada (D2O) e aquecimento entre 50 a 70 oC para os derivados de quitosana. As curvas
de TG/DTG foram obtidas em termobalança TGA-50 Shimadzu, sob atmosfera dinâmica de N2
(50 mL.min-1), razão de aquecimento de 10 oC.min-1 e faixa de temperatura de 25 a 600 oC. As
análises de DSC foram realizadas em célula calorimétrica DSC-50 Shimadzu, sob atmosfera
dinâmica de N2 (100 mL.min-1), razão de aquecimento de 10 oC.min-1 e faixa de temperatura de 25 a
500 oC.
Resultados e Discussão
Para a obtenção do pró-fármaco polimérico, NF foi quimicamente modificada em derivado
carboxílico (SCNFOH) para favorecer a esterificação do fármaco com o grupamento amínico livre
das unidades desacetiladas da quitosana (Figura 1). A ligação do fármaco ao polímero nas formas
de éster e amida não são casuais e foram planejadas para serem cindidas por esterases cutâneas nãoespecíficas, liberando o fármaco topicamente de forma prolongada. O prolongamento da ação é
esperado, ainda, porque são necessárias várias etapas para reconstituir a forma ativa do prófármaco, no caso, NF: (1) cisão da amida entre SCNFOH e a quitosana; (2) cisão do éster entre o
ácido succinoílico e NFOH e (3) reversão química (catalisada pelo meio ácido) do NFOH a NF.
Neste caso, pode-se considerar o produto desenvolvido como pró-fármaco triplo, uma vez que
envolve três etapas para liberação da molécula ativa. Sob o ponto de vista da atividade, vale
salientar que NFOH tem mostrado atividade per se em estudos de atividade contra Trypanosoma
cruzi22-24. A atividade antimicrobiana própria do NFOH foi evidenciada por La-Scalea e
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colaboradores31 em estudos de voltametria cíclica e, assim como para o NF, é dependente da
redução do grupo nitro. Assim sendo, o retardamento, ou mesmo a inibição, do rearranjo ácidocatalisado do NFOH a NF colabora tanto para o prolongamento da ação quanto para manutenção da
atividade antimicrobiana, uma vez que se espera a atividade de ambos, com a vantagem de NFOH
ser menos tóxico.
O
nitrofural
N
O2N
O
OH
N
H
NH2
- CH O
2
O
hidroximetilnitrofural
N
O2N
O
H+
N
H
N
H
O
O
OH
O
O
hemissuccinato de hidroximetilnitrofural
O2 N
N
O
N
H
O
N
H
OH
O
O
O
OH
NH
H+
O
O
HO
NH2
6'
4'
pró-fármaco de nitrofural com
quitosana como transportador polimérico
O
HO
7
O
2
3
O
O2 N 1
N
5
N
H
O
O
HO
O
2'
10 11
8 9
OH
NH
O
NH
O
O
O
OH
5'
3'
O
HO
O
O
1'
OH
O
N
6 H
4
Figura 1 – Planejamento reacional do pró-fármaco polimérico do nitrofural empregando a quitosana como transportador polimérico.
NFOH e SCNFOH foram caracterizados por RMN (1H e
13
C), DSC e TG. A
hidroximetilação do NF a NFOH é confirmada pelo surgimento de dois tripletos (4,61 e 5,51 ppm),
no espectro de RMN 1H (Figura 2A), que não são evidenciados no espectro do NF (dado não
mostrado), e que são atribuídos, respectivamente, aos dois prótons da metila e ao próton da
hidroxila do grupamento hidroximetil introduzido. Além disso, o próton do nitrogênio terminal
(apesar de dois, se comportam como singlete no NF), após substituição, passa a acoplar com os
prótons do grupo metilênico do grupo hidroximetílico introduzido e aparece no espectro do NFOH
como tripleto a 7,64 ppm. A síntese da SCNFOH foi comprovada pelo surgimento de dois singletos
(Figura 2B): um a 2,42 ppm, que corresponde aos prótons das metilas do espaçante succinoílico, e
outro a 12,16 ppm, que corresponde ao próton do ácido carboxílico terminal. A inserção desse
espaçante na molécula do fármaco é comprovada pelo comportamento do hidrogênio do carbono 8,
que passou de um tripleto no espectro do NFOH (Figura 2A) para um dubleto, devido à influência
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do acoplamento com a nova vizinhança dos prótons do grupamento introduzido. Entretanto, a
permanência do sinal a 5,52 ppm pode ser atribuída ao hidrogênio da hidroxila do NFOH de partida,
o que indica que o método de isolamento do SCNFOH deve ser otimizado.
A
B
Figura 2 – Espectros de RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) de NFOH (A) e SCNFOH (B).
A Figura 3A mostra a sobreposição das curvas de DSC e TG/DTG obtidas para o NFOH. As
curvas TG/DTG evidenciam que NFOH é termicamente estável até ∼120 oC, decompondo-se em
duas etapas: a primeira, entre 120 e 170 oC, com pequena perda de massa (∆m = 2,64%, TpicoDTG =
147 oC) e a segunda, de 170 a 310 oC, com acentuada perda de massa (∆m = 43,9%, TpicoDTG = 205
o
C). A partir de 310 oC, a perda de massa ocorre lenta e gradativamente até 600 oC, devido à
eliminação de material carbonáceo formado na etapa anterior. A curva de DSC revela a ocorrência
de um evento exotérmico entre 120 e 157 oC (∆H = 41,28 J.g-1, TpicoDSC = 146 oC), que coincide
com a primeira perda de massa. A segunda etapa perda de massa evidenciada nas curvas TG/DTG
corresponde na curva DSC aos três eventos térmicos entre 170 e 310 oC: o primeiro é endotérmico
(∆H = 165,7 J.g-1, TpicoDSC = 189 oC) e é seguido de dois eventos exotérmicos (∆H = 1300 J.g-1,
TpicoDSC = 199 e 217 oC). A decomposição térmica do NFOH teve comportamento distinto do seu
protótipo, NF (dado não mostrado), que se decompõe em uma única etapa exotérmica
(∆H = 730 J.g-1, TpicoDSC = 245 oC),com acentuada perda de massa (∆m = 52,1%, TpicoDTG = 245 oC).
Além disso, verifica-se que a hidroximetilação do NF acarretou a diminuição da estabilidade
térmica do novo derivado, de 220 para 120 oC.
A Figura 3B mostra a sobreposição das curvas de DSC e TG/DTG obtidas para o SCNFOH.
A primeira perda de massa (∆m = 1,05%, TpicoDTG = 35 oC) corresponde à eliminação da umidade da
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amostra, decorrente do processo de lavagem com água para o isolamento do produto. A
decomposição térmica do SCNFOH, assim como para o NFOH, ocorre com duas etapas: a primeira,
entre 95 e 160 oC, com pequena perda de massa (∆m = 6,28%, TpicoDTG = 147 oC), e a segunda, de
160 a 295 oC, composta pela sobreposição de três eventos e com acentuada perda de massa (∆m =
43,8%, TpicoDTG = 202, 211 e 220 oC). A curva de DSC revela dois eventos: o primeiro,
endotérmico, entre 90 e 165 oC (∆H = 154,3 J.g-1, TpicoDSC = 140 oC) e o segundo, exotérmico, de
165 a 300 oC (∆H = 1060 J.g-1, TpicoDSC = 213 oC), que coincidem, respectivamente, com a primeira
e segunda etapas de perdas de massa. Verifica-se, também, que a introdução do espaçante
succinoílico no NFOH acarretou a diminuição da estabilidade térmica do pró-fármaco, de 120 para
90 oC. Fica claro que as subseqüentes derivatizações do NF provocam gradual perda de estabilidade
térmica, fator este que deve ser observado nas condições a ser padronizadas para a síntese do prófármaco e formação dos filmes.
80
DSC
0,00
60
-0,2
Endo
-2,50
-0,40
-0,1
TG
-0,3
-5,00
0
40
100
200
300
400
Temperatura (oC)
500
600
DTG
80
2,00
60
1,00
Endo
2,50
100
B
0,0
Fluxo de Calor (mw/mg)
100
Derivada primeira (mg/min)
Fluxo de Calor (mw/mg)
DTG
40
Massa (%)
-0,20
3,00
A
Massa (%)
Derivada primeira (mg/min)
5,00
0,00
TG
0,00
20
DSC
-1,00
0
100
200
300
400
Temperatura ( oC)
500
600
Figura 3 – Curvas de TG/DTG e DSC (atmosfera de N2, razão de aquecimento de 10o C.min-1 ) da NFOH (A) e SCNFOH (B).
Há fortes indicativos de que a síntese do pró-fármaco do NFOH, tendo a quitosana como
transportador, ocorreu. Comparando-se o espectro de RMN 1H do pró-fármaco (Figura 4A) com o
da quitosana sem substituição (Figura 4B), observa-se o aparecimento de um novo singleto a
3,14 ppm, que pode ser atribuído aos grupos metilênicos do espaçante succinoílico do SCNFOH,
observadas a 2,42 ppm (Figura 2B). Esse deslocamento do sinal em quase 1 ppm para campo mais
baixo se deve à diferença de temperatura de realização das medidas. Como o próton H1 do anel
glicosamínico da quitosana costuma ser encoberto pelo sinal da água, é importante aumentar a
temperatura para deslocar todos os sinais para campo mais baixo e permitir a visualização do sinal
do próton H1. Entretanto, como a análise do comportamento térmico dos derivados do NF revelou
gradual perda de estabilidade térmica com as subsequentes derivatizações, optou-se por realizar a
análise do pró-fármaco em temperatura mais branda que para a quitosana sem modificação, o que
explica a diferença de ocorrência dos sinais entre os espectros da quitosana e do pró-fármaco
polimérico.
Anais do 10o Congresso Brasileiro de Polímeros – Foz do Iguaçu, PR – Outubro/2009
A
B
Figura 4 – Espectros de RMN 1H (300 MHz, D2 O) de (A) Q-SCNFOH, realizado a 50 oC e (B) quitosana, realizado a 70 o C.
Nos espectros de RMN 13C (Figuras 5A e 5B), observa-se a presença de dois novos sinais, a
63 e 23 ppm, que são atribuídos, respectivamente, aos C8 e C10/11 do SCNFOH.
A
B
Figura 5 – Espectros de RMN 13C (75 MHz, D2 O) da (A) Q-SCNFOH, realizado a 50 oC e (B) quitosana, realizado a 70 o C.
A Figura 6A mostra a sobreposição das curvas de DSC do SCNFOH, quitosana e o produto
da reação entre ambos para síntese do pró-fármaco polimérico, Q-SCNFOH. A ausência de eventos
térmicos característicos do SCNFOH na curva DSC do Q-SCNFOH descarta a possibilidade da
nova espécie se tratar da mistura física dos reagentes. Além disso, o padrão das curvas de DSC
revela que todas as amostras são espécies diferentes entre si.
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A Figura 6B mostra que Q-SCNFOH possui mais umidade do que a amostra polimérica de
partida. Isso porque o produto da reação foi liofilizado para seu isolamento, enquanto que a amostra
de quitosana foi analisada sob a forma de filme, submetido à secagem em estufa. Outra
consideração importante é que Q-SCNFOH é termicamente menos estável que a quitosana, além de
se decompor em dois eventos exotérmicos, ao passo que o polímero de partida se decompõe,
aparentemente, em uma única etapa e em temperatura mais elevada. De fato, as modificações
térmicas detectadas na Q-SCNFOH reforçam a conclusão de que se obteve o pró-fármaco desejado.
É difícil considerar que o fármaco tenha permanecido adsorvido à quitosana após 4 dias de diálise e
uma etapa de filtração. Por essa razão, provavelmente, o produto dessa reação seja o pró-fármaco do
NF, ligada à quitosana por meio de espaçante succinoílico.
SCNFOH
Q-SCNFOH
Q
100
Endo
1,20
0,00
-0,20
0
200
400
T(o C)
60
40
SCNFOH
Q-SCNFOH
Q
20
A
-1,20
-0,10
-0,30
80
Massa (%)
Fluxo de Calor (mw/mg)
2,40
DTG (mg/min)
0,00
B
0
0
100
200
300
Temperatura (oC)
400
500
0
200
400
600
Temperatura (oC)
800
Figura 6 – Sobreposição das curvas de (A) DSC e (B) TG/DTG para SCNFOH, Q-SCNFOH e quitosana .
O pró-fármaco polimérico, depois de isolado, foi capaz de formar filme por metodologia
comumente empregada para a quitosana, tornando este planejamento bem sucedido ao seu
propósito. Entretanto, a formação dos filmes encontra-se em estudos de otimização de temperatura,
tempo de exposição para secagem e concentração dos agentes solubilizantes e alcalinizantes para
garantir a estabilidade do pró-fármaco polimérico.
Conclusões e Perspectivas
Apesar do pró-fármaco de NF empregando quitosana como transportador polimérico ter sido
sintetizado com sucesso, a metodologia ainda se encontra em fase de otimização quanto às
condições de melhor estabilidade e rendimento dos produtos. Estudos subsequentes para
determinação da cinética de estabilidade e liberação da NF serão futuramente realizados.
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Agradecimentos
Ao CNPq e à FAPESP, pelo auxílio financeiro.
À Dra. Maria Inês de Almeida Gonçalves, pela execução dos espectros de RMN.
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Anais do 10o Congresso Brasileiro de Polímeros – Foz do Iguaçu, PR – Outubro/2009