14081 - Coltec

Título do projeto: Aspectos reprodutivos de Crotalus durissus (Reptilia, Squamata,
Viperidae): um estudo envolvendo a espermatogênese e a determinação da
duração do ciclo.
As serpentes possuem uma considerável variação nos padrões usados para reprodução.
A estrutura e organização dos testículos geralmente são semelhantes entre os amniotas,
embora cada espécie possa exibir características morfológicas e funcionais particulares,
como aquelas relacionadas a estratégias reprodutivas e de comportamento. Nos répteis,
assim como em outros vertebrados, a espermatogênese é um processo cíclico, complexo
e altamente organizado no qual a espermatogônia diploide se diferencia em
espermatozoides maduros haploides. Este processo ocorre no interior dos túbulos
seminíferos nos testículos. Assim, no epitélio seminífero são observadas diferentes
gerações de células germinativas que estão associadas às células de Sertoli (células
responsáveis pela nutrição e sustentação das células que irão formar os gametas
masculinos) e são arranjadas em padrão consistente entre a base e porção superior deste
epitélio. Embora de ocorrência ampla no Brasil, poucos estudos contemplando a
biologia reprodutiva de Crotalus durissus (cascavel) foram realizados. Neste contexto,
torna-se
objetivo
do
presente
estudo
investigar
de
maneira
detalhada,
a
espermatogênese, isto é, o processo de formação do espermatozoide da cascavel,
caracterizando seus estádios bem como a duração do ciclo espermatogênico. Assim,
para a avaliação do processo espermatogênico serão utilizados 24 espécimens de
Crotalus durissus (6 espécimes por estação do ano – coletas em andamento e realizadas
pela doutoranda Flávia C. Resende) doados à Fundação Ezequiel Dias (Funed). Os
indivíduos serão pré-anestesiados com gelo seco, pesados e eutanasiados com overdose
de barbitúrico (Tiopental 100 mg/kg) via intra-cardíaca. Após a confirmação do óbito,
será realizada uma incisão ventral que permitirá a coleta dos testículos. Os mesmos
serão pesados e fixados em glutaraldeído 4% tamponado. Para a avaliação da duração,
serão feitas injeções intracelomáticas de BrDU, um marcador de proliferação celular em
nove animais, sendo um espécimen por tempo (1 hora, 7, 15, 22, 23, 24, 30, 31 ou 32
dias). A eutanásia e coleta de órgãos serão realizadas conforme descrito anteriormente,
entretanto os testículos serão fixados em solução de Bouin e incluídos em Paraplast.
Para o estudo da espermatogênese, fragmentos do testículo serão incluídos em glicol
metacrilato (resina plástica) e as secções de 4µm coradas com Azul de Toluidina. As
lâminas serão avaliadas em microscópio óptico Olympus BX-60. As diferentes gerações
de células germinativas serão identificadas bem como a maneira com a qual estas
células se organizam no epitélio seminífero. Após a determinação dos estádios, serão
avaliadas 200 secções transversais a fim de se estabelecer a frequência dos mesmos.
Para o estudo da duração do ciclo, secções com 5µm de espessura serão
desparafinizadas e reidratadas. A imunohistoquímica será realizada seguindo o
protocolo específico desenvolvido em nosso laboratório para detecção de BrdU no
parênquima do testículo (Campos-Júnior et al., 2013; Sousa et al., 2014). As lâminas
serão montadas e analisadas em microscópio Olympus BX-60 para detectar o tipo de
célula germinativa mais avançada marcada nos nove diferentes períodos investigados
através das injeções de BrDU.