Tipo de Comunicación: Comunicación Oral Simposio

Tipo de Comunicación:
Comunicación Oral
Simposio:
BIOINGENIERÍA MOLECULAR, BIOLOGÍA DE SISTEMAS E INGENIERÍA METABÓLICA.
NUEVAS TECNOLOGÍAS
Título:
Análise da expressão genética com silenciamento do gene NPP1 de Phytophthora
cinnamomi mediada por iRNA
Autores:
Costa R, Dominguez A, Choupina A
Centro de Trabajo:
Departamento de Microbiología y Genética, Edificio Departamental // CIMO, Escola
Superior Agrária de Bragança, Instituto Politécnico de Bragança
Email:
[email protected]
Palabras Clave:
Phytophthora cinnamomi; NPP1; iRNA; hairpin-RNA; SDS – PAGE; RT-qPCR.
Comunicación:
Phytophthora cinnamomi é um Oomiceta associado ao solo pertencente ao Reino
Chromista. Este peseudofungo é responsável pelo declínio de mais de mil plantas
ornamentais, florestais ou de fruto, e ataca raízes finas. É capaz de segregar uma nova
classe de proteínas denominada NPP1 (proteína 1 indutora de necrose de Phytophthora),
responsável por induzir necrose em folhas e raízes de plantas, levando à morte destas.
Este trabalho relatará a análise da expressão genética com silenciamento do gene NPP1
de Phytophthora cinnamomi mediada por iRNA.
Para efetuar o silenciamento genético foi empregue a técnica de iRNA. Isto constitui uma
estratégia para análise da função de genes através da utilização de moléculas de RNA de
fita dupla, em que uma das fitas apresenta sequência complementar ao RNA mensageiro
do gene alvo, causando a degradação de sequências específicas do RNAm. Foi usada
uma construção baseada em sistema de expressão plasmídico hairpin-RNA, por meio da
introdução de um íntrão entre fragmentos sentido e anti sentido do gene alvo na construção
hairpin-RNA. Construiu-se com sucesso uma cassete de silenciamento para o gene de
interesse baseado em sistemas de expressão hairpin-RNA no vetor pTH210 e realizou-se a
transformação de Phytophthora cinnamomi por meio de PEG baseada em emprego de
protoplastos e de transformação por meio de eletroporação baseada no emprego de
zoósporos.
Após crescimentos em antibiótico seletor higromiciana B (200 ug/mg) confirmou-se o
sucesso de sete transformantes resistentes a higromiciana B por meio destas duas vias.
Foram feitas infecções de raízes de Castanheiro com inóculo de Phytophthora cinnamomi
mutante/normal para diferentes tempos de 24, 48 e 72 horas, o que proporcionou uma
análise morfológica comparativa entre os castanheiros. Verificou-se um contraste evidente
entre os castanheiros infectados por P. cinnamomi mutante e normal. Após 72 horas de
infecção observou-se percentualmente um menor aparecimento de necrose nas plantas
infectadas por P.cinnamomi mutante, enquanto para as plantas infectadas com o
pseudofungo normal observou-se um maior percentual de necrose nos castanheiros, este
resultado parece indicar a efetividade da cassete silenciadora na Phytophthora cinnamomi
transformante. A análise da efetivamente da cassete silenciadora será realizada por meio
de SDS – PAGE e RT-qPCR