Resumo - Esalq

APLICAÇÃO DE NOVOS MARCADORES MOLECULARES NO MELHORAMENTO DE
PLANTAS
Ao longo dos anos, avanços em biologia molecular têm levado à introdução de novos tipos de
marcadores moleculares. Os primeiros marcadores moleculares estabelecidos foram as isoenzimas,
sendo diferenciadas em géis de eletroforese pelo tamanho e carga. O surpreendente nível de
polimorfismo encontrado pela primeira vez dentro de populações trouxe a idéia de que a maioria das
mutações é neutra. Este provavelmente é o maior legado das isoenzimas. O surgimento de técnicas de
manipulação de DNA levou ao desenvolvimento de marcadores RFLP, que permitiram a análise de
regiões não-codificadoras e de mutações silenciosas. Na década de 80, a técnica de PCR permitiu a
amplificação de fragmentos de DNA, e levou ao aparecimento de marcadores como RAPD,
microssatélites e AFLP. Estes dois últimos marcadores em sido amplamente utilizados em análises de
diversidade genética de plantas. Apesar da disponibilidade de diferentes marcadores, grande parte da
informação obtida é oriunda de polimorfismos em regiões do genoma detectadas por marcadores
aleatórios. Com a popularização das técnicas de seqüenciamento foi possível o desenvolvimento de
marcadores funcionais e a análise de polimorfismos de seqüências. Esses marcadores, baseados em
genes candidatos ou genes-alvo, aumentam a probabilidade de se estabelecer correlações entre fenótipo
e genótipo, pois a variabilidade observada reflete diferenças fenotípicas.
Seqüenciamento de DNA e marcadores moleculares começaram a convergir quando os dados
acumulados passaram a mostrar variações entre seqüências de indivíduos de uma mesma espécie. Logo
se percebeu que Single-Nucleotide Polymorphisms (SNP) eram os marcadores mais abundantes nos
genomas. SNPs são mutações de ponto, inserções ou deleções em regiões do genoma, e consistem em
alterações de uma única base entre fragmentos homólogos de DNA, além de pequenas inserções ou
deleções, podendo ocorrer tanto em regiões codificadoras como em não codificadoras dos genomas. Em
regiões codificadoras, quando resultam em uma substituição de aminoácido na seqüência protéica, são
denominados não sinônimos. Neste caso, a substituição pode ser conservativa ou não conservativa em
função das características dos aminoácidos envolvidos na troca, podendo resultar em modificações
estruturais e funcionas na proteína. Embora os SNPs sinônimos não alterem a seqüência protéica, eles
podem modificar a estrutura e a estabilidade do RNA mensageiro, e conseqüentemente, afetar a
quantidade de proteína produzida. Algumas vezes, as alterações das bases nitrogenadas têm origem em
erros de incorporação de bases durante a replicação do DNA, ou podem ser causadas por lesões no
DNA por agentes ambientais. As mutações que ocorrem em células germinativas e são transmitidas às
gerações seguintes podem se fixar na população. Quando a mutação está fixada em uma freqüência
mínima de 1% é considerada um SNP (Kwok & Gu, 1999). Existem várias técnicas de genotipagem de
SNPs, entre elas a hibridização em microarrays, a extensão de primers e a ligação.
Recentemente, Hu & Vick (2003) desenvolveram a técnica Target Region Amplification
Polymorphism (TRAP), um marcador dominante, que combina a facilidade dos marcadores RAPD,
sendo, porém, altamente reproduzível, com abundante polimorfismo dos marcadores AFLP. A
metodologia TRAP utiliza ferramentas de bioinformática e Expressed Sequence Tags (ESTs) para gerar
marcadores polimórficos ao redor de seqüências de genes candidatos. O polimorfismo é gerado a partir
da combinação de um primer fixo, desenhado a partir de uma seqüência EST de interesse, e um primer
arbitrário. Trabalhos recentes relatam o emprego de marcadores TRAP no acesso da diversidade
genética em cana e identificação de possíveis genes candidatos associados à tolerância ao frio e
envolvidos na rota metabólica da sacarose (Alwala et al., 2006).
Outro marcador que vem sendo muito utilizado na identificação de polimorfismos nas regiões do
genoma relacionadas à resistência de plantas é o Nucleotide-Binding Site (NBS). Esta técnica consiste
na amplificação de determinadas regiões utilizando primers degenerados homólogos às seqüências
conservadas dos genes de resistência (R-genes). De acordo com a literatura, a maioria das bandas
obtidas pela técnica do NBS apresenta níveis significativos de similaridade com seqüências conhecidas
de genes de resistência e análogos de genes de resistência (RGAs), sugerindo que esta técnica permite
a amplificação de marcadores polimórficos ligados a genes de resistência. O marcador NBS vem sendo
utilizado com sucesso em batata, tomate, alface, cevada (Van der Linden et al., 2004), sendo
identificados domínios de genes de resistência altamente conservados entre as espécies.
A maioria dos marcadores moleculares é dependente da eletroforese em gel, o que os torna
lentos e trabalhosos. Possuem ainda dificuldades em correlacionar com precisão bandas em géis com
variações alélicas. Para superar essas restrições foram desenvolvidos métodos de hibridização, tais
como microarrays. Tal metodologia pode ser usada para a identificação de marcadores SNPs em alguns
poucos organismos modelos ou de grande importância econômica, como o ser humano. Contudo, o custo
da aplicação de tal técnica para o melhoramento de plantas é proibitivo, já que o uso em larga escala
torna-se financeiramente inviável para a quase totalidade das espécies, especialmente aquelas que
possuem recursos financeiros limitados e/ou grandes e complexos genomas. Diversity Arrays Technology
(DArT) oferece uma solução prática a esses problemas, permitindo a análise de representações
genômicas sem a necessidade de seqüenciamento. DArT é baseado em hibridizações de microarray,
sendo independente do uso de géis e por isso feito em larga escala e rapidamente, sendo muito mais
barato por não possuir a fase de seqüenciamento. O princípio da técnica é a construção de painéis de
diversidade e a hibridização destes com representações genômicas, detectando a presença ou a
ausência de fragmentos específicos no genoma.
Referências
ƒ
ƒ
AKBARI, M.; WENZL, P.; CAIG, V.; CARLING, J.; XIA, L.; YANG, S.; Theoretical and Applied
Genetics, v. 113, p. 1409-1420, 2006.
ALWALA, S.; SUAN, A.; ARRO, J.A.; VEREMIS, J.C.; KIMBENG, C.A. Target region amplification
polymorphism (TRAP) for assessing genetic diversity in sugarcane germplasm collections.
Crop Science, v.46, p. 448-455, 2006.
ƒ
HU, J.; VICK, B.A. Target region amplification polymorphism: a novel marker technique
for plant genotyping. Plant Molecular Biology Reporter, n. 21, p.289-294, 2003.
ƒ
KWOK, P.Y.; GU, Z. Single nucleotide polymorphism libraries: why and how are we building
them? Molecular Medicine Today, v.5(12), p. 538-543, 1999.
ƒ
SCHLÖTTERE, C. The evolution of molecular markers – just a matter of fashion? Nature
ƒ
VAN DER LINDEN, C.G.; WOUTERS, D.C.A.E.; MIHALKA, V.; KOCHIEVA, E.Z.; MARINUS,
J.M.; SMULDERS, M.J.M.; VOSMAN, B. Efficient targeting of plant disease resistance loci
using NBS profiling. Theoretical and Applied Genetics, n. 109, p. 384-393, 2004.
WENZI, P.; CARLING, J.; KUDRNA, D.; JACCOUD, D.; HUTTNER, E.; KLEINHOFS, A; KILIAN,
A. Diversity arrays technology (DarT) for whole-genome profiling of barley. PNAS, v. 101, n.
26, p. 9915-9920, 2004.
XIA, L.; PENG, K.; YANG, S.; WENZL, P.; VICENTE, M.C.de,; FREGENE M.; KILIAN A.
Theoretical and Applied Genetics, v. 110, p. 1092-1098, 2005.
YOON, M.S.; SONG, Q.J.; CHOI, I.Y., SPECHT, J.E., HYTEN, D.L., CREGAN, P.B.
BARCSoySNP23: a panel of 23 selected SNPs for soybean cultivar identification. Theoretical
and Applied Genetics, n.114, p. 885-899, 2007.
Reviews Genetics, v. 5, p.63-69, 2004.
ƒ
ƒ
ƒ