Tese Mestrado (Valentim Coelho)

Efeito do fosfonato de potássio na protecção das raízes do
castanheiro (Castanea sativa Mill.) contra Phytophthora
cinnamomi.
Valentim Pereira dos Santos Coelho
Dissertação apresentada à Escola Superior Agrária de Bragança
para obtenção do Grau de Mestre em Agroecologia
Orientado por
Prof. Doutora Maria Eugénia Madureira Gouveia
Prof. Luís Filipe de Sousa Teixeira Nunes
Bragança
2009
Aos meus pais,
irmãos
e à minha afilhada
ii
Toda a nossa ciência, comparada com a realidade,
é primitiva e infantil – e, no entanto, é a coisa mais
preciosa que temos.
Albert Einstein (1879-1955)
iii
Agradecimentos
Ao entregar este trabalho, é com o maior prazer, que agradeço a todos os que de
alguma forma contribuíram para a sua realização.
Em primeiro lugar à minha orientadora, Professora Doutora Eugénia Gouveia,
da Escola Superior Agrária, pela grande ajuda ao longo do trabalho laboratorial e
escrito, permanente disponibilidade, incentivo e amizade demonstrada.
Ao Prof. Luís Nunes por ter aceitado ser meu co-orientador e pela ajuda na
revisão deste trabalho e sua análise de dados e pelo incentivo e amizade demonstrada.
Ao Professor Doutor José Alberto Pereira e à Professora Doutora Paula Baptista
por todo apoio, incentivo e pela ajuda na análise de dados.
Ao Laboratório de Protecção de Plantas do Departamento de Produção e
Tecnologia Vegetal (DPTV) por ter disponibilizado todos os recursos à realização deste
trabalho.
Ao Engenheiro Ivo Oliveira pela ajuda na revisão deste trabalho, pelo apoio,
incentivo e boa disposição sempre demonstrada.
À Dona Serafina Isabel Fernandes pela amizade e ajuda na fase experimental
deste trabalho.
Aos meus colegas, elementos do Laboratório do DPTV, da Escola Superior
Agrária, Susana Pereira, Ricardo Malheiro e Anabela Sousa, e à Isabel Afonso do
Laboratório de Biologia, pelo apoio, incentivo e boa disposição sempre demonstrada.
Aos amigos Rui Bento, Carla Costa (Passarinho), Luísa Santos, Lurdes Pires,
Patrícia Pires, Domingos Campelos, Francisco Campelos (Joca), Gonçalo Meireles,
Amílcar Brás (Micas), Sara Lomar, Roberto Direito pela amizade, companheirismo,
pela paciência e por todo o apoio nos momentos mais difíceis.
À minha família que não poupou esforços na minha formação, especialmente
pelo amor, carinho, dedicação e incentivo constante e pelo apoio em mais este passo da
minha vida.
A todos que directa e indirectamente me ajudaram na realização deste projecto.
iv
Lista de Quadros
Quadro 1 – Fungicidas ditiocarbamatos (adaptado de Hewitt, 1998)
Quadro 2 – Fungicidas sistémicos para o controlo de Phytophthora spp. (adaptado de
Schwinn, 1987)
Quadro 3 – Principais aplicações práticas dos fungicidas sistémicos contra
Phytophthora e outros fungos Oomicetas (Adaptado de (Erwinn & Ribeiro, 1996)
Quadro 4 – EC50 do metalaxil (concentração que inibe o crescimento micelial em 50%)
de Phytophthora cinnamomi (adaptado de Erwin & Ribeiro, 1996)
Quadro 5 – Alguns dos importantes termos usados para classificar os produtos
fosfonatos (adaptado de Landschoot & Cook, 2005)
Quadro 6 – Isolados de Phytophthora usados no ensaio
Quadro 7 – Valores (em centímetros) do crescimento do ano, altura total e do diâmetro
ao nível do colo
Quadro 8 – Valores médios (em centímetros) do crescimento do ano, altura total e do
diâmetro ao nível do colo
Quadro 9 – Valor da biomassa da parte aérea (folhas e caules) das plantas de
castanheiro nas diferentes modalidades (com aplicação de fosfonato potássico e sem
aplicação de fosfonato potássico)
Quadro 10 – Valores médios da biomassa total da parte aérea (folhas e caules) nas
diferentes modalidades (com aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de
fosfonato potássico)
Quadro 11 – Biomassa das raízes secundárias nas diferentes modalidades (com
aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato potássico)
Quadro 12 – Valores médios da biomassa total das raízes secundárias nas diferentes
modalidades (com aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato
potássico)
Quadro 13 – Comprimento radicular nos diferentes tratamentos (com aplicação foliar
de fosfonato potássico e sem aplicação foliar de fosfonato potássico) (CRT –
comprimento radicular total; CRS – comprimento das raízes sãs; CRD – Comprimento
das raízes doentes; %RD – percentagem de raízes doentes)
Quadro 14 – Valores médios do comprimento radicular total, do comprimento das
raízes sãs e do comprimento das raízes doentes nos diferentes tratamentos (com
aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato potássico)
v
Quadro 15 – Número de raízes total e o número de raízes doentes nas diferentes
modalidades
Quadro 16 – Valores médios do número de raízes e comprimento radicular nos
diferentes tratamentos (com aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de
fosfonato potássico)
Quadro 17 – Detecção de Phytophthora cinnamomi nas raízes secundárias
Quadro 18 – Valores (centímetros) do comprimento da lesão
Quadro 19 – Valores da média da dimensão da lesão nas diferentes condições de
tratamento
Quadro 20 – Crescimento micelial (centímetros) dos isolados de Phytophthora
cinnamomi (Pr120, 810 e 804), Phytophthora cambivora (Ar102 e Pr135), Psolithus
tinctorius e Cryphonectria parasitica, em meio de cultura PDA acrescido de 5 µg/ml;
20 µg/ml e 50 µg/ml de fosfonato potássico e controlo.
Quadro 21 – EC50 do fosfonato potássico (concentração que inibe o crescimento
micelial em 50%) em diferentes isolados de Phytophthora cinnamomi, Phytophthora
cambivora, Pisolithus tinctorius e Cryphonectria parasitica
Quadro 22 – Crescimento micelial (centímetros) dos isolados de Phytophthora
cinnamomi (Pr120, 810 e 804) e Phytophthora cambivora (Ar102 e Pr135) crescendo
em meio de cultura PDA acrescido de 20 µg/ml; 50 µg/ml e 100 µg/ml de fosfonato
potássico e sem adição de fosfonato potássico (controlo)
vi
Lista de Figuras
Figura 1 – Estrutura química do propamocarbe
Figura 2 – Estrutura química do cimoxanil
Figura 3 – Estrutura química do metalaxil
Figura 4 – Estrutura química do fosetil de alumínio (fosetil-Al)
Figura 5 – Disposição dos vasos na bancada
Figura 6 – Inoculação em ramo destacado
Figura 7 – Biomassa das folhas e caules das plantas de castanheiro tratadas com
fosfonato potássico por pulverização foliar e sem aplicação de fosfonato potássico.
Figura 8 – Percentagem de raízes doentes nas diferentes modalidades (com aplicação
de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato potássico)
Figura 9 – Plantas de castanheiro crescendo em substrato inoculado com Phytophthora
cinnamomi, nas diferentes modalidades (com e sem aplicação de fosfonato de potássio)
Figura 10 – Sintomatologia em plantas de castanheiro (a – plantas sem aplicação de
fosfonato, b – plantas com aplicação de fosfonato)
Figura 11 – Sistema radicular sem sintomas da Doença da Tinta (a), com sintomas da
Doença da Tinta (b)
Figura 12 – Isolamento de troços de raiz de plantas de castanheiro infectadas com P.
cinnamomi, em meio selectivo P10VPH
Figura 13 – Comprimento médio da lesão em castanheiros inoculados com
Phytophthora cinnamomi 25 dias após aplicação de fosfonato potássico. Barras verticais
correspondem ao erro padrão.
Figura 14 – Percentagem da inibição do crescimento dos isolados de Phytophthora
cinnmomi (Pr120, 810 e 804) e Phytophthora cambivora (Ar102 e Pr135) em meio
PDA acrescido de fosfonato potássico. Cada ponto representa a média de cinco
repetições.
Figura 15 – Phytophthora cinnamomi em diferentes concentrações de fosfonato
potássico (A – Controlo, B – 5 µg/ml, C – 20 µg/ml, D – 50 µg/ml)
Figura 16 – Phytophthora cinnamomi em diferentes concentrações de Aliette (A - 20
µg/ml B - 50 µg/ml C - 100 µg/ml)
vii
Resumo
A Doença da Tinta do Castanheiro, é considerada como uma das principais
causas do desaparecimento dos soutos. Phytophthora cinnamomi e P. cambivora são as
duas espécies associadas à Doença da Tinta do Castanheiro, sendo P. cinnamomi a
espécie preponderante na doença da tinta em Portugal. Os agentes patogénicos que
causam a Doença da Tinta no Castanheiro provocam uma situação de difícil solução,
pois estes possuem formas de sobrevivência e de disseminação que lhes permite
manterem-se no solo quase indefinidamente. Os meios de luta disponíveis para
combater as doenças provocadas por Phytophthora, não têm, até hoje, resolvido de
forma eficiente e duradoura os problemas sanitários das culturas e das florestas atacadas
por estes parasitas. Actualmente os fosfitos, sais ou os ésteres do ácido fosforoso, por
estarem associados com os mecanismos biológicos de resistência e induzirem na planta
mecanismos de defesa são uma forma alternativa no combate contra P. cinnamomi.
Com este trabalho estudou-se o efeito da aplicação foliar de fosfonato potássico
em plantas jovens de castanheiro que cresceram em substrato inoculado com
P. cinnamomi. Estudou-se ainda um método indirecto, por inoculação de P. cinnamomi
na parte aérea da planta, para determinar o efeito protector nas raízes e o efeito in vitro
do fosfonato potássico e fosetil-Al em diferentes isolados de Phytophthora e outros
fungos associados com o castanheiro.
Os resultados obtidos mostram que a aplicação foliar do fosfonato potássico,
protegeu as raízes dos castanheiros, não evidenciando as planta tratadas com fosfonato
potássico sintomas da Doença da Tinta. Todas as plantas que cresceram em substrato
inoculado com P. cinnamomi e sem aplicação foliar de fosfonato potássico
evidenciaram sintomas característicos da doença com epinastia e necrose das folhas. A
análise estatística evidenciou diferenças significativas entre tratamentos em todos os
parâmetros relacionados com as raízes. O peso seco das raízes secundárias foi o
parâmetro fisiológico mais afectado, tendo as plantas sem tratamento com fosfonato
potássico menor comprimento radicular e menor numero de raízes assim como grande
extensão de podridão radicular.
A protecção conferida pelo fosfonato de potássio avaliada por inoculação de P.
cinamomi na parte aérea da planta revelou que o comprimento da lesão é superior nas
plantas não tratadas com fosfonato potássico ao contrário do verificado em plantas não
viii
tratadas tendo sido considerado uma metodologia adequada para avaliar o efeito
protector da substância utilizada.
A análise da toxicidade in vitro revelou que os valores de EC50 variam entre 0,64
µg/ml e 31,56 µg/ml para P. cinnamomi e 9,92 µg/ml e 22,44 µg/ml para P. cambivora.
O fosetil-Al apresentou baixa toxicidade in vitro nas diferentes espécies de
Phytophthora.
Palavras-chave: P. cinnamomi, Doença da Tinta do Castanheiro, raízes, fosfonato
potássico
ix
Abstract
Chestnut Ink Disease is considered one of the most important causes of the
disappearance of the chestnut orchards. The two associated species to the chestnut ink
disease are Phytophthora cinnamomi and P. cambivora, being the first one the foremost
important cause of this disease in Portugal. The pathogenic agents related to the ink
disease in chestnut bring out a situation of complex resolution, due to their survival and
spreading ways, that allow them to remain in the soil almost indefinitely. The available
control means against diseases caused by Phytophthora, haven’t been able, so far, to
resolve, in a long-lasting and efficient way the health problems of crops and forests
infected by these parasites. Currently, phosphites, salts or esters of phosphorous acid,
due to their relation to the biological resistance mechanisms, as well as their ability to
induce defense mechanisms in plants, are an alternative way to control P. cinnamomi.
The aims of this work are to evaluate the effect of foliar application of potassium
phosphonate in young plants of chestnut in the radicular protections against
Phytophthora. An indirect method was also tested, by P. cinnamomi inoculation in the
aerial part of the plant, to determine the protective effect on roots and in vitro effect of
potassium phosphonate and fosetil-Al in different Phytophthora isolates and other fungi
associated with the chestnut.
The achieved results showed that the plants treated with foliar application of
potassium phosphonate didn´t show the symptoms of ink disease, leading to the
conclusion that this product did protect the chestnut roots against this disease. All the
plants grown in substrate inoculated with P. cinnamomi and without foliar application
of potassium phosphonate showed symptoms of the disease with epinasty and necrosis
of leaves. A statistic analysis provides significant differences between treatments in all
the root related parameters. Dry root weight was the most affected physiological
parameter, and the plants without treatment with potassium phosphonate have lower
root length and lower number of roots.
The potassium phosphonate protection action, evaluated with the inoculation of
P. cinamomi in branches of the plant revealed that the length of the lesion is higher in
plants not treated with potassium phosphonate due to the lack of the protection granted
by this compound, thus proving to be an adequate methodology to evaluate the
protective effect of the used substance.
x
The in vitro toxicity analyses revealed EC50 ranging from 0,64 mgL-1 to 31,56
mgL-1 for P. cinnamomi and 9,92 mgL-1 to 22,44 mgL-1 for P. cambivora. Fosetyl-Al
showed low toxicity in vitro in different species of Phytophthora.
Key-words: P. cinnamomi, Chestnut Ink Disease, roots, potassium phosphonate
xi
Índice
Lista de Quadros............................................................................................................. v Lista de Figuras ............................................................................................................ vii Resumo ......................................................................................................................... viii Abstract ........................................................................................................................... x Índice ............................................................................................................................. xii
1 – Introdução ................................................................................................................. 1 1.1 – A Doença da Tinta do Castanheiro ...................................................................... 1 1.1.1 – Considerações gerais .................................................................................... 1 1.1.2 – O Género Phytophthora ............................................................................... 2 1.1.3 – Phytophthora cinnamomi ............................................................................. 3 1.1.4 – Expressão dos sintomas e meios de luta ....................................................... 4 1.2 – A luta química contra Oomicetas ........................................................................ 7 1.2.1 – Fungicidas preventivos ................................................................................. 7 1.2.1.1 – Fungicidas inorgânicos .......................................................................... 8 1.2.1.1.1 – Compostos de cobre ....................................................................... 8 1.2.1.2 – Fungicidas orgânicos ............................................................................. 9 1.2.1.2.1 – Ditiocarbamatos ............................................................................. 9 1.2.1.2.2 – Ftalimidas ..................................................................................... 10 1.2.2 – Fungicidas sistémicos ................................................................................. 10 1.2.2.1 – Carbamatos .......................................................................................... 11 1.2.2.2 – Oxinas cianoacetamidas (acetamidas) ................................................. 13 1.2.2.3 – Fenilamidas.......................................................................................... 14 1.2.2.4 – Etilfosfitos ........................................................................................... 18 1.3 – A luta química no combate à Doença da Tinta do Castanheiro......................... 21 1.3.1 – A luta química em Portugal ........................................................................ 21 1.3.2 – Limitações e métodos alternativos de luta química no combate à Doença da
Tinta do Castanheiro............................................................................................... 28 1.4 – Os fosfitos na protecção vegetal ........................................................................ 30 1.4.1 – O fósforo e sua influência na planta ........................................................... 30 1.4. 1.1 – Fosfanato ............................................................................................ 31 1.4.1.2 – Fosfato ................................................................................................. 31 1.4.1.3 – Modo de acção do ião fosfonato .......................................................... 32 1.4.1.4 – O uso do fosfito em agricultura ........................................................... 34 1.4.1.5 – Influência do fosfito na planta ............................................................. 36
xii
2 – Objectivos ................................................................................................................ 38
3 – Material e Métodos ................................................................................................. 39 3.1 – Material biológico ............................................................................................. 39 3.1.1 – Isolados P. cinnamomi e P. cambivora utilizados neste estudo ................. 39 3.1.2 – Outros organismos utilizados neste estudo................................................. 39 3.1.2.1 – Pisolithus tinctorius ............................................................................. 39 3.1.2.2 – Cryphonectria parasitica ...................................................................... 39 3.1.3 – Plantas......................................................................................................... 40 3.2 – Substratos .......................................................................................................... 40 3.2.1 – Substrato de inóculo ................................................................................... 40 3.2.2 – Substrato dos vasos..................................................................................... 40 3.3 – Meios de cultura utilizados ................................................................................ 40 3.4 – Fosfonato de potássio ........................................................................................ 41 3.5 – Estudo do efeito de fosfonato potássico na protecção das raízes do castanheiro
.................................................................................................................................... 41 3.5.1 – Parâmetros fisiológicos............................................................................... 42 3.5.1.1 – Altura e diâmetro ao nível do colo ...................................................... 42 3.5.1.2 – Biomassa.............................................................................................. 42 3.5.1.3 – Comprimento e número de raízes secundárias .................................... 42 3.5.2 – Sintomatologia ............................................................................................ 42 3.6 – Avaliação do efeito protector do fosfonato potássico por inoculação de P.
cinnamomi na parte aérea da planta ............................................................................ 43 3.7 – Avaliação da toxicidade in vitro do fosfonato potássico e fosetil-Al ................ 44 3.7.1 – Toxicidade in vitro do fosfonato potássico ................................................ 44 3.7.2 – Toxicidade in vitro do fosetil-Al ................................................................ 44 3.8 – Análise estatística .............................................................................................. 45 4 – Resultados................................................................................................................. 46 4.1 – Efeito de fosfonato potássico na protecção do castanheiro ............................... 46 4.1.1 – Parâmetros fisiológicos............................................................................... 46 4.1.1.1 – Altura e diâmetro ao nível do colo ...................................................... 46 4.1.1.2 – Biomassa da parte aérea ...................................................................... 47 4.1.1.3 – Biomassa radicular .............................................................................. 49 4.1.1.4 – Comprimento e número de raízes secundárias .................................... 50 4.1.2 – Sintomatologia ............................................................................................ 54 4.2 – Avaliação indirecta do efeito protector do fosfonato potássico por inoculação de
P. cinnamomi na parte aérea da planta ....................................................................... 56 4.3 – Toxicidade in vitro do fosfonato potássico e fosetil-Al .................................... 58 xiii
4.3.1 – Resposta in vitro ao fosfonato potássico .................................................... 58 4.3.2 – Resposta in vitro ao fosetil-Al .................................................................... 61
5 – Discussão e Conclusões........................................................................................... 63
6 – Bibliografia .............................................................................................................. 69 xiv
1 – Introdução
1.1 – A Doença da Tinta do Castanheiro
1.1.1 – Considerações gerais
A Doença da Tinta do Castanheiro é considerada como uma das principais
causas do desaparecimento do castanheiro em toda a Europa. A doença expandiu-se
com grande rapidez destruindo milhões de castanheiros (Cortizo et al., 1999).
A Doença da Tinta do Castanheiro europeu (Castanea sativa Mill.) existirá em
Espanha desde 1726 (Crandall, 1950). Em Portugal é conhecida desde 1838, quando nas
margens do rio Lima se verificaram sintomas como o amarelecimento e queda
prematura das folhas e ainda o aparecimento de uma podridão húmida nas raízes que
mais tarde levava à morte da árvore (Fernandes, 1953). Elorrieta (1949) menciona a
existência em 1859 de castanheiros doentes com sintomas da Doença da Tinta no Norte
de Itália, nas províncias da Toscana, Piemonte e Ligúria, em França, nos departamentos
do Gard, Lozère e Baixos Pirenéus e em Portugal no Centro e no Norte. Nos Estados
Unidos a doença é referenciada a partir de 1854, tendo provocando a destruição de
grandes extensões de castanheiro americano (Castanea dentata Marshall.) (Gravatt,
1954).
Em Portugal a área de ocupação do castanheiro tem vindo a sofrer um
decréscimo acentuado desde que esta doença se instalou. O avanço da doença tem sido
de tal forma devastador que hoje praticamente não existem castanheiros no Minho e as
áreas de ocupação regrediram em mais de 50 % em Trás-os-Montes e Beira Alta,
regiões onde segundo Marques (1988) existem ainda as maiores manchas de castanheiro
em Portugal. A Doença da Tinta que invariavelmente provoca a morte do castanheiro é
uma doença endémica em todas as regiões castaneícolas. Na região de Trás-os-Montes
várias estimativas indicam 15 % de árvores afectadas pela doença (Carvalheira, 1997;
Martins et al., 1997) mesmo nas regiões de maior aptidão para o castanheiro como a
Terra Fria Transmontana.
Phytophthora cinnamomi e P. cambivora são as duas espécies associadas à
Doença da Tinta do Castanheiro. Em Portugal, P. cinnamomi é a espécie mais
frequentemente isolada e por isso considerada a espécie preponderante no
desenvolvimento da Doença da Tinta em Portugal (Fernandes, 1966; Gouveia, 2004).
P. cinnamomi, foi isolada de castanheiro pela primeira vez, no nosso país, em
1941 por Moniz da Maia. Estes isolamentos foram confirmados por Pimentel em 1942
1
que também isolou e identificou P. cinnamomi e P. cambivora de castanheiro com
sintomas da doença (Pimentel, 1947).
1.1.2 – O Género Phytophthora
O Género Phytophthora contém alguns dos mais destrutivos patogéneos de
plantas, causando um largo número de doenças em muitas espécies vegetais.
Phytophthora deriva da palavra grega ‘phyto’ (planta) e ‘phthora” (destruidor). O
Género Phytophthora foi assim denominado por Antón de Bary em 1876, quando
descreveu Phytophthora infestans como a espécie tipo deste género (Cortizo, et al.,
1999). Erwin & Ribeiro (1996) incluíram no género Phytophthora 64 espécies, todas
elas parasitas de espécies vegetais. Um grande número de espécies tem capacidade de
causar infecção em vários hospedeiros, podendo causar uma miríade de doenças em
diferentes espécies vegetais. Recentemente foram descritas novas espécies, P. quercina
(Jung et al., 1999); P. europaea E. M. Hansen & T. Jung sp. nov., P. uliginosa T. Jung
& E. M. Hansen sp. nov., P. psychrophila T. Jung. & E. M. Hansen sp. nov. (Jung et al.,
2002) parasitas de espécies florestais, P. ipomoeae Flier & Grunwald sp. nov. (Flier et
al., 2002) parasita em Ipomoea longipedunculata e estritamente relacionada com P.
infestans; P. brassicae De Cock & Man in’t Veld sp. nov. (Man in’t Veld et al., 2002)
parasita do género Brassica e estritamente relacionada com P. porri a que se acrescenta
ainda a associação de espécies de Phytophthora já conhecidas a novos hospedeiros:
P. megasperma em oliveira (Sanchez et al., 2001), P. cactorum em Carya illinoensis
(Reilly et al., 1997) e P. boehmeriae em algodão (Elena & Paplomatas, 1997).
O Género Phytophthora pertence à Classe dos Oomycetes. Tem sido
tradicionalmente colocado no Reino Fungi, na Família Pythiaceae (Erwin & Ribeiro,
1996). No entanto os novos conhecimentos sugerem a inclusão da Classe dos
Oomycetes no Reino Stramenopila (Wong, 2006).
As espécies de Phytophthora causam doenças cujos sintomas variam desde
podridões radiculares, podridões do colo, cancros no caule, “blight” nas folhas e
podridões dos frutos. São responsáveis por algumas das mais devastadoras doenças tais
como o “dieback” dos eucaliptos na Austrália, causada por P. cinnamomi (Shearer &
Tippett, 1989), o míldio da batata causado por P. infestans na Irlanda, “black pod” do
cacau causado por P. palmivora, e muitas outras doenças com grande importância
económica (Erwin & Ribeiro, 1996).
2
1.1.3 – Phytophthora cinnamomi
P. cinnamomi Rands foi isolado pela primeira vez em 1922, na ilha de Sumatra,
da árvore da canela (Cinnamomum burmanii) (Zentmyer, 1980). Desde então, foi
registada a sua presença em mais de 70 países e em quase 1000 hospedeiros os quais
são predominantemente plantas lenhosas (Roberts & Boothroyd, 1984). Os hospedeiros
principais incluem o abacateiro, o eucalipto, o ananaseiro, o castanheiro, varias espécies
de pinheiro, muitas plantas ornamentais, e ainda de um número extraordinário de
plantas australianas nativas.
A origem geográfica de P. cinnamomi tem sido objecto de controvérsia e
discussão. Um possível foco de origem será a área que inclui o Nordeste Australiano, a
Malásia, a Indonésia e a Nova Guiné (Zentmyer, 1980). Existe um estudo genético de
populações de P. cinnamomi dessas regiões com base na análise de isoenzimas. Este
estudo revelou que os isolamentos australianos possuem uma menor variabilidade,
apresentando apenas quatro genótipos isoenzimáticos multilocus, enquanto que uma
amostra limitada de isolamentos provenientes da Papua Nova-Guiné apresenta nove
daqueles genótipos e ainda um número superior de alelos. Estes dados sugerem que os
quatro genótipos australianos poderão representar clones que sofreram uma evolução
isolada a partir de uma introdução de isolamentos da Papua Nova-Guiné. A discussão
em torno do centro de origem de um agente patogénico não tem apenas interesse
académico. O conhecimento da variabilidade genética no centro de origem poderá
fornecer informações acerca de dados potenciais que seriam imputáveis a migrações
adicionais e que regiões deveriam ser monitorizadas para minimizar os efeitos de
futuras migrações (Goodwin, 1997). O centro de origem é também o melhor local para
encontrar novas fontes de resistência. Além disso o conhecimento da ecologia de um
patogéneo no seu centro de origem poderia fornecer pistas acerca das potenciais novas
estratégias de controlo, como por exemplo organismos a usar na luta biológica. De
qualquer modo P. cinnamomi foi introduzido na Austrália Ocidental, na América,
Europa Ocidental e África. Encontra-se predominantemente em zonas subtropicais e
tropicais, assim como em algumas regiões temperadas (Zentmeyer, 1981).
P. cinnamomi além de ter a capacidade de provocar doença em muitas espécies
vegetais e invadir ecossistemas inteiros, tem ainda a capacidade de permanecer no solo
e na ausência de hospedeiros por períodos de tempo muito longos, devido à formação de
estruturas de resistência. Têm ainda capacidade para sobreviver como saprófita de
3
outras espécies de Phytopthora e é conhecido por sobreviver por um período de 6 anos
na maioria dos solos (Zentmyer & Mircetich, 1966). Embora ocorra lise do micélio
pelos microrganismos do solo, particularmente Trichoderma spp. e Gliocladium spp.
(Reeves, 1975; Malajczuk, 1983), Phytophthora pode sobreviver por longos períodos no
solo através de clamidósporos (Weste, 1983). Por outro lado, possui ainda estratégias de
rápido aumento de inoculo sempre que as condições lhe são favoráveis e processos
alternativos de germinação dos propágulos que respondem rapidamente às alterações
ambientais. A disseminação de P. cinnamomi tem ocorrido principalmente através de
plantas de viveiros infectadas e outros materiais vegetais.
1.1.4 – Expressão dos sintomas e meios de luta
Em castanheiro e utilizando a descrição de Grente (1961), P. cinnamomi provoca
nas raízes mais finas um enegrecimento, devido à decomposição do córtex, ficando com
aspecto húmido e apodrecido. As raízes de maior diâmetro também são atacadas,
evidenciando manchas enegrecidas, devido à alteração do córtex e do câmbio. O lenho
não é atingido, mas pode ficar escurecido devido à oxidação da seiva que sai dos tecidos
do floema.
Em correspondência com esta sintomatologia radicular, manifesta-se na parte
aérea da planta um conjunto de sintomas bastante característicos, embora alguns deles
estejam também associados a outras doenças de origem parasitária ou fisiológica.
Fernandes (1966), um dos autores que mais estudou a Doença da Tinta do Castanheiro
em Portugal, descreve como sintomas característicos da doença na parte aérea da planta,
os seguintes: folhas amarelecidas e sem brilho que vão murchando, acabando por cair
prematuramente; dessecamento rápido das folhas (ocorrência ocasional), que ficam
firmemente agarradas nos ramos, mesmo no período de repouso vegetativo; folhas de
dimensões reduzidas (quando os ataques deste parasita ocorrem na Primavera; flores
masculinas de fraco desenvolvimento que caem sem ter polinizado as flores femininas
que raramente se formam; ouriços de pequena dimensão e sem fruto; ouriços que ficam
aderentes à árvore durante um ou mais anos; castanhas muito pequenas e sem
características organolépticas; desenvolvimento de ramos junto ao colo da árvore e
abaixo das pernadas principais; colo da planta com uma mancha escura de contornos
irregulares ou em forma de cunha, quando se destaca a epiderme (não é sintoma
constante da doença, mas quando se observa, é quase certo estar a árvore infectada);
4
líquido escuro de aparecimento ocasional, semelhante à tinta de escrever, sintoma que
deu o nome vulgar à doença e que se deve à oxidação das substâncias fenólicas que se
libertam devido ao crescimento dos tecidos sãos que dilaceram os tecidos doentes que
não cresceram.
Em plantas jovens de castanheiro a sintomatologia é bastante evidente,
adquirindo as plantas um aspecto amarelecido que rapidamente evolui para necrose e
dessecamento de toda a planta. As folhas ficam pendentes, enroladas e com aspecto
seco. Esta sintomatologia progride rapidamente levando à morte da planta, num período
de tempo relativamente curto (Gouveia, 1993).
A sintomatologia provocada por Phytophthora spp. que atacam as raízes,
evidencia-se na parte aérea, quando o processo infeccioso se encontra já em estado
avançado de evolução. Tal facto torna difícil detectar, por sintomatologia, os ataques
precoces destes fungos, tornando as estratégias de luta mais difíceis de aplicar, quando
se pretende actuar ao nível do hospedeiro.
Os agentes patogénicos que causam a Doença da Tinta no Castanheiro provocam
uma situação de difícil solução, pois estes possuem formas de conservação e de
disseminação que lhes permite a sobrevivência no solo quase indefinidamente. O
controlo de P. cinnamomi é difícil devido à grande quantidade de hospedeiros e
capacidade desta espécie em sobreviver sob a forma de clamiósporos, e nas raízes de
outras plantas que por vezes não manifestam sintomas.
Como P. cinnamomi não pode ser erradicada uma vez que tenha infectado uma
área, são necessárias estratégias de controlo de protecção integrada para minimizar a
dispersão e desenvolvimento da doença. As medidas de protecção devem ser
implementadas logo nos viveiros para que se produzam plantas saudáveis. Fonseca
(1994) recomenda a inspecção cuidadosa dos viveiros destruindo todas as plantas
doentes e circunvizinhas a estas, e ainda a promoção de boas condições de drenagem e
fertilidade do solo. Hardy et al. (2001) têm delineado várias estratégias de protecção
para o controlo de P. cinnamomi em ecossistemas naturais. Elas incluem a restrição do
acesso de veículos para zonas não infectadas, limpeza de veículos e equipamentos para
retirar solo aderente ou restos de plantas e impedir os movimentos de água de áreas
infectadas para áreas não infectadas e minimizar a circulação de veículos e actividades
florestais durante o período húmido.
Os meios de luta disponíveis para combater as doenças provocadas por
Phytophthora que atacam as raízes não têm, até hoje, resolvido de forma eficiente e
5
duradoura os problemas sanitários das culturas e das florestas atacadas por estes
parasitas. Sendo esta uma doença difícil de erradicar quando estabelecida no terreno, os
investigadores têm-se preocupado em encontrar meios de combate eficazes no seu
controlo, havendo uma intensa procura de métodos alternativos que possam resolver o
problema.
6
1.2 – A luta química contra Oomicetas
1.2.1 – Fungicidas preventivos
Os fungicidas não sistémicos, após aplicação, ficam na superfície das folhas e
dos frutos e não penetram na planta. A redistribuição na planta ocorre através da fase de
vapor ou através da acção da chuva. Em muitos casos os fungicidas não sistémicos não
são redistribuídos e a sua acção é limitada às folhas tratadas. Uma desvantagem destes
fungicidas é a sua dependência da aplicação do fungicida alcançar uma completa
cobertura da cultura-alvo (Hewitt, 1998).
Os fungicidas não sistémicos são geralmente inibidores “multi-site”, obtendo,
uma resposta através da ruptura de vários processos bioquímicos, alcançado através da
capacidade em se ligarem a grupos químicos, como as moléculas tiol, comum a muitas
enzimas (Hewitt, 1998).
Os fungicidas são geralmente classificados como erradicativos, protectores ou
curativos. No entanto, como refere Reis & Bresolin (2007) há várias maneiras de
classificar os fungicidas (fungistáticos, protectores, mesostêmicos, erradicativos, de
contacto, curativos, preventivos, sistémicos, etc.), não havendo uma classificação clara
na literatura dedicada a este tema. Simões (2005) classifica os fungicidas, com base na
actuação no patogéneo, como preventivos (ou protectores ou profiláticos), curativos (ou
terapêuticos) e erradicantes (ou anti-esporulantes).
No caso de fungicidas preventivos a acção é protectora ou de pré-penetração. O
fungicida inibe a germinação, impedindo a penetração do fungo nos tecidos do
hospedeiro. Os fungicidas curativos têm a acção confinada à pós-infecção. Nesse caso já
ocorreu a penetração e ainda não são vistos os sintomas. No caso dos fungicidas
erradicantes há uma inibição do crescimento micelial e da esporulação não ocorrendo
regeneração ou recuperação das células ou dos tecidos mortos pois este processo é
irreversível (Reis & Bresolin, 2007).
Um fungicida protector é uma substância que é aplicada profilacticamente na
cultura alvo. A sua actividade ocorre numa ou em mais fases iniciais da infecção
fúngica que podem ir desde a germinação dos esporos até à penetração preliminar no
tecido do hospedeiro, o que impede a infecção e o desenvolvimento de sintomas da
doença (Hewitt, 1998). Uma vez ocorrida a penetração do patogéneo na planta, os
fungicidas protectores não conseguem impedir a invasão posterior dos tecidos pelo
fungo, isto é, não têm acção curativa ou erradicativa (Reis & Bresolin, 2007).
7
1.2.1.1 – Fungicidas inorgânicos
1.2.1.1.1 – Compostos de cobre
A calda bordalesa, descoberta acidentalmente por Millardet em 1982 em França
foi um dos primeiros fungicidas inorgânicos a ser usado. Este fungicida consiste numa
mistura de sulfato de cobre e hidróxido de cálcio e estava associada ao controlo do
míldio da vinha, Plasmopara viticola (Hewitt, 1998). A calda bordalesa foi usada com
sucesso no combate do míldio da batateira provocado por Phytophthora infestans, e em
muitas outras doenças provocadas por outras espécies de Phytophthora, tendo sido
usada, por exemplo, como pulverização foliar no controlo de Phytophthora palmivora
(Butl) (Hislop, 1963). Outros sais de cobre que são usados frequentemente como
preventivos por aplicação foliar incluem o oxicloreto de cobre e o óxido cuproso,
embora este último não seja frequentemente usado (Heitefuss, 1989).
Os fungicidas cúpricos como a calda bordalesa e o oxicloreto de cobre
continuam a ser utilizados de forma simples ou em combinação com fungicidas
sistémicos como o cimoxanil para controlar algumas doenças na vinha (P. viticola),
batata e tomate (Phytophthora infestans), lúpulo (Pseudoperenospora humuli), banana
(Mycosphaerella musicola), café (Colletotrichum kahawae) e chá (Exobasidium vexans)
(Hewitt, 1998).
Os compostos de cobre são por vezes combinados com metalaxil para alargar o
espectro de acção contra patogeneos alvo (por exemplo bactérias) ou impedir o
desenvolvimento de isolados de P. infestans resistentes ao metalaxil (Schwinn &
Margot, 1991).
O ião cobre (Cu2+) libertado na superfície das folhas é prontamente acumulado
por fungos sensíveis. Forma complexos com enzimas que possuam um grupo sulfidrilo
(-SH), hidróxilo (-OH), amino (-NH2) e carboxílico (-COOH) inactivando-as levando a
uma perturbação geral do metabolismo (Hewitt, 1998). De acordo com Heitefuss (1989)
os fungicidas cúpricos são particularmente eficazes contra fungos Oomicetas. Isto pode
dever-se à natureza hidrófila dos sais de cobre. A capacidade dos fungicidas cúpricos se
redistribuírem pela folhagem por acção da chuva é uma importante vantagem destes
fungicidas.
Após a infecção ocorrer, uma aplicação com cobre pode não ser suficientemente
eficaz. Por outro lado, o cobre que penetra nas folhas, em certa medida pode causar
8
crescimento retardado e necroses (“russeting”) nos frutos. Este factor fitotóxico do
cobre é uma desvantagem no seu uso (Erwin & Ribeiro, 1996).
1.2.1.2 – Fungicidas orgânicos
1.2.1.2.1 – Ditiocarbamatos
Os ditiocarbamatos (Quadro 1) foram desenvolvidos entre 1951 e 1962 e têm
sido usados extensivamente como fungicidas de largo espectro de acção, muitos dos
quais têm tido sucesso para o controlo de Phytophthora. O ácido ditiocarbâmico é
combinado com diferentes catiões para fazer fungicidas que difere em certas
propriedades (Erwin & Ribeiro, 1996). O composto mais simples é o metano de sódio
(Vapam), um sal de sódio que é solúvel em água. Devido a sua fitotoxicidade o metano
de sódio não é usado na forma de pulverização (Erwin & Ribeiro, 1996).
Quadro 1 – Fungicidas ditiocarbamatos (adaptado de Hewitt, 1998)
Estrutura química
Nome comum
(CH3)2N.CS.SZnS.CS.N(CH3)2
Zirame
[-SCS.NHCH2CH2NHCS.S.ZN-]X
Zinebe
[(CH3)2NCS.S]2FeSCS.N(CH3)2
Ferbam
(CH3)2N.CS.SS.CS.N(CH3)2
Tirame
[-SCS.NHCH2CH2NHCS.S.Mn-]X
Manebe
[-SCS.NHCH2CH2NHCS.S.Mn-]X (Zn)y
Mancozebe
O zirame e o ferbam são dialquilo ditiocarbamatos, enquanto o nabam, o zinebe,
o manebe, e o propinebe são bis(alquiloditiocarmabatos). O mancozebe é um sal de
manganésio-zinco altamente estável e é mais activo que o manebe ou o zinebe sozinhos
(Erwin & Ribeiro, 1996).
Como a maior parte dos fungicidas protectores, os ditiocarbamatos são
fungicidas de largo espectro de acção, usados como fungicida foliar e para o tratamento
de solo, das sementes e dos frutos (Venturia spp., Taphrina deformans), em vinha (P.
vitícola), em vegetais (P. infestans), beterraba sacarina (Cercosporella beticola), tabaco
(Pseudoperonospora tabacina) e lúpulo (P. humuli).
Os ditiocarbamatos são muito menos fitotóxicos que os fungicidas de cobre.
Alguns ditiocarbamatos aumentam a cor verde das folhas, provavelmente devido à
9
adição de catiões como o zinco, corrigindo uma deficiência em micronutrientes
(Heitefuss, 1989). Os fungicidas ditiocarbamatos têm uma função protectora mas não
são translocados na folhagem. Eles são provavelmente o mais importante grupo de
fungicidas no combate ao míldio da batata e do tomate (33% do mercado mundial)
(Erwin & Ribeiro, 1996). Os ditiocarbamatos são ainda usados em misturas com o
metalaxil pois têm um maior espectro de acção e tendem a suprimir o desenvolvimento
de resistências ao metalaxil, nomeadamente em P.infestans (Schwinn & Margot, 1991).
Geralmente os ditiocarbamatos não são fitotóxicos, mas podem induzir danos em
algumas culturas em circunstâncias excepcionais, como por exemplo o uso do
mancozebe ou o zinebe em plantas sensíveis ao zinco (Hewitt, 1998).
1.2.1.2.2 – Ftalimidas
As ftalimidas foram introduzidas em 1952 com o anúncio da captana e do
folpete (Hewitt, 1998). Elas conferem controlo protector contra um largo número de
fungos patogéneos, tendo sido usadas para o controlo de Venturia spp. em maçãs e
pêras, P. viticola e B. cinerea em vinha e B. cinerea, Colletotrichum spp., Ascochyta
spp., Pythium spp., Phoma spp. e Thielaviopsis basicola em vegetais e ornamentais,
Glomerella cingulata em café, bem como P. infestans e Alternaria solani em batata e
tomate.
As ftalimidas têm sido usadas em grande medida para controlar os míldios, mas
só o captafol e o folpete têm tido importância no controlo do míldio do tomateiro. Estes
fungicidas exercem um efeito protector mas não são translocados (Erwin & Ribeiro,
1996). No entanto, a aplicação é suficiente para cobrir novos crescimentos (Schwinn &
Margot, 1991).
A captana, o captafol e o folpete preferencialmente, reagem com enzimas do
grupo sulfidrilo (-SH) mas podem também atacar grupos amina e inibir enzimas que não
contêm grupos sulfidril (Hewitt, 1998).
1.2.2 – Fungicidas sistémicos
A aparição no mercado de compostos químicos de acção sistémica abriu e
melhorou as possibilidades no combate a patogéneos do género Phytophthora.
O desenvolvimento de fungicidas sistémicos para controlar Oomicetas, nos quais
estão incluídos parasitas obrigatórios como os míldios, Phytophthora e Pythium começa
10
em 1976 com o cimoxanil (Serres & Carraro, 1976), seguido do metalaxil (Urech et al.,
1977), furalaxil (Schwinn et al, 1977, ofurace (Lukens et al, 1978), oxadixil (Gisi et al,
1983) e fosetil-Al (Bertrand et al., 1977; Williams et al, 1977).
Schwinn (1987) classifica os fungicidas sistémicos em quatro classes diferentes
de compostos: carbamatos, oxinas cianoacetamidas, acilaminas e os etilfosfitos (Quadro
2). Erwin & Ribeiro (1996) acrescentam a estes quatro grupos, os isoxazoles, dos quais
faz parte o fungicida hymexazol.
Um fungicida sistémico é caracterizado como um composto que pode ser
absorvido passivamente ou activamente através das raízes, ramos, folhas e flores e ser
translocado para outra área da planta. A translocação pode ser através das folhas
(mobilidade translaminar), no sentido ascendente para os novos crescimentos
(apoplástico) ou no sentido descendente (simplástico). A maioria dos fungicidas
sistémicos deslocam-se no sentido ascendente com o fluxo de transpiração, no entanto,
o fosetil-Al desloca-se em ambos os sentidos (no fluxo de transpiração e no floema).
Quadro 2 – Fungicidas sistémicos para o controlo de Phytophthora spp. (adaptado de
Schwinn, 1987).
Classe química
Nome comum Nome comercial
Carbamatos
Protiocarbe
Propamocarbe
Previcur S70
Previcur N
Oxinas cianoacetamidas
Cimoxamil
Curzate
Acilamina
Furalaxil
Metalaxil
Fongarid
Ridomil, Acilon, Aprom
Etilfosfitos
Milfuram
Benalaxil
Fosetil-Al.
Patafol, Caltan
Galben
Aliette
Os fungicidas sistémicos são menos susceptíveis de perdas devidas à chuva que
os fungicidas protectores e podem suprimir o patogénio após a infecção ter ocorrido. A
eficácia de um fungicida sistémico é maior que a de um fungicida protector e durante
um período mais longo. As principais aplicações práticas destes fungicidas sistémicos
encontram-se descritas no Quadro 3.
1.2.2.1 – Carbamatos
Os carbamatos são principalmente activos como tratamentos do solo contra
doenças das raízes e caules causadas por Phytophthora spp. e Pythium spp., em
11
ornamentais (Englander et al, 1980; Favreau, 1978; Pieroh et al., 1975), algumas
hortícolas, e tabaco (McIntyre & Lukens, 1977).
Quadro 3 – Principais aplicações práticas dos fungicidas sistémicos contra
Phytophthora e outros fungos Oomicetas (Adaptado de (Erwinn & Ribeiro, 1996).
Composto
Protiocarbe
Propamocarbe
Principal uso
Doenças de raízes
caules
Principais culturas
e Ornamentais, vegetais
Método de aplicação
Imersão
Hymexazol
Doenças de raízes
caules em plântulas
e Arroz, beterraba
Imersão, molhando as
sementes, em pó
Furalaxil
Doenças
caules
e Ornamentais
Imersão
Cimoxanil
Doenças foliares
Fosetil-Al
Folhas, caules, e doenças Vinha, abacate,
radiculares
ananás, citrinos,
ornamentais
Pulverização,
imersão, injecção
Metalaxil e
compostos
relacionados
Folhas, caules e doenças Vinha, batata, abacate,
radiculares
ananás, citrinos,
tabaco, lúpulo, milho,
sorgo e milho-miúdo
Pulverização,
imersão, grânulos,
molhando as
sementes
de
raízes
Vinha, batata
Pulverização
O protiocarbe é translocado apoplasticamente nas plantas (Ryan, 1977). Segundo
Iwan & Goller (1975), nenhuma evidência tinha sido ainda encontrada para o transporte
simplástico. Apesar do transporte apoplástico ter sido estabelecido, as raízes parecem
apresentar uma substancial barreira à absorção do protiocarbe (Kluge, 1978), o qual
pode explicar a acção um tanto limitada destes carbamatos.
O prothiocarbe tem uma capacidade sistémica limitada e não é translocado a
partir do ponto de aplicação. O prothiocarbe é activo contra Aphanomyces, um membro
das Saprolegniales, e Bremia, um míldio dos Perenosporales (Schwinn & Staub, 1987).
O propamocarbe (Figura 1) é um análogo do protiocarbe no qual uma molécula
de oxigénio substitui o enxofre. O propomocarbe é translocado das raízes para os novos
rebentos.
Figura 1 – Estrutura química do propamocarbe
12
De acordo com Schwinn & Satub (1987), o propamocarbe e o protiocarbe são
usados em culturas hortícolas e ornamentais. Em aplicações ao solo em altas
concentrações foram supressivos para podridões radiculares do rododendro causadas
por P. cinnamomi (Englander et al., 1980), e para podridões radiculares do tabaco
causadas por P. parasitica var. nicotianae (Reilly, 1980).
Apesar das indicações que o propomocarbe e o protiocarbe são sistémicos e
activos contra Phytophthora, elas não foram amplamente usados comercialmente
(Erwin & Ribeiro, 1996).
1.2.2.2 – Oxinas cianoacetamidas (acetamidas)
Pouco tempo depois da introdução dos carbamatos, apareceu o cimoxanil
(Denis, 1976; Richards & Delp, 1976; Serres & Carraro, 1976). O cimoxanil (Figura 2)
foi desenvolvido pela DuPont e foi comercializado na Europa como curzate desde 1979.
Este fungicida é sistémico na forma apoplástica e tem actividade selectiva contra fungos
Peronosporales, embora dentro deste género os fungos tenham diferentes sensibilidades
ao cimoxanil (Erwin et al., 1987).
O cimoxanil tem grande capacidade de penetrar a folhagem e tem mais
propriedades curativas que o propamocarbe e o protiocarbe. Este fungicida é
rapidamente metabolizado nos tecidos da planta e tem uma meia vida de apenas alguns
dias (Klopping & Delp, 1980).
Figura 2 – Estrutura química do cimoxanil
A actividade do cimoxanil nas folhas tem demonstrado ser menor que o
metalaxil ou o fosetil mas mais longa que os fungicidas protectores. (Schwinn & Staub,
1987; 1995; Schwinn & Margot, 1991). É eficaz em pulverização foliar contra o míldio
da batateira, causado por P. infestans, e míldio da vinha causado por Plasmopara
vitícola (Douchet et al, 1977; Schwinn & Staub, 1987; 1995).
O cimoxanil é mais eficaz contra o estado de crescimento hifal do que as fases
iniciais (o desprendimento dos zoóporos dos esporângios e a sua germinação). O
13
composto inibe a biossintese do ácido nucleico e proteínas em P. cinnamomi e Botrytis
cinerea, mas é provável que a actividade seja induzida por uma interacção com os
processos metabólicos do hospedeiro (Hewitt, 1998).
O cimoxanil não é suficientemente persistente para ser usado sozinho, porque a
sua acção protectora perde-se em poucos dias, no entanto tem um efeito curativo forte
durante 3-4 dias após a infecção, dependendo da duração do período de incubação.
Devido ao seu tempo de meia vida ser relativamente curto, o cimoxanil é usado em
baixas concentrações, principalmente em combinação com um fungicida preventivo
como o mancozebe ou o folpete (Erwin & Ribeiro, 1996) para induzir actividade a
longo prazo e através da sua actividade curativa e prolongar o intervalo entre as
pulverizações (Hewitt, 1998). Estas misturas têm um efeito sinergético e aumentam a
duração da actividade protectora (Klopping & Delp, 1980). Tem sido usado com
sucesso em combinação com o oxadixil (Schwinn & Staub, 1987).
1.2.2.3 – Fenilamidas
Entre os compostos fenilamidas, o furalaxil, o metalaxil e o benalaxil estão
incluídos nas acilalaninas, o ofurace e o ciprofuram nas acilamino-butirolactonas, e o
oxadixil nas acilamino-oxazolidinonas (Schwinn & Staub, 1987). Estes compostos tem
alta actividade específica contra Oomicetas. A base desta especificidade é desconhecida
(Hewitt, 1998).
As acilalaninas são altamente eficazes quer in vitro quer in vivo contra todos os
fungos patogénicos da ordem Peronosporales. A molécula mais eficaz dentro desta
classe de fungicidas é o metalaxil (Schwinn, 1987). Outro membro desta classe, o
furalaxil está particularmente adaptado para uso em ornamentais (Wiertsema &
Wissink, 1977).
O desenvolvimento do fungicida sistémico metalaxil [N-(2,6-Dimethylphenyl)N-(methoxyacetyl)alanine] (Figura 3) foi um marco na história do controlo de fungos
patogénicos dentro dos Peronosporales, sendo também considerado por Urech et al.
(1977) e Schwinn et al. (1977) como o mais activo e versátil dos fungicidas para o
controlo de doenças provocadas por Phytophthora.
O metalaxil é formulado como um pó molhável para ser usado por pulverização
foliar e como material granular para ser aplicado ao solo na altura da plantação. O
14
produto é comercializado com os seguintes nomes: Ridomil para aplicação foliar, Apron
para tratamento de sementes e Subdue para aplicação ao solo (Erwin & Ribeiro, 1996).
O metalaxil é solúvel em água e eficaz contra todas as espécies de Phytophthora
em doses muito baixas. No entanto nenhum dos compostos fenilamidas tem qualquer
efeito em fungos não Oomicetas. Para obter um controlo destes fungos outros
compostos têm de ser adicionados ao metalaxil e aos outros compostos fenilamidas
(Erwin & Ribeiro, 1996).
Figura 3 – Estrutura química do metalaxil
Estudos sobre a resposta de crescimento de várias espécies de Phytophthora a
diferentes doses de metalaxil em meio de cultura CMA (Corn Meal Agar) mostraram
diferentes sensibilidades das espécies de Phytophthora (Erwin & Ribeiro, 1996),
variando os valores do EC50 entre os 2-30 ng/ml para P. boehmeriae (Bailey & Coffey,
1984) e os 19 µg/ml para P. drechsleri f. sp. cajani (Chauhan & Singh, 1987). A dose
de resposta (EC50) de P. cinnamomi ao metalaxil é apresentada no Quadro 4.
Quadro 4 – EC50 do metalaxil (concentração que inibe o crescimento micelial em 50%)
de Phytophthora cinnamomi (adaptado de Erwin & Ribeiro, 1996)
Dose mínima
P. cinnamomi (A1 e A2)
Referência
EC50 0,07-0,29 µg/ml
Coffey et al. (1984)
EC50 0,075 µg/ml
Coffey & Bower (1984)
EC50 0,11 µg/ml
Benson (1979)
EC50 0,9 µg/ml
Fuller & Gisi (1985)
90 % da inibição da formação dos Geissler & Katekar (1983)
zoósporos a 10 µg/ml (furalaxil) e
25 µg/ml (metalaxil)
15
Um estudo efectuado por Gouveia (2004) sobre a sensibilidade ao metalaxil de
isolados de P. cinnamomi e P. cambivora, associadas à doença da Tinta do Castanheiro,
revelou diferentes sensibilidades destas duas espécies, tendo P. cambivora revelado
menor sensibilidade ao metalaxil. Os isolados de P. cinnamomi apresentaram grande
variabilidade quanto aos valores de EC50 tendo variado entre 0,09 µg/ml para o isolado
mais sensível e 14,8 µg/ml para os isolados mais tolerantes. Um isolado apresentou o
valor de EC50 de 14,8 µg/ml, o que pode ser considerado um valor elevado podendo ser
indicativo da possibilidade do aparecimento da resistência em relação ao fungicida
metalaxil.
O metalaxil movimenta-se apoplasticamente a partir de sementes, raízes e folhas
para os novos crescimentos (Staub et al 1978; Zaki et al, 1981; Gupta et al, 1985); por
isso o efeito sistémico e curativo que o metalaxil exerce nas plantas faz com que seja
mais vantajoso que os fungicidas curativos (protectores) especialmente quando a
infecção ocorreu antes da aplicação. Alguns estudos descrevem a translocação
simplástica (basipetal) do metalaxil (Staub et al., 1978; Zaki et al., 1981) embora este
movimento seja de menor importância. Sendo o metalaxil solúvel em água, ele pode ser
aplicado ao solo onde é prontamente transportado pelas raízes e translocado
apoplasticamente nos tecidos das plantas (Schwinn, 1983; Bruck, et al., 1980, Schwinn
& Staub, 1987). O metalaxil é um exemplo de um fungicida com acção no interior da
planta, sendo tóxico contra Phytophthora quando esta infecta e cresce em plantas
(Schwinn & Staub, 1987, 1995).
O metalaxil tem um efeito supressivo específico no RNA ribossomal (rRNA)
(Davidse, 1987, 1995; Davidse et al, 1983). Davidse (1987) explica que a inibição da
síntese de rRNA em última análise leva á inibição do desenvolvimento do fungo pois a
redução do rRNA priva as células dos ribossomas que regulam a síntese de proteínas.
Assim, o metalaxil normalmente não inibe a germinação dos esporângios ou dos
esporos enquistados tão eficazmente como o faz com o crescimento micelial porque os
esporos intactos aparentemente têm suficientes ribossomas para formar o tubo
germinativo (Erwin & Ribeiro, 1996); no entanto, quando os tubos germinativos de
Phytophthora penetram a folha, o metalaxil que tem sido translocado dentro da
folhagem tratada é capturado pelo micelio. O metalaxil causa depois malformação e
cessação do crescimento do micélio infectado.
Bruck et al (1980) e Staub et al. (1980) comparam os locais de acção do
metalaxil no ciclo de vida do patogénio P. infestans com um fungicida residual como o
16
manebe. Enquanto o manebe inibe a formação de zoósporos a partir dos esporângios, a
germinação dos zoósporos e a penetração inicial, o metalaxil inibe a formação
secundária dos haustórios, o crescimento micelial dentro da folha e a formação de lesões
e esporulação. Um fungicida preventivo como o manebe, no entanto, mata os esporos
germiantivos em poucas horas na folha, mas não tem efeito no micelio após este ter
penetrado nas folhas (Erwin & Ribeiro, 1996). Uma vez que a infecção tenha ocorrido
os fungicidas preventivos têm pouco ou nenhum efeito no progresso da doença porque
Phytophthora pode progredir sem impedimentos se tiver infectado as células internas
das folhas antes da aplicação do fungicida. O metalaxil afecta o desenvolvimento do
micélio na folha só após penetração (Grohmann & Hoffman, 1989).
Torna-se evidente que o metalaxil interfere muito mais com o desenvolvimento
do fungo durante grande parte do ciclo da doença que o manebe, devido à sua rápida
penetração no tecido hospedeiro. O metalaxil é eficaz contra todos os estados de
desenvolvimento da doença dentro do tecido hospedeiro, ao passo que um fungicida
residual de contacto interfere unicamente com a fase inicial, por exemplo a formação de
zoósporos a partir dos esporângios ou a germinação dos esporângios (Scwinn, 1987).
In vitro, o metalaxil inibe o crescimento micelial e a formação de clamidósporos
e esporangios. A concentração requerida para inibir a formação de esporângios é 25
vezes mais baixa do que a inibe a formação de clamidósporos e100 vezes mais baixa
que a necessária para inibir o crescimento micelial (Schwinn, 1987).
Como o metalaxil é solúvel em água e é absorvido pelas raízes, tem sido
utilizado com sucesso usado em imersão ou em grânulos em culturas tais como a soja
(Schmitthenner, 1985) e muitas plantas ornamentais crescendo em contentores em
viveiros (Benson, 1979, 1990). Devido ao longo tempo de meia vida do metalaxil nos
solos (15 a 30 dias) e a sua alta mobilidade, a sua actividade no solo é excelente (Cohen
& Coffey, 1986).
Para culturas como a batata, o tomate e culturas hortícolas nas quais ocorrem
doenças foliares simultaneamente com doenças provocadas por Phytophthora, as
acilalaninas são mais eficientes misturadas com outros fungicidas alargando-lhe o
espectro de actividade (Urech et al, 1977). Similarmente estas misturas melhoram o
nível de controlo nas folhas senescentes, nas quais as acilalaninas são menos eficazes,
por razões desconhecidas que nos tecidos mais jovens (Schwinn, 1987). Estas misturas
são consideradas uma ferramenta valiosa para reduzir o risco de desenvolvimento de
resistência em populações de Phytophthora spp.
17
Quando o metalaxil é usado repetidamente em alguns solos ele degrada-se
rapidamente devido à acção de fungos e da flora bacteriana (Bailey & Coffey, 1984).
Bailey & Coffey descobriram que o tempo de meia vida do metalaxil era marcadamente
reduzido em solos tratados com metalaxil, estando as bactérias e fungos associados com
a biodegradação do metalaxil.
No inicio da década de oitenta do século XX, em plantações de batatas, na
Europa Ocidental, especialmente na Holanda e Irlanda e depois progressivamente no
resto do mundo, foram aparecendo casos de resistência ao metalaxil em isolados de P.
infestans (Schwinn, 1987). O repetido uso do metalaxil aplicado no campo estabeleceu
uma contínua e alta pressão de selecção que favoreceu o desenvolvimento da resistência
(Hewitt, 1998). Para evitar este problema, as empresas começaram a comercializar
misturas de acilalaninas com fungicidas convencionais como os ditiocarbamatos e
ftalamidas para uso contra patogénios das folhas (Schwinn, 1987). Tais misturas não
foram desenvolvidas para patogénios do solo porque o risco da resistência era
considerado baixo. Apesar de não terem aparecido casos de resistência em espécies de
Phytophthora, que sejam patogéneos do solo, as evidências genéticas demonstradas pela
investigação em P. infestans sugerem que um aumento da resistência nestes patogénios
pode ocorrer (Erwin & Ribeiro, 1996).
1.2.2.4 – Etilfosfitos
Os alquil-fosfonatos são uma classe de fungicidas sistémicos com boa actividade
contra doenças causadas por fungos pertencentes à ordem Peronosporales,
particularmente o míldio da videira, o míldio do lúpulo e muitas doenças da raiz e do
colo causadas por Phytophthora spp.
Os fungicidas fosfonatos incluem o fosetil-Al e os produtos da sua
decomposição, o ácido fosfórico. O desenvolvimento do fosetil-Al é um marco na luta
química contra doenças causadas por Phytophthora, apesar da sua actividade
relativamente fraca contra o míldio da batateira causada por Phytophthora infestans, e a
podridão radicular da soja, causada por P. sojae. Fosetil-Al e o ácido fosfórico, quase
sempre referido como fosfitos, mas mais correctamente denominados por fosfonatos,
(Coffey & Ouimette, 1989), são notavelmente eficazes para o controlo de doenças
radiculares causadas por Phytophthora em abacaxi (Rohrbach & Schenck, 1985),
abacate (Coffey et al., 1984; Darvas et al., 1984; Pegg et al., 1985; Coffey, 1987; De
18
Boer et al, 1990), citrinos (Laville, 1979; De Boer et al, 1990; Le Roux et al., 1991) e
nogueira (Matheron & Mircetich, 1985).
O fosetil-Al (Aliette) (Figura 4) é quimicamente conhecido como alumínio TrísO-ethyl fosfonato e foi descrito pela primeira vez em França (Bertrand et al., 1977;
Williams et al., 1977). Em 1977 iniciou-se a sua comercialização sob patente da RhonePoulenc Agrochemie Company. O Aliette foi inicialmente rotulado para o controlo de
doenças provocadas por Pythium em campos de golfe e usado nos relvados como
tratamento preventivo (Landschoot & Cook, 2005).
Figura 4 – Estrutura química do fosetil de alumínio (fosetil-Al)
O fosetil-Al tem alta actividade fungicida na maioria das espécies do grupo
Peronosporales, no entanto algumas espécies, tais como P. infestans, são relativamente
insensíveis (Erwin et al, 1987). Por outro lado alguns patogéneos, como Guignardia
spp., Alternaria spp., e Cercospora spp., outros grupos taxonómicos que não os
Perenosporales são também controlados (Bertrand et al., 1977; Chalazet et al, 1977).
Este produto inibe a formação de esporângios e zoósporos em P. citrophthora,
P. parasitica, P. cactorum e P. citricola, e a produção de oósporos e clamidósporos em
P. citricola e P. cinnamomi. P. megasperma e P. infestans são comparativamente
insensíveis (Farih et al., 1981).
O fosetil-Al é o primeiro fungicida comercial que é verdadeiramente sistémico.
É translocado quer por movimento acropetal (raiz-copa) quer por movimento basipetal
(copa-raiz) após aplicação foliar (Bertrand et al., 1977). Isso resulta numa acção
curativa e leva à protecção temporária das novas folhas formadas após a aplicação. No
entanto, este efeito parece ser obtido à custa da sua concentração nas folhas
pulverizadas, o que diminui o efeito protector destas folhas (Schwinn, 1987). O fosetilAl é recomendado contra doenças foliares em misturas com fungicidas residuais como o
folpet e mancozebe. Estas combinações mostram um efeito sinergético que permite
19
prolongar os intervalos entre as aplicações (Chalazet et al., 1977; Lafon et al., 1977;
Marais & van der Walt, 1978).
O fosetil-Al rapidamente se converte a ácido fosfórico ou sal de fosfato ou outro
componente menor (Fenn & Coffey, 1984; Saindrenan et al., 1985; Cohen & Coffey
(1986); Coffey & Ouimette, 1989; Guest & Grant, 1991; Griffiths et al., 1992). A
toxicidade in vitro do fosetil-Al contra as diferentes espécies de Phytophthora em meio
convencional é relativamente baixa (1000 µg/ml ou superior) (Clerjeau & Beyries,
1977; Bompeix et al., 1980; Farih et al., 1981); no entanto a fungitoxicidade para P.
cinnamomi num meio sintético (Ribeiro et al., 1975) no qual o nível de fosfito é baixo
(0,084 mM) ocorre a concentrações tão baixas como 10 µl/ml para o ácido fosfórico e
50 µl/ml para o fosetil-Al.
A descoberta que o ião fosfonato era o princípio activo do fosetil-Al (Bompeix
& Saindrenan, 1984; Bower & Coffey, 1985; Fenn & Coffey, 1984, 1985; Coffey &
Joseph, 1985) estimulou a investigação do fosfonato como um fungistático e também
como um meio de controlo de doenças causadas por Phytophthora. O fosetil-Al é eficaz
no controlo de doenças após Phytophthora se ter estabelecido (Griffith et al., 1992).
Guest & Grant (1991) relatam em alguns estudos que injecções no tronco do abacateiro
com fosfonato controlaram com sucesso a podridão radicular causada por P.
cinnamomi.
A introdução do fosetil-Al melhorou marcadamente a luta química contra
doenças de folhas, frutos, caules e raízes provocadas por Phytophthora. Esta substância
química é particularmente valiosa contra alguns patogénios do solo em culturas anuais,
culturas perenes, e em ornamentais anuais e perenes (Schwinn, 1987).
20
1.3 – A luta química no combate à Doença da Tinta do Castanheiro
1.3.1 – A luta química em Portugal
A primeira referência que se conhece no combate à Doença da Tinta do
Castanheiro é dos finais do século XIX e deve-se ao italiano Gandolfo. Consistia em
abrir uma cova à volta do castanheiro afectado pela doença pondo a descoberto as raízes
principais e a sua inserção no colo do tronco. Para Gandolfo, as baixas temperaturas do
Inverno provocariam a morte do agente causador da doença, e isso curaria o castanheiro
(Cortizo et al, 1999). Este método, tendo obtido resultados positivos, só podia ser
aplicado em regiões de invernos rigorosos, onde as temperaturas se mantinham durante
um longo período de tempo abaixo de zero. Nas regiões de invernos temperados a
eficácia seria duvidosa. Experiências deste tipo foram realizadas no Nordeste
Transmontano, e apesar de os invernos serem bastante frios os fracassos do tratamento
eram frequentes pois mais cedo ou mais tarde os castanheiros acabavam por morrer
(Fernandes, 1979). A idêntica conclusão chegou Urquijo (1941) depois de diversas
observações feitas na região da Galiza.
Este processo manteve-se até a década de 30 do século XX quando o agrónomo
espanhol Urquijo Landaluze modificou o procedimento de Gandolfo ao aplicar
fungicida às raízes e ao tronco que ficam descobertas, o qual ficou conhecido como
“Método Urquijo”. O método só em 1941 viria a ter um maior incremento depois de
Urquijo ter realizado várias experiências para determinar o poder fungicida dos diversos
sais de cobre com possibilidade de aplicação no combate contra a doença, de modo a
encontrar um sal de cobre mais eficaz e que tornasse o tratamento económico,
permitindo-lhe melhorar bastante o seu método. Para Urquijo, a solubilidade dos
produtos cúpricos a utilizar nos tratamentos era o principal factor a considerar, razão
pela qual empregou nos seus ensaios, sais de cobre pouco solúveis não só porque
asseguram um maior período de eficácia, mas também porque evitam o perigo de
intoxicações das árvores (Fernandes, 1947). De todos os produtos cúpricos ensaiados, o
óxido cuproso mostrou-se ser o mais activo, tendo-se usado em Espanha a seguinte
mistura:
Carbonato ou oxicloreto de cobre a 17% ............................... 2 partes
Óxido cuproso ........................................................................ 1 parte
Caulino ou gesso .................................................................... 2 partes
21
O “Método Urquijo” consistia em três operações (Suarez, 1989): 1) descasque
do tronco e raízes mais grossas até 40-50 cm de profundidade, pondo-as a descoberto e
limpando-as com uma escova de arame para não ficar terra aderente; 2) molhar todas as
partes descobertas com água, ou com um aderente. Usou-se, como aderente, cola de
carpinteiro ou produtos à base de resina. Fernandes (1947) refere o uso em Espanha do
produto “Ipem” feito à base da resina, na proporção 1:1000; 3) Aplicação do produto
cúprico de forma a constituir-se uma camada uniforme de pó em volta da base do troco
e das raízes. Depois de bem espalhado, de modo que cubra todas as raízes e o tronco na
sua parte enterrada, cobre-se novamente com terra, tapando com cuidado para que o
produto aderido à raiz não seja arrastado por terra. Urquijo (1971) aconselhava esperar
um pouco antes de se cobrir as raízes com terra, mas era aconselhado cobrir sempre que
se esperasse chuva.
Urquijo aconselhava a não se tratarem árvores com mais de 1/3 do perímetro
infectado de modo a evitar fracassos. Como preventivo, o método mostrou ser dos
melhores no combate à doença da tinta, pois raramente os castanheiros tratados
apareciam infectados (Fernandes, 1947). Segundo o mesmo autor, os estudos efectuados
pelo micologista Urquijo Landaluze permitiram assim salvar muitos castanhais tendo as
árvores tratadas reagido muito bem aos tratamentos e muitas delas voltaram a dar fruto
após a aplicação do sal de cobre.
O carácter epidémico da Doença da Tinta e os sucessivos anos de devastações
que levaram ao desaparecimento de um elevado número de soutos de Norte a Sul de
Portugal levaram, no início da década de 40 do século XX, os poderes públicos a agir
para se estudar o problema da Doença da Tinta em Portugal e encontrar soluções para o
seu combate. Os Serviços Florestais nomearam nessa década Lopes Pimentel para
estudar a doença e encontrar métodos de luta eficazes. Apoiando-se nestes estudos
Vieira Natividade elabora em 1944 o Plano de Valorização e Defesa do Castanheiro.
Com base neste plano e nos resultados obtidos em Espanha, inicia-se em 1945 uma
campanha de tratamento contra a doença da tinta do castanheiro, com a utilização de
sais de cobre pouco ionizáveis seguindo o “Método Urquijo”, com ligeiras
modificações, para melhor se adaptar às condições agro-climáticas e possibilidades
económicas e sociais de Portugal.
O método, aparentemente simples, exigia cuidados especiais para que o êxito do
tratamento fosse assegurado e compreendia as seguintes fases (Fernandes, 1966): 1)
abertura de uma cova ou caldeira à volta da árvore a uma profundidade de 40 a 50 cm;
22
2) limpeza de todo o sistema radicular posto a descoberto e cerca de 20 cm do tronco, a
partir do colo, com uma escova de arame de aço; 3) lavagem e aplicação de um aderente
molhante nas raízes e tronco; 4) polvilhamento das mesmas regiões com um sal
insolúvel de cobre; 5) aterro da caldeira alguns minutos após o tratamento.
Após vários estudos sobre os produtos aderentes a utilizar, Fernandes (1949)
conclui que o aderente «P» era o único que reunia as melhores qualidades, pois além de
não ser cáustico, tinha uma aderência perfeita na concentração de 3/1000.
Os tratamentos contra a Doença da Tinta do castanheiro tiveram início no
concelho de Vinhais, por se tratar de uma das regiões de maior interesse para a cultura
do castanheiro e onde a doença mostrava tendências para alastrar (Fernandes, 1953),
tendo depois continuado os tratamentos por outros concelhos do distrito de Bragança,
Vila Real, Viseu e Guarda.
Relativamente ao período de tratamento, enquanto que em Espanha se
realizavam tratamentos em qualquer época do ano, Fernandes (1947) aconselhava a
fazer-se os tratamentos na época de Julho a Novembro, pois as condições climatéricas
durante o Inverno, nas regiões onde se iam efectuar esses mesmos tratamentos não eram
as mais favoráveis para a realização destas operações.
Aplicado no primeiro ano sem o sucesso esperado, pois os tratamentos incidiram
sobre árvores muito doentes, o método viria a ser alterado nos anos seguintes com a
aplicação de tratamentos em árvores até 1/3 dos ramos da copa com sintomas evidentes,
segundo a recomendação de Urquijo, e de forma preventiva em árvores suspeitas ou
sem sintomas da doença.
Fernandes (1952) evidenciava que os castanheiros sujeitos a tratamento tinham
reagido favoravelmente pelo que poderia considerar bom o método seguido, e que
quando o método era aplicado como preventivo mostrava-se mais eficaz pois a
percentagem de indivíduos que não reagiam ao tratamento era de 1%, enquanto que
quando era aplicado como curativo as falhas eram de quase 5%.
Com base nos resultados obtidos, Fernandes (1953) considerava o método bom e
que se devia continuar a usar enquanto não existam outros métodos mais expeditos e
económicos e não existam plantas resistentes em número suficiente para distribuir pelas
regiões infectadas pois os tratamentos apesar de inicialmente dispendiosos, cerca de
10$00 por árvore, as árvores salvas compensavam toda a despesa num só ano de
produção e também pelo efeito dos tratamentos que ultrapassava o limite previsto (mais
de 7 anos), quando aplicado como preventivo.
23
A luta contra a Doença da Tinta foi também seguida em viveiros que se
encontravam contaminados. A aplicação da solução de sulfato de cobre a 2% e a 4% ou
da aplicação de carbonato de cobre em pó à razão de 100 g/m2, além do arranque e
queima de todas as plantas mortas ou com sintomas de doenças, permitiu a produção de
plantas sãs.
No início da década de 50, apesar dos resultados obtidos, o custo dos
tratamentos era ainda elevado devido ao preço dos fungicidas que encarecia de ano para
ano e ao preço da mão-de-obra. De modo a tornar o método mais económico e eficiente
foram realizados ensaios quer em laboratório quer no campo com o objectivo de se
estudarem diversos produtos cúpricos. Em laboratório estudaram-se vários fungicidas
sólidos quanto à solubilidade e à acção repulsiva aos parasitas, tais como carbonato de
cobre, Coppesan, Cobre Sandoz, Vericuivre, Dithane Z-78, Dithane M-45 e Cupertane
(Fernandes, 1966), tendo-se verificado a eficácia de todos os fungicidas. Em 1951
foram experimentas as misturas cúpricas de cobre Sandoz (óxido cuproso) e gesso (1:2)
e Perenox e gesso (1:1), tratando os castanheiros pelo método de Urquijo, uns sãos e
outros em vários estados de infecção. Segundo Fernandes (1955), o tratamento com as
duas misturas cúpricas acima mencionadas era mais vantajoso sob o ponto de vista
económico do que com a mistura anteriormente utilizada (2:1:2).
Além dos métodos de defesa directa referidos, Taveira Fernandes desenvolveu
um novo método onde se experimentou a aplicação da mistura cobre Sandoz e gesso
(1:2) incorporada no terreno por meio de uma cava funda, até uma profundidade de 30
cm, sobre toda a superfície correspondente à projecção da copa e à razão de 100 g/m2
(Fernandes, 1955).
O novo método desenvolvido por Taveira Fernandes, de fácil aplicação, revelou
ser mais económico, pois as despesas com a mão-de-obra eram em média bastante
inferiores que o tratamento realizado pelo método Urquijo o que permitiu reduzir o
custo dos tratamentos por árvore tratada.
Fernandes (1966) refere também a vantagem de este método poder ser aplicado
com certo êxito aos povoamentos em regime de talhadia, desde que o solo não seja
muito pedregoso e em viveiros.
Além destes métodos foram também ensaiados o processo de injecção de
fungicidas líquidos, e a aplicação de fungicidas líquidos por pressão em castanheiros de
madeira explorados em regime de talhadia, tendo-se utilizado soluções de sulfato de
cobre em diferentes concentrações, mas sem grandes resultados na época em causa
24
(Fernandes, 1970), pois havia dificuldades em introduzir perfeitamente o fungicida na
seiva e em encontrar doses mínimas letais para o parasita sem prejudicar o normal
desenvolvimento da planta.
Desde 1945 até 1973 foram tratados contra a Doença da Tinta cerca de 1000000
de castanheiros. Pelo método Urquijo ou pelo processo de incorporação de uma mistura
cúprica por meio de uma cava funda manteve-se a produtividade de centenas de milhar
de castanheiros a maioria dos quais sucumbiram sem os tratamentos. Inúmeras regiões
das províncias de Trás-os-Montes, Alto Alentejo, Beira Alta e Beira Baixa mantiveram
os seus soutos em plena produção graças aos tratamentos aplicados (Fernandes, 1970).
Fernandes (1974) afirmava que embora muitas árvores sucumbissem, os êxitos
alcançados com os tratamentos aplicados eram significativos para se continuar as
campanhas de tratamento contra a Doença da Tinta do Castanheiro. No entanto, apesar
dos êxitos descritos por Fernandes, os trabalhos realizados no combate à Doença da
Tinta ficavam aquém do esperado, pois as verbas atribuídas para a defesa dos soutos
eram insignificantes em relação ao que seria necessário para tratar todas as regiões onde
o castanheiro tinha interesse económico e onde a doença causava prejuízos bastante
significativos. As dificuldades no recrutamento da mão-de-obra para a realização das
operações que eram cada vez maiores e o agravamento do preço dos fungicidas,
impediam também que fosse tratado um maior número de árvores.
Fernandes afirmava que as despesas dos tratamentos deviam continuar a cargo
do estado devido á dificuldade de aplicação do método e ainda de o castanheiro ser uma
cultura de regiões agrícolas deficitárias pois se assim não fosse que o país se arriscava a
ver num período não muito longo os soutos totalmente destruídos pela doença. O autor
afirmava também que o custo médio por árvore tratada era insignificante quando
comparado com o seu rendimento em fruto, realçando as vantagens que se alcança não
só pelo valor da castanha que sendo um fruto seco de alta qualidade tem mercado
assegurado, tanto interno como externo, mas também pela madeira que se desvaloriza
consideravelmente pela acção da doença.
No entanto, como a luta directa contra a doença da tinta só interessa para a
defesa dos soutos em exploração, fica por resolver o problema da sua reconstituição em
terras grandemente infectadas e da expansão da cultura pois não se consideram regiões
imunes ao parasita.
25
Os custos muito elevados de mão-de-obra impediram que desde 1975 o método
de Urquijo pudesse continuar a ser aplicado no nosso país no combate preventivo e
curativo contra a doença da tinta do castanheiro (Dias, 1991).
Na década de 90 foi adoptado um novo método de combate à doença da tinta do
castanheiro nos soutos portugueses, denominado GAFEX. Segundo Dias (1991), o
método GAFEX é sequência natural dos métodos anteriormente referidos e tem como
base trabalhos desenvolvidos por Magalhães et al (1985) sobre a redistribuição do ião
cobre exógeno nos perfis de alguns solos vitícolas onde foi demonstrado que aplicações
repetidas de cobre a superfície do solo formavam uma fase cúprica no perfil do solo,
resultante da percolação ou lixiviação dos depósitos superficiais do cobre até uma
profundidade determinada, variando a concentração de cobre desde os 117,8 ppm de Cu
total à superfície e 38 ppm entre os 45 e os 100 cm de profundidade.
O método desenvolvido por Dias (1991) descreve-se nos passos seguintes:
a) O ião cobre é aplicado à superfície do solo na zona envolvente do tronco e na
própria base deste, sem que o solo tenha sido removido.
b) Da superfície o cobre migra até uma determinada profundidade. A percolação é
feita pela água da chuva que o arrasta e o redistribui.
c) O método GAFEX não é um método curativo antes um método preventivo,
admitindo-se que em infecções localizadas haja possibilidade de se suspender a
progressão do processo infeccioso geral.
d) O ião cobre utilizado é o que se encontra no oxicloreto de cobre da formulação
GAFEX, sendo de 5 miligramas de Cu por litro de água (5 ppm), a dose letal, LD100,
para os zoósporos de P. cambivora (Viennot-Bourgin, 1949).
e) A preferência dada ao pó molhavel GAFEX reside no facto de uma calda deste
preparado aplicado sobre o tronco até um metro de altura constituir uma reserva de
cobre para redistribuição agregada ao ritidoma do castanheiro. Este deposito é arrastado
gradualmente para o terreno, podendo levar meses essa lavagem.
f) Excluiu-se o carbonato de cobre, por não existir no mercado nacional e o sulfato
de cobre devido às possíveis reacções químicas características dos sais solúveis de
cobre.
g) Uma vez que o ião cobre não é colocado directamente nas zonas a defender, o
processo de percolação ou redistribuição é lento e depende das quedas pluviométricas
inverno-primaveris.
26
O autor recomendava iniciar as aplicações um ano após as plantações e repetir-se
durante 5 anos seguidos ou, no caso de soutos, adultos proceder a uma série de
aplicações anuais durante 5 anos com o objectivo de concentrar o ião cobre na zona
colo-raízes principais devendo atingir os 5 ppm ou mais na zona envolvente do colo.
Dias (1991) admitia que aplicando uma calda de GAFEX a 2,5 % uma vez por ano em
anos sucessivos (até cinco anos) no tronco até um metro de altura e na terra num raio de
1 a 1,25 metros à volta do tronco conseguia obter os 5 ppm na zona envolvente do
tronco.
A aplicação devia fazer-se de Janeiro a fins de Março com a terra já saturada de
água. Dias (1991) salientava o facto de o método ter um carácter preventivo e que as
aplicações muito precoces em soutos recém plantados eram as que melhores resultados
poderiam garantir a longo prazo.
O método deveria ser acompanhado por medidas complementares, importantes no
combate à doença da tinta, tais como, recurso às mobilizações mínimas, adopção de
herbicidas e recolha dos ouriços e sua queima. A folhada devia ser deixada à superfície
do solo.
O método GAFEX, de carácter preventivo, consistia nas seguintes operações:
1º - No início do ano, se necessário, fazer uma caldeira de poucos centímetros de
fundo, à volta das árvores a tratar à distância de 1 metro ou 1,5 metros do tronco.
2º - Em qualquer data de Janeiro a Março fazer o tratamento.
3º - Para o tratamento preparar uma calda de 2,5 kg de GAFEX em 100 litros de
água e aplicar 1 ou 2 ou mais litros desta calda por cada árvore.
4º - A aplicação da calda faz-se com um regador ou pulverizador até à altura de
1 metro no tronco e no terreno à volta do mesmo até 1 ou 1,5 metros de distância.
5º - Repetir este tratamento durante 5 anos seguidos e voltar a repetir o processo
durante outros 5 anos após um intervalo de 5 anos.
6º - Tratar sempre e desde o segundo ano de plantação os castanheiros novos que
deverão vir sãos do viveiro.
7º - Não fazer lavouras nem gradagens no souto. Para combater as ervas, silvas e
rebentos de castanheiro recomendava-se a utilização de herbicidas. Retirar os restos de
ouriços ou queima-los e deixar a folhada no terreno sem a enterrar.
Posteriormente, estudos de avaliação da eficácia do metalaxil e foseil-Al
aplicados ao solo para combater P. cinnamomi em castanheiro foram realizados pela
Direcção Regional de Agricultura de Trás-os-Montes (DRATM) com vista a
27
homologação
destes
produtos
fitofarmacéuticos.
Os
resultados
preliminares
apresentados por Mantas & Sousa (1991) sobre as primeiras observações no controlo
químico, com o fosetil-Al e o metalaxil num souto infectado por P. cinnamomi
revelaram-se satisfatórios. Os mesmos autores referem que o tratamento com o fosetilAl parece apenas provocar uma paragem na evolução dos sintomas na árvore, enquanto
que o tratamento com o metalaxil, para além da paragem na evolução dos sintomas,
provocavam uma melhoria de vigor e uma reconstituição dos tecidos afectados.
O fosetil-Al (Aliette) e o oxicloreto de cobre estão actualmente com autorização
de venda em Portugal, pela Direcção-Geral de Agricultura e Desenvolvimento Rural
(http://www.dgadr.pt/) estando incluídos na lista de substâncias activas homologadas
pela DGADR para o castanheiro (actualizada a 31/03/2009). Durante algum tempo estas
duas substâncias activas estiveram aconselhadas pela DGADR para Protecção Integrada
do Castanheiro no combate à Doença da Tinta.
1.3.2 – Limitações e métodos alternativos de luta química no combate à Doença da
Tinta do Castanheiro.
Os fungicidas sistémicos oferecem grande flexibilidade de uso no controlo de
doenças foliares devido à sua alta actividade fungitóxica, à deslocação rápida para
folhas e ramos após aplicação foliar ou aplicação ao solo e à sua actividade curativa. No
entanto o aparecimento de resistência limitaram o uso de alguns destes fungicidas como
é o caso das acilamidas. O uso de fungicidas químicos vem também sofrendo uma série
de restrições, principalmente devido ao seu efeito residual, aparecendo todos os anos
nova legislação sobre a colocação de produtos fitofarmacêuticos no mercado que
permitam uma utilização sustentável destes pesticidas.
Os meios de luta disponíveis no combate à Doença da Tinta do Castanheiro não
têm, até hoje, resolvido de forma eficiente e duradoura os problemas sanitários das
culturas atacadas por este parasita. O controlo da doença baseia-se em impedir a
infecção e limitar a dispersão do patogéneo mediante medidas culturais, biológicas e
químicas (Smith et al., 1992). Os tratamentos químicos propostos são muito diversos:
pulverização da copa das árvores infectadas com fungicidas e adubações foliares,
injecções no tronco das árvores doentes e aplicação de diferentes produtos fungistáticos
às raízes doentes e ao solo (Navarro et al., 2004).
28
Actualmente estão a se investigadas formas alternativas para o controlo desta
doença, como por exemplo, a aplicação de produtos à base de fosfitos.
Os fosfitos são os sais ou os ésteres do ácido fosforoso, não são tóxicos para a
planta e têm propriedade fungicida (Cohen & Coffey, 1986). A sua acção sobre os
fungos pode-se dar de uma forma directa (Fenn & Coffey, 1985; Rohrbach & Schenck,
1985) ou através da activação de mecanismos de defesa da planta, como o estímulo à
produção de fitoalexinas (Guest & Grant, 1991; Jackson et al., 2000). O tratamento com
fosfitos induz a planta a apresentar resposta imediata ao ataque de patogéneos (Guest &
Bompeix, 1990).
Na Australia, o uso de fosfitos têm produzido bons resultados sobre o controlo
de P. cinnmomi em ecossistemas naturais, (Shearer & Tippett, 1989; Hardy et al., 2001).
A aplicação de fosfito reduziu significativamente a extensão da doença em florestas de
Banksia (Shearer et al., 2004). Estudos de Pilbeam et al. (2000) e Tynan et al. (2001)
mostram o sucesso dos tratamentos de fosfito na redução da colonização de
P. cinnamomi em plantas nativas do Oeste da Austrália. Em Espanha, Navarro et al.
(2006) têm demonstrado a eficácia do fungicida fosfonato no controlo de P. cinnamomi
em Quercus spp.
Perante estes resultados os fungicidas fosfonatos poderão ser uma mais-valia na
luta contra a doença da tinta do castanheiro.
29
1.4 – Os fosfitos na protecção vegetal
1.4.1 – O fósforo e sua influência na planta
O fósforo é um dos principais elementos necessários para o crescimento e
desenvolvimento de todas as espécies vivas. O fósforo não ocorre naturalmente como
elemento livre, pois é muito reactivo, combinando-se rapidamente com outros
elementos, como o oxigénio e o hidrogénio. O ciclo global do fósforo ocorre pela
oxidação e redução de compostos de fósforo por reacções de transferência de electrões
(McDonald et al., 2001). Embora as bactérias estejam envolvidas na reacção redox do
fósforo (Adams & Conrad, 1953; Imazu et al., 1998), o mecanismo bioquímico e
genético dessas transformações não estão ainda bem compreendidos. Quando o fósforo
é oxidado, o produto é um ortofosfato (P043-), no qual quatro átomos de oxigénio estão
ligados a um único átomo de fósforo. A pH neutro o ião ortofosfato está presente como
uma mistura de HPO42- e H2PO4-. É na forma H2PO4- que o ião ortofosfato é
normalmente transportado no interior das células das plantas. O ião P043- está
intimamente envolvido com a bioenergética celular e a regulação metabólica, e é
também um importante componente estrutural das macromoleculas tais como os ácidos
nucleicos e fosfolípidos. Desempenha um papel crítico em praticamente todos os
principais processos metabólicos nas plantas, incluindo fotossíntese e respiração. Ao
contrário do que acontece em algumas células bacterianas (Adams & Conrad, 1953;
Imazu et al., 1998) o fosfato não pode ser reduzido no interior das células de plantas ao
seu estado de oxidação mais baixo. Em vez disso, o ião P043- é sequestrado no interior
dos vacúolos das células ou incorporado na forma orgânica (ex: inicialmente como
ATP) via foto- ou por fosforilação oxidativa. A fosforolise de fosfato de certos ésteres
altamente energéticos por enzimas amido fosforilase também resulta na incorporação
directa do fosfato nos compostos orgânicos (Plaxton, 1998).
Apesar da sua importância para o metabolismo das plantas, o fosfato é um dos
nutrientes menos disponíveis em muitos ecossistemas aquáticos e terrestres. A maior
parte do fósforo na crosta terrestre ocorre numa forma mineral insolúvel que é
largamente indisponível para as plantas (Plaxton, 1998). O uso maciço de fosfatos em
fertilizantes (90% do fosfato mineral usado mundialmente), demonstra que o teor de
fosfato livre na maioria dos solos está em níveis sub-óptimos para o crescimento das
plantas. É largamente aceite que o fosfato é o único nutriente, contendo fósforo,
importante para o óptimo crescimento e desenvolvimento das plantas. No entanto, ao
30
longo dos últimos 20 anos uma forma reduzida de fosfato conhecida como fosfito
(H2PO3-) tem sido usada cada vez mais, para melhorar o rendimento de muitas culturas,
embora, o uso extensivo de fosfitos e seus produtos relacionados, na agricultura, tenha
levantado controvérsia na comunidade científica (McDonald et al., 2001).
1.4. 1.1 – Fosfanato
No sentido mais lato, o termo fosfonato descreve qualquer composto contendo
uma ligação carbono-fósforo. Alguns exemplos de compostos fosfonatos incluem os
insecticidas organofosforados, medicamentos antivirais, retardadores de chama e alguns
herbicidas. Os compostos fosfonatos também podem ocorrer de forma natural em
algumas formas de vida, incluindo os Protozoa, molusculos, coelenterates e Oomicetas
(Guest & Grant, 1991). Os fosfonatos foram inicialmente estudados como fertilizantes
na Alemanha e nos Estados Unidos durante as décadas de 1930 e 1940 (Guest & Grant,
1991). Alguns dos termos usados para identificar produtos fosfonatos encontram-se
descritos no Quadro 5.
1.4.1.2 – Fosfato
Os fungicidas e fertilizantes fosfonatos não devem ser confundidos com os
fosfatos derivados de fertilizantes tais como o fosfato de amónio e o tri-superfosfato,
apesar de os fosfonatos e os compostos de fosfato serem quimicamente muito similares,
eles diferem significativamente na forma como actuam na planta e no fungo
(Landschoot & Cook, 2005).
O fosfato (HPO4-) é transportado nas plantas e incorporado no interior das
células, onde forma uma importante molécula de energia (ATP) e componentes
estruturais das membranas das células e ADN. É essencial para o crescimento radicular,
fotossíntese e respiração nas plantas. Os fungicidas e fertilizantes fosfonatos são
absorvidos pela planta e incorporados no interior das células como iões fosfito (H2PO3).
Este ião tem menos um átomo de oxigénio que o fosfato e por isso não actua da mesma
maneira que o fosfato na planta. Embora o ião fosfito possa ser transportado para o
interior das células das plantas, não parece estar envolvido em qualquer fase do
metabolismo do fósforo (produção de ATP, fotossíntese ou respiração). No solo, ao
longo do tempo, o fertilizante fosfonato no solo pode ser convertido por bactérias
podendo depois ser translocado e metabolizado pelas plantas. Esta conversão não é
31
considerada um meio muito eficiente de libertação de fósforo para a planta quando
comparado com os fertilizantes com fosfato. O ião fosfito tem efeito fungitóxico directo
em certos patogeneos de plantas, um benefício que não é encontrado com o ião fosfato
(Landschoot & Cook, 2005).
Quadro 5 – Alguns dos importantes termos usados para classificar os produtos
fosfonatos (adaptado de Landschoot & Cook, 2005).
Termo
Fosfonato
Ácido fosforoso
Ácido fosfónico
Fosfito
Etil fosfonato
Ácido fosfórico
Fosfato
Definição
Qualquer composto contendo uma ligação carbono-fósforo. Normalmente
usado para descrever produtos feitos de sais ou esteres do ácido fosforoso.
Substância sólida anídrica. Composto químico descrito pela fórmula
HPO(OH)2 ou H3PO3. O ingrediente básico dos produtos fosfonatos.
Ácido forte produzido por dissolução de ácido fosforoso em água. O termo
ácido fosfónico é mais comummente conhecido como ácido fosforoso.
Os fosfitos são os sais ou os ésteres do ácido fosforoso. O fosfito mais
comum é o fosfito de potássio e é feito por mistura de uma solução de
hidróxido de potássio com ácido fosfónico. O fosfito de potássio é também
referido como um sal mono e di-potássio do ácido fosforoso em alguns
produtos fosfonatos. As plantas transportam iões fosfito (H2PO3) mas eles
não são usados no metabolismo do fósfofro. Os fosfitos têm propriedades
fungicidas.
Composto orgânico ligado a um ião alumínio formando alumínio tris (O-Etil
fosfonato) ou fosetil-Al, o ingrediente activo do Aliette.
Ácido forte usado no fabrico do fertilizante fosfato.
Principal componente do fertilizante fosfato, usado na forma de fosfato de
amónio, fosfato de potássio ou fosfato de cálcio. As plantas translocam-no e
usam os iões fosfato (H2PO4- ou HPO4-) para ATP, ADN, fotossíntese,
respiração e outras funções metabólicas. O fosfato não tem propriedades
fungicidas.
1.4.1.3 – Modo de acção do ião fosfonato
O modo de acção dos fungicidas fosfonatos tem sido uma longa fonte de
controvérsia e mistério. Alguns cientistas acreditam que a maior parte do efeito
fungicida destes produtos é exercido directamente sobre o fungo patogénico enquanto
outros acreditam na combinação do efeito directo sobre o fungo e da estimulação das
defesas do hospedeiro na prevenção da doença (Landschoot & Cook, 2005). Afek &
Sztejnberg (1989) sugeriam a existência de que o ião fosfonato tinha uma dupla forma
de acção para o controlo de doenças produzidas por Oomicetas: a) acção indirecta:
potenciando os mecanismos de defesa naturais da planta; b) acção directa: actuando
como fungistático. Estudos com fungicidas fosfonatos incorporados em meio de cultura
não mostraram efeito directo em Pythium aphanidermatum. Portanto, foi assumido que
o modo de acção não envolve a morte do fungo directamente mas antes a estimulação
32
de defesas químicas e físicas da planta contra as doenças (Sanders et al., 1983). No
entanto, estudos posteriores mostraram que meios com fungicidas fosfonatos não
inibiam fungos porque a concentração de fosfato no meio de cultura era demasiado alta.
Baixando a quantidade de fosfato no meio de cultura permitia ao ião fosfito inibir
directamente o fungo. Aparentemente, quer o fosfito quer o fosfato competem pelo
mesmo transporte na membrana celular e o fosfato tende a competir com o fosfito por
esses locais, bloqueando assim a captação de fosfito pelo fungo (McDonald et al, 2001).
Esta descoberta conduziu os cientistas a explorar o modo como os fungicidas fosfonatos
perturbam o metabolismo dos fosfatos no fungo.
Num estudo usando três espécies de Phytophthora, cientistas australianos
descobriram que os fungicidas fosfonatos interferem com o metabolismo do fosfato por
acumulação de dois composto, polifosfato e pirofosfato, nas células do fungo. Pensa-se
que a acumulação deste composto desvia ATP para outros processos metabólicos
resultando num decréscimo do crescimento do fungo (Landschoot & Cook, 2005).
Mais recentemente foram encontrados fungicidas fosfonatos que inibiam
algumas enzimas-chave necessárias para o crescimento e desenvolvimento em
Phytophthora palmivora (Stehmann & Grant, 2000). Esses estudos sugerem que o modo
de acção é pelo menos parcialmente, se não maioritariamente, inibidor directo de
fungos. Além disso, o modo de acção dos fungicidas fosfonatos parece ser
suficientemente amplo pelo que o potencial de desenvolvimento de resistência não é tão
forte como com outros fungicidas sistémicos (Landschoot & Cook, 2005).
Considerando que o ião fosfito tem pouco ou nenhum efeito no metabolismo do
fósforo na planta, parece improvável que possa prevenir doenças por estimulação das
defesas do hospedeiro. Todavia, alguns estudos revelam que quando certas espécies de
Phytophthora infectam determinadas espécies de plantas tratadas com fungicidas
fosfonatos, são produzidos inibidores químicos do fungo chamados de fitoalexinas
(Landschoot & Cook, 2005). Um recente estudo envolvendo Eucalyptus mostrou que a
concentração de ião fosfito na planta pode determinar a dimensão da activação das
defesas do hospedeiro. Quando a concentração do ião fosfito nas raízes era baixo, as
enzimas de defesa do hospedeiro eram estimuladas, mas quando a concentração do ião
fosfito era alta as enzimas de defesa do hospedeiro continuavam inalteradas e os iões
fosfito inibiam o crescimento do patogéneo antes de ele causar doença (Jackson et al.,
2000).
33
Estudos da estimulação dos mecanismos de defesa do hospedeiro são difíceis de
conduzir e requerem a capacidade de detectar minúsculas quantidades de compostos
complexos na planta. Portanto, muito pouco é conhecido acerca do modo de acção em
comparação com o efeito directo dos fungicidas fosfonatos.
1.4.1.4 – O uso do fosfito em agricultura
Na década de 30 do século XX, foram realizados estudos usando uma variedade
de diferentes compostos contendo fósforo, para determinar a sua eficácia como meio de
fornecer fósforo para suportar o crescimento vegetal. Determinou-se que o fosfito era
uma fonte de fósforo muito pobre, e a conversão, no solo, de fosfito para fosfato era
muito lenta para ser agronomicamente relevante (MacIntire, et al., 1950; Guest & Grant,
1991). Plantas cultivadas em solos nos quais o fosfito tinha sido acrescentado ao
suplemento natural dos níveis de fosfato, tinham um crescimento mais fraco do que as
plantas cultivadas em solos adubados com fosfonato. Em alguns casos, quando as
plantas foram replantadas no mesmo solo um ano após a aplicação inicial, elas cresciam
melhor que as plantas plantadas no ano da aplicação. Isso deve-se à lenta conversão do
fosfito em fosfato no solo (MacIntire, et al., 1950). No entanto, o aumento da
produtividade nunca foi equivalente à observada quando as necessidades em fósforo
foram fornecidas directamente às culturas pelo fosfato. Estes resultados, em conjunto
com o facto de o fosfito ser um meio mais caro para fornecer fósforo do que o fosfafo
na forma de superfosfato, levou ao desinteresse por parte dos agricultores na aplicação
dos fosfitos. No entanto o fosfito viria a retornar à agricultura quando na década de 70
do século XX se verificou que o fosfito reagia com o etanol para formar etil-fosfonato
reprimindo eficazmente algumas doenças radiculares causadas por fungos da ordem dos
Oomicetas, particularmente Phytophthora sp. (Guest & Grant, 1991, Smillie et al.,
1989). O etil-fosfonato tornou-se naquela época amplamente comercializado sob o
nome comercial Aliette® ou fosetil-Al. A parte Al do nome deriva do uso de iões de
alumínio (Al3+) para neutralizar a única carga do ião etil-fosfonato, de modo que o
fosetil-Al tem três iões etil-fosfonatos que são ionicamente ligados a um ião Al. O
fosfito, libertado na planta por hidrólise do etil-fosfonato, é o responsável pela
protecção das plantas contra fungos patogéneos (Smillie et al., 1989; MacIntire, et al.,
1950; Fen & Coffey, 1984; Guest & Grant, 1991;Grant et al., 1992). O sal de potássio
do fosfito é um agente igualmente eficaz para controlar infecções em plantas
34
provocadas por Phytophthora sp. (Smillie et al., 1989; MacIntire, et al., 1950; Fen &
Coffey, 1984; Guest & Grant, 1991; Grant et al., 1992, Niere, et al., 1994). Assim, tanto
o K-fosfito como o fosetyl-Al foram largamente empregues para o controlo contra um
grande número de doenças provocadas por Phytophthora (McDonald et al, 2001).
Observações de Fen & Coffey (1984, 1989) demonstraram que o local de acção
dos fungicidas fosfitos está dentro do fungo patogénico e não na planta hospedeira, em
que 0,1 a 3 mM de fosfito inibiram marcadamente o crescimento de micélio de
Phytophthora em culturas estéreis (Fen & Coffey, 1984; Grant et al., 1992, Griffith et
al., 1992; Niere, et al., 1990, 1994). Estudos de espectroscopia 31P-NMR revelaram que
o fosfito perturba o metabolismo do fósforo em Phytophthora causando uma
acumulação massiva de polifosfato (poly-P) e pirofosfato (PPi) (Guest & Grant, 1991;
Niere, et al., 1990; 1994). A toxicidade do fosfito em Phytophthora, sugerida em grande
parte, pela sua capacidade em aumentar pirofosfatos, e por conseguinte, indirectamente
inibir reacções pirofosforilase-chave, essenciais ao anabolismo (Griffith et al., 1992). A
eficácia do fosfito em suprimir Phytophthora depende em certa medida da concentração
de fosfato que está presente (Grant et al., 1992). Isto foi explicado quando foi mostrado
que o ião fosfato e ião fosfito competem pelos mesmos transportadores em
Phytophthora e que o fosfato é melhor competidor por esses locais que o fosfito
(Griffith et al., 1992). Concentrações relativamente altas de fosfito também inibiram as
actividades de algumas enzimas da via glicolítica e oxidativa das pentose-fosfatos em
extractos clarificados de Phytophthora (Stehmann & Grant, 2000). Isto suporta a
hipótese de que o fofito pode inibir algumas enzimas que actuam num único sítio em
Phytophthora. Actualmente existe ampla concordância de que esses efeitos deletérios
directos dos fosfitos no metabolismo de Phytophthora são importantes no controlo de
doenças causadas nas plantas. No entanto, este caminho pode não ser o único meio
através do qual o controlo é exercido (Guest & Grant, 1991; Smillie et al., 1989;
Jackson et al., 2000).
As plantas possuem mecanismos endógenos eficazes e altamente sofisticados
para combater as infecções. Elas são capazes de reconhecer a maior parte dos
organismos invasores e responder à presença deles gerando poderosos produtos antimicrobianos na zona circundante da tentativa de invasão.
Plantas tratadas com fosfito parecem ser capazes de gerar compostos
antimicrobiano mais eficazes do que aquelas não tratadas com o produto químico (Guest
& Grant, 1991; Smillie et al., 1989). Existe uma estreita relação entre a concentração de
35
fosfito presente no local de invasão e o ponto em que os genes de defesa da planta são
expressos (Jackson et al., 2000). Assim, foi argumentado que a capacidade do fosfito
em controlar a patogenicidade em Phytophthora sp. resulta da sua influência na planta,
tornando-a capaz de responder mais eficazmente ao organismo invasor. Outros têm
mantido que o fosfito não tem nenhum efeito sobre as plantas, mas sobre o fungo
restringindo directamente o crescimento do fungo patogénico, e obrigando-o a alterar a
sua estrutura de tal forma que é melhor reconhecido como um invasor pela planta
hospedeira. Um reconhecimento mais eficiente permite uma resposta de defesa mais
rápida e, consequentemente, mais eficaz (McDonald et al., 2001). Estudos de Jackson et
al. (2000) parecem ter reconciliado estas duas hipóteses. Ensaios com Eucalyptus
marginata inoculados com P. cinnamomi mostraram que o efeito do fosfito em
controlar o patogéneo é determinado pela concentração de fosfito na interface
hospedeiro-patogeneo. Quando a concentração de fosfito nas raízes era baixa, o fosfito
interagia com o local de ingresso para estimular enzimas de defesa do hospedeiro
(Jackson et al., 2000). Quando a concentração de fosfito nas raízes era elevada, as
defesas mantiveram-se inalteradas, e o fosfito pareceu actuar directamente no patogéneo
para inibir o seu crescimento antes
1.4.1.5 – Influência do fosfito na planta
Independentemente do mecanismo pelo qual os fosfitos actuam para restringir
Phytophthora durante a sua invasão em plantas, trabalhos recentes têm revelado que os
fosfitos têm efeitos directos sobre as plantas, independentemente de eles terem sido
modificados por Phytophthora ou não. Plantas tratadas com fosetil-Al ou fosfito
rapidamente acumulam fosfito no interior das suas células (Carswell et al., 1996; Fen &
Coffey, 1984; Forster et al, 1998). O fosfito é móvel no floema e acumula nos tecidos
em crescimento (Carswell et al., 1996, Guest & Grant, 1991). Como as plantas são
incapazes de metabolizar o fosfito (Carswell et al., 1996, Guest & Grant, 1991,
Carswell et al., 1996), ele persiste nos seus tecidos por longos períodos. No entanto, tem
sido geralmente assumido que os níveis de fosfito utilizados para controlar
Phytophthora não interferem com o crescimento ou o metabolismo das plantas
hospedeiras (Mcintire et al., 1950). No entanto estudos recentes demonstraram que
concentrações relativamente baixas de fosfito (ex: 1-2 mM) quebram drasticamente o
desenvolvimento de mecanismos de compensação de deficiência de fosfato mas não em
36
plantas de Brassica nigra fertilizadas com fosfato (Carswell et al., 1996, Guest & Grant,
1991). Análises
31
P-NMR revelam que os níveis intracelulares de fosfato geralmente
decrescem em Brassica sp. tratada com fosfito, e que o fosfato acumulado em folhas e
raízes desce para níveis até 6 a16 vezes mais baixo em plantas fertilizadas com fosfato.
Além disso, os tratamentos com fosfito reduzem a indução de enzimas (Ex: APase) e
transportadores (ex: transportadores de fosfato na membrana plasmática) característicos
da resposta por défice de fosfato em Brassica sp. (Carswell et al., 1996, 1997). A
redução de 75% da indução da APase causada por tratamentos com fosfito de células de
B. napus com deficiência de fosfato foi correlacionada com um decréscimo similar da
quantidade da proteína APase immunoreactiva (Carswell et al., 1997). Um aumento da
razão raiz:caules, o padrão da resposta morfológica da planta à limitação de nutrientes
não foi observado quando plantas de B. nigra privadas de fosfato cresceram na presença
de 1,5 mM de fosfito (Carswell et al., 1996). No entanto o mecanismo preciso pelo qual
os fosfitos exercem esse efeito é desconhecido, pondo-se a hipótese que os fosfitos
interferem com o sinal da cadeia de transdução pelo qual Brassica sp. detecta e
responde à deficiência de fosfato a nível molecular.
O anião fosfito parece representar uma ferramenta útil com a qual continuar a
investigar a “via do sinal de transdução” pelo qual as plantas respondem à falta de
fosfato a nível molecular.
37
2 – Objectivos
A Doença da Tinta do Castanheiro é uma das principais causas do
desaparecimento dos soutos. Os meios de luta disponíveis para combater as doenças
provocadas por Phytophthora que atacam as raízes não têm, até hoje, resolvido de
forma eficiente e duradoura os problemas sanitários das culturas e das florestas atacadas
por estes parasitas.
Os fosfitos e em particular o fosfonato de potássio têm sido utilizados com
sucesso no controlo de P. cinnamomi em várias espécies florestais.
O efeito dos fosfonatos na protecção dos castanheiros deve também ser estudado
de forma a melhorar as possibilidades de luta contra a Doença da Tinta do Castanheiro.
Com este trabalho pretende-se avaliar o efeito da aplicação foliar de fosfonato
potássico em plantas jovens de castanheiro na protecção radicular associada a P.
cinnamomi. Para concretizar este objectivo geral foram estabelecidos os seguintes
objectivos específicos que a seguir se indicam:
- avaliar a eficácia dos tratamentos de fosfonato potássico por aplicação foliar e com
carácter preventivo em castanheiro;
- avaliar o efeito protector do fosfonato potássico por inoculação de P. cinnamomi na
parte aérea da planta como medida indirecta da protecção radicular;
- estudar o efeito in vitro do fosfonato potássico e fosetil-Al em diferentes isolados de
Phytophthora e outros fungos associados com o castanheiro.
38
3 – Material e Métodos
3.1 – Material biológico
3.1.1 – Isolados P. cinnamomi e P. cambivora utilizados neste estudo
Os isolados de Phytophthora utilizados neste estudo foram obtidos de
castanheiros com sintomas da Doença da Tinta, na região de Trás-os-Montes (Gouveia
et al., 2004), e mantidos na colecção de Phytophthora da Escola Superior Agrária de
Bragança (Quadro 6). Os isolados são mantidos em meio de cultura PDA (Potato
Dextrose Agar - Difco, 39 g/L) a 25ºC no escuro.
Quadro 6 – Isolados de Phytophthora usados no ensaio
Espécie
Código
Hospedeiro
P. cinnamomi
P. cambivora
Ano de isolamento
Pr 120
Castanea sativa
2001
Pr 125
Solo
2001
804
Castanea sativa
1998
810
Castanea sativa
1998
Ar 102
Castanea sativa
2001
Pr 135
Solo
2001
3.1.2 – Outros organismos utilizados neste estudo
3.1.2.1 – Pisolithus tinctorius
O fungo micorrízico Pisolithus tinctorius, é uma espécie habitante do solo e da
rizosfera que estabelece relações de simbiose com as raízes do castanheiro. P. tinctorius
cresceu em meio de cultura sólido Melin & Norkans (MMN) (Marx, 1969), sendo
depois repicado para placas em PDA (Potato Dextrose Agar, 39g/l).
3.1.2.2 – Cryphonectria parasitica
Cryphonectria parasítica é o fungo responsável pelo cancro do castanheiro. O
isolado de C. parasitica utilizado encontra-se na colecção de C. parasitica da Escola
Superior Agrária de Bragança sendo mantido em meio de cultura PDA (Potato Dextrose
Agar - Difco, 39 g/L) a 25ºC no escuro.
39
3.1.3 – Plantas
Para a realização dos ensaios utilizaram-se plantas de castanheiro com um ano
de idade. A estratificação das castanhas foi feita antecipadamente em areia, e mantida
com humidade para que ocorra a germinação. As castanhas germinadas são plantadas
em tabuleiros alveolados com a dimensão de 6cm x 6cm x 20cm para o normal
crescimento das plantas de castanheiro.
3.2 – Substratos
3.2.1 – Substrato de inóculo
A quantidade de P. cinnamomi utilizada para a inoculação dos substratos foi
conseguida por subcultura do isolado Pr120. P. cinnamomi (Pr120) foi previamente
colocado a crescer em placas de Petri com PDA (Potato Dextrose Agar – Dicfo, 39 g/L),
a 25ºC no escuro, sendo depois todo o conteúdo do crescimento micelial colocado em
sacos com um litro de uma mistura de vermiculite humedecida, antecipadamente
esterilizada por autoclave (120 ºC/ durante uma hora). Os sacos de vermiculite
inoculados foram selados para evitar contaminações e colocados a incubar em estufa a
20-22ºC e regularmente homogeneizado para uniformizar o crescimento do parasita no
substrato.
3.2.2 – Substrato dos vasos
Utilizou-se um substrato de terra vegetal e areia na proporção de 3:1
previamente desinfestado com formol e inoculado com 0,5 % (v/v) com P. cinnamomi,
que previamente cresceu em sacos com vermiculite. O substrato de plantação foi
colocado em vasos com 15 Litros de capacidade.
3.3 – Meios de cultura utilizados
Para a manutenção de P. cinnamomi para os diferentes ensaios utilizou-se o
meio de cultura PDA (Potato Dextrose Agar – Difco, 39 g/L).
Para o isolamento das raízes com sintomas de doença da Tinta do Castanheiro
utilizou-se o meio selectivo P10VPH de Tsao e Guy (1977) tendo-se substituído o meio
base por PDA (39 g L-1, Difco) mantendo-se todos os outros constituintes nas
proporções indicadas (PCNB – 100 mg L-1; hymexazol – 50 mg L-1; vancomicina – 200
40
mg L-1; pimaricina – 10 mg L-1), sendo estes constituintes adicionados após a
autoclavagem (121ºC/20 minutos) e quando o meio de cultura atinge uma temperatura
de cerca de 45ºC.
3.4 – Fosfonato de potássio
O fosfonato de potássio utilizado no ensaio é uma formulação líquida de
potássio e de fósforo em forma de fosfonato (fósforo total (P2O5), 30% (p/v); potássio
total (K2O) 20% (p/v)). Este produto é comercializado com o nome Atlante®. A solução
stock foi preparada com água destilada à concentração de 3 ml/L. O fosfonato potássico
foi aplicado aos castanheiros por pulverização através de um pequeno pulverizador.
3.5 – Estudo do efeito de fosfonato potássico na protecção das raízes do
castanheiro
O efeito da aplicação foliar do fosfonato potássico foi estudado em plantas de
castanheiro com um ano de idade nas estufas do IPB/ESA. Os castanheiros foram
colocados em vasos de 15 litros (Figura 5) de capacidade que se mantiveram em estufa
durante quatro meses, com rega semanal por inundação e rega por nebulização a
intervalos regulares durante o período diurno.
Figura 5 – Disposição dos vasos na bancada
41
Ultrapassada a crise inicial da transplantação (24 horas) aplicou-se fosfonato
potássico à concentração de 3 ml L-1 por pulverização foliar, ou água destilada, até as
folhas ficarem molhadas pela aplicação da calda. Deixou-se secar o produto durante 24
horas e restabeleceu-se o sistema de rega. Utilizaram-se 5 vasos com 3 plantas por vaso
por tratamento e de forma aleatória, na bancada da estufa.
3.5.1 – Parâmetros fisiológicos
3.5.1.1 – Altura e diâmetro ao nível do colo
No final do ensaio, realizaram-se medições, do crescimento anual, do
crescimento total e do diâmetro ao nível do colo, em todas as plantas.
3.5.1.2 – Biomassa
A biomassa foi determinada, considerando os diferentes órgãos da planta, folhas,
caules e raízes, no fim do ensaio. O material fresco foi pesado e posto a secar numa
estufa a 60ºC, até peso constante.
3.5.1.3 – Comprimento e número de raízes secundárias
No final do ensaio retiraram-se os castanheiros dos vasos e lavaram-se as raízes
cuidadosamente com água para tirar toda a terra aderente, evitando danificar as raízes
para não produzir perda de biomassa radicular. Após lavagem em água corrente as
raízes foram fotografadas e em seguida avaliou-se o comprimento radicular e o número
de raízes secundárias.
3.5.2 – Sintomatologia
Avaliou-se a sintomatologia na parte aérea da planta, de 15 em 15 dias durante
todo o período do ensaio. No final do ensaio as plantas foram retiradas dos vasos,
retirando-se o substrato aderente às raízes com a ajuda de água corrente. Avaliou-se o
sistema radicular quanto à presença e extensão de podridões radiculares, sintomas
característicos do desenvolvimento de Phytophthora.
Adicionalmente retiraram-se segmentos de raízes doentes e com aspecto
saudável para isolamento de P. cinnamomi no meio de cultura selectivo P10VPH de
Tsao e Guy (1977). Os tecidos de raiz utilizados para o isolamento de Phytophthora
foram desinfectados com hipoclorito de sódio a 3% durante cerca de 2 minutos sendo
42
posteriormente lavados com água destilada. Retirou-se o excesso de humidade com
papel absorvente e colocaram-se os troços de raiz em meio selectivo P10VPH, sendo em
seguida postos a incubar a 20-22ºC. A presença de Phytophthora foi confirmada por
observação microscópica, ao nível das hifas.
3.6 – Avaliação do efeito protector do fosfonato potássico por inoculação de
P. cinnamomi na parte aérea da planta
Foram seleccionadas 10 plantas jovens de castanheiro com a altura e diâmetro
aproximadamente iguais e mantidas nas estufas da ESA/IPB com condições de
temperatura e humidade reguladas.
A inoculação foi realizada com micélio, obtido por crescimento em PDA (Potato
Dextrose Agar - Difco, 39g/L) do isolado de P. cinnamomi (Pr120), dividido em
pequenos troços de igual diâmetro.
Para a realização da inoculação seccionou-se o ápice do ramo, transferiu-se o
disco de micélio e meio de cultura e foi posto em contacto com a secção transversal
previamente seccionada. Para evitar a dessecação dos tecidos e criar um ambiente
húmido, cobriu-se a zona próxima da inoculação com papel de alumínio (Figura 6).
Figura 6 – Inoculação em ramo destacado
43
As plantas de castanheiro foram tratadas por pulverização foliar com fosfonato
potássico (Atlante) à concentração de 3 mlL-1 enquanto que as plantas que serviram de
controlo foram pulverizadas com água destilada.
A aplicação de fosfonato potássico foi feita três dias antes da inoculação dos
ramos com P. cinnamomi.
Mediu-se o comprimento da lesão provocada pelo desenvolvimento do parasita
nesses tecidos, evidenciada pela necrose dos tecidos da planta inoculada.
As medições da dimensão da lesão (DL), expressa em milímetros, foram
realizadas ao fim de 25 dias após a inoculação, altura em que as plantas começavam a
evidenciar amarelecimento das folhas.
3.7 – Avaliação da toxicidade in vitro do fosfonato potássico e fosetil-Al
Para determinar o efeito tóxico do fosfonato potássico e do fosetil-Al, expresso
pelo EC50 (concentração que inibe o crescimento micelial em 50 %), realizaram-se teste
de toxicidade in vitro em diferentes isolados de P. cinnamomi e P. cambivora assim
como em Pisolithus tinctorius, um fungo Basidyiomicete que estabelece relações de
simbiose micorrízica com as raízes do castanheiro.
3.7.1 – Toxicidade in vitro do fosfonato potássico
O efeito tóxico do fosfonato potássico foi avaliado pelo crescimento micelial dos
diferentes isolados de Phytophthora e pelo isolado de Pisolithus tinctorius, em meio
PDA contendo 0, 5, 20 e 50 µg ml-1 de fosfonato potássico. De cada isolado em
crescimento activo retiraram-se secções circulares com 5 mm de diâmetro e colocaramse no centro de placas de Petri. As placas (cinco por isolado) foram incubadas a
22-24 ºC durante 5 dias. No final deste período mediu-se o crescimento micelial,
efectuando-se medições do raio maior e raio menor, e determinou-se para cada
concentração a percentagem de redução de crescimento micelial por comparação com o
crescimento na ausência de fosfonato potássico.
3.7.2 – Toxicidade in vitro do fosetil-Al
O efeito tóxico do fosetil-Al foi avaliado pelo crescimento micelial dos
diferentes isolados de Phytophthora, em meio PDA contendo 0, 20, 50 e 100 µg ml-1 de
fosetil-Al. De cada isolado em crescimento activo retiraram-se secções circulares com 5
44
mm de diâmetro e colocaram-se no centro de placas de Petri. As placas (cinco por
isolado) foram incubadas a 22-24 ºC durante 5 dias. No final deste período mediu-se o
crescimento micelial, efectuando-se medições do raio maior e raio menor, e determinouse para cada concentração a percentagem de redução de crescimento micelial por
comparação com o crescimento na ausência de fosetil-Al.
O valor que reduz o crescimento micelial em 50% (EC50) em cada isolado em
estudo foi obtido por regressão linear dos valores probit da percentagem de redução do
crescimento e dos valores da concentração expressos em logaritmo.
3.8 – Análise estatística
A análise estatística foi realizada no software SPSS 16.0®, recorrendo-se ao teste
t-student para amostras independentes e procedendo-se à avaliação da significância da
diferença entre os valores médios das variáveis em estudo para os dois grupos
considerados. Os pressupostos deste método estatístico, nomeadamente a normalidade e
a homogeneidade das variâncias nos dois grupos, foram avaliados através do teste de
Shapiro-Wilk (n<50) e do teste de Levene, respectivamente. . Pontualmente, em casos
onde foram detectados ligeiros desvios relativamente à distribuição normal, utilizou-se
o teste de Mann-Whitney (não-paramétricos). Consideraram-se estatisticamente
significativas as diferenças das médias cujo p-value do teste é inferior ou igual a 0,05.
45
4 – Resultados
4.1 – Efeito de fosfonato potássico na protecção do castanheiro
4.1.1 – Parâmetros fisiológicos
4.1.1.1 – Altura e diâmetro ao nível do colo
O crescimento das plantas de castanheiro foi registado no final do ensaio, ao fim
de 4 meses de crescimento.
Os valores do crescimento do ano, altura total e diâmetro ao nível do colo das
plantas de castanheiro, expresso em centímetros, nas diferentes modalidades (aplicação
foliar de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato potássico), encontram-se no
Quadro 7.
Quadro 7 – Valores (em centímetros) do crescimento do ano, altura total e do diâmetro
ao nível do colo
Com fosfonato potássico
Sem fosfonato potássico
Plantas Cres. ano Alt. total Diâmetro
Cres. ano Alt. total Diâmetro
1
4,0
32,0
0,40
6,0
27,5
0,40
2
10,0
29,0
0,50
11,0
29,0
0,85
3
12,0
31,5
0,70
6,5
25,5
0,40
4
7,5
27,0
0,60
8,0
28,5
0,50
5
19,0
32,0
0,90
12,0
31,5
0,60
6
5,0
29,5
0,60
15,5
34,0
0,55
7
6,5
25,5
0,65
7,0
21,0
0,40
8
10,0
28,5
0,50
23,5
37,5
0,50
9
12,0
30,5
0,70
12,5
32,0
0,45
10
11,5
25,0
0,65
7,5
29,0
0,60
11
10,0
30,0
0,60
6,5
22,0
0,70
12
13,0
27,5
0,65
11,0
27,5
0,40
13
11,5
31,0
0,70
18,0
34,5
0,60
14
3,5
20,0
0,70
9,5
31,5
0,50
Cres. – Crescimento, Alt. – Altura
As plantas que não foram sujeitas à aplicação foliar de fosfonato potássico
apresentaram um crescimento em altura ligeiramente superior às plantas em que houve
aplicação foliar de fosfonato potássico. No entanto, os valores obtidos com o teste
t-student não evidenciaram diferenças significativas entre os crescimentos do ano
(P=0,44), para as duas modalidades ensaiadas.
46
A média do crescimento do ano obtida no final do ensaio nas plantas com
aplicação foliar de fosfonato potássico foi de 9,68 cm, e nas plantas sem aplicação de
fosfonato potássico foi de 11,04 cm (Quadro 8).
As alturas médias obtidas no final do ensaio para cada um dos tratamentos foram
de 28,50 cm para as plantas com aplicação de fosfonato potássico e 29,35 cm para as
plantas sem aplicação de fosfonato potássico. A análise estatística não evidenciou
diferenças significativas entre as modalidades (teste t-student, P=0,57).
Quadro 8 – Valores médios (em centímetros) do crescimento do ano, altura total e do
diâmetro ao nível do colo
Crescimento ano
Altura total
Diâmetro
média±sd
Com fosfonato
9,68±4,14 a
Sem fosfonato
11,04±5,07 a
sd – desvio padrão da média
média±sd
média±sd
28,50±3,33 a
29,36±4,62 a
0,63±0,11 a
0,53±0,13 b
Nota: Em cada coluna, as médias seguidas de letras diferentes, diferem significativamente (P ≤ 0.05).
As plantas tratadas com fosfonato potássico por aplicação foliar apresentaram
um maior diâmetro ao nível do colo que as plantas sem aplicação foliar de fosfonato
potássico.
O diâmetro médio ao nível do colo médio registado para as plantas sujeitas a
tratamento foliar com fosfonato potássico foi de 0,63 cm, enquanto que para as plantas
onde não houve tratamento por aplicação foliar com fosfonato potássico foi de 0,53 cm.
Como esta variável apresentou ligeiros desvios da distribuição normal (apenas no grupo
de plantas não sujeitas à aplicação do fosfonato), utilizou-se o teste de Mann-Whitney
para avaliar a significância da diferença de médias. Os resultados obtidos indicaram
diferenças significativas entre os tratamentos (P=0,043).
4.1.1.2 – Biomassa da parte aérea
Os valores da biomassa da parte aérea das diferentes modalidades tratadas
encontram-se no Quadro 9.
As plantas sem tratamento com fosfonato potássico obtiveram um valor de
biomassa da parte aérea (folhas e caules) ligeiramente superior às plantas tratadas com
fosfonato potássico por aplicação foliar. No entanto a análise estatística (teste t-student)
não revelou diferenças significativas entre os valores de peso seco da biomassa das
47
planttas tratadas com fosfonnato potássicco por apliccação foliar e os valorees das plantaas em
que não
n houve aplicação
a
fooliar de fosfo
fonato potásssico.
Quaddro 9 – Valor
V
da biiomassa daa parte aérrea (folhas e caules) das plantaas de
castaanheiro nas diferentes modalidaddes (com ap
plicação de fosfonato potássico e sem
apliccação de fossfonato potáássico)
Com fosfonnato potássiico
Sem
m fosfonatoo potássico
Planntas
Follhas
Caaules
Total
Folhass
Caulees
Tottal
1
0,,94
1
1,57
2,51
1,63
1,500
3,1
13
2
1,,37
2
2,59
3,96
2,78
3,599
6,3
36
3
3,,05
3
3,99
7,04
1,09
1,211
2,2
23
4
1,,19
2
2,06
2,166
3,9
95
3,25
1,80
5
1,,86
2
2,61
2,900
6,2
24
4,47
3,34
6
2,,41
3
3,35
5,75
3,14
3,111
6,2
24
7
1,,95
3
3,10
5,05
1,42
1,144
2,5
56
8
2,,35
2
2,19
4,54
3,42
3,677
7,0
09
9
2,,35
2
2,73
5,08
1,39
2,155
3,5
55
100
1,,75
2
2,26
4,01
2,24
2,733
4,9
97
11
1,,72
0
0,87
2,58
1,46
1,433
2,8
89
122
6,29
2,10
2,,58
3
3,71
2,199
4,2
29
133
1,,05
1
1,36
2,40
3,03
3,800
6,8
82
1,99
144
2,944
4,9
94
- sem
m dados
Na Figurra 7 registaam-se os ressultados da biomassa da
d parte aérrea expresso
os em
gram
mas.
Peso seco (g)
Com fosfonato
C
o potássico
Sem fosfo
onato potássico
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Folhass
Caules
Mateerial
Figurra 7 – Bioomassa dass folhas e caules das plantas dee castanheirro tratadas com
fosfoonato potásssico por pullverização foliar
fo
e sem aplicação de
d fosfonatoo potássico.
48
O valor de biomassa médio mais elevado foi registado nas plantas em que não
houve aplicação foliar de fosfonato potássico com 4,67 g e o valor de biomassa médio
mais baixo foi registado nas plantas com aplicação foliar de fosfonato potássico com
4,38 g (Quadro 10).
Quadro 10 – Valores médios da biomassa total da parte aérea (folhas e caules) nas
diferentes modalidades (com aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de
fosfonato potássico)
Com fosfonato potássico
Sem fosfonato potássico
Biomassa total
sd – desvio padrão da média
média±sd
média±sd
4,38±1,47 a
4,67±1,66 a
Nota: Em cada linha, as médias seguidas de letras diferentes, diferem significativamente (P ≤ 0.05).
As plantas com aplicação foliar de fosfonato potássico obtiveram um valor
médio de biomassa das folhas inferior (1,89 g) em relação às plantas sem aplicação
foliar de fosfonato potássico (2,20 g) (Figura 7). No entanto o mesmo não se passou
relativamente à biomassa dos caules, pois aqui o valor médio de biomassa registado foi
superior (2,49 g) em relação às plantas sem aplicação foliar de fosfonato potássico (2,20
g).
4.1.1.3 – Biomassa radicular
Os valores da biomassa das raízes secundárias das diferentes modalidades
encontram-se no Quadro 11.
Os valores médios da biomassa obtidos para as raízes secundárias foram de
2,34g para a modalidade em que houve aplicação foliar de fosfonato potássico e 1,05g
na modalidade sem aplicação de fosfonato de potássico (Quadro 12). A análise
estatística (teste t-student) revelou diferenças significativas entre estes dois tratamentos
(P=0,014).
Quadro 11 – Biomassa das raízes secundárias nas diferentes modalidades (com
aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato potássico)
Plantas Com fosfonato potássico Sem fosfonato potássico
1
1,88
1,55
2
0,70
1,83
3
3,32
0,54
49
Quadro 11 – Biomassa das raízes secundárias nas diferentes modalidades (com
aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato potássico) (continuação)
Plantas Com fosfonato potássico Sem fosfonato potássico
4
1,47
0,81
5
0,92
6
5,19
0,81
7
4,97
0,38
8
2,56
1,25
9
1,58
0,86
10
2,30
1,30
11
0,88
12
0,32
1,25
13
2,49
1,14
14
1,29
1,16
- sem dados
Quadro 12 – Valores médios da biomassa total das raízes secundárias nas diferentes
modalidades (com aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de fosfonato
potássico)
Com fosfonato potássico
Sem fosfonato potássico
Biomassa raiz
sd – desvio padrão da média
média±sd
média±sd
2,34±1,52 a
1,05±0,38 b
Nota: Na linha, as médias seguidas de letras diferentes, diferem significativamente (P ≤ 0.05).
O peso seco das raízes secundárias foi o parâmetro fisiológico mais afectado
pela inoculação de P. cinnamomi. As plantas tratadas por aplicação foliar de fosfonato
potássico apresentaram valores de biomassa das raízes secundárias maiores que as
plantas não tratadas com fosfonato potássico, indicando assim que P. cinnamomi não
causou danos no sistema radicular dos castanheiros que receberam o tratamento com
fosfonato potássico.
4.1.1.4 – Comprimento e número de raízes secundárias
No Quadro 13 apresentam-se os valores obtidos do comprimento total da raiz
secundária, comprimento das raízes sãs, comprimento das raízes doentes e a
percentagem de raízes doentes nas duas modalidades.
Nas plantas que cresceram no substrato inoculado com P. cinnamomi e sem
aplicação de fosfonato potássico todo o sistema radicular evidenciava podridão
radicular, quer considerando o comprimento radicular, quer o número de raízes.
50
Exceptua-se a esta situação uma única planta que, não evidenciando sintomas da
Doença da Tinta na parte aérea, apresentava 70 % do total do comprimento das raízes
com podridão radicular e praticamente todas as raízes infectadas.
Nas plantas tratadas por pulverização foliar com fosfonato potássico, 50% das
plantas não evidenciava qualquer sintoma de podridão nas raízes, sendo que as outras
50% manifestaram sintomas, apresentando infecção radicular variando entre os 2 e os
16% do comprimento radicular.
O maior comprimento radicular foi registado nas plantas em que houve
aplicação foliar de fosfonato potássico com 2046,0 cm e o menor comprimento
radicular foi registado nas plantas sem aplicação foliar de fosfonato potássico com
243,0 cm.
Quadro 13 – Comprimento radicular nos diferentes tratamentos (com aplicação foliar de
fosfonato potássico e sem aplicação foliar de fosfonato potássico) (CRT – comprimento
radicular total; CRS – comprimento das raízes sãs; CRD – Comprimento das raízes
doentes; %RD – percentagem de raízes doentes)
Com fosfonato potássico
Sem fosfonato potássico
Plantas
CRT
CRS
CRD
%RD
CRT
CRS
CRD
%RD
1
694,5
694,5
0,0
0,0
2
1201,5 1201,5
0,0
0,0
617,2
0,0
617,2
100
3
2046,0 2046,0
0,0
0,0
387,5
0,0
387,5
100
4
773,0
773,0
0,0
0,0
392,0
0,0
392,0
100
5
1098,0 998,0
50,0
4,55
389,0
0,0
389,0
100
6
1939,5 1939,5
0,0
0,0
545,0
0,0
545,0
100
7
954,5
794,0
160,5
16,82
243,0
0,0
243,0
100
8
1108,0 1108,0
0,0
0,0
806,5
0,0
806,5
100
9
680,5
653,5
27,0
3,97
831,0
0,0
831,0
100
10
937,5
908,5
29,0
3,09
972,5
0,0
972,5
100
11
617,5
521,0
96,5
15,63
540,5
0,0
540,5
100
12
968,5
906,0
62,5
6,45
841,0
0,0
841,0
100
13
683,5
662,5
16,0
2,34
623,5
0,0
623,5
100
14
676,0
676,0
0,0
0,0
1396,5 414,5
982,0
70,32
- sem dados
No Quadro 14 encontram-se os valores médios do comprimento radicular total,
comprimento das raízes sãs e comprimento das raízes doentes. Os resultados estatísticos
revelam diferenças significativas (P <0,05) entre os dois tratamentos. Neste caso, dado o
51
ligeirro afastameento da norm
malidade poor parte dass variáveis num
n
dos grrupos, utilizzou-se
iguallmente o tesste de Mannn-Whitney.
Quaddro 14 – Vaalores médioos do comprrimento rad
dicular total,, do comprimento das raízes
r
sãs e do compriimento das raízes doenntes nos differentes trattamentos (com aplicação de
fosfoonato potásssico e sem aplicação
a
dee fosfonato potássico)
Com fosfonato
f
potássico
p
Sem fosfoonato potásssico
Comprimentto radicular
C
Comprimentoo raízes sãs
Com
mprimento raízes
r
doenttes
sd – desvio padrrão da médiia
média±sd
d
m
média±sd
10027,04±450
0,11a
9
991,57±31,
88a
31,54±47,5
54a
660,40±309,25b
464,17±114,96b
628,52±240,83b
Nota:: Em cada linhha, as médias seguidas de leetras diferentees, diferem siggnificativamennte (P ≤ 0.05).
Relativam
mente à peercentagem de raízes doentes,
d
as plantas quue cresceram
m em
substtrato inocullado com P.
P cinnamom
mi e sem aplicação
a
fooliar de fosfonato potáássico
regisstaram 95,17 % do tottal de raízees doentes, enquanto nas
n plantass tratadas com o
fosfoonato potásssico esse vaalor foi de 3,07% (Figurra 8).
%
100
80
60
40
20
0
com ffosfonato pottássico
se
em fosfonato p
potássico
Figurra 8 – Perceentagem de raízes doenntes nas dife
ferentes moddalidades (ccom aplicaçção de
fosfoonato potásssico e sem aplicação
a
dee fosfonato potássico)
O número total de raízes e de
d raízes do
oentes encoontra-se no Quadro 15
5. As
planttas tratadas por aplicaação foliar de
d fosfonatto potássicoo apresentarram um nú
úmero
médiio de 49,577 raízes (Quuadro 16), enquanto as
a plantas não
n tratadass com fosffonato
potásssico apresentaram um
m número inferior dee raízes (36,62) estanndo quase todas
doenntes, tendo revelado
r
naa análise esstatística (teeste t-studennt) diferençças significaativas
entree estes dois tratamentoss (P=0,02277).
52
Quadro 15 – Número de raízes total e o número de raízes doentes nas diferentes
modalidades
Com fosfonato potássico
Plantas Nº raízes
Raízes
% Raízes
doentes
doentes
1
55
0
0,0
2
54
0
0,0
3
92
0
0,0
4
36
0
0,0
5
45
12
26,7
6
65
0
0,0
7
41
10
24,4
8
58
0
0,0
9
38
1
2,6
10
23
1
4,3
11
48
12
25,0
12
63
6
9,5
13
34
1
2,9
14
42
0
0,0
- sem dados
Sem fosfonato potássico
Nº raízes
Raízes
% Raízes
doentes
doentes
34
34
100
27
27
100
28
28
100
36
36
100
36
36
100
21
21
100
37
37
100
56
56
100
46
46
100
40
40
100
45
45
100
41
41
100
29
24
82,8
Das plantas tratadas por aplicação foliar de fosfonato potássico, sete plantas não
apresentaram qualquer raiz doente. Nas restantes raízes os sintomas de podridão
variaram entre 2 e 26 % do número das raízes.
Quadro 16 – Valores médios do número de raízes e comprimento radicular nos
diferentes tratamentos (com aplicação de fosfonato potássico e sem aplicação de
fosfonato potássico)
Com fosfonato potássico
Sem fosfonato potássico
Número de raízes
Raízes doentes
sd – desvio padrão da média
média±sd
média±sd
49,57±17,01a
3,07±4,76a
36,62±9,31b
36,23±0,38b
Nota: Em cada linha, as médias seguidas de letras diferentes, diferem significativamente (P ≤ 0.05).
As plantas tratadas com fosfonato potássico por aplicação foliar evidenciaram na
parte radicular sintomas de podridão em 50% das raízes variando entre os 2 e 16 % do
comprimento das raízes aparecendo os sintomas apenas num número reduzido de raízes.
Nas plantas que cresceram em substrato inoculado com P. cinnamomi e sem aplicação
53
foliar de fosfonato potássico todo o sistema radicular apresentava sintomas de podridão
radicular e evidenciavam um menor número de raízes.
4.1.2 – Sintomatologia
A sintomatologia foi registada de 15 em 15 dias durante todo o período do
ensaio. No final do ensaio verificou-se que todas as plantas de castanheiro que
cresceram em substrato inoculado com P. cinnamomi e tratadas por aplicação foliar de
fosfonato potássico estavam vivas sem evidenciar sintomas da Doença da Tinta. Nesta
modalidade 50 % das plantas tratadas com aplicação foliar de fosfonato potássico
apresentavam entre os 2 e os 17% do sistema radicular infectado sem no entanto
apresentarem sintomas na parte aérea.
Todas as plantas que cresceram em substrato inoculado com P. cinnamomi e sem
aplicação foliar de fosfonato potássico evidenciaram sintomas característicos da doença
com epinastia e necrose das folhas (Figuras 9 e 10), com excepção de uma planta que
apresentava 70 % do total do comprimento das raízes com podridão radicular e
praticamente todas as raízes infectadas sem no entanto evidenciar sintomas da Doença
da Tinta na parte aérea.
Figura 9 – Plantas de castanheiro crescendo em substrato inoculado com Phytophthora
cinnamomi, nas diferentes modalidades (com e sem aplicação de fosfonato de potássio).
54
Figura 10 – Sintomatologia em plantas de castanheiro (a – plantas sem aplicação de
fosfonato, b – plantas com aplicação de fosfonato)
O sistema radicular das plantas que cresceram em substrato inoculado com
P. cinnamomi e sem aplicação foliar de fosfonato potássico apresentava-se com um
aspecto húmido e enegrecido com grande parte das raízes destruídas, consequência da
infecção por este patogéneo (Figura 11).
Figura 11 – Sistema radicular sem sintomas da Doença da Tinta (a), com sintomas da
Doença da Tinta (b)
55
Todas as plantas que cresceram em substrato inoculado com P. cinnamomi e sem
aplicação de fosfonato potássico evidenciaram presença de Phytophthora em todas as
raízes inoculadas em meio selectivo P10VPH (Quadro 17).
A sintomatologia da parte aérea traduz a evolução da doença na parte radicular
avaliada de uma forma directa neste trabalho por observação visual dos sintomas de
podridão das raízes depois de confirmada a presença de P. cinnamomi por isolamento
em meio selectivo (Figura 12).
Quadro 17 – Detecção de Phytophthora cinnamomi nas raízes secundárias
Raízes com aspecto saudável
Com fosfonato potássico
Sem fosfonato potássico
+
(+) Isolamentos positivos, (-) Ausência de isolamentos positivos
Raízes doentes
+
+
Nas plantas que cresceram em substrato inoculado com P. cinnamomi e com
aplicação de fosfonato potássico verificou-se que apesar da presença de Phytophthora
nas raízes que tinham um aspecto doente, a planta não manifestava os sintomas
característicos desta doença.
Figura 12 – Isolamento de troços de raiz de plantas de castanheiro infectadas com
Phytophthora cinnamomi, em meio selectivo P10VPH.
4.2 – Avaliação indirecta do efeito protector do fosfonato potássico por
inoculação de P. cinnamomi na parte aérea da planta
Os valores do comprimento da lesão encontram-se no Quadro 18. O
comprimento máximo da lesão nas plantas tratadas por aplicação foliar de fosfonato
potássico foi de 2,0 cm e nas plantas sem qualquer tratamento o comprimento máximo
da lesão foi de 10,0 cm.
56
Quadro 18 – Valores (centímetros) do comprimento da lesão
Comprimento da lesão (cm)
1
2
3
4
Com fosfonato potássico
2,0
0,1
1,5
0,0
Água destilada
10,0
4,5
7,4
8,4
5
2,0
7,0
Os valores da média da dimensão da lesão obtida por este processo de
inoculação, nas diferentes condições de tratamento (com aplicação foliar de fosfonato
potássico e sem aplicação de fosfonato) encontram-se expressos no Quadro 19.
Quadro 19 – Valores da média da dimensão da lesão nas diferentes condições de
tratamento
média±sd
Com fosfonato potássico
Água destilada
1,12±1,00
7,46±2,02
sd – desvio padrão da média
O desenvolvimento da lesão é diferente nas duas modalidades estudadas. Os
resultados destas inoculações revelaram que os castanheiros sujeitos a tratamento por
aplicação foliar de fosfonato potássico evidenciavam um crescimento de lesão muito
inferior ao das plantas sem qualquer tratamento, sendo as diferenças entre os
tratamentos estatisticamente significativas (P=0,00023) após análise pelo teste t-student
(Figura 13).
(cm)
9
b
8
7
6
5
4
3
2
a
1
0
fosfonato de potássio
água destilada
Figura 13 – Comprimento médio da lesão em castanheiros inoculados com
Phytophthora cinnamomi 25 dias após aplicação de fosfonato potássico. Barras verticais
correspondem ao erro padrão.
Nota: Em cada coluna, as médias seguidas de letras diferentes, diferem significativamente (P ≤ 0.05).
57
4.3 – Toxicidade in vitro do fosfonato potássico e fosetil-Al
4.3.1 – Resposta in vitro ao fosfonato potássico
O crescimento micelial dos diferentes isolados nas diferentes concentrações de
fosfonato potássico em estudo (5 µg/ml; 20 µg/ml e 50 µg/ml de fosfonato potássico e
controlo) é apresentado no Quadro 20.
Todos os isolados apresentaram um aumento da inibição com o aumento da
concentração de fosfonato potássico, no entanto o grau de inibição não foi igual para
todos os isolados. O isolado 804 foi aquele que foi mais inibido pelo fosfonato potássico
obtendo 100% de inibição a 50 µg/ml (Figura 14). O isolado de C. parasitica, um fungo
patogénico do castanheiro e que se desenvolve na parte aérea, foi o que apresentou
menor inibição (36,61%) na concentração mais alta de fosfonato potássico.
O crescimento micelial dos isolados de Phytophthora em estudo foi inibido em
função das diferentes concentrações de fosfonato de potássio em estudo (5 µg/ml; 20
µg/ml e 50 µg/ml) (Figura 15). Os isolados de P. cambivora (Ar102 e Pr135)
apresentaram crescimentos inferiores em relação aos isolados de P. cinnamomi (Pr120,
Pr125, 810, 804).
Quadro 20 – Crescimento micelial (centímetros) dos
cinnamomi (Pr120, 810 e 804), Phytophthora cambivora
tinctorius e Cryphonectria parasitica, em meio de cultura
20 µg/ml e 50 µg/ml de fosfonato potássico e controlo.
Controlo
5 µg/ml
isolados de Phytophthora
(Ar102 e Pr135), Psolithus
PDA acrescido de 5 µg/ml;
20 µg/ml
50 µg/ml
média±sd
média±sd
média±sd
média±sd
P. cinnamomi Pr120
7,32±0,44a
1,88±0,08b
1,26±0,2c
0,34±0,22d
P. cinnamomi Pr125
6,80±0,44a
4,45±0,46b
3,73±0,06cb
3,10±0,75c
P. cinnamomi 810
7,80±0,48a
2,22±0,13b
1,86±0,19b
0,96±0,09c
P. cinnamomi 804
7,08±0,48a
1,78±0,16b
0,78±0,22c
0,00±0,00d
P. cambivora Ar102
5,18±0,38a
3,20±0,56b
3,20±0,56b
1,20±0,07c
P. cambivora Pr135
1,36±0,25a
0,94±0,15ba
0,72±0,08b
0,50±0,12b
Pisolithus tinctorius
2,03±0,21a
1,17±0,15b
0,77±0,12c
0,70±0,10c
Cryphonectria parasitica
7,47±0,06a
5,50±1,08b
5,10±0,44b
4,73±0,15b
sd – desvio padrão da média
Nota: Em cada linha, as médias seguidas de letras diferentes, diferem significativamente (P ≤ 0.05).
58
100
Pr120
90
80
Pr125
Inibição (%)
70
810
60
50
804
40
30
Ar102
20
Pr135
10
0
P. tinctorius
0
5
20
50
C. parasitica
Concentração de fosfonato potássico (µg/ml)
Figura 14 – Percentagem da inibição do crescimento dos isolados de Phytophthora
cinnamomi (Pr120, 810 e 804) e Phytophthora cambivora (Ar102 e Pr135) em meio
PDA acrescido de fosfonato potássico. Cada ponto representa a média de cinco
repetições.
A
C
B
D
Figura 15 – Phytophthora cinnamomi em diferentes concentrações de fosfonato
potássico (A – Controlo, B – 5 µg/ml, C – 20 µg/ml, D – 50 µg/ml)
O estudo realizado evidenciou grande variação na sensibilidade dos diferentes
organismos ao fosfonato potássico. Os valores do EC50 variariam entre 0,64 mgL-1 para
o isolado mais sensível, um isolado de P. cinnamomi, e 867,36 mgL-1 para o isolado
mais tolerante o fungo C. parasitica associado com o Cancro do Castanheiro.
59
O EC50 (concentração que inibe o crescimento micelial em 50 %) do fosfonato
potássico em P. cinnamomi foi para os diferentes isolados inferior ou próximo de 1
mgL-1 com excepção do isolado Pr 125 que apresentou valores muitas vezes superiores
e da mesma ordem de grandeza nas diferentes repetições. P. cambivora apresentou
valores superiores aos de P. cinnamomi e com grande variabilidade entre os isolados
testados (Quadro 21).
O fungo micorrízico Pysolithus tinctorius, um Basidiomycete com capacidade de
estabelecer relações de simbiose com as raízes de castanheiro, apresentou um valor
elevado de EC50 mas inferior ao obtido no isolado de Phytophthora (Pr 125) com menor
sensibilidade ao fosfonato potássico
O particular modo de acção dos fosfonatos não permite, no entanto, induzir o
efeito deste parâmetro no grau de protecção das raízes do castanheiro e apenas ensaios
com estes isolados permitirão obter essas informações.
O valor do EC50 em Pisolhitus tinctorius indica baixa toxicidade directa do
fosfonato potássico mas uma vez mais este parâmetro não é um bom indicador do seu
efeito na interacção micorrízica em plantas onde se aplicou fosfonato, aspecto que é
necessário avaliar antes de utilização generalizada destes produtos em castanheiro.
Quadro 21 – EC50 do fosfonato potássico (concentração que inibe o crescimento
micelial em 50%) em diferentes isolados de Phytophthora cinnamomi, Phytophthora
cambivora, Pisolithus tinctorius e Cryphonectria parasitica.
Valor de EC50* (mgL-1)
Espécie
Isolado
P. cinnamomi
P. cambivora
Pr120
1,34
Pr125
31,56
810
0,64
804
0,97
Ar102
9,92
Pr135
22,44
Pisolithus. tinctorius
14,10
Cryphonectria parasitica
867,36
* Concentração que inibe o crescimento micelial em 50%
O isolado de C. parasitica obteve um valor de EC50 muito elevado (876,36
mgL-1). Este valor de EC50 indica baixa toxicidade directa do fosfonato potássico sobre
60
este fungo mas cujo efeito na protecção do castanheiro contra este fungo terá de ser
avaliado in vivo dado o particular modo de acção destas substâncias.
A avaliação da toxicidade do fosfonato potássico pela determinação do EC50 em
meio PDA evidenciou uma grande variabilidade entre os isolados de P. cinnamomi e
também em P. cambivora, outra espécie de Phytophthora associada com a doença da
tinta em castanheiro. A variabilidade dos valores obtidos indica susceptibilidade não
uniforme da população das espécies parasitas.
4.3.2 – Resposta in vitro ao fosetil-Al
O crescimento micelial dos diferentes isolados nas diferentes concentrações de
fosetil-Al em estudo (20 µg/ml; 50 µg/ml e 100 µg/ml de fosetil-Al e controlo) é
apresentado no Quadro 22.
Os isolados de P. cinnamomi em estudo, apresentaram um maior crescimento
que os isolados de P. cambivora. O isolado de P. cinnamomi (Pr120) foi o que
apresentou maior crescimento na concentração mais alta (100 µg/ml) de fosetil-Al,
sendo o isolado de P. cambivora (Pr135) aquele que apresentou um menor crescimento
nessa mesma concentração. No entanto o aumento da concentração de fosetil-Al não se
traduziu numa inibição do crescimento micelial nos isolados das diferentes
Phytophthoras (Figura 16).
Quadro 22 – Crescimento micelial (centímetros) dos isolados de Phytophthora
cinnamomi (Pr120, 810 e 804) e Phytophthora cambivora (Ar102 e Pr135) crescendo
em meio de cultura PDA acrescido de 20 µg/ml; 50 µg/ml e 100 µg/ml de fosfonato
potássico e sem adição de fosfonato potássico (controlo).
Controlo
20 µg/ml
50 µg/ml
100 µg/ml
média±sd
média±sd
média±sd
média±sd
Pr120
7,32±0,44a
7,02±0,64a
7,10±0,99a
7,28±0,76a
810
7,80±0,48a
7,32±0,35ba
6,88±0,22b
7,06±0,17b
804
7,08±0,48a
6,74±0,77a
6,50±0,43a
6,44±0,73a
Ar102
5,18±0,38a
4,72±0,33ba
4,34±1,11ba
5,52±0,26b
Pr135
1,36±0,25a
1,64±0,48ba
1,14±0,11b
2,08±0,15b
sd – desvio padrão
Nota: Em cada linha, as médias seguidas de letras diferentes, diferem significativamente (P ≤ 0.05).
61
Em geral, crescimento micelial dos isolados de Phytophthora em estudo não foi
significativamente (P>0,05) inibido pelas diferentes concentrações de fosetil-Al (20
µg/ml; 50 µg/ml e 100 µg/ml). Neste contexto, não é possível estabelecer a relação entre
a dose do produto em ensaio e os efeitos tóxicos no organismo, pelo que o valor do
EC50 não pode ser determinado com base nas concentrações em estudo. O resultado é no
entanto o esperado uma vez que o fosetil-Al é considerado sem toxicidade directa nestes
organismos. A acção tóxica do fosetil-Al só se manifesta in vivo ou seja quando
aplicado na planta.
Figura 16 – Phytophthora cinnamomi em diferentes concentrações de Aliette (A - 20
µg/ml B - 50 µg/ml C - 100 µg/ml)
62
5 – Discussão e Conclusões
P. cinnamomi é um parasita reconhecido desde 1922 quando Rands identificou o
causador da doença radicular da árvore da canela (Cinnamomum burmanii) na região de
Sumatra. Considerado como parasita vegetal de distribuição mais generalizada e com
maior número de hospedeiros (Zentmeyer, 1981), está presente em todos os continentes
e causa infecção em mais de 1000 espécies vegetais onde as plantas lenhosas e
arbustivas estão largamente representadas (Zentmeyer, 1981). Considerado como
parasita introduzido nas regiões onde actualmente provoca doenças com importância
económica, o local de origem do parasita é ainda um tema com alguma controvérsia,
sendo considerado a região da Malásia e do Norte da Austrália um possível centro de
origem. Crandall & Gravatt (1969) referem que o parasita teria sido disperso pelos
portugueses, espanhóis e franceses pelos diferentes continentes. Uma outra teoria
considera o parasita um organismo frequente na micoflora do solo e seriam as alterações
climáticas o factor determinante no desenvolvimento deste organismo como parasita
Woods (1953). Esta teoria foi considerada pouco verosímil por Zentmeyer (1980) mas a
relevância actual do tema e os estudos relacionados com os efeitos das alterações
climáticas poderão proporcionar uma análise mais abrangente desta teoria.
P. cinnamomi invade inicialmente as raízes mais finas das plantas lenhosas
podendo também causar podridões nas raízes de maior dimensão e mesmo no colo da
planta tendo ainda capacidade de infectar folhas e frutos em condições laboratoriais.
Sendo um parasita das raízes, o controlo da doença é considerado particularmente difícil
(Gouveia, 1994) e de resultados não completamente previsíveis mesmo com a aplicação
de substâncias sistémicas uma vez que o parasita se encontra no solo com elevada
capacidade de sobrevivência mesmo na ausência de hospedeiro. Têm ainda a capacidade
de rapidamente produzir grande quantidade de propágulos (zoósporos) que vão causar
infecção nas raízes. A dificuldade do tratamento do solo por substâncias de acção tóxica
no parasita é igualmente pouco eficaz pela dificuldade associada ao grande volume de
solo que seria necessário tratar e à necessidade de o manter isento dos parasitas durante
todo o ciclo de vida do hospedeiro.
Com este trabalho estudou-se a eficácia do tratamento com fosfonato potássico,
(Atlante®) com carácter preventivo e por aplicação foliar, na protecção das raízes do
castanheiro em relação P. cinnamomi. A resposta ao tratamento foi estudada com base
63
nos sintomas evidenciados pela planta tanto na parte aérea como nas raízes e em
parâmetros fisiológicos relacionados com o crescimento da planta.
O termo “fosfonato” refere-se a compostos contendo um corpo fósforohidrogénio (P-H) que confere actividade biológica contra Oomicetas (Guest et al.,
1995). O modo de acção do fosfonato não está ainda bem compreendido. No entanto é
geralmente aceite que mecanismos complexos são directa e indirectamente responsáveis
na perturbação do metabolismo do fósforo dos patogéneos e na estimulação dos
mecanismos de defesa dos hospedeiros (Guest & Grant, 1991; Guest et al., 1995;
Smillie et al., 1989).
Relativamente aos parâmetros fisiológicos, as plantas que não foram sujeitas à
aplicação foliar de fosfonato potássico apresentaram um crescimento em altura
ligeiramente superior às plantas em que houve aplicação foliar de fosfonato potássico,
sem no entanto apresentarem diferenças significativas. O diâmetro ao nível do colo das
plantas com aplicação foliar de fosfonato potássico foi superior ao das plantas sem
aplicação de fosfonato potássico, tendo os valores obtidos mostrado diferenças
significativas entre as modalidades.
A biomassa da parte aérea, determinada em folhas e caules, não apresenta
diferenças significativas entre as plantas de castanheiro tratadas com fosfonato potássico
por aplicação foliar e as plantas sem aplicação de fosfonato, embora os valores das
plantas sem aplicação de fosfonato potássico seja ligeiramente superior.
Os valores da biomassa radicular apresentaram diferenças significativas entre as
plantas de castanheiro tratadas por pulverização foliar com fosfonato potássico e as
plantas sem tratamento. As plantas que cresceram em substrato inoculado com P.
cinnamomi e com aplicação de fosfonato potássico apresentaram todo o sistema
radicular, quer considerando o comprimento radicular quer considerando o número de
raízes, com podridão radicular, excepto uma planta, que apesar de apresentar 70% do
sistema radicular infectado ainda não apresentava sintomas da Doença da Tinta na parte
aérea. Das plantas que foram tratadas com fosfonato potássico, só 50% apresentaram
sintomas da doença nas raízes, variando essa infecção entre os 2 e os 16% do sistema
radicular. Os resultados obtidos mostram que P. cinnamomi infectou o sistema radicular
dos castanheiros, sendo visíveis os sintomas nas plantas que não foram tratadas. A
aplicação de fosfonato potássico protegeu o sistema radicular uma vez que passados
quatro meses a grande maioria das raízes não apresentavam sintomas de podridão
radicular. De referir que embora não sejam visíveis sintomas nas raízes a presença de P.
64
cinnamomi foi obtida por isolamento do parasita em meio selectivo no substrato e nas
raízes das plantas sem sintomas.
O parâmetro fisiológico mais afectado pela inoculação de P. cinnamomi é o peso
seco das raízes. P. cinnamomi actua sobre o sistema radicular em geral, mas
especialmente sobre as raízes finas (Smith, 1992). Navarro et al. (2006) verificaram
também que o peso seco da raiz secundária tinha sido o parâmetro fisiológico mais
afectado quando estudaram o efeito do fosfonato em Quercus ilex e Quercus suber.
A protecção conferida pelo fosfonato de potássio foi também avaliada por
inoculação de P. cinamomi na parte aérea da planta. Este método pode considerar-se um
método indirecto da avaliação do efeito protector e baseia-se na capacidade do
hospedeiro limitar o crescimento do parasita. Este princípio é também aceite quando se
avalia a resistência do castanheiro em relação a Phytophthora pelo método de
inoculação em ramo destacado (Gouveia 1994; Fernández-López et al., 2001). O
comprimento da lesão é superior nas plantas não tratadas com fosfonato potássico uma
vez que não se encontravam protegidas. O facto de o parasita ter um crescimento
limitado nos tecidos do hospedeiro quando se fez a aplicação do fosfonato de potássio
permite associar esta característica à protecção conferida pelo fosfonato. Apesar de o
método avaliar o efeito protector de forma indirecta a facilidade da sua execução poderá
ser de grande utilidade para conhecer o período de tempo em que a planta se encontra
protegida e estudar a concentração necessária para que o produto seja eficaz sem causar
efeitos tóxicos.
A hipótese de acção dos fosfonatos estar relacionada com os mecanismos de
resistência das plantas está fundamentada em evidências experimentais a nível
bioquímico (Jackson et al., 2000; Daniel et al. 2005; Daniel & Guest 2006). Jackson et
al. (2000) verificaram aumento de enzimas relacionadas com mecanismos de defesa
nomeadamente fenilalanina amónia liase (PAL), 4- comarato coenzima A ligase (4-CL),
cinamil álcool desidrogenase (CAD) em Eucalyptus marginata enquanto Daniel &
Guest (2006) verificaram rápida agregação do citoplasma e migração do núcleo das
células, fenómenos associados com reacções de hipersensiblidade, produção de
superoxido (O2-) e acumulação de compostos fenólicos na interacção susceptível de A.
thaliana e P. palmivora. Daniel & Guest (2006) consideram ainda que a quantidade de
produto presente no interior da planta não será suficiente para induzir efeito tóxico
directo e esse efeito estará associado à acumulação de produtos de defesa da planta
tóxicos para o fungo. O efeito tóxico do anião fosfonato estará relacionada com a
65
competição com o anião fosfato (H3PO4-) em diferentes enzimas e a diferença de
sensibilidade entre as espécies dependerá da sua capacidade em distinguir o anião
fosfonato do anião fosfato ou ATP e da capacidade de excluir o anião fosfonato na
presença do anião fosfato (Stechmann & Grant, 2000). A presença do anião fosfonato
nos sais inorgânicos do ácido fosfórico o seu reduzido custo assim como o fim do
período
de
patente
do
tris-O-ethylphosphonate
(fosetil-Al)
determinaram
o
aparecimento de muitas substâncias baseadas neste princípio activo comercializadas
como fertilizantes com ou sem indicação do seu efeito fungicida. Os fosfonatos são
considerados (http//www.epa.esa.gov/pesticides/biopesticides) biopesticidas pela EPAUS e enquadrados nos fungicidas bioquímicos em termos regulamentares dado o seu
particular modo de acção e por serem substâncias muito frequentes no ambiente, pese
embora, o facto destes produtos não ocorrem naturalmente na natureza.
A aplicação foliar do fosfonato potássico, protegeu as raízes do castanheiro
numa situação em que é de considerar elevada pressão de inoculo do parasita durante
todo o período do ensaio. O estado saudável da grande maioria das raízes, mesmo
depois de 4 meses, sugere que o mecanismo de defesa se situará nas primeiras etapas do
processo de infecção como acontece nas interacções incompatíveis desencadeados nos
hospedeiros resistentes. As plantas tratadas com fosfonato potássico evidenciaram um
comportamento semelhante às plantas resistentes, não tendo proporcionado o
crescimento do parasita quando inoculadas na parte aérea, ao contrário do que
aconteceu com as plantas não tratadas com esta substância. As condições de aplicação
do produto fazem supor que a substância ou produtos da sua degradação ou do seu
metabolismo se encontrarão na raiz quando do contacto com o parasita o que
desencadeará os mecanismos de defesa.
Em várias plantas o fosfonato é rapidamente detectado nas folhas e raízes em
poucos minutos ou em algumas horas após aplicação e persiste durante um período
substancial contribuindo com actividade biológica nos tecidos das plantas (Guest et al.,
1995). Ouimette & Coffey (1989) reportam que uma quantidade elevada de fosfonato
contabilizado para um efeito directo em P. cinnamomi foi registada em folhas e raízes
de abacate durante oito semanas. No entanto é necessário aplicar fosfonato antes da
infecção para um eficaz controlo da doença porque os valores variam significativamente
dependendo do tempo de aplicação. A eficácia dos fosfonatos aumenta quando aplicado
com carácter preventivo. Mesmo assim Marks & Smith (1992) encontraram um efeito
positivo na redução dos danos provocados por P. cinnamomi em Leucadendron quando
66
os tratamentos se fazem de forma simultânea à infecção, e tem-se documentado o efeito
protector quando se aplica 24 horas após a infecção (Rohrbach & Schenk, 1985).
A avaliação da toxicidade do fosfonato potássico pela determinação do EC50 em
meio PDA evidenciou uma grande variabilidade entre os isolados de P. cinnamomi e
também em P. cambivora, outra espécie de Phytophthora associada com a doença da
tinta em castanheiro. Os valores de EC50 variaram entre 0,64 mgL-1 e 31,56 mgL-1 para
P. cinnamomi e 9,92 mgL-1 e 22,44 mgL-1 para P. cambivora. Estes valores indicam um
efeito tóxico mais elevado do fosfonato potássico, para os isolados de Phytophthora,
quando comparado com o EC50 do fosfito (Phyto-Fos-K, 33,7g/100ml) um outro
produto com base em fosfonato potássico e comercializado numa formulação sólida
pela A. M. C. Chemical S. Ltda. Os valores de Ec50 do Phyto-Fos-K, obtidos por Coelho
et al., (2005), variaram entre 2,99 e 172,39 mgL-1 para P. cinnamomi tendo P.
cambivora apresentado valores entre 47,23 e 237,25 mgL-1.
A variabilidade nos valores obtidos indica susceptibilidade não uniforme da
população das espécies parasitas e diferenciação de susceptibilidade dos isolados. O
particular modo de acção dos fosfonatos não permite, no entanto, concluir sobre o efeito
da substância no grau de protecção das raízes do castanheiro e apenas ensaios com estes
isolados na presença da planta permitirão obter essas informações.
O crescimento micelial dos isolados estudados não foi inibido com o aumento da
concentração do fosetil-Al, o que indica baixa toxicidade directa do fosetil-Al nas
espécies de Phytophthora. Clerjeau & Beyries (1977); Bompeix et al. (1980) e Farih et
al. (1981) tinham também já demonstrado a baixa toxicidade in vitro do fosetil-Al em
diferentes espécies de Phytophthora. Os resultados obtidos neste ensaio confirmam esta
afirmação, pois todos os isolados em estudo apresentaram o mesmo crescimento na
presença das diferentes concentrações de fosetil-Al, e da mesma ordem de grandeza do
controlo ou seja sem adição de fosetil-Al.
O valor do EC50 em Pysolhitus tinctorius indica baixa toxicidade directa do
fosfonato potássico mas, uma vez mais, este parâmetro não é um bom indicador do seu
efeito na interacção micorrízica em plantas onde se aplicou fosfonato potássico, aspecto
que é necessário avaliar directamente nas plantas antes da utilização generalizada destes
produtos em castanheiro.
O isolado de C. parasitica, um fungo patogénico da parte aérea do castanheiro,
associado com a conhecida doença do Cancro do Castanheiro, obteve um valor de EC50
67
muito elevado (876,36 mgL-1). Este valor de Ec50 indica baixa toxicidade directa do
fosfonato potássico sobre este fungo não sendo, uma vez mais possível avaliar o efeito
na planta e consequentemente no controlo da doença.
P. cinnamomi é parasita em muitas espécies lenhosas onde os fosfitos foram
igualmente testados tendo evidenciado eficácia no controlo da doença. Os resultados
obtidos neste trabalho vão de encontro aos obtidos por Wilkinson et al. (2001), Hardy et
al. (2001), Barrett et al. (2003) e Navarro et al. (2006), que avaliaram a acção curativa e
preventiva da aplicação do fosfonato no controlo de P. cinnamomi.
A aplicação dos fosfitos pela via foliar, obviamente, não remove P. cinnamomi
do ambiente solo tendo-se confirmado a sua presença no substrato dos vasos mesmo
onde as raízes não manifestaram sintomas de podridão. Este aspecto tem implicações
práticas importantes uma vez que a pressão do inoculo se mantêm no solo e pode ser
transportado para outros locais onde iniciará novos focos da doença. Conhecer o
período de tempo em que as raízes ficam protegidas e o efeito do fosfonato potássico
quando a infecção está já instalada nas raízes assim como as épocas e doses de
aplicação são aspectos sobre os quais é necessário obter informações para tornar
eficiente e permitir a inclusão deste meio de protecção das raízes do castanheiro em
programas de protecção integrada.
O efeito do fosfonato de potássio em castanheiros adultos deve também ser
estudado, ajustando as doses para evitar problemas de fitotoxicidade e desenvolver os
processos de aplicação mais adequados à aplicação no campo de forma simples e
económica.
68
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