Exemplo 1 - PRPPG

18º Evento de Iniciação Científica da UFPR
18º EVINCI
Nº 000 CLONAGEM, SUPEREXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA
NODD DE Herbaspirillum seropedicae
Aluno de Iniciação Científica: Denny Marcel Seccon (PIBIC/CNPq)
Nº de Registro do Projeto de Pesquisa no BANPESQ/THALES: 2003012612
Orientador: Roseli Wassem
Colaborador: Emanuel Maltempi de Souza, Fábio de Oliveira Pedrosa
Departamento: Genética
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: nodD, Herbaspirillum seropedicae.
Área de Conhecimento: 2.02.02.00-8
Bactérias diazotróficas são responsáveis pela fixação do nitrogênio atmosférico. Dentre estas,
as da família Rhizobiaceae estabeleceram simbiose com plantas leguminosas, colonizando as
raízes em órgãos chamados nódulos. O reconhecimento entre os parceiros simbióticos começa
com a secreção de flavonóides pela planta, aos quais a bactéria responde com a secreção de
fatores Nod que ativam na planta genes responsáveis, em última instância, pela formação dos
nódulos. O flavonóide age ativando, na bactéria, a proteína ativadora de transcrição NodD. A
proteína NodD ativa então outros genes nod, nol e noe, promovendo a síntese das enzimas
responsáveis pela formação dos fatores Nod. Os fatores Nod são lipo-quito-oligossacarídeos
(LCOs) formados por 3 a 5 resíduos de N-acetilglucosaminil unidos por ligação -1,4. Essa
cadeia principal é sintetizada pelos produtos dos genes nodABC. Os demais genes envolvidos
no processo são responsáveis por modificações estruturais na cadeia, de forma que a
diversidade de estruturas finais dos fatores Nod é a principal responsável pela especificidade
entre a parceria simbiótica. Genes nod têm sido encontrados em microorganismos
diazotróficos endofíticos não formadores de nódulos, nos quais sua função não é ainda
conhecida. Em Herbaspirillum seropedicae, bactéria pertencente a esta classe, vários genes
nod foram encontrados, apesar de os genes nodABC estarem ausentes. Dentre os genes
identificados está o gene nodD, cuja função ainda é desconhecida em bactérias não
noduladoras. O objetivo geral deste trabalho é elucidar a função do gene nodD em H.
seropedicae. A comparação de seqüências entre as proteínas NodD de H. seropedicae e de
bactérias noduladoras revelou grande similaridade, sendo a maior similaridade observada com
um grupo de bactérias com ampla faixa de plantas hospedeiras. Análises estruturais
reconheceram um motivo hélice-volta-hélica na região N-terminal de NodD de H.
seropedicae, o qual é típico de proteínas ativadoras de transcrição. O gene nodD de H.
seropedicae foi amplificado por PCR a partir de um clone da biblioteca genômica da bactéria
(projeto GENOPAR) e clonado em vetor pGEM-T. Durante a amplificação do gene inseriu-se
um sítio de restrição para a enzima NdeI em sua região inicial, o que era necessário para a
correta inserção do gene no vetor de expressão pET-28a. Através de restrição com as enzimas
NdeI e SalI (cujo sítio está presente no plasmídeo pGEM), a região codificadora foi clonada
no vetor pET-28a, previamente restrito pelas mesmas enzimas. Ensaios de expressão foram
realizados, e a proteína expressa apresenta massa molecular compatível com a esperada
(34.752Da). A proteína NodD superexpressa está sendo purificada e será utilizada para
determinação de sua atividade.Suporte Financeiro: CNPq/UFPR, Fundação Araucária.
Livro de Resumos do 18º Evento de Iniciação Científica da UFPR