OBTENÇÃO DE COMPÓSITOS HIDROXIAPATITA
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS OBTENÇÃO DE COMPÓSITOS HIDROXIAPATITA-QUITOSANA CONTENDO SULFADIAZINA DE PRATA COMPLEXADA EM βCICLODEXTRINA GABRIELA DAS GRAÇAS GOMES TRINDADE SÃO CRISTÓVÃO Fevereiro 2015 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS OBTENÇÃO DE COMPÓSITOS HIDROXIAPATITA-QUITOSANA CONTENDO SULFADIAZINA DE PRATA COMPLEXADA EM βCICLODEXTRINA GABRIELA DAS GRAÇAS GOMES TRINDADE Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe, como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profª. Dra. Rogéria de Souza Nunes SÃO CRISTÓVÃO Fevereiro 2015 3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE T833o TrTrindade, Gabriela das Graças Gomes Obtenção de compósitos hidroxiapatita-quitosana contendo sulfadiazina de prata complexada em β-ciclodextrina / Gabriela das Graças Gomes Trindade; orientador Rogéria de Souza Nunes. – São Cristovão, 2015. 90 f. : il. Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal de Sergipe, 2015. 1. Quitosana. 2. Sulfadiazina de prata. 3. Hidroxiapatita. 4. Farmácia. I. Nunes, Rogéria de Souza, orient. II. Título. CDU 615.012 4 GABRIELA DAS GRAÇAS GOMES TRINDADE OBTENÇÃO DE COMPÓSITOS HIDROXIAPATITA-QUITOSANA CONTENDO SULFADIAZINA DE PRATA COMPLEXADA EM βCICLODEXTRINA Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe, como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Aprovada em: ___/____/_____ _________________________________________________ Orientador (a): Profª. Drª. Rogéria de Souza Nunes _________________________________________________ 1º Examinador (a) _________________________________________________ 2º Examinador (a) PARECER _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ 5 Aos meus pais, Joscelino e Maria e À minha irmã, Carolina! 6 AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida, fonte de sabedoria, Te agradeço por sempre estar presente, abençoando meus sonhos, aumentando minha fé e força para seguir; Aos meus preciosos pais, Joscelino e Maria, que se doaram inteiros para realizar este sonho. Por toda dedicação, confiança, cuidado e principalmente pelo amor incondicional. Esta vitória é mais uma prova do amor e educação transmitida durante minha formação; A minha irmã Carolina, pelo amor incondicional, amizade, companheirismo, dedicação, paciência, sempre ao meu lado me impulsionando com determinação, fé, esperança e alegria. Este singelo trabalho dedico a você, que não mediu esforços para me apoiar quando precisava; Aos meus familiares pelo apoio e orações, em especial a minha tia avó Artemísia, tio Gildásio e tia Margarida, por compartilhar muita sabedoria, afeto e confiança. Sou eternamente grata a torcida de vocês; A minha orientadora, professora Dra. Rogéria de Souza Nunes, pela orientação, dedicação, confiança, paciência, ensinamentos, oportunidades e amizade durante toda a minha vida acadêmica. Por todo interesse e incentivo durante esses anos de pesquisa científica, por sempre acreditar no meu potencial e compartilhar idéias que sempre motivaram o meu trabalho; Ao professor Dr. Mário Ernesto, colaborador e parceiro deste trabalho. Agradeço pelo apoio, dedicação, ensinamentos e incentivo em contribuir com seus conhecimentos durante o desenvolvimento deste trabalho; Ao professor Dr. Victor Hugo Sarmento, por todo incentivo e sugestões durante a banca de seminários, por compartilhar idéias que contribuíram na construção desta dissertação; Ao professor Dr. Adriano Antunes, por todo apoio, incentivo, paciência, sugestões, ensinamentos e contribuições dados ao trabalho. Pela dedicação e disposição em contribuir durante as bancas de avaliação, sou imensamente grata; 7 Ao professor Dr. Luís Eduardo, por todo incentivo e contribuições dados ao trabalho. Agradeço pela disposição em contribuir durante as bancas de avaliação; A Ricardo, pela paciência, amor, amizade, companheirismo, dedicação e por estar ao meu lado em todos os momentos diminuindo o "stress" e multiplicando a alegria a cada conquista; As minhas amigas "Mestrandas Lindas", pela amizade, cumplicidade, companheirismo, paciência, incentivo, carinho, pela torcida até o final de cada apresentação nos seminários, e por todos momentos compartilhados; Aos meus amigos, em especial a Juh, Mari, Dai, Dri, Lícia, Joyce e Drika, pela amizade, companheirismo, alegria, compreensão e incentivo, por estarem sempre do meu lado; As minhas alunas de Pibic, Thay e Valéria, pela dedicação aos experimentos, amizade e contribuições no desenvolvimento desta dissertação; Ao LADEF, em especial a Alyne, Sarah, Joyce, Juh, Drika, Lícia, Dani, Raquel, Kelvin, Bella e Micheline, pelo apoio, incentivo, carinho, paciência, por todos os momentos compartilhados com muita alegria que se tornaram muito especiais; Aos professores do NPGCF, pelo incentivo e conhecimentos compartilhados durante as disciplinas e atividades; A secretaria do NPGCF, em especial a André, pelo apoio e amizade durante esse período; Aos centros de pesquisa NUCEM- UFS, LPCM-UFS, CMNano-UFS e NUESC-UNIT, pela oportunidade de execução das análises para o desenvolvimento desta dissertação; A CAPES e CNPq, pelo apoio financeiro concedido para a execução deste trabalho; A todos, Muito obrigada! 8 RESUMO A utilização de compósitos contendo biocerâmicas e polímeros a fim de combinar as vantagens dos materiais isolados, com o objetivo de produzir um sistema com características mecânicas apropriadas para liberação de fármacos tem sido bastante estudada nos últimos anos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver compósitos hidroxiapatita-quitosana contendo sulfadiazina de prata, um antibiótico de escolha para o tratamento de queimaduras e feridas amplas da pele, complexada em β-ciclodextrina. Os compósitos foram obtidos por meio do método de evaporação do solvente. A fim de melhorar a solubilidade da sulfadiazina de prata em meio aquoso, complexos de inclusão foram obtidos por malaxagem, em diferentes razões estequiométricas de sulfadiazina de prata/β-ciclodextrina (1:1, 1:2 e 1:3) respectivamente. Após obtenção, os complexos, os compósitos e seus componentes isolados foram caracterizados por calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria, espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier, difração de raios X e microscopia eletrônica de varredura. O desenvolvimento do método de doseamento e a eficiência de complexação do fármaco foram realizados por cromatografia líquida de alta eficiência. Os resultados de caracterização referentes aos componentes isolados, mistura física e complexos de inclusão obtidos, permitiram visualizar interações entre o fármaco e a βciclodextrina, sugerindo a complexação. Os resultados de caracterização dos compósitos e seus componentes permitiram visualizar possíveis interações entre a hidroxiapatita, quitosana e os complexos de inclusão demonstrando que houve a formação do compósito após incorporação do fármaco. O método de doseamento foi desenvolvido e apresentou resposta linear na faixa de concentração de 0,003 a 0,03 mg/mL, com r² = 0,9996, e o ensaio demonstrou precisão, exatidão, limite de quantificação, limite de detecção e robustez adequadas para a investigação do doseamento do fármaco. Os complexos de inclusão 1:1 obtiveram maior eficiência de complexação da sulfadiazina de prata em β-ciclodextrina (32,15%). Dessa maneira, a razão estequiométrica 1:1 mostrou-se suficiente para formação do complexo de inclusão de sulfadiazina de prata/β-ciclodextrina, e posteriormente, foi favorável ao ser incorporado ao compósito hidroxiapatita/quitosana. Palavras chave: Compósitos; quitosana, sulfadiazina de prata; sistemas de liberação. 9 ABSTRACT The use of composites containing bioceramics and polymers in order to combine the advantages isolated materials, with the aim of producing a system with suitable mechanical characteristics for drug delivery has been widely studied in recent years. Thus, the aim of this work was to develop hydroxyapatite-chitosan composites containing silver sulfadiazine, an antibiotic of choice for treatment of burns and skin extensive wounds, complexed in β-cyclodextrin. The composites were obtained by solvent evaporation method. In order to improve the solubility of the silver sulfadiazine in an aqueous medium, inclusion complexes were obtained by paste method, at different stoichiometric ratios silver sulfadiazine/β-cyclodextrin (1:1, 1:2 and 1:3), respectively. After procurement, the complexes, composites and its individual components were characterized by differential scanning calorimetry, thermogravimetry, Fourier transformed infrared, X-ray diffraction and scanning etectron microscopy. The development of the assay method and the drug complexation efficiency was performed by high performance liquid chromatography. The characterization results of the components, physical mixture and inclusion complexes obtained, allowed us to visualize the interaction between the drug and βcyclodextrin, suggesting complexation. The characterization results of the components and composites showed possible interactions between hydroxyapatite, chitosan and inclusion complexes demonstrating that there was formation of the composite after incorporation of the drug. The drug assay method was developed and showed a linear response in the concentration range from 0.003 to 0.03 mg/mL, with r² = 0.9996, and the test showed precision, accuracy, quantification limit, detection limit and robustness adequate for investigation of drug dosing. The inclusion complexes 1:1 had higher complexation efficiency of silver sulfadiazine in βcyclodextrin (32.15%). Thus, the stoichiometric ratio 1:1 proved to be sufficient for formation of the inclusion complex of silver sulfadiazine/β-cyclodextrin, and subsequently was favorable to be incorporated into the hydroxyapatite/chitosan composites. Keywords: Composites; chitosan, silver sulfadiazine; delivery systems. 10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17 2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 19 2.1 Sistemas de liberação de fármacos .................................................................... 19 2.2 Polímeros ............................................................................................................ 20 2.3 Quitosana ............................................................................................................ 20 2.4 Filmes de quitosana ............................................................................................ 22 2.5 Compósitos ......................................................................................................... 23 2.6 Sulfadiazina de prata ........................................................................................... 26 2.7 Ciclodextrinas ...................................................................................................... 27 2.8 Técnicas utilizadas para caracterização físico-química ....................................... 31 2.9 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .................................................. 32 3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 34 3.1 Geral.................................................................................................................... 34 3.2 Específicos .......................................................................................................... 34 4 METODOLOGIA .................................................................................................... 35 4.1 Material................................................................................................................ 35 4.1.1 Reagentes e solventes ..................................................................................... 35 4.1.2 Equipamentos .................................................................................................. 35 4.2 Métodos............................................................................................................... 36 4.2.1 Obtenção dos complexos de inclusão .............................................................. 36 4.2.2 Obtenção da pasta de hidroxiapatita ................................................................ 37 4.2.3 Obtenção dos compósitos ................................................................................ 37 4.2.4 Caracterização dos componentes, dos complexos de inclusão e dos compósitos ................................................................................................................ 38 4.2.4.1 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) ................................................... 38 4.2.4.2 Termogravimetria e termogravimetria derivada (TG/DTG) ............................ 39 4.2.4.3 Determinação de umidade por Karl Fisher .................................................... 39 4.2.4.4 Espectroscopia de absorção na região do Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)....................................................................................................... 39 4.2.4.5 Difração de Raios X (DRX) ............................................................................ 40 11 4.2.4.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) .................................................. 40 4.2.5 Desenvolvimento do método de doseamento da sulfadiazina de prata por CLAE ......................................................................................................................... 40 4.2.5.1 Condições cromatográficas ........................................................................... 41 4.2.5.2 Determinação da linearidade da curva analítica ............................................ 41 4.2.5.3 Precisão ........................................................................................................ 41 4.2.5.4 Exatidão ........................................................................................................ 42 4.2.5.5 Limite de detecção e quantificação ............................................................... 42 4.2.5.6 Robustez ....................................................................................................... 43 4.2.5.7 Determinação da eficiência de complexação da sulfadiazina de prata nos complexos de inclusão por CLAE.............................................................................. 43 4.2.6 Análise Estatística ............................................................................................ 44 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 45 5.1 Caracterização dos complexos de inclusão ........................................................ 45 5.1.1 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) ...................................................... 45 5.1.2 Termogravimetria e termogravimetria derivada (TG/DTG) ............................... 47 5.1.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)............................................................................................................ 52 5.1.4 Difração de Raios X (DRX) ............................................................................... 55 5.1.5 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ..................................................... 57 5.2 Caracterização dos compósitos .......................................................................... 58 5.2.1 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) ..................................................... 58 5.2.2 Termogravimetria e termogravimetria derivada (TG/DTG) ............................... 60 5.2.3 Difração de Raios X (DRX) ............................................................................... 64 5.2.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ..................................................... 66 5.3 Desenvolvimento do método de doseamento da sulfadiazina de prata por CLAE .................................................................................................................................. 69 5.3.1 Linearidade....................................................................................................... 69 5.3.2 Precisão ........................................................................................................... 70 5.3.3 Exatidão ........................................................................................................... 72 5.3.4 Limite de detecção e quantificação .................................................................. 73 5.3.5 Robustez .......................................................................................................... 73 12 5.3.6 Determinação da eficiência de complexação da sulfadiazina de prata nos complexos de inclusão por CLAE.............................................................................. 74 6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 76 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 76 APÊNDICE.................................................................................................................84 13 Índice de figuras Figura 1. Estrutura química da quitosana. Fonte: (AZEVEDO et al., 2008). ............. 21 Figura 2. Estrutura cristalina da hidroxiapatita. Fonte:(Adaptada de IVANOVA, 2001) .................................................................................................................................. 24 Figura 3. Estrutura química da sulfadiazina de prata. Fonte: (ROCHA et al., 2011).26 Figura 4. Estrutura e propriedades de α-, β- e γ-CD. Fonte: (VENTURINI et al., 2008). ........................................................................................................................ 28 Figura 5. Curvas DSC da Beta-ciclodextrina (β-CD), Sulfadiazina de prata (SDAg), Mistura-física (MF), Complexo inerte (Cinerte 1:1), Complexo SDAg/β-CD 1:1 (CSDAg 1:1), Complexo SDAg/β-CD 1:2 (CSDAg 1:2) e Complexo SDAg/β-CD 1:3 (CSDAg 1:3) analisadas em atmosfera de N2 (50 mL min-1), com razão de aquecimento de 10 °C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 400 °C. ................. 46 Figura 6. Curvas TG da β-CD, SDAg, MF, Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDZ 1:2 e CSDAg 1:3 analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10 °C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 800 °C. ................. 48 Figura 7. Curvas DTG da β-CD, SDAg, MF, Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3 analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10°C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 800 °C. .................. 51 Figura 8. Espectros de FTIR da β-CD, SDAg e MF analisadas de 4000-400 cm-1. .. 53 Figura 9. Espectros de FTIR do Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3, analisadas de 4000-400 cm-1. ................................................................................... 54 Figura 10. Difratograma de raios X da β-CD, SDAg, MF, Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3. ......................................................................................... 56 Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura da β-CD, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3 com aumento de 400x e 2000x. ............................................................. 58 Figura 12. Curvas DSC da HAP, QUI e compósitos HAP/QUI, HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2, analisadas em atmosfera de N2 (50 mL min-1), com razão de aquecimento de 10 °C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 400 °C. ............................................................................ 59 Figura 13. Curvas TG da HAP, QUI e compósito HAP/QUI (HAP/QUI) analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10°C min -1 na faixa de temperatura entre 25 °C e 800 °C. ....................................................................... 61 Figura 14. Curvas DTG da HAP, QUI e compósito HAP/QUI analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10°C min-1 na faixa de temperatura entre 25 °C e 800 °C. ....................................................................... 61 14 Figura 15. Curvas TG dos compósitos HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2 analisadas em atmosfera de N 2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10 °C min-1. .................................................... 63 Figura 16. Curvas DTG dos compósitos HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2 analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10 °C min-1. .................................................... 63 Figura 17. Difratograma de raios X da HAP, QUI e do compósito HAP/QUI (HAP/QUI). ................................................................................................................ 65 Figura 18. Difratograma de raios X dos compósitos QUI/HAP em diferentes proporções orgânico/inorgânico incorporados com complexos de inclusão nas razões 1:1 e 1:2 (HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2). ................................................................................................. 66 Figura 19. Micrografias eletrônicas de varredura dos compósitos na ausência de SDAg (HAP/QUI 60/40) e na presença de SDAg (HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2) obtidas nos aumentos de 1000x e 3000x. ................................................ 67 Figura 20. Micrografias eletrônicas de varredura dos compósitos na ausência de SDAg (HAP/QUI 40/60) e na presença de SDAg (HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2) obtidas nos aumentos de 1000x e 3000x. ................................................ 68 Figura 21. Representação gráfica da curva analítica da solução de SDAg obtido a 254 nm por CLAE. ..................................................................................................... 69 Figura 22. Cromatograma da solução estoque de SDAg na concentração de 0.005 mg/mL obtido a 254 nm por CLAE. ........................................................................... 70 15 Índice de tabelas Tabela 1: Propriedades físico-químicas da α, β e γ- ciclodextrina. ........................... 29 Tabela 2: Razão estequiométrica entre β-ciclodextrina e sulfadiazina de prata. ...... 37 Tabela 3: Relação das diferentes proporções dos constituintes para formação dos compósitos. ............................................................................................................... 38 Tabela 4: Percentuais de perdas de massa da β-CD, SDAg, MF, Cinerte, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3, obtidos por TG em faixas de temperaturas diferentes. .................................................................................................................................. 49 Tabela 5: Percentuais do teor de água das amostras obtidos por Karl Fischer. ....... 51 Tabela 6: Percentuais de perdas de massa dos compósitos (HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2), em faixas de temperaturas diferentes. ........................................................................................... 62 Tabela 7. Repetibilidade do método de quantificação da SDAg por CLAE. .............. 71 Tabela 8. Precisão intermediária do analista 1 em dias diferentes do método de quantificação da SDAg por CLAE. ............................................................................ 71 Tabela 9. Precisão intermediária do analista 2 em dias diferentes do método de quantificação da SDAg por CLAE. ............................................................................ 72 Tabela 10. Valores obtidos no teste de recuperação para SDAg por CLAE a 254 nm em três níveis de concentração................................................................................. 70 Tabela 11. Parâmetros analíticos variáveis para determinação da robustez. ........... 74 Tabela 12. Percentuais da eficiência de complexação da MF e dos complexos de SDAg/β-CD nas diferentes razões estequiométricas. ............................................... 74 16 Índice de Equações Equação 1: Coeficiente de variação.............................................................. 42 Equação 2: Equação para determinação da Exatidão.................................. 42 Equação 3: Limite de detecção..................................................................... 42 Equação 4: Limite de quantificação............................................................... 42 17 1 INTRODUÇÃO O tratamento de desordens, defeitos e doenças envolvendo o tecido, como no caso de queimaduras graves, é uma problemática que vem sendo tratada clinicamente com a substituição parcial ou total do tecido lesionado. Novas estratégias são amplamente discutidas e estudadas devido às complicações decorrentes do processo de reposição e cicatrização, tais como infecções, septicemia e até óbito (FAJARDO et al., 2013; HEGASY et al., 2013; MORSI et al., 2014). Um dos tratamentos tópicos padrão em queimaduras é a utilização de sulfadiazina de prata, um agente antibacteriano eficaz no tratamento de feridas e queimaduras (GURFINKEL et al., 2012). Este fármaco combina a ação inibitória do sal de prata, juntamente com o efeito antibacteriano da sulfadiazina. Além disso, a prata, também possui atividade antimicrobiana eficaz em uma ampla gama de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, bem como propriedades antifúngicas (HEGASY et al., 2013). Outros tipos de combinações de medicamentos da família das sulfonamidas com prata foram testados in vitro, porém a sulfadiazina de prata pareceu ser o mais eficaz. Uma explicação possível pra tal eficácia, pode ser relativo a forte ligação de sulfadiazina de prata ao DNA bacteriano, que é diferente dos demais sais de prata (KLASEN, 2000). Nos últimos anos, tem aumentado a procura de materiais para cicatrização de feridas provocadas por queimaduras na liberação de doses precisas de sulfadiazina de prata. O desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos tem sido bastante relevante por estabelecer alternativa terapêutica mais eficiente, que possibilitem administrar os medicamentos com mais segurança e com efeitos colaterais minimizados (FELICE (MOHAMMADPOURDOUNIGHI, et BEHFAR, al., et al., 2014). 2010), Nanopartículas géis, compósitos (JAHANSHAHI et al., 2012), ciclodextrinas (HEGASY et al., 2013), filmes poliméricos 18 (FAJARDO et al., 2013), lipossomas, dentre outros, tem sido estudados como alternativa frente ao uso dos sistemas clássicos. A utilização de compósitos como veículo promissor na liberação de fármacos cresceu nos últimos anos na área de Engenharia tecidual, e tem atraído a atenção de muitos pesquisadores. Devido à possibilidade de combinar as vantagens de diferentes materiais com o objetivo de produzir um sistema único com propriedades e estruturas melhoradas (FAJARDO et al., 2013; MORSI et al., 2014). O desenvolvimento de compósitos bioativos formados pela associação de hidroxiapatita e quitosana tornou-se interessante, pois a hidroxiapatita confere uma maior resistência mecânica ao sistema e a quitosana é uma matriz importante que reforça a sua indicação como sistema de liberação de fármacos (FAJARDO et al., 2013; PIGHINELLI e KUCHARSKA, 2013; BABAEI et al., 2013). Logo, o desenvolvimento do compósito hidroxiapatita/quitosana para liberação da sulfadiazina de prata no tratamento de queimaduras na pele, mostra-se adequada. No entanto, a sulfadiazina de prata apresenta baixa solubilidade em sistemas aquosos e sofre oxidação quando exposta a luz e umidade (HEGASY et al., 2013). Para ser farmacologicamente ativo, todos os fármacos devem possuir algum grau de solubilidade em água. Considerando tais aspectos, a utilização de ciclodextrinas para formação de complexos de inclusão tem sido sugerida com o propósito de melhorar a solubilidade e estabilidade do fármaco neles complexado. Neste contexto, a complexação da sulfadiazina de prata em ciclodextrina torna-se uma opção viável para contornar os problemas de solubilidade e estabilidade do fármaco e, posteriormente, na incorporação em compósitos hidroxiapatita/quitosana para o tratamento de feridas e queimaduras. 19 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Sistemas de liberação de fármacos O interesse na busca de novos sistemas de liberação de fármacos é bastante relevante para desenvolver novas formulações, otimizar preparações farmacêuticas e contribuir com a busca de alternativas terapêuticas modernas, mais eficientes e com efeitos colaterais minimizados. A liberação de um fármaco a partir da sua forma farmacêutica e sua subseqüente absorção são eventos controlados pelas propriedades físico-químicas do fármaco, da forma farmacêutica, das características fisiológicas e fisico-químicas do sistema biológico (AULTON, 2005). Os sistemas de liberação modificados de fármacos permitem aperfeiçoar a liberação de um fármaco até seu local de ação, e oferecem diversas vantagens quando comparados com os sistemas de liberação convencional, dentre elas: a maior eficácia terapêutica; a diminuição da toxidade e maior tempo de permanência do fármaco na circulação; a administração segura e conveniente (menor número de dose); o aumento da estabilidade do fármaco; o direcionamento a alvos específicos; e a capacidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas como lipofílicas (FELICE et al., 2014). Dentre os principais sistemas, incluem-se géis, compósitos (JAHANSHAHI et al., 2012), nanopartículas (MOHAMMADPOURDOUNIGHI et al., 2010), ciclodextrinas (HEGASY et al., 2013) e filmes poliméricos (FAJARDO et al., 2013). Entre os sistemas de liberação utilizados para aplicações farmacêuticas, destacam-se os sistemas poliméricos. Estes, pela sua variedade, versatilidade e propriedades são a classe de materiais mais investigada no desenvolvimento de tais sistemas. Dentre as principais características para que os materiais poliméricos possam ser utilizados nesses sistemas é ser biocompatível, isto é, não produzir reação adversa e ter habilidade de desencadear em um organismo a resposta apropriada para uma aplicação específica, e ser, de preferência, biodegradável (SWETHA et al., 2010; FAJARDO et al., 2013). 20 Os sistemas poliméricos de liberação modificada de fármacos podem ser agrupados, de acordo com a sua estrutura, em sistemas matriciais e em sistemas reservatórios. Nos sistemas matriciais, o fármaco é adsorvido ou solubilizado no interior de uma matriz polimérica. Enquanto que nos sistemas reservatórios, o fármaco se encontra envolvido por uma membrana polimérica, isolando o núcleo do meio externo, retardando a liberação do fármaco (SCHAFFAZICK et al., 2003). Dessa maneira, a melhoria no desenvolvimento de sistemas de liberação modificada depende da seleção de um agente apropriado capaz de controlar a liberação do fármaco, manter a ação terapêutica ao longo do tempo e/ou de liberar o fármaco em um determinado tecido ou órgão alvo. Dentro das opções, os polímeros são agentes versáteis e promissores para exercer tal função (LOPES et al., 2005; SWETHA et al., 2010). 2.2 Polímeros Vários polímeros vêm sendo estudados e utilizados nos sistemas de liberação de fármacos com o intuito de liberá-los efetivamente no alvo pretendido e, dessa maneira, aumentar os benefícios terapêuticos do tratamento. Polissacarídeos naturais e seus derivados representam um grupo de polímeros largamente utilizados em formas farmacêuticas, sendo preferidos, em detrimento de polímeros sintéticos, devido à baixa toxicidade, baixo custo e disponibilidade. Aliado a isto, a biodegradabilidade, características filmogênicas e facilidade de processamento têm constituído um elemento de elevado interesse destes como excipientes farmacêuticos. Em particular, os polímeros naturais, como a quitosana, têm sido extensivamente utilizada em pesquisas nessa área, devido às suas propriedades (SHI, YUBAO e ZHANG, 2008; SWETHA et al., 2010; MUZZARELLI et al., 2011; FAJARDO et al., 2013). 2.3 Quitosana A quitosana é um polímero natural proveniente da reação de desacetilação da quitina, o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza, encontrado principalmente no exoesqueleto de insetos e nas carapaças de crustáceos (DAROZ et al., 2008). Sua estrutura química é formada por uma sequência linear de açúcares 21 monoméricos do tipo β-(1→4)-2-amino 2-desoxi-D-glicose e β-(1→4)-2-acetamida 2desoxi-D-glicose com a presença de grupos amino; e grupos hidroxila primário e secundário, como representado na Figura 1 (THEIN-HAN et al., 2009; XIANMIAO et al., 2009). Figura 1. Estrutura química da quitosana. Fonte: (AZEVEDO et al., 2008). Do ponto de vista econômico, a principal fonte de obtenção da quitosana é através da N-desacetilação alcalina da quitina. O processo de desacetilação representa a proporção de grupos amino livres presentes na cadeia polimérica e é descrito por influenciar o grau de pureza do polímero e suas propriedades físicoquímicas, como solubilidade, pKa e viscosidade (SANTOS et al., 2003; SILVA et al., 2006). O grau de desacetilação da quitosana em produtos comerciais normalmente se encontra na faixa de 70 a 95%, e a massa molar média entre 10 e 1000 kDa (BARROS et al., 2006). Os grupamentos funcionais amino e hidroxilas da quitosana estão relacionados às características de solubilidade e reatividade que esse polímero apresenta. Quanto à solubilidade, a quitosana é uma base fraca com valor de pKa em torno de 6,5, sendo, portanto, insolúvel em valores de meio neutro e alcalino, mas forma sais solúveis em água com ácidos inorgânicos e orgânicos fracos, incluindo ácido glutâmico, clorídrico, láctico e acético, resultando em soluções viscosas (SANTOS et al., 2003). Em meio ácido, é um polieletrólito catiônico que tem seus grupos aminos protonados (NH+3), conferindo à molécula cargas positivas podendo formar complexos eletrostáticos com espécies carregadas negativamente incluindo proteínas, enzimas, outros polímeros naturais ou sintéticos, fármacos e ânions de baixa massa molar (ZHANG et al., 2002). 22 Devido à natureza de sua configuração química e as suas propriedades, tais como: sua abundância, não toxicidade, hidrofilicidade, biodegradabilidade, biocompatibilidade e propriedades antibacterianas (AZEVEDO et al., 2007), a quitosana tem sido empregada na preparação de filmes, géis e esferas, para os mais diversos fins (SILVA et al., 2006; AZEVEDO et al., 2007) e tem despertado muito interesse em diversas áreas tecnológicas, como biotecnologia, cosméticos, processamento de alimentos, produtos biomédicos (pele artificial, adesivos cutâneos ou curativos, lentes de contato, etc.) e sistemas de liberação de fármacos (FAJARDO et al., 2013; SWETHA et al., 2010; MUZZARELLI et al., 2011). Especificamente, na área médica e de farmacêutica, podemos destacar o uso da quitosana como biomaterial e como excipiente em formulações farmacêuticas e em sistemas de liberação de fármacos (SWETHA et al., 2010; MUZZARELLI et al., 2011). Além disso, é capaz de formar filmes para aplicação em pele e mucosa. Silva et al. (2008) desenvolveram filmes de quitosana com boas propriedades para a aplicação na pele, representando uma formulação promissora para incorporação de fármacos para administração tópica e transdérmica. 2.4 Filmes de quitosana De uma maneira geral, pode-se definir um filme como uma barreira fina entre duas fases (PORTER, 1990). Uma técnica simples para o preparo de filmes de quitosana é a simples evaporação do solvente de uma solução desse polímero disposta sobre uma placa de vidro, produzindo, geralmente, filmes flexíveis, resistentes e com elevada absortividade à água (SCHROEDER et al., 2007). Essa absorção de água induz o intumescimento do filme, ou seja, a separação das cadeias do polímero permitindo a troca gasosa (DESPOND et al., 2001; ASSIS e SILVA, 2003). Filmes obtidos a partir da quitosana pura, têm sido utilizados com sucesso na produção de curativos e de pele artificial para o tratamento de queimaduras, por promover uma rápida cicatrização do tecido e diminuir os riscos de infecção da região afetada (RHIM et al., 2006; AOYAGI et al., 2007; FAJARDO et al., 2013). Os grupos reativos amino e hidroxilas da quitosana também permitem o estabelecimento de diferentes tipos de interação deste polímero com diferentes tipos 23 de fármacos dando origem aos sistemas de liberação de fármacos, como por exemplo, aqueles obtidos para liberação de antibióticos. Os fármacos quando veiculados nesses sistemas podem ser liberados de forma gradual, em sítios de ação local ou sistêmica, melhorando a eficácia terapêutica, além de poderem ser aplicados na superfície da pele ou na mucosa (PEPPAS et al., 2000; FAJARDO et al., 2013). Senel et al. (2000) relataram que a liberação controlada de clorexidina incorporada em filmes de quitosana é uma proposta promissora para aplicação na cavidade oral. Denkbas et al. (2004) desenvolveram esponjas de quitosana impregnadas de norfaloxina para recobrimento de ferida e, ao mesmo tempo, liberação controlada do antibiótico. Outro estudo utilizando filmes de quitosana como carreadores de antibióticos foi demonstrado por Nascimento et al. (2009) na qual, os autores mostraram que o uso tópico do gel de quitosana com sulfadiazina de prata a 1% promoveu a neovascularização e reduziu a reação inflamatória em queimaduras e essa nova formulação mostrou boas propriedades associadas a eficiente liberação do fármaco. O aumento do interesse nas aplicações biomédicas da quitosana tem gerado oportunidades de produção de biomateriais especializados, principalmente com novas modificações químicas e físicas, as quais têm promovido novas atividades biológicas para fins específicos. Estas estratégias também têm envolvido a combinação da quitosana com outros polímeros e materiais inorgânicos na produção de compósitos (HEIN et al., 2008; SWETHA et al., 2010). 2.5 Compósitos Geralmente, qualquer material consistindo de dois ou mais componentes com diferentes propriedades, com fases macroscopicamente identificadas, pode ser classificado como material compósito (FONSECA et al., 2008; YUAN et al., 2008). Assim, a idéia principal em se produzir um compósito é combinar dois ou mais componentes para produzir um material com propriedades que não são atingidas com os componentes originais isoladamente (LI et al., 2009). Atualmente, um dos caminhos para a formação de novos substitutos de tecidos é a obtenção de compósitos contendo biocerâmica e polímeros biodegradáveis (LI et al., 2009; 24 SWETHA et al., 2010; NIKPOUR et al., 2012; ROGINA et al., 2013; MOHAMED et al., 2014). Biocerâmicas naturais (hidroxiapatita, carbonato de cálcio) são conhecidos por apresentarem um arcabouço que pode prover um suporte físico que viabiliza a manutenção de várias funções do tecido (MUZZARELLI et al., 2011; ARMENTANO et al., 2010). A hidroxiapatita é uma biocerâmica composta de cálcio e fósforo, que se assemelha ao maior constituinte inorgânico dos tecidos duros, o que evita a possibilidade de rejeição e favorece a regeneração do tecido cicatricial (NIKPOUR et al., 2012). Ela pode ser de origem natural ou sintética (ARMENTANO et al., 2010), as de origem natural, entretanto, apresentam como limitantes os fatores econômicos, por tratar-se de um procedimento complexo que requer gastos, como também de contaminações (KUMAR et al., 2010). A estrutura da hidroxiapatita está representada na Figura 2, onde os grupos fosfatos, hidroxilas e cálcio, distribuem-se espacialmente segundo um sistema hexagonal. Figura 2. Estrutura cristalina da hidroxiapatita. Fonte:(Adaptada de IVANOVA, 2001) Uma variedade de métodos sintéticos pode dar origem a cristais de hidroxiapatita, tais como precipitação, sol-gel, microemulsão, mecânico-químico e hidrotérmico. A depender da metodologia aplicada são formadas partículas com diversas morfologias e cristalinidade (YUAN et al., 2008; KUMAR et al., 2010). Dentre estes métodos, o da reação e precipitação por via úmida apresenta vantagens como mistura homogênea, baixa temperatura de síntese e capacidade de formar nanocristais. 25 A hidroxiapatita é altamente reconhecida em aplicações médicas por apresentar excelente biocompatibilidade, bioatividade, osteocondutividade e ausência de reações inflamatórias e tóxicas (XIANMIAO et al., 2009; YUAN et al., 2008; NIKPOUR et al., 2012; MOHAMED et al., 2014). A combinação da hidroxiapatita com outros materiais têm sido amplamente estudada (ROGINA et al., 2013). Vários biopolímeros têm sido empregados, tais como colágeno, cola de fibrina, gelatina, quitosana, poliácido láctico e alginato de sódio (YUAN et al., 2008; ROGINA et al., 2013) na preparação de compósitos com características mecânicas melhoradas. Neste sentido, encontram-se os compósitos formados pela associação de hidroxiapatita e quitosana (YUAN et al., 2008; LI et al., 2009; NIKPOUR et al., 2012). Os compósitos envolvem geralmente a presença de um componente inorgânico (hidroxiapatita), cujas funções são dar resistência mecânica, físico e química adequadas ao compósito e a presença de uma matriz polimérica (quitosana) que juntos proporcionam a liberação controlada de fármacos, complementando as propriedades dos compósitos (FONSECA et al., 2008; ROGINA et al., 2013). A quitosana vem sendo relatada como uma boa matriz para esses sistemas, pois apresenta boa flexibilidade, ideal para uma matriz polimérica que se objetiva associar a hidroxiapatita. Já que a hidroxiapatita têm sido aplicada como suporte de cargas para oferecer a resistência mecânica necessária aos compósitos, e dessa forma prolongar ou controlar a liberação de fármacos. Alguns autores observaram que compósitos dessa natureza são mecanicamente flexíveis e podem ser facilmente moldáveis com formatos desejáveis (ROGINA et al., 2013; PIGHINELLI e KUCHARSKA, 2013; MOHAMED et al., 2014). O desenvolvimento de compósitos contendo quitosana e hidroxiapatita têm sido preparados pelo método de evaporação do solvente para diversas aplicações em engenharia de tecidos (KITHVA et al., 2010). A partir dos resultados obtidos, os autores afirmaram que, além da dispersão uniforme de partículas de hidroxiapatita na matriz de quitosana, a ligação química entre os componentes desempenhou um papel importante nas propriedades de tensão observadas. Kong et al. (2006) realizaram um estudo in vitro para investigar a bioatividade da hidroxiapatita/quitosana e observou que os compósitos apresentaram melhor bioatividade do que a quitosana isolada. 26 Dessa forma, é interessante desenvolver compósitos hidroxiapatita/quitosana para estudar o comportamento mecânico a partir da presença de hidroxiapatita como partícula de carga no perfil de liberação de fármacos. 2.6 Sulfadiazina de prata A sulfadiazina de prata (SDAg) é um antibiótico tópico pertencente à classe das sulfonamidas. Foi desenvolvida por Charles L. Fox Jr., da Universidade de Columbia, Estados Unidos, por meio da associação de dois agentes antibacterianos já conhecidos e utilizados no tratamento de queimaduras – nitrato de prata e sulfadiazina – criando, assim, um composto extremamente efetivo contra infecções, aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA), em 1973 (RAGONHA et al., 2005). A partir de sua aprovação, tornou-se o fármaco de escolha para o tratamento de queimaduras, pois possui propriedades cicatrizantes, oferecendo aumento na sobrevida dos pacientes queimados devido ao amplo espectro de ação antimicrobiano. A SDAg (Figura 3), cuja fórmula é C10H9AgN4O2S, apresenta peso molecular de 357,14 g/mol, disposta na forma de pó cristalino de coloração branca à ligeiramente amarelada. É praticamente insolúvel em água, etanol, éter e clorofórmio. A configuração dos íons de prata é uma bipirâmide trigonal distorcida. Além disso, cada prata é coordenada a um nitrogênio da pirimidina e mais um íon prata da cadeia vizinha (VOGLER; KUNKELY, 1989). Figura 3. Estrutura química da sulfadiazina de prata. Fonte: (ROCHA et al., 2011). Seu mecanismo de ação está diretamente ligado ao íon de prata que causa a precipitação de proteínas e age diretamente na membrana citoplasmática da célula 27 bacteriana, exercendo ação bactericida imediata, e ação bacteriostática residual, pela liberação de pequenas quantidades de prata iônica (PATEL et al., 2008; HEGASY et al., 2013; MORSI et al., 2014). MORSI et al., (2014) desenvolveram e caracterizaram um novo sistema nanoparticulado carregado com sulfadiazina de prata para o tratamento tópico de queimaduras de segundo grau. Lichtensteisn e Margalit (1995) desenvolveram lipossomas contendo SDAg, com altos níveis de encapsulamento e capacidade de liberação prolongada da SDAg, que pode agir como um bioadesivo quando aplicado topicamente. Nascimento et al., (2009) também obtiveram uma formulação a partir de um gel de quitosana, contendo SDAg a 1%, o qual mostrou uma maior evolução no processo de cicatrização da pele. Rajendran et al., (2014) avaliaram a estabilidade da hidroxiapatita na presença de diferentes concentrações de prata, durante o processo de síntese em temperaturas diferentes. Os resultados de difração de raios X revelaram um aumento de cristalinidade embora a hidroxiapatita se manteve estável. Além disso, o estudo antibacteriano contra Staphylococcus aureus a partir dos compósitos hidroxiapatita/prata com 1, 3 e 5% (p/p) de prata mostrou que 3% em peso de prata é suficiente para matar as bactérias envolventes, indicando aplicações potenciais para intervenções terapêuticas. Dessa forma, a contribuição da hidroxiapatita como partícula de carga para melhorar as propriedades mecânicas dos compósitos torna-se também importante no estudo do perfil de liberação da sulfadiazina de prata, a partir do sistema formado. Porém, a sulfadiazina de prata possui baixa solubilidade em sistemas aquosos e sofre oxidação quando exposta a luz e umidade. Neste contexto, a utilização de ciclodextrinas é viável, pois podem melhorar a solubilidade e estabilidade do fármaco neles complexado. 2.7 Ciclodextrinas Um dos campos mais promissores a ser explorado na tentativa de superar a pouca solubilidade de alguns compostos é através do uso de ciclodextrinas. As ciclodextrinas (CDs) foram descobertas por Villiers em 1891, a partir do produto 28 de degradação do amido em um meio de cultura de Bacillus amylobacter, a qual denominou "celulosina", por suas características semelhantes à celulose. Por volta de 1904, Schardinger descreveu detalhes da sua preparação, caracterização, isolamento e a determinação das suas estruturas. Também as denominou por ciclomaltose, cicloamilose ou dextrinas de Schardinger. Nos anos posteriores Freudenberg e French ampliaram os conhecimentos das CDs quanto à sua produção enzimática, fracionamento e a caracterização de suas propriedades (ELLOUZE et. al., 2011). As CDs são oligossacarídeos cíclicos compostos de unidades de glicose. As CDs obtidas com maior rendimento, conhecidas como naturais, contém seis, sete e oito unidades de glicose, sendo denominadas de α-ciclodextrina (α-CD), βciclodextrina (β-CD) e γ-ciclodextrina (γ-CD), respectivamente, unidas por ligações glicosídicas α-(1-4), como representado na Figura 4. Figura 4. Estrutura e propriedades de α-, β- e γ-CD. Fonte: (VENTURINI et al., 2008). Uma conseqüência estrutural dessas ligações glicosídicas α-(1-4), é a formação de uma molécula num formato semicircular tipo cone truncado (Figura 4), garantindo a esta molécula uma cavidade de dimensões apropriadas, o que depende do número de unidades de glicose, com grupos hidroxil em suas unidades 29 de α-glicose. Os chamados grupos hidroxil primários (grupos hidroximetil: – CH2OH) situam-se na abertura mais estreita deste cone, enquanto os grupos hidroxil secundários situam-se na abertura mais larga. Uma característica importante destes grupos hidroxil é seu caráter hidrofílico, promovendo a solubilização das CDs em meio aquoso (VENTURINI et al., 2008). Destas, a β-ciclodextrina parece ser a mais vantajosa para utilização farmacêutica como agente complexante, devido as suas propriedades físicoquímicas e ao tamanho da sua cavidade (Tabela 1). Pórem, a β-CD possui baixa solubilidade em água, quando comparada aos outros tipos de CDs. A explicação para este efeito é que a molécula de β-CD apresenta um cinto secundário constituído de ligações de hidrogênio, e com isso forma-se uma estrutura rígida e estável (VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006; SZEJTLI, 1998). Tabela 1: Propriedades físico-químicas da α, β e γ- ciclodextrina. α-CD β-CD Unidade de glicose γ-CD 6 7 8 Massa molar (g/mol) 972 1135 1297 Solubilidade aquosa (g/100 mL a 25ºC) 14,5 1,85 23,2 4,7-5,3 6,0-6,5 7,5-8,3 7,9±0,1 7,9±0,1 7,9±0,1 174 262 427 12,333 12,202 12,081 Diâmetro interno (Ǻ) Altura da estrutura (Ǻ) Volume da estrutura (Ǻ) 3 pKa (25ºC) Fonte: Adaptado de SZEJTLI, 1994; VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006. A presença das hidroxilas livres na parte externa das CDs confere a essas moléculas um caráter hidrofílico, devido às hidroxilas primárias e secundárias, e uma cavidade interna relativamente hidrofóbica devido ao oxigênio das ligações glicosídicas que, por sua vez, permite as ciclodextrinas complexarem-se com moléculas que apresentam dimensões compatíveis com a sua cavidade. A complexação altera as propriedades físico-químicas, como a solubilidade em água, estabilidade e biodisponibilidade de fármacos complexados (ARAÚJO et al., 2003; BRITTO et al., 2004; VENTURINI et al., 2008). O complexo de inclusão em solução aquosa ocorre na medida em que a cavidade levemente apolar da CD é ocupada por moléculas de água que são 30 energeticamente desfavoráveis, dada a natureza da interação polar-apolar e, portanto, podem ser facilmente substituídas por um substrato que seja menos polar que a água. Considera-se que a força motriz para a complexação seja a substituição das moléculas de água de alta entalpia por substratos apropriados. Esse processo leva a complexação total ou parcial da molécula hóspede na cavidade da CD, tornando-a solúvel em água (BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Os compostos viáveis de se tornarem substratos em complexos de inclusão são extensos, pode-se citar os compostos alifáticos de cadeia linear ou ramificada, aldeídos, cetonas, álcoois, ácidos orgânicos, ácidos graxos, compostos aromáticos, aminas, etc., que podem, ainda, se apresentar nos estados sólido, líquido e gasoso (WANG et al., 2011). Devido a essa gama de possibilidades, vários métodos de preparação dos complexos de inclusão são reportados a fim de se adequar melhor ao sistema disponível, porém, todos eles se baseiam no mesmo princípio de substituição das moléculas de água presentes na cavidade hidrofóbica das CDs (MENEZES et al., 2011). O método da co-precipitação consiste na adição, com agitação constante, do composto hóspede a uma solução de CD previamente preparada, sendo o complexo posteriormente recolhido por filtração. O método de preparação de pastas (malaxagem) consiste na mistura da CD, do composto hóspede e de uma quantidade mínima de solvente que são levados a um misturador durante tempo variável, e o complexo é recolhido depois de seco sem nenhum outro tipo de tratamento. O método de mistura física envolve a mistura da CD e da molécula hóspede sem a presença de solvente, o que torna este método menos eficaz e com tempos de mistura que variam entre diversas horas e dias (DEL VALLE et al.,2004). Os complexos formados podem posteriormente ser caracterizados por diversas técnicas, nomeadamente por Espectrometria UV-Visível, por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), entre outras, tendo em vista a determinação da proporção de complexação e das propriedades físico-químicas dos complexos formados. Dessa maneira, ciclodextrinas têm sido bastante utilizadas no desenvolvimento de produtos farmacêuticos, particularmente devido às suas 31 propriedades de inclusão molecular de fármacos com características hidrofóbicas, alternando-lhes a solubilidade e consequente aumento da taxa de dissolução de fármacos pouco solúveis, aumentando a estabilidade e, em alguns casos, melhorando a biodisponibilidade (ASTRAY et al., 2009). Diniz (2007) estudando complexos de tetraciclina com β-ciclodextrina nas mesmas razões molares (1:1) também relatou diferenças nas propriedades microbiológicas e físico-químicas destes compostos sugerindo a formação de complexos diferentes entre si e com arranjos supramoleculares diferenciados. 2.8 Técnicas utilizadas para caracterização físico-química Os compósitos e complexos de inclusão podem ser caracterizados mediante a combinação de diversas técnicas, sendo estas, principalmente: os métodos termoanalíticos, calorimetria exploratória diferencial (DSC) e termogravimetria (TG), espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), a difratometria de raios X (DRX) e a microscopia eletrônica de varredura (MEV). A análise térmica dos sistemas sólidos contendo fármacos é uma das técnicas mais utilizadas para estudar suas interações com os constituintes da formulação. Dentre as técnicas termoanalíticas, a análise DSC é uma das mais requisitadas nos estudos de pré-formulação, sendo utilizada para estudar as possíveis interações intermoleculares entre fármacos e outros componentes da formulação (DEL VALLE et al.,2004). Através da TG pode se obter informações quantitativas quanto à perda de massa dos materiais, além de informações importantes da estabilidade térmica dos sistemas frente à incorporação do fármaco. A análise de FTIR pode ser utilizada para identificar moléculas através da análise das suas ligações. A importância em se aplicar esta técnica em estudos de pré-formulação deve-se ao fato de identificar os grupos funcionais através da comparação dos modos vibracionais da amostra com substâncias químicas de referência. Além disso, a espectroscopia FTIR permite identificar algumas características importantes ou alterações na composição dos compósitos e dos 32 complexos de inclusão e possíveis modificações (interações) nos diferentes grupos moleculares devido à incorporação do fármaco (CAI et al., 2009). A partir da técnica de DRX é possível observar os perfis cristalinos das amostras, referentes à sua composição e ao ordenamento cristalino das moléculas do sistema, além disso, mudanças decorridas das interações entre os componentes (KUMAR et al., 2010). A MEV é muito utilizada para a análise microestrutural de materiais sólidos, e esta técnica pode ser utilizada para investigar a morfologia do fármaco puro e modificações na presença de outros constituintes e do fármaco nos sistemas formados (XIANMIAO et al., 2009). 2.9 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) A cromatografia é definida como um procedimento pelo qual solutos são separados por um processo de migração dinâmica diferencial em um sistema que consiste de duas fases, uma estacionária, composta por sítios ativos em que o soluto interage por adsorção, partição, troca iônica, formação de pares iônicos, interações hidrofóbicas, separação quiral ou exclusão por tamanho, e outra fase, móvel, em que o soluto é transportado continuamente por um fluxo constante, e possui mobilidades diferentes devido a sua interação com a fase estacionária (COLLINS, 2006). Através desta técnica é possível identificar e quantificar substâncias através de metodologias analíticas. A CLAE é uma técnica de separação baseada em uma fase estacionária sólida e uma fase móvel líquida. Compostos a serem analisados são dissolvidas em um solvente adequado, e a maior parte das separações é realizada à temperatura ambiente. Assim, a maior parte dos princípios ativos não voláteis ou termicamente instáveis, podem ser cromatografados sem decomposição ou necessidade de formar derivados voláteis. Os módulos que fazem parte do cromatográfo líquido de alta eficiência são: bomba quaternária, injetor, forno, detector e degaseificador. Dentre os diferentes detectores para a CLAE, os detectores DAD (detector de arranjo de diodos), merecem destaque por serem amplamente utilizados no desenvolvimento de 33 metodologias analíticas. Estes detectores possuem a habilidade de medir absorvâncias de múltiplos comprimentos de onda simultaneamente na totalidade da faixa do ultravioleta-visível. Isso ocorre, pois a luz emergente é dispersa por uma grade holográfica, e os comprimentos de onda resultantes são focalizados sobre uma fila de fotodiodos. Assim, todo o espectro pode ser armazenado. A técnica de CLAE é amplamente utilizada para a avaliação da eficiência de complexação de complexos de inclusão com CDs, citada em diversos trabalhos (FLOOD et al., 2000 e KIM et al., 2010). Apesar de ter sido criada essencialmente como uma técnica de separação, passou a ocupar um lugar de destaque como técnica analítica qualitativa e quantitativa nas mais diversas aplicações e áreas, contando com um enorme número de publicações (HEGASY et al., 2013; MORSI et al., 2014). 34 3 OBJETIVOS 3.1 Geral Desenvolver compósitos hidroxiapatita-quitosana contendo sulfadiazina de prata complexada em β-ciclodextrina. 3.2 Específicos Caracterizar os materiais precursores e suas misturas físicas; Obter complexos de inclusão contendo sulfadiazina de prata em βciclodextrina nas razões estequiométricas (1:1; 1:2 e 1:3), respectivamente, utilizando os métodos de malaxagem e mistura física para melhorar a solubilidade do fármaco; Desenvolver o método de doseamento da sulfadiazina de prata complexada em β-CD por CLAE; Determinar a eficiência de complexação da sulfadiazina de prata nos complexos de inclusão por CLAE; Preparar compósitos hidroxiapatita/quitosana e incorporar os complexos de inclusão formados; Caracterizar os complexos de inclusão e compósitos por DSC, TG, FTIR, DRX e MEV. 35 4 METODOLOGIA 4.1 Material 4.1.1 Reagentes e solventes Sulfadiazina de prata (HENRIFARMA®); Quitosana média viscosidade (SIGMA ALDRICH®); β-ciclodextrina cristalina (SIGMA ALDRICH®); Metanol grau CLAE (PANREAC®); Hidróxido de amônio 28-30% (NEON®); Acetonitrila grau CLAE (PANREAC®); Ácido o-Fosfórico 85% (SYNTH®); Ácido acético glacial (ISOFAR®); Fosfato de amônio dibásico (NEON®); Nitrato de cálcio (NEON®); Água ultra pura Milli-Q (MEGAPURITY®); Membrana 0,45 µm (MILLIPORE®) 4.1.2 Equipamentos Balança analítica (DENVER® APX-200); Balança semi-analítica (ACCULAB® VIC-612); Agitador magnético (FISATOM®); Titulador Potenciométrico (METROHM® Titrando 836); Capela de fluxo laminar; Cromatógrafo líquido de alta eficiência – CLAE – Cromatógrafo líquido Young Lin Instrument modelo YL9100 CLAE System, equipamento com bomba modelo YL 9110, detector com comprimento de onda variável UV/VIS modelo YL 9160; Banho ultra-som (UNIQUE® USC 1450); Difratômetro de raios-X (RIGAKU DMAX 2000); Espectrofotômetro de absorção na região do Infravermelho com transformada de Fourier (PERKIN ELMER®); 36 Termobalança (TGA Instruments TG-DTA 2960 SDT); Calorímetro exploratório diferencial (TA Instruments DSC 2010); Microscópio eletrônico de varredura (JSM-6510LV). 4.2 Métodos 4.2.1 Obtenção dos complexos de inclusão Os complexos de inclusão foram obtidos por malaxagem, em diferentes razões estequiométricas de sulfadiazina de prata/β-ciclodextrina (1:1, 1:2 e 1:3) respectivamente (CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3). Essas quantidades estequiométricas foram calculadas a partir da massa molar de cada uma delas (MMSDAg= 357,14 g. mol-1 e MMβ-CD= 1135 g. mol-1), pesadas e homogeneizadas em um gral com auxílio de pistilo. Uma quantidade de 3 mL de solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v), solvente utilizado para solubilizar a sulfadiazina de prata, além de umedecer a mistura para formação de uma pasta foi acrescentado aos poucos. A amostra foi acondicionada em um dessecador até a formação de um filme seco. Após a formação do filme a mesma foi triturada e homogeneizada em gral com auxílio de pistilo, acondicionada em frascos plásticos hermeticamente fechados e armazenada em dessecador para uma melhor conservação (Adaptado de MARRETO et al., 2008; FOROUTAN et al., 2002). A mistura física (MF) foi obtida com o objetivo de realizar as devidas comparações entre os componentes e os complexos de inclusão formados. Para a MF foram pesadas quantidades estequiométricas de sulfadiazina de prata/βciclodextrina (SDAg: β-CD), como apresentada na Tabela 2. Esse método consistiu na simples mistura mecânica em um gral com auxílio de pistilo sem adição de solvente. Após 30 minutos da formação da mistura, foi acondicionada em dessecador e logo após, armazenada em plásticos hermeticamente fechados para melhor conservação. Os complexos de inclusão foram obtidos no Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico - Departamento de Farmácia - Universidade Federal de Sergipe (UFS). 37 Tabela 2: Razão estequiométrica entre β-ciclodextrina e sulfadiazina de prata. Composição Razão estequiométrica 1:1 β-ciclodextrina 1,8916g Sulfadiazina de prata 0,5952 g 4.2.2 Obtenção da pasta de hidroxiapatita A síntese da hidroxiapatita ocorreu pelo processo de reação e precipitação por via úmida, como citada por Gonsalves (2012). O nitrato de cálcio [Ca (NO3)2.4H2O] a 0,167 mol.L-1 (fonte de íons Ca2+) foi gotejado com a vazão de 2 mL.min-1, sob a solução doadora de íons fosfato (PO4 3- ), solução de fosfato de amônio dibásico [(NH4)2HPO4] a 0,1 mol.L-1. Durante o processo de precipitação e síntese da hidroxiapatita, o controle do pH do meio reacional foi mantido em 10,4 através da adição de uma base de hidróxido de amônio (NH4OH) 28-30% (v/v) e mantido sob agitação magnética constante em temperatura ambiente. A hidroxiapatita em pasta foi mantida em processo de maturação, a qual envolve o crescimento de cristais em um período de 24 horas e posteriormente foi seguida de lavagem com água destilada até que o pH da pasta formada atingisse a neutralidade. A pasta de hidroxiapatita foi obtida no Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico - Departamento de Farmácia UFS. 4.2.3 Obtenção dos compósitos Inicialmente, foi preparada uma dispersão de quitosana 1,5% (m/v) em solução aquosa de ácido acético 2% (v/v), a qual permaneceu sob agitação magnética constante durante 24 horas. Após este período, o hidrogel de quitosana foi filtrado sob vácuo, para remoção de impurezas. O compósito hidroxiapatita/quitosana (HAP/QUI) foi obtido a partir da proporção 60:40 em massa, na qual a pasta de hidroxiapatita foi adicionada sob o hidrogel de quitosana sem fármaco e permaneceu em agitação por 2 horas a temperatura ambiente. 38 Devido a baixa solubilidade da sulfadiazina de prata em solução aquosa, a incorporação do fármaco ao compósito, foi inviável nesta etapa da metodologia. Além disso, a solubilidade da sulfadiazina de prata em solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v), torna-se incompatível com a faixa de estabilidade da quitosana (meio ácido). Dessa forma, os complexos de inclusão obtidos foram incorporados ao hidrogel de quitosana e, posteriormente, a pasta de hidroxiapatita foi adicionada, permanecendo em agitação por 2 horas para a obtenção dos compósitos contendo fármaco. Na Tabela 3 está representada a relação das diferentes proporções dos constituintes para formação dos compósitos. Tabela 3: Relação das diferentes proporções dos constituintes para formação dos compósitos. COMPLEXOS DE AMOSTRAS % HIDROXIAPATITA % QUITOSANA INCLUSÃO HAP/QUI 60 40 - HAP/QUI I 60 40 SDAg: β-CD 1:1 HAP/QUI II 40 60 SDAg: β-CD 1:1 HAP/QUI III 60 40 SDAg: β-CD 1:2 HAP/QUI IV 40 60 SDAg: β-CD 1:2 A formação dos compósitos foi baseado no método de evaporação de solvente, tal como sugerida por Xianmiao et al. (2009). O hidrogel do compósito formado foi transferido para uma superfície lisa (placas do tipo Petri) de diâmetro de 5 cm e mantidos em estufa na temperatura de 60º C permanecendo durante 10 horas para completa evaporação dos solventes. Os compósitos foram conservados em dessecador, para assim, evitar a absorção de umidade. 4.2.4 Caracterização dos componentes, dos complexos de inclusão e dos compósitos 4.2.4.1 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) As análises referentes à calorimetria exploratória diferencial foram executadas em um instrumento TA Instruments DSC 2010, onde 2 mg de amostras foram colocadas em cápsula de alumínio. O aparelho foi programado para operar na 39 faixa de temperatura de 25 a 400 ºC, com razão de aquecimento de 10 ºC min-1, em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL min-1). As análises foram realizadas no Laboratório Multiusuário do Departamento de Física da Universidade Federal de Sergipe. 4.2.4.2 Termogravimetria e termogravimetria derivada (TG/DTG) As análises termogravimétricas foram executadas em instrumento TGA Instruments TG-DTA 2960 SDT, onde 5 mg de amostras foram colocadas em um cadinho de platina aberto e o aparelho programado para trabalhar na faixa de 25 a 800 °C, com razão de aquecimento de 10 °C min-1, em atmosfera dinâmica de nitrogênio (100 mL min-1). As análises foram realizadas no Laboratório Multiusuário do Departamento de Física da Universidade Federal de Sergipe. 4.2.4.3 Determinação de umidade por Karl Fisher O teor de umidade dos componentes isolados e dos complexos de inclusão foi mensurado através do método de titulação potenciométrica empregando um Titulador Potenciométrico Metrohm® Titrando 836 com o reagente Karl Fischer. O método aplicado é uma modificação da norma ASTM D1744. O solvente de titulação empregado é constituído de uma mistura de metanol seco (pureza 99,8%) e clorofórmio (pureza 99%) na proporção 3:1. A análise foi realizada em triplicata. A análise foi realizada no Instituto de Tecnologia e Pesquisa (ITP) no Núcleo de Estudo de Sistemas Coloidais (NUESC) da Universidade Tiradentes (UNIT). 4.2.4.4 Espectroscopia de absorção na região do Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) A HAP, QUI, SDAg, β-CD, MF e os complexos de inclusão foram analisados a partir da preparação de pastilhas de KBr fazendo uma varredura na faixa de 4000 a 400 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e acúmulo de 16 espectros por medida. Os compósitos foram analisados pelo modo ATR na faixa de 4000 a 700 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e acúmulo de 16 espectros por medida. As análises foram realizadas no Laboratório Multiusuário II no Departamento de Química-UFS. 40 4.2.4.5 Difração de Raios X (DRX) Os difratogramas de raios X das amostras foram obtidos utilizando um difratômetro, operando em modo de varredura, com radiação Cu-Kα (λ = 1,5418 Ǻ) e filtro de níquel com voltagem de 40 kV e corrente de 40 mÅ, velocidade de varredura 2 º/mim em 2θ (5 – 60 º). As análises foram realizadas no Laboratório Multiusuário do Departamento de Física da Universidade Federal de Sergipe. 4.2.4.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) A análise estrutural e morfológica da β-CD, dos complexos de inclusão e dos compósitos com e sem fármaco foram avaliados por MEV em diferentes seções e aumentos para obtenção de uma melhor área analisada. As amostras foram montadas em stubs de alumínio e depositadas em fita de grafite, a qual foi revestida com uma fina camada de ouro. Posteriormente, os materiais foram submetidos à análise de imagem em microscópio JSM-6510LV, com voltagem de aceleração de 5 kV e magnitude de 1000x e 3000x, no Centro Multiusuário de Nanotecnologia (CMNano) da UFS. 4.2.5 Desenvolvimento do método de doseamento da sulfadiazina de prata por CLAE O procedimento de desenvolvimento de métodos deve incluir todas as etapas necessárias para demonstrar que os resultados obtidos são confiáveis e reprodutíveis. Os parâmetros da metodologia analítica para quantificação da SDAg utilizados foram baseados na Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2003). A metodologia foi desenvolvida pela determinação dos seguintes parâmetros: linearidade, precisão, exatidão, seletividade, robustez, limite de detecção e limite de quantificação. O doseamento da SDAg foi realizado por CLAE, segundo metodologia descrita por Foroutan et al. (2002). As análises foram realizadas a partir de uma solução padrão de sulfadiazina de prata na concentração de 1mg/mL, na qual 10 mg de fármaco foi dissolvido em 3 mL de solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v) e completou-se num balão volumétrico de 10 mL com metanol. A solução padrão foi 41 homogeneizada por 5 minutos. Em seguida, foram feitas as devidas diluições com fase móvel composta por água:acetonitrila:ácido fosfórico (900:99:1 v/v) sendo homogeneizada, filtrada e sonicada para realização das demais análises. 4.2.5.1 Condições cromatográficas As análises foram realizadas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência modelo YL9100 da YL instrument co.,LTD., utilizando-se detector ultravioleta (UV/VIS) configurado para o comprimento de onda de 254 nm, baseado na metodologia descrita por Foroutan et al. (2002). A separação cromatográfica por eluição isocrática foi realizada com uma coluna C18 (Phenomenex®) com dimensões de 150 x 4,6 mm e tamanho de partícula de 5 µm, a temperatura ambiente. A fase móvel foi composta por água:acetonitrila:ácido fosfórico (900:99:1 v/v) sendo sonicada e bombeada a um fluxo de 1,2 mL/min. O volume de injeção foi de 20 L. As determinações foram realizadas em triplicatas. 4.2.5.2 Determinação da linearidade da curva analítica A linearidade do método analítico, ou seja, a proporcionalidade entre a concentração e a resposta, foi determinada pela obtenção da curva analítica, a partir da diluição da solução padrão de SDAg em fase móvel. A partir desta solução, a curva analítica foi construída nas concentrações de 0,003; 0,005; 0,008; 0,01; 0,02 e 0,03 mg/mL, utilizando-se a fase móvel como solvente. A curva analítica foi preparada e analisada em triplicata. As áreas médias, correspondentes a três determinações para cada diluição de SDAg foram plotadas no eixo das ordenadas e as concentrações (mg/mL), no eixo das abscissas. A curva analítica e sua respectiva equação da reta foram determinadas através do estudo de regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados. 4.2.5.3 Precisão A precisão é o parâmetro que avalia a proximidade entre as várias medidas efetuadas na mesma amostra. A precisão pode ser estimada em três níveis: 42 repetibilidade (precisão intra-corrida), precisão intermediária (precisão inter-corrida) e reprodutibilidade. Desta forma, foram preparadas três concentrações de baixa (0,003 mg/mL), média (0,008 mg/mL) e alta (0,03 mg/mL), em triplicata. A precisão do método foi avaliada nos níveis de repetibilidade (precisão intra-corrida) e precisão intermediária (precisão inter-corrida), sendo expressa matematicamente através do coeficiente de variação (CV%), calculado pela seguinte fórmula: CV% = (desvio padrão/média) x 100 (Equação 1) A precisão intermediária foi realizada em dois dias diferentes e por analistas diferentes. 4.2.5.4 Exatidão A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados individuais e um valor aceito como referência. Pode ser calculada como a porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionada à amostra. Desta maneira, foram preparadas soluções com três concentrações diferentes, baixa, média e alta, com triplicatas. A exatidão (E%) do método foi expressa pelo quociente da concentração de SDAg obtida e o valor teórico, sendo determinada segundo a Equação 2: E% = [Sulfadiazina de prata]Média medida x 100 (Equação 2) [Sulfadiazina de prata]Teórica 4.2.5.5 Limite de detecção e quantificação Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram determinados, matematicamente, a partir da curva analítica resultante da média das três curvas analíticas. Foram determinados de acordo com os modelos matemáticos propostos pela resolução 899/2003 (Equação 3 e 4) (BRASIL, 2003). LD=DPx3/IC (Equação 3) LQ=DPx10/IC (Equação 4) Onde: DP = Desvio padrão do intercepto com o eixo Y de, no mínimo 3 curvas analíticas; 43 IC = Inclinação da curva analítica. 4.2.5.6 Robustez A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas variações dos parâmetros analíticos sem alterar significativamente sua exatidão e precisão, portanto é uma medida da quantidade de variabilidade que o método pode suportar, sem perder a confiabilidade, e sua estimativa depende do tipo de metodologia analítica utilizada. A robustez do método de quantificação da SDAg foi verificada a partir da variação de temperatura da coluna cromatográfica (35 °C e 45 °C) e do pH da fase móvel (3,0 e 4,0). A partir da concentração média (0,008 mg/mL), as análises foram avaliadas e realizadas em triplicata. Os resultados da avaliação da robustez foram submetidos à análise estatística utilizando o teste de One-way ANOVA, seguido de Pós-Teste de Tukey com o auxílio do software GraphPad Prism versão 5.0. 4.2.5.7 Determinação da eficiência de complexação da sulfadiazina de prata nos complexos de inclusão por CLAE A eficiência de complexação da sulfadiazina de prata nos complexos de inclusão foi realizado por CLAE segundo metodologia analítica de doseamento desenvolvida. As análises foram realizadas em cromatógrafo YL9100 HPLC, utilizando-se detector ultravioleta 254 nm, Coluna C18 (Phenomenex® 150 x 4,6 mm), tamanho de partícula de 5 µm, a temperatura ambiente e fase móvel composta por água:acetonitrila:ácido fosfórico (900:99:1 v/v), com fluxo de 1,2 mL/min, baseado na metodologia descrita por Foroutan et al. (2002). Para a preparação das amostras, foi pesado o equivalente de 10 mg de amostra e diluiu-se em 3 mL de solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v) e completou-se num balão volumétrico de 10 mL com metanol, da mesma forma da preparação da solução padrão da curva analítica do método, baseado na metodologia descrita por Foroutan et al. (2002). A partir desta solução, preparou-se as diluições (concentração média = 0,008 mg/mL) com fase móvel (água: 44 acetonitrila: ácido fosfórico) numa proporção de 900:99:1 (v/v), sendo posteriormente, homogeneizadas e filtradas para realização das análises. 4.2.6 Análise Estatística Os experimentos foram analisados por análise de variância de uma via (ANOVA), seguidos do pós-teste de Tukey e os gráficos foram gerados pelo Software estatístico Graph Pad Prism 5.0. O valor de p menor que 0,05 foi considerado significativo. 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste estudo, foram discutidos os resultados de caracterização físicoquímica dos componentes e complexos de inclusão da sulfadiazina de prata com a β-ciclodextrina (SDAg: β-CD) nas razões estequiométricas de 1:1, 1:2 e 1:3, respectivamente, utilizando o método de malaxagem; a caracterização físico-química dos componentes e compósitos formados, e por fim, o desenvolvimento da metodologia analítica para doseamento da SDAg por CLAE. 5.1 Caracterização dos complexos de inclusão 5.1.1 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) A técnica DSC permite a detecção quantitativa de todos os processos que requerem energia (FIGUEIRAS et al., 2007) e é considerada como um instrumento analítico importante na caracterização de interações de fármacos e os componentes da formulação (ARAÚJO et al., 2009). É amplamente utilizada na caracterização das ciclodextrinas e dos seus complexos, pela rapidez das análises. Na Figura 5, estão representadas as curvas DSC da β-CD, SDAg, MF e dos complexos de inclusão. A curva DSC da β-CD exibiu um evento endotérmico na faixa de temperatura de 43-120 °C (Tpico = 101,6 °C), correspondente à desidratação da molécula. Este evento é relatado na literatura, referente à perda de moléculas de água de solvatação para o ambiente, em temperaturas até 120 °C. Na faixa de temperatura de 220-230 °C, é possível observar uma transição de fase cristalina, já relatado por Serafini et al., (2012) e Menezes et al., (2014). A partir de 300 °C, ocorreu um evento endotérmico na faixa de 306-320 °C (Tpico = 316,68 °C) característico da fusão da molécula, seguido de sua decomposição térmica e eliminação do material carbonáceo, a partir de 334 °C. Resultados semelhantes foram também encontrados por Falcão et al., (2011) e Silva (2012). A curva DSC da SDAg mostrou um patamar de estabilidade térmica para o composto até a temperatura próxima de 280 °C, provavelmente devido a presença do íon prata. A partir de 280 °C, pode-se observar um evento exotérmico 46 apresentando um pico máximo a 290 °C, relacionado a decomposição do fármaco. Resultados semelhantes foram relatados por Hegasy et al., (2013). Na curva DSC da MF pode-se observar uma sobreposição dos eventos térmicos dos componentes. Na faixa de temperatura entre 43-120 °C (Tpico = 104 °C) exibiu um evento endotérmico, devido à desidratação da estrutura molecular da βCD, com forma mais acentuada em relação aos eventos térmicos dos complexos. Isso ocorre provavelmente por apresentar pouca interação do fármaco com a molécula hospedeira (β-CD). A partir de 267 °C, pode-se observar o evento exotérmico relacionado a decomposição térmica da SDAg apresentando pico máximo a 277° C. 334 -CD 316,68 353 SDAg -1 Fluxo de Calor (mW.min ) 290 101,6 277 MF 333 Cinerte 104 316,92 CSDAg 1:1 Endo 88 278 CSDAg 1:2 282 CSDAg 1:3 114 116 281 104 50 100 150 200 250 300 350 400 Temperatura (°C) Figura 5. Curvas DSC da Beta-ciclodextrina (β-CD), Sulfadiazina de prata (SDAg), Mistura-física (MF), Complexo inerte (Cinerte 1:1), Complexo SDAg/β-CD 1:1 (CSDAg 1:1), Complexo SDAg/β-CD 1:2 (CSDAg 1:2) e Complexo SDAg/β-CD 1:3 (CSDAg 1:3) analisadas em atmosfera de N2 (50 mL min-1), com razão de aquecimento de 10 °C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 400 °C. 47 A curva DSC do complexo inerte apresentou uma sobreposição dos eventos térmicos da β-CD. Isso demonstra que a presença da solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v) para formação do complexo, provavelmente não interfere na estabilidade térmica da β-CD. Nas curvas DSC dos três complexos de inclusão (CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3) pode-se verificar algumas mudanças nos perfis das curvas: o evento endotérmico da β-CD na faixa de temperatura de 43-120 °C está ligeiramente deslocado nos complexos: CSDAg 1:1 (Tpico = 114 °C); CSDAg 1:2 (Tpico = 116 °C), isso pode ser explicado pela provável interação do fármaco com a β-CD ao deslocar os eventos relacionados a perda de água para temperaturas mais altas, quando as proporções de SDAg/β-CD são 1:1 e 1:2, sugerindo a substituição de moléculas de água por moléculas de SDAg que portanto dá uma maior estabilidade térmica quando comparado a curva DSC da MF. O evento de decomposição térmica para todos os complexos, sofreu deslocamento para temperaturas menores (na faixa de temperatura de 270-290 °C, CSDAg 1:1 (Tpico = 278 °C); CSDAg 1:2 (Tpico = 282 °C) e CSDAg 1:3 (Tpico = 281 °C), sugerindo a possível complexação da SDAg na cavidade da β-CD. Além disso, verifica-se que o evento exotérmico de decomposição da SDAg não se manifesta na curva dos complexos, o que pode ser associado que quando moléculas de SDAg se encontram no interior da cavidade da β-CD estas não mais interagem entre si no estado sólido, pois são essas interações que teriam que ser rompidas para se iniciar a decomposição do fármaco propriamente dito. Resultados semelhantes foram encontrados por Araújo et al., (2009), Figueiras et al., (2007) e Ribeiro et al., (2008) em seus trabalhos de complexo de inclusão com β-CD e fármacos, também observaram o desaparecimento de picos endotérmicos ou exotérmicos nos complexos e concluíram como um indicativo de formação de complexo. 5.1.2 Termogravimetria e termogravimetria derivada (TG/DTG) A estabilidade térmica da β-CD, SDAg, MF e dos complexos de inclusão foi analisada por TG/DTG. As curvas TG/DTG, para todas as amostras analisadas, 48 estão apresentadas nas Figuras 6 e 7. A Tabela 4 apresenta as perdas de massa calculadas a partir das faixas de temperatura específicas para cada material. A análise das curvas TG/DTG da β-CD permite identificar que na faixa de temperatura de 43-120 °C (Tpico ~ 84 ºC) ocorreu um evento de perda de massa de 15,85%, referente à liberação de moléculas de água a partir da cavidade e superfície da β-CD. Em seguida, é verificado um patamar de estabilidade térmica, entre 120 e 290 °C. Enquanto que na faixa de temperatura de 290-400 °C (Tpico ~ 325 ºC), ocorreu uma perda de massa de 76,56%, relacionada a decomposição térmica da βCD. Subsequentemente, ocorre um evento de perda de massa de 4,42%, referente a eliminação de material carbonáceo (400-800 °C). Tais resultados encontram-se de acordo com a literatura que relata para a β-CD, perda de massa relativa à saída de água, em temperatura compreendida entre 25 e 90 °C. Já a decomposição térmica inicia-se próximo a 280 °C, onde são detectados seus produtos de decomposição (SIQUEIRA‐LIMA et al., 2014; SERAFINI et al., 2012; MENEZES et al., 2014). 100 Perda de massa (%) 80 -CD 60 SDAg MF 40 Cinerte 1:1 CSDAg 1:1 20 CSDAg 1:2 CSDAg 1:3 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Temperatura (°C) Figura 6. Curvas TG da β-CD, SDAg, MF, Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDZ 1:2 e CSDAg 1:3 analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10 °C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 800 °C. 49 A partir das curvas TG/DTG da SDAg, não foi verificado nenhum evento evolvendo perda de massa até a temperatura próxima de 276 °C. Essa característica provavelmente está relacionada a estabilidade que o íon metálico da prata promove ao composto (EL-BARADIE, 2005). Esse resultado pode ser confirmado através da análise da curva DSC da SDAg, na qual não houve eventos térmicos na temperatura citada. A partir de 276 °C, pode-se observar três eventos envolvendo perda de massa. A primeira perda de massa (51,68%) ocorreu entre 276-400 °C (Tpico ~ 289 ºC), correspondente à decomposição da 2-aminopirimidina (EL-BARADIE, 2005). Em seguida, observa-se o segundo evento envolvendo perda de massa (5,81%) entre 400-550 °C (Tpico ~ 418 ºC), referente a decomposição do anel aromático e das duas moléculas de dióxido de enxofre. A terceira perda de massa está relacionada a decomposição final do fármaco, tendo como resíduo final à prata metálica em um percentual igual a 7,42% (550-800 °C). Tabela 4: Percentuais de perdas de massa da β-CD, SDAg, MF, Cinerte, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3, obtidos por TG em faixas de temperaturas diferentes. ∆m (%) ∆m (%) ∆m (%) ∆m (%) ∆m (%) Amostras 43 – 120 °C 120 – 290 °C 290 – 400 °C β-CD 15,85 - 76,56 SDAg - - 51,68 5,81 7,42 MF 6,45 - 35,06 5,86 4,30 Cinerte 1:1 13,87 - 71,78 CSDAg 1:1 12,95 - 60,58 7,21 6,72 CSDAg 1:2 13,44 - 57,22 6,12 4,45 CSDAg 1:3 11,57 - 48,12 4,94 4,95 400 – 550 °C 550 – 800 °C 4,42 5,06 As curvas TG/DTG da MF mostraram uma sobreposição dos eventos térmicos obtidos para os componentes isolados. A primeira perda de massa (6,45%) ocorreu entre 43-120 °C, referente à liberação de moléculas de água a partir da cavidade e superfície da β-CD. A segunda perda de massa (35,06%), ocorreu entre 276-400 °C (Tpico ~ 276 ºC) referente às perdas de massa de decomposição inicial tanto do fármaco quanto da β-CD, apresentando um percentual inferior quando 50 comparado aos complexos (Tabela 4), o que pode indicar uma baixa eficiência de inclusão e interação entre as moléculas do hóspede e da molécula hospedeira. As demais perdas de massa (5,86%) entre 400-550 °C, e (4,30%) entre 550-800 °C, correspondem à decomposição final dos materiais de partida. Resultados semelhantes foram discutidos por Siqueira‐Lima et al., (2014) na qual relaciona a baixa eficiência de complexação, por ser a mistura física o método menos eficiente de interação e substituição das moléculas de água da cavidade da ciclodextrina pela molécula do hóspede. A partir da análise das curvas TG/DTG do complexo inerte pode-se observar que as perdas de massa são muito semelhantes com aquelas encontradas para a βCD pura (Tabela 4), evidenciando que a presença da solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v), utilizada para solubilizar a SDAg para formação do complexo, provavelmente não interfere na estabilidade térmica da β-CD. As curvas TG/DTG dos complexos mostraram-se bastante semelhantes. A partir da Tabela 4 pode-se observar um aumento das perdas de massa entre 43-120 °C quando comparado à mistura física, (CSDAg 1:1-12,95%; CSDAg 1:2- 13,44%; CSDAg 1:3- 11,57%) sugerindo a substituição de moléculas de água de solvatação da cavidade e da superfície da β-CD pela presença do íon da prata de constituição do fármaco, provavelmente incluso. Resultados semelhantes foram observados por Hegasy et al., (2013) quando analisaram por TG o comportamento e estabilidade térmica da SDAg e dos complexos de SDAg em carboximetil-β-CD e compararam os resultados de perda de água da mistura física. Pode-se observar também (Figura 7) que os complexos apresentaram uma redução na Tpico da decomposição térmica (CSDAg 1:1 – Tpico ~ 280 ºC; CSDAg 1:2 – Tpico ~ 284 ºC; CSDAg 1:3 – Tpico ~ 284 °C) quando comparados a Tpico da decomposição térmica da β-CD (Tpico ~ 325 °C), indicando assim maior estabilidade térmica com a formação dos complexos de inclusão. Esses resultados podem ser confirmados ao analisar as curvas DSC dos complexos, observando o deslocamento dos eventos térmicos relacionados à decomposição térmica para temperaturas menores, sugerindo a complexação. Posteriormente, a partir de 400 ºC para ambos os complexos ocorre perda de massa relacionada ao final da decomposição térmica dos componentes e liberação de material carbonáceo. 51 -CD SDAg MF Cinerte 1:1 1ª Derivada CSDAg 1:1 CSDAg 1:2 CSDAg 1:3 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Temperatura (°C) Figura 7. Curvas DTG da β-CD, SDAg, MF, Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3 analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10°C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 800 °C. Os resultados dos percentuais de perdas de massa dos complexos encontrados por termogravimetria (TG) foram corroborados pela análise de determinação do teor de água pelo método potenciométrico de Karl Fischer com o objetivo de calcular as perdas totais de água nas amostras. A partir da análise da Tabela 5, pode-se observar que os percentuais de água referentes aos complexos foram menores quando comparados com a β–CD pura. De acordo com Serafini et al., (2012), a diminuição do teor de água está relacionada à formação de complexo de inclusão, pois as moléculas de água originalmente encontradas na cavidade da β–CD teriam sido substituídas pela molécula do hóspede (SDAg). Tabela 5: Percentuais do teor de água das amostras obtidos por Karl Fischer. Amostras Teor de água % (n-2) β-CD SDAg MF Cinerte 1:1 CSDAg 1:1 CSDAg 1:2 CSDAg 1:3 12,25 5,45 6,06 12,12 8,23 8,95 8,63 52 5.1.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) Para os componentes necessários para formação dos complexos de inclusão, a análise dos espectros de FTIR pode ser realizada comparando-se a posição das bandas da molécula hóspede, da ciclodextrina e da mistura física com as dos complexos. Geralmente, quando ocorre a complexação, é possível observar que as bandas de absorção podem mudar de posição, diminuir ou até mesmo desaparecer (SPRICIGO et al., 2008). Os espectros de FTIR da β-CD, SDAg e MF estão representados na Figura 8. Como podemos observar, o espectro da β-CD apresentou bandas largas características, entre 3500-3200 cm-1, associada ao estiramento assimétrico do grupamento hidroxila (OH) e na região entre 1154-1000 cm-1, associada ao estiramento assimétrico (1154 cm-1) e simétrico (1032 cm-1) de éteres (C-O-C), referente à ligação α-(1-4). Evidenciou-se também uma banda em 2927 cm-1, relacionada às vibrações de estiramento C-H, e em 1639 cm-1, deformação angular da ligação H-O-H presente na amostra, além de modos vibracionais referentes às deformações (C-H) na região entre 1250 e 1450 cm-1 (WANG et al., 2014; SERAFINI et al., 2012). A observação do espectro de FTIR da SDAg permitiu identificar bandas características em 3340 e 3385 cm-1 correspondente à deformação axial do grupamento NH2 (amina primária) e bandas que estão entre 1352 a 1140 cm-1 correspondente a ligação S=O. Em 3247 e 1642 cm -1, pode-se observar bandas referentes à deformação axial e angular do grupamento NH da sulfonamida, respectivamente. Em 1595 cm-1, pode-se evidenciar uma banda atribuída ao estiramento vibracional do anel fenólico conjugado ao grupamento NH2, e as bandas em 1547 e 834 cm-1 estão associadas à vibração da ligação (C=C) do anel pirimidínico e do anel aromático para substituído. Além disso, podem ser observadas vibrações simétricas em SO2 a 1129 cm-1 (BORGES et al., 2005; PRIETO et al., 2006; FAJARDO et al., 2013). 53 -CD) 938 1639 1369 2927 Transmitância (%) 1154 1595 1352 1032 1547 834 (SDAg) 3409 1642 3247 1222 3340 3385 1129 2929 (MF) 1226 3247 1636 1424 1127 1031 3409 4000 3500 3000 1500 1000 500 -1 Número de onda (cm ) Figura 8. Espectros de FTIR da β-CD, SDAg e MF analisadas de 4000-400 cm-1. O espectro de FTIR para a MF mostrou uma sobreposição das bandas características de β-CD e SDAg. Pode-se perceber que algumas bandas de absorção da SDAg são visualizadas no espectro da MF (1595 cm -1, 1547 cm-1, 1352 cm-1, 834 cm-1), porém as bandas características da β-CD (3409 cm-1, 2927 cm-1, 1639 cm-1, 1032 cm-1) destacaram-se no espectro. Pode-se observar pela Figura 8, que não houve deslocamento significativo das bandas de absorção, o que se observa é apenas uma diminuição da intensidade destas causada pela vizinhança química diferenciada. De acordo com Corti et al. (2007), o espectro da mistura física corresponde à sobreposição dos espectros da molécula hóspede e da ciclodextrina. Os espectros de FTIR dos complexos (Cinerte; CSDAg 1:1; CSDAg 1:2; CSDAg 1:3) estão apresentados na Figura 9. Como podemos observar, no espectro de FTIR para o complexo inerte, as bandas características da β-CD (3409 cm-1, 2927 cm-1, 1639 cm-1, 1032 cm-1) foram predominantes no espectro, e desta forma, a solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v) utilizada na preparação dos complexos obtidos por malaxagem, provavelmente não interfere na reação de complexação. 54 1638 (Cinerte) 2927 1650 1028 3400 1158 Transmitância (%) (CSDAg 1:1) (CSDAg 1:2) (CSDZ 1:3) 1420 1130 4000 3500 3000 1500 1000 500 -1 Número de onda (cm ) Figura 9. Espectros de FTIR do Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3, analisadas de 4000-400 cm-1. Os espectros de FTIR dos complexos (Cinerte; CSDAg 1:1; CSDAg 1:2; CSDAg 1:3) foram muito semelhantes. Verifica-se pela Figura 9, que as bandas características da SDAg em 3340 e 3385 cm-1, correspondente à deformação axial do grupamento NH2 (amina primária) foram suprimidas, dando lugar ao surgimento de uma banda larga (principalmente, observado no complexo CSDAg 1:3). Estas observações podem sugerir a saída de moléculas de água da cavidade da β-CD e a quebra de ligações de hidrogênio após a inclusão da SDAg. Na região de 1650 cm-1, a banda característica da deformação angular C=N foi também suprimida, bem como ocorreu redução na intensidade das bandas características da SDAg, compreendidas entre 1650 e 1130 cm-1. Tais observações indicam algum tipo de interação entre a molécula hospedeira (β-CD) e o hóspede (SDAg), sugerindo a formação do complexo de inclusão. Periasamy et al. (2014) em um trabalho de investigação espectral e de caracterização estrutural do complexo de dibenzalacetona:β-CD obtiveram resultados semelhantes aos encontrados no presente estudo, na qual o espectro de FTIR do complexo apresentou modificações na posição ou intensidade de algumas 55 bandas características da dibenzalacetona, sugerindo a formação do complexo de inclusão. Delrivo, Zoppi e Longhi (2012) observaram a partir do FTIR das misturas físicas com β-CD e metil-β-CD e sulfadiazina, que os espectros das misturas físicas apresentaram uma sobreposição dos espectros obtidos para os componentes isolados. Em contraste, os espectros de FTIR dos complexos preparados por diferentes métodos, não revelaram o aparecimento de novas bandas, embora tenha sido observado diferenças nos espectros em relação a sulfadiazina pura. Estes resultados puderam confirmar a existência de interações intermoleculares entre a sulfadiazina e as ciclodextrinas no estudo. Os resultados de caracterização por FTIR corroboraram com os resultados obtidos anteriormente por DSC e TG/DTG, indicando a formação dos complexos de inclusão. 5.1.4 Difração de Raios X (DRX) A Figura 10 apresenta os difratogramas de raios X da β-CD, SDAg, MF e dos complexos de inclusão obtidos. A partir da análise da figura, faz-se a comparação dos difratogramas dos componentes puros com os do complexos. O difratograma de raios X da β-CD (Figura 10) apresenta um perfil predominantemente cristalino, entre 5º e 60º, destacando-se picos de difração característicos de grande intensidade em 2θ= 5,2º; 10,4º; 12,3º; 13,6º; 14,6º; 20,5º; 22º e 26,4º. Resultados semelhantes são encontrados nos trabalhos de Siqueiralima et al., (2014) e Periasamy et al., (2014). O difratograma de raios X da SDAg exibiu picos finos e intensos, característicos de um fármaco que se apresenta na forma cristalina, com ângulos de difração em 2θ= 10,1º; 11,8º; 23,1º; 24º e 28,2º. Um perfil tipicamente semelhante ao difratograma em estudo, também foi encontrado por Hegasy et al., (2013). No difratograma de raios X da MF, verifica-se a sobreposição dos padrões cristalinos da β-CD e da SDAg, demonstrando a presença dos principais picos 56 característicos de cada material, embora os picos fortes indicam a retenção da estrutura cristalina da SDAg na mistura física. CD) (SDAg) (MF) (Cinerte) (CSDZ 1:1) (CSDZ 1:2) (CSDZ 1:3) 10 20 30 40 50 60 2 Figura 10. Difratograma de raios X da β-CD, SDAg, MF, Cinerte 1:1, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3. A partir da análise dos difratogramas de raios X dos complexos de inclusão na Figura 10, foi possível observar um novo perfil de difração com a presença de novos padrões de difração, verificando-se uma diminuição no grau de cristalinidade com tendência para amorfização. Estas características podem confirmar a complexação entre a SDAg e β-CD. O complexo CSDAg 1:3 apresentou entre os demais complexos o perfil mais próximo ao da ciclodextrina com um pico de 57 intensidade máxima em 2θ= 14,5º, como aquele encontrado no difratograma da βCD em 2θ= 14,6º. Isto pode estar relacionado pelo alto teor de ciclodextrina no mesmo. De acordo com os difratogramas apresentados sugere-se que ocorreu a formação de um novo perfil de difração e portanto, a interação da β-CD e da SDAg para formação dos complexos de inclusão nas razões molares obtidas, quando são comparados com o difratograma da MF, na qual se verifica uma sobreposição dos padrões cristalinos. Estes resultados podem ser confirmados pelos resultados de DSC, TG/DTG e FTIR discutidos anteriormente. 5.1.5 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) A MEV é uma técnica bastante utilizada para definir qualitativamente a formação de complexos de inclusão (TAKAHASHI, 2009). Na Figura 11 estão representadas as micrografias eletrônicas de varredura da β-CD, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3. A morfologia da superfície da β-CD pura, como mostrado na Figura 11, apresenta partículas cristalinas de tamanho irregular e na forma de paralelogramos monoclínicos, com superfície e contorno bem definidos. Carvalho e Pinto (2014) obtiveram micrografias da β-CD semelhantes ao presente estudo. Por sua vez, os complexos de inclusão (CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3) obtidos pelo método da malaxagem, apresentaram drásticas mudanças na forma e no tamanho das partículas, resultando em aglomerados que sugerem uma modificação do cristal e do pó, sugerindo assim a formação de complexos. Essa observação está de acordo com resultados obtidos por Hegasy et al., (2013), os quais observaram nos complexos de inclusão com SDAg uma tendência para agregação, sugerindo a existência de materiais amorfos com a formação dos complexos. Esse resultado confirma os resultados de DRX obtidos anteriormente, na qual a formação de um novo perfil de difração foi acompanhado pela diminuição no grau de cristalinidade com tendência para amorfização, indicando a complexação. 58 Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura da β-CD, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3 com aumento de 400x e 2000x. 5.2 Caracterização dos compósitos 5.2.1 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) Na Figura 12, estão representadas as curvas DSC das amostras de HAP, QUI e compósitos HAP/QUI, HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2. A curva DSC obtida para a QUI apresentou dois eventos claros e característicos do polímero. O primeiro, um evento endotérmico em 96°C, correspondente à perda de água e o segundo, exotérmico (306°C) está relacionado ao início da decomposição térmica dos grupos aminos deste polímero (GUINESI, CAVALHEIRO, 2006). O DSC da HAP mostrou claramente a formação de dois eventos endotérmicos: em 37°C e 124°C, correspondente a perda de água (EGUES, 2005). 59 Foi possível a visualização de três eventos para o compósito HAP/QUI: um endotérmico em 55°C; outro endotérmico em 110°C e um exotérmico em 267°C. Através da análise da curva DSC, podemos inferir que houve pequenos deslocamentos e modificações de intensidade, quando comparados aos eventos térmicos obtidos para as amostras isoladas. Isso permite confirmar a interação entre a HAP e a QUI na formação do compósito. Figura 12. Curvas DSC da HAP, QUI e compósitos HAP/QUI, HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2, analisadas em atmosfera de N2 (50 mL min-1), com razão de aquecimento de 10 °C min-1 na faixa de temperatura entre 25 e 400 °C. As curvas DSC dos compósitos após a incorporação dos complexos de inclusão mostraram-se bastante semelhantes e estão representadas na Figura 12. Foi possível a visualização de dois eventos para os compósitos formados: um 60 endotérmico na faixa 90 a 100 °C; relacionado a liberação de água proveniente da composição dos constituintes e um exotérmico próximo a 300 °C, referente a decomposição térmica dos materiais. Através da análise da curvas DSC, podemos inferir que houve pequenos deslocamentos e modificações de intensidade, quando comparados as diferentes proporções de quitosana e hidroxiapatita. Isso permite confirmar a formação dos compósitos após a incorporação dos complexos de inclusão nas diferentes razões molares. 5.2.2 Termogravimetria e termogravimetria derivada (TG/DTG) As curvas TG/DTG da HAP, QUI e HAP/QUI estão apresentadas nas Figuras 13 e 14. As curvas TG/DTG da HAP apresentaram dois eventos envolvendo perda de massa. O primeiro, na faixa de temperatura entre 50 e 100 ºC, indicando perda de 72,45%, atribuído à evaporação de água e o segundo com temperatura próxima a 300°C, perda de massa de 1,87%, atribuído à decomposição térmica com formação de produtos carbonáceos (SIVAKUMAR, MANJUBALA E RAO, 2002). A pasta de HAP contém um elevado teor de água e, quando levada ao aquecimento ocorre maior perda de massa, devido à evaporação de moléculas de água presentes na amostra. Os dados de TG/DTG para a QUI mostraram dois eventos de perda de massa: o primeiro, inferior a 100 ºC, o segundo (275-450 ºC) e um terceiro evento entre 450-670 ºC. A primeira perda de massa foi de 11,18% e pode ser atribuída à liberação de água adsorvida na amostra. A segunda e a terceira perda de 47,32% e 7,66% correspondem à decomposição térmica do polímero e eliminação de material carbonáceo (PANG E ZHITOMIRSKY, 2008). A partir das curvas TG/DTG do compósito HAP/QUI foram observados quatro eventos de perda de massa: o primeiro (34-80 °C) com 12,37%, o segundo entre 80 e 146 °C com 4,88%, o terceiro (146-325 °C) com 18,35% e o quarto entre 325 e 700 °C com 3,23%. A perda de massa observada em 285 ºC para a QUI desapareceu na curva obtida para o compósito HAP/QUI, podendo indicar uma possível interação entre os grupos amino da QUI e os grupos fosfato da HAP. A perda de massa do compósito devido à presença de HAP é mínima, porque como 61 observado na curva da HAP sua maior perda de massa ocorre devido o processo de evaporação de água contida na amostra. Perda de massa (%) 100 (HAP) (QUI) 80 (HAP/QUI) 60 40 20 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Temperatura (C) Figura 13. Curvas TG da HAP, QUI e compósito HAP/QUI (HAP/QUI) analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10°C min-1 na faixa de temperatura entre 25 °C e 800 °C. (HAP) 1ª Derivada (QUI) (HAP/QUI) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Temperatura (°C) Figura 14. Curvas DTG da HAP, QUI e compósito HAP/QUI analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10°C min-1 na faixa de temperatura entre 25 °C e 800 °C. As curvas TG/DTG dos compósitos após a incorporação dos complexos de inclusão mostraram-se bastante semelhantes e estão representadas nas Figuras 15 e 16. A partir da análise da Tabela 6 pode-se observar uma diminuição das perdas de massa dos compósitos contendo SDAg entre 34-80 °C quando comparado ao 62 compósito HAP/QUI, apesar de que o compósito HAP/QUI 60/40 1:1 apresentou um aumento de perda de massa (14,13%), provavelmente devido a maior interação dos grupamentos aminos da quitosana (em maior proporção) com grupamentos fosfato da HAP, durante a formação dos compósitos. Pode-se observar também que os compósitos contendo fármaco apresentaram, maiores percentuais de perda de massa durante a decomposição térmica dos componentes na faixa de temperatura de 146-325 ºC, indicando assim maior estabilidade desses sistemas quando comparado ao compósito HAP/QUI (18,35%). Posteriormente, a partir de 400 ºC para ambos os compósitos ocorre perda de massa relacionada à decomposição térmica dos componentes e liberação de material carbonáceo. Tabela 6: Percentuais de perdas de massa dos compósitos (HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2), em faixas de temperaturas diferentes. Δm% Δm% Δm% Δm% Amostras 34 – 80 °C 80 – 146 °C 146 – 325 °C 325 – 800 °C HAP/QUI 12,37 4,88 18,35 3,23 HAP/QUI 60/40 1:1 14,13 4,55 34,11 19,01 HAP/QUI 60/40 1:2 12,11 4,47 34,52 13,35 HAP/QUI 40/60 1:1 11,46 4,41 28,30 17,22 HAP/QUI 40/60 1:2 11,28 4,21 28,83 23,36 63 Figura 15. Curvas TG dos compósitos HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2 analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10 °C min-1. (HAP/QUI 40/60 1:1) (HAP/QUI 40/60 1:2) 1ª Derivada (HAP/QUI 60/40 1:1) (HAP/QUI 60/40 1:2) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Temperatura (°C) Figura 16. Curvas DTG dos compósitos HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2 analisadas em atmosfera de N2 (100 mL min-1) com razão de aquecimento de 10 °C min-1. 64 5.2.3 Difração de Raios X (DRX) As análises de difração de raios X avaliam qualquer mudança no grau de cristalinidade das substâncias. Na Figura 17, estão representados os difratogramas da HAP, QUI e do compósito HAP/QUI. Como pode ser observado, a HAP possui picos característicos que correspondem a seus planos cristalinos. Os picos intensos em ângulos de difração em 25.8º, 32.2º, 34.1º e 40º representam os principais planos cristalinos da HAP, e foram também observados nos difratogramas dos compósitos com algumas modificações. Cai et al. (2009) e Li et al. (2012) encontraram resultados semelhantes ao difratograma da HAP apresentado. No DRX da QUI foi observado dois halos, um de alta intensidade em 24° e um de menor intensidade próximo a 10°, correspondentes a estrutura polimérica e ligações amino terminais (HU et al., 2004). Entretanto, predomina a estrutura amorfa, característico de um polímero como a QUI. As ligações amino terminais de sua estrutura também contribuem para o seu caráter amorfo, pois as pontes de hidrogênio que atuam como ligações secundárias também contribuem para a mudança do ângulo de ligação entre as moléculas de QUI (COSTA Jr. e MANSUR, 2008). O difratograma do compósito HAP/QUI apresentou um novo perfil de difração, indicando a formação de uma nova estrutura cristalina. Pode-se observar picos cristalinos em ângulos de difração em 13.8º, 16.2º e 19.7º, apesar da diminuição da cristalinidade dos picos característicos do polímero. Ângulos de difração em 32.2º e 39º, confirmam a formação e a presença da HAP no compósito. Pode-se observar que após a formação do compósito, picos cristalinos da HAP ainda existiam, entretanto diminuíram, o que provavelmente indica a formação de uma nova espécie a partir da interação entre a HAP e o polímero (MANJUBALA et al., 2006) e que são confirmados pelos resultados de DSC e TG/DTG observados anteriormente. O pico em 32.2º da HAP é diminuído após a formação do compósito, o que também indica a interação com o polímero, provavelmente devido a interação molecular entre a HAP e a matriz polimérica. 65 (HAP) (QUI) (HAP/QUI) 10 20 30 2 40 50 60 Figura 17. Difratograma de raios X da HAP, QUI e do compósito HAP/QUI (HAP/QUI). A partir da análise dos difratogramas de raios X dos compósitos após a incorporação dos complexos de inclusão na Figura 18, foi possível observar um novo perfil de difração para os compósitos formados, apesar dos difratogramas apresentarem-se bastante semelhantes entre si. Pode-se observar que os picos cristalinos em ângulos de difração em 13.8º, 16.2º e 19.7º, do difratograma do compósito HAP/QUI não foram significativamente alterados, confirmando a formação dos compósitos após incorporação dos complexos de inclusão. Além disso, pode-se observar uma diminuição nos ângulos de difração em 32.2º e 39º, planos cristalinos característicos da HAP, confirmando a ligação da quitosana com cristais da HAP. A ausência de picos cristalinos dos complexos de inclusão, indica que a incorporação do fármaco não alterou o grau de cristalinidade dos compósitos formados. 66 (HAP/QUI 60/40 1:1) (HAP/QUI 60/40 1:2) (HAP/QUI 40/60 1:1) (HAP/QUI 40/60 1:2) 10 20 30 40 50 60 2 Figura 18. Difratograma de raios X dos compósitos QUI/HAP em diferentes proporções orgânico/inorgânico incorporados com complexos de inclusão nas razões 1:1 e 1:2 (HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2). 5.2.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) A MEV foi utilizada como técnica comprobatória e suplementar as observações sugeridas pelas análises de DSC, TG/DTG e DRX descritas nas secções anteriores. É uma técnica bastante utilizada para definir qualitativamente a superfície de compósitos formados pela associação de HAP e QUI. Nas Figura 19 e 20 estão representadas as micrografias eletrônicas de varredura dos compósitos na ausência de SDAg (HAP/QUI 60/40 e HAP/QUI 40/60) e na presença de SDAg (HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2, HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2). A partir da Figura 19, foi possível observar as alterações na morfologia de superfície dos compósitos após incorporação dos complexos de inclusão de SDAg/β-CD nas proporções 1:1 e 1:2, principalmente quando são alteradas as proporções de HAP e QUI nos compósitos. Esse resultados de MEV corroboram com os resultados obtidos anteriormente, confirmando a formação dos compósitos a partir da interação dos grupos da HAP e dos grupos da QUI. Além disso, a presença 67 dos complexos de inclusão não alteraram a constituição dos sistemas, sendo portanto favorável a formação dos compósitos. Figura 19. Micrografias eletrônicas de varredura dos compósitos na ausência de SDAg (HAP/QUI 60/40) e na presença de SDAg (HAP/QUI 60/40 1:1, HAP/QUI 60/40 1:2) obtidas nos aumentos de 1000x e 3000x. 68 Figura 20. Micrografias eletrônicas de varredura dos compósitos na ausência de SDAg (HAP/QUI 40/60) e na presença de SDAg (HAP/QUI 40/60 1:1 e HAP/QUI 40/60 1:2) obtidas nos aumentos de 1000x e 3000x. 69 5.3 Desenvolvimento do método de doseamento da sulfadiazina de prata por CLAE A determinação quantitativa de fármacos exige o uso de procedimentos analíticos validados para que os resultados gerados sejam reprodutíveis e confiáveis. Assim, após estabelecidas as condições cromatográficas para a quantificação da SDAg por cromatografia líquida de alta eficiência, o método foi desenvolvido com base na Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2003). Os parâmetros avaliados foram: linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e quantificação e robustez. 5.3.1 Linearidade A linearidade foi determinada pela obtenção da curva analítica preparada conforme descrita no item 4.2.5.2. A representação gráfica da curva analítica e o coeficiente de regressão das soluções de SDAg em concentrações de 0.003 a 0.03 mg/mL pelo método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) na região do ultravioleta a 254 nm estão representados na Figura 21. Na Figura 22 está representado o cromatograma da solução estoque de SDAg na concentração de 0.005 mg/mL obtido a 254 nm por CLAE durante a realização da curva analítica. 6000 5000 y = 176964x - 169,84 2 R = 0,9996 Área (a.u.) 4000 3000 2000 1000 0 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 Concentração (mg/mL) Figura 21. Representação gráfica da curva analítica da solução de SDAg obtido a 254 nm por CLAE. 70 Figura 22. Cromatograma da solução estoque de SDAg na concentração de 0.005 mg/mL obtido a 254 nm por CLAE. A equação da reta, determinada através do método dos mínimos quadrados, é: y = 176964x - 169,84 onde x é a concentração em mg/mL e y a área obtidos por CLAE, apresentando um coeficiente de correlação (R2) igual a 0,9996. O coeficiente de correlação é um parâmetro que permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois valores superiores a 0,99 indicam que existe uma resposta linear na faixa de concentração trabalhada (BRASIL, 2003). Os resultados encontrados demonstram que a curva analítica pode ser utilizada para quantificar amostras contendo SDAg, conferindo a validade do método de acordo com a linearidade. 5.2.2 Precisão Repetibilidade é a concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo, sendo realizado pelo mesmo analista e a mesma instrumentação (BRASIL, 2003). A repetibilidade do método cromatográfico em estudo foi avaliada através de 9 determinações contemplando o intervalo linear da curva analítica, ou seja, 3 concentrações: baixa (0,003 mg/mL), média (0,008 mg/mL) e alta (0,03 mg/mL), em triplicata (Tabela 7). 71 Tabela 7. Repetibilidade do método de quantificação da SDAg por CLAE. Concentração de SDAg (mg/mL) Área média ± DP CV (%) 0,003 361,42 ± 0,58 0,16 0,008 1304,65 ± 0,73 0,36 0,03 5139,41 ± 1,84 0,07 DP = Desvio Padrão CV (%) = Coeficiente de Variação em porcentagem Os resultados obtidos na avaliação da repetibilidade das amostras apresentaram coeficiente de variação (CV%) entre 0,07 e 0,36%, demonstrando que o método é preciso, de acordo com o estabelecido pela RE 899/03, onde o CV preconizado para este estudo deve ser abaixo de 5%. A precisão intermediária é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos de uma mesma amostra. Esta foi determinada a partir da média, desvio padrão e coeficiente de variação entre analistas e dias diferentes. Os resultados obtidos para o ensaio de precisão intermediária das amostras encontram-se nas Tabelas 8 e 9. Tabela 8. Precisão intermediária do analista 1 em dias diferentes do método de quantificação da SDAg por CLAE. Concentração de SDAg Área média ± DP CV (%) (mg/mL) Dia 1 0,003 361,42 ± 0,58 0,16 0,008 1304,65 ± 1,73 0,36 0,03 5139,41 ± 1,84 0,07 0,003 361,19 ± 1,20 0,33 0,008 1301,59 ± 1,58 0,35 0,03 5136, 41 ± 1,84 0,05 Dia 2 DP = Desvio Padrão CV (%) = Coeficiente de Variação em porcentagem 72 Tabela 9. Precisão intermediária do analista 2 em dias diferentes do método de quantificação da SDAg por CLAE. Concentração de SDAg Área média ± DP CV (%) (mg/mL) Dia 1 0,003 360,30 ± 0,70 0,19 0,008 1301,38 ± 1,55 0,11 0,03 5139,38 ± 1,24 0,04 0,003 362,15 ± 0,91 0,25 0,008 1302,19 ± 1,84 0,29 0,03 5142, 97 ± 1,29 0,06 Dia 2 DP = Desvio Padrão CV (%) = Coeficiente de Variação em porcentagem Os valores de CV (%) determinados pelo ensaio de precisão intermediária por analistas e em dias diferentes encontram-se abaixo do valor preconizado pela ANVISA, que é no máximo 5%, portanto o método pode ser considerado preciso sob as condições estabelecidas. 5.2.3 Exatidão A exatidão é a relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente. Os valores de recuperação obtidos para cada concentração estudada estão apresentados na Tabela 10. Para os valores descritos na Tabela 10, é possível observar que a porcentagem de recuperação varia de 100,02 a 103,59%, portanto todos os resultados foram satisfatórios, ou seja, todas as porcentagens de recuperação ficaram entre os limites preconizados, demonstrando dessa forma, uma boa exatidão do método e uma recuperação adequada. 73 Tabela 10. Valores obtidos no teste de recuperação para SDAg por CLAE a 254 nm em três níveis de concentração. Concentração de SDAg Área média ± DP CV (%) Exatidão (%) (mg/mL) 0,003 363,18 ± 0,74 0,20 100,40 0,008 1296,81 ± 1,17 0,32 103,59 0,03 5140,41 ± 1,29 0,03 100,02 DP = Desvio Padrão CV (%) = Coeficiente de Variação em porcentagem 5.2.4 Limite de detecção e quantificação O limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas. O limite de quantificação (LQ), por sua vez, é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas (BRASIL, 2003). O método apresentou um valor de LD de 0,0019 mg.mL-1 e LQ de 0,0026 mg.mL-1. Demonstrando limites satisfatórios, uma vez que os valores foram inferiores à menor concentração utilizada na construção da curva de linearidade (0,003 mg.mL-1). 5.2.5 Robustez A robustez do método foi determinada pela comparação entre a alteração de temperatura da coluna cromatográfica e pH da fase móvel (Tabela 11). A partir dos resultados obtidos pela análise estatística ANOVA, é possível observar que não há diferença significativa entre as amostras, com o valor de p<0,05, além disso apresentaram coeficiente de variação entre 0,11 e 0,26%, demonstrando ser um método robusto nos fatores analisados. 74 Tabela 11. Parâmetros analíticos variáveis para determinação da robustez. Amostras pH Temperatura (ºC) Área média ± DP CV(%) 1 3,0 35 1302,37 ± 1,47 0,19 2 4,0 35 1301,38 ± 1,55 0,11 3 3,0 45 1299,69 ± 1,33 0,25 4 4,0 45 1300,46 ± 1,49 0,26 *Diferença significativa em p<0,05 (ANOVA). 5.2.5 Determinação da eficiência de complexação da sulfadiazina de prata nos complexos de inclusão por CLAE A eficiência de complexação da SDAg nos complexos de SDAg/β-CD foi determinado por CLAE utilizando a curva analítica padrão. As concentrações das amostras analisadas no cromatógrafo foram calculadas utilizando-se as áreas e a equação da reta, apresentadas na Tabela 12. A partir dos resultados obtidos (Tabela 12), pode-se observar que a formação dos complexos de inclusão com a SDAg, em diferentes razões molares, apresentaram percentuais de eficiência de complexação bastante próximos. Porém o complexo de inclusão obtido com a menor razão estequiométrica (1:1) apresentou o maior eficiência de complexação (32,15%). Este fato pode ser observado pois, a molécula de SDAg apresenta um ambiente hidrofóbico que é compatível com as características do interior da cavidade da β-CD. Tabela 12. Percentuais da eficiência de complexação da MF e dos complexos de SDAg/β-CD nas diferentes razões estequiométricas. Eficiência de Amostras Massa teórica Massa experimental complexação (Complexos) SDAg/β-CD (mg/mg) (%) SDAg/β-CD 1:1 3,14 1,00952 32,15 SDAg/β-CD 1:2 3,14 0,86804 27,64 SDAg/β-CD 1:3 3,14 0,78417 24,97 Mistura Física 3,14 0,69125 22,01 75 Além disso, as dimensões das moléculas devem ser compatíveis com o tamanho da cavidade da ciclodextrina. Dessa maneira, a razão estequiométrica 1:1 pode ser suficiente para formação do complexo de inclusão SDAg/ β-CD. O baixo teor de inclusão para a mistura física (22,01%), em relação aos complexos, pode ser explicado pela não adição de água durante a preparação da amostra. Apesar de não haver formação de ligações, acredita-se que a substituição das moléculas de água de alta entalpia da cavidade da ciclodextrina por outra substância menos polar que a água seria a força principal envolvida na formação dos complexos. 76 6 CONCLUSÕES A partir do presente estudo, foi possível obter complexos de inclusão de sulfadiazina de prata com a β-ciclodextrina através do método de malaxagem, que mostrou-se eficiente e aplicável a moléculas com baixa solubilidade em meio aquoso. Além disso, foi possível obter compósitos hidroxiapatita/quitosana após incorporação dos complexos de inclusão pelo método de evaporação do solvente; Os resultados de (DSC/TG/DTG/DRX/MEV) dos componentes, mistura física e dos complexos de inclusão obtidos nas diferentes razões molares, permitiram visualizar interações entre o fármaco e a β-ciclodextrina, sugerindo a complexação. Além disso, a caracterização dos complexos de inclusão por espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) demonstrou que houve deslocamentos e redução na intensidade das bandas características da SDAg, sugerindo a formação dos complexos de inclusão; Os resultados (DSC/TG/DTG/DRX/MEV) dos componentes e dos compósitos permitiram visualizar possíveis interações entre a hidroxiapatita e a quitosana, demonstrando que houve a formação do compósito hidroxiapatita/quitosana após incorporação dos complexos de inclusão; O método desenvolvido para o doseamento de sulfadiazina de prata por CLAE apresentou valores satisfatórios que atendem os limites preconizados para os parâmetros de validação de um método quantitativo, conforme as normas nacionais. O método apresentou linearidade satisfatória com r2 > 0,99, com equação da reta, y = 176964x - 169,84. Obteve-se boa precisão, exatidão e robustez com valores de coeficiente de variação menores que 5%; A eficiência de complexação da sulfadiazina de prata nos complexos de inclusão foi determinado a partir do método desenvolvido. O complexo de inclusão obtido com a menor razão estequiométrica (1:1) apresentou o maior percentual de eficiência de complexação (32,15%). Dessa maneira, a razão estequiométrica 1:1 é suficiente para formação do complexo de inclusão sulfadiazina de prata/βciclodextrina, e posteriormente, foi favorável ao ser incorporado ao compósito hidroxiapatita/quitosana. 77 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AOYAGI, S.; ONISHI, H.; MACHIDA, Y. Novel chitosan wound dressing loaded with minocycline for the treatment of severe burn wounds. Int. J Pharm, 330, 138-145, 2007. ARAÚJO, M.V.G.; MACEDO, F.L.O.; NASCIMENTO, C.C.; CONEGERO, L.S.; BARRETO, L.S.; ALMEIDA, L.E.; COSTA, N.B.; JR, GIMENEZ L.F. 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Galvão1, Adriana de Jesus Santos1, Rogéria de Souza Nunes1 1 Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe, Sergipe, Brasil. E-mail: *[email protected] Resumo Este trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização dos complexos de inclusão de sulfadiazina de prata em β-ciclodextrina por calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG) e determinação do teor de umidade por Karl Fischer. Os complexos de inclusão foram obtidos por malaxagem, em diferentes razões estequiométricas de sulfadiazina de prata/β-ciclodextrina (1:1, 1:2 e 1:3) respectivamente. De acordo com a análise de DSC, é possível observar que o evento de fusão (Tpico = 290 °C) e início de decomposição do fármaco desapareceu na curva dos complexos de inclusão, o que pode ser associado a complexação de moléculas de sulfadiazina de prata no interior da cavidade da β-ciclodextrina. Os resultados de TG referentes aos complexos de inclusão apresentaram maiores percentuais de perda de massa quando comparados à mistura física de sulfadiazina de prata/ β-ciclodextrina. Essa observação sugere maior estabilidade desses sistemas. Os complexos obtidos mostraram interessantes propriedades térmicas sugerindo sua aplicação no desenvolvimento de um sistema para liberação. Palavras-chave: β-ciclodextrina, sulfadiazina de prata, complexação, análise térmica. Abstract This study aimed the obtaining and characterization of the silver sulfadiazine inclusion complexes in βcyclodextrin by differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG) and moisture determination by Karl Fischer method. The inclusion complexes were obtained by paste method, at different stoichiometric ratios of the silver sulfadiazine/β-cyclodextrin (1:1, 1:2 and 1:3) respectively. According to the DSC analysis, it can be possible to observe that melting point (T peak = 290 °C) and beginning of the drug decomposition disappeared in the inclusion complexes curves, which may be associated with the complexation of silver sulfadiazine molecules within β-cyclodextrin cavity. TG data related to inclusion complexes presented higher mass loss values when compared to the silver sulfadiazine/β-cyclodextrin physical mixture. This observation suggests a greater stability of these systems. The inclusion complexes showed interesting thermal properties suggest its application in the development of delivery system. Keywords: β-cyclodextrin, silver sulfadiazine, complexation, thermal analysis. 86 INTRODUÇÃO O tratamento de desordens, defeitos e doenças envolvendo o tecido, como no caso de queimaduras graves, é uma problemática que vem sendo tratada clinicamente com a substituição parcial ou total do tecido lesionado [1]. Um dos tratamentos tópicos padrão em queimaduras é a utilização de sulfadiazina de prata (SDAg), um agente antibacteriano eficaz no tratamento de feridas e queimaduras [2]. Este fármaco combina a ação inibitória do sal de prata, juntamente com o efeito antibacteriano da sulfadiazina. Além disso, a prata, também possui atividade antimicrobiana eficaz em uma ampla gama de bactérias gram-negativas e gram-positivas, bem como propriedades antifúngicas. No entanto, a sulfadiazina de prata apresenta baixa solubilidade em sistemas aquosos e sofre oxidação quando exposta a luz e umidade [3]. Considerando tais aspectos, a utilização de ciclodextrinas para formação de complexos de inclusão tem sido sugerida com o propósito de melhorar a solubilidade e estabilidade do fármaco neles associado. As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos que apresentam conformação química peculiar: suas unidades de glicopiranose arranjam-se na forma de cones, e podem ser consideradas moléculas anfifílicas. Por apresentarem duas regiões de comportamento diferentes, o exterior das CDs é formado por grupos hidroxilas sendo altamente polar, enquanto seu interior da cavidade é relativamente apolar. As principais ciclodextrinas naturais conhecidas são a α, a β e a γ-ciclodextrina. A β-ciclodextrina (β-CD) é a mais vantajosa para utilização farmacêutica como agente complexante, devido as suas propriedades físico-químicas e ao tamanho da sua cavidade [4]. Neste contexto, a complexação da sulfadiazina de prata em ciclodextrina torna-se uma opção viável para contornar os problemas de solubilidade e estabilidade do fármaco. E, posteriormente, na incorporação em formulações tópicas para o tratamento de feridas e queimaduras. MATERIAL E MÉTODOS ® Material. A β-ciclodextrina cristalina foi adquirida da SIGMA ALDRICH . A sulfadiazina de prata foi ® ® adquirida da Henrifarma . O hidróxido de amônio (28-30% v/v) foi adquirido da NEON . Preparação dos complexos de inclusão. Os complexos de inclusão foram obtidos por malaxagem, em diferentes razões estequiométricas de sulfadiazina de prata/β-ciclodextrina (1:1, 1:2 e 1:3) respectivamente. Essas quantidades estequiométricas foram calculadas a partir da massa molar de cada uma delas (PMSDAg= 357.14 g e PMβ-CD= 1135 g), pesadas e homogeneizadas em um gral com auxílio de pistilo. Uma quantidade de 3 mL de solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v), solvente utilizado para solubilizar a sulfadiazina de prata, além de umedecer a mistura para formação de uma pasta foi acrescentado aos poucos. A amostra foi acondicionada em um dessecador até a formação de um filme seco. Após a formação do filme a mesma foi triturada e homogeneizada em gral com auxílio de pistilo, acondicionada em frascos plásticos hermeticamente fechados e armazenada em dessecador para uma melhor conservação. A mistura física (MF) foi obtida com o objetivo de realizar as devidas comparações entre os componentes e os complexos de inclusão formados. Para a MF foram pesadas quantidades estequiométricas de sulfadiazina de prata/β-ciclodextrina (SDAg: β-CD). 87 Esse método consistiu na simples mistura mecânica em um gral com auxílio de pistilo sem adição de solvente. Após formação da mistura, foi acondicionada em dessecador e logo após, armazenada em plásticos hermeticamente fechados para melhor conservação [5, 6]. Caracterização: Calorimetria exploratória diferencial. As curvas DSC foram obtidas utilizando um -1 calorímetro TA Instruments DSC 2010, em atmosfera dinâmica de N 2 (50 mL min ), razão de -1 aquecimento de 10 ºC min , na faixa de temperatura entre 25 e 400 ºC, utilizando cerca de 2 mg de amostra seladas hermeticamente em cápsula de alumínio. O equipamento foi calibrado utilizando padrão de Índio e Zinco metálico. Termogravimetria. As curvas TG/DTG foram obtidas a partir de uma termobalança TGA Instruments -1 TG-DTA 2960 SDT, em atmosfera dinâmica de N2 (100 mL min ), razão de aquecimento de 10 ºC -1 min , na faixa de temperatura entre 25 e 800 ºC, utilizando cerca de 5 mg de amostra em porta amostra de platina. Determinação do teor de umidade por Karl Fischer. O teor de umidade dos complexos de inclusão foi mensurado através do método de titulação potenciométrica empregando um Titulador Potenciométrico Metrohm® Titrando 836 com o reagente Karl Fischer. O solvente de titulação empregado é constituído de uma mistura de metanol seco (pureza 99.8%) e clorofórmio (pureza 99%) na proporção 3:1. As análises foram realizadas em triplicata. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da análise de calorimetria exploratória diferencial (DSC) para os complexos de inclusão e seus componentes isolados estão representados na Fig. 1. A curva de DSC da β-CD exibiu um evento endotérmico na faixa de temperatura de 43-120 °C (Tpico = 101.6 °C), que pode estar relacionado à desidratação da molécula. Na faixa de temperatura de 220-230 °C é possível observar uma transição de fase cristalina, já relatado por [7, 8]. A partir de 300 °C ocorreu um evento endotérmico na faixa de 306-320 °C (Tpico = 316.68 °C) característico da fusão da molécula, seguido de sua termodecomposição e eliminação do material carbonáceo, a partir de 334 °C. A análise das curvas TG/DTG da β-CD, representadas na Fig. 2, permite identificar que na faixa de temperatura de 43-120 °C (Tpico ~ 84 ºC) ocorreu um evento de perda de massa de 15.85%, referente à liberação de moléculas de água a partir da cavidade da β-CD, confirmando os resultados obtidos na curva DSC. Em seguida, é verificado um patamar de estabilidade térmica, entre 120 e 290 °C. Enquanto que na faixa de temperatura de 290-400 °C (Tpico ~ 325 ºC), ocorreu uma perda de massa de 76.56 %, relacionada a rápida fusão/decomposição da β-CD. Subsequentemente, ocorre um evento de perda de massa de 4.42 %, referente ao final de sua decomposição (400-800 °C). A curva de DSC da SDAg (Fig. 1) mostrou um patamar de estabilidade térmica até a temperatura próxima de 280 °C. A partir de 280 °C, pode-se observar um evento exotérmico apresentando um pico máximo a 290 °C, relacionado a rápida fusão seguido de decomposição do fármaco. A partir das curvas TG/DTG da SDAg, representadas na Fig. 2, não foi verificado nenhum evento evolvendo perda de massa até a temperatura próxima de 276 °C. Essa característica provavelmente está relacionada a estabilidade que o íon metálico da prata promove ao composto [9]. Esse resultado é confirmado através da curva de DSC, que não exibiu evento térmico. A partir de 276 °C, pode-se 88 observar três eventos envolvendo perda de massa. A primeira perda de massa (Δm =51.68 %) ocorreu entre 276-400 °C (Tpico ~ 289 ºC), correspondente à decomposição da 2-aminopirimidina. Em seguida, observa-se o segundo evento envolvendo perda de massa (5.81 %) entre 400-550 °C (Tpico ~ 418 ºC), referente a decomposição do anel aromático e das duas moléculas de dióxido de enxofre. A terceira perda de massa está relacionada a decomposição final do fármaco, tendo como resíduo final à prata metálica em um percentual igual a 7.42 % (550-800 °C). Na curva de DSC da MF (Fig. 1) pode-se observar uma sobreposição dos eventos térmicos dos componentes isolados. Na faixa de temperatura entre 43-120 °C (Tpico = 104 °C) exibiu um evento endotérmico, devido à desidratação da estrutura molecular da β-CD, com forma mais acentuada em relação aos eventos térmicos dos complexos. Isso ocorre provavelmente por apresentar pouca interação do fármaco com a molécula hospedeira (β-CD). A partir de 267 ° C, pode-se observar o evento exotérmico relacionado a fusão da SDAg seguido da sua termodecomposição apresentando pico máximo a 277° C. As curvas TG/DTG da MF (Fig. 2) mostraram uma sobreposição dos eventos térmicos obtidos para os componentes isolados. A primeira perda de massa (6.45 %) ocorreu entre 43-120 °C, referente à liberação de moléculas de água a partir da cavidade da β-CD. A segunda perda de massa (35.06 %), ocorreu entre 276-400 °C (Tpico ~ 276 ºC) referente às perdas de massa de decomposição inicial tanto do fármaco quanto da β-CD, apresentando um percentual inferior quando comparado aos complexos, o que pode indicar uma baixa eficiência de inclusão e interação entre as moléculas do hóspede e da molécula hospedeira. As demais perdas de massa (5.86 %) entre 400-550 °C, e (4.30 %) entre 550-800 °C, correspondem à decomposição final dos materiais de partida. Resultados semelhantes foram discutidos por [10] na qual relaciona a baixa eficiência de complexação, por ser a mistura física o método menos eficiente de interação e substituição das moléculas de água da cavidade da ciclodextrina pela molécula do hóspede. A curva de DSC do complexo inerte apresentou uma sobreposição dos eventos térmicos da β-CD. Isso demonstra que a presença da solução de hidróxido de amônio (28-30% v/v) para formação do complexo, provavelmente não interfere na estabilidade térmica da β-CD. Esse resultado pode ser confirmado ao analisar as curvas TG/DTG do complexo inerte e da β-CD, observando as perdas de massa em temperatura próxima. Nas curvas de DSC (Fig. 1) dos três complexos de inclusão (CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3) pode-se verificar algumas mudanças nos perfis das curvas: o evento endotérmico da β-CD na faixa de temperatura de 43-120 °C está ligeiramente deslocado em todos os complexos: CSDAg 1:1 (Tpico = 114 °C); CSDAg 1:2 (Tpico = 116 °C) e CSDAg 1:3 (Tpico = 104 °C), isso pode ser explicado pela interação do fármaco com a β-CD, sugerindo a inclusão da molécula de SDAg em substituição e liberação de água da cavidade da β-CD. O evento de fusão da β-CD para todos os complexos, sofreu deslocamento e passou a ocorrer na faixa de temperatura de 270-290 °C, CSDAg 1:1 (Tpico = 278 °C); CSDAg 1:2 (Tpico = 282 °C) e CSDAg 1:3 (Tpico = 281 °C), sugerindo a complexação da SDAg na cavidade da β-CD. Além disso, verifica-se que o evento exotérmico de fusão e início de decomposição da SDAg não se manifesta na curva dos complexos, o que pode ser associado que quando moléculas de SDAg se encontram no interior da cavidade da β-CD estas não mais interagem 89 entre si no estado sólido, pois são essas interações que teriam que ser rompidas para se iniciar a fusão do fármaco propriamente dito. As curvas TG/DTG dos complexos mostraram-se bastante semelhantes. A partir da Tabela 1 pode-se observar um aumento das perdas de massa entre 43-120 °C quando comparado à mistura física, (CSDAg 1:1- 12.95 %; CSDAg 1:2- 13.44 %; CSDAg 1:3- 11.57 %) indicando saída de moléculas de água de solvatação da cavidade do complexo formado para substituição de moléculas do fármaco, provavelmente incluso. Pode-se observar também que os complexos apresentam, percentuais maiores de perda de massa (CSDAg 1:1 – 60.58 %; CSDAg 1:2 - 57.22 %; CSDAg 1:3 48.12 %) na faixa de temperatura de 290-400 ºC, indicando assim maior estabilidade desses sistemas quando comparados à mistura física (35.06%). Posteriormente, a partir de 400 ºC para ambos os complexos ocorre perda de massa relacionada à decomposição térmica dos componentes e liberação de material carbonáceo. 334 (a) 316,68 353 (b) -1 Fluxo de Calor (mW min ) 290 101,6 277 (c) 333 (d) 104 316,92 (e) Endo 88 278 (f) 282 (g) 114 116 281 104 50 100 150 200 250 300 350 400 Temperatura (°C) Fig. 1 Curvas DSC da Beta-ciclodextrina (a), Sulfadiazina de prata (b), Mistura-física (c), Complexo inerte (d), Complexo SDAg/β-CD 1:1 (e), Complexo SDAg/β-CD 1:2 (f) e Complexo -1 SDAg/β-CD 1:3 (g) analisadas em atmosfera de N2 (50 mL min ), com razão de aquecimento 10 ºC -1 min na faixa de temperatura entre 25 e 400 ºC. Os resultados de perdas de massa encontrados por termogravimetria (TG) foram corroborados pela análise de determinação do teor de água pelo método potenciométrico de Karl Fischer com o objetivo de calcular as perdas totais de água nas amostras. A partir da análise da Tabela 1, pode-se observar que as porcentagens de água referentes aos complexos foram menores quando comparadas com a mistura física e a β–CD pura. De acordo com [7], a diminuição do teor de água está relacionado com a formação de complexo de inclusão, pois as moléculas de água originalmente encontradas na cavidade da β–CD teriam sido substituídas pela molécula do hóspede (SDAg). 90 Fig. 2 Curvas de TG/DTG da Beta-ciclodextrina (β-CD), Sulfadiazina de prata (SDAg), Mistura-física (MF), Complexo inerte (Cinerte 1:1), Complexo SDAg/β-CD 1:1 (CSDAg 1:1), Complexo SDAg/β-CD 1:2 (CSDZ 1:2) e Comlexo SDAg/β-CD 1:3 (CSDAg 1:3) analisadas em atmosfera de N2 (100 mL -1 -1 min ) com razão de aquecimento 10 °C min na faixa de temperatura entre 25 e 800 ºC. Tabela 1: Perdas de massa da β-CD, SDAg, MF, Cinerte, CSDAg 1:1, CSDAg 1:2 e CSDAg 1:3, e determinação do teor de umidade por Karl Fischer. Amostras Perda de massa (%) 1ª Etapa a β-CD 15.85 SDAg - MF 6.45 Cinerte 1:1 13.87 a 12.95 a 13.44 a 11.57 a a CSDAg 1:1 CSDAg 1:2 CSDAg 1:3 Karl Fischer 2ª Etapa 3ª Etapa 4ª Etapa d 76.56 c 4.42 51.68 b 5.81 35.06 c 5.86 71.78 c 5.06 60.58 c 57.22 c 48.12 c 12.25 d 7.42 d 4.30 d 5.45 d 6.06 d d 7.21 d 6.12 d 4.94 Teor de água (%) 12.12 d 8.23 d 8.95 d 8.63 6.72 4.45 4.95 a Porcentagem de água liberada até 120 °C. Perda de massa relacionada ao início da decomposição da SDAg. c Decomposição térmica na faixa de 290 a 400 °C. d Formação de material carbonáceo devido a carbonização da amostra na faixa de 400 a 800 °C. b CONCLUSÕES A partir do presente estudo, foi possível obter complexos de inclusão de sulfadiazina de prata com a β-ciclodextrina através do método de malaxagem, que mostrou-se eficiente e aplicável a moléculas com baixa solubilidade em meio aquoso. Os resultados obtidos a partir dos estudos de DSC e TG/DTG dos componentes, mistura física e dos complexos de inclusão obtidos em diferentes razões 91 molares, permitiram visualizar interações entre o fármaco e a β-ciclodextrina, sugerindo a complexação. A partir destes resultados, conclui-se que é possível preparar complexos a partir da mistura entre a sulfadiazina de prata e a β-ciclodextrina, vislumbrando a utilização destes em sistemas de liberação. AGRADECIMENTOS Ao CNPq e a CAPES, pelo apoio financeiro outorgado durante a realização deste trabalho. REFERÊNCIAS 1 Morsi NM, Abdelbary GA, Ahmed MA. Silver sulfadiazine based cubosome hydrogels for topical treatment of burns: Development and in vitro/in vivo characterization. Eur J Pharm Biopharm. 2014;86:178–189. 2 Gurfinkel RM, Palivatkel-Naim R, Gleisinger L, Rosenberg AJ. Comparison of purified olive oil and silver sulfadiazine in the treatment of partial thickness porcine burns. Am. J. Emerg. 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