Orceína de Shikata, Victoria blue

MÉTODO DA ORCEÍNA MODIFICADO PARA O ANTÍGENO
DE SUPERFÍCIE DO VÍRUS DA HEPATITE B (HBsAg)
FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada.
SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros.
SOLUÇÕES
SOLUÇÃO DE PERMANGANATO DE POTÁSSIO A 0,15%
Permanganato de potássio (KMnO4) ^..................0,15 grama.
Água destilada ............................até completar 100 mililitros.
Antes de usar, acrescente 0,15 mililitros de ácido sulfúrico concentrado.
^ BIOSSEGURANÇA:
O permanganato de potássio é tóxico, irritante e sensibilizante. O ácido
sulfúrico é corrosivo, irritante e sensibilizante. Evite inalá-los, ingeri-los, e
o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa.
SOLUÇÃO DE ÁCIDO OXÁLICO A 1,5%
Ácido oxálico(C2H2O4)^..........................................1,5 grama.
Água destilada ............................até completar 100 mililitros.
^ BIOSSEGURANÇA:
O ácido oxálico é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato
com a pele e outras partes do corpo, além da roupa.
SOLUÇÃO DE ORCEÍNA
Orceína (preferencialmente BDH)a............................1 grama.
Etanol a 70% ................................................... 100 mililitros.
Ácido clorídrico (HCl), concentrado ......................1 mililitro.
Deixe envelhecer à temperatura ambiente por 5 a 7 dias. Filtre e coloque no refrigerador por 1dia
antes do uso. Isto eliminará a coloração de fundo. Armazene a solução no refrigerador.
a
Corantes artificiais não darão os resultados desejados. ORCEIN, produto no 34063,
manufaturado pela British Drug House (BDH) Ltd., Poole, England. Distribuidor USA: GarllardSchlesinger, Chemical Mfg. Corp. Carle Place, N.Y., 11514.
^ BIOSSEGURANÇA:
O ácido clorídrico é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato
com a pele, mucosas, e outras partes do corpo, além da roupa.
PROCEDIMENTO
1.
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Desparafine e hidrate até a água destilada.
Coloque na solução de permanganato de potássio e deixe por 5 minutos.
Enxágue em água destilada; 2 trocas.
Coloque na solução de ácido oxálico a 1,5% e deixe até que os cortes fiquem sem cor;
usualmente 10 a 15 segundos são o suficiente.
Lave gentilmente em água de torneira por 1 minuto.
Enxágue em água destilada; 2 trocas, enchendo e despejando cada troca.
Enxágue em etanol a 95%; 2 trocas.
Deixe corar por 1 noite na solução de orceína.
Enxágue em etanol a 95% e em etanol absoluto; 2 trocas em cada.
Clarifique em xileno; 3 trocas.
Monte em meio resinoso.
RESULTADOS
Coloração marrom-escura ocorre em todo ou parte do citoplasma dos hepatócitos que, à
Hematoxilina & Eosina, mostram citoplasma “em vidro-despolido.” b O citoplasma positivamente corado
corresponde à presença do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HbsAg), o que pode ser
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods
in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.
demonstrado pela imunofluorescência e pela imunomicroscopia eletrônica. A orceína também cora o
sistema elástico e a proteína ligada ao cobre (metalotionina). Esta última aparece como grânulos
castanhos.
b
As células “em vidro-despolido”podem também corar-se pelo método da aldeído-fucsina, para
o sistema elástico, assim como pelo Victoria Blue.
REFERÊNCIAS
DEODHAR, K.P. - Orcein staining of hepatitis B antigen in paraffin sections of liver biopsies.
J. Clin. Pathol., 28: 66, 1975.
SHIKATA, T.- Staining methods of Australia antigen in paraffin sections. Jpn. J. Exp. Med., 44:
25, 1974.
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods
in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.
MÉTODO VICTORIA BLUE (TANAKA) PARA O ANTÍGENO
DE SUPERFÍCIE DO VÍRUS DA HEPATITE B (HBsAg)
FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada.
SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros.
SOLUÇÕES
SOLUÇÃO DE VICTORIA BLUE 1
Dextrina (C6H10O5)n xH2O............................................................5 gramas.
Victoria blue1 ..............................................................................2 gramas.
Resorcinol [1,3-C6H4(OH)2]^...................................................... 4 gramas.
Aqueça gradualmente, levando até a ebulição. Acrescente:
Solução de cloreto férrico (FeCl3)^, a 29%, em ebulição ......25mililitros.
[Solução de cloreto férrico a 29%: 29 gramas em 100 mililitros de solução com água destilada]
^ BIOSSEGURANÇA:
O resorcinol (1, 3, benzenediol) é irritante e sensibilizante. O cloreto férrico é tóxico
e corrosivo. Evite inalá-los, ingeri-los, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer
partes do corpo, além da roupa
SOLUÇÃO ESTOQUE DE PERMANGANATO DE POTÁSSIO A 0,3%
Permanganato de potássio (KMnO4)^..................................0,3 grama.
Água destilada .........................................até completar 100 mililitros.
^ BIOSSEGURANÇA:
O permanganato de potássio é tóxico, irritante e sensibilizante. O ácido sulfúrico é
corrosivo, irritante e sensibilizante. Evite inalá-los, ingeri-los, e o contato com a pele,
mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa.
SOLUÇÃO ESTOQUE DE ÁCIDO SULFÚRICO A 0,3%
Ácido sulfúrico (H2SO4)^............................................. 0,3 mililitro.
Água destilada............................................................99,7 mililitros.
L Despeje o ácido sulfúrico na água e não o contrário!
^ BIOSSEGURANÇA:
O ácido sulfúrico é corrosivo, irritante e sensibilizante. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o
contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa.
SOLUÇÃO DE TRABALHO DE PERMANGANATO DE POTÁSSIO-ÁCIDO SULFÚRICO
Solução estoque de permanganato de potássio a 0,3%..............50 mililitros.
Solução estoque de ácido sulfúrico a 0,3%.............................. 50 mililitros.
Faça no momento de usar.
SOLUÇÃO DE BISSULFITO DE SÓDIO A 4%
Bissulfito de sódio (Na2S2O5)^....................................................4 gramas.
Água destilada ..............................................até completar 100 mililitros.
Faça no momento de usar.
[N.doT.: O bissulfito de sódio do comércio consiste, principalmente, do metabissulfito de sódio (Na 2S 2O 5), o qual
possui as mesmas propriedades do verdadeiro bissulfito. Mantenha o frasco sempre bem fechado e em local fresco,
pois, quando aberto tende a perder algum SO2 e a oxidar-se em sulfato. In: Windholz, M. et al., eds.- The Merck
Index.10th ed.; Rahway, N.J., USA; Merck & Co., Inc., 1983].
^ BIOSSEGURANÇA: O bissulfito de sódio é irritante e sensibilizante. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato
com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa.
1
[ N. do T.: Victoria Blue 4R (C. I. 42563) (sinônimo: Fat Blue 4R): corante básico, solúvel em água e etanol. Cora vírus, flagelos de
bactérias, protozoários parasitas. In: Locquin, M.V. & Langeron, M. - Handbook of Microscopy. London, Butterworths, 1983, pp. 174; e
Lillie, R.D. (ed) - H.J. Conn’s Biological Stains. 9th ed., The Williams & Wilkins Company, 1977, St. Louis, Reprinted by Sigma (1990)].
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods
in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.
SOLUÇÃO DE NUCLEAR FAST RED (KERNECHTROT)
Nuclear Fast Red (kernechtrot) (C.I. 60760) ............................................. 0,1 grama.
Solução de sulfato de alumínio [Al 2 (SO4)3]^ a 5% ........até completar 100 mililitros.
[Solução de sulfato de alumínio a 5%: 5 gramas de sulfato de alumínio em 100 mililitros de solução com água destilada].
Aqueça, lentamente, até ferver. Após esfriar, filtre, e acrescente um grão de timol para preservar.
^ BIOSSEGURANÇA:
O sulfato de alumínio é tóxico, irritante e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e
o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa.
PROCEDIMENTO
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Desparafine e hidrate até a água destilada.
Coloque na solução de trabalho de permanganato de potássio-ácido sulfúrico e deixe por 5
minutos.
Coloque na solução de bissulfito de sódio a 4% e deixe por 1 minuto.
Lave em água corrente.
Enxágue em etanol a 70% por alguns minutos.
Core na solução de Victoria Blue por 1 hora a 1 semana dependendo da intensidade
desejada.
Diferencie em etanol a 70%, por 3 a 5 minutos ou mais, até que o fundo se torne totalmente
descorado (OBS: Uma diferenciação correta pode requerer 3 minutos a 24 horas).
Lave em água corrente por poucos minutos.
Contracore na solução de Nuclear Fast Red por 5 minutos.
Lave em água corrente por 5 minutos.
Desidrate e clarifique através de etanol a 95%, etanol absoluto, e xileno; 2 trocas de
2 minutos em cada.
Monte em meio resinoso.
RESULTADOS
Antígeno de superfície do vírus da hepatite B ....................azul.
Lipofuscina, mastócitos, elastina, mucina ..........................azul.
Núcleos e citoplasma ..................................................vermelho.
Pigmento biliar ...........................................................vermelho.
Hemossiderina .........................................................azul-pálido.
Proteína associada ao cobre ................................................azul.
REFERÊNCIA
TANAKA, A.B.- Victoria blue-nuclear fast red stain for Hbs antigen detection in paraffin
sections. Acta Pathol. Jpn., 31: 93, 1981.
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods
in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.