ANÁLISE MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM TECIDOS DE

UNIVERSIDADE PARANAENSE
CLEITON PAULO AIGNER
ANÁLISE MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM
TECIDOS DE Gallus gallus UTILIZANDO A PCR EM
TEMPO REAL
UMUARAMA
2008
UNIVERSIDADE PARANAENSE
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA
CLEITON PAULO AIGNER
ANÁLISE MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM
TECIDOS DE Gallus gallus UTILIZANDO A PCR EM
TEMPO REAL
Dissertação apresentada como parte das
exigências para a obtenção do grau de
mestre no programa de Mestrado em
Biotecnologia Aplicada à Agricultura da
Universidade Paranaense – UNIPAR, sob
orientação do Prof. Dr. Aristeu Vieira da
Silva
UMUARAMA
2008
A289a Aigner, Cleiton Paulo
Análise molecular de Toxoplasma gondii em tecidos de
Gallus gallus utilizando a PCR em tempo real / Cleiton Paulo
Aigner. – Umuarama: Universidade Paranaense - UNIPAR,
2008.
52 f.
Orientador: Prof. Dr. Aristeu Vieira da Silva.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Paranaense UNIPAR.
1. Toxoplasma gondii. 2. Galinha. 3. PCR em tempo real.
I. Universidade Paranaense – UNIPAR. II. Título.
(21 ed) CDD: 616.936
Bibliotecária Responsável
Inês Gemelli
CRB 9/966
Dedico este trabalho à minha família, meus
pais, irmãos, cunhados e sobrinhos, as
pessoas especiais em minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Renato Luis Pedron e Clarice Salete Aigner Pedron pela orientação e
apoio em buscar e lutar por meus anelos.
Agradeço a meus pais pelas palavras de incentivo e orgulho no caminho em
busca de meu aperfeiçoamento.
Agradeço a meu orientador Aristeu Vieira da Silva por compartilharmos juntos as
dificuldades e alegrias deste processo.
Agradeço a meu co-orientador Fabiano Sandrini pelos vários momentos de
análises e discussão.
Agradeço a Alvaro Largura e Marco Antonio Largura pelo auxílio na realização
desta etapa.
Agradeço aos acadêmicos do curso de Graduação em Medicina Veterinária da
Universidade Paranaense, bolsistas do Programa Institucional de Bolsas de
Iniciação Científica, Ronaldo César da Rosa e Rodrigo José Mattei, e as
acadêmicas do Mestrado em Ciência Animal, Jacqueline Batista de Araújo e
Franciele Rossandra Piassa, pelo auxílio nas coletas de amostras e na
preparação das amostras de tecidos.
Agradeço à Universidade Paranaense, ao Alvaro Centro de Análises e Pesquisas
Clínicas e à Fundação Araucária de Apoio Científico e Tecnológico do Paraná
pelo suporte financeiro a este trabalho.
“Quando as lutas que a vida lhe oferecer
forem duras, suavize-as. Não aumente
sua dureza tornando-se pessimista ou
deixando que sua fortaleza decaia. Faça
da luta, em todo momento, um
ensinamento; torne doce seu sabor
quando essa luta lhe for amarga. Verá
como a observância deste conselho o
levará ao triunfo.” (Carlos Bernardo
González Pecotche)
CLEITON PAULO AIGNER
QUANTIFICAÇÃO DE Toxoplasma gondii EM TECIDOS DE Gallus gallus
UTILIZANDO A PCR EM TEMPO REAL
RESUMO
Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório, de
distribuição mundial, que acomete todas as espécies homeotérmicas, incluindo o
ser humano e animais de companhia e produção. As galinhas criadas
extensivamente têm sido estudadas em todo o mundo como marcadoras da
contaminação ambiental e no estudo da variabilidade genética do parasito. A PCR
em tempo real é uma metodologia onde os processos de amplificação e detecção
são produzidos de maneira simultânea, usando marcadores fluorescentes. A
detecção da fluorescência permite medir durante a amplificação a quantidade de
DNA sintetizado, já que a fluorescência emitida é proporcional à quantidade de
DNA formado, o que permite conhecer e registrar durante as fases a cinética da
reação de amplificação. Diversos artigos descrevem ensaios moleculares para
detecção de toxoplasmose, mas a maior parte destes está direcionada ao
diagnóstico humano ou estudos filogenéticos. Este trabalho objetivou quantificar o
parasito em amostras de cérebro e coração de galinhas sorologicamente positivas
ao parasito, pela PCR em tempo real para um gene repetitivo. Amostras de
sangue de 65 galinhas foram avaliadas para a presença de anticorpos pelo
método de aglutinação direta (MAD), encontrando-se 28 amostras positivas. De
26 destas galinhas foram coletados cérebro e coração, submetidos à digestão
pela pepsina e extração de DNA pelo Trizol®. O DNA parasitário foi amplificado e
detectado em equipamento StepOneTM Real Time PCR System pelo sistema
SYBR® Green. A quantificação do DNA se deu pela comparação entre os sinais
de amplificação das amostras com aqueles obtidos em suspensões de amostras
de cérebro e coração artificialmente contaminadas com 104 a 100 taquizoítos da
cepa RH. DNA parasitário foi detectado em 24 das 26 amostras examinadas, sem
diferença significativa entre os tecidos examinados, seja na freqüência de
positividade, seja na quantidade de parasitos por grama de tecido. Correlação
positiva entre os títulos de anticorpos e a quantificação de parasitos foi registrada
para as amostras de cérebro, mas não para as amostras de coração.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii; PCR em tempo real; galinha; diagnóstico;
quantificação.
CLEITON PAULO AIGNER
Toxoplasma gondii QUANTIFICATION IN TISSUE OF Gallus gallus USING REAL
TIME PCR
ABSTRACT
Toxoplasma gondii is a worldwide distributed obligatory intracellular parasite that
affects all homoeothermic species, including humans, pets and livestock. Chicken
bred in free-range conditions have been studied all over the world as markers of
environmental contamination and in the study of the genetic variability of the
parasite. Real time PCR is a methodology where amplification and detection were
produced at same time, using fluorescent markers. Fluorescence detection
permits the measure of synthesized DNA amount during amplification phase,
because the fluorescence signal is proportional to the amount of synthesized DNA,
and this leads to know and register during this process the amplification reaction
kinetics. Many papers describe molecular assays for toxoplasmosis detection,
mainly directed for diagnosis in humans or phylogenetics studies. The objective of
this study was the quantification of the parasite in brain and heart samples of
chickens serologically positive for T. gondii using real-time PCR based on a
repetitive element. Blood samples of 65 chickens were analyzed for the presence
of antibodies using the modified agglutination test (MAT), producing 28 positive
samples. Brain and heart samples were collected from 26 MAT positive chickens,
and these samples were digested by acid pepsin and submitted to DNA extraction
using Trizol®. Parasite DNA was amplified and detected in a StepOne® Real Time
PCR System with fluorescent detection using SYBR® Green. DNA quantification
was obtained by means of signal amplification observed in the samples compared
with suspensions of brain and heart artificially contaminated with 104 to 100 RH
strain tachyzoites. The DNA of the parasite was detected in 24 of the 26 samples
analyzed, with no statistical difference between the different tissues, either in the
frequency of positive results or in the quantity of parasites per gram of tissue. A
positive correlation between antibody titers and parasite quantification was
observed in brain, but not in heart samples.
Key words:
Quantification
Toxoplasma gondii; Chicken; Real-time PCR; Diagnosis;
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................ 5
ABSTRACT ............................................................................................................. 6
INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................... 8
QUANTIFICAÇÃO DE Toxoplasma gondii PELA PCR EM TEMPO REAL EM
TECIDOS DE GALINHAS SOROPOSITIVAS CRIADAS EXTENSIVAMENTE
DO ESTADO DO PARANÁ, BRASIL .................................................................... 14
CONCLUSÕES GERAIS ...................................................................................... 29
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 30
APÊNDICE: COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO............................. 33
APÊNDICE: CLASSIFICAÇÃO DO PERIÓDICO NA QUALIS CIÊNCIAS
AGRÁRIAS............................................................................................................ 35
APÊNDICE: CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ................. 36
8
INTRODUÇÃO GERAL
A toxoplasmose é uma doença parasitária com prevalência mundial.
Esta zoonose acomete milhões de pessoas, sendo provocada pelo protozoário
Toxoplasma gondii (REISCHL et al., 2003), parasito intracelular capaz de invadir
os mais diversos tecidos de mamíferos e aves (JAUREGUI et al., 2001).
Em humanos, os grupos com maior susceptibilidade são os indivíduos
imunocomprometidos e os fetos. A toxoplasmose congênita ocorre quando a
infecção primária se apresenta durante a gravidez, neste caso pode induzir
abortos espontâneos ou sérias seqüelas ao feto como hidrocefalia, calcificações
cerebrais, retardo mental, perturbações neurológicas, alterações oculares entre
outras (REISCHL et al., 2003).
Em indivíduos imunocompetentes a parasitose normalmente é
assintomática. Em indivíduos imunocomprometidos como portadores do vírus da
imunodeficiência adquirida - HIV, transplantados ou indivíduos com neoplasias, a
sintomatologia é variável, dependendo da imunidade individual e da virulência da
cepa do parasito, sendo capaz de levar os indivíduos acometidos ao óbito. A
toxoplasmose é considerada uma das maiores causas de morbimortalidade em
pacientes com síndrome de imunodeficiência adquirida - AIDS (EDVINSSON,
2006).
Na vida pós-natal, os seres humanos infectam-se, na maioria das
vezes, pela ingestão de oocistos esporulados encontrados no meio-ambiente ou
pela ingestão de cistos teciduais em carne crua ou mal cozida de hospedeiros
intermediários. Entretanto, na maioria das vezes, não se sabe qual destas vias é
epidemiologicamente mais importante, sendo provável que as fontes principais de
infecção pelo T. gondii sejam diferentes em populações humanas com hábitos
culturais e alimentares distintos (TENTER, 1999). No Brasil, dados provenientes
de genotipagem de cepas isoladas de diversas fontes, indicam uma alta
freqüência de cepas recombinantes, o que evidencia que a maior parte das
infecções ocorrem pela ingestão de oocistos, fortalecendo a importância dos
felinos e da contaminação ambiental na transmissão e manutenção da
enfermidade (FERREIRA et al., 2006).
9
Estimou-se em US$ 3.698.756 os custos relacionados à toxoplasmose
congênita (ROBERTS, 1990). Em todos os países, a maior parte da população
humana e animal apresenta parasitismo pelo T.gondii. Nos mais variados climas e
condições sociais, as populações podem apresentar uma percentagem de
indivíduos positivos que varia de 20 a 83% (um a dois bilhões de pessoas). Em
algumas regiões, 40 a 70% de humanos adultos, aparentemente saudáveis,
apresentam-se sorologicamente positivos para toxoplasmose. Provavelmente é o
protozoário mais difundido entre a população humana e animal, incluindo as aves
(TENTER, 2000).
Nos Estados Unidos da América, pela análise dos dados de nove
sistemas nacionais de notificação em saúde e dados publicados em periódicos
especializados, estimam-se 1.500.000 infecções anuais em humanos, sendo
cerca de 15% sintomáticas. Neste país, entre 1992 e 1996, a toxoplasmose foi a
responsável por cerca de 5.000 hospitalizações, com pelo menos 2.500 casos de
origem alimentar, o que representa 4,1% das internações causadas por infecções
alimentares. No período foram registrados 750 óbitos por toxoplasmose, com
cerca de 50% de infecções adquiridas pelo consumo de alimentos contaminados,
o que representa 20,7% das mortes associadas às infecções de origem alimentar.
Além disso, o desenvolvimento de casos crônicos de toxoplasmose, como
naqueles indivíduos infectados pela via congênita, nos que desenvolvem
corioretinite e em pacientes infectados pelo HIV, é estimado em 4.700 a 12.100
casos anuais (MEAD et al., 1999).
Entre as fontes possíveis de infecção para o ser humano, as aves
domésticas, notadamente as galinhas (Gallus gallus), principalmente as criadas
de forma extensiva, vem sendo estudadas em várias regiões do mundo,
notadamente por serem ótimas indicadoras da contaminação ambiental, dado os
seus hábitos alimentares (DUBEY et al., 2006).
No Brasil, como em outros países, tem-se verificado a prevalência da
infecção de galinhas pelo T. gondii. Apontou-se uma prevalência de 10,3% entre
as 155 amostras examinadas de soros de galinhas do município de Jaguapitã,
PR, pela reação de imunofluorescência indireta, considerando como ponto de
corte o título 16 (GARCIA et al., 2000).
10
No Estado de São Paulo, colhendo 82 amostras de galinhas de quatro
diferentes localidades, foram encontradas 32 (39,02%) amostras sorologicamente
reagentes ao método de aglutinação direta (MAD), considerando um título de 25
como indicativo de positividade (DUBEY et al., 2002).
Em estudo realizado em Campos dos Goytacazes (RJ), encontrou-se
uma prevalência de anticorpos anti-T. gondii da ordem de 65,15% entre as 198
amostras de soro examinadas pelo método de aglutinação direta. Houve variação
da taxa de infecção entre as galinhas oriundas da zona rural (55,10%), suburbana
(67,09%) e urbana (70,97%). Ao recolher amostras de cérebro e coração de 86
galinhas, isolou-se parasitos viáveis em camundongos de 61 (70,90%) das
amostras testadas, inclusive de animais soronegativos, indicando assim o alto
nível de contaminação ambiental e o risco para a saúde pública. Os autores
frisam a descrição da área do estudo, onde em trabalho anterior (BAHIAOLIVEIRA, 2003) foi determinada uma infecção de 84% da população de menor
condição social. No estudo citado, a prevalência de infecção esteve associada ao
consumo de água não filtrada e/ou água obtida de lagos e riachos, provavelmente
contaminados com oocistos do parasito lixiviados a partir do solo contaminado na
época de chuvas (BAHIA-OLIVEIRA, 2003).
No estado do Paraná, estudando aves da região de Santa Izabel do
Ivaí, foram encontrados 16 de 40 (40%) das aves examinadas positivas ao
método de aglutinação direta, considerando como ponto de corte a diluição 1:5
(DUBEY et al., 2006).
A infecção pelo T. gondii pode ser diagnosticada indiretamente, por de
métodos de detecção de anticorpos, e diretamente pela reação em cadeia da
polimerase (PCR), hibridação, isolamento e detecção em cortes histológicos
(TENTER, 2000).
O T.gondii possui um genoma nuclear de aproximadamente 87Mb, o
que equivale a um conteúdo de DNA de 100x10-15g/parasita (CORNELISSEN et
al., 1984), com 11 cromossomos descritos, um genoma mitocondrial de seis kb e
um genoma epissomal de 35 kb, na organela denominada apicoplasto (AJIOKA et
al., 2001). Atualmente as técnicas utilizadas visam, na maioria das vezes, detectar
11
seqüências dos genes SAG-1, que codifica a principal proteína de membrana dos
taquizoítos de T.gondii, do gene B1, de função desconhecida, ambos presentes
no genoma nuclear e porções codificadoras de DNA ribossomal (rDNA).
No
genoma nuclear do T.gondii existe apenas uma cópia do gene SAG-1, 35 cópias
do gene B1 e 110 cópias de genes para rDNA, o que em parte explica as
diferenças encontradas na sensibilidade de muitos protocolos de PCR para a
detecção de Toxoplasma (ELIS, 1998). Outra seqüência não codificadora, com
200 a 300 cópias no genoma nuclear do T.gondii, utilizada na PCR descrita por
Homan et al. (2000), demonstrou sensibilidade maior que a detecção do gene B1,
possibilitando ainda a quantificação de cistos parasitários no cérebro de animais
experimentalmente infectados, usando um ensaio de quantificação competitivo.
Os estudos que utilizam a PCR tradicional para detecção e
discriminação de parasitas patogênicos são largamente empregados, o que ainda
não ocorre em estudos que aplicam a técnica de PCR em tempo real na
quantificação de parasitas (BELL; CARTWRIGHT, 2002).
Na PCR em tempo real, os processos de amplificação e detecção são
produzidos de maneira simultânea, usando marcadores fluorescentes. Há
redução de problemas com contaminação, pois se utiliza um sistema fechado,
não
havendo
necessidade
de
manipulação
posterior
dos
produtos
de
amplificação. A detecção da fluorescência permite medir durante a amplificação a
quantidade de DNA sintetizado, já que a fluorescência emitida é proporcional à
quantidade de DNA formado, o que permite conhecer e registrar durante as
sucessivas fases da reação à cinética de amplificação (COSTA, 2004).
As metodologias de PCR “quantitativas” que não utilizam a técnica em
tempo real apresentam diversas limitações inerentes ao uso de termocicladores
convencionais e geralmente são descritos como métodos semiquantitativos.
Técnicas semiquantitativas de PCR analisam produtos de amplificação limites,
neste ponto, a síntese de "redes" (primers dimers) é significativamente reduzida,
efeitos inibitórios acumulam e as diferenças de concentrações iniciais dos alvos
de amplificação são mascaradas. Diferentemente do que se observa na
quantificação por PCR em tempo real, que apresenta erros mínimos na
performance (BELL; CARTWRIGHT, 2002).
12
Os sistemas de detecção por fluorescência utilizados na PCR em
tempo real podem ser divididos em dois grupos: agentes intercalantes e sondas
específicas
marcadas
com
fluorocromos.
Os
agentes
intercalantes
são
fluorocromos que aumentam significativamente a emissão de fluorescência, ao se
unir a fitas de DNA de dupla hélice, e com isso o aumento de DNA em cada ciclo
se reflete em um aumento proporcional da fluorescência emitida. SYBR® Green é
o sistema de detecção mais utilizado neste grupo e apresenta como vantagens a
facilidade na otimização das reações, além de um custo reduzido quando
comparado às sondas específicas. A desvantagem é a redução da especificidade
ocasionada pelo aumento na emissão de fluorescência gerada por produtos de
amplificação inespecíficos da PCR e dímeros de primers (COSTA, 2004).
Para analisar a presença de dímeros de primers ou outros produtos de
amplificação inespecíficos da PCR, utiliza-se no final da reação uma curva de
dissociação, para confirmação ou não da especificidade e acurácia da
quantificação (NAGY, 2006). A curva de dissociação é baseada na aplicação de
um gradiente de temperaturas crescentes depois da PCR, para monitorar a
cinética de dissociação dos fragmentos amplificados, desta forma é possível
comparar se a temperatura de melting (Tm) do DNA amplificado é compatível com
a do DNA avaliado (COSTA, 2004).
As sondas específicas são sondas marcadas com fluorocromos. A
emissão da fluorescência é determinada por um processo de transferência de
energia fluorescente mediante ressonância (FRET) entre as moléculas. As mais
utilizadas são as sondas de hidrólise, denominadas TaqMan®, sondas de
hibridização (molecular beacons) e primers modificados como Scorpion™
(COSTA, 2004).
Diversos artigos descrevem ensaios moleculares para detecção de
toxoplasmose, mas a maioria está direcionado ao diagnóstico humano ou estudos
filogenéticos (JAUREGUI et al., 2001).
Um estudo experimental foi realizado para o desenvolvimento de um
ensaio por PCR em tempo real para detecçao de T. gondii em tecidos de suínos e
camundongos, utilizando o sistema TaqMan®. Este estudo demonstrou que a
13
quantificação de T. gondii nesta metologia traz como vantagens em relação aos
outros métodos moleculares o fato da reação ser realizada em sistema fechado e
sem necessidade de manipulação posterior, a rapidez do ensaio, com resultados
que podem ser confirmados dentro de 24 horas além da sensibilidade e ampla
faixa de linearidade nas concentrações de DNA (JAUREGUI et al., 2001).
A PCR em tempo real para quantificação de T. gondii pelo sistema
SYBR®Green foi utilizada em um modelo experimental de toxoplasmose
congênita. Neste estudo a detecção e a quantificação do parasito foram avaliadas
em cobaias (Cavia porcelus), pela da amplificação do gene B1. A quantificação
por PCR em tempo real foi comparada a nested PCR, apresentando sensibilidade
inferior quando utilizado o gene B1 (FLORI et al., 2002).
Em animais, testes sorológicos para identificação de infecção por T.
gondii em suínos e em estudos epidemiológicos, seguidos do isolamento do
parasita em camundongos ou gatos para confirmação da infecção são
usualmente utilizados. Porém esta prática traz como desvantagem a necessidade
de utilização de animais para o isolamento, o tempo necessário para o processo
(de seis a oito semanas), tornando seu custo e o tempo para um diagnóstico
definitivo, elevados. Com o desenvolvimento da técnica de PCR em tempo real,
pode-se suprir estas desvantagens, além de ser um método direto, o processo
pode ser completado em 24 horas ou menos (JAUREGUI et al., 2001).
A inexistência de artigos descrevendo a detecção e quantificação do
Toxoplasma gondii em tecidos de aves utilizando a PCR em tempo real, a
redução do tempo para a finalização do diagnóstico e a importância das galinhas
como marcadoras da contaminação ambiental, demonstram a relevância deste
estudo.
14
QUANTIFICAÇÃO DE TOXOPLASMA GONDII PELA PCR EM
TEMPO REAL EM TECIDOS DE GALINHAS SOROPOSITIVAS
CRIADAS EXTENSIVAMENTE DO ESTADO DO PARANÁ, BRASIL
Cleiton Paulo Aigner1, Aristeu Vieira da Silva2
1
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura, Universidade Paranaense/Alvaro
Centro de Análises e Pesquisas Clínicas/Instituto de Investigação Científica do Paraná –
IICP, Rua General Osório 212 – Centro, Cascavel, PR, Brazil.
2
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura / Mestrado em Ciência Animal,
Universidade Paranaense – UNIPAR, Praça Mascarenhas de Moraes, s/n – Centro,
Umuarama, PR, Brazil.
Resumo
Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório, de
distribuição mundial, que acomete todas as espécies homeotérmicas, incluindo o ser
humano e animais de companhia e produção. As galinhas criadas extensivamente têm sido
estudadas em todo o mundo como marcadoras da contaminação ambiental e no estudo da
variabilidade genética do parasito. Este trabalho objetivou quantificar o parasito em
amostras de cérebro e coração de galinhas sorologicamente positivas ao parasito, pela realtime PCR para um gene repetitivo. Amostras de sangue de 65 galinhas foram avaliadas
para a presença de anticorpos pelo método de aglutinação direta (MAD), encontrando-se
28 amostras positivas. De 26 destas galinhas foram coletados cérebro e coração,
submetidos à digestão pela pepsina e extração de DNA pelo Trizol®. O DNA parasitário
foi amplificado e detectado em equipamento StepOneTM Real Time PCR System pelo
sistema SYBR®Green. A quantificação do DNA se deu pela comparação entre os sinais de
amplificação das amostras com aqueles obtidos em suspensões de amostras de cérebro e
15
coração artificialmente contaminadas com 104 a 100 taquizoítos da cepa RH. DNA
parasitário foi detectado em 24 das 26 amostras examinadas, sem diferença significativa
entre os tecidos examinados, seja na freqüência de positividade, seja na quantidade de
parasitos por grama de tecido. Correlação positiva entre os títulos de anticorpos e a
quantificação de parasitos foi registrada para as amostras de cérebro, mas não para as
amostras de coração.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii; Galinha; PCR em tempo real; Diagnóstico;
Quantificação
1. Introdução
A toxoplasmose é uma doença parasitária com prevalência mundial. Esta
zoonose acomete milhões de pessoas, sendo provocada pelo protozoário Toxoplasma
gondii (Reischl et al., 2003), parasito intracelular capaz de invadir os mais diversos tecidos
de mamíferos e aves (Jauregui et al., 2001). Em humanos, os grupos com maior
susceptibilidade são os indivíduos imunocomprometidos e os fetos. A toxoplasmose
congênita pode ocorrer quando a infecção primária se dá durante a gravidez, induzindo
abortos espontâneos ou sérias seqüelas ao feto como hidrocefalia, calcificações cerebrais,
retardo mental, perturbações neurológicas e alterações oculares, entre outras (Reischl et al.,
2003).
Na vida pós-natal, os seres humanos infectam-se, na maioria das vezes, pela
ingestão de oocistos esporulados encontrados no meio-ambiente ou pela ingestão de cistos
teciduais em carne crua ou mal cozida de hospedeiros intermediários. Entretanto, na
maioria das vezes, não se sabe qual destas vias é epidemiologicamente mais importante,
sendo provável que as fontes principais de infecção pelo T. gondii sejam diferentes em
populações humanas com hábitos culturais e alimentares distintos (Tenter, 1999). No
16
Brasil, dados provenientes de genotipagem de cepas isoladas de diversas fontes, indicam
uma alta freqüência de cepas recombinantes, o que evidenciaria que a maior parte das
infecções ocorreriam pela ingestão de oocistos, fortalecendo a importância dos felinos e da
contaminação ambiental na transmissão e manutenção da enfermidade (Ferreira et al.,
2006).
As galinhas (Gallus gallus), principalmente as criadas de forma extensiva, vêm
sendo estudadas em várias regiões do mundo, por serem ótimos indicadores da
contaminação ambiental, dado os seus hábitos alimentares (Dubey et al., 2006). Nestas
aves altas taxas de infecção são frequentemente encontradas em todos os países estudados,
e no Brasil são comuns taxas de 39% (Dubey et al., 2002) a 66% (Dubey et al., 2006).
Para os estudos genéticos das cepas circulantes em populações de aves criadas
extensivamente, frequentemente recorre-se a inoculação de camundongos com tecidos
obtidos das aves, e posterior análise molecular das cepas isoladas. Entretanto, além de
consumir até dois meses para que se obtenha um resultado final, a utilização de animais é
dispendiosa e incorre em entraves éticos. Por outro lado, apesar da proporção de cepas
isoladas em camundongos a partir de tecidos de galinhas soropositivas ser de cerca de 75%
na maioria dos trabalhos conduzidos no Brasil, De Oliveira et al. (2008) obtiveram sucesso
de isolamento em 28,4% das aves soropositivas. Adicionalmente, a passagem do parasito
pelo animal pode selecionar genótipos mais virulentos para esta espécie (Villena et al.,
2004), prejudicando a interpretação e o alcance dos resultados obtidos nestas análises.
Desta maneira, este estudo propõe-se avaliar a PCR em tempo real para uma
seqüência genômica repetitiva para detecção de T. gondii em amostras de cérebro e
coração de galinhas de criação extensiva sorologicamente reagentes ao parasito, de forma a
propor uma alternativa rápida para análise e triagem de amostras candidatas a
genotipagem. Adicionalmente, o estudo teve como objetivo avaliar a correlação entre os
17
títulos de anticorpos séricos e a quantidade de parasitos detectado em cada tecido
examinado.
2. Material e Métodos
2.1. Animais e exame sorológico
Amostras de sangue de 65 galinhas criadas extensivamente em cinco propriedades
rurais localizadas no município de Toledo, PR, Brasil, foram coletadas pela punção da veia
da asa. O soro obtido por centrifugação foi examinado pelo método de aglutinação direta
(MAD), a diluição inicial foi de 1:25, e os soros reagentes, titulados em diluições
sucessivas na base dois até 1:3200 (Desmonts e Remington, 1980).
2.2. Preparação dos tecidos
As aves reagentes ao MAD foram abatidas por deslocamento crânio cervical e
coletados o coração e o cérebro, acondicionados em tubos Falcon com 30 mL de solução
de antibióticos (penicilina G + estreptomicina) e mantidas sob refrigeração até o
processamento laboratorial. No Laboratório de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde
Pública da Universidade Paranaense, Umuarama, PR, Brasil, estas amostras foram
submetidas, individualmente, a digestão em solução ácida de pepsina segundo Dubey
(1998). O sedimento obtido após o último estágio de centrifugação foi pesado e
ressuspendido em cinco vezes o volume em solução salina 0,9%, de forma obter 200 µg de
tecido por mL de suspensão. Esta suspensão foi imediatamente congelada a -20oC para
extração de DNA e detecção molecular de Toxoplasma gondii realizada na unidade de
Biologia Molecular do Alvaro Centro de Análises e Pesquisas Clínicas, em Cascavel, PR,
Brasil.
2.3. PCR em tempo real
Extração de DNA
18
O DNA foi extraído de 400µL da suspensão de tecidos com TRIZOL® LS Reagent
(Invitrogen, Paisley, UK) seguindo o protocolo do fabricante.
Sensibilidade analítica da PCR em tempo real
Duas suspensões de tecido, obtidas a partir do cérebro e coração de galinhas
sabidamente negativas para T. gondii, foram artificialmente contaminadas com 104
taquizoítos de T. gondii, cepa RH. Desta suspensão foi extraído o DNA total, diluído em
série na base 10 em água destilada estéril, obtendo-se soluções de DNA correspondentes a
103, 102, 101 e 100 taquizoítos do parasito. Uma curva padrão para cálculo da amplificação
foi obtida pela diluição seriada do DNA de T. gondii e subseqüente análise das cinco
concentrações (104, 103, 102, 101 e 100). Estas suspensões foram submetidas a PCR em
tempo real como descrito para as amostras de tecido.
Amplificação e quantificação do DNA pela PCR em tempo real
Utilizou-se para a detecção de fluorescência na PCR em tempo real o sistema
SYBR®Green, por meio do equipamento StepOne™ Real Time PCR System (Applied
Biosystems). Os oligonucletídeos utilizados (Invitrogen) amplificam uma região de 529
pares de base, que se repete de 200 a 300 vezes no genoma do parasito, sendo as
seqüências direta e reversa respectivamente: 5’CACAGAAGGGACAGAAGT e
5’TCGCCTTCATCTACAGTC (Edvinsson et al., 2006).
Para o ensaio, foi utilizado como volume final de reação, 20 μL, sendo 10 µL de
SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1,5 µL de cada oligonucleotídeo na
concentração de 10 pmol/µL, 5 µL de DNA e 2 µL de água destilada estéril. A reação
ocorreu com incubação inicial a 95oC por cinco minutos (hot start), seguido de 35 ciclos de
95°C por 30 s, 55°C por 30 s e 72°C for 1,5 min, finalizando com uma extensão adicional
72°C por sete minutos.
19
O número de parasitos por grama de tecido foi obtido pela fórmula (FN x 1000)/80,
onde o fator de normalização (FN) foi obtido por: (Concentração de DNA da curva-padrão
/ Concentração de DNA da amostra) x número de amplicons na amostra.
As amostras que apresentaram sinal de amplificação menor que o limite inferior de
detecção da curva padrão foram submetidas a um segundo ensaio de 40 ciclos, seguido de
uma análise pela curva de melting para avaliar a presença de dímeros de primers ou outros
produtos não-específicos da PCR.
2.4. Análise estatística
A comparação da freqüência de amplificação de DNA segundo o tecido avaliado
foi realizada pelo teste de McNemar, enquanto que a quantificação de DNA entre os
tecidos foi comparada pelo teste de Wilcoxon. A correlação entre o título de anticorpos e a
quantificação do parasito em cada um dos tecidos avaliados foi realizada pelo cálculo do
coeficiente de Spearmann. Foram considerados significativos valores de p menores que
0,05.
3. Resultados
3.1. Sorologia
Das 65 amostras de soro testadas, 28 (43,1%) foram positivas ao MAD, com os
títulos descritos na Tabela 1. Foram coletados o cérebro e o coração de 26 aves positivas
ao MAD para extração de DNA e amplificação do mesmo pela PCR em tempo real.
20
Tabela 1.
Propriedades, animais e respectivos títulos ao MAD e quantificação de
Toxoplasma gondii em amostras de cérebro e coração de galinhas criadas extensivamente.
Toledo, PR, Brasil. 2008.
Quantificação de T. gondii
(parasitos/g)
Propriedade
Animal
Título ao MAD
Cérebro
Coração
1
7
≥ 3200
672.06
ND
1
10
50
114.55
118.58
1
11
≥ 3200
NQ
ND
1
15
800
ND
49.26
1
17
800
486.70
ND
1
18
200
109.67
155.21
1
19
800
NQ
58.07
2
3
400
NQ
571.76
2
4
200
NQ
33.49
2
8
1600
234.02
ND
2
9
400
228.23
982.80
2
10
1600
ND
332.98
2
13
800
263.31
23.68
2
16
800
93.02
323.96
2
17
400
435.20
831.65
2
18
400
437.46
578.82
2
19
1600
1470.09
NQ
3
1
800
ND
ND
3
2
1600
22742.38
62.81
4
5
200
518.93
NQ
4
8
1600
NQ
60.06
4
9
800
500.08
NQ
5
1
400
1350.80
ND
5
2
800
ND
ND
5
3
≥ 3200
6545.50
NQ
5
9
400
81.10
163.75
ND: não detectável
NQ: não quantificável
21
3.2. Sensibilidade analítica
A figura 1 apresenta a curva padrão de amplificação do DNA obtido das diluições
sucessivas de T. gondii nas suspensões de cérebro e coração. Como se verifica na figura,
nos tecidos em que o parasito foi diluído, a detecção do mesmo foi obtida em todos os
pontos de diluição testados. Com isso a PCR obteve uma sensibilidade analítica
correspondente a um parasito por mL de suspensão.
A
B
Figura 1. Detecção pela PCR em tempo real de um elemento repetitivo de 529 pares de
base de T. gondii. Gráficos de amplificação com 104(a), 103(b), 102(c), 101(d) e 100(e)
taquizoítos da cepa RH como amostra inicial de DNA homogeneizada com suspensões de
cérebro (A) ou coração (B) de galinha. ΔRn, sinal de fluorescência.
3.3. PCR em tempo real
No ensaio de quantificação, das 26 amostras de cérebro testadas, em 22 (84,6%)
houve amplificação de DNA de T. gondii. Destas amostras, cinco apresentaram
amplificações inferiores ao limiar mínimo de detecção da curva padrão, sendo os
resultados destas amplificações confirmados em um segundo ensaio com 40 ciclos seguido
por uma curva de dissociação. Para as 26 amostras de coração avaliadas, a detecção de
DNA do parasito foi observada em 21 (80,8%), onde seis destas amostras foram
22
confirmadas no segundo ensaio. Ao comparar os tecidos quanto à amplificação de DNA,
não houve diferença entre eles quando avaliada a proporção de amostras positivas
(p=0,6547) e mesmo quanto à quantidade de DNA parasitário por grama de amostra
(p=0,4258). Considerando os resultados obtidos em cérebro e coração, houve amplificação
de DNA de T. gondii em 24 (92,3%) das aves avaliadas.
A Tabela 1 demonstra os valores de quantificação nas amostras que apresentaram
sinal de amplificação acima do limiar inferior de detecção da curva padrão, ajustadas para
um grama de tecido. Nas amostras de cérebro (Figura 2) foram detectados de 81 a 22742
parasitos por grama, com mediana de 437 parasitos por grama de tecido, e de 23 a 982
parasitos por grama, com mediana de 155 nas amostras de coração.
A
B
Figura 2. Detecção pela PCR em tempo real de um elemento repetitivo de 529 pares de
base de T. gondii. Gráficos de amplificação com 104(a), 103(b), 102(c), 101(d) e 100(e)
taquizoítos da cepa RH como amostra inicial de DNA homogeneizada com suspensões de
cérebro de galinha, e uma amostra de cérebro de galinha soropositiva (f) com alta (A) ou
baixa (B) quantidade de DNA de T. gondii. ΔRn, sinal de fluorescência.
23
Quando confrontados pelo teste de Spearmann, verificou-se correlação significativa
entre os títulos de anticorpos e a quantificação de parasitos no cérebro (r=0,5315; p=0,0281
– Figura 3), não se verificando o mesmo comportamento para as amostras de coração (r=0,1955; p=0,4850).
Figura 3. Correlação entre os títulos ao MAD e o número de parasitos/g de tecido cerebral.
Toledo, PR, Brasil. 2008.
Discussão
Este trabalho demonstra a amplificação de DNA de T. gondii em amostras de
cérebro e coração de galinhas soropositivas pelo método de aglutinação direta. Como no
trabalho de Jauregui et al. (2001), em amostras de cérebro de suínos, foi demonstrada
correlação entre os títulos de anticorpos séricos e a quantidade de DNA do parasito na
amostra. No presente trabalho, entretanto, quando avaliada esta correlação em amostras de
coração, não houve significância. Este resultado reflete a irregularidade de recuperação do
parasito dos órgãos de galinhas, já verificado em trabalhos de inoculação experimental
24
(Dubey et al., 1993; Kaneto et al., 1997), normalmente com superioridade de detecção no
cérebro, seguido do coração.
Em duas amostras com título pelo MAD de 800, não se observou amplificação
de DNA de T. gondii. Possíveis causas para o fato são as de que os cistos não
necessariamente serão localizados somente nos tecidos avaliados ou ainda a possibilidade
de degradação do DNA durante o processo de digestão.
A elevada sensibilidade do método em conjunto com a região do genoma
utilizada, demonstrada pela detecção tanto em cérebro quanto em coração de um parasito
por mL, reflete a sensibilidade descrita por Edvinsson et al. (2006), que também utilizaram
a PCR em tempo real dirigida para um elemento repetitivo de 529 pares de base com o
sistema SYBR®Green, porém em amostras de sangue de humanos transplantados e
imunocomprometidos. Jauregui et al. (2001) detectaram a mesma sensibilidade em
amostras de tecidos de suíno e camundongos, porém utilizando o sistema TaqMan e
amplificação de seqüência dirigida para a região ITS1 do gene 18S rRNA.
Em nove reações (cinco de cérebro e quatro de coração) o número de cópias
detectadas foi inferior ao menor ponto da curva padrão. Para excluir a possibilidade de que
o sinal de amplificação observado nestas amostras fosse decorrente de dímeros de primers,
produtos inespecíficos da PCR e confirmar se o produto correto foi amplificado, foi
realizado um segundo ensaio seguido de uma curva de dissociação. A análise deste ensaio
confirmou que os produtos amplificados não eram inespecíficos. Curvas de dissociação
com este objetivo, também foram utilizadas por de Edvinsson et al. (2006) e Nagy et al.
(2006) em trabalhos com T. gondii.
Não se observou diferença estatística (p=0,6547) na detecção do T. gondii entre
os tecidos analisados, fato que vai ao encontro com a informação que os cistos
25
frequentemente são encontrados concomitantemente em coração e cérebro, por serem os
órgãos preferenciais de alojamento dos cistos nesta espécie (Dubey et al., 1993).
Kijlstra et al. (2008) testaram, por um ensaio quantitativo duplex baseado na
TaqMan®PCR em tempo real usando um elemento repetitivo (AF146527) como alvo
primário e uma seqüência de DNA ribossomal 18S das células hospedeiras como alvo
secundário,
amostras
de
coração
de
79
roedores
e
22
Crocidura
russula
(Mammalia:Soricidae); em 71 destes animais os cérebros também foram testados. Doze
animais foram positivos para a presença de DNA de T. gondii, sendo oito em coração e
quarto em cérebro, e nenhum animal com o coração e o cérebro positivos, resultados que
divergem do nosso estudo, onde se encontrou positividade tanto em cérebro como em
coração em 16 dos 24 animais positivos (66,67%).
Jauregui et al. (2001) aponta a dificuldade de detecção do T. gondii em tecidos
de animais de grande porte, por motivos como erros de amostragem, local de preferência
do parasito e a possibilidade de, ao executar qualquer teste para a detecção de cistos
teciduais, resultados falso-negativos poderem resultar de amostras de tamanho insuficiente.
Esta dificuldade e a possibilidade de resultados falsos negativos é reduzida quando se
trabalha com galinhas, pois se possibilita a utilização do órgão inteiro, tanto para o cérebro
quanto para o coração. Por outro lado, a seqüência gênica alvo utilizada para amplificação
também influencia o sucesso da técnica, como demonstrado por Da Silva & Langoni
(2003), que comparam quatro pares de oligonucleotídeos na amplificação de DNA de T.
gondii em amostras de cérebro e músculo de ratos experimentalmente infectados,
encontrando superioridade para a seqüência repetitiva, mesma utilizada neste trabalho.
Os resultados encontrados confirmam a sensibilidade analítica da detecção do
parasito em amostras de tecido de aves pela utilização da amplificação de um gene
repetitivo num sistema de PCR em tempo real baseado em detecção fluorescente pelo
26
SYBR®Green. A quantificação do parasito nos tecidos demonstra a possibilidade de
aplicação de outros sistemas de detecção molecular para análise genotípica diretamente nas
amostras de tecidos, permitindo a comparação com os resultados obtidos pela inoculação
em camundongos, e, eventualmente, prescindido da utilização da bioprova para estas
análises.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Cintia Larissa Schmitt e Marciano Antunes, do Alvaro
Centro de Análises e Pesquisas Clínicas pelo auxílio prestado, a Ronaldo César da Rosa e
Rodrigo Mattei (PIBIC/UNIPAR), Jacqueline Batista de Araújo e Franciele Rossandra
Piassa (Mestrado em Ciência Animal), pelo auxílio na obtenção e preparação das amostras.
Ao Rodrigo Cosa da Silva e Vanessa Yuri de Lima, da Faculdade de Medicina Veterinária
e Zootecnia da UNESP pelo auxílio com as referências bibliográficas, e à Universidade
Paranaense, à Fundação Araucária e ao Alvaro Centro de Análises e Pesquisas Clínicas
pelo suporte financeiro a este projeto.
27
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29
CONCLUSÕES GERAIS
O estudo de quantificação de T. gondii em amostras de cérebro e
coração de galinhas pela PCR em tempo real, apresentou-se como um teste
rápido podendo ser utilizado como alternativa para análise e triagem de amostras
de animais candidatas à genotipagem.
A correlação entre os títulos de anticorpos séricos e a quantidade de
parasitos detectados foi observada quando o tecido analisado foi cérebro.
Os resultados positivos apresentados ao avaliar-se T. gondii em
tecidos de galinha, por exemplo, a rapidez do teste, abrem perspectivas futuras
para
a
utilização
desta
técnica
na
pesquisa
de
outros
parasitas
ou
microrganismos em galinhas em situações onde a necessidade de agilidade no
diagnóstico é fundamental. Enfermidades como a coccidiose, micoplasmoses e
salmoneloses, importantes na produção avícola podem ter o diagnóstico
maximizado pela adoção de técnicas moleculares de alta performance.
As mesmas perspectivas podem ser avaliadas na detecção de
microrganismos em outras espécies, principalmente quando há a necessidade de
diagnóstico rápido e específico, como nos casos de suspeitas de febres
hemorrágicas e outras viroses de progressão clínica rápida.
30
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APÊNDICE: COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO
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35
APÊNDICE: CLASSIFICAÇÃO DO PERIÓDICO NA QUALIS
CIÊNCIAS AGRÁRIAS
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APÊNDICE: CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA