universidade federal da paraíba centro de - TEDE

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FISIOLÓGICAS
JOSÉ GUILHERME FERREIRA MARQUES GALVÃO
PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA PULMONAR:
ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS
JOÃO PESSOA – PB
2016
JOSÉ GUILHERME FERREIRA MARQUES GALVÃO
PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA PULMONAR:
ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS
Dissertação apresentada ao Programa
Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências
Fisiológicas do Centro de Biotecnologia, da
Universidade Federal da Paraíba como parte
dos requisitos para obtenção do título de
MESTRE EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS.
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Rodrigues Mascarenhas
JOÃO PESSOA – PB
2016
DEDICATÓRIA
À minha fortaleza da inspiração, meus amados pais José Rosalvo e Gilda
À minha fortaleza do amor, minha alma gêmea Alynne
À minha fortaleza da verdade, meus queridos irmãos Lucas e Aurélio Neto
AGRADECIMENTOS
A Deus, aquele que sustenta todas as coisas pela palavra do seu poder, sendo
a luz das nossas pesquisas e vidas.
À minha orientadora, Profa. Sandra Rodrigues Mascarenhas, por ter me
ensinado antes de qualquer coisa, o verdadeiro sentido do altruísmo científico.
Obrigado por todas as oportunidades e principalmente por acreditar em mim,
quando até eu mesmo duvidei. A senhora é um dos seres humanos mais
incríveis que existe. O melhor humor ácido. O timing britânico mais oportuno. E
ainda reserva espaço para ser a mãe científica mais amiga.
Aos meus pais, José Rosalvo e Gilda, por toda a torcida e confiança ao longo
dos anos. Eu sei o quanto foi difícil para vocês, abrir mão de sonhos para
compartilhar dos nossos (seus filhos). Obrigada pelos seus ensinamentos, e
por mostrar que o respeito ao próximo sempre estará ligado a aceitar as
diferenças. A eterna gratidão, é o sentimento mais precioso que eu sinto nesse
momento. Eu amo muito vocês!
À minha esposa, Alynne, o meu porto seguro e minha verdadeira companheira
de jornada. Não entramos no caminho um do outro por acaso, tenho certeza
disso. Eu te amo por tudo! Pelo apoio incondicional – mesmo com os conselhos
e puxões de orelha mais certeiros – e por nunca se negar a enfrentar o mundo
como um só. Você é a minha pessoa.
Aos meus irmãos de sangue José Lucas e Aurélio Neto. Posso até ser o mais
velho, mas tenham a certeza de que vocês me ensinaram muito mais do que
imaginam por todas as nossas vidas. E ao irmão de coração Danilo Duarte,
pela alegria e coragem que inspira. Obrigado infinitamente pelas risadas e pela
sensação única de pertencimento. Nós nunca estaremos sozinhos.
Aos meus familiares, primos e tios – em especial às tias Lena (in memorian) e
Dodó –, por ter sonhado junto comigo e comemorado cada conquista como se
fosse a última! Vocês fizeram os retornos ao meu sertão serem mais calorosos
e especiais.
Aos meus sogros, Verônica e Roberto, e meus queridos cunhados João
Paulo e Gabriel, por terem sido minha segunda família desde o início. Sei o
quanto vocês confiam em mim e agradeço muito por isto.
Aos que fazem do Laboratório de Imunofarmacologia a melhor família de
irmãos, primos e tios científicos! Em especial ao grande irmão Luiz Henrique
por todo o companheirismo, amizade e ensinamentos nos últimos dois anos, e
às parceiras de asma, Laércia, Larissa, Talissa e Deyse. À professora Marcia
Regina Piuvezam, pelo apoio científico no laboratório, sempre com conselhos
pontuais e aos professores Cláudio e Giciane. Aos egressos e saudosos
Jacqueline, a irmã científica mais velha que me ensinou os primeiros passos
na imunologia e Adriano, o truqueiro mais bacana e histológico.
Aos professores e funcionários da Pós-Graduação em Fisiologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP), por toda a atenção e
cuidado que tiveram durante meu cumprimento dos créditos por lá. Foi uma
experiência indescritível estar com todos vocês.
Aos amigos do sertão, Júnior, Dênis, Aninha e Raquel por garantirem a
felicidade da volta. Aos amigos da graduação, Renan, André e Jucélio, pela
torcida e por terem sido o começo. Às amigas de república, Ana Jéssica e
Flávia, a companhia de vocês em Ribeirão Preto, mesmo que curta, nos trouxe
histórias e aprendizados para uma vida.
Aos professores da banca de mestrado, Maria do Socorro de França Falcão
(CBiotec, UFPB), Carmen Cabanelas Pazos de Moura (IBCCF, UFRJ) e
Marcia Regina Piuvezam (CCS, UFPB), por prontamente aceitarem o convite
para participar desta banca e pelas contribuições dadas a este trabalho.
A Crispim Duarte por seu excelente trabalho desempenhado junto ao Biotério
Prof. Dr. Thomas George.
A todos que fazem parte do Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em
Ciências Fisiológicas e do Centro de Biotecnologia (UFPB).
À Universidade Federal da Paraíba por possibilitar a realização desta
pesquisa, e ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.
“Não adianta a gente ficar sentado se preocupando.
O que tiver que ser será, e nós o enfrentaremos quando vier.”
(Harry Potter e o Cálice de Fogo)
RESUMO
GALVÃO, J. G. F. M. PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA
PULMONAR: ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS. 2016. Dissertação.
(Departamento de Biologia Celular e Molecular, Universidade Federal da
Paraíba, João Pessoa – PB, 2016).
A ouabaína (OUA), um potente inibidor da Na+/K+ ATPase, foi identificada como
uma substância endógena presente no plasma humano. Nos últimos anos, foi
evidenciado que a OUA é capaz de interferir em diversos aspectos do sistema
imunológico e em diferentes modelos de inflamação, porém o seu efeito na
inflamação alérgica pulmonar não tinha sido investigado previamente.
Processos inflamatórios alérgicos das vias aéreas inferiores são caracterizados
por migração celular e hiperresponsividade brônquica, em decorrência da
sensibilização por antígenos proteicos como a ovalbumina (OVA). Objetivo:
Avaliar o efeito da ouabaína no modelo de inflamação alérgica pulmonar
induzida por OVA. Métodos: Camundongos BALB/c fêmeas (n = 6) foram
sensibilizados e desafiados com OVA e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.)
com OUA (0,56 mg/kg) dois dias antes das sensibilizações e uma hora antes
destas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1 hora antes de cada
desafio. Parâmetros da inflamação alérgica, como migração celular e produção
de citocinas no fluido do lavado broncoalveolar (BALF), produção de muco e
remodelamento histopatológico pulmonar quantificação de IgE sérica, foram
analisados posteriormente. Resultados: A ouabaína reduziu em 60% o número
total de células presentes no BALF como um reflexo da inibição de leucócitos
polimorfonucleares e linfócitos T CD3+, bem como a produção de citocinas do
fenótipo Th2, IL-4 e IL-13. Ademais, a ouabaína reduziu os parâmetros
inflamatórios histopatológicos, como hiperplasia das células caliciformes com
consequente diminuição de muco, além de reduzir o título de OVA-IgE
específica. Conclusão: Estes dados sugerem que a OUA apresenta efeito antiinflamatória
no modelo
de
inflamação alérgica
pulmonar, modulando
parâmetros do fenótipo Th2.
Palavras chaves: digitálicos cardiotônicos, linfócito, neutrófilo, alergia.
ABSTRACT
GALVÃO, J. G. F. M. PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA
PULMONAR: ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS. 2016. Dissertation.
(Departamento de Biologia Celular e Molecular, Universidade Federal da
Paraíba, João Pessoa – PB, 2016).
Ouabain (OUA), a potent Na+/K+ ATPase inhibitor, was identified as an
endogenous substance present in human plasma. It was shown that OUA is
able to interfere in several aspects of the immune system and inflammation, but
the effect of this substance in allergic lung inflammation had not been previously
investigated. Lower airways inflammation process is characterized by cell
migration and bronchial hyperresponsiveness, as a result of sensitization by
protein antigens such as ovalbumin (OVA). Aim: Evaluate the effect of ouabain
on the model of allergic pulmonary inflammation induced by OVA. Methods:
BALB/c mice (n = 6) were sensitized and challenged with OVA and pretreated
intraperitoneally (ip) with OUA (0.56 mg/kg) two days before the sensitization
and one hour before them, or dexamethasone (2 mg/kg) subcutaneously 1 hour
before to each challenge. Allergic inflammation parameters, such as cell
migration, and production of cytokines in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),
mucus production and pulmonary histopathologic remodeling, and IgE
quantitation were analyzed posteriorly. Results: Ouabain reduced (60%) BALF
cells as a reflex of polymorphonuclear leukocyte inhibition and T CD3+
lymphocytes, as well as it reduced the production of Th2 profile cytokines, IL-4
and IL-13. Furthermore, ouabain also reduced histopathologic parameters of
inflammation, such as hyperplasia of goblet cells and with consequent mucus
decrease, besides it reduced OVA-specific IgE titer. Conclusion: These results
suggests that OUA presents anti-inflammatory effect on pulmonary allergic
inflammation, modulating Th2 phenotype parameters.
Keywords: cardiotonic digitalics, lymphocyte, neutrophils, allergy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química da ouabaína .................................................. 21
Figura 2. Efeitos imunomoduladores da ouabaína .................................... 24
Figura 3. Fisiopatologia da asma alérgica ................................................. 28
Figura 4. Esquema representativo do protocolo experimental de inflamação
pulmonar alérgica induzida por ovalbumina .............................................. 39
Figura 5. Esquema representativo da contagem de células totais e diferenciais
.................................................................................................................... 41
Figura 6. Esquema representativo das subpopulações de leucócitos, por
tamanho e granularidade celular, após análise por citometria de fluxo ..... 42
Figura 7. Esquema representativo da quantificação de citocinas pelo Ensaio
Imunoenzimático de ELISA sanduíche ....................................................... 43
Figura 8. Esquema representativo da preparação do corte histológico pulmonar
..................................................................................................................... 45
Figura 9. Esquema representativo da dosagem de IgE OVA-específica pelo
método de Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA) ........................................... 48
Figura 10. Análise histopatológica do efeito da ouabaína sob o modelo de
inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com
hematoxilina-eosina (HE) ........................................................................... 61
Figura 11. Efeito da ouabaína sobre as alterações histopatológicas no modelo
de inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com
coloração P.A.S. (Ácido Periódico de Schiff) ............................................. 64
Figura 12. Esquema representando os efeitos da ouabaína no processo
inflamatório alérgico pulmonar obtidos neste trabalho ............................... 76
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Efeito da ouabaína na migração de leucócitos totais e diferenciais
(linfócitos, macrófagos, eosinófilos e neutrófilos) para o espaço broncoalveolar
na inflamação alérgica pulmonar experimental induzida por OVA .................. 51
Gráfico 2. Efeito da ouabaína na porcentagem de granulócitos (eosinófilos e
neutrófilos) no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ...... 54
Gráfico 3. Percentual de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) no BALF após
o tratamento com ouabaína na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
.......................................................................................................................... 55
Gráfico 4. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na porcentagem de linfócitos
T CD3+ no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ........... 57
Gráfico 5. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na produção das citocinas
IL-13, IL-4 e IFN-γ no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
......................................................................................................................... 59
Gráfico 6. Score histológico de parâmetros inflamatórios no modelo de
inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ............................................ 62
Gráfico 7. Análise quantitativa da presença de muco na região bronquiolar em
cortes histológicos no modelo de inflamação alérgica pulmonar induzida por
OVA ................................................................................................................. 66
Gráfico 8. Efeito da ouabaína no título de IgE-OVA específica no modelo de
inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ............................................ 65
LISTA DE ABREVIATURAS
ANG II = Angiotensina II
ANOVA = Análise de variância
ATP = Trifosfato de adenosina
Al(OH)3 = Hidróxido de sódio
BALF = Fluido do lavado broncoalveolar
CD = Cluster of diferenciation
CEUA = Conselho de ética no uso de animais
DEXA = Dexametasona
ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay
FACS = Fluorescent-activated classificador de células
FSC = Forward scattered hight
FITC = Isotiocianato de fluoresceína
FcεRI = Receptor de alta afinidade pela região Fc da imunoglobulina E
HE = Hematoxilina-eosina
e.p.m. = Erro padrão da média
i.p. = Intraperitoneal
i.v. = Intravenosa
INF-γ = Interferon gama
IL = Interleucina
IgE = Imunoglobulina E
GATA 3 = Proteína 3 ligante do GATA
K+ = Íon potássio
LAK = Linfoquinas
LB = Linfócitos B
MAPK = Proteína cinase ativada por mitógeno
MHC-II = Complexo Maior de Histocompatibilidade classe II
nM = Nanomolar
Na+ = Íon sódio
Na+/K+- ATPase = Bomba sódio, potássio ATPase
NFATc = Fator nuclear de ativação de células T c1
NF-κB = Fator de transcrição nuclear κB
OUA = Ouabaína
OVA = Ovalbumina
pM = Picomolar
PAS = Ácido periódico de Schiff
PCA = Anafilaxia cutânea passiva
PFE = Pico de fluxo expiratório
SSC = Side scattered hight
SNC = Sistema nervoso central
Th = T helper
TNF-α = Fator de necrose tumoral α
TPA = Éster de forbol
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................................ 20
2.1 Ouabaína ............................................................................................................................ 21
2.2 A ouabaína e o sistema imunológico ......................................................................... 23
2.3 A inflamação alérgica pulmonar e os fenótipos da asma..................................... 25
2.4 A fisiopatologia da asma alérgica Th2 ....................................................................... 27
3. JUSTIFICATIVA................................................................................................................... 34
4. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 36
4.1 Objetivo geral ................................................................................................................... 37
4.2 Objetivos específicos ..................................................................................................... 37
5. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................... 38
5.1 Material ............................................................................................................................... 39
5.1.1 Substâncias e sais ....................................................................................................... 39
5.1.2 Aparelhos e equipamentos ........................................................................................ 39
5.2 Métodos.............................................................................................................................. 39
5.2.1 Animais ........................................................................................................................... 39
5.2.2 Grupos experimentais................................................................................................. 39
5.2.3 Protocolo experimental de inflamação pulmonar alérgica induzida por OVA
..................................................................................................................................................... 40
5.2.4 Contagem de células totais e diferenciais no fluido do lavado
broncoalveolar (BALF) .......................................................................................................... 41
5.2.5 Diferenciação de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) e marcação celular
de subpopulações de linfócitos T CD3+ no BALF ......................................................... 43
5.2.6 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF .................................. 44
5.2.7 Histologia pulmonar .................................................................................................... 45
5.2.7.1 Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE) ......................................................... 47
5.2.7.2 Coloração P.A.S. (Ácido Periódico – Schiff) ...................................................... 48
5.2.8 Dosagem do título de IgE OVA-específica............................................................. 49
5.2.9 Análise estatística ........................................................................................................ 50
6. RESULTADOS ..................................................................................................................... 51
6.1 Efeito da ouabaína na migração de células totais e diferenciais para o fluido
do lavado broncoalveolar (BALF) ...................................................................................... 52
6.2 Efeito da ouabaína no percentual de granulócitos no BALF na inflamação
alérgica pulmonar analisado por citometria de fluxo ................................................... 55
6.3 Efeito da ouabaína sob a subpopulação de linfócitos T CD3+ presentes no
BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ........................................ 58
6.4 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF na inflamação
alérgica pulmonar induzida por OVA ................................................................................ 60
6.5 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na
inflamação alérgica pulmonar induzia por OVA corados com hematoxilina-eosina
(HE)............................................................................................................................................. 62
6.6 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na
inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA corados com P.A.S. (Ácido
Periódico de Schiff) ............................................................................................................... 65
6.7 Efeito da ouabaína sob o título de IgE-OVA específica na inflamação alérgica
pulmonar experimental ......................................................................................................... 68
7. DISCUSSÃO......................................................................................................................... 70
8. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 78
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 81
APÊNDICE A - Substâncias e sais ....................................................................................... 95
APÊNDICE B - Aparelhos e equipamentos ......................................................................... 97
ANEXOS .................................................................................................................................... 98
16
1. INTRODUÇÃO
17
A ouabaína é um glicosídeo cardiotônico que foi inicialmente isolada das
cascas, raízes e sementes de plantas pertencentes a família das Apocynaceae,
como a Acocanthera ouabaio e a Strophanthus gratus. Agindo como um
inibidor da Na+K+-ATPase, este glicosídeo foi utilizado por muitos anos no
tratamento da insuficiência cardíaca congestiva (NICHOLS; MALDONADO,
1993). A identificação da ouabaína como uma substância endógena no plasma
e tecidos de mamíferos superiores (HAMLYN et al., 1991; FERRANDI et al.,
1997) possibilitou sua utilização como agente efetor em diversos mecanismos
reguladores e mantenedores da homeostase (BAGROV et al., 2008). Esse
glicosídeo é produzido principalmente pelas glândulas adrenais, hipófise e
hipotálamo (FERRANDI et al., 1997; TYMIAK et al., 1993; KAWAMURA et al.,
1999; SCHONER et al., 2000) e estudos sugerem que em situações de
estresse agudo ocorre uma maior liberação de ouabaína, tal como a produção
de cortisol durante o exercício físico (GOTO et al., 1995) e durante a gravidez
(VAKKURI et al., 2000), sendo ambas as liberações reguladas pelos mesmos
fatores endócrinos.
O papel imunomodulador da ouabaína foi evidenciado a partir da sua
capacidade de inibir a proliferação de linfócitos induzida por diversos mitógenos
como a fito-hemaglutinina (QUASTEL et al., 1968; OLEJ et al., 1998), éster de
forbol (OLEJ et al., 1994) e concanavalina-A (SZAMEL et al., 1981;
RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2008). A ouabaína induz a redução na
expressão de mCD14 em monócitos humanos (VALENTE et al., 2009),
aumenta a expressão da molécula CD69 na superfície de timócitos
(RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2003), sendo capaz também de reduzir
os
níveis
de
MAPK
p38
fosforilada
e
de
NFATc1
(RODRIGUES-
MASCARENHAS et al., 2008) nessas mesmas células. Adicionalmente, nosso
grupo
demonstrou
que
a
ouabaína
possui
efeito
anti-inflamatório
e
antinociceptivo (VASCONCELOS et al., 2011), bem como modula eventos
moleculares da inflamação aguda ao reduzir a ativação de NF-κB em peritonite
induzida por zimosan (LEITE et al., 2015).
A inflamação é definida como uma resposta adaptativa que pode ser
desencadeada por estímulos endógenos e exógenos, resultando numa grande
18
variedade de processos fisiológicos e patológicos (MEDZHITOV, 2008).
Durante a resposta inflamatória, o limite entre os efeitos benéficos – que levam
a adaptação a desregulação fisiopatológica dos tecidos – e os efeitos
descontrolados – que levam ao desequilíbrio homeostático – pode ser
facilmente ultrapassado (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Desta forma,
entende-se que o estado inflamatório patológico está diretamente ligado ao
desenvolvimento de doenças como a artrite reumatoide (SILVERSTEIN et al.,
2000), a doença de Crohn (ATREYA et al., 2000), a asma alérgica (SIMPSON
et al., 2010) dentre outras.
Pouco se sabe sobre a ação da ouabaína em quadros inflamatórios
alérgicos. Foi demonstrado que em pacientes com asma moderada, baixas
concentrações dessa substância são capazes de causar broncodilatação
(AGRAWAL et al., 1986) e que ela é capaz de modular a liberação de
histamina em mastócitos (SENOL et al., 2007; LAGO et al., 2001). A asma é
uma doença infamatória crônica, na qual muitas células do sistema imune inato
e adaptativo agem em associação com células epiteliais, causando hiperreatividade brônquica, produção exacerbada de muco e remodelamento das
vias aéreas inferiores (SIMPSON et al., 2010). Essa doença inflamatória afeta
todas as idades, porém se apresenta com maior magnitude em crianças e
adolescentes, podendo os sintomas variar quanto à gravidade e frequência. É
relatada também uma maior incidência de ataques de asma no período noturno
e na realização de atividades físicas (BARNES, 2008).
Durante uma crise de asma, a mucosa dos brônquios intumesce,
resultando em estreitamento das vias aéreas e redução do fluxo de ar para
dentro e para fora dos pulmões e consequentes alterações na frequência
respiratória. Estas alterações podem ser retratadas como uma das principais
condições dos asmáticos, pois afeta não apenas a respiração, mas produz
outras complicações como a insônia, promovendo a fadiga diurna e níveis
reduzidos de atividade. Este quadro tem um impacto significativo na qualidade
de vida destes indivíduos, sendo o responsável por grande parte das ausências
escolares e no trabalho justificadas por motivos médicos (LAMBRECHT;
HAMMAD, 2015).
19
Na resposta inflamatória alérgica, a primeira exposição a antígenos
proteicos induz a ativação de linfócitos Th2, um dos pontos iniciais do
desenvolvimento da asma alérgica (DE MONCHY et al., 1985). Essa ativação
linfocitária, assim como a eosinofilia identificada no fluido do lavado
broncoalvelolar (BALF) e nos tecidos pulmonares (ROBINSON et al., 1992), o
aumento na concentração das interleucinas IL-4, IL-5 e IL-13 (WOODRUFF et
al., 2009) e a presença de IgE no soro de indivíduos atópicos (CHENG et al.,
2014), são repostas diretamente relacionadas com a inflamação alérgica.
20
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
21
2.1 Ouabaína
A ouabaína é um glicosídeo cardíaco conhecido inicialmente como um
composto de origem vegetal, extraído das cascas e raízes da árvore Ouabaio
(Acocanthera ouabaio) e de sementes do gênero Strophanthus (Strophanthus
gratus
e
Strophanthus
kombé),
ambos
pertencentes
à
família
das
Apocynaceae. Os glicosídeos cardíacos desenvolvem diferentes atividades ao
se ligarem a Na+/K+-ATPase, uma proteína presente na membrana celular, que
utiliza a energia do ATP para transportar íons Na + e K+ contra um gradiente
eletroquímico, mantendo baixos níveis citosólicos de Na+ e altas concentrações
de K+ em praticamente todas as células animais (LINGREL, 2010). A sua
atividade enzimática é essencial para muitos eventos fisiológicos, para a
manutenção do equilíbrio osmótico e do pH, para a atividade de células
nervosas e musculares e para a manutenção do potencial de repouso celular,
possuindo um papel central na função renal através da reabsorção de Na + e
água (NICHOLS; MALDONADO, 1993).
Em 1991, Hamlyn e colaboradores, identificaram uma substância
endógena, circulante no plasma de mamíferos superiores semelhante à
ouabaína. A ouabaína pode ser encontrada no plasma humano em
concentrações de 50 pM a 80 nM, sendo produzida pela adrenal, hipotálamo,
hipófise e na região anteroventral do terceiro ventrículo (PAMNANI et al., 1981;
HAMLYN et al., 1991; FERRANDI et al., 1997; SCHONER, 2000; SCHONER et
al., 2003). Essa substância apresenta características químico-estruturais,
biológicas e imunológicas idênticas as da ouabaína encontrada em vegetais
(FERRANDI et al., 1997; SCHONER, 2000). Portanto, nos últimos anos, a
ouabaína tem sido amplamente estudada por sua capacidade de interferir em
diversos mecanismos reguladores e mantenedores da homeostase (BAGROV;
SHAPIRO, 2008).
Caracterizada quimicamente como um composto hidrofílico, formada a
partir da união de um esteróide (ouabagenina) e um açúcar (ramnose) por uma
ligação glicosídica (Figura 1), a ouabaína tem como principais estímulos para a
sua secreção: o aumento de angiotensina II (ANG II), do hormônio
adrenocorticotrófico (DE WARDENER et al., 1961) e da concentração
22
plasmática de sódio e volume extracelular (BLAUSTEIN, 1993). Os níveis
endógenos de ouabaína podem ser alterados por diversos eventos fisiológicos
e patológicos. Assim, o estado homeostático da síntese de ouabaína endógena
tende a ser modificado quando se observa mudanças em parâmetros
fisiológicos responsáveis pela manutenção dos níveis da substância. Desta
forma a sua liberação ocorre em circunstâncias similares àquelas onde há
secreção
de
corticoides
(GOTO
et
al.,
1995).
Figura1. Estrutura química da ouabaína
Fonte: KAWAMURA et al., 1999.
Níveis elevados de ouabaína foram encontrados em pacientes
hipertensos (SCHONER, 2000), bem como em diferentes modelos de ratos
com hipertensão. Alguns estudos demonstraram a participação da ouabaína
endógena no desenvolvimento da hipertensão neurogênica, sendo a liberação
de ANG II, um dos principais mecanismos desencadeadores desta doença
(ROSSONI et al., 2003; XAVIER et al., 2004; WENCESLAU et al., 2011).
Concomitante com a produção de cortisol, a ouabaína é produzida em
diferentes níveis durante os três trimestres clássicos da gestação humana,
23
apresentando uma concentração três vezes maior no último trimestre
(VAKKURI et al., 2000).
A ouabaína também pode agir como um neuromodulador do sistema
nervoso central (SNC), aumentando a atividade de neurônios simpáticos em
ratos (DE WARDENER, 2001). Adicionalmente, este digitálico pode estimular
ou inibir a apoptose de células do SNC, a depender da concentração utilizada.
Este evento foi observado em estudos de regeneração de retina, onde
concentrações micromolares da ouabaína induziram a apoptose das células
ganglionares, enquanto que concentrações nanomolares protegeram as
mesmas células da apoptose (DE REZENDE CORREA et al., 2005; FIMBEL et
al., 2007).
2.2 A ouabaína e o sistema imunológico
O sistema imunológico é formado por células e órgãos cujas atividades
estão
relacionadas
ao
estabelecimento
da
homeostasia
a
partir
do
desenvolvimento de uma resposta imune. Essa resposta pode ser manipulada
por substâncias ativas para regular respostas indesejadas resultantes de
processos inflamatórios exacerbados, reações autoimunes e alérgicas, bem
como em situações de rejeição de transplantes, estimulando assim respostas
de proteção (CHAUSSABEL; PASCUAL; BANCHEREAU, 2010).
A ouabaína é capaz de interferir em diversos aspectos da resposta
imunológica exercendo diversos efeitos inibitórios (ECHEVARRIA-LIMA e
RUMJANEK,
2006;
RODRIGUES-MASCARENHAS
et
al.,
2009;
VASCONCELOS et al., 2011; LEITE et al., 2015; DA SILVA et al., 2016). Na
presença de glicocorticoides e durante a proliferação induzida por mitógenos,
ocorre um aumento na síntese da Na+/K+-ATPase, em sua conformação de
maior afinidade com a ouabaína, a forma E2 (QIU et al, 2003). A ouabaína,
então, reduz a proliferação linfocitária induzida por estímulos como éster de
forbol (TPA) (OLEJ et al, 1994) e interleucina 2 (STOECK et al, 1983; OLEJ et
al, 1998). Esta inibição ocorre também sobre a geração de células natural
killers ativadas por linfoquinas (LAK) e também sob a proliferação de timócitos
24
desencadeada por concanavalina-A, sem, no entanto, inibir a atividade
citotóxica dessas células (DE MORAES et al., 1989; OLEJ et al., 1994).
O papel da ouabaína em timócitos murinos ainda não está totalmente
esclarecido, entretanto estudos demonstram que esse digitálico induz a
expressão
de
CD69,
através
MASCARENHAS et al., 2003).
do
influxo
de
cálcio
(RODRIGUES
A inibição da Na+/K+-ATPase por meio de
concentrações elevadas de ouabaína causa despolarização da membrana
plasmática destes timócitos, in vitro, e potencializa a morte induzida por
glicocorticoides (MANN et al., 2001). Outros dados demonstraram que esse
sinergismo entre ouabaína e hidrocortisona também pode ocorrer in vivo
(RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2006).
Por outro lado, em linfócitos maduros de sangue periférico, a ouabaína é
capaz de induzir um aumento da expressão do proto-oncogen c-myc, levando
parte dessa população à morte por apoptose (OLEJ et al., 1998). A inibição da
Na+/K+-ATPase por altas concentrações da ouabaína causa a despolarização
da membrana plasmática (MANN et al., 2001) e redução dos níveis de K+, que
por sua vez, induz a atividade das caspases (BORTNER; HUGHES;
CIDLOWSKI, 1997), reforçando o papel da ouabaína em processos
apoptóticos.
Estudos recentes vêm demonstrando que a ouabaína também é capaz
de modular a maturação dos linfócitos B (LB), visto que foi observado uma
redução no número de LB maduros na medula óssea e sangue periférico,
durante o tratamento por três dias consecutivos com esse glicosídeo (DE
PAIVA et al., 2011). A ouabaína ainda é capaz de reduzir as diferentes
populações de LB no baço e em linfonodos mesentéricos (DA SILVA et al.,
2016). Sugere-se que estes efeitos sejam decorrentes do sinergismo da
ouabaína com glicocorticoides, pois os mesmos resultados não foram
evidenciados in vitro.
Foi descrito que ouabaína consegue interferir em diversos aspectos da
resposta inflamatória aguda induzida por distintos agentes flogísticos e que sua
atividade anti-edematogênica e antinociceptiva está relacionada à inibição da
ação de mediadores como prostaglandinas e bradicininas, sendo este efeito
25
independente da ação da histamina (DE VASCONCELOS et al., 2011). Além
disso, a ouabaína é capaz de modular etapas moleculares dos eventos que
levam a inflamação aguda característica da peritonite induzida por zimosan, ao
reduzir as citocinas IL-1β e TNF-α e o número de células que migram para o
sítio inflamado. Esses eventos estão relacionados com a capacidade desse
glicosídeo em reduzir a ativação do fator de trasncrição NF-κB (Figura 2)
(LEITE et al., 2015).
Figura 2. Efeitos imunomoduladores da ouabaína
Fonte: GALVÃO, 2016.
2.3 A inflamação alérgica pulmonar e os fenótipos da asma
A inflamação alérgica é resultante de uma resposta imune exacerbada
contra substâncias que, para a maioria das pessoas são inócuas. As doenças
alérgicas mais comuns incluem a asma alérgica, a rinite alérgica, a alergia
alimentar, a dermatite atópica e o angioedema (HOLGATE; POLOSA, 2008). A
26
etiologia dessas doenças ainda é complexa e está constantemente associada à
susceptibilidade genética de indivíduos a iniciar respostas mediadas por IgE e
estímulos ambientais específicos, condição denominada atopia (SICHERER;
SAMPSON, 2007; MURDOCH; LLOYD, 2010).
Os dados epidemiológicos mais recentes indicam que as doenças
alérgicas possuem prevalência, morbidade e mortalidade crescente em todo o
mundo. Estima-se que essas doenças afetem cerca de 20% da população
mundial (EDWARDS et al., 2012), sendo 6,3 milhões o número de brasileiros
diagnosticados com asma alérgica no Brasil (BRASIL, 2015).
O diagnóstico clínico da asma é sugerido pela presença de um ou mais
sintomas, como dispnéia, tosse crônica, sibilância, opressão ou desconforto
torácico, sobretudo à noite ou nas primeiras horas da manhã, caracterizando
um processo inflamatório pulmonar que pode, ou não, estar associado a um
quadro alérgico (BOUSQUET et al., 2007). As manifestações que sugerem
fortemente a identificação da asma são: a variabilidade dos sintomas, o
desencadeamento dos mesmos por irritantes inespecíficos (como fumaças,
odores fortes e exercício) ou por aero alérgenos (como ácaros e fungos) e a
piora dos sintomas à noite e a melhora espontânea, ou após o uso de
medicações específicas para asma (RAMOS et al., 2006; PACHER et al, 2007).
Embora esse diagnóstico em sua forma clássica (asma alérgica) de
apresentação não seja difícil, a confirmação deve ser feita por um método
objetivo, uma vez que os sinais e sintomas da asma não são exclusivos dessa
condição. Logo, dentre os testes diagnósticos disponíveis na prática clínica
temos: a espirometria (antes e após o uso de broncodilatador), os testes de
bronco provocação e as medidas seriadas de Pico de Fluxo Expiratório (PFE).
Em certos casos, a comprovação da reversibilidade da obstrução ao fluxo
aéreo pode ser demonstrada apenas com o teste terapêutico com corticoide
oral (SOUSA, 2011).
Ao longo os anos, a asma tinha sido considerada como uma única
doença, porém sua heterogeneidade de sintomas acabou promovendo o
conceito de que a patologia poderia apresentar vários fenótipos ou grupos de
características consistentes. Desta forma, os fenótipos acabaram sendo
27
constituídos principalmente por dois tipos: asma do tipo Th2 – asma precoce,
asma tardia e asma induzida pelo exercício – e Asma não-Th2 – asma induzida
pela obesidade e asma neutrofílica (WENZEL, 2012).
Sendo assim, o fenótipo da asma é classificado pelas características
clínicas de um indivíduo que decorre da interação do genótipo com fatores
ambientais, o “endotype”, que é a via de sinalização celular capaz que
promover o fenótipo (ANDERSON, 2008; LOTVALL et al., 2011). Para se
definir um fenótipo é necessário caracterizar a patofisiologia, clínica,
biomarcadores, genética e uma resposta à terapia medicamentosa (LOTVALL
et al., 2011).
A classificação desses fenótipos na asma começou décadas atrás com
os conceitos de asma extrínseca (alérgica) e intrínseca (não alérgica)
(RACKEMANN, 1947). Indivíduos com asma extrínseca apresentavam a
doença no início da vida e eram caracterizados atópicos (produzem IgEespecífica à alérgenos). Por outro lado, asma intrínseca estava relacionada a
indivíduos que desenvolviam a doença mais tarde na vida (após 40 anos de
idade), mas que comprovadamente não passou pela sensibilização alérgica
necessária para validar o fenótipo Th2 (WENZEL, 2006).
2.4 A fisiopatologia da asma alérgica Th2
Desde o surgimento do conceito de que a imunidade poderia ser dividida
em Th1 e Th2 (MOSMANN et al., 1986), a asma tem sido considerada do tipo
Th2, sendo associada à atopia e à alergia, bem como as reações de
hipersensibilidade do tipo imediata, com a presença de eosinófilos e resposta
positiva aos corticosteróides. Apesar de estudos recentes demonstrarem a
existência de diferentes fenótipos de asma, como dito anteriormente, ainda
ocorre à prevalência da asma tradicional tipo Th2 (cerca de 70%) (HALDAR et
al., 2008; MOORE et al., 2010).
A fisiopatogênese da asma associa-se a mecanismos moleculares e
celulares da inflamação das vias aéreas. Na asma alérgica tipo Th2, essa
28
inflamação é amplamente dependente da sensibilização pela IgE. O primeiro
contato do organismo com o alérgeno inalado – proteínas de ácaros presentes
na poeira doméstica, ou no pelo de animais e no polén de flores –, ocorre com
o auxílio do Complexo Maior de Histocompatibilidade classe II (MHC-II) e de
moléculas co-estimulatórias como CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) presente nas
células dendríticas. A apresentação e ativação dos linfócitos T auxiliares
indiferenciados
(LT
helper
–
Th0),
ao
estímulo
alérgico
dependem
essencialmente do MHC-II e da co-estimulação para a ativação dos linfócitos
Th0 e sua diferenciação em linfócitos do tipo Th2, (LLOYD et. al, 2010).
A ligação de CD80 ou CD86 ao CD28 em linfócitos Th0 aumenta a
localização nuclear do fator de transcrição NFAT1c (Nuclear factor of activated
T cell) e induz a expressão da proteína 3 ligante do GATA (GATA 3), o principal
regulador da diferenciação Th2 (RODRIGUEZ-PALMERO et al., 1999). Os
linfócitos Th2, por sua vez, passam a sintetizar citocinas que promovem a
diferenciação de linfócitos B em plasmócitos. Estudos para avaliação dos
fenótipos clínicos da asma alérgica demonstraram uma forte influência
hereditária e genética para este fenótipo de troca na asma Th2 (MOORE et al.,
2010). Sabe-se que os genes associados ao perfil imune Th2 envolvendo os
das citocinas IL-4, IL-13, IL-4Rα e do fator de transcrição GATA 3 apresentam
maior mutação neste fenótipo e esse grau é constantemente relacionado com a
severidade da inflamação pulmonar alérgica no quadro asmático (SLAGER et
al., 2011). Logo, os linfócitos B na presença de citocinas tais como IL-4 e IL-13
favorecem a troca de isotipo das imunoglobulinas produzidas pelo plasmócito
em IgE específica ao alérgeno sensibilizante (Figura 3) (WILLS-KARP, 1998).
A IL-4 é essencial para a proliferação e manutenção do perfil de
resposta imune adaptativa Th2, para a produção da imunoglobulina E (IgE) e
participa do processo de migração de eosinófilos do vaso sanguíneo para o
tecido. Sendo assim, a imunomodulação do perfil Th2 na asma é dependente
da presença de IL-4 (BRUSSELLE et al., 1994; CORRY et al., 1996).
29
Figura 3. Fisiopatologia da asma alérgica
Na asma alérgica, o processo de sensibilização se dá após a primeira exposição ao alérgeno
com o auxílio das células dendríticas e posterior produção de IgE (1). Durante o segundo
contato (2), os mastócitos degranulam e liberam diversos mediadores e citocinas responsáveis
pela eosionopoese e eosinofilia característica (3), hipertrofia e hiperplasia de células
musculares lisas, com posterior remodelamento das vias aéreas inferiores (4) e metaplasia das
células
caliciformes
com
o
aumento
da
produção
de
muco,
caracterizando
a
hiperresponsividade brônquica (5). Fonte: Adaptada de LAMBRECHT; HAMMAD, 2015.
A IL-13 participa do processo de hiper-reatividade brônquica, hiperplasia,
hipertrofia e metaplasia das células caliciformes, esse processo leva a
diferenciação das células epiteliais a produzirem muco espesso contendo as
mucinas MUC5AC e MUC5BC, causando obstrução do lúmen das vias aéreas
(WILLS-KARP et al., 1998).
A eosinofilia característica do processo inflamatório pulmonar alérgico é
decorrente da ação da IL-5, a qual participa do processo de maturação desses
30
leucócitos na medula óssea, a eosionopoese. O recrutamento de eosinófilos
para o tecido pulmonar e para a mucosa intersticial decorre pela atuação de
quimiocinas,
como
eotaxina
1,
2
e
3
(CCL11,
CCL24
e
CCL26,
respectivamente). Substâncias liberadas dos eosinófilos após sua ativação e
citólise, como a proteína catiônica eosinofílica (ECP) e proteína básica principal
(MBP), podem causar diretamente a hiper-reatividade brônquica devido a
danificação local das células do tecido pulmonar (COYLE et al., 1994; COYLE
et al., 1995; YOUSEFI; SIMON, 2012). Os eosinófilos ainda apresentam a
capacidade de apresentar os antígenos aos linfócitos T (VAN RIJT et al., 2003).
Posteriormente a fase de diferenciação Th2, as IgEs produzidas irão
ligar-se aos receptores de alta afinidade do tipo FcεRI, presentes na membrana
celular de mastócitos e de basófilos pulmonares, ricos em mediadores da
inflamação (HOGAN et al., 1998), favorecendo a diferenciação e ativação dos
eosinófilos pela ação da IL-5 (PALMQVIST et al., 2007). O contato
subsequente do mesmo alérgeno com a submucosa, promove uma ligação
cruzada entre o alérgeno e as IgEs presentes na superfície dos mastócitos e
basófilos,
através
de
uma
reação
antígeno-anticorpo,
provocando
a
degranulação destas células e a liberação de mediadores pré-formados
(histamina)
e
derivados
dos
fosfolipídios
de
membrana
(serotonina,
leucotrienos, prostaglandinas, fator de ativação plaquetária), capazes de
causar contração do músculo liso brônquico e inflamação da mucosa
respiratória ou seja, provocar broncoespasmo e edema (MCKAY, 2004;
BARNES, 2008; EDWARDS et al, 2012).
A resposta tardia ocorre como consequência da regulação positiva de
citocinas, quimiocinas e de moléculas de adesão que motivam a ativação e o
recrutamento de células inflamatórias, em particular dos linfócitos, basófilos e
eosinófilos e ainda neutrófilos e macrófagos para o local onde ocorreu o
contato. Os eosinófilos que infiltram a mucosa brônquica fixam também IgEs na
sua membrana e respondem ao contato com o alérgeno libertando mediadores
(SHAKOORY et al., 2004). O acúmulo de eosinófilos gera quimiocinas próinflamatórias e enzimas citolíticas incluindo a proteína catiônica eosinofílica e a
proteína básica principal que provocam ruptura da integridade do epitélio das
31
vias aéreas. Alguns asmáticos também apresentam além de eosinofilia,
neutrofilia na expectoração. Isto evidencia um processo inflamatório misto,
demonstrando que existem sim interações entre a ativação de outras vias
imunológicas e desvio para outros fenótipos, como o perfil imune Th17 com
produção de IL-17 e consequente migração neutrofílica (DOE et al., 2010).
Um equilíbrio entre os mecanismos pró e anti-inflamatórios nas
interfaces da mucosa epitelial – um dos locais de maior exposição a
microrganismos constitutivos e alérgenos –, permite uma protecção eficaz
contra agentes patogênicos e ainda evita respostas inflamatórias adversas
associadas à inflamação alérgica, tal como a asma (MALOY; POWRIE 2011).
Durante muitos anos, postulou-se que as respostas inflamatórias na asma
aconteciam devido a uma deficiência dos linfócitos T CD4+ reguladores naturais
ou induzidos (Tregs). Em camundongos, o resultado usual da inalação de
antígenos inócuos, tais como a OVA, é a tolerância, um processo mediado pela
indução de Tregs por Foxp3 (OSTROUKHOVA et al., 2012). De fato,
camundongos que não expressam Foxp3, apresentam uma elevação de CNS1
– uma proteína marcadora de processos inflamatórios –, bem como uma
escassez de Tregs e um consequente desenvolvimento de fortes respostas
Th2 (JOSEFOWICZ et al., 2012).
Os linfócitos T CD8+ também desempenham um papel imunoregulador
no processo inflamatório das vias aéreas na asma alérgica devido a inibição do
processo de sensibilização do organismo para alérgenos, atenuando a
resposta Th2 via inibição da produção de IgE e produção da citocina IFN-γ, a
qual, está envolvida na alteração da capacidade das células dendríticas
pulmonares (DCs) durante a apresentação antigênica polarizar os linfócitos T
CD4+ para o fenótipo Th1 (TANG et al., 2012). A depleção dos linfócitos T
CD8+ está envolvida com o aumento dos níveis séricos de IgE alérgeno específica, remodelamento e hiper-reatividade das vias aéreas (STOCK et al.,
2004; TSUCHIYA et al., 2009).
O perfil de resposta imune Th1, também desempenha um papel
fundamental na regulação das respostas celulares desencadeada pelo fenótipo
Th2. Esse controle é mediado por citocinas como IFN-γ, IL-2 e TNF-β. Onde o
32
IFN-γ, por exemplo, antagoniza a formação do fator de transcrição GATA 3 e,
portanto, reduz a polarização para geração das células Th2 (GAVETT et al.,
1995). No entanto, ao contrário das evidências clássicas de que o perfil Th1
necessariamente anula o perfil Th2, provou-se que em alguns casos a IL-18,
um indutor do IFN-γ – é capaz de aumentar a sensibilização alérgica, e
diversas características do processo infamatório pulmonar alérgico (WILD et
al., 1999).
33
34
3. JUSTIFICATIVA
35
A resposta inflamatória consiste na progressão de eventos iniciais até o
possível desenvolvimento de uma resposta crônica (MEDZHITOV, 2008). Já foi
demonstrado que a ouabaína é capaz de interferir em diversos modelos de
inflamação (RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2008; VASCONCELOS et
al., 2011; JACOB et al., 2013). No entanto, o seu papel na inflamação alérgica,
ainda não tinha sido investigado anteriormente
Neste trabalho, foi avaliada a capacidade da ouabaína estender os seus
efeitos na inflamação aguda para processos de inflamação mais tardios ou
crônicos, como a inflamação pulmonar alérgica induzida pela hipersensibilidade
à ovalbumina em camundongos BALB/c. Esta hipótese está embasada no
efeito da ouabaína na liberação de mediadores pelos mastócitos (SENOL et al.,
2007), na modulação da migração celular (LEITE et al., 2015), na maturação de
linfócitos B (DA SILVA et al., 2016) e na síntese de citocinas que também são
características da inflamação alérgica pulmonar (JACOB et al., 2013).
36
4. OBJETIVOS
37
4.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito da ouabaína no modelo de inflamação alérgica pulmonar
induzida por ovalbumina.
4.2 Objetivos específicos
 Avaliar a
migração de
células totais e
diferenciais (linfócitos,
macrófagos, eosinófilos e neutrófilos) no fluido do lavado broncoalveolar
(BALF) dos diferentes grupos de animais experimentais;
 Identificar, utilizando a citometria de fluxo, as subpopulações de
linfócitos T (CD3+) presentes no BALF dos animais sensibilizados e
desafiados com OVA e tratados ou não com ouabaína;
 Quantificar a produção de citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF dos
diferentes grupos de animais experimentais;
 Demonstrar os parâmetros histopatológicos que envolvem a migração
de leucócitos para o espaço perivascular e peribroncoalveolar;
vasodilatação; integridade epitelial; oclusão alveolar; hiperplasia das
células caliciformes e hiperprodução de muco;
 Quantificar o título de IgE-OVA específica nos soros dos animais dos
diferentes grupos experimentais.
38
5. MATERIAL E MÉTODOS
39
5.1 Material
5.1.1 Substâncias e sais
A lista de substâncias utilizadas encontra-se no apêndice A.
5.1.2 Aparelhos e equipamentos
A lista de aparelhos e equipamentos utilizados encontra-se no apêndice
B.
5.2 Métodos
5.2.1 Animais
Para a realização desse trabalho, todos os protocolos experimentais
foram aprovados pelo Conselho de Ética no Uso de Animais (CEUA) com
registro no. 100/2015 (ANEXO A). Camundongos da linhagem BALB/c fêmeas
com idade entre 6-8 semanas, pesando de 20 a 25g e ratas Wistar, pesando de
120 a 150g foram utilizados no protocolo experimental de inflamação pulmonar
alérgica induzida por ovalbumina. Os animais foram mantidos em gaiolas de
polipropileno a uma temperatura de 25 ± 2 ºC, em ciclos de claro e escuro de
12 horas com livre acesso à água e a uma dieta controlada, a base de ração do
tipo pellets (PURINA®) durante todo o período de experimentação.
Os animais utilizados nesse trabalho foram fornecidos pelo biotério Prof.
Dr.
Thomas
George
do
IPeFarM/UFPB.
Cada
grupo
experimental
compreendeu 6 animais. Para avaliação da reprodutibilidade dos resultados
foram realizadas três repetições de cada protocolo experimental.
5.2.2 Grupos experimentais
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais (n=6), o
grupo Salina – representando os animais saudáveis e não sensibilizados com
ovalbumina (OVA) –, o grupo OVA – representando os animais que
apresentaram alterações imunológicas devido a um quadro patológico alérgico
inflamatório pulmonar, devido a sensibilização com OVA –, o grupo DEXA –
animais sensibilizados com OVA e tratados com a droga padrão utilizada na
40
terapêutica da inflamação alérgica pulmonar, a dexametasona (2 mg/kg) – e o
grupo OUA – animais sensibilizados com OVA e tratados com a substância
teste ouabaína (0,56 mg/kg).
5.2.3 Protocolo experimental de inflamação pulmonar alérgica induzida
por OVA
O modelo de inflamação pulmonar alérgica induzida por OVA
desenvolvido neste presente trabalho, foi adaptado do protocolo experimental
de Lloyd e colaboradores (2000). Dois dias antes das sensibilizações (dias -1, 2, 10 e 11) e uma hora antes das mesmas (dias 0 e 12), os camundongos
foram pré-tratados com injeções intraperitoneais (i.p) contendo 200 µL de
ouabaína (0,56 mg/Kg) ou salina, a fim de sofrerem o mesmo estresse
provocado. Nos dias 0 e 12 do protocolo, os camundongos BALB/c fêmeas
foram sensibilizados com a injeção de 10μL/g via intraperitoneal (i.p.) de uma
suspensão contendo 50 μg/mL de OVA grade V (SIGMA Chemical, St. Louis,
MO) e 10 mg/mL de Al(OH)3 (VETEC, Rio de Janeiro, RJ) em solução salina.
No período compreendido entre os dias 19 a 22 do protocolo
experimental, os animais foram desafiados diariamente com aerossol de OVA
grade II (SIGMA Chemical, St. Louis, MO) a 5% em solução salina. Uma hora
antes de cada desafio com aerossol, o grupo DEXA foi tratado com 200 µL de
dexametasona (2 mg/kg), a fim de termos uma droga padrão para realizarmos
as posteriores comparações. Cada desafio foi realizado durante 30 minutos
diários em uma câmara fechada, sob um fluxo contínuo de aerossol, com o
auxílio de um nebulizador ultrassônico. No vigésimo terceiro dia – 24 horas
após o último desafio – os animais foram eutanasiados por overdose
anestésica (cetamina + xilazina), e posteriormente foram coletados os materiais
biológicos: sangue, fluido do lavado broncoalveolar (BALF) e tecido pulmonar
(pulmões) (Figura 4).
41
Figura 4. Esquema representativo do protocolo experimental de inflamação pulmonar
alérgica induzida por ovalbumina
.
5.2.4 Contagem de células totais e diferenciais no fluido do lavado
broncoalveolar (BALF)
Para quantificação do número total das células e do número de células
diferenciais, 24 horas após o último desafio, ocorrido no dia 22 do protocolo
experimental, os animais foram anestesiados, após esse procedimento foi
coletado o sangue pelo plexo braquial, em seguida a traqueia foi exposta com
auxílio de pinça e tesoura cirúrgica, para maior visualização dessa estrutura os
lobos da glândula tireoide foram retirados e então foi inserido um cateter
periférico IV-18G de poliuretano (Descarpack) para a coleta do BALF.
No cateter foi conectada uma seringa contendo 1 mL de HBSS -/- gelado,
este foi administrado na traqueia sentido pulmão. Inicialmente foi injetado
apenas 0,5 mL de HBSS-/- gelado, aguardou-se um tempo de 10 segundos e
então foi aspirado o mesmo volume, finalizando a primeira lavagem, em
seguida foi injetado todo o volume de HBSS-/- gelado contido na seringa de 1
mL, após 10 segundos foi aspirado, sendo realizado a segunda lavagem, o
BALF coletado foi transferido para um tubo tipo eppendorf e armazenado no
gelo, para preservar a viabilidade celular. Em seguida uma nova seringa foi
42
conectada ao cateter e foi injetado mais 0,5 mL de HBSS -/- gelado, repetindo a
espera de 10 segundos e aspirando todo o BALF contido no pulmão, realizando
assim três lavagens, o BALF foi transferido para o mesmo tubo eppendorf,
totalizando o BALF com 1,5 mL de HBSS-/- gelado.
Uma alíquota do BALF (10 μL) foi retirada e adicionada, na proporção
1:4, a 30 μL de solução de Turk (VETEC, Rio de Janeiro, RJ), que devido a sua
ação hemolítica, lisa as hemácias e cora os leucócitos do BALF. Foi então
retirado uma alíquota de 10 μL da solução de Turk com BALF e levada a
câmara hemocitométrica (Neubauer), sendo realizada a contagem das células
totais no microscópio óptico (40 X - BX40, OLYMPUS) (Figura 5). Após a
contagem das células totais ser realizada, o BALF foi centrifugado (centrífuga
CR422, JONAM) em 1000 rpm a 4ºC por 5 minutos. Os sobrenadantes foram
retirados e congelados à -20ºC para posterior dosagem de citocinas
(BEZERRA-SANTOS et al., 2006).
O pellet do BALF foi ressuspenso em 500µL de HBSS -/- gelado e
homogeneizado, em seguida foi retirado 200 μL do BALF e centrifugado na
citospin (FANEN, São Paulo, SP, Brasil Mod. 2400). As lâminas obtidas foram
fixadas e coradas pelo método panóptico (Kit Panóptico, Renylab), o qual se
baseia em três passos principais: a fixação das células na lâmina por ação de
um fixador, um corante básico cora de azul, estruturas ácidas como o núcleo
das células, e um corante ácido cora de rosa estruturas celulares básicas como
o citoplasma, então esses contrastes de coloração celular proporciona uma
visualização e contagem diferencial de células realizada por microscopia
óptica. Cada lâmina foi percorrida até a contagem de 100 células, utilizando
para isso a objetiva de imersão (100X), os leucócitos contados foram divididos
em quatro subpopulações: linfócitos; macrófagos; eosinófilos e neutrófilos
(Figura 5).
43
Figura 5. Esquema representativo da contagem de células totais e diferenciais
5.2.5 Diferenciação de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) e marcação
celular de subpopulações de linfócitos T CD3+ no BALF
A distinção das populações celulares heterogêneas utilizando a
citometria de fluxo é permitida pela avaliação dos parâmetros forward scattered
hight (FSC) e side scattered hight (SSC), os quais distinguem as células pelo
tamanho (difração da luz) e granularidade (difusão da luz) respectivamente. A
análise do tamanho dos linfócitos foi identificada por FSC lo/SSClo e a
granularidade dos granulócitos por SSChi (VAN RIJT et al., 2004), (Figura 6).
A análise por citometria de fluxo também foi realizada pela quantificação
da fluorescência dos marcadores celulares. A fluorescência verde emitida pelo
isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi detectada após passagem em filtro de
530nm (FL1). A fluorescência laranja da ficoeritrina (PE) foi detectada após
passagem em filtro de 585nm (FL2). O citômetro de fluxo (FACSCalibur II,
Becton Dickinson) utilizado foi equipado com laser de íons de argônio de
15mW em 488nm, resfriado a ar.
44
Figura 6. Esquema representativo das subpopulações de leucócitos, por tamanho e
granularidade celular, após análise por citometria de fluxo
O pellet do BALF foi utilizado para análise dos parâmetros FSC e SSC,
bem como para a expressão de CD3 pelas subpopulações de linfócitos
avaliadas. Para a marcação das moléculas de superfície das células utilizamos
o anticorpo anti-CD3 (FITC) (eBioscience). Para isto, 5 x 105 células/mL foram
centrifugadas a 1200 rpm. Para impedir ligações inespecíficas, as células foram
previamente mantidas na presença de soro de camundongo por 5 minutos e
posteriormente incubadas por 20 minutos a 4°C em 10 μL do anticorpo, na
concentração estipulada pelo fabricante. No fim da incubação, as células foram
lavadas e resuspensas em HBSS-/- para leitura em citômetro de fluxo.
5.2.6 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF
O sobrenadante do BALF armazenado a -20°C foi utilizado para a
quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ, onde foi utilizado o teste
imunoenzimático ELISA sanduíche, de acordo com o protocolo especificado no
kit do fabricante (eBioscience, Inc. Science Center Drive, San Diego, CA-USA).
45
De forma sucinta, o método de sanduíche, ou captura, é indicado para
identificação de antígenos (IL-4, IL-13 e IFN-γ), e este antígeno fica entre dois
anticorpos. Assim, um anticorpo primário específico ao antígeno (citocinas) é
adsorvido no poço da microplaca. Em seguida o BALF contendo o antígeno (IL4, IL-13 e IFN-γ) é adicionado. Depois o segundo anticorpo específico ao
antígeno marcado com uma enzima é adicionado. Esta enzima que reage com
o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos
poços indica a presença do antígeno (IL-4, IL-13 e IFN-γ), e os poços que não
mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão. A leitura foi
realizada em leitor de placa (MICROPLATE READER versa Max, tunable, BN
2529 Molecular Devices) a 450nm. As quantidades de citocinas foram
calculadas a partir de cada curva-padrão de cada citocina quantificada. A figura
8 demonstra esquematicamente e de forma geral a quantificação das citocinas
utilizando o ELISA sanduiche (Figura 7).
Figura 7. Esquema representativo da quantificação de citocinas pelo Ensaio
Imunoenzimático de ELISA sanduíche
46
5.2.7 Histologia pulmonar
Para avaliar as características histológicas pulmonar dos camundongos,
ambos os lóbulos direito e esquerdo do pulmão de cada animal foram
coletados 24 horas após o último desafio ocorrido no dia 22 do protocolo
experimental. Após anestesia e coleta do sangue pelo plexo braquial e BALF, o
tórax do animal foi aberto com auxílio de pinça e tesoura cirúrgica e então foi
realizada a perfusão cardíaca com administração de 20 mL de salina no
coração, no intuito de realizar uma lavagem do pulmão.
Para evitar a digestão do tecido por enzimas presentes no interior das
células (autólise) ou por enzimas bacterianas, os cortes foram colocados em
fixadores: formalina tamponada por 72 horas e logo após em álcool etílico 70%
até o momento do corte histológico. Esse procedimento mantem a integridade
do tecido, uma vez que os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao
interagirem com os grupos aminos das proteínas, por pontes de hidrogênio.
Os pulmões fixados foram inicialmente hidratados por imersões em água
corrente durante 24 horas. Após esse procedimento as amostras foram
desidratadas durante 1 hora em cada diferente concentração de álcool etílico
(70, 80, 90 e 100%). O processo de desidratação foi realizado porque a água
presente nos tecidos não é miscível em substâncias apolares como a parafina
para inclusão, além disso, a graduação nas concentrações de álcool é
imprescindível para que ocorra a desidratação homogênea dos tecidos,
evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.
Após a remoção do álcool, o tecido pulmonar passou por duas horas
imersos em xilol e em seguida em parafina líquida (parafina histológicaERVIEGAS, São Paulo, SP), mantida nesse estado com o auxílio de
dispensador de parafina a 56°C – ponto de fusão (CR422, JONAM) e
posteriormente, o tecido foi transferido para o molde contendo parafina líquida.
Poucos minutos após ser colocada na fôrma, à parafina solidificou e obteve-se
o "bloco" de parafina contento o fragmento do tecido em seu interior. Os blocos
de parafina assim formados, foram retirados das fôrmas e realizados cortes
histológicos com espessura de 5μm, com o auxílio de um micrótomo (SP Labor
47
300). Os cortes foram colocados em banho-maria (38 – 39°C), sendo retirados
após, com lâminas. A secagem das lâminas foi realizada em temperatura
ambiente.
Com os cortes aderidos nas lâminas, estes foram corados com
Hematoxilina-Eosina (HE) ou Ácido Periódico de Schiff (PAS) e depois foi
realizado a montagem das lâminas. Como meio de montagem foi utilizado o
bálsamo do Canadá. Cada grupo de animais teve três lâminas coradas em
cada coloração (Figura 8).
Figura 8. Esquema representativo da preparação do corte histológico pulmonar
5.2.7.1 Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE)
A técnica hematoxilina-eosina (HE) é clássica, dicrômica e de alta
finalidade diagnóstica: hematoxilina, corante básico que cora componentes
ácidos como os núcleos de todas as células, e eosina corante ácido que cora
componentes básicos como o citoplasma de todas as células, proporcionando
uma observação geral de todas as estruturas pulmonares. As lâminas foram
inicialmente desparafinizadas por imersão no xilol, o primeiro xilol com duração
de 10 min e o segundo xilol com duração de 10 min. Em seguida, as lâminas
passaram pelo processo de hidratação em álcool absoluto, o primeiro álcool
por 5 min e o segundo álcool por 5 min.
48
As lâminas foram colocadas sucessivamente em álcool 90, 80 e 70% por
5 min e água destilada por 1 min. Então, foram imersas na hematoxilina por 30
segundos, mergulhadas rapidamente em água destilada, depois em água
destilada novamente, com a finalidade de retirar o excesso de corante. Em
seguida, as lâminas foram colocadas no corante eosina, por 5 min, e em
seguida desidratadas com álcool 80, 90% e absoluto 3 min em cada. O material
histológico passou pelo banho em xilol por 10 min, onde o primeiro xilol foi por
5 min e o segundo xilol por mais 5 min. Após coloração foi colocado sobre o
corte o bálsamo do Canadá e uma lamínula. Depois, com auxílio de uma pinça,
foram retiradas as bolhas e a lamínula foi comprimida com firmeza sobre o
corte para o espalhamento do bálsamo. Após 24h foram retirados os excessos
de bálsamo para acabamento do preparo das lâminas. Nas lâminas coradas
pela hematoxilina-eosina são observados em azul escuro, ou roxo os núcleos,
em rosa o citoplasma e em vermelho as hemácias.
Para análise morfológica dos cortes corados pela hematoxilina e eosina
(HE), foi criado um score (pontuação) de 0 – 7, onde este é quantificado de
acordo com a lesão evidenciada. As lesões evidenciadas foram vasodilatação
(presente (1) ou ausente (0)); manutenção da integridade bronquiolar
(inalterada (0), parcial (1) ou total (2)); migração de células, onde zero (0)
significa ausência de migração, (1) poucas células 0-9 células por campo, (2)
mais de 10 células por campo e (3) formação de “ninhos” de células
perivascular e peribronquiolar. Por fim, como parte do score avaliou-se a
congestão (presente (1) ou ausente (0)). Quando presente soma-se o número
referente a análise, quando ausente, 0. Parâmetros avaliados em 5 campos da
lâmina (COSTA et al., 2008; ZOU, 2014).
5.2.7.2 Coloração P.A.S. (Ácido Periódico – Schiff)
O ácido periódico de Schiff revela glicogênio e mucina intracelular. As
lâminas foram inicialmente desparafinadas por imersão no xilol durante 10 min
hidratadas em álcool absoluto, álcool 90, 80 e 70% por 5 min e água destilada
por 1 min. Depois foram colocadas no ácido periódico por 10 min, na água
destilada por 1 min e no reativo de Schiff por 25 min, quando retiradas foram
49
colocadas em 3 banhos sulfurosos de 2 min cada e mergulhadas 1 min em
água. Em seguida, as lâminas foram colocadas em hematoxilina por 5 min e
mergulhadas em água. Durante 6 min foram desidratadas com álcool 80, 90%
e absoluto sendo 2 min em cada álcool. Para clareamento foi utilizado xilol, as
lâminas foram imersas no primeiro xilol por 5 min e no segundo xilol por 5 min.
Nas lâminas coradas por P.A.S. é observado em bolina a presença de
glicogênio ou polissacarídeos neutros (contendo grupos 1,2 glicol), mucina
(glicoproteína, principal constituinte do muco), proteoglicanos não se coram, os
núcleos e os citoplasmas se coram em roxo claro. Nos cortes analisados por
PAS a análise foi quantitativa e realizada a partir do software KS 300.
5.2.8 Dosagem do título de IgE OVA-específica
O título de IgE OVA-específica foi determinado pelo teste de anafilaxia
cutânea passiva (PCA). Inicialmente 24 horas após o último desafio, no dia 23
do protocolo experimental. Os animais foram anestesiados e então realizada
assepsia com álcool 70% em seguida o plexo braquial foi exposto com auxílio
de pinça e tesoura cirúrgica e foi coletado cerca de 0,5 a 1mL de sangue com o
auxílio de uma pipeta Pasteur, esse foi armazenado em tubos do tipo
eppendorf inclinados a 45º e estocados em geladeira por cerca de 4 horas,
para facilitar formação dos coágulos e coleta dos soros, realizada após a
centrifugação do sangue em 1500 RPM a 4°C por 10 minutos. Os soros foram
armazenados a –20ºC para serem utilizados no PCA.
Os soros armazenados foram diluídos em salina. Para cada amostra foi
realizada oito diluições seriadas (1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1.024; 1:2.048;
1:4.096 e 1:8.192) e um volume de 50 μL dessas amostras foi injetado por via
intradérmica (i.d.) em oito diferentes sítios do dorso de ratas Wistar depiladas e
previamente anestesiadas. Após 24 horas, foi realizado o desafio antigênico
nas caudas das ratas pela administração intravenosa (i.v.) de 0,5 mL/animal na
veia da cauda de uma solução contendo 10 mg/mL do corante Azul de Evans a
1% (VETEC, Rio de Janeiro, RJ) e 4 mg/mL de OVA grade V. Após 30 minutos,
os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical, e os diâmetros das
manchas formadas no dorso foram medidas com o auxílio de uma régua
50
milimétrica de 20cm. O título foi determinado pela maior diluição do soro capaz
de promover uma mancha mensurável  5 mm (Figura 9) (COSTA et al., 2008).
Figura 9. Esquema representativo da dosagem de IgE OVA-específica pelo método de
Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA)
5.2.9 Análise estatística
Todos os dados foram analisados pelo programa Graph Pad Prism©
versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.A.). Para analisar os
dados obtidos por citometria de fluxo, utilizamos o FlowJo software.
Todos os resultados obtidos foram expressos como média ± erro padrão
da média (e.p.m.) e analisados estatisticamente empregando-se o ANOVA oneway seguido do teste de Tukey, onde foram considerados significativos os
valores de p < 0,05.
51
6. RESULTADOS
52
6.1 Efeito da ouabaína na migração de células totais e diferenciais para o
fluido do lavado broncoalveolar (BALF)
No modelo de inflamação alérgica pulmonar induzida por ovalbumina
(OVA), espera-se um aumento na migração celular para o sítio inflamado
(pulmões) em decorrência das sensibilizações e posteriores desafios (segundo
contato)
realizados
durante
o
protocolo
(LLOYD
et
al.,
2000).
As
sensibilizações e desafios com o alérgeno proteico aumentaram em 69% (p <
0,001) o número de leucócitos totais no espaço broncoalveolar do grupo OVA
quando comparado ao grupo salina (Gráfico 1A). Na comparação da migração
celular ocorrida nos grupos pré-tratados com a ouabaína (0,56 mg/kg) em
relação à ocorrida no grupo OVA, observou-se que o pré-tratamento com a
substância teste foi eficaz em reduzir 60% (p < 0,01) a migração celular para o
espaço
broncoalveolar
(Gráfico
1A),
assim
como
a
droga
padrão
dexametasona (2 mg/kg) no grupo DEXA, 66% (p < 0,01) (Gráfico 1A).
Na análise dos leucócitos diferenciais, observou-se que o grupo OVA
apresentou um aumento significante no número de linfócitos, macrófagos,
eosinófilos e neutrófilos (p < 0,001) no BALF em comparação com o grupo
salina (Gráfico 1B, C, D e E). Já com relação à migração de leucócitos
diferenciais na comparação entre os grupos tratados com OUA e o grupo OVA,
nota-se uma diminuição de polimorfonucleares como, linfócitos (p < 0,01),
eosinófilos (p < 0,001) e neutrófilos (p < 0,01) (Gráfico 1B, D e E), porém a
ouabaína não foi capaz de reduzir o número de macrófagos (Gráfico 1C). O
mesmo foi observado nas comparações entre os grupos DEXA e OVA.
53
Gráfico 1. Efeito da ouabaína na migração de leucócitos totais e diferenciais (linfócitos,
macrófagos, eosinófilos e neutrófilos) para o espaço broncoalveolar na inflamação
alérgica pulmonar experimental induzida por OVA
A
Células totais x 10 6/ mL
0.8
###
0.6
0.4
**
0.2
**
0.0
lin
Sa
a
VA
O
D
A
EX
B
0.25
##
0.04
0.03
0.02
0.01
**
**
***
0.20
#
0.15
0.10
0.05
D
A
U
O
D
EX
A
VA
O
U
Sa
lin
A
a
0.00
O
D
EX
A
VA
O
Sa
lin
a
0.00
Macrófagos x 10 6/ mL
E
0.3
**
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com OVA e prétratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das sensibilizações
e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1 hora antes de
cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e a migração de
A
**
0.0
U
A
U
O
EX
A
D
VA
O
a
Sa
lin
***
O
***
0.00
0.1
EX
A
0.05
D
0.10
0.2
VA
0.15
##
O
Neutrófilos x 10 6/ mL
###
a
0.20
Sa
lin
Linfócitos x 10 6/ mL
A
C
0.05
Eosinófilos x 10 6/ mL
U
O
54
leucócitos foi quantificada em microscopia óptica comum. A. Células Totais; B. Linfócitos; C.
Macrófagos; D. Eosinófilos e E. Neutrófilos. Os resultados foram expressos como média ±
e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por ANOVA one-way, seguida do teste de
#
Tukey. Valores de p < 0,05,
##
p < 0,01 e
###
p < 0,001 foram considerados significativos quando
comparados com o grupo salina, e **p < 0,01 e ***p < 0,001 foram considerados significativos
quando comparados com o grupo OVA.
55
6.2 Efeito da ouabaína no percentual de granulócitos no BALF na
inflamação alérgica pulmonar analisado por citometria de fluxo
O grupo OVA apresentou aumento significativo de 88,8% (p < 0,001) na
migração celular de granulócitos – representados por eosinófilos e neutrófilos –
para o espaço broncoalveolar, em relação ao grupo salina (Gráficos 2 e 3,
respectivamente). Na comparação da migração celular de granulócitos ocorrida
nos grupos pré-tratados com ouabaína em relação à ocorrida no grupo OVA,
observou-se uma redução de 41,1% (p < 0,05), abaixo da redução de 64,3% (p
< 0,01) observada no tratamento com a droga padrão dexametasona (Gráficos
2 e 3, respectivamente). Estes dados corroboram a modulação da migração de
eosinófilos e neutrófilos mencionados, na contagem diferencial de células nas
lâminas produzidas a partir do BALF.
56
Gráfico 2. Efeito da ouabaína na porcentagem de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos)
no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
Camundongos BALB/c fêmeas (n = 6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina
(OVA) e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e após
sua centrifugação, o pellet foi utilizado para classificação dos leucócitos pela análise do
tamanho celular (FSC- forward scatter, por difração de luz) e granularidade ou complexidade
citoplasmática (SSC- side scatter, por difusão de luz) na citometria de fluxo. As regiões
demarcadas fazem referência ao tamanho celular e complexidade intracelular característica
dos granulócitos (eosinófilos e neutrófilos). As figuras foram analisadas pelo programa FlowJo
software. Os resultados são representativos de 3 experimentos.
57
Gráfico 3. Percentual de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) no BALF após o
tratamento com ouabaína na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
20
Células (%) em R1
###
###
15
*
10
**
5
0
lin
Sa
a
O
VA
D
A
EX
O
U
A
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com OVA e prétratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das sensibilizações
e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1 hora antes de
cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e após sua
centrifugação, o pellet foi utilizado para classificação dos leucócitos pela análise do tamanho
celular (FSC-
forward scatter, por difração de luz) e granularidade ou complexidade
citoplasmática (SSC- side scatter, por difusão de luz) na citometria de fluxo. Os resultados
foram expressos como média ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por ANOVA
one-way, seguida do teste de Tukey. Valores
###
p < 0,001 foram considerados significativos
quando comparados com o grupo salina, e *p < 0,05; **p < 0,01 foram considerados
significativos quando comparados com o grupo OVA.
58
6.3 Efeito da ouabaína sob a subpopulação de linfócitos T CD3+ presentes
no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
Para demonstrar o efeito da ouabaína sob a subpopulação de linfócitos
T CD3+, selecionamos um dot plot representativo (um experimento – n= 6) do
grupo OVA (Gráfico 4A). Um histograma representando a intensidade de
fluorescência do anticorpo anti-CD3, explicita a migração desta subpopulação
de linfócitos para o espaço broncoalveolar (Gráfico 4B). O grupo OVA
apresentou um aumento de 37% (p < 0,001) na migração celular de linfócitos T
CD3+ para o espaço broncoalveolar, em relação ao grupo salina (Gráfico 4C).
O pré-tratamento com ouabaína reduziu o número de linfócitos T CD3 + em 15%
(p < 0,05) quando comparado ao grupo OVA (Gráfico 4C). A droga padrão
dexametasona diminuiu em 38% (p < 0,001) a migração celular de linfócitos T
CD3+ (Gráfico 4C).
59
Gráfico 4. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na porcentagem de linfócitos T CD3
+
no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
A
B
C
% Células CD3+ (M1)
80
###
60
*
***
40
20
0
lin
Sa
a
VA
O
D
A
EX
U
A
O
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)
e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e após
sua centrifugação, o pellet foi utilizado para quantificar os linfócitos T CD3
+
através da
intensidade de fluorescência, captada pela marcação de antígenos de superfície com
anticorpos monoclonais específicos ligados a fluorocromos pela técnica de citometria de fluxo.
A região demarcada do dot plot representativo é referente a população de linfócitos de um
grupo OVA. O histograma representa a intensidade de fluorescência da marcação com antiCD3 em um experimento. As figuras foram analisadas pelo programa FlowJo software. A
diferença entre os grupos foi analisada por ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey.
Valores
###
p< 0,001 foram considerados significativos quando comparados com o grupo salina,
e *p< 0,05; ***p< 0,001 foram considerados significativos quando comparados com o grupo
OVA.
60
6.4 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF na inflamação
alérgica pulmonar induzida por OVA
Citocinas clássicas do perfil Th2, IL-4 e IL-13 (Gráfico 5A e B),
apresentaram-se em níveis elevados (p < 0,001) no grupo OVA, em
comparação aos níveis das mesmas no grupo salina. O pré-tratamento com
ouabaína (0,56 mg/kg) foi capaz de reduzir os níveis de IL-4 (37,7%) e IL-13
(30%) (p < 0,05) (Gráfico 5 A e B). Os níveis de IFN-γ não se mostraram
elevados no grupo OVA em comparação ao grupo salina, comprovando a
polarização da resposta para o fenótipo Th2, já que o IFN-γ é uma citocina de
perfil Th1 (ELENKOV; CHROUSOS, 1999) (Gráfico 5C).
A droga padrão dexametasona reduziu, como esperado, os níveis de
todas as citocinas analisadas (Gráfico 5A, B e C).
61
Gráfico 5. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na produção das citocinas IL-13, IL-4 e
IFN-γ no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
A
B
###
##
90
IL-13 (pg/mL)
IL-4 (pg/mL)
#
80
120
*
60
30
***
60
*
40
**
20
0
0
a
lin
a
S
O
VA
D
A
EX
O
U
A
lin
Sa
a
O
VA
D
A
EX
O
C
IFN- (pg/mL)
100
80
60
40
**
20
A
O
U
EX
A
D
VA
O
Sa
lin
a
0
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)
e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e
centrifugado. O sobrenadante foi coletado e utilizado o ensaio imunoenzimático (ELISA
sanduíche) para quantificação das concentrações das citocinas. A. IL-13; B. IL-4 e C. IFN-γ. Os
resultados foram expressos como média ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por
#
ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey. Valores de p < 0,05 e
###
p < 0,001 foram
considerados significativos quando comparados com o grupo salina, e *p < 0,05, **p < 0,01 e
***p < 0,001 foram considerados significativos quando comparados com o grupo OVA.
U
A
62
6.5 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na
inflamação alérgica pulmonar induzia por OVA corados com hematoxilinaeosina (HE)
A figura 10 (A – D) mostra o efeito morfológico do pré-tratamento com
ouabaína (0,56 mg/kg) ou tratamento com dexametasona (2 mg/kg) sob o
modelo experimental de inflamação alérgica pulmonar. Nas imagens coradas
pela Hematoxilina-Eosina, observadas em aumento total de 20x nota-se que o
animal saudável, salina (A), não apresentou alterações morfológicas na
constituição do parênquima pulmonar. Entretanto, no animal doente, OVA (B),
observou-se evidências de parâmetros inflamatórios como migração de células
com formação de anéis (seta), infiltrado celular (bola), perda da integridade
epitelial bronquiolar (raio).
A alteração histológica é demonstrada no score histológico no gráfico 6,
onde o animal OVA evidenciou uma inflamação tecidual (p < 0,001) em relação
ao animal salina. Nos animais pré-tratados com ouabaína (D) e tratados com
dexametasona (C) observou-se redução da migração de células inflamatórias
(seta), que funciona como padrão inflamatório do modelo, corroborando com os
dados anteriores que mostraram as duas substâncias reduzindo os níveis de
IL-4, citocina essencial para proliferação e manutenção do fenótipo Th2, no
processo inflamatório pulmonar (BRUSSELLE et al., 1994). Os tratamentos
foram capazes de reduzir todos os parâmetros inflamatórios analisados, como
explicita os dados do score histológico inflamatório (Gráfico 6).
63
Figura 10. Análise histopatológica do efeito da ouabaína sob o modelo de inflamação
alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com hematoxilina-eosina (HE)
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)
e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último
desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e
coloração por HE. Os parâmetros inflamatórios observados foram a migração de células com
formação de ninhos no espaço perivascular e peribronquiolar (seta), infiltrado celular (bola),
perda da integridade epitelial bronquiolar (raio). Tecidos corados por hematoxilina e eosina,
vistos em microscópio óptico comum em aumento total de 20x.
64
Gráfico 6. Score histológico de parâmetros inflamatórios no modelo de inflamação
alérgica pulmonar induzida por OVA
Score Histológico
8
###
6
4
2
***
***
0
lin
Sa
a
O
VA
D
A
EX
O
U
A
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)
e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/Kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último
desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e
coloração por HE. Os parâmetros inflamatórios observados foram a migração de células no
espaço perivascular e peribronquiolar, vasodilatação, manutenção da integridade epitelial
bronquiolar e congestão. Tecidos vistos em microscópio óptico comum em aumento total de
20x. Os resultados foram expressos como média ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi
analisada por ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey. Valores de
###
p < 0,001 foram
considerados significativos quando comparados com o grupo salina e ***p < 0,001 foram
considerados significativos quando comparados com o grupo OVA.
65
6.6 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na
inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA corados com P.A.S.
(Ácido Periódico de Schiff)
A figura 11 (A – D) mostra a análise histopatológica do pré-tratamento
com ouabaína (0,56 mg/Kg) ou tratamento com dexametasona (2 mg/kg) sob o
modelo experimental de inflamação alérgica pulmonar. Nas imagens de tecidos
coradas pelo P.A.S., observadas em um aumento total de 40x nota-se que o
animal salina (A) – saudável –, não apresenta alterações morfológicas na
constituição do parênquima pulmonar como a hipertrofia ou hiperplasia de
células caliciformes. Por outro lado, o animal OVA (B), apresenta evidências do
aumento dessas células (seta), bem como alterações hiperplásicas.
Nos
animais
pré-tratados
com
ouabaína
(D)
e
tratados
com
dexametasona (C) parâmetros morfológicos determinados pela coloração PAS,
foram alterados: diminuição da hiperplasia e hipertrofia das células caliciformes
e hiperprodução de muco em comparação com o grupo OVA. Esta redução, se
justifica também pela ação das substâncias na diminuição nos níveis de IL-13,
a principal citocina ligada ao processo de hiper-reatividade brônquica,
hiperplasia, hipertrofia e metaplasia das células caliciformes, no modelo
experimental utilizado (WILLS-KARP et al., 1998).
66
Figura 11. Efeito da ouabaína sobre as alterações histopatológicas no modelo de
inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com coloração P.A.S.
(Ácido Periódico de Schiff)
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)
e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/Kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último
desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e
coloração por P.A.S. (Ácido Periódico de Schiff). O parâmetro observado é a hipertrofia e
hiperplasia de células caliciformes, evidenciadas pela coloração de PAS. Tecidos corados por
P.A.S., vistos em microscópio óptico comum em aumento total de 40x.
67
Gráfico 7. Análise quantitativa da presença de muco na região bronquiolar em cortes
histológicos no modelo de inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA
10000
Pixel/m2
8000
6000
4000
2000
A
U
O
EX
A
D
VA
O
Sa
lin
a
0
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)
e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último
desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e
2
coloração por PAS. Foi realizada a análise da intensidade de coloração do PAS em pixel/µm
nos diferentes grupos de tratamento. As análises foram realizadas através do software KS300.
68
6.7 Efeito da ouabaína sob o título de IgE-OVA específica na inflamação
alérgica pulmonar experimental
Como esperado, nos soros dos animais do grupo salina não foi
detectado IgE, pois os mesmos não foram sensibilizados (Gráfico 8). O título de
IgE-OVA especifica foi maior que 1024 no grupo OVA. No grupo
dexametasona, houve uma redução no título de IgE (256) quando comparado
com o grupo OVA (Gráfico 8). O pré-tratamento com a ouabaína também foi
capaz de reduzir esse título para 512 (p < 0,01), quando comparado ao grupo
OVA (Gráfico 8).
Log2 IgE-OVA específica
Gráfico 8. Efeito da ouabaína no título de IgE-OVA específica no modelo de inflamação
alérgica pulmonar induzida por OVA
11
###
10
9
**
***
8
7
lin
Sa
a
VA
O
D
A
EX
U
A
O
Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)
e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das
sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1
hora antes de cada desafio. Os soros dos animais foram coletados 24h após o último desafio e
título de IgE OVA-específica, determinado pelo teste de PCA. Os resultados foram expressos
como média do log2 do título de IgE ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por
###
ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey. Valores de
p < 0,001 foram considerados
significativos quando comparados com o grupo salina e ***p < 0,001 foram considerados
significativos quando comparados com o grupo OVA.
69
70
7. DISCUSSÃO
71
O presente trabalho demonstrou que a ouabaína é capaz de modular
diversos aspectos da resposta inflamatória desencadeada na inflamação
alérgica pulmonar induzida por OVA, incluindo migração celular para os
pulmões, tendo eosinófilos, neutrófilos e linfócitos T CD3+ como principais
exemplos dos leucócitos modulados; níveis de citocinas (IL-4 e IL-13); aspectos
histopatológicos, como infiltrado peribronquiolar, perivascular e produção de
muco, e o título de IgE-OVA específica.
Por muitos anos, acreditou-se que os efeitos da ouabaína estendiam-se
apenas
as
suas
caracteristicas
clássicas
de
glicosídeo
cardiotônico
(BLAUSTEIN,1993) e este hormônio só desempenhava, portanto, seu
mecanismo como inibidora da Na+/K+-ATPase (LINGREL, 2010). No entanto,
nosso grupo tem evidenciado, que o tratamento por três dias consecutivos com
a ouabaína na dose de 0,56 mg/kg apresenta uma atividade anti-inflamatória e
anti-nociceptiva dependente de mediadores como a prostaglandina e a
bradicinina (DE VASCONCELOS et al., 2011), modula negativamente a
inflamação aguda peritoneal em modelo experimental de leishmaniose causada
pela Leishmania (L.) amazonensis, ao reduzir a migração celular e os níveis de
citocinas pró-inflamatórias características da infecção, como o TNF-α e o IFN-γ
(JACOB et al., 2012).
Recentemente, foi descrito que a ouabaína também apresenta a
capacidade de reduzir a resposta inflamatória na peritonite induzida por
zimosan, diminuindo não só a migração celular, como a permeabilidade
vascular, ao inibir a ativação do NF-κB, um fator de transcrição essencial para
a produção das citocinas IL-1β e TNF-α (LEITE et al., 2015), ambas integrantes
desse modelo de peritonite. Além disso, sabe-se que a ouabaína é capaz de
modular mecanismos celulares de mastócitos (LAGO et al., 2001; SENOL et
al., 2007), células fundamentais para o desencadeamento, por exemplo, das
respostas inflamatórias alérgicas pulmonares (BARNES, 2008).
Os modelos de inflamação alérgica pulmonar frequentemente utilizam a
ovalbumina (OVA) como o antígeno sensibilizante. O processo envolve a
sensibilização sistêmica com o auxílio de um adjuvante (Al(OH) 3) (KUMAR;
HERBERT; FOSTER, 2008). A via de sensibilização e escolha do antígeno
72
pode oferecer diferentes perspectivas sobre a fisiopatogênese da inflamação
nas vias aéreas inferiores. Por exemplo, a OVA tem a vantagem de estar
disponível em formas relativamente puras, com níveis muito baixos de
endotoxinas
contaminantes
de
preparações
antigênicas
convencionais,
permitindo assim, a indução de uma resposta predominante do fenótipo Th2
(HERBERT et al., 2010).
Neste modelo, fomos capazes de detectar que o pré-tratamento com a
ouabaína (0,56 mg/kg) por três dias (DE VASCONCELOS et al., 2011), antes
das sensibilizações, reduziu o número de células totais presentes no fluido do
lavado broncoalveolar (BALF) (Gráfico 1A), bem como o número de
subpopulações específicas como granulócitos (eosinófilos e neutrófilos)
(Gráfico 1 D e E; Gráfico 2 e Gráfico 3) e linfócitos (Gráfico 1B e Gráfico 4).
Durante o processo inflamatório alérgico pulmonar, o segundo contato
com o alérgeno, provoca a degranulação de mastócitos (HOGAN et al., 1998) e
o posterior recrutamento de várias células, como os eosinófilos (PALMQVIST et
al., 2007), neutrófilos (SHAW et al., 2007) e linfócitos (SIEGLE et al., 2006)
para a região da inflamação. Estas células podem liberar moléculas
inflamatórias, como citocinas, quimiocinas, ROS e enzimas proteolíticas, que
podem causar danos teciduais (SERHAN; SAVILL, 2005). Assim, a regulação
do recrutamento destas células e sua depuração são processos críticos na
inflamação (MANNA; SREENIVASAN; SARKAR, 2006).
O tratamento medicamentoso da asma brônquica – um dos tipos de
inflamação alérgica pulmonar – se baseia no uso de corticoides, resultando na
modulação negativa de eosinófilos, que sofrem apoptose (WOOLLEY et al.,
1996). Sabendo que a ouabaína apresenta propriedades químico estruturais
semelhantes a de outros corticosteroides, (FERRANDI et al., 1997; SCHONER,
2000) bem como é capaz de induzir apoptose (ORLOV et al, 1999) e de
amplificar os efeitos da morte celular induzida por FAS (NOBEL et al, 2000,
BORTNER et al, 2001), podemos sugerir que sua ação na diminuição da
eosinofilia (Gráfico 1D) no BALF, pode estar relacionada as características
citadas anteriormente, apesar de não ter sido identificada a presença de
células com perfil apoptótico nas amostras estudadas.
73
A neutrofilia (SHAW et al., 2007; WAKASHIN et al., 2008), um dos
pontos da inflamação das vias aéreas inferiores, que cada vez mais fica em
evidência nos modelos de inflamação alégica pulmonar (BELLINI et al., 2011;
BRANDT et al., 2013), foi reduzida pelo pré-tratamendo com a ouabaína no
nosso modelo (Gráfico 1E). Estudos, demonstraram que a ouabaína é capaz
de diminuir a migração de neutrófilos na peritonite induzida por concanavalina
A (VASCONCELOS et al., 2011) e por zimosan (LEITE et al., 2015). Ademais,
foi observado que, em animais infectados com Streptococcus pneumoniae,
uma bactéria gram-positiva, a digoxina, um glicosídeo cardíaco, foi capaz de
inibir a migração de neutrófilos, impedindo assim, o desenvolvimento da
pneumonia pneumocócica no hospedeiro (ESPOSITO; POIRIER; CLARK,
1989), corroborando os nossos achados.
Os linfócitos T CD3+ tem um papel fundamental na patogênese da asma
e no desenvolvimento do perfil Th2 que modula o processo inflamatório
alérgico crônico das vias aéreas (JOSEFOWICZ et al., 2012). As citocinas
produzidas pelos linfócitos do fenótipo Th2 (IL-4, IL-13 e IL-5) promovem a
produção de IgE, eosinofilia sérica e tecidual e hiperreativade das vias áreas,
uma vez que, os níveis destas citocinas estão aumentados no BALF de
pacientes que desenvolvel algum quadro inflamatório pulmonar (BLOEMEN et
al., 2007; FINKELMAN et al., 2010; PORTER et al., 2011).
Ao avaliar as subpopulações de linfócitos T CD3+ no BALF, os animais
do grupo OVA apresentaram um aumento na migração desses linfócitos em
relação ao grupo salina (Gráfico 4), corroborando assim a quantificação de
linfócitos, e demonstrando a presença e atuação destes leucócitos na
imunomodulação do processo inflamatorio das vias aéreas característico da
asma alérgica (HUANG et al., 2009). O pré-tratamento com a ouabaína na
dose de 0,56 mg/Kg reduziu a migração de linfócitos CD3+, bem como o
tratamendo com a dexametosona (Gráfico 4).
A ouabaína é capaz de inibir a proliferação de timócitos ativados por
concanavalina A (SZAMEL et al, 1981) e induzir atrofia tímica em sinergismo
com outros corticoides como a hidrocortisona (RODRIGUES-MASCARENHAS
et al., 2006). Ela também reduz a fosofrilação de p38 e consequentemente os
74
níveis de NFATc1, ambas moléculas de vias de sinalização independentes de
alterações iônicas e absolutamente indispensáveis para a translocação do
receptor de linfócitos T na resposta imunitária (RODRIGUES-MASCARENHAS
et al., 2008). Elucidado estes dois pontos, podemos sugerir que a ação da
ouabaína na redução das subpopulações de linfóctios T CD3 + está relacionada
com os eventos moleculares de maturação (RODRIGUES-MASCARENHAS et
al., 2006) e resposta celular (RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2008) das
células T, que pode estar sendo inibidos pela ouabaína.
O aspecto imunológico da asma induzida no modelo de inflamação
alérgica pulmonar utilizado nesse estudo caracteriza-se por apresentar um
perfil de resposta imune tipo 2 com preponderância de células do fenótipo Th2.
Esse fenótipo celular é caracterizado por produzir citocinas tais como IL-4, IL-5,
IL-13 preferencialmente e ser dependente de IgE e IgG1 –imunoglobilinas
consideradas marcadores fenotípicos da asma alérgica (COSTA et al., 2008). A
produção dessas imunoglobulinas é dependente das citocinas IL-4 e IL-13
(TODO-BOM e PINTO, 2006) e elevados níveis de IgE estão associados com
reações alérgicas do tipo imediato e gravidade da doença (COSTA et al.,
2008).
As reduções nos níveis de IL-4 e IL-13 pelo pré-tratamento com a
ouabaína, observadas neste presente trabalho (Gráfico 5A e B), podem estar
relacionadas tanto com a capacidade desse glicosídeo em reduzir as
subpopulações de linfócitos T CD3+, células essenciais para a manutenção do
processo inflamatório (RODRIGUEZ-PALMERO et al., 1999; SLAGER et al.,
2011), quanto com a sua ação moduladora sob os mastócitos (LAGO et al.,
2001; SENOL et al., 2007), um dos principais efetores do processo asmático
alérgico, após o segundo contato com o antígeno (HOGAN et al., 1998) e
também um dos principais produtores de IL-4 e IL-13
O IFN-γ é uma citocina de perfil Th1, raramente é encontrada em níveis
elevados durante a exacerbação do fenótipo Th2 na asma alérgica (WILD et
al., 1999; MAZZARELLA et al., 2002). No nosso estudo, apenas o tratamendo
com a dexametasona foi capaz de reduzir os níveis da citocina (Gráfico 5C).
Em outros modelos de inflamação, a ouabaína é capaz de modular as
75
concentrações de IFN-γ (JACOB et al., 2012), mas sendo o fenótipo Th2
dominante
na
resposta
inflamatória
pulmomar
alérgica
(ELENKOV;
CHROUSOS, 1999), esta citocina não se mostra elevada o suficiente, como
comprovado neste trabalho (Gráfico 5C), para que a ouabaína module sua
produção.
As alterações histopatológicas do processo inflamatório alérgico são
pontos delimitantes para se avaliar a imunomodulação em protocolos de alergia
pulmonar (BEZERRA-SANTOS et al., 2012; MONTEIRO et al., 2016). Os
padrões inflamatórios avaliados neste presente estudo através das colorações
das secções pulmonares com hematoxilina-eosina (HE) e PAS (Ácido Periódico
de Schiff) foram migração de células para o espaço perivascular e
peribronquiolar, vasodilatação, manutenção da integridade epitelial bronquiolar,
entupimento alveolar, hiperplasia e hipertrofia das células caliciformes e
hiperprodução de muco. Todos essas características foram moduladas pelo
pré-tratamento com a ouabaína.
A redução do padrão e do score inflamatório nas secções HE (Figura 10
e Gráfico 6) podem ser corroboradas pela capacidade que a ouabaína tem de
imunomodular a liberação de mediadores pelos mastócitos (LAGO et al., 2001;
SENOL et al., 2007), já que as reações de fase tardia do fenótipo Th2 como
aumento
nos
níveis
de
IL-4,
sustentação
da
migração
eosinófilica
(BRUSSELLE et al., 1994; CORRY et al., 1996) e infiltração vascular e
peribronquiolar de células (EDWARDS et al, 2012) são dependentes da ação
dos mastócitos ativados no segundo contato com o antígeno (MCKAY et al.,
2004).
A ouabaína também reduz a hiperplasia das células caliciformes na
secções PAS, o que corrobora com a diminuição dos níveis de IL-13, uma das
principais citocinas participantes do aumento no processo de hiperreatividade
brônquica e de células epiteliais hiperplásicas nos pulmões (WILLS-KARP et
al., 1998).
Por fim, determinamos o título de IgE-OVA específica com a finalidade
de confirmar que realmente foi desencadeado um processo inflamatório
alérgico pulmonar, mediado pela hipersensibilidade a ovalbumina (LLOYD et
76
al., 2000; KUMAR; HERBERT; FOSTER, 2008). A ouabaína foi capaz de
reduzir o título IgE-OVA específica, que se mostrou elevado no grupo OVA,
confirmando a sensibilização mediada por IgE nesse modelo (Gráfico 8). Essa
redução, pode ser justificada pela capacidade que a oubaína tem de inibir a
maturação de linfóctios B no baço e na circulação periférica (PAIVA et al.,
2011), ou mesmo, pelo seu papel limitante na dinâmica entre as diferentes
subpopulações de linfócitos B nos órgãos periféricos (DA SILVA et al.,2016).
Com esses achados, podemos sugerir que a ouabaína é capaz de
estender sua atividade anti-inflamatória ao modelo de inflamação alérgica
pulmonar, no entanto, outros protocolos são necessários para caracterizar os
mecanismos moleculares pelos quais a ouabaína atua neste modelo. Este
conjunto de dados sugere que a ouabaína possui um papel fisiológico
modulador
da
resposta
inflamatória,
interferindo
negativamente
em
características fenótipcas do modelo de inflamação alérgica pulmonar, que
envolvem a migração de células para o sítio inflamado, a produção de citocinas
do perfil Th2, as características histopatológicas do processo e os níveis de
IgE.
77
78
8. CONCLUSÕES
79
A análise dos resultados permite concluir que:

O pré-tratamento com a ouabaína (0,56 mg/kg), mostrou uma ação antiinflamatória uma vez que foi capaz de reduzir a migração de células
para o sítio da inflamação;

A ouabaína reduz a subpopulação de linfócitos T CD3 + no fluido do
lavado broncoalveolar (BALF);

A ouabaína atenuou a produção de citocinas características do fenótipo
Th2, IL-4 e IL-13, porém não interferiu nos níveis de IFN-γ;

As alterações histopatológicas do modelo de inflamação pulmonar
alérgica foram moduladas negativamente pela oubaína;

A ouabaína reduziu a proporção do título de IgE-OVA específica
presente no BALF.
80
Figura 12. Esquema representando os efeitos da ouabaína no processo inflamatório
alérgico pulmonar obtidos neste trabalho
81
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APÊNDICE A - Substâncias e sais
Ácido acétido glacial (C2H4O2) – VETEC
Ácido clorídrico (HCl) –VETEC
Ácido fosfotunguístico (H3PW 12O40) – VETEC
Ácido periódico (HIO4) – VETEC
Álcool metílico (CH3OH) – VETEC
Aldeído fórmico (CH2O) – MERCK
Alúmen de potássio (KAI(SO4)2) – MERCK
Anticorpo Monoclonal: anti-CD3
Bissulfito de sódio (NaHSO3) – MERCK
Carvão ativado – VETEC
Cloral hidratado – VETEC
Cloreto de potássio (KCl) – MERCK
Cloreto de sódio (NaCl) – SIGMA
Cloridrato de quetamina – VETBRANDS
Clorofórmio (CHCl3) – LTF
Corante azul de evans – VETEC
Corante cromotropo 2R – VETEC
Corante eosina Y – VETEC
Corante hematoxilina – VETEC
Corante Panóptico – NEWPROV
Corante test-green F.C.F. – VETEC
Corante violeta de genciana – VETEC
96
Dexametasona – Aché ®
D-gluxose (C6H12O6) – SIGMA
Etanol (C2H5OH) – CBiotec
Ficoeritrina
Fosfato de potássio (KH2PO4) – REAGEN
Fosfato de sódio anidro (Na2HPO4) – MERCK
Formaldeído – MERCK
Glicerina (C3H3(OH)3) – VETEC
Hidróxido de alumínio (Al(OH)3) – VETEC
Hidróxido de sódio (NaOH) – REAGEN
Metabissulfito de sódio (Na2S2O5) – MERCK
Ouabaína – SIGMA
OVA grade II – SIGMA
OVA grade V – SIGMA
Óxido de mercúrio amarelo (Hg2O) – LAFAN
Parafina para Histologia – COAL
Timol (C10H14O) – VETEC
Xilol (C6H4(CH3)2) – VETEC
97
APÊNDICE B - Aparelhos e equipamentos
Agitador Vortex – VWR – Scientific Pro ducts
Autoinclusor – Leica EG 120
Balança analítica – Sartorius
Banho histológico – ANCAP
Centrífuga refrigerada - Centra MP4R – International Equipement Company
(IEC)
Citômetro – FACS Callibur
Estufa – ICAMO – modelo 3
Histotécnico processador automático de tecidos – OMA – DM – 40
Microscópio óptico – Nikon
Micrótomo – Leica RM 2125 – RT
Nebulizador – Pulmosonic Star – Soniclear
98
ANEXOS
ANEXO A – Certidão da comissão de ética no uso de animais (CEUA)
99
ANEXO B – Artigo em colaboração publicado em 2015 (Mediators of
Inflammation - WebQualis CAPES: B2; Fator de impacto: 3,236; Online
ISSN: 0962-9351).
100
ANEXO C - Artigo em colaboração publicado em 2015 (frontiers in
Physiology - WebQualis CAPES: B1; Fator de impacto: 3,534; Online
ISSN: 1664-042X).
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ANEXO D – Artigo submetido com os resultados desta dissertação
(Immunobiology - WebQualis CAPES: B1; Fator de impacto: 3,044; Online
ISSN: 0171-2985).