UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS SILVIA OLIVEIRA DE SOUZA THAGIANE RODRIGUES CAMPOS Candida albicans: FATORES DE VIRULÊNCIA E DE RESISTÊNCIA E O USO DE DERIVADOS VEGETAIS COMO ALTERNATIVA DE TRATAMENTO DA CANDIDÍASE ORAL Anápolis 2011 SILVIA OLIVEIRA DE SOUZA THAGIANE RODRIGUES CAMPOS Candida albicans: FATORES DE VIRULÊNCIA E DE RESISTÊNCIA E O USO DE DERIVADOS VEGETAIS COMO ALTERNATIVA DE TRATAMENTO DA CANDIDÍASE ORAL Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Goiás como exigência parcial à obtenção do título de Bacharel em Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Plínio Lázaro Faleiro Naves Anápolis 2011 Para aqueles que nos ensinaram na jornada da vida... Que a única razão pela qual se vive é o AMOR... A Deus e a nossas famílias. Dedicamos AGRADECIMENTOS Agradecemos a Deus pelas nossas vidas. Obrigada Senhor por estar ao nosso lado todos os dias, nos dando força e coragem para enfrentar os desafios diários. Agradecemos aos nossos pais por todo exemplo ministrado, exaltando a importância do conhecimento para a construção de uma carreira profissional. Somos gratas a toda dedicação e atenção advindas do nosso orientador Dr. Plínio Lázaro Faleiro Naves. Agradecemos grandemente aos nossos noivos pelo amor incondicional, apoio e compreensão. A todos os parentes, que mesmo longe, torcem por nós e aos colegas de curso que participaram de cada etapa dessa conquista, espero que nossa amizade se conserve com o tempo. Agradecemos ao CNPq pela concessão das bolsas e ao Prof. Dr. Evandro Leão Ribeiro pelo carinho de disponibilizar alguns artigos científicos para a realização desta revisão bibliográfica. “O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.” José de Alencar RESUMO Candida albicans representa o principal micro-organismo associado com a candidíase oral. É um fungo oportunista polimórfico, que se apresenta sob formas leveduriformes, no estado saprofítico, estando associado à colonização assintomática; ou como formas filamentosas de pseudo-hifas e hifas verdadeiras observadas em processos infecciosos. O equilíbrio entre Candida albicans e hospedeiro é propiciado pela manutenção da integridade das barreiras teciduais, relação harmônica da microbiota autóctone e funcionamento adequado do sistema imunológico humano. Diversos fatores mecânicos, físicos, químicos e iatrogênicos podem contribuir para a ruptura do equilíbrio da microbiota oral propiciando um aumento na multiplicação e invasão do tecido por C. albicans. Aderência, dimorfismo (formação de micélio), variabilidade fenotípica (switching), produção de enzimas extracelulares e toxinas constituem os principais fatores de virulência de C. albicans, além da formação de comunidades microbianas denominadas biofilme, que contribuem para sua expressiva patogenicidade e resistência aos antifúngicos disponíveis. As candidíases orais apresentam-se sob variados aspectos clínicos, destacando-se os tipos: pseudomembranosa aguda; eritematosa aguda, estomatite ulcerosa, crônica hiperplásica e quelite angular. O arsenal terapêutico disponível atualmente contra candidíase oral inclui agentes antifúngicos para uso tópico, tais como Anfotericina B e Nistatina e o fármaco sintético imidazólico, clotrimazol e quando um tratamento sistêmico é necessário, os azóis cetoconazol, fluconazol e itraconazol são prescritos. Diante da limitação do uso desses fármacos como o desenvolvimento de resistência, derivados de origem vegetal têm sido apontados como possibilidades de tratamento. Diante do exposto os objetivos, com base na literatura atual, são reunir dados sobre candidíase oral. Destacar os fatores de virulência da espécie Candida albicans. E ainda, enfatizar os estudos in vitro com derivados vegetais como busca de uma alternativa terapêutica à resistência microbiana. Investigações com derivados vegetais vêm sendo realizadas na perspectiva de se conhecer as propriedades biológicas e terapêuticas. Os trabalhos em nível laboratorial são necessários para fornecer subsídios à realização de ensaios clínicos posteriores. Esses conhecimentos podem levar à descoberta de importantes moléculas com atividade antimicrobiana. PALAVRAS-CHAVE: Candida albicans. Biofilme. Candidíase oral. Resistência. Fatores de virulência. ABSTRAT Candida albicans is the main micro-organism associated with oral candidiasis. It is an opportunistic polymorphic fungus, which appears in forms yeast-saprophyte in the state, being associated with asymptomatic colonization, or as filamentous forms of pseudo-hyphae and true hyphae observed in infectious processes. The balance between Candida albicans and host is brought about by maintaining the integrity of tissue barriers, harmonious relationship of indigenous microbiota and proper functioning of the human immune system. Several mechanical factors, physical, chemical, and may contribute to iatrogenic disruption of the balance of the oral microbiota providing an increase in multiplication and tissue invasion by C. albicans. Adherence, dimorphism (formation of mycelium), phenotypic variation (switching), production of extracellular enzymes and toxins are the main virulence factors of C. albicans and the formation of microbial communities called biofilms, which contribute to their significant pathogenicity and resistance to available antifungal agents. The oral candidiasis comes in various clinical aspects, especially the types: acute pseudomembranous, acute erythematous, ulcerative stomatitis, angular cheilitis and chronic hyperplastic. The currently available therapeutic arsenal against oral candidiasis include antifungal agents for topical use, such as amphotericin B and nystatin and synthetic imidazole drug, clotrimazole, and when a systemic treatment is necessary, the azoles ketoconazole, fluconazole and itraconazole are prescribed. Given the limitation of the use of these drugs as the development of resistance, extracts of natural origin have been suggested as treatment options. Given the above objectives, based on current literature, are gathering data on oral candidiasis. Highlight the virulence factors of Candida albicans species. Also, emphasize the in vitro studies with search of natural extracts as an alternative therapy of microbial resistance. Investigations with derivatives have been carried out vegetables from the perspectiveof knowing the biological and therapeutic properties. The work at the laboratory levelare needed to provide subsidies to clinical trials later. This knowledge may lead to the discovery of important molecules with antimicrobial activity. KEY WORDS: Candida albicans. Biofilm. Oral candidiasis. Resistance. Virulence factors. LISTA DE FIGURAS FIGURA 1- Diagrama esquemático da parede celular de Candida albicans. .......................... 16 FIGURA 2 - Representação das manoproteínas da parede celular de C. albicans ................... 16 FIGURA 3 - Tipos morfológicos de Candida albicans: levedura (3a), pseudo-hifas (3b) e hifas (3c). .................................................................................................................................. 18 FIGURA 4 - Formação de tubo germinativo de C. albicans em soro fetal bovino à 37°C ...... 18 FIGURA 5 - Fases da formação do biofilme de Candida ........................................................ 24 FIGURA 6 - Candidíase pseudomembranosa aguda ................................................................ 32 FIGURA 7 - Candidíase eritematosa aguda no dorso da língua (Figura 7a) e no palato (Figura 7b) ............................................................................................................................................. 33 FIGURA 8 - Estomatite ulcerosa por prótese ........................................................................... 33 FIGURA 9 - Quelite angular .................................................................................................... 34 FIGURA 10 - Candidíase crônica hiperplásica ........................................................................ 35 FIGURA 11- Mecanismo de ação da nistatina, com detalhe para a formação de poros na membrana plasmática e fluxo de saída de íons da célula ......................................................... 38 FIGURA 12 - Estrutura química da nistatina ........................................................................... 39 FIGURA 13- Estrutura química da anfotericina B ................................................................... 39 FIGURA 14-Modelo estrutural e funcional das bombas de efluxo, proteínas ABC e bombas MFS .......................................................................................................................................... 44 FIGURA 15- Microscopia eletrônica da parede celular de células planctônicas e células de biofilme de C. albicans............................................................................................................. 47 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS AIDS -Acquired Immunodeficiency Syndrome- Síndrome da Imunodeficiência Adquirida ATCC - American Type Culture Collection CD4- Receptor de superfície de linfócito T auxiliar C3- Componentes protéicos da cascata da via clássica do sistema complemento (C1, C3, C4 e C5) CFM - Concentração fungicida mínima CO2 - Dióxido de carbono DM- Dimetilase HIV - Human Immmunodeficiency Virus/ Vírus da imunodeficiência humana IgA- Imunoglobulina A MIC- Concentração inibitória mínima OMS - Organização Mundial da Saúde pH - potencial hidrogeniônico SEP - Substância extracelular polimérica Ufc - Unidade formadora de colônia UI - Unidades Internacionais UV - Ultravioleta ºC - Grau Celsius µg - Micrograma mL – Mililitro mm³ - Milímetro cúbico µm - Micrômetro SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 12 2. FONTE DOS DADOS ................................................................................................... 14 3. CARACTERÍSTICAS DA LEVEDURA Candida albicans ...................................... 15 4. FATORES DE VIRULÊNCIA DE Candida albicans ................................................ 19 4.1. ADERÊNCIA.................................................................................................................. 20 4.2 FORMAÇÃO DE MICÉLIO .......................................................................................... 20 4.3. VARIABILIDADE FENOTÍPICA ................................................................................. 21 4.4. PRODUÇÃO DE EXOENZIMAS .................................................................................. 22 4.5. PRODUÇÃO DE TOXINAS .......................................................................................... 23 5. O BIOFILME FORMADO POR C. albicans ............................................................. 23 5.1. BIOFILME COMO FATOR DE VIRULÊNCIA ............................................................ 25 6. RESPOSTA IMUNE À Candida albicans ................................................................... 26 6.1. DEFESAS PRIMÁRIAS DA MUCOSA ORAL............................................................. 27 7. FATORES QUE PREDISPOEM À CANDIDÍASE ORAL ...................................... 27 8. CANDIDÍASE ............................................................................................................... 29 8.1. CANDIDÍASE ORAL..................................................................................................... 30 9. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA CANDIDÍASE ORAL.................................... 31 9.1. CANDIDÍASE PSEUDOMEMBRANOSA AGUDA .................................................... 31 9.2. CANDIDÍASE ERITEMATOSA AGUDA .................................................................... 32 9.3. ESTOMATITE ULCEROSA RELACIONADA À PRÓTESE ...................................... 33 9.4. QUELITE ANGULAR ................................................................................................... 34 9.5. CANDIDÍASES CRÔNICAS HIPERPLÁSICAS .......................................................... 34 10. TRATAMENTO DE ESCOLHA PARA CANDIDÍASE ORAL ............................. 35 10.1. CLOREXIDINA ............................................................................................................. 37 10.2. AGENTES TERAPÊUTICOS SISTÊMICOS ................................................................ 39 10.3. AGENTES TERAPÊUTICOS TÓPICOS ....................................................................... 36 11. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA DESENVOLVIDOS POR C.albicans .......... 41 11.1. RESISTÊNCIA AOS POLIENOS .................................................................................. 42 11.2. RESISTÊNCIA AOS AZÓLICOS .................................................................................. 43 12. BIOFILME E RESISTÊNCIA .................................................................................... 45 13. AVALIAÇAO DA SUSCEPTIBILIDADE IN VITRO DE Candida albicans .......... 48 14. DERIVADOS VEGETAIS COMO ALTERNATIVA AO TRATAMENTO DE INFECÇÕES CAUSADAS POR CEPAS RESISTENTES DE Candida albicans ............ 51 15. DERIVADOS VEGETAIS NA INIBIÇÃO DE Candida albicans IN VITRO ......... 51 16. CONCLUSÃO ............................................................................................................... 60 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 61 12 1. INTRODUÇÃO As leveduras do gênero Candida são consideradas micro-organismos oportunistas presentes na microbiota normal da cavidade oral e tratos gastrointestinais e urogenitais de seres humanos, sem ocasionar processos patológicos em indivíduos saudáveis, mas quando ocorre uma ruptura do equilíbrio biológico, geralmente resultante de fatores predisponentes patológicos, fisiológicos, imunológicos e mecânicos - há um aumento na multiplicação e invasão destes micro-organismos nos tecidos, ocasionando infecções denominadas candidíases (SUZUKI, 2009; MATOS et al., 2009). A candidíase oral é a infecção fúngica endógena que mais acomete os humanos e geralmente é uma infecção secundária a algum outro fator local ou sistêmico. O principal patógeno implicado no seu desenvolvimento é a espécie Candida albicans, um fungo polimórfico que pode se apresentar sob a forma leveduriforme de blastósporo (comensal) ou sob a forma micelial de hifa ou pseudo-hifa (patogênica) (DINIZ et al., 2010). Alguns fatores locais e sistêmicos podem predispor a ocorrência da candidíase oral, como imunocomprometimento, xerostomia, alterações hormonais, o uso de aparelhos ortodônticos, próteses totais e pacientes sob terapia antibiótica prolongada. Em pacientes imunocomprometidos, especialmente nos casos de AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) e pacientes oncológicos. Desta forma, o controle dos níveis de leveduras do gênero Candida na cavidade oral pode ser considerado medida importante na prevenção desta patologia (MATOS et al., 2009). Além de características inerentes ao paciente, fatores de virulência dessa levedura têm um papel essencial na gênese desse processo infeccioso. Aderência, dimorfismo (formação de micélio), variabilidade fenotípica (switching), produção de enzimas extracelulares e toxinas constituem os principais fatores de virulência de C. albicans, além da formação de comunidades microbianas denominadas biofilme, que contribuem para sua expressiva patogenicidade e resistência aos antifúngicos disponíveis (CHANDRA et al., 2001). O arsenal terapêutico disponível atualmente contra as micoses orais inclui um número excessivo de agentes antifúngicos que apresentam mecanismos de ação similares. A maioria dos antifúngicos atua sobre os esteróides da membrana celular do fungo ou contra as enzimas que regulam a síntese dos ácidos nucléicos (URIZAR, 2002). Segundo GILMAN et al (2005) e RANG et al (2007) os agentes terapêuticos de escolha para o tratamento da 13 candidíase oral podem ser classificados em dois grupos: o primeiro, os antibióticos antifúngicos para uso tópico, tais como Anfotericina B e Nistatina e o fármaco sintético imidazólico, clotrimazol de uso tópico. O segundo grupo de fármacos inclui os azóis cetoconazol, fluconazol e itraconazol quando um tratamento sistêmico é necessário. Atualmente, observa-se um crescimento na utilização de produtos naturais a nível mundial como também uma forte tendência de busca por terapias menos agressivas destinadas ao atendimento primário à saúde. Partindo desse interesse, o uso de plantas medicinais tem sido extensivamente estudado. Diversos fatores têm colaborado com o desenvolvimento de práticas de saúde que incluam plantas medicinais, principalmente baixo custo e fácil manuseio (RIBEIRO et al., 2005). A Organização Mundial da Saúde (OMS) incentivou o estudo científico das plantas medicinais a partir dos anos setenta, objetivando o conhecimento dos benefícios desses agentes medicinais e avaliando os riscos quanto a sua toxicidade. Dentre as diversas atividades biológicas avaliadas se destaca a ação antimicrobiana (MOLINA et al., 2008). A busca por fitoterápicos efetivos contra micro-organismos tem chamado a atenção. O uso de plantas medicinais tem sido proposto em vários estudos e diversos derivados de plantas foram testados com o objetivo de reduzir a atividade dos micro-organismos na cavidade oral. Os produtos de origem natural não agridem a natureza e para tratamento das infecções orais são utilizados com a vantagem de não apresentarem efeitos colaterais (AGUIAR et al., 2009; MOLINA et al., 2008). Diante da possibilidade de infecção por esse patógeno, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, usuários crônicos de antimicrobianos e portadores de prótese dentária total, alguns antifúngicos sintéticos têm sido propostos no tratamento da doença. Porém, diante das limitações para o uso desses fármacos, como evidência de resistência microbiana, alto custo e ocorrências de efeitos indesejáveis, algumas substâncias de origem natural têm sido apontadas como possibilidades de tratamento, haja vista sua reconhecida atividade antifúngica (CASTRO; LIMA, 2010). Os objetivos do presente trabalho, com base na literatura atual, são reunir dados sobre a patologia candidíase oral. Destacar os fatores de virulência da espécie Candida albicans, pois contribuem para sua expressiva patogenicidade e resistência aos antifúngicos disponíveis. E ainda, enfatizar os estudos in vitro com derivados vegetais como busca de uma alternativa terapêutica à resistência microbiana. 14 2. FONTE DOS DADOS Buscou-se artigos originais que abordassem o tema, utilizando as bases de dados online CAPES, SciELO, BIREME e Pub-Med; livros e o Google Acadêmico como site de busca. O critério de escolha para inclusão dos artigos priorizou os trabalhos de revisão bibliográfica, artigos mais recentes, dissertações de mestrado e teses de doutorado, todos com busca pelas palavras-chave: Candida albicans, candidíase oral, fatores de virulência de Candida albicans, terapia aplicada na candidíase oral, resistência aos tradicionais antifúngicos, derivados vegetais, inibição de Candida albicans por meio de derivados vegetais. 15 3. CARACTERÍSTICAS DA LEVEDURA Candida albicans Do ponto de vista taxonômico, são descritas atualmente 197 espécies de Candida pertencentes ao Reino Fungi, divisão Eumycota, subdivisão Deuteromycotina, classe Blastomycetes e Família Cryptococcaceae. Sendo que apenas 10% destas são reconhecidas como agentes etiológicos de infecções em seres humanos (MALUCHE; SANTOS, 2008; RIBEIRO, 2008; VALLE; RENDE; OKURA, 2010) Essas leveduras caracterizam-se como fungos oportunistas que se encontram presentes como comensais na superfície de mucosas e pele humana, além de certos animais. Cerca de 20 a 50% da população carreia espécies de Candida na cavidade oral sendo a espécie Candida albicans correspondente por 60 a 90% dos isolamentos. Embora C.albicans ainda seja considerada o principal agente etiológico da candidíase oral, outras espécies, como C.glabrata, C. dubliniensis, C. parapsilosis, C. Krusei e C. Tropicalis estão cada vez mais presentes (CATE et al., 2009; HENNING; PERRONE, 2001; MARTINS et al., 2002; RIBEIRO, 2002; SCHERMA et al., 2004; URIZAR, 2002). A espécie Candida albicans, como outros fungos, são micro-organismos eucarióticos desprovidos de pigmentos fotossintetizantes que possuem parede celular bem definida, composta basicamente por quitina, a membrana plasmática tem dupla camada lipídica, contendo vários esteróis, dentro os quais o principal é o ergosterol. A nutrição é feita a partir de fontes de carbono absorvidas do ambiente, já que a sua parede celular é rígida e não permite a realização da fagocitose (AGUIAR, 2007). A parede celular de C. albicans é uma estrutura dinâmica e robusta, que protege as células das mudanças no ambiente extracelular (Figura 1). É o ponto de contato direto com as células do hospedeiro, contém determinantes antigênicos e glicoproteínas envolvidas na adesão aos tecidos do hospedeiro. É constituída por uma camada interna do esqueleto composto por quitina, β1, 3- e β1, 6- glucanos, e uma camada externa dominada por manoproteínas ligadas a manose (FONTINHA, 2010). 16 FIGURA 1- Diagrama esquemático da parede celular de Candida albicans. Fonte: Pardi & Cardoso, 2002. As manoses têm sido identificadas como o principal antígeno da superfície de C. albicans. As manoproteínas da parede celular de C. albicans estão constituídas por resíduos de manose unidos entre si por ligações α -1,6, os quais se unem pela porção da proteína através dos resíduos de N-Acetil Glucosamina (unidos entre sí por ligações ß-1, 4) e um resíduo de Asparagina e resíduos de Manose que se unem à proteína através de resíduos dos aminoácidos Serina e Treolina (PARDI; CARDOSO, 2002) (Figura 2). FIGURA 2 - Representação das manoproteínas da parede celular de C. albicans Fonte: Pardi & Cardoso, 2002. * NAcGlc= N-Acetil D Glucosamina, M= Manose,Ser= Serina, Thr= Treonina, Asn= Asparagina. Candida albicans é uma levedura comensal facilmente isolada da mucosa oral, trato gastrointestinal, vagina e pele de seres humanos desde o nascimento, mas em circunstâncias excepcionais quando ocorre uma ruptura do equilíbrio biológico, geralmente resultante de 17 fatores predisponentes - patológicos, fisiológicos, imunológicos e mecânicos - há um aumento na multiplicação e invasão destes micro-organismos nos tecidos, ocasionando infecções denominadas candidíases (MARTINS et al., 2002; SUZUKI, 2009; VALLE; RENDE; OKURA, 2010). Considerando aspectos microbiológicos, a levedura Candida albicans é caracterizada primariamente pela morfologia colonial úmida, cremosa e odor específico, de aspecto liso ou rugoso e coloração branco-amarelada em meio de cultura Ágar Sabouraud, formação de tubo germinativo, assimilação de carbono, e capacidade fermentativa. Seu crescimento é favorecido em temperaturas variando de 20ºC a 38ºC. O pH ácido favorece sua proliferação sendo que pH para seu crescimento varia de 2,5 até 7,5. Microscopicamente as células leveduriformes são de formato esférico, ovóides ou alongados, medindo 3 a 5µm de diâmetro e são Gram positivas (ANDRADE, 2006; BARBIERI, 2005; RIBEIRO, 2008). A levedura está muito bem adaptada ao corpo humano, por isso pode colonizá-lo sem produzir sinais de doença em condições de normalidade fisiológica. Esta relação de equilíbrio entre Candida albicans e hospedeiro é propiciada pela manutenção da integridade das barreiras teciduais, relação harmônica da microbiota autóctone e funcionamento adequado do sistema imunológico humano, havendo em contrapartida por parte do fungo leveduriforme, permanência equilibrada da capacidade de aderência e da produção de enzimas e toxinas (ÁLVARES et al., 2007; CALDERONE; FONZIWA, 2001; RIBEIRO et al., 2004; VIEIRA et al., 2005). C. albicans é um fungo polimórfico, que se apresenta sob formas leveduriformes (Figura 3a), com formas esféricas ou ovais, no estado saprofítico, estando associado à colonização assintomática; ou como formas filamentosas de pseudo-hifas (Figura 3b) e hifas verdadeiras (Figura 3c), observadas em processos infecciosos, onde crescem melhor em superfícies quentes e úmidas podendo os filamentos longos e ramificados estender-se ao longo de 100µm aproximadamente. O critério para a diferenciação entre hifa verdadeira e pseudo-hifa está na observação da formação do tubo germinativo, que é denominado de hifa verdadeira. A partir da célula leveduriforme, na formação da hifa verdadeira não há a constrição entre a célula-mãe e o filamento, já as pseudo-hifas possuem a constrição entre a célula-mãe e o comprimento do filamento (AGUIAR, 2007; ÁLVARES et al., 2007; BARBEDO; SGARBI, 2010) . 18 FIGURA 3 - Tipos morfológicos de Candida albicans: levedura (3a), pseudo-hifas (3b) e hifas (3c). Fonte: Aguiar, 2007. O tubo germinativo se define como uma extensão filamentosa de uma célula levedurifome. Sua formação ocorre em cultivos de soros animais a 37°C e em caldo Sabouraud dextrose (PARDI; CARDOSO, 2002; RIBEIRO, 2008). Em C. albicans, a orientação do tubo germinativo no estado leveduriforme e de pseudo-hifa é determinada pelo polarissoma um complexo de proteínas envolvidas na orientação do crescimento do tubo germinativo, enquanto na formação do tubo germinativo de hifa verdadeira a orientação é determinada tanto pelo polarissoma como pelo spitzenkorper uma estrutura responsável pelo crescimento e desenvolvimento polarizado (BARBEDO; SGARBI, 2010) (Figura 4). FIGURA 4 - Formação de tubo germinativo de C. albicans em soro fetal bovino à 37°C Fonte: Ribeiro, 2008. A alternância entre formas leveduriformes e formas filamentosas é reversível e determinada pela interação de vários fatores, por exemplo, temperatura (hifas à 37 ºC e leveduras em temperatura inferior), pH (hifas em pH neutro e leveduras em pH ácido), abundância de nutrientes (crescimento de levedura) ou deficiência (crescimento de hifas),e 19 presença do soro sanguíneo (crescimento de hifas) ou ausência do soro sanguíneo (crescimento de levedura). Assim, as condições que imitam a corrente sanguínea incentivam o crescimento de hifas, enquanto que condições encontradas na pele ou na mucosa gástrica tendem a promover o crescimento de leveduras ( WEBSTER; WEBER, 2007). As leveduras e as formas de hifas diferenciam-se em muitas características que influenciam na sua capacidade para causar a patologia. Por exemplo, hifas são revestidas com manoproteínas que se aderem fortemente às proteínas encontradas nas membranas de superfície celular de mamíferos. Estas adesinas tomam a forma de fímbrias e projetam-se para além da parede celular. A adesão desempenha uma papel na patogênese especialmente quando combinada com o modo de crescimento invasor apresentado pelas hifas. Além disso, as hifas secretam aspartil proteinases e fosfolipases capazes de degradar o tecido infectado (WEBSTER; WEBER, 2007). Candida albicans é a espécie de maior relevância em função da sua prevalência tanto em hospedeiros imunocompetentes como aqueles com alguma alteração de base ou comprometimento imunitário. É a espécie de Candida com maior conhecimento patogênico, devido à diversidade de fatores de virulência descobertos (ÁLVARES et al., 2007; BARBEDO; SGARBI, 2010; VALLE; RENDE; OKURA, 2010; SUZUKI, 2009). 4. FATORES DE VIRULÊNCIA DE Candida albicans Os micro-organismos têm desenvolvido mecanismos que permitem o sucesso na colonização ou infecção no hospedeiro. Como resultado muitos patógenos, incluindo espécies de Candida, expressam uma série de estratégias específicas para se estabelecer, colonizar, causar a patologia e superar as defesas de hospedeiros susceptíveis. (NAGLIK; CHALLACOMBE; HUBE, 2003). Os fatores de virulência de C. albicans, aumentam a eficácia no desenvolvimento de infecções em mucosas ou sistêmicas, dependendo do sítio, do estágio e também da natureza da resposta do hospedeiro. De uma forma geral, estes processos infecciosos são favorecidos pela ruptura do equilíbrio parasita-hospedeiro. Ainda sim neste contexto, este fungo possui propriedades celulares que são capazes de conferir a habilidade de produzir inicialmente o processo de colonização e consequentemente à infecção. Aderência, dimorfismo (formação de micélio), variabilidade fenotípica (switching), produção de enzimas extracelulares e toxinas constituem os principais fatores relacionados às células fúngicas. Além da formação de comunidades microbianas denominadas biofilme (RIBEIRO, 2008). 20 4.1. ADERÊNCIA A adesão a mucosa é influenciada por diversos fatores tais como: produção do tubo germinativo, carboidratos, pH , temperatura, fosfolipases, proteases e outras enzimas extracelulares. A colonização e infecção por Candida começam com a aderência às células epiteliais. A presença de receptores específicos sobre a membrana citoplasmática é necessária para a fixação e penetração intracelular do fungo (HENNING; PERRONE, 2001; VIDOTTO et al., 2003). A adesão das células de Candida aos tecidos do hospedeiro é um fenômeno complexo e multifatorial, utilizando diversos tipos de adesinas expressas em superfícies de células modificadas morfologicamente. Mas a característica marcante das células de Candida é a formação de biofilme nas células do hospedeiro, resultando em maior aderência do fungo (KHAN et al., 2010). O mecanismo de aderência envolve por parte do fungo, glicoproteínas, proteínas do tipo lectinas que apresentam a capacidade de identificar vários tipos de açúcares e receptores para a fração C3b do sistema complemento, e por parte do hospedeiro, receptores celulares para as adesinas de Candida como: fibrina, fibronectina e laminina, que favorecem a infecção pela matriz extracelular (RIBEIRO, 2008). 4.2 FORMAÇÃO DE MICÉLIO A parede celular é responsável pela morfologia final da célula. As espécies de Candida podem reproduzir-se por gemulação, dando à célula uma forma oval (característica das leveduras), também chamada de blastósporo ou blastoconídio, ou podem crescer sob a forma filamentosa através da produção de tubos germinativos resultando numa conversão da forma de levedura para um crescimento em forma de micélio, com produção de hifas e pseudo-hifas (CARDOSO, 2004). Essa capacidade de alternar entre a forma unicelular de levedura e a forma filamentosa (pseudo-hifa ou hifa) é conhecida como dimorfismo morfológico. Dentre as espécies, apenas C. albicans e C. dubliniensis apresentam dimorfismo, podendo crescer sob a forma de levedura e também sob a forma filamentosa (CARDOSO, 2004; KHAN et al., 2010; KULETA; KOZIK; KOZIK, 2009). 21 A maior parte das espécies de Candida mostra uma predominância da forma filamentosa em meios com baixas concentrações de glicose e concentrações elevadas de CO2. Pelo contrário, a forma de levedura prevalece quando estas espécies são cultivadas em meios com elevadas concentrações de glicose e baixas concentrações de CO2. Em contraste com as outras espécies de Candida, C. albicans tem uma forte capacidade de produzir, sob condições menos favoráveis para o seu crescimento, clamidósporos, que são estruturas esféricas que apresentam uma parede celular densa, e que se formam em resposta a mudanças de condições ambientais, permitindo que a levedura se adapte a diferentes nichos ecológicos (CARDOSO, 2004). Vários fatores regulam a transição de células leveduriformes para tubos germinativos e, posteriormente, a pseudohifas e micélios. Esses fatores compreendem temperatura, pH, meios que contenham substâncias indutoras (soro, N-acetil-D-glicosamina, L-prolina, etanol) e agentes quelantes que inativam a disulfidril redutase, enzima responsável pela redução das pontes dissulfeto da parede celular. O crescimento miceliano, decorrente da formação de tubos germinativos, é observado como uma repressão da divisão normal da célula leveduriforme, em que as ligações covalentes de dissulfeto da parede celular não sofrem redução enzimática (RIBEIRO et al., 2010). A formação de micélio pelas espécies de Candida tem sido relacionada com o aumento da virulência em decorrência da variabilidade antigênica da superfície e do formato micelial que favorece maior aderência, dificultando a fagocitose extra e intracelular pelo sistema imune (RIBEIRO, 2008). Por exemplo, as células na forma de levedura, quando fagocitadas por macrófagos, produzem hifas e secretam proteinases associadas a hifas que matam os macrófagos; esses fatores também evitam que as hifas sejam mortas por neutrófilos (KHAN et al., 2010). As hifas têm maior capacidade de aderir e penetrar nas células epiteliais humanas do que os blastoconídios (ÁLVARES et al., 2007). Na forma de hifa, Candida albicans é invasiva e patogênica, enquanto que na forma de levedura é comensal e não patogênica (CANNON et al., 1995). É importante ressaltar que a presença de fontes de carbono e nitrogênio é essencial para a transformação de blastósporo a hifas em C. albicans (PARDI; CARDOSO, 2002). 4.3. VARIABILIDADE FENOTÍPICA 22 A variabilidade fenotípica, expressa pelo fenômeno de switching, é caracterizada pela alta frequência, reversibilidade e por demonstrar diferenças nas propriedades de superfície celular de C. albicans e nos aspectos morfológicos das colônias fúngicas. Traz como consequência a alteração na aderência às células epiteliais, na suscetibilidade antifúngica e na atividade fungicida de neutrófilos (RIBEIRO, 2008). As colônias mudam sua aparência e assumem diferentes formas, incluindo forma lisa, áspera, forma de estrela, pontiaguda, enrugada e distorcida (KHAN et al., 2010; KULETA; KOZIK; KOZIK, 2009). O switching é reversível, ocorre espontaneamente em estado de stress e resulta em mudanças no comportamento da superfície da célula, aparência da colônia e metabolismo. São atributos bioquímicos e moleculares para se tornar mais virulenta e eficaz durante a infecção (KHAN et al., 2010). Mudança fenotípica é uma parte muito importante da adaptabilidade do patógeno para a mudança de ambiente durante a invasão do organismo humano. A capacidade de infectar muitos tecidos é fundamental para o sucesso do ataque e disseminação dentro do hospedeiro (KULETA; KOZIK; KOZIK, 2009). 4.4. PRODUÇÃO DE EXOENZIMAS Várias substâncias produzidas por C. albicans têm sido associadas à infecção, ou seja, consideradas fatores de virulência (ÁLVARES et al., 2007). Dentre as diversas enzimas produzidas, destacam-se as proteinases e as fosfolipases, capazes de promover a destruição nas membranas celulares das células hospedeiras. As fosfolipases degradam os fosfolipídios da membrana plasmática das células do hospedeiro, que alteram as características da superfície dessas células, facilitando a aderência e, consequentemente, a infecção. As proteinases hidrolisam a ligações peptídicas das proteínas presentes nas células do hospedeiro (AGUIAR, 2007). A produção de fosfolipase é considerada um fator importante para o processo de infecção. Essa enzima, localizada na superfície da levedura e na extremidade do tubo germinativo, atua pela hidrólise dos fosfolipídeos, dando origem aos lisofosfolipídeos que causam dano à célula epitelial. Este atributo é específico de C. albicans, sendo esta atividade muito alta durante a invasão de tecidos (KULETA; KOZIK; KOZIK, 2009; ZARDO; MEZZARI, 2004). As aspartil proteinases desempenham um papel importante na degradação dos componentes da mucosa (colágeno, queratina), assim como de componentes imunes 23 (citosinas, anticorpos), facilitando a invasão dos tecidos do hospedeiro (OMBRELLA; RACCA; RAMOS, 2008). 4.5. PRODUÇÃO DE TOXINAS As toxinas produzidas por este fungo podem ser divididas em dois grandes grupos, o primeiro inclui as toxinas de alto peso molecular (glicoproteína-canditoxina) e o segundo engloba as toxinas de baixo peso molecular (HENNING; PERRONE, 2001). A produção de substâncias toxigênicas (toxicoglicoproteínas e canditoxinas) ocorre durante processo infeccioso por espécies de Candida. Estas toxinas provocam, em determinadas concentrações, a morte de animais de laboratório, suscitam a produção de anticorpos e por ação de toxóides podem ser neutralizadas, demonstrando a sua importância como elemento integrante do mecanismo de infecção fúngica (RIBEIRO, 2008). 5. O BIOFILME FORMADO POR C. albicans A capacidade da levedura em aderir, infectar e causar a doença é definida como potencial de virulência ou patogenicidade. Um dos principais mecanismos de virulência deste fungo é a sua versatilidade de adaptação, e capacidade de adesão em sítios variados, principalmente, a formação, em sua superfície, de comunidades microbianas denominadas biofilmes (SUZUKI, 2009). O biofilme é uma comunidade microbiana caracterizada por células que estão irreversivelmente aderidas a um substrato ou interface e embebidas em uma matriz extracelular de substâncias poliméricas que as próprias células produzem e exibem um fenótipo alterado com respeito à taxa de crescimento e transcrição de genes (DORLAN; COSTERTON, 2002). Os biofilmes podem se formar em uma grande variedadede superfícies, incluindo tecidos vivos, dispositivos médicos, sistema de tubulação de água potável, ambientes industriais e sistemas aquáticos naturais (DONLAN, 2002). Biofilmes são compostos principalmente por células microbianas e por substância extracelular polimérica (SEP). A SEP ou matriz extracelular pode deter de 50% a 90% do total de carbono orgânico do biofilme e pode ser considerada como a estrutura mais abundante do biofilme, podendo variar de acordo com suas propriedades químicas e físicas, mas é composta principalmente de polissacarídeos e glicoproteínas. No biofilme, os fungos 24 geralmente estão envolvidos pela matriz extracelular e muitas vezes reduzem suas atividades metabólicas ficando aparentemente “adormecidos”(CATE et al., 2009; DONLAN, 2002). O ciclo de desenvolvimento do biofilme pode ser resumido em três fases: a iniciação, a maturação e a manutenção. Ao biofilme atribui-se uma série de vantagens à colônia, como melhor comunicação entre células, em função da solução de continuidade entre elas, facilitando as atividades bioquímicas, melhor proliferação, acesso a nichos e recursos que não poderiam ser utilizados por células isoladas e a defesa coletiva contra fatores antagônicos (BARBIERI, 2005). Seu desenvolvimento ocorre em três fases e dura aproximadamente 24-48 horas (Figura 5). Na fase inicial, as células planctônicas, na forma de levedura aderem à superfície do substrato. Após a aproximação das células, ocorre a interação destas com superfícies hidrofóbicas e eletrostáticas. A produção de adesinas pela levedura e a aderência de plaquetas e fibrinas do hospedeiro ao substrato ajudam ainda mais na adesão primária. Na fase secundária as células aderidas proliferam formando microcolônias e começam a produzir a matriz extracelular. Neste momento existe o aparecimento de mecanismos de comunicação intercelulares que leva a uma expressão diferencial de genes. Esses genes são responsáveis na transição de leveduras para hifas, na arquitetura da parede celular, na coesividade do biofilme dada pela matriz. E por último, quando as células começam a se confluírem, a rede formada começa a ser constituída de uma transição de células diferenciadas em pseudohifas, hifas e leveduras, tudo envolvido pela matriz extracelular polimérica e promovendo um crescimento tridimensional (CARDOSO, 2004; MUKHERJEE et al., 2005; SUZUKI, 2009). FIGURA 5 - Fases da formação do biofilme de Candida Fonte: Cardoso, 2004. 25 O crescimento do biofilme está limitado pela existência de nutrientes no meio ambiente e pela difusão desses mesmos nutrientes através da matriz do biofilme, bem como pela liberação de resíduos (CARDOSO, 2004). 5.1. BIOFILME COMO FATOR DE VIRULÊNCIA Um dos mais importantes fatores de virulência da espécie de Candida albicans é a sua habilidade em formar biofilmes, e, portanto, eles assumem grande importância no contexto clínico porque são associados com a persistência do micro-organismo no processo infeccioso e a capacidade de expressar resistência contra a maioria dos agentes antimicrobianos (HENRIQUES; AZEREDO; OLIVEIRA, 2005). A formação de biofilmes é uma estratégia para a sobrevivência e proliferação no ambiente oral. A complexa estrutura de um biofilme permite a organização das populações de C.albicans de modo a oferecer proteção contra os mecanismos de remoção pela saliva e dificultar a ação de agentes antimicrobianos (HOFLING et al., 2004). As células que constituem os biofilmes apresentam características fenotípicas diferentes das células em suspensão, tais como um aumento de resistência aos antifúngicos e as defesas do hospedeiro (DORLAN; COSTERTON, 2002). As maiores vantagens dos microorganismos se organizarem em comunidades consistem na maior capacidade de captação de nutrientes, favorecendo um crescimento mais ordenado da comunidade e maior proteção contra radiações UV, fagocitose, desidratação e resistência a antifúngicos (SUZUKI, 2009). Os mecanismos responsáveis pela resistência a antifúngicos podem estar relacionados com limitações difusionais à passagem do agente pela matriz extracelular, com alterações fenotípicas das células no biofilme e ainda com o desenvolvimento de mecanismos de resistência por alteração do genótipo das células (CARDOSO, 2004). Outro mecanismo proposto para a resistência do biofilme aos agentes antimicrobianos é que as células associadas ao biofilme crescem significantemente mais devagar do que as células planctônicas e, como consequência, captam os agentes antimicrobianos mais lentamente (DORLAN; COSTERTON, 2002). A adesão a diferentes substratos artificiais e formação de biofilme são atualmente um grave problema na medicina, devido à resistência aos agentes antifúngicos e patogenicidade aumentada entre a subpopulação de células que formadoras do biofilme. Estima-se que nas últimas décadas, infecções microbianas de seres humanos são estritamente correlacionadas com a formação de biofilme em 65% dos casos (KULETA; KOZIK; KOZIK, 2009). 26 Todas as formas morfológicas conhecidas, células de levedura, pseudo-hifas, e hifas formam biofilme e elas têm propriedades diferentes das células planctônicas ou suspensas. A produção de aspartil proteinases é maior durante a formação de biofilme. Além disso, as células de C. albicans expressam diversos genes que influenciam na patogenicidade, os produtos desses genes participam da adesão, da síntese de carboidratos, da resistência aos fármacos (bombas de efluxo, por exemplo) e do quorum sensing mecanismo que corresponde a um processo de comunicação intra e interespécies microbianas, o que permite aos microorganismos expressarem alterações fenotípicas marcantes quando estes se encontram em altas densidades populacionais (KULETA; KOZIK; KOZIK, 2009). O papel das moléculas de quorum sensing secretada por C. albicans foi estudado e detalhes consideráveis foram descobertos. C. albicans usa pelo menos duas moléculas de quorum sensing tirosol e farnesol. Sob condições permissivas para a formação do tubo germinativo, tirosol estimula a formação de hifas de C.albicans, enquanto que farnesol inibe a transição de levedura para o crescimento das hifas (CATE et al., 2009). 6. RESPOSTA IMUNE À Candida albicans A imunidade à C. albicans está presente em indivíduos adultos imunocompetentes, e é o resultado do comensalismo do fungo nas mucosas do hospedeiro. Como comensal, esse fungo, assintomaticamente, coloniza a superfície epitelial, aparentemente, na forma de blastoconídio. Como resultado desta exposição, muitos indivíduos saudáveis desenvolvem imunidade específica à C. albicans, detectável por testes cutâneos e a resposta de linfócitos do sangue periférico contra seus antígenos, assim como pela presença de anticorpos específicos no soro e secreção mucosa (COSTA; FELIPE; GAZIRI, 2008). Assim, a permanência do fungo como comensal deve-se a vários fatores, como: a pele intacta, que se torna bem protegida por células queratinizadas; a superfície mucosa onde o fungo compartilha os nutrientes disponíveis com outros micro-organismos comensais; a presença de mucinas e de IgA secretora e de numerosas bactérias da microbiota que fazem proteção, circundando as células fúngicas, impedindo sua adesão (SENET, 1997). Modificações nestas barreiras naturais, como aquelas causadas por antibioticoterapia, corticoterapia, quimioterapia, cirurgias, podem disparar a invasão do fungo e o processo patogênico (COSTA; FELIPE; GAZIRI, 2008). As imunidades, inata e adaptativa (celular e humoral), estão envolvidas na proteção contra a infecção por C. albicans. A imunidade inata, por meio de macrófagos e neutrófilos, 27 domina a proteção contra candidemia, enquanto a imunidade celular ativada, predominantemente, por citocinas das células T CD4+, protege as mucosas da infecção. (FIDEL JÚNIOR, 2002). A redução da população dos linfócitos CD4+ predispõe os pacientes a várias infecções fúngicas. Dentre os fungos responsáveis por doenças em indivíduos imunodeprimidos e nos aparentemente sadios, encontramos as espécies do gênero Candida (NAGLIK; CHALLACOMBE; HUBE, 2003). C. albicans é, sem dúvida alguma, a espécie mais frequentemente isolada, pois é a espécie com maior patogenicidade, devido à diversidade de fatores de virulência (BARBEDO; SGARBI, 2010). 6.1. DEFESAS PRIMÁRIAS DA MUCOSA ORAL As defesas primárias da mucosa oral incluem: barreira física do epitélio, peptídeo antimicrobiano lingual (defensina com efeito de antibiótico de amplo espectro), IgA secretora salivar, diferentes fatores salivares (lisozimas, histatinas, lactoferrina entre outros), juntamente com o próprio fluxo e arraste feito pela saliva que impedem a colonização. As alterações mais triviais parecem ser suficientes para permitir que C. albicans produza uma infecção oral, que nos caso mais graves podem estender-se a faringe, esôfago e até mesmo levar a uma infecção disseminada. Como comensais da cavidade oral, C. albicans podem aderir a proteínas da saliva e a bactérias da cavidade oral impedindo assim sua remoção desta área (PANIZO; REVIÁKINA, 2001). Entre os fatores relacionados ao hospedeiro, é importante ressaltar os vários mecanismos antimicrobianos inespecíficos presentes na saliva e os anticorpos imunoglobulinas A (IgA), que funcionam como primeira linha de defesa contra diferentes agentes infecciosos sendo essencial para manutenção da saúde oral. A presença da IgA protege contra a multiplicação e aderência de C. albicans. Os macrófagos e polimorfonucleares são lançados na cavidade oral e funcionam como a principal linha de defesa contra a invasão e multiplicação de C.albicans (BARBIERI, 2005). 7. FATORES QUE PREDISPOEM À CANDIDÍASE ORAL A transformação da forma comensal para patógeno depende da combinação de três grupos de fatores: hospedeiro, fungo e fatores que modificam o ambiente da cavidade oral. A mucosa oral possui propriedades antifúngicas que protege contra a invasão por Candida 28 graças à presença de certas proteínas e outros fatores não determinados. Todas aquelas circunstâncias que alteram a integridade da mucosa mediante traumatismos, maceração ou oclusão (como ocorre nos portadores de próteses dentárias) favorecem a adesão do fungo e a invasão da mucosa (URIZAR, 2002). A saliva constitui um elemento antifúngico de primeira ordem que tem a função de barreira mecânica que dificulta a adesão do fungo, e um poder antifúngico devido aos seus componentes protéicos: lisozimas, lactoferrina, lactoperoxidase e glicoproteínas. Os anticorpos anti-Candida presentes na saliva são do tipo IgA e atuam inibindo a aderência das leveduras à mucosa oral. Portanto, condições como síndrome de Sjögren, radioterapia da cabeça e pescoço ou fármacos que reduzem a secreção de saliva podem aumentar o risco de candidíase oral (AKPAN; MORGAN, 2002; URIZAR, 2002). Dentaduras predispõem a infecção por Candida em 65% dos idosos que usam prótese dentária. O uso de dentaduras produz um ambiente favorável ao crescimento de Candida com pouco oxigênio, baixo pH e um ambiente anaeróbio. Devido à grande aderência destas leveduras ao acrílico, ao fluxo reduzido de saliva abaixo da superfície da dentadura, dentaduras mal equipadas e uma insipiente higiene oral. A higiene oral envolve a limpeza dos dentes, cavidade oral, língua e dentaduras diariamente. Dentaduras devem ser limpas e desinfetadas todos os dias e retiradas durante a noite ou por pelo menos seis horas diárias. As dentaduras devem ser embebidas em solução de limpeza de dentaduras como clorexidina, já que esta é mais eficaz na eliminação de Candida do que escovação (AKPAN; MORGAN, 2002). O hipotiroidismo, hipoparatiroidismo e a insuficiência supra-renal, principalmente de origem autoimune, são as enfermidades endócrinas mais frequentemente associadas à candidíase oral (URIZAR, 2002). Os pacientes portadores da diabetes mellitus são mais suscetíveis a candidíase oral. Isso pode ser explicado porque nos diabéticos há uma maior ocorrência de diversas espécies de Candida. No entanto, a relação entre o diabetes e a candidíase oral não está elucidada, apesar de ter sido demonstrado um aumento significativo da adesão de Candida as células epiteliais destes pacientes, quando comparados as pessoas saudáveis (AGUIAR, 2007). As deficiências nutricionais também interferem como fatores na gênese das candidíases orais. A deficiência de ferro determina a aparição de anormalidades no epitélio e altera alguns processos imunológicos celulares, como a respostas de anticorpos e a fagocitose. As avitaminoses, como a deficiência de folato (que determina o aparecimento de mudanças degenerativas na mucosa oral), a hipovitaminose A e a deficiência de vitaminas B1, B2, B12 e 29 C favorecem o aparecimento da candidíase oral. As dietas ricas em hidratos de carbono fornecem grande quantidade de nutrientes para o crescimento de Candida, favorecendo a candidíase (URIZAR, 2002). Fármacos como antimicrobianos alteram a microbiota local oral criando um ambiente suscetível a proliferação de Candida. A microbiota oral é restaurada quando a antibioticoterapia é interrompida. Fármacos imunossupressores como os agentes antineoplásicos têm sido descritos em muitos estudos por predisporem à candidíase oral por alteração da microbiota oral, destruição da superfície da mucosa e modificação de características da saliva (AKPAN; MORGAN, 2002). A presença maior de candidíase oral nas idades extremas da vida se associa a uma série de fatores que incidem com mais intensidade ou maior frequência nestes períodos. A imaturidade do sistema imunológico, a aparição de infecções que se agravam com o uso de antibióticos de amplo espectro, a existência de deficiências imunológicas congênitas e do estreito contato com a mãe e os cuidadores, favorecendo o contágio na infância. Nos pacientes idosos, a xerostomia concomitante com tratamentos antimicrobianos e com corticóides, além da presença de próteses dentárias desajustadas, aumentam a incidência de candidíases. O tabaco aumenta a queratinização epitelial, reduzindo a concentração de IgA na saliva e diminuindo a função dos leucócitos polimorfonucleares (URIZAR, 2002). A candidíase orofaríngea é a infecção fúngica oportunista que mais frequentemente acomete indivíduos HIV (Vírus da imunodeficiência humana) positivos. Na maioria destes indivíduos, cerca de 90%, apresentam pelo menos um episódio durante o curso da AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), quando a contagem de linfócitos T CD4 (+) encontra-se inferior a 200 células/mm³ e, em muitas vezes, é detectada em episódios recorrentes (FAVALESSA; MARTINS; HAHN, 2010) A candidíase oral constitui uma das infecções oportunistas mais frequentes em pacientes oncológicos. A radioterapia e quimioterapia acarretam desequilíbrio da ecologia do ambiente oral, por exemplo, mielossupressão, comprometimento do fluxo salivar e as lesões de mucosite. Possibilitando a penetração e inflamação dos tecidos da mucosa oral pelo fungo (SENA et al., 2009). 8. CANDIDÍASE A candidíase não se manifesta em pacientes saudáveis. Para esta patologia se desenvolver é necessário que os membros da microbiota estejam com baixa capacidade 30 competitiva favorecendo, assim, o crescimento do fungo. A presença deste fungo não determina a manifestação da doença, é necessário ocorrer à invasão nos tecidos, a qual usualmente ocorre na superfície e em apenas algumas circunstâncias (NETO; DANESI; UNFER, 2005). Candidíase é uma micose causada por leveduras do gênero Candida, em que a lesão pode ser branda, aguda ou crônica, superficial ou profunda, e de espectro clínico bem variável. O principal agente das candidíases é a C. albicans, porém a infecção pode ser causada por outras espécies não-albicans. A maioria dos estudos mostra que esta espécie constitui 60% dos isolados de amostras clínicas. Uma vez que esta levedura faz parte da microbiota humana, ela é considerada uma micose oportunista (AGUIAR, 2007; BARBEDO; SGARBI, 2010). Os processos patológicos produzidos são diversos e compreendem: a inflamação, formação de pus e reposta granulomatosa. Os locais mais acometidos são a mucosa orofaríngea e vaginal, pele e anexos, brônquios e pulmões e trato gastrointestinal. Além disso, a doença pode se tornar sistêmica nas septicemias, endocardites, meningites, candidemias ou ainda candidíases disseminadas (AGUIAR, 2007). 8.1. CANDIDÍASE ORAL A cavidade oral é colonizada por leveduras do gênero Candida, principalmente C. albicans desde o nascimento, que colonizam a mucosa oral como leveduras saprófitas. A prevalência de Candida como comensal na cavidade oral de indivíduos saudáveis varia entre 20 a 75%. Contudo, podem tornar-se patógenos assumindo a forma invasiva filamentosa, quando condições locais desfavoráveis associam-se a fatores predisponentes como: tabagismos, imunossupressão, xerostomia, uso de próteses, aparelhos ortodônticos, alterações endócrinas, discrasias sanguíneas (BARBEDO; SGARBI, 2010). Candidíase oral é a infecção fúngica mais comum, especialmente no começo e fim da vida. A incidência de C. albicans isoladas da cavidade oral é relatada em 45% em recémnascidos, 45-65% em crianças saudáveis, 30-45% em adultos saudáveis, 50-65% em pessoas que usam dentaduras, 90% dos pacientes com leucemia aguda submetidos à quimioterapia e 95% dos pacientes com HIV (AKPAN; MORGAN, 2002). A candidíase oral não é uma doença letal, mas causa desconfortos de diferentes graus, altera o paladar, tornando a ingestão desagradável e dolorosa, levando a uma diminuição do apetite e emagrecimento do paciente, que pode ser fatal em pacientes 31 que precisam de uma dieta de elevado teor calórico, como no caso de HIV positivos, pacientes internados e idosos. Pode ser a porta de entrada para outras formas de candidíase mais graves, tais como esofágica, orofaringeanas, laringeanas ou sistêmica (URIZAR, 2002). A possibilidade de esta levedura colonizar as superfícies orais depende tanto da efetividade dos mecanismos defensivos do hospedeiro, como da capacidade de adesão às células epiteliais da boca e de bactérias da cavidade oral que impedem sua remoção desta área. O balanço entre a colonização e a candidíase depende da capacidade da Candida em modular a expressão dos fatores de virulência em resposta as mudanças ambientais, combinada com a eficiência do sistema imunológico do hospedeiro e das terapias antifúngicas (PANIZO; REVIÁKINA, 2001; URIZAR, 2002). 9. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA CANDIDÍASE ORAL A candidíase oral manifesta-se sob as seguintes formas: agudas, crônicas ou mucocutâneas. As formas agudas são diferenciadas em candidíase pseudomembranosa aguda e candidíase eritematosa (ou atrófica) aguda. As formas crônicas da doença são conhecidas como atróficas (estomatite ulcerosa relacionada à prótese e quelite angular) e hiperplásicas (AGUIAR, 2007; NETO; DANESI; UNFER, 2005). 9.1. CANDIDÍASE PSEUDOMEMBRANOSA AGUDA A candidíase pseudomembranosa é a forma clínica mais conhecida podendo acometer pessoas em qualquer idade (NETO; DANESI; UNFER, 2005). Clinicamente caracteriza pela presencia de grumos ou placas branco amareladas, de consistência gelatinosa (Figura 6). Ao serem raspadas se desprendem facilmente deixando uma zona eritematosa, ulcerada, às vezes dolorosa, com uma mucosa adjacente de aparência normal. As lesões podem se localizar em qualquer zona da mucosa oral, mas predominam na mucosa jugal, orofaríngea e margens laterais da língua. A sintomatologia é mínima, porém nos casos mais graves, os pacientes podem se queixar de dor, ardor ou disfagia. Nos pacientes HIV positivos, podem aparecer formas crônicas difíceis de erradicar (URIZAR, 2002). 32 FIGURA 6 - Candidíase pseudomembranosa aguda Fonte: Akpan & Morgan, 2002. Conhecida popularmente como “sapinho”. A candidíase pseudomembranosa também pode ser desenvolvida pela exposição do paciente aos antimicrobianos de amplo espectro ou por comprometimento do seu sistema imunológico (AGUIAR, 2007). 9.2. CANDIDÍASE ERITEMATOSA AGUDA A referida patologia pode ser o resultado da persistência da forma pseudomembranosa, mas a candidíase eritematosa aguda se apresenta clinicamente como uma área avermelhada de bordas mal definidas na mucosa oral sem a presença de placas esbranquiçadas. É frequentemente identificada no dorso da língua (Figura 7a) e no palato (Figura 7b) onde se notam áreas de despapilação e desqueratinização. Os pacientes acometidos por esse tipo de candidíase se queixam de sensação de queimação (AGUIAR, 2007; NETO; DANESI; UNFER, 2005; URIZAR, 2002). a 33 b FIGURA 7 - Candidíase eritematosa aguda no dorso da língua (Figura 7a) e no palato (Figura 7b) Fonte: Urizar, 2002. Atualmente representa a forma clínica mais comum tanto em pacientes imunocompetentes quanto nos imunodeprimidos. Está associada ao uso de corticosteróides e antimicrobianos de amplo espectro e em pacientes portadores de AIDS. Os achados histopatológicos são similares aos encontrados na pseudomembranosa, com uma infiltração de polimorfonucleares no tecido conectivo, certa atrofia epitelial e uma vascularização hiperêmica e pode evoluir para um quadro crônico, conhecida como candidíase atrófica crônica, sob as formas candidíase do tipo estomatite ulcerosa relacionada à prótese e candidíase do tipo quelite angular (AGUIAR, 2007; URIZAR, 2002). 9.3. ESTOMATITE ULCEROSA RELACIONADA À PRÓTESE A estomatite protética é um processo inflamatório associado com o uso de próteses removíveis (Figura 8). É caracterizada por vermelhidão aveludada e pedregosa, com pouca queratinização, persistente na área coberta pela prótese removível, preferencialmente o palato (URIZAR, 2002). O palato encontra-se hiperêmico e doloroso (NETO; DANESI; UNFER, 2005). FIGURA 8 - Estomatite ulcerosa por prótese Fonte: Aguiar, 2007. 34 Outros fatores, como o acúmulo de bactérias, redução de saliva e irritação mecânica, podem estar relacionados à estomatite por prótese. Também está relacionada aos pacientes HIV positivos (AGUIAR, 2007). 9.4. QUELITE ANGULAR Quelite angular é caracterizada por uma vermelhidão dos ângulos da boca, com o aparecimento de trincas ou fissuras e formação de crosta (Figura 9). Observa-se dor, desconforto ou sangramento durante a abertura da boca. Fatores predisponentes incluem anomalias relacionadas ao envelhecimento e rugas, diminuição da dimensão vertical, defeitos de prótese, xerostomia, certos medicamentos, pobreza de nutrientes. Em muitos casos é uma infecção mista, na qual as bactérias como Staphylococcus aureus e alguns estreptococos estão associadas à Candida albicans (NETO; DANESI; UNFER, 2005; URIZAR, 2002). FIGURA 9 - Quelite angular Fonte: Akpan & Morgan, 2002. A anemia ferropriva e/ou deficiência de vitamina B12 são fatores predisponentes para o aparecimento desse tipo de candidíase e está associada a pacientes HIV positivos (AGUIAR, 2007). 9.5. CANDIDÍASES CRÔNICAS HIPERPLÁSICAS Alguns pacientes apresentam manifestações clínicas na forma de placas brancas não removíveis, ilustrado na Figura 10. Quando isso ocorre, são denominadas de candidíases crônicas hiperplásicas. Clinicamente se apresentam na forma de lesões crônicas, com discreta elevação, que variam para lesões pequenas, palpáveis, translúcidas, de coloração 35 esbranquiçada (AGUIAR, 2007). A localização habitual desta patologia é o dorso da língua, à frente das papilas circunvaladas. (NETO; DANESI; UNFER, 2005). FIGURA 10 - Candidíase crônica hiperplásica Fonte: Akpan &Morgan, 2002). A candidíase cutâneo-mucosa é um tipo de candidíase crônica hiperplásica, considerada como um componente de um grupo raro de desordens imunológicas. Esta forma de candidíase frequentemente resiste ao tratamento, ocorrendo à remissão temporária após a terapia padrão com antifúngico. Ocorre extenso envolvimento da pele e ocorrência de massas granulomatosa e córneas na face e couro cabeludo (NETO; DANESI; UNFER, 2005). Outro tipo de candidíase hiperplásica é a candidíase associada às disfunções endócrinas. Os distúrbios endócrinos envolvidos podem ser o diabetes mellitus, o hipotiroidismo, o hipoparatiroidismo e a doença de Addison (AGUIAR, 2007). 10. TRATAMENTO DE ESCOLHA PARA CANDIDÍASE ORAL O tratamento da candidíase oral é simples nos pacientes imunocompetentes ou com imunodepressão leve, em que geralmente os antifúngicos tópicos apresentam resultados satisfatórios. No entanto, nos casos de imunodepressão o problema maior está na elevada taxa de recidivas, requerendo a combinação de uma terapia intensiva tanto sistêmica como local. Apesar dos excelentes resultados com antifúngicos azólicos orais, encontramos formas clínicas de candidíases orais crônicas resistentes ao tratamento. A retirada dos fatores predisponentes, combinada com derivados azólicos ou poliênicos, é o principal tratamento (BARBEDO; SGARBI, 2010). A terapia para candidíase oral deve ser específica para cada 36 paciente, de acordo com o seu estado de saúde, manifestação clínica e gravidade da infecção, dor oral e capacidade de usar um agente tópico (AGUIAR, 2007). O arsenal terapêutico disponível atualmente contra as micoses orais inclui um número excessivo de agentes antifúngicos que apresentam mecanismos de ação similares. A maioria dos antifúngicos atua sobre os esteróides da membrana celular do fungo ou contra as enzimas que regulam a síntese dos ácidos nucléicos. Como as células de eucarióticas de Candida são similares aos dos mamíferos, estes fármacos interferem também nas rotas metabólicas das células humanas, por isso apresentam maior toxicidade (URIZAR, 2002). Uma das formas de tratamento da candidíase oral é a higienização. A higienização envolve a limpeza dos dentes, da cavidade oral, da língua e das próteses, quando presentes, diariamente. Para aplicação de agentes tópicos, as próteses, devem ser retiradas, para proporcionar um contato direto do fármaco com a mucosa oral. As próteses podem ser desinfetadas utilizando solução antisséptica de clorexidina (AGUIAR, 2007). Nas candidíases oral o tratamento farmacológico deve ser inicialmente tópico e em casos graves ou de resistência, a terapia tópica deve ser combinada a sistêmica. A terapia tópica é utilizada em lesões bem delimitadas, sendo empregada para evitar os efeitos adversos causados pelo tratamento sistêmico e a ocorrência de interações medicamentosas. O método terapêutico realizado através de antifúngicos tópicos oferece segurança, pois esses compostos não são absorvíveis. Porém, a terapia tópica apresenta certas desvantagens para o paciente, como gosto desagradável e necessidade de múltiplas aplicações diárias (AGUIAR, 2007; SENA et al., 2009; URIZAR, 2002). Segundo GILMAN et al (2005) e RANG et al (2007) os agentes terapêuticos de escolha para o tratamento da candidíase oral podem ser classificados em dois grupos: o primeiro, os antibióticos antifúngicos para uso tópico, tais como Anfotericina B e Nistatina e o fármaco sintético imidazólico, clotrimazol de uso tópico. O segundo grupo de fármacos inclui os azóis cetoconazol, fluconazol e itraconazol quando um tratamento sistêmico é necessário. 10.1. CLOREXIDINA Como antisséptico de amplo espectro, a clorexidina é ativa contra bactérias Grampositivas e Gram-negativas, assim como, para fungos e alguns vírus. No que diz respeito à inibição de C. albicans a clorexidina é bem mais efetiva do que outros produtos (DINIZ et al., 2010; SEKINO et al., 2004). 37 Quimicamente classifica-se como digluconato de clorexidina. Um detergente catiônico com ação fungicida, mesmo em concentrações muito baixas e o seu uso na prevenção, tratamento e alternativa complementar no combate a candidíase oral deve ser ressaltado, pois suprime significativamente a adesão de C. albicans em substratos orgânicos e inorgânicos. Solução de bochecho de gluconato de clorexidina tem sido utilizada com sucesso no tratamento de candidíase pseudomembranosa e associada à estomatite protéica (AGUIAR, 2007; DINIZ et al., 2010; ELLEPOLA; SAMARANAYAKE, 2000). A afinidade da clorexidina as paredes celulares dos micro-organismos, aos mucopolissacáridos salivares e à hidroxiapatita é alta podendo ser observada elevada concentração do componente na saliva por várias horas após uma única dose. O mecanismo de ação em baixas concentrações é basicamente causar danos na membrana celular e dispersão de moléculas de baixa massa molecular dos micro-organismos, já em concentrações elevadas causa precipitação e coagulação de proteínas do citoplasma (RODRIGUES, 2009; SEMPREBOM, 2007). 10.2. AGENTES TERAPÊUTICOS TÓPICOS A anfotericina B e Nistatina pertencem ao grupo dos polienos, quem têm como alvo o ergosterol presente nas membranas plasmáticas das leveduras. Este tipo de antifúngico possui uma estrutura anfipática, com um lado hidrofílico e um lado hidrofóbico. Atua ao nível da membrana, intercalando-se entre as moléculas do ergosterol, formam canais que permitem a passagem dos componentes citoplasmáticos, em especial íons de potássio, provocando um desequilíbrio no gradiente de prótons existente entre o interior da célula e o meio exterior, acabando por conduzir à morte da célula (CARDOSO, 2004) (Figura 11). 38 FIGURA 11- Mecanismo de ação da nistatina, com detalhe para a formação de poros na membrana plasmática e fluxo de saída de íons da célula Fonte: Aguiar, 2007. A anfotericina B tópica apresenta-se nas formas de loção, creme e pomada. Todas essas preparações contêm 3% de anfotericina B e são aplicadas nas lesões de três a quatro vezes ao dia. A propriedade mais importante é provavelmente sua capacidade de formar poros na membrana fúngica causando distúrbios graves no equilíbrio iônico. Quando usada topicamente garante o sucesso terapêutico (GILMAN et al., 2005; RANG et al., 2007). A anfotericina B é muito pouco absorvida quando administrada oralmente, sendo esta via utilizada apenas para o tratamento de infecções fúngicas do trato gastrointestinal superior. (FONTINHA, 2010). A nistatina (Figura 12) possui estrutura similar à da anfotericina B (Figura 13) e com o mesmo mecanismo de ação. Em suspensão é aplicada topicamente sobre as lesões. O paciente deve bochechar e deglutir o medicamento de três a quatro vezes ao dia. A suspensão de nistatina costuma ser eficaz na candidíase oral de pacientes imunocompetentes. Os efeitos adversos podem incluir náuseas, vômito e diarreia. Os comprimidos de nistatina com 500.000 UI dissolvidos na boca, por pelo menos quatro vezes ao dia, produzem excelentes resultados. Ainda existem disponíveis as preparações tópicas pomadas, cremes e pós. Os pós são os preferidos para lesões úmidas e são aplicados duas a três vezes por dia (GILMAN et al., 2005; NETO; DANESI; UNFER, 2005; RANG et al., 2007). 39 FIGURA 12 - Estrutura química da nistatina Fonte: Aguiar, 2007. FIGURA 13- Estrutura química da anfotericina B Fonte: Cannon et al., 2009. O uso de pastilhas orais de 10 mg de clotrimazol é apropriadamente considerado uma terapia tópica. A atividade antifúngica deve-se inteiramente a concentração local do fármaco, não ocorrendo efeitos sistêmicos. O paciente deve ser orientado a chupar a pastilha até que se dissolva. O medicamento é administrado durante 14 dias, cinco vezes ao dia. O clotrimazol interfere com o transporte de aminoácidos para dentro do fungo por ação na membrana celular. Em pacientes imunocompetentes o índice de cura pode atingir 100% (GILMAN et al., 2005; NETO; DANESI; UNFER, 2005; RANG et al., 2007). 10.3. AGENTES TERAPÊUTICOS SISTÊMICOS A terapia sistêmica com os azóis cetoconazol, fluconazol e itraconazol oferece maior tempo de ação do que a terapia tópica, já que os fármacos não são eliminados rapidamente 40 pela saliva, como os agentes tópicos, mantendo-se em atividade por período mais prolongado (AGUIAR, 2007; SENA et al., 2009). Os derivados azólicos são compostos fungistáticos sintéticos que podem ser classificados em imidazóis ou triazóis, de acordo com o número de átomos de nitrogênio no anel azólico. Os imidazóis são representados pelo cetoconazol, miconazol e clotrimazol. Os derivados triazólicos são representados pelo itraconazol, fluconazol e voriconazol. Estes compostos azólicos atuam mediante a inibição da enzima lanosterol 14-α demetilase no complexo citocromo P-450 dos fungos. O resultado é a inibição da conversão de lanosterol em ergosterol, com a depleção conseguinte de ergosterol, acumulação de precursores e perda da integridade da membrana fúngica. Os azóis também inibem a conversão das células de levedura de Candida em hifas, a forma invasiva e patogênica do fungo (RANG et al., 2007; SANTOS et al., 2005; SILVA, 2006). Os triazóis se distinguem dos imidazóis pela sua menor influência em inibir as enzimas do citocromo P-450 dos mamíferos, isto é, eles são mais seletivos para o P-450 fúngico do que os imidazóis, resultando em menor toxicidade e efeitos colaterais (ELLEPOLA; SAMARANAYAKE, 2000). O fluconazol é um antifúngico triazol bem tolerado e um agente seguro que tem boa atividade clínica contra a maioria das cepas de C. albicans, mas é menos ativo contra as espécies não-albicans, como C. Glabrata e C. Krusei, pois o uso excessivo desse fármaco deu origem ao desenvolvimento de resistência dessas espécies. O uso terapêutico na candidíase oral é uma dose de 200 mg no primeiro dia e, em seguida, 100 mg/dia durante pelo menos duas semanas. Interações medicamentosas com o fluconazol são mais raras, porque de todos os derivados azólicos, ele é o que menos age sobre as enzimas microssômicas hepáticas. As limitações mais importantes do fluconazol estão referidas a sua falta de atividade contra fungos filamentosos, e a resistência natural de algumas leveduras contra este composto (ELLEPOLA; SAMARANAYAKE, 2000; GILMAN et al., 2005; SANTOS et al., 2005; SILVA, 2006 ). O cetoconazol se distingue dos triazóis pela sua maior influência em inibir as enzimas do citocromo P- 450 dos mamíferos, isto é, ele é menos seletivo para o P-450 fúngico do que os mais novos derivados azólicos. Assim os efeitos colaterais são mais pronunciados como o risco de toxicidade hepática. A recidiva é comum depois do tratamento aparentemente bem-sucedido. O cetoconazol não é usado no tratamento primário da candidíase oral,sua principal indicação é para a candidíase oral secundária, como na candidíase mucocutânea crônica. A sua eficácia é precária em paciente imunodeprimidos podendo ser substituído por 41 um fármaco mais moderno, o itraconazol (ELLEPOLA; SAMARANAYAKE, 2000; GILMAN et al., 2005; RANG et al., 2007; SILVA, 2006). O itraconazol é um fármaco altamente lipofílico que é bem absorvido após a administração oral, porém sofre extensa metabolização hepática, e tem um amplo espectro de ativida de antifúngica. É eficaz em várias micoses superficiais, incluindo candidíase oral, devido à C.albicans como também C.krusei e C. Glabrata. Geralmente, itraconazol é bem tolerado, embora perturbações gastrointestinais, cefaléia e tontura têm sido relatados (ELLEPOLA, SAMARANAYAKE, 2000; RANG et al., 2007). 11. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA DESENVOLVIDOS POR C.albicans Os fungos habitam uma variedade de ambientes, incluindo o corpo humano. Este ambiente pode mudar enquanto o fungo coloniza e se espalha dentro de um tecido. Essas mudanças ambientais causam estresse fisiológico nas células fúngicas e os fungos desenvolvem respostas para atenuar os efeitos nocivos do estresse. Assim como mudanças de temperatura, pH e osmolaridade, a administração de fármacos antifúngicos também representa um fator de estresse ao qual o fungo responde desenvolvendo alguns mecanismos para sua sobrevivência (CANNON et al., 2009). Classicamente, o termo resistência em micro-organismo é descrito como a persistência ou progressão de uma infecção no hospedeiro, mesmo que a concentração do fármaco no sítio da infecção seja máxima (RIBEIRO et al., 2004). Existem diferentes tipos de mecanismos bioquímicos que contribuem para o fenótipo de resistência a fármacos em eucariotos (CLAUDINO, 2007). A resistência é considerada primária quando um organismo é resistente ao fármaco antes da exposição, enquanto que a resistência secundária é desenvolvida em resposta à exposição ao fármaco (JABRA-RISK; FALKLER; MEILLER, 2004). O uso crescente de fármacos antifúngicos tem contribuído no surgimento de leveduras com resistência secundária, sendo necessária a aplicação de métodos para avaliar a susceptibilidade a esses fármacos (SENA et al., 2009). As constantes falhas nos tratamentos de infecções micóticas têm chamado a atenção para o grave problema da resistência aos agentes antifúngicos, bem como para os mecanismos envolvidos neste fenômeno. Com o advento da AIDS e com a expansão da terapia antineoplásica, a imunossupressão passou a ser um problema destes pacientes, uma vez que 42 infecções por Candida, principalmente as formas oral e esofágica, passaram a ser mais frequentes e de difícil tratamento (LINARES, 2009). Existem basicamente dois tipos de mecanismos moleculares pelos quais um fungo pode adquirir resistência a um antifúngico. O primeiro consiste em modificações na enzima alvo, tanto em sua regulação (aumento ou diminuição dos níveis), como na sua capacidade de interação com o antifúngico. O segundo mecanismo consiste na incapacidade do antifúngico alcançar concentrações eficazes no sítio de ação, que pode ser devido à existência de barreiras de permeabilidade ou presença de sistemas de bombeio ativo do antifúngico para o exterior celular (HERNÁEZ; PLA; NOMBELA, 1997). 11.1. RESISTÊNCIA AOS POLIENOS O ergosterol está envolvido em várias funções celulares como a fluidez e integridade da membrana, no funcionamento de várias enzimas que se ligam à membrana da célula do fungo, como a quitina sintetase, enzima importante para o crescimento e divisão celular (RIBEIRO et al., 2004). Os polienos ligam-se ao ergosterol presente na membrana plasmática da célula do fungo e como consequência, poros são formados na membrana, permitindo a passagem de componentes citoplasmáticos que levam à morte celular (INGROFF, 2008). A resistência de células fúngicas à polienos está relacionada com a alteração do conteúdo de ergosterol celular, com significativa redução da afinidade pelo antifúngico. O mecanismo de resistência à anfotericina B parece ser uma alteração ou diminuição na quantidade de esterol na membrana celular (PEREA; PATTERSON, 2002). Estas deficiências podem ser o resultado de mutações nos genes que codificam algumas das enzimas envolvidas na síntese do ergosterol. Defeitos no gene ERG3 tem sido relatados como promotores da acumulação de outros esteróis, em vez de ergosterol (INGROFF, 2008). Mutações no gene ERG3 (que codifica a C-5 esterol desaturase, enzima da via de biossíntese do ergosterol), diminuem a concentração do esterol na membrana e causa resistência a anfotericina B (CANNON et al., 2009). A enzima P- 450 citocromo dimetilase, importante enzima envolvida na biossintese do ergosterol, tem sido estudada, pois, demonstrou-se que mutantes resistentes á anfotericina B, são deficientes nesta enzima, consequentemente, apresentam menores níveis de ergosterol. Outros mecanismos de resistência envolvem: aumento da atividade da catalase intracelular do fungo, o que impede a formação de radicais livres responsáveis pelos poros, e alterações nas enzimas δ-5-6-dessaturase e δ-8-7-isomerase que determinam o acúmulo de 14-metil- 43 fecosterol na membrana plasmática do fungo, composto que não se constitui em alvo para polienos, resultando em cepas resistentes (LINARES, 2009). 11.2. RESISTÊNCIA AOS AZÓLICOS Os agentes azólicos interferem na biossíntese do ergosterol, o esterol presente em maior quantidade na membrana plasmática dos fungos. A ação desses fármacos ocorre através da inibição da enzima 14-α dimetilase (14 DM), uma enzima do citocromo P-450 importante na rota de biossíntese do ergosterol, que catalisa a remoção oxidativa do grupo 14α- metil do lanosterol (ZARDO; MEZZARI, 2004). A resistência de C. albicans aos componentes azólicos pode ser resultado de uma alteração da enzima alvo, o citocromo P-450 lanosterol 14-demetilase, quer pela superexpressão ou por mutações de ponto em seu gene de codificação (ERG11) (PEREA; PATTERSON, 2002). O ERG11 é o gene que codifica a proteína citocromo P-450 14-α dimetilase em diversas espécies de interesse médico, incluindo C. albicans. As mutações no gene ERG11 resultam em mudanças de aminoácidos na proteína, que levam a alterações conformacionais, resultando no decréscimo da afinidade desta aos antifúngicos azólicos. Em relação a P-450 14 α-dimetilase a resistência pode ocorrer também pelo aumento da concentração desta enzima no interior celular. Isto pode ocorrer pelo aumento da taxa de transcrição do gene ERG11 ou pela amplificacao cromossômica do mesmo (CLAUDINO, 2007). Um segundo mecanismo importante é a diminuição da concentração dos agentes antifúngicos azólicos nas células do fungo como consequência de bombas de efluxo (PEREA; PATTERSON, 2002). Existem duas classes principais de bombas de efluxo, proteínas ABC e bombas de MFS. Estas proteínas da membrana translocam as moléculas dos fármacos e outros compostos de forma ativa através das membranas celulares utilizando energia de diferentes fontes. As proteínas ABC são transportadores primários que usam a hidrólise de ATP como fonte de energética. As bombas MFS são transportadores secundários que utilizam a energia da força motriz de prótons através da membrana plasmática, como vizualisado na Figura 14 (CANNON et al., 2009). 44 . FIGURA 14-Modelo estrutural e funcional das bombas de efluxo, proteínas ABC e bombas MFS Fonte: Cannon et al., 2009. Tais proteínas bombeiam o fármaco para fora da célula, reduzindo assim a concentração intracelular dos azóis. As proteínas transportadoras ABC são codificadas pelos genes CDR1 e CDR2, enquanto que as bombas MFS são expressas pelo gene MDR1 (WHITE et al., 2002). A alta regulação dos genes CDRs confere resistência a muitos azólicos, enquanto que a alta regulação do gene MDR1 isoladamente leva a resistência exclusivamente do fluconazol. Alta regulação do gene CDR1 tem sido associada com o desenvolvimento da resistência de C. albicans ao fluconazol (PEREA; PATTERSON, 2002). Embora as bombas de efluxo estejam localizadas na membrana plasmática e sejam bastante numerosas, apenas algumas dessas proteínas são transportadoras de fármacos ou têm a capacidadede expulsá-los (INGROFF, 2008). Outro mecanismo de resistência apresentado pela espécie de C. albicans é a alteração na composição dos esteróis da membrana Alterações na composição de esteróis e fosfolipídios presentes na membrana da célula fúngica podem resultar na diminuição da quantidade de fármaco que atravessa pela membrana do fungo, pois afetam a fluidez e simetria da membrana. Pode ocorrer ainda o acúmulo de esterol intermediário, através de alterações em outros componentes do ciclo de biossíntese do ergosterol, contribuindo para o mecanismo de resistência. Uma consequência deste tipo de mecanismo de resistência a azóis é 45 que a ausência de ergosterol causa resistência cruzada a outros antifungicos disponíveis, como a anfotericina B (CLAUDINO, 2007). 12. BIOFILME E RESISTÊNCIA O biofilme é uma comunidade microbiana onde as células dos organismos estão irreversivelmente aderidas a uma superfície e embebidas em uma matriz extracelular de substâncias poliméricas, que as próprias células produzem. A espécie C. albicans é considerada atualmente o patógeno humano com maior capacidade de crescer em biofilme. Células em biofilme possuem fenótipo alterado e uma resistência extraordinária a muitos antifúngicos, tornando sua erradicação um processo difícil (NETT et al., 2007). O biofilme de C. albicans é composto por leveduras, hifas e pseudo-hifas. É um estágio de desenvolvimento distindo, que difere fenotipicamente das células planctônicas. O metabolismo é diferente no biofilme e genes específicos são expressos durante sua formação. (UWAMAHORO; TRAVEN, 2010). Biofilmes formados por Candida albicans tem se mostrado resistente aos antifúngicos, incluindo anfotericina B, triazóis e flucitosina (NETT et al., 2007). Esses agentes apresentam menos atividades contra células de C.albicans em biofilme do que contra células planctônicas (DOUGLAS et al., 2002). A resistência ao biofilme de C. albicans não é inteiramente entendida e possivelmente envolve mecanismo multifatorial (NETT et al., 2007). Possíveis mecanismos incluem: penetração limitada de fármacos através da matriz do biofilme, alterações fenotípicas resultantes de uma diminuição da taxa de crescimento ou da limitação de nutrientes, indução da expressão de genes de resistência na superfície, presença de células resistentes e ativação de bombas de efluxo na membrana da célula. (DOUGLAS et al., 2002). O desenvolvimento do biofilme de C. albicans é associado com um aumento da presença de substância extracelular polimérica. Não está claro se o aumento da resistência aos fármacos em biofilmes de C. albicans é devido à produção de material extracelular ou devido a alterações bioquímicas e genéticas nas células fúngicas (CHANDRA et al., 2001). Acreditase que a matriz do biofilme pode impedir ou limitar o acesso do fármaco à célula. Porém, estudos realizados mostraram que a extensão da matriz formada no biofilme de C. albicans não afeta a susceptibilidade do biofilme aos fármacos (DOUGLAS et al., 2002). 46 A taxa de crescimento celular tem sido considerada uma importante moduladora da atividade do antifúngico em biofilmes. As células em biofilmes crescem lentamente devido a quantidade limitada de nutrientes, resultando no decréscimo do metabolismo do microorganismo. Uma lenta taxa de crescimento é frequentemente associada com a adoção de um fenótipo alterado pelo micro-organismo, o qual pode afetar a susceptibilidade do mesmo aos agentes antimicrobianos. Além disso, os fármacos antimicrobianos são mais eficazes nas células em crescimento (JABRA-RISK; FALKLER; MEILLER, 2004). Isso sugere que a resistência se desenvolve com o tempo, coincidindo com a fase de maturação do biofilme (CHANDRA et al., 2001). Estudos recentes sugerem que o aumento da resistência antifúngica durante a formação do biofilme também está associada com o aumento da atividade metabólica durante o desenvolvimento do biofilme e não só como reflexo da baixa taxa de crescimento. Além disso, a maioria das células de biofilme são metabolicamente ativas, com elevada taxa de transcrição de genes associada com a síntese de ribossomos. (VEDIYAPPAN; ROSSIGNOL; ENFERT, 2010). Como a resistência antifúngica do biofilme de C.albicans não pode ser atribuída somente à exclusão da matriz ou baixa taxa de crescimento, a expressão de genes induzidos por contato é provavelmente um mecanismo pelo qual a resistência aos fármacos é adquirida. Além disso, ocorre a síntese de novas proteínas depois do ataque de C. albicans à superfície, sugerindo que a resistência também pode surgir como consequência da expressão de genes de resistência na superfície (JABRA-RISK; FALKLER; MEILLER, 2004). A formação do material extracelular associado com o biofilme de C.albicans sugere que genes que codificam enzimas envolvidas na síntese de carboidratos são regulados de forma diferente durante a formação do biofilme. É também possível que um aumento da expressão de genes de resistência aos fármacos seja responsável pelo aumento do MIC (Concentração Inibitória Mínima), observado no biofilme de C.albicans. (CHANDRA et al., 2001). Estudos demonstraram diferenças na produção de carboidratos entre células de biofilmes e células planctônicas. Mudanças na parede celular e na secreção de carboidratos (incluindo aqueles inseridos na matriz) são associadas com o crescimento do biofilme formado por Candida e contribuem para o fenótipo de resistência do biofilme. Aproximadamente 80 a 90 % da parede celular de C. albicans é composta por carboidrato A parede celular de C.albicans é composta principalmente de três componentes interconectados 47 por ligações covalentes: 1,3 e 1,6 glucano (50 a 60 %), manoproteínas (30 a 40%) e quitina (0,6 a 9%) (NETT et al., 2007). Estudos sugerem que alterações na parede celular envolvendo 1,3-glucano em C. albicans podem contribuir para a resistência antifúngica. Paredes celulares de células em biofilme contêm maiores concentrações de 1,3-glucano do que células planctônicas Esses resultados sugerem que os componentes da parede celular, como o glucano, podem interagir fisicamente com a penetração antifúngica e inibir o sítio de ação. Outra possibilidade é que as alterações na parede celular das células do biofilme protegem a célula estruturalmente de fatores externos, incluindo antifúngicos conforme visualizado na Figura 12 (NETT et al., 2007). FIGURA 15- Microscopia eletrônica da parede celular de células planctônicas e células de biofilme de C. albicans Fonte: Nett et al., 2007. O decréscimo do conteúdo de ergosterol e redução dos níveis de expressão dos genes de biossíntese tem sido relatado em biofilmes maduros de Candida e podem contribuir para a resistência. A capacidade das células do biofilme maduro em sobreviver com baixos níveis de esteróis, combinado com elevados níveis de enzimas biossintéticas, podem contribuir para a resistência aos componentes azólicos e polienos (FINKEL; MITCHELL, 2011). De fato, os componentes azólicos atuam inibindo a biossíntese do ergosterol e os polienos atuam através da ligação ao ergosterol (LEWIS, 2008). O biofilme de C.albicans contém uma subpopulação de células resistentes que são tolerantes a alguns fármacos antifúngicos, como clorexidina e anfotericina B. Essas células são capazes de continuar o desenvolvimento do biofilme na presença desses compostos (QUINDÓS; VILLAR-VIDAL; ERASO, 2009). 48 Tem-se relatado que os genes MDR1, MDR2 e CDR2 que codificam proteínas de efluxo são altamente expressos em biofilmes jovens (NAILIS et al., 2010). Existem duas classes principais de bombas de efluxo, proteínas ABC e bombas de MFS (CANNON et al., 2009).Tais proteínas bombeiam o fármaco para fora da célula, reduzindo assim a concentração intracelular dos componentes azólicos (WHITE et al., 2002). Entretando, linhagens de células mutantes contendo deleções em alguns desses genes, mantiveram seu fenótipo de resistência durante o crescimento do biofilme (RAMAGE et al., 2005). Dessa forma, essas observações reforçam que a resistência do biofilme é um fenômeno complexo e não pode ser explicado por um simples mecanismo molecular (DOUGLAS et al., 2002). Entretando, um conhecimento integral do mecanismo de resistência do biofilme é necessário para o desenvolvimento de tratamentos eficientes contra infecções por Candida (UWAMAHORO; TRAVEN, 2010). 13. AVALIAÇAO DA SUSCETIBILIDADE IN VITRO DE Candida albicans A introdução dos antifúngicos azólicos representou um avanço no tratamento das infecções fúngicas, porém seu amplo emprego até mesmo como profilaxia para pacientes imunocomprometidos tem favorecido a seleção de cepas resistentes tornando fundamental a identificação do agente etiológico causador da candidíase antes de iniciar a terapêutica empírica, bem como a realização do antifungigrama em alguns indivíduos para conhecer e monitorar a resistência a esses fármacos (DALAZEN et al., 2011). A literatura tem demonstrado a ocorrência de cepas com sensibilidade diminuída e outras resistentes in vitro a determinados fármacos indicados para tratamento de candidíase oral (CANDIDO; AZEVEDO; KOMESU, 1999). O estudo realizado por Dalazen et al (2011) avaliou 30 amostras isoladas durante quadros de recidiva de candidíase oral de pacientes idosos com sinais clínicos definidos de candidíase eritematosa, sendo a maioria diabética. O perfil de resistência obtido foi cerca de 97% para a anfotericina B, 93% para o fluconazol e 73% para o miconazol. Os resultados serviram como alerta para a emergência de cepas com resistência adquirida, pois boa parte dos isolados clínicos foram oriundos de pacientes que já tinham sido tratados, mas residiram a candidíase. Favalessa, Martins e Hahn (2010) caracterizaram e determinaram o perfil de suscetibilidade in vitro de leveduras do gênero Candida isoladas de pacientes infectados pelo 49 HIV frente aos antifúngicos. Os isolados de C. albicans provenientes das amostras clínicas de secreção de orofaringe e raspado oral foram 67,7%. Com o estudo observou-se elevados valores de concentrações inibitórias mínimas, sendo estes valores iguais a 29,6% para fluconazol, 30,8% para itraconazol, 25,9% para voriconazol, 23,4% para cetoconazol e 1,2% para a anfotericina B, sugerindo resistência dessa espécie aos azólicos e anfotericina B. Rodrigues (2009) avaliou a suscetibilidade de 40 isolados de leveduras da espécie C.albicans provenientes de indivíduos portadores de aparelhos ortodônticos fixos a antifúngicos e colutórios. Concluiu-se que todos os isolados testados foram sensíveis ao grupo dos polienos, nomeadamente à anfotericina B e à nistatina. No caso dos azóis, comportam-se de diferentes maneiras, ao cetoconazol 22,5% foram resistentes, 75% tiveram resistência intermediária e 2,5% foram sensíveis e no caso do fluconazol todos os isolados foram sensíveis. Castro et al (2007) avaliaram a sensibilidade antifúngica de Candidas sp. isoladas da mucosa orofaríngea de 52 portadores do HIV e respectivos controles, residentes na Região Noroeste Paulista. Foram isoladas cerca de 80% de cepas de Candida albicans e 21% de Candida não-albicans, nos dois grupos estudados. Dentre as cepas de C. albicans obtidas dos soropositivos para o HIV, verificou-se que 8% eram resistentes ao fluconazol, enquanto 35% foram dose-dependente (uma para o cetoconazol e 12 para o fluconazol). Todas as cepas obtidas foram sensíveis a anfotericina B, enquanto uma cepa de C. albicans foi resistente a todos os azóis. Treze por cento das cepas foram resistentes ao fluconazol, em ambos os grupos. Carvalho et al (2007) avaliaram o perfil de susceptibilidade e fatores de virulência de amostras de leveduras isoladas nos diferentes sítios anatômicos (boca, trato gastrointestinal e vaginal) de pacientes portadores de AIDS. Como resultados, vinte amostras foram submetidas ao teste de susceptibilidade, sendo 4,3% dos isolados apresentaram resistência à anfotericina B, 65,2% sensíveis ao fluconazol, 4,3% sensíveis dose-dependente e 30,4% foram consideradas resistentes ao fluconazol. A maioria das amostras apresentou produção de fosfolipase e atividade hemolítica. Semprebom (2007) avaliou 36 cepas de C. albicans isoladas de bolsas periodontais quanto à suscetibilidade ao digluconato de clorexidina em cultura aeróbica e anaeróbica. De acordo com os resultados obtidos a clorexidina foi ineficaz na contenção do crescimento da C. albicans proveniente da bolsa periodontal, quando testado em aerobiose. Segundo o estudo realizado uma mesma cepa de C. albicans quando crescida em biofilme se torna oito vezes mais resistente à clorexidina que quando crescida em fase planctônica. 50 Ito et al (2004) estudaram a suscetibilidade de 55 cepas de leveduras do gênero Candida isoladas de pacientes com periodontite crônica, sendo que 39 eram isolados de C. albicans. Dos fármacos testados o cetoconazol apresentou a menor eficácia dentre os isolados de C. albicans e uma amostra apresentou resistência. Considerando a toxixidade e a presença de cepas resistentes o estudo sugeriu que o cetoconazol não é um fármaco ideal para tratamento da candidíase oral decorrente de periodontite. Os resultados obtidos com o estudo indicaram que o fluconazol foi o fármaco mais eficaz no tratamento periodontal de super infecções por C. albicans. Belazi et al (2004) avaliaram isolados de 30 pacientes com candidíase oral pseudomembranosa e mucosite que recebiam radioterapia para câncer de cabeça e pescoço. Ao ser realizado os testes de suscetibilidade dos isolados, verificaram resistência em oito dos vinte e três isolados de Candida albicans. 14. DERIVADOS VEGETAIS COMO ALTERNATIVA AO TRATAMENTO DE INFECÇOES CAUSADAS POR CEPAS RESISTENTES DE Candida albicans A biodiversidade dos vegetais constitui a mais importante fonte de biomoléculas para a produção de uma infinidade de produtos de importância econômica, incluindo modelos para a síntese de inúmeros novos fármacos (CARDOSO et al., 2010). O Brasil possui grande potencial para o desenvolvimento da Fitoterapia, uma vez que apresenta a maior diversidade vegetal do mundo e tecnologia para validar cientificamente este conhecimento (DINIZ et al., 2010). Plantas medicinais são amplamente utilizadas pela humanidade desde os tempos primórdios. Atualmente, embora seja produzida uma larga escala de fármacos antifúngicos e antibacterianos para o tratamento de diversas doenças de origem microbiana, o uso indiscriminado e prolongado de fármacos industrializados tem levado à seleção de microorganismos resistentes a esses compostos, tornando a utilização de produtos de origem natural uma importante alternativa. O uso de fitoterápicos tem-se intensificado em vários países do mundo, principalmente no Brasil, que possui uma flora rica e diversa (MOLINA et al., 2008). A Organização Mundial da Saúde (OMS) incentivou o estudo científico das plantas medicinais a partir dos anos setenta, objetivando o conhecimento dos benefícios desses agentes medicinais e avaliando os riscos quanto a sua toxicidade. Dentre as diversas atividades biológicas avaliadas se destaca a ação antimicrobiana (MOLINA et al., 2008). 51 Atualmente, a medicina tem se tornado mais receptiva ao uso de substâncias microbicidas derivadas de plantas, pois muitos micro-organismos aumentaram sua taxa de resistência, principalmente aqueles oportunistas, aos antimicrobianos empregados na terapia tradicional, diminuindo a capacidade terapêutica dessas substâncias. Assim, plantas medicinais surgem como fonte de novas moléculas com grande potencial antimicrobiano (CARDOSO et al., 2010; MARTINS, 2009; SILVA; RANGEL, 2010). As pesquisas com extratos de origem vegetal para uso oral têm aumentado nos últimos anos buscando novos produtos com maior atividade farmacológica, menor toxicidade e custos mais acessíveis à população (COSTA et al., 2009). A candidíase oral tem como principal patógeno implicado no seu desenvolvimento a espécie Candida albicans que tem sido designada como a espécie fúngica com maior capacidade para formar biofilme, inclusive sobre hidroxiapatita (mineral que constitui a estrutura dentária) e resina acrílica (material utilizado na preparação de próteses dentárias), o que ajuda a perceber sua significativa patogenicidade. E ainda os fatores de virulência de C. albicans, aumentam a eficácia do desenvolvimento da patologia (CASTRO; LIMA, 2010; DINIZ et al., 2010). O tratamento convencional para as doenças fúngicas é muito limitado, particularmente devido ao limitado espectro dos antifúngicos atuais, e por conta do alto custo do tratamento, ainda mais quando se necessita de um tratamento prolongado (MARTINS, 2009). Mediante essa realidade, a necessidade de novas alternativas terapêuticas tornou-se evidente, assim, investigações com extratos de plantas vêm sendo realizadas na perspectivas de se conhecer as propriedades biológicas e terapêuticas que apresentem eficácia significativa e menores efeitos colaterais (CASTRO; LIMA, 2010; DINIZ et al., 2010; SILVA; RANGEL, 2010). 15. DERIVADOS VEGETAIS NA INIBIÇÃO DE Candida albicans IN VITRO Na última década, estudos in vitro avaliaram o efeito antimicrobiano de óleos essenciais, sendo que muitos deles provaram possuir propriedades antimicóticas (TAMPIERI et al., 2005). Mentha piperita ou hortelã-pimenta, planta da família Lamiaceae, está entre os mais populares ingredientes de alimentos e chás à base de ervas. Esta planta tem propriedades: antiinflamatória, antiespasmódica, antiemética e analgésica (ISCAN et al., 52 2002; TAMPIERI et al., 2005). Entretanto, M. piperita tem sua atividade antimicrobiana (antibacteriana, antifúngica e antiviral) pouco citada na literatura (MATOS et al., 2009). Um estudo realizado por Matos et al (2009) verificou a ação antifúngica do extrato de hortelã (extrato etanólico de M. piperita) sobre C. albicans. Os resultados mostraram que o extrato de hortelã apresentou ação superior tanto inibitória quanto fungicida sobre amostras clínicas de C. albicans. O potencial antimicrobiano dessa planta é devido a um importante componente presente nesse extrato, o mentol. A Richardia brasiliensis Gomez é conhecida popularmente como poaia-branca, poaia-do-campo ou poaia. É uma erva-daninha nativa da América do Sul. No Brasil, tem vasta distribuição geográfica, com maior ocorrência em regiões agrícolas do Centro-Oeste, Sudeste e Sul. (LORENZI, 1991). Utilizada popularmente através de infuso ou decocto da raiz, como expectorante, emética, diaforética (GRANDI et al., 1989), vermífuga e para o tratamento de hemorróidas (ANGRA et al., 2007). Devido à ausência de relatos da atividade antimicrobiana da R. brasiliensis, Figueredo et al (2009) estudaram o potencial antimicrobiano do extrato etanólico bruto das partes aéreas (folhas e caules) e raízes de R. brasiliensis utilizando micro-organismos padrão e isolados clínicos, entre eles Candida albicans. Concluíram que tanto o extrato etanólico bruto das partes aéreas quanto das raízes apresentaram atividade antimicrobiana contra a levedura C. albicans que pode está relacionada com a presença de flavonóides e terpenos em sua composição química. Esse estudo representou a primeira descrição da atividade antimicrobiana da R. brasiliensis. Candida albicans tem sido designada como a espécie fúngica com maior capacidade para formar biofilme, o que contribui para sua expressiva patogenicidade e colabora para infecções micóticas superficiais em mucosas da cavidade oral. Devido às limitações da utilização dos fármacos tradicionais extratos obtidos a partir do Eucalyptus globulus L., espécie vegetal conhecida popularmente como eucalipto-comum, têm sido amplamente utilizados em pesquisas científicas que buscam reconhecer sua atividade antifúngica ( HENRIQUES; AZEREDO; OLIVEIRA, 2005). Seu uso medicinal é embasado pelo conhecimento popular, que relata significativa ação anti-séptica, desinfetante e expectorante (SILVA et al., 2003). Considerando efetiva a atividade antimicrobiana do óleo essencial de E. globulus Castro e Lima (2010) avaliaram, in vitro, a atividade antifúngica do óleo essencial de E. globulus L. para espécies de Candida associadas a infecções da cavidade oral. Todas as cepas de Candida utilizadas apresentaram-se sensíveis ao óleo essencial de E. globulus L. causando 53 inibição de crescimento sobre 76,2% das cepas utilizadas no ensaio. Dentre os microorganismos avaliados neste estudo, destacou-se a C. albicans e C. tropicalis, para estas espécies, foi possível observar susceptibilidade ao óleo essencial de E. globulus em concentrações de até 39 µg.mL–1. Os resultados sugerem que o óleo essencial de E. globulus pode ser um promissor antifúngico de origem natural para tratamento de infecções fúngicas localizadas em tecidos bucais. A atividade antifúngica do óleo essencial de E. globulus L. tem sido atribuída principalmente a presença de eucaliptol e cineol que possuem uma importante característica, sua hidrofobicidade, que permite sua interação com estruturas celulares que tem constituição lipídica, promovendo aumento da permeabilidade, o que pode provocar uma saída extensiva de eletrólitos, indispensáveis à sobrevivência celular. Estudos futuros são necessários para confirmar essa hipótese (CASTRO; LIMA, 2010). Diniz et al (2010) testaram a atividade antifúngica de extratos vegetais (folha e caule de Myrciaria cauliflora berg. - jabuticabeira) no controle de fungos relacionados com a candidíase oral. Observou-se que tanto o extrato da folha como do caule de Myrciaria cauliflora berg apresentaram atividade antifúngica in vitro frente a Candida albicans. De acordo com os resultados observados neste estudo, o extrato do caule de Myrciaria cauliflora berg. mostrou-se mais eficaz frente as linhagens ensaiadas do que o extrato da folha de jabuticabeira. As folhas de Myrciaria cauliflora berg apresentam um alto teor de compostos fenólicos e taninos orientando a avaliação da atividade antimicrobiana deste vegetal. (SOUZA, 2007). Alves et al (2009) tiveram como propósito verificar in vitro a atividade antimicrobiana, antiaderente e antifúngica dos extratos vegetais da malva (Malva Sylvestris), aroeira-do-sertão ( Myracrodruon urundeuva All ) e goiabeira (Psidium guajava Linn) na prevenção de formação do biofilme dental e proliferação de cepas do gênero Candida. Na avaliação da atividade antifúngica observou-se que os extratos hidroalcoólicos analisados apresentaram atividade antifúngica sobre as cepas padronizadas utilizadas de Candida albicans. De acordo com a literatura Molina et al (2008) avaliaram in vitro a atividade antifúngica de derivados vegetais de própolis, mamona, sálvia e calêndula sobre vinte cepas de Candida albicans isoladas da cavidade oral humana. Os resultados demonstraram que o extrato glicólico de própolis apresentou efeito fungicida para todas as cepas de C. albicans mesmo nas concentrações mais diluídas. O extrato glicólico de sálvia apresentou capacidade fungicida para 80% das cepas de C. albicans. Já o extrato glicólico de calêndula demonstrou 54 atividade antifúngica para apenas 10% das cepas de C. albicans avaliadas e o extrato comercial de mamona não apresentou atividade fungicida. Os extratos glicólicos de própolis e sálvia foram os mais efetivos sobre C. albicans. A Rosmarinus officinalis Linn. é conhecida popularmente como alecrim-comum e utilizada basicamente como condimento, mas esta planta apresenta propriedades antioxidantes e antimicrobianas ( JOLY, 1993; PORTE; GODOY, 2001). Syzgium cumini Linn., conhecida como jambolão, é normalmente utilizada na forma de chá de suas folhas por pacientes diabéticos e também tem sido usada para enxágues bucais para o tratamento de aftas, estomatites, afecções da garganta e outras doenças orais (KAPOOR, 1990). A avaliação do potencial antifúngico dos extratos glicólicos destas espécies sobre cepas clínicas de C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis, isoladas da cavidade oral de indivíduos submetidos à terapia com antibióticos por tempo prolongado para o tratamento da tuberculose pulmonar foi o objetivo da análise de Costa et al (2009). O estudo utilizou 30 cepas de leveduras do gênero Candida, das quais 14 eram C. albicans, 8 C. glabrata e 8 C. tropicalis. Dentre as leveduras testadas, C. tropicalis foi a maissensível aos extratos utilizados. As cepas de C. albicansforam mais susceptíveis ao extrato de R. officinalis Linn.,enquanto que para C. glabrata não houve diferença entre os extratos testados. O gengibre, cujo nome científico é Zingiber officinale, possuí seu rizoma seco largamente empregado na culinária como condimento, em bebidas e na medicina popular (PECIULIENE et al., 2001). Os compostos encontrados no gengibre responsáveis pela atividade antioxidante, antiinflamatória, antiproliferativa, antitoxidade hepática e atividade antitumoral são os diarilheptanoides. Um deles é o 6-gingerol, encontrado em grande concentração, capaz de inibir a produção de prostaglandinas e interleucina 1α (AGUIAR et al., 2009). As propriedades retratadas indicam para o uso promissor do gengibre, então, Aguiar et al (2009) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato glicólico de gengibre e solução de Hipoclorito de sódio 2.5% sobre vinte e quatro isolados bucais de Candida albicans. Os dados revelaram que o extrato glicólico de gengibre mostrou-se fungicida, em 20% das amostras, com a concentração de diluição fungicida mínima de 6% e, em 80% das amostras a concentração de diluição fungicida mínima foi equivalente a 12,5%. O hipoclorito de sódio foi efetivo e superior ao extrato glicólico de gengibre, mesmo na menor concentração testada sobre as leveduras. A espécie Arctium minus (Hill) Bernh., conhecida popularmente como “bardana”, representa uma das espécies vegetais com vasta utilização na medicina fitoterápica. Entre as 55 diversas atividades biológicas desta planta descritas na literatura está o potencial antimicrobiano in vitro sobre bactérias e leveduras especialmente do gênero Candida (HOLETZ et al., 2002; PEREIRA et al., 2005). Lubian et al (2010) propuseram avaliar o efeito antifúngico do extrato aquoso das folhas de Arctium minus (Hill) Bernh., por meio da determinação da MIC (Concentração inibitória mínima) e CFM (Concentração fungicida mínima) sobre diferentes espécies e linhagens do gênero Candida. A atividade foi avaliada contra quatro linhagens de C. albicans, três linhagens de C.tropicalis, uma linhagem de C. glabrata, uma linhagem de C. stellatoidea, uma linhagem de C.dubliniensis e uma linhagem de C. krusei, totalizando 11 amostras fúngicas. De acordo com este estudo, concentrações inferiores a 12,5 mg/mL foram insuficientes para que o extrato aquoso de Arctium minus apresentasse efeito fungistático ou fungicida in vitro. Já a concentração de 12,5 mg/mL apresentou efeito fungistático sobre a maioria das linhagens e espécies testadas (C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. stellatoidea, C. dubliniensis e C. krusei e o efeito fungicida foi observado apenas sobre uma espécie de C. krusei. O tomilho é uma planta tipicamente utilizada na culinária como condimento e erva aromática, e seu óleo essencial usado como antimicrobiano e antioxidante, sendo que o timol é o principal constituinte do tomilho (SANTORO et al., 2007; MEWES; KRUGER; PANK, 2008). Partindo desse princípio, Silva e Rangel (2010) testaram a atividade antimicrobiana do extrato etanólico de folhas de Thymusvulgaris L. (tomilho) nas concentrações de 50 mg/ml, 100 mg/ml e 200 mg/ml diante de algumas cepas fúngicas padrão, incluindo Candida albicans (ATCC 10231). A melhor atividade encontrada foi para as menores concentrações, como é o caso das cepas de Candida albicans, Candida glabrata e Pseudomonas aeruginosa. A Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray. (Asteraceae) conhecida no Brasil como girassol mexicano, flor-do-amazonas, margaridão é popularmente utilizada no combate ao alcoolismo, contra dores de estômago, úlcera, problemas no fígado e no combate ao envenenamento. Com o propósito de investigar in vitro um possível potencial antifúngico Castro et al (2010) testaram o extrato diclorometânico concentrado das inflorescências de T.diversifolia frente a quatro espécies do gênero Candida sendo elas: C. albicans (ATCC 18804), C. tropicalis (ATCC 750), C. parapsilosis (ATCC 22019) e C. krusei (ATCC 6258). Os testes antifúngicos realizados com a fração hexânica tiveram resultados satisfatórios na inibição de cepas do gênero Candida, com concentração inibitória mínima (MIC) de 128 µg/mL. 56 Espécies da família Sapindaceae têm sido usadas na medicina tradicional como diuréticas, estimulantes, expectorantes, sedativas, vermífugas e no tratamento de dermatites. Das atividades biológicas descritas para espécies de Sapindaceae, destaca-se a atividade antimicrobiana. Santos et al (2010) através da determinação da Concentração inibitória mínima testaram a atividade antimicrobianas dos extratos etanólicos de folhas, galhos e caule de Dilodendron bipinnatum (Sapindaceae). Utilizaram os micro-organismos padrão: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Bacillus subtilis (ATCC 6623), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Micrococcus luteus (ATCC 9341) e Candida albicans (ATCC 10231). Os extratos etanólicos dos galhos e das folhas apresentaram a MIC igual a 250 µg/mL e CFM igual a 500 µg/ mL sobre C. albicans. O extrato etanólico dos caules não apresentou atividade em nenhum dos organismos testados Pterodon emarginatus Vogel (Fabaceae) é uma árvore do Cerrado conhecida popularmente como sucupira branca utilizada na medicina popular em preparações antireumáticas, antiinflamatórias, analgésicas e antiinfecciosas (BUSTAMANTE et al., 2010). A falta de dados na literatura sobre a atividade antimicrobiana das cascas da P. emarginatus levou Bustamante et al (2010) a avaliarem a atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos brutos das cascas de P. emarginatus contra bactérias Gram-positivas esporuladas e não esporuladas, bactérias Gram-negativas e contra o fungo Candida albicans. O extrato etanólico bruto da casca da P. emarginatus inibiu o crescimento de todas as bactérias e o fungo C. albicans. A MIC foi de 0,74 mg/mL para o fungo C. albicans. O presente estudo abre perspectivas para o uso das cascas da P. emarginatus como antimicrobiano, já que uso popular das sementes e frutos é mais frequente. Conhecidas como babosa, as plantas do gênero Aloe popularmente são usadas em função de suas propriedades cicatrizante, bactericida, antifúngica, laxante, hidratante e antiinflamatória (LORENZI; MATOS, 2002; FENNER et al., 2006) A fim de contribuir para um melhor conhecimento da espécie, o trabalho realizado por Cardoso et al (2010) teve como objetivo estudar o potencial antimicrobiano de extratos etanólicos e clorofórmicos foliares de Aloe arborescens Mill. produzidos em diferentes épocas do ano. Foram utilizadas cepaspadrão de alta concentração de unidades formadoras de colônias (ufc) de Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphilococcus aureus e Candida albicans. Neste trabalho os extratos clorofórmicos de inverno e verão mostraram maior atividade antimicrobiana sobre C. albicans com MIC de 256 µg/mL e não foram observados 57 efeitos expressivos da sazonalidade sobre o potencial antimicrobiano dos extratos etanólicos, sendo o extrato de verão o de menor eficiência antimicrobiana. A Uncaria tomentosa (Unha de Gato) é uma planta indígena da floresta Amazônica e de outras áreas tropicais da América do Sul e Central. Tem aplicação no tratamento de diversas patologias, entre elas a candidíase. Paiva et al (2009) avaliaram clínico e laboratorialmente a ação do gel da Uncaria tomentosa em pacientes portadores de candidíase na cavidade oral. Foram selecionados 20 pacientes que apresentavam clinicamente e laboratorialmente infecção por Candida. Os mesmos foram divididos em dois grupos. O grupo-teste (Uncaria tomentosa/Imuno-Max Gel), composto por 10 pacientes, foi orientado a utilizar o gel da Uncaria tomentosa, sobre as lesões nacavidade oral, 3x ao dia por um período de 14 dias. O grupo-controle (Miconazol/Daktarin Gel) utilizou a medicação da mesma forma prescrita para o grupo-teste. Após o período de tratamento, os pacientes retornaram para nova avaliação clínica e laboratorial. A Uncaria tomentosa mostrou ser um fitofármaco promissor, apresentando vantagem sobre o miconazol de não ter provocado reações adversas nos pacientes, uma vez que, 40% dos pacientes do grupo-controle, apresentaram reações indesejáveis. Stryphnodendron adstringens, também conhecido como “barbatimão”, é uma planta nativa da região do cerrado do Brasil. A literatura documenta que extratos de barbatimão apresentam diversas atividades biológicas, incluindo efeitos antimicrobianos e cicatrizantes. Santos et al (2009) avaliaram a suscetibilidade in vitro de bactérias e fungo patogênicos da cavidade oral a extratos aquosos e etanólicos de barbatimão. Os estes de suscetibilidade foram realizados em cepas-padrão: S. mutans (ATCC 70069), Staphylococcus aureus (ATCC 12692), Actinobacillus actinomycetemcomitans (ATCC 29522) e Candida albicans (ATCC 18804). Os resultados mostraram que o extrato aquoso de barbatimão apresentou somente atividade antibacteriana considerável, enquanto que o extrato etanólico de barbatimão mostrou tanto atividade antibacteriana quanto antifúngica. Concluíram que os extratos de barbatimão apresentam atividade antimicrobiana contra micro-organismos patogênicos da cavidade oral e que tais extratos poderiam ser considerados uma possível alternativa terapêutica para condições infecciosas da cavidade oral. Várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas e direcionadas no descobrimento de novos agentes antimicrobianos provenientes de plantas, para serem aplicados em produtos farmacêuticos na terapia de diversas patologias bucais. Assim, Pereira et al (2009) realizaram um estudo com o objetivo de avaliar in vitro a propriedade antimicrobiana de extratos glicólicos (75%) de Psidium guajava L. (goiabeira), Syzygium cumini L. (jambolão) e 58 Pimpinella anisum L. (erva-doce) sobre cepas padrão de Candida albicans, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli e Bacillus atrophaeus (esporos). Os resultados obtidos neste estudo demonstraram o potencial antimicrobiano dos extratos glicólicos em diferentes concentrações, frente às cepas padrões de E. faecalis, S. aureus, S.mutans, E. colie C. albicans, micro-organismos que estão relacionados às patologias da cavidade oral. Silva et al (2010) avaliaram a atividade antimicrobiana in vitro, pelo método de difusão em disco, das diferentes partes de duas espécies pertencentes à família Rutaceae coletadas na Chapada Diamantina, Bahia, Brasil: Spiranthera odoratissima A. St.-Hil. e Zanthoxylum stelligerum Turcz., bem como do alcalóide diidroqueleritrina, isolado do extrato metanólico de Z. stelligerum frente a cepas padrão de microrganismos e isolados clínicos. Os resultados apresentados indicaram que o extrato da raiz da espécie Z. stelligerume o alcalóide extraído desta apresentaram propriedades antimicrobianas contra as cepas Gram positivas e leveduras do gênero Candida, incluindo C. albicans. Ponzi et al (2010) realizaram um estudo utilizando o extrato hidroetanólico da planta, Momordica charantia L., conhecida popularmente como Melão de São Caetano. Para a realização dos ensaios microbiológicos, foram selecionados espécies de origem clínica bem como, cepas padrões de origem ATCC. O extrato hidroetanólico da planta foi eficaz para Staphylococos aureus e epidermidis e para os fungos Candida albicans e Candida tropicalis. Sugeriram a utilização dessa substância como meio alternativo de baixo custo para o tratamento das afecções da boca, justificando seu desenvolvimento tecnológico farmacêutico. Mardegan (2007) teve como uns dos objetivos do seu estudo testar a atividade dos extratos (diclorometanico e metanólico) de Rosmarinus officinalis (Alecrim), Mentha piperita (Hortelã), Casearia sylvestris (Guaçatonga), Arctium lappa (Bardana), Arrabidaea chica (Crajiru) e Tabebuia avellanedae (Ipê-Roxo) para determinar o potencial antifúngico em cepas padrão de Candida spp (C. albicans, C. dubliniensis, C. parapsilosis, C. tropicalis e C.krusei) e em amostras clínicas de Candida albicans. Sob as condições experimentais utilizadas conclui-se que o extrato metanólico de Arrabidaea chica foi o mais efetivo na inibição do crescimento de várias espécies de Candida, inclusive em relação aos isolados clínicos de C. albicans, seguido dos extratos diclorometanicos de Arctium lappa e Mentha piperita. Nos testes de inibição das proteinases de Candida albicans os que se destacaram foram os extratos diclorometanico de Arrabidaea chica, Casearia sylvestris e Mentha piperita. A relevante atividade antifúngica in vitro contra uma variedade de espécies de Candida torna-os promissores como agente antifúngico. 59 A partir dos resultados obtidos nos trabalhos, sugerem-se novos estudos mais aprofundados e específicos com a finalidade de descobrir e conhecer melhor as atividades biológicas e, possivelmente, chegar a uma importante molécula isolada responsável pela atividade antimicrobiana, além de verificar seus possíveis efeitos adversos e resistências cruzadas, e, dessa maneira, possibilitar o surgimento de um novo antimicrobiano com grande potencial no mercado farmacêutico (SILVA; RANGEL, 2010). 60 16. CONCLUSÃO A presente revisão da literatura abordou a espécie de levedura Candida albicans. Uma levedura comensal facilmente isoladas da mucosa oral. Um fungo polimórfico, que se apresenta sob formas leveduriformes no estado saprofítico, estando associado à colonização assintomática; ou como formas filamentosas, observadas em processos infecciosos. A ruptura do equilíbrio biológico, geralmente resultante de fatores predisponentes - patológicos, fisiológicos, imunológicos e mecânicos - há um aumento na multiplicação e invasão destes micro-organismos no tecido oral, ocasionando a infecção denominada candidíase oral, que corresponde à infecção micótica oral mais prevalente e manifesta-se sob as seguintes formas: agudas, crônicas ou mucocutâneas. Os fatores de virulência dessa levedura têm um papel essencial no desenvolvimento desse processo infeccioso. A produção de exoenzimas e toxinas representam importantes fatores de virulência da espécie patogênica Candida albicans e sua habilidade em formar biofilme. Esses são estruturas altamente organizadas, que conferem a levedura um comprovado aumento da resistência a antifúngicos, em função do estado metabólico que se encontram e à difícil penetração e difusão de fármacos. E ainda suas capacidades de aderência, dimorfismo (formação de micélio) e variabilidade fenotípica (switching). No que diz respeito ao tratamento, medicamentos tópicos, como a nistatina, ocasionam uma resposta terapêutica favorável. A higiene oral orientada é indispensável para o sucesso do tratamento. Para os casos mais graves, os antifúngicos sistêmicos são os mais indicados. Mas, o desenvolvimento de mecanismos de resistência aos antifúngicos tem representado um grande desafio, ressaltando o interesse em plantas com propriedades terapêuticas no combate á infecção. Os resultados obtidos com os estudos in vitro dos derivados vegetais indicam a importante significância clínica de se avaliar meios alternativos e economicamente viáveis para o controle da Candidíase Oral, considerando o aparecimento e aumento da incidência da espécie de Candida albicans resistentes à terapêutica convencional. Diante das limitações dos estudos in vitro, torna-se importante lembrar que estes resultados podem não corresponder aos reais comportamentos dos derivados vegetais in vivo, uma vez que não estão expostas às mesmas condições da cavidade oral. Contudo, trabalhos em nível laboratorial são necessários para fornecer subsídios à realização de ensaios clínicos posteriores. E esses conhecimentos podem levar à descoberta de importantes moléculas e medicamentos nas áreas médica e farmacêutica. 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, I. P. B. Efeitos do Vinagre em Candida albicans após Aderência in vitro em Resina Acrílica Termicamente Ativada. 2006. 49 f. Dissertação (Mestrado) - Departamento de Odontologia, Universidade de Taubaté, Taubaté, 2006. AGUIAR, A. P. S. et al. Avaliação in vitro da ação do extrato glicólico de gengibre sobre Candida albicans. Revista de Odontologia da Universidade Cidade de São Paulo, v. 21, n. 2, p. 144-9, mai-ago, 2009. AGUIAR, M. M. G. B. Desenvolvimento de Novos Comprimidos Bucais de Nistatina para o Tratamento de Candidíase Oral. 2007.146 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007. ANGRA, M. F. et al. Sinopse das plantas conhecidas como medicinais e venenosas no Nordeste do Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, p. 114-40, 2007. AKPAN, A.; MORGAN, R. Oral Candidiasis. Postgraduate Medical Journal, v. 78, p. 455459, 2002. ÁLVARES, C. A. et al. Candidíase vulvovaginal: fatores predisponentes do hospedeiro e virulência das leveduras. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, Maringá, v. 43, n. 5, p. 319-327, out. 2007. ALVES, P. M.et al.Atividade antimicrobiana, antiaderente e antifúngica in vitro de plantas medicinais brasileiras sobre microrganismos do biofilme dental e cepas do gênero Candida. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 42, n. 2, p. 222-224, mar-abr, 2009. BARBEDO, L. S.; SGARBI, D. B. G. Candidíase. J. Brás. Doenças Sex. Transm., v. 22, n. 1, p. 22-38, 2010. BARBIERI, D. S. V. Análise da Aderência “in vitro” de Streptococcus mutans e Candida albicans na Superfície Dentária. 2005. 110 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) Departamento de Patologia Básica, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2005. 62 BELAZI, M. et al. Oral Candida isolates in patients undergoing radiotherapy for head and neck cancer: prevalence, azole susceptibility profiles and response to antifungal treatment. Oral Microbiol.Immunol., v. 19, p. 347-351, 2004. BUSTAMANTE, K. G. L. 1. et al. Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico bruto da casca da sucupira branca (Pterodon emarginatus Vogel) – Fabaceae. Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.12, n.3, p.341-345, 2010. CALDERONE, R. A.; FONZIWA, W. A. Virulence factors of C. albicans.Trends Microb., v. 9, p. 327-335. 2001. CANDIDO, R. C.; AZEVEDO, R. V. P.; KOMESU, M. C. Leveduras do gênero Candida na cavidade oral com e sem lesão: detecção de susceptibilidade a antifúngicos - técnica do Etest. J. Bras.Patol., v. 35, n. 4, p. 210-6, 1999. CANNON, R. D. et al. Oral Candida: Clearence, Colonization, or Candidiasis? Journal of Dental Research, v. 74, n. 5, p. 1152-1160, 1995. CANNON, R. D. et al. Efflux-Mediated Antifungal Drug Resistance. Clinical Microbiology Reviews, New Zealand, v. 22, n. 2, p. 291-321, Apr. 2009. CARDOSO, B. C. Efeito de antifúngicos em suspensões e biofilmes de Candida albicans e Candida dubliniensis. 2004. 75f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia)- Departamento de Engenharia Biológica da Universidade do Minho, Universidade do Minho, 2004. CARDOSO, F. L. et al. Análise sazonal do potencial antimicrobiano e teores de flavonóides e quinonas de extratos foliares de Aloe arborescens Mill., Xanthorrhoeaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, n. 1, p. 35-40, Jan./Mar, 2010. CARVALHO, P. G. et al. Teste de susceptibilidade a agentes antifúngicos e fatores de virulência em leveduras obtidas de pacientes portadores de HIV/AIDS. In:EAIC ENCONTRO ANUAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 16., 2007, Maringá – PR.Anais... Maringá: Universidade Estadual de Maringá - PR, 2007. CASTRO, M. N. M. et al. Atividade Antifúngica e Toxicidade das Inflorescências de Flor-doamazonas (Tithonia Diversifolia). Revista Eletrônica de Farmácia, v. 7, n. 3, p. 72–81, 2010. 63 CASTRO, R. D.; LIMA, E. O. Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de Eucalyptus globulus L. sobre Candida spp.Rev Odontol UNESP, Araraquara, v. 39, n. 3, p. 179-184, maio/jun., 2010. CASTRO, G. M. et al. Estudo de colonização por Candida sp.na cavidade oral de indivíduos soropositivos e soronegativos para HIV-1 no Noroeste Paulista, Brasil. Rev Panam Infectol, v. 9, n. 3, p. 26-31, 2007. CATE, J.M. et al. Molecular and Cellular Mechanisms That Lead to Candida Biofilm Formation.J Dent Res, v.88, n. 2, p. 105-115, 2009 CHANDRA, J. et al. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology, v.183, n. 18, p. 5385-5394, 2001. CLAUDINO, A. L. R. Caracterização de Isolados de Candida spp.de Cavidade Oral Quanto aos Aspectos Fenotípicos e Moleculares e Obtenção de Mutantes Heteroresistentes à Anfotericina B e Fluconazol. 2007. 80 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal de Alfenas, Minas Gerais, 2007. COSTA, A. C. B. P. et al. Atividade antifúngica dos extratos glicólicos de Rosmarinus officinalis Linn.e Syzygium cumini Linn. sobre cepas clínicas de Candida albicans, Candida glabratae Candida tropicalis. Revista de Odontologia da UNESP, v. 38, n. 2, p. 111-116, 2009. COSTA, I. C; FELIPE, I; GAZIRI, L C J. Resposta imune a Candida albicans. Semina: Ciências Biológicas e da Saúde, Londrina, v. 29, n. 1, p. 27-40, jan./jun. 2008. CROMACK, T. H. SMITH, J. M. Calendula officinalis produção potencial and crop agronomy in southers england. Ind Crop Prod, v. 7, n. 2, p. 223-9, 1998. DALAZEN , D. et al. Comparação do perfil de suscetibilidade entre isolados clínicos de Candida spp. orais e vulvovaginais no Sul do Brasil. J Bras Patol Med Lab, v. 47, n. 1, p. 33-38, fev. 2011. DINIZ, D. N.et al. Efeito antifúngico in vitro do extrato da folha e do caule de Myrciaria cauliflora berg. sobre microrganismos orais. Rev Odontol UNESP, Araraquara, v. 39, n.3, p. 151-156, maio/jun., 2010. 64 DONLAN, R. M. Biofilms: Microbial Life on Surfaces. Emerging Infetious Diseases.Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA, v. 8, n. 9, p-881-888, set. 2002. DORLAN, R. M.; COSTERTON. J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, Atlanta, Geórgia v. 15, n. 2, p.167-193, 2002. DOUGLAS, L. J. Medical importance of biofilms in Candida infections. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 19, p. 139-143, 2002. ELLEPOLA, A. N. B.; SAMARANAYAKE, L. O. Oral Candida Infections and Antimycotys. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine, v. 11, n.2, p. 172-198, 2000. FAVALESSA, O. C.; MARTINS, M. A.; HAHN, R. C. Aspectos micológicos e suscetibilidade in vitro de leveduras do gênero Candida em pacientes HIV-positivos provenientes do Estado de Mato Grosso. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 43, n. 6, p. 673-677, nov-dez, 2010. FENNER, R. et al. Plantas utilizadas na medicina popular brasileira com potencial antifúngico. Braz J Pharm Sci, v. 42, p. 369-374, 2006. FIDEL JÚNIOR, P. L. The protective immune response against vaginal candidiasis: lessons learned from clinical studies and animal model. International Reviews of Immunology, Philadelphia, v. 21. n. 6, p. 515-548, 2002. FIGUEREDO, A. D. L. et al. Avaliação da atividade antimicrobiana das partes aéreas (folhas e caules) e raízes de Richardia brasiliensis Gomez (Rubiaceae). Rev Ciênc Farm Básica Apl, v. 30, n. 2, p. 193-196, 2009. FINKEL, J. S.; MITCHELL, A. P.; Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology, v. 9, p. 109-118, feb., 2011. FONTINHA, A. L. D. Determinação da susceptibilidade de Candida spp.à Anfotericina B pelo método de microdiluição. 2010. 66f. Monografia (Licenciatura em Ciências Farmacêuticas- Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Fernando Pessoa, Porto, 2010. 65 GILMAN, A. G. et al. As bases Farmacológicas da Terapêutica. 10. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. GRANDI, T. S. M. et al. Plantas medicinais de Minas Gerais, Brasil.Acta Bot Brás, v. 3, n. 2, p. 185-224, 1989. HENNING, M. M.; PERRONE, M. Factores determinantes de patogenicidad en relacion a la ecologia de Candida albicans en cavidade oral. Acta Odontológica Venezolana, Caracas, v. 39, n. 2, abr. 2001. HENRIQUES, M.; AZEREDO, J.; OLIVEIRA, R. Candida albicans and Candida dubliniensis: comparasion of biofilms in terms of biomass and activity. British Jounal of Biomedical Science. v. 63, n. 1, 2005. HERNÁEZ, M. L.; PLA, J.; NOMBELA, C. Molecular and genetic aspects of resistance to azoles in Candida albicans. Rev Iberoam Micol, v.14, n. 4, p. 150-4, 1997. HOFLING, J. F. et al. Colonização oral por espécies de Candida: Adesão, formação de biofilme e interações microbianas. Revista da Faculdade de Odontologia, v. 9, n. 1, p. 2226, 2004. HOLETZ, F.B. et al. Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.97, p.1027-31, 2002. INGROFF, A.E. Mechanims of resistance to antifungal agents: Yeast and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micologia. Espanha, v. 25, p. 101-106, 2008. ISCAN, G. et al. Antimicrobial screening of Mentha piperita essential oils. J Agric Food Chem, v. 50, p. 3943-6, 2002. ITO, C. Y. K. et al. In vitro antifungal susceptibility of Candida spp. isolates from patients with chronic periodontitis and from control patients. Braz Oral Res, v. 18, n. 1, p. 80-4, 2004. 66 JABRA-RIZKI, M. A. J; FALKLER, W.A; MEILLER, T. F. Fungal Biofilms and Drug Resistance. Emerging Infectious Diseases, v. 10, n. 1, p. 14-19, jan. 2004. JOLY, A.B. Botânica: introdução à taxonomia vegetal. 11ed. São Paulo: Companhia Editora Nacional, 1993. KAPOOR, L. D. Handbook of ayuverdic medicinal plants. Boca Raton: CRC; 1990. KHAN, M. S. A. et al.Virulence and Pathogenicity of Fungal Pathogens with Special Reference to Candida albicans: Combating Fungal Infections. 1. ed. Berlin Heidelberg: Springer, 2010. 45p. KULETA, J. K.; KOZIK, M. R.; KOZIK, A. Fungi pathogenic to humans: molecular bases of virulence of Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigates. Acta Biochimica Polonica. v. 56, n. 2, p. 211-224, 2009. LEWIS, K. Bacterial Biofilms. Boston: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2008. LINARES, C. E. B. Avaliação da Atividade da Superóxido Dismutase e Catalase de Candida albicans e Candida dubliniensis Expostas a Antineoplásicos, Íons Metálicos e Antifúngicos. 2009. 126f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) – Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rio Grande do Sul, 2009. LORENZI, H. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas, tóxicas e medicinais. Nova Odessa, São Paulo: Instituto Plantarum, p. 440, 1991. LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas cultivadas. Nova Odessa: InstitutoPlantarum, 2002. LUBIAN, C. T. et al. Atividade antifúngica do extrato aquoso de Arctium minus (Hill) Bernh. (Asteraceae) sobre espécies orais de Candida. Rev.Bras. Pl. Med., Botucatu, v.12, n.2, p.157-162, 2010. MALUCHE, M. E.; SANTOS, J. I. Candida sp. e infecções hospitalares: aspectos epidemiológicos e laboratoriais. Departamento de Análises Clínicas, Centro de Ciências da 67 Saúde, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, RBAC, v. 40, n. 1, p. 65-67, 2008. MARDEGAN, R.C. Atividade Inibitória de Extratos Vegetais sobre Candida spp e sobre Proteinases sintetizadas por Candida albicans. 2007.93f. Tese (Doutorado em Biologia Buço-Dental). Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, São Paulo, 2007. MARTINS, C.A.P. et al. Presença Candida spp. em pacientes com periodontite crônica. Ciênc. Odontol. Brás, v. 5, p. 75-85, 2002. MARTINS, I. M. C. L. B. Avaliação da ação antifúngica de Citrus Limon Linn. Frente a leveduras do gênero Candida. 2009. 75f. Dissertação (Mestrado em Diagnóstico Oral)Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Federal da Paraíba, 2009. MATOS, B. M. et al. Atividade antifúngica do extrato alcoólico de Mentha piperita sobre Candida albicans e C. tropicalis. Rev Odontol UNESP, Araraquara, v. 38, n. 4, p. 244-48, jul./ago. 2009. MEWES, S.; KRUGER, H.; PANK, F. Physiological morphological chemical and genomic diversities of different origins of thyme (Thymus vulgaris L.).Genetic Resources Crop Evolution, v. 55, p. 1303-1311, 2008. MOLINA, F. P. et al. Própolis, sálvia, calêndula e mamona – atividade antifúngica de derivados vegetais sobre cepas de Candida albicans. Cienc Odontol Brás, v. 11, n. 2, p. 8693, abr./jun, 2008. MUKHERJEE, P. K. et al. Candida biofilm: a well-designed protected environment. Med Mycol, v. 43, n.3, p. 191-208, 2005. NAGLIK, J. R.; CHALLACOMBE, S. J.; HUBE, B.; Candida albicans Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. v. 67, n. 3, p. 400-428, Set., 2003. NAILIS, H. Transcriptional response to fluconazole and amphotericin B in Candida albicans biofilms.Res Microbiol, v. 161, p. 284-292, 2010. 68 NETO, M. M.; DANESI, C. C.; UNFER,D. T. Candidíase Oral: Revisão da Literatura. Saúde, v. 31, n.1 – 2, p. 16-26, 2005. NETT, J. et al. Putative Role of β-1,3 Glucans in Candida albicans Biofilme Resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 51, n. 2, p. 510-520, Feb. 2007. OMBRELLA, A. M.; RACCA, L.; RAMOS, L. Actividades proteinasa y fosfolipasa de aislamientos de Candida albicans provenientes de secreciones vaginales con distintos valores de pH. Revista Iberoamericana de Micologia, Espanha, v. 25, p. 12-16, 2008. PAIVA, L. C. A. et al. Avaliação clínica e laboratorial do gel da Uncaria tomentosa(Unha de Gato) sobre candidíase oral. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 2ª, p. 423-428, Abr./Jun. 2009. PANIZO, M. M; REVIÁKINA, V. Candida albicans y su efecto patógeno sobre las mucosas. Rev. Soc. Ven. Microbiol, v. 21, n. 2, jul. 2001. PARDI, G.; CARDOSO, E. I. Algunas Consideraciones Sobre Candida albicans Como Agente Etiológico De Candidiasis Oral.Acta Odontológica Venezolana, Caracas, v. 40, n. 1, fev. 2002. PECIULIENE, V. et al. Isolation of yearts and enteric bacteria in rootfilled teeth with chronic apical periodontitis. Int Endod J, v. 34, n. 6, p. 429-34, Sept, 2001 . PEREA, S; PATTERSON, T. F. Antifungal Resistance in Pathogenic Fungi. Clinical Infectious Diseases Journal, n. 35, p. 1073-1080, 2002. PEREIRA, J.V. et al. Antimicrobial activity of Arctium lappa: constituents against microorganism commonly found in endodontic infections. Brazilian Dental Journal, v.16, n.3, p.192-6, 2005. PEREIRA, C. A. et al. Ação Antimicrobiana In vitro de Extratos Glicólicos de Psidium Guajava L., Syzygium Cumini L. e Pimpinella Anisum L. Rev Inst Adolfo Lutz, São Paulo, v. 68, n. 1, p. 102-8, 2009. 69 PONZI, E. A. C. et al. Atividade antimicrobiana do extrato de Momordica charantia L. Rev. Cir. Traumatol. Buco-Maxilo fac., Camaragibe, v.10, n.1, p. 89-94, jan./mar. 2010. PORTE, A.; GODOY, R. L. O. Alecrim (Rosmarinus officinalis L.): Propriedade antimicrobiana e química do óleo essencial. B Ceppa, v. 2, p. 193-210, 2001. QUINDÓS, G.; VILLAR-VIDAL, M.; ERASO, E. Actividad de La micafungica contra lãs biopelículas de Candida. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 26, n. 1, p. 49-55, 2009. RAMAGE, G. et al. Candida Biofilms: an Update. American Society for Microbiology, v. 4, n. 4, p. 633-638, apr.2005. RANG, H. P. et al. Farmacologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007. RIBEIRO, E.L. et al. Aspectos das leveduras de Candida vinculadas às infecções nosocomiais. Revista Newslab, ed. 64, p. 106-128, 2004. RIBEIRO, A. Q. et al. Perfil de utilização de fitoterápicos em farmácias comunitárias de Belo Horizonte sob a influência da legislação nacional. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, n. 1, p. 65-70, jan./mar, 2005. RIBEIRO, M. A. Exoenzimas e mecanismos moleculares de resistência ao fluconazol de C. albicans isoladas de mulheres HIV positivas. 2002. 156 f. Tese (Doutorado) – Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002. RIBEIRO, E. L. Leveduras de Candida isoladas da boca de crianças com Síndrome de Down: aspectos feno-genotípicos, relação intrafamiliar e perfil de imunoglobulinas. 2008. 129 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, Brasília, 2008. RIBEIRO, E. L. et al. Tubos germinativos na genotipagem de isolados bucais de Candida albicans de crianças com Síndrome de Down e pais e/ou responsáveis. Revista Clínica e Pesquisa em Odontologia – UNITAU, v. 2, n. 1, p.34-38, 2010. RODRIGUES, S. I. J. C. Ação de antifúngicos e soluções anti-microbianas em isolados (Candida albicans) da cavidade oral de portadores de aparelhos ortodônticos fixos. 2009.87f. Dissertação (Mestrado em Análises Laboratoriais)-Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 2009. 70 SANTORO, G. F. et al. Effect of oregano (Origanum vulgare L.) and thyme (Thymus vulgaris L.) essential oils on Trypanosoma cruzi (Protozoa: Kinetoplastida) growth and ultrastructure. Parasitology Research, v. 100, n. 4, p. 783–790, 2007. SANTOS, J. C. et al.Constituintes Químicos e Atividade Antimicrobiana dos Extratos de Dilodendron Bipinnatum (Sapindaceae). Quim. Nova, v. 33, n. 10, p. 2080-2082, 2010. SANTOS, V. R.et al. Suscetibilidade de micro-organismos patogênicos orais a extratos aquosos e etanólicos de Stryphdendron adstringens (barbatimão). Int J Den, v. 8, n. 1, p. 1-5, jan./mar.,2009. SANTOS, I. D.et al.Características gerais da ação, do tratamento e da resistência fúngica ao fluconazol. Scientia Medica, v. 15, n. 3, jul./set.2005. SCHERMA, A. P. et al. Presença de Candida spp. na cavidade oral de lactantes durantes os primeiros quatro meses de vida. Cienc. Odontol. Brás, v.7, n. 3, p. 79-86, 2004. SEKINO, S. et al.The effect of a chlorhexidine regimen on de novo plaque formation. J Clin Periodontol, v. 31, p. 609-614, 2004. SEMPREBOM, A. M. Aumento da suscetibilidade de Candida albicans à clorexidina em condições de anaerobiose. 2007. 56f. Dissertação (Mestrado em Odontologia)-Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, 2007. SENA, M. F. et al. Tratamento de candidíase oral em pacientes com câncer de cabeça e pescoço: uma revisão sistemática. Revista da AMRIGS, Porto Alegre, v. 53, n. 3, p. 241245, jul/set. 2009. SENET, J. M. Risk factors and physiopathology of candidiasis.Revista Iberoamericana de Micologia, Barcelona, v. 14, n. 1, p. 6-13, 1997. SILVA J. et al. Analgesic and anti-inflammatory effects of essential oils of Eucalyptus. J Ethnopharmacol, v. 89, p. 277-83, 2003. SILVA, P. Farmacologia. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koongan, 2006. 1369 p. 71 SILVA, T. B.; RANGEL, E.T. Avaliação da Atividade Antimicrobiana do Extrato Etanólico do Tomilho (Thymus Vulgaris L.) in vitro.Revista Eletrônica de Farmácia, v. 7, n. 2, p. 48– 58, 2010. SILVA, C. V. et al.Avaliação da atividade antimicrobiana de duas espécies de Rutaceae do Nordeste Brasileiro.Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, n. 3, p. 355-360, Jun./Jul. 2010. SOUZA, T. M. Estudo farmacognóstico e avaliação da atividade antimicrobiana e citotóxica de preparações cosméticas contendo o extrato de folhas de Myrciaria cauliflora O. Berg. e de casca de Stryphnodendron adstringens (Mart.)Coville.2007.Dissertação mestrado. Araraquara, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP, São Paulo, 2007. SUZUKI, L. C. Desenvolvimento de biofilme formado por Candida albicansin vitro para estudo da terapia fotodinâmica. 2009. 48 f. Dissertação (Mestrado em Ciências na área de Tecnologia Nuclear). Instituto de Pesquisas Energéticas Nucleares, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. TAMPIERI, M. P. et al. The inhibition of Candida albicans by selected essential oils and their major components.Mycopathologia, v. 159, p. 339-45, 2005. URIZAR, J.M.A. Candidíasis orales. Rev. Iberoam. Micol, v.19, p. 17-21, 2002. UWAMAHORO, N.; TRAVEN, A. Yeast, Filaments and Biofilms in Pathogenesis of Candida albicans. Australian Biochemist, v. 4, n. 1, p. 16-19, apr. 2010. VALLE, G. C.; RENDE, J. C.; OKURA, M. H. Estudo da Incidência do Gênero Candida em Hospital Público Universitário. Revista NewsLab, ed. 101, p. 202-222, 2010. VEDIYAPPAN, G.; ROSSIGNOL, T.; ENFERT, C. Interaction of Candida albicans Biofilms with Antifungals: Transcriptional Response and Binding of Antifungal to Beta- Glucans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 54, n. 5, p. 2096-2111, may. 2010. 72 VIDOTTO, V. et al. Adherence of Candida albicans and Candida dubliniensis to buccal and vaginal cells.Revista Iberoamericana de Micologia, Espanha, v.20, p. 52-54, 2003. VIEIRA, J. D. G. et al. Candida albicans isoladas da cavidade oral de crianças com síndrome de Down: ocorrência e inibição do crescimento por Streptomyces sp.Revista Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. v. 38, n. 5, p. 383-386, set/out. 2005. ZARDO, V.; MEZZARI, A. Antifúngicos nas infecções por Candida sp.Revista Newslab, ed. 63, p. 136-146, 2004. WEBSTER, J.; WEBER, R. W. S. Introduction to Fungi.3. ed. Cambridge: Cambridge University Press, 2007. WHITE, T. C. et al. Resistance Mechanims in Clinical Isolates of Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 46, n. 6, p. 1704-1713, jun. 2002.