Assimilação de nitrogênio: N2, NO - e NH + N2, NO

Assimilação de nitrogênio:
N2, NO3 - e NH4+
soja
Objetivos:
• Identificação das formas de N que
efetivamente entram no sistema
vegetal.
• Reconhecimento das enzimas chaves
dos processos de fixação e
assimilação de N nas plantas.
• Formas de mobilização de N entre os
tecidos.
• Mecanismos de controle do processo.
KEGG PATHWAY Database
http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html
NO3-
nitrate
NO2nitrite
N2
NH3/NH4+
KEGG PATHWAY Database
http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html
NO3-
nitrate
NO2nitrite
N2
NH3/NH4+
Formas de entrada no metabolismo de plantas
Bacteria
Anabaena
NO3nitrate
NO2nitrite
Planta
Arabidopsis
NH3/NH4+
N2
Shinorhizobium
Oryza
Demais
organismos?
Formas de entrada no metabolismo de animais
Homo sapiens
Principal deficiência nutricional na agricultura
trigo
trigo
trigo
gramado
Nitrogênio; formas e estados de oxidação
ÚTEIS?
Espécies
Nome
Nível de
Oxidação
NH3, NH4+
Ammonia, ion amônio
-3
N2H4
Hidrazina
-2
NH2OH
Hidroxilamina
-1
N2
Nitrogênio molecular
N2O
Óxido nitroso
+1
NO
Óxido nítrico
+2
HNO2, NO2-
Ácido nitroso, íon nitrito
+3
NO2
Dióxido de nitrogênio
+4
HNO3, NO3-
Ácido nítrico, íon nitrato
+5
0
Tamanho dos reservatórios globais de Nitrogênio
ÚTEIS?????
Reservatório/Tipo de
Metric Tons
% do Total
Biosfera
2.8 x 1011
0.0002
Hidrosfera
2.3 x 1013
0.014
Atmosfera
3.86 x 1015
2.3
Geosfera
1.636 x 1017
97.7
Crosta
0.13 - 1.4 x 1016
0.78-8.4
Solos e Sedimentos
0.35 - 4.0 x 1015
0.21-2.4
Mantle and Core
1.6 x 1017
95.6
Ciclo do nitrogênio
%: fixação natural
2% reações fotoquímicas
8%
nitrificação
nitrificação
90% fixaçãobiológica:
LIVRES E SIMBIONTES
Objeto de estudo
soja :
Bradirhizobium
Anaerobiose
Gunnera : Nostoc (no caule)
-bact
+ bact
Azolla : Anabaena (ciano)
cana : Acetobacter
Anabaena
(arroz)
Anaerobiose
methanococcus
Nostoc
Anaerobiose
Organismos fixadores de N2
• Fixadores de vida livre
– Eubacteria
– Archaebacteria
• Fixadores em associação
com plantas
– cooperação metabólica
• NeC
– Eubacteria
• cianobactérias
• alfa-proteobactérias dos grupos
Rhizobiales e Rhodospirillales
Distribuição filogenética das eubactérias
fixadoras de N2 (Buchanan, 2000).
Patógenos
Simbiontes vs nutrição
Interações
essenciais…
-Co
+Co
(essencial para o simbionte)
tomate : nemátodo
Azolla : Anabaena (ciano)
tomate : Cladosporium
FIXAÇÂO
BIOLÓGICA DE
NITROGÊNIO!
soja : Bradirhizobium
tomate : Pseudomonas
feijão : Rhizobium
videira : Xylella
raíz : micorriza
Fixadores em associação com plantas
Simbiose extracelular
Azolla : Anabaena
Simbiose intracelular
Glicine : Bradyrhizobium
Simbiose intracelular
Rhizobium
Glicine : Bradyrhizobium
Nódulos em Sesbania
Nosso objeto de estudo
Um grupo singular... Alpha-proteobacteria
Árvore filogenética das
alfa-proteobactérias
estimada pela comparação
da seqüência do 16S RNA
patógenos
Rhizobium
Sinorhizobium
Mesorhizobium
Bradyrhizobium
Rhizobium
Sinorhizobium
Mesorhizobium
Associação
simbiótica
formadora
de nódulos
Bradyrhizobium
Ciclo do N vs Fixação Biológica
Ex: moléculas com N em plantas
nitrificação
desnitrificação
[N2 + 4NADH + 4H+ + 16 ATP →2NH3 + H2 + 4NAD++16 ADP + 16 Pi]
NITROGENASE
Fixação do N2 atmosférico
• O N disponível para plantas > 90% provém da fixação
biológica > ~80% gerado por associações simbióticas.
• A forma atmosférica N≡
≡N não está disponível para a
maioria dos organismos.
• Quebra da tripla ligação envolve alto gasto energético.
[16 ATP ]
• Atividade da nitrogenase é inibida pela presença de
oxigênio.
• Evolução de processos simbióticos (interação eucariotoprocarioto~patogênese).
Fixação industrial
• Fertilização química
• Processo de Haber-Bosch
– 1913, os trabalhos de Fritz
Haber e Carl Bosch na
Alemanha permitiram a síntese
química de amônia (NH3).
– Produção anual de
80x1012g/ano
- N≡
≡N quebra da tripla ligação
Simbiose intracelular:
formação de nódulos
• Como se desenvolve o
processo de infeção e
estabelecimento do nódulo?
• Quais são os genes da
planta e da bactéria
envolvidos?
• Como está regulado o
Nódulo > Medicago : Sinorhizobium
sistema?
Como se desenvolve o processo de infeção e
estabelecimento do nódulo?
1. Raízes liberam substâncias: flavonóides, betaína,
que são reconhecidos pelo produto do gene NodD na bactéria
que induz a expressão dos
genes Nod que irão sintetizar fatores Nod.
2. Bactérias liberam os
“fatores” Nod: oligossacarídeos de lipoquitina
(particularidades entre diferentes interações)
3. As raízes receptam os fatores Nod, com
lectinas e apresentam alteração
no fluxo iônico,
4. As raízes expressam as
nodulinas, são infectadas, e seguem
o programa para a morfogênese
do nódulo.
Fatores Nod
oligossacarídeos de lipoquitina
2
enzimas
1
3 Receptor?
Bactéria
Transdução do sinal: flutuações de Cálcio nos pelos radiculares
quando expostos aos Fatores Nod.
Alterações provavelmente devidas
a influência sobre
os canais ou bombas de Ca2+...
?
...inicia-se a curvatura do pêlo radicular.
simbiossomo
Quais são os genes da planta e da bactéria
envolvidos?
Genes Nod:
•Síntese de fatores Nod
•Proteínas envolvidas na atividade
fixadora de N
Nodulinas:
•participam da invasão,
estabelecimento e manutenção do
nódulo
Tecidos afetados pela formação do nódulo:
epiderme, cortex, endoderme e periciclo
Fatores Nod
•ativação gênica na planta (nodulinas)
•indução de divisão celular
•(18-30 hrs)
Local de formação
do nódulo (região
cortical na frente
dos polos
xilemáticos
Quais são os genes da planta envolvidos?
Na planta:
Nodulinas
•precoces
• ENOD11
• ENOD12
•ENOD40
•genes dim
•genes sym
•tardias
• leghemoglobina (Lb)
•Transportadores de NH4+ para a membrana do simbiossomo
PLASMID
PLASMID pNGR234a
CHROMOSOME
Quais são os genes
envolvidos?
Na bactéria:
Expressão precoce
•Genes nod, nol, noe
(síntese e secreção de fatores
nod)
•especificidade hospeiro
Expressão tardia
•Genes nifH, nifD e nifK
(nitrogenase)
•Genes fix
(regulatórios)
Complexo enzimático da nitrogenase
(Heterohexámero)
[N2 + 4NADH + 4H+ + 16 ATP →2NH3 + H2 + 4NAD++16 ADP + 16 Pi]
(NAD+)
(NADH)
Polipeptídeo MoFe 4 subunidades (2α e 2β) totalizando 240 kDa: Fe-S-Mo Cofactor
Polipeptídeo Fe 2 subunidades idênticas totalizando 64 kDa: 4Fe-4S Cofactor
TOTAL: 304 kDa
Nitrogenase: Controle da expressão gênica
↓ O2
Via NodD
Fatores de
transcrição
nif: nitrogenase
fixN: ambiente
microaeróbico (?)
Nódulo ativo
•
•
•
•
Simbiossomos
Leghemoglobina (hemo/Fe)
Citocromo oxidase de alta afinidade: gerador
do ATP necessário para fixação.
Células “vazias” formam barreira para o
oxigênio.
•
Respiração bacteriana usa O2, e o ATP
produzido é utilizado na fixação de N2
(citocromo oxidase de alta afinidade).
•
A nitrogenase sempre está funcionando em
condições subótimas.
•
Se ↑ O2, aumenta a respiração, e
consequentemente o ATP, a fixação também
pode aumentar (consome o ATP) .
•
Se ↑ ↑ ↑ O2, a inativação da nitrogenase faz
aumentar muito o ATP, a respiração é inibida,
menos O2 e consumido e a nitrogenase é mais
inibida…..colapso do metabolismo.
Translocação de esqueletos contendo N a partir das raízes fixadoras pode variar entre diferentes plantas:
•Amidas: gln, asp, purinas (nódulos de alfafa, ervilha e outras espécies)
•Ureídas: derivados de ácido úrico como ác. Alantóico e alantoina (feijão, soja e vigna)
•OutrosAminoácidos
- Entrada de N em
plantas sem
fixação biológica
de N2
- Transformação de
NO3- para NH4+
- Assimilação do
NH4+ e biosíntese
de compostos
nitrogenados
Entrada de NO3- e NH4+
• NO3-: Absorção do solo
– transportador do tipo
simporte
• NH4+: Absorção do solo
– transportador do tipo
simporte (alta afinidade, induzida e
baixa afinidade, constitutivo)
• Que vias enzimáticas são
utilizadas?
– NR/NiR
– GS/GOGAT
– GDH
• Localização nos tecidos
Arabidospsis mutante para transportador de nitrato.
A mutante para o transportador de NO3- não absorve
clorato que é tóxico.
NO3- a NH4+: duas reações
Nitrato reductase
Cofatores:
Mo, HemoFe, FAD
NO3
NADH
NAD+
NO2
Citoplasma de folhas e raízes
•Dependendo da espécie: folha ou raíz
•Dependendo da disponibilidade de NO3:
extensão da expressão
↑NR ↑↑↑NiR
Nitrito reductase
NR regula
NiR impede aúmulo de NO2
Cofatores:
FeS, siroheme
Platídios de folhas e raízes
Regulação da atividade da Nitrato redutase
– Transcricional:
nitrato ↑,
ritmo circadiano
sacarose ↑
glutamina ↓
luz (fitocromo) ↑
Plântulas de cevada (expostas a NO3)
nia mRNA (tomate)
Regulação da atividade da Nitrato redutase
– Pós-transcricional (rápida e reversível)
• fosfoliração: inativa
• defosforilação: ativa
Escuro
Baixo CO2
cinase
Fosfatase
Gene nir
Gene nr
sacarose
ABA
mRNA
NiR
mRNA
da NR
luz
Baixo CO2
escuro
NR
inativa
NiR
ativa
NR
ativa
degradação
NO3-
NO2-
pós-transcricional
transcricional
Citocinina
transcricional
Resumindo...
NH4+
Assimilação de NH4+
GS
GOGAT
Folha: (cp e cit)
(cp)
Raiz: (cit)
(plastos)
Carbohidratos
Luz
+ trans
Luz
+ trans
+ atividade
α-Ketoglutarato
transaminação
α-Ketoglutarato
Carbohidratos
Luz
-Trans
- atividade
Assimilação de NH4+
GS
GOGAT
Folha: (cp e cit) (cp)
Raiz: (cit)
(plastos)
X
X
X
X
Interação NO3- e metabolismo de C:
1-↑
↑ NO3- desvia C de amido →aa
1
↑
↓
2- ↑luz e carbohidratos:
Ativa GC-GOGAT e inibe AS para
acumular N em compostos ricos em
carbono: glutamina (1/4) e glutamato
(a partir dos quais muitas outras rotas
surgem)
Baixa Energia:
Acumulo de N em compostos com alta
relação N/C e estável para o
transporte: asparagina(2/4)
1
2
Glutamate synthase
Interação NO3- e metabolismo de C:
Reciclagem do fosfoglicota da fotorespiração
Translocação de esqueletos contendo N a partir
das raízes pode variar entre diferentes
plantas:
Amidas: gln, asp, purinas (nódulos de alfafa,
ervilha e outras espécies)
Ureídas: derivados de ácido úrico como ác.
Alantóico e alantoina (feijão, soja e
vigna)
Nitrato
Aminoácidos
RAÍZ
Comparação dos processos de
incorporação de N ao metabolismo
Planta não nodulada
Assimilação N
em raiz e folha
N translocado
preferencialmente
como nitrato, Gln ou
Asn
Altos teores de
nitrato no solo
Planta nodulada
(feijão, soja)
Assimilação N
em raiz.
N translocado
Gln, Asn ou ureídes
Baixos teores de
Nitrato no solo
Referências bibliográficas e sítios
• Buchanan, Gruismen and Jones (2000) Capítulo 16 pg: 786824.
• Heldt (2005) Capítulos 10 e 11. Plant Biochemistry.
• Kerbauy (2004) Capítulos 3 e 4.
• Taiz (2002) Capítulos 12 pg: 260-272.
• Forde (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53: 203-224.
• Geurts and Bisseling (2002) The plant Cell, Supplement:
S239-S249.
• Kistner and Parniske (2002) Trends in Plant Science, 7: 511518.
• Heldt (2005) Plant Biochemistry.
• http://academic.reed.edu/biology/Nitrogen/
• http://www.genome.ad.jp/kegg/metabolism.html