REANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS B

UNIVERSIDADE PAULISTA
REANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS B-1 NO
FOCO INFLAMATÓRIO AGUDO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós- Graduação em Patologia Ambiental
e Experimental da Universidade Paulista –
UNIP, para obtenção do título de mestre
em Patologia Ambiental e Experimental.
TATIANA MARA MONTEIRO PAIXÃO
SÃO PAULO
2013
TATIANA MARA MONTEIRO PAIXÃO
REANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS B-1 NO
FOCO INFLAMATÓRIO AGUDO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós- Graduação em Patologia Ambiental
e Experimental da Universidade Paulista –
UNIP, para obtenção do título de mestre
em Patologia Ambiental e Experimental,
sob orientação do Prof. Dr. Mario
Mariano.
SÃO PAULO
2013
Paixão, Tatiana Mara Monteiro.
Reanálise da migração e da diferenciação de células B-1 no foco
inflamatório agudo / Tatiana Mara Monteiro Paixão - 2013.
30 f. : il. color. + CD-ROM.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade
Paulista, São Paulo, 2013.
Área de Concentração: Imunopatologia.
Orientador: Prof. Dr. Mario Mariano
1. Célula B-1. 2. Migração. 3. Diferenciação. 4. Inflamação.
Título. II. Mariano, Mario (orientador).
I.
TATIANA MARA MONTEIRO PAIXÃO
REANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS B-1 NO
FOCO INFLAMATÓRIO AGUDO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Patologia Ambiental e
Experimental da Universidade Paulista –
UNIP, para obtenção do título de mestre
em Patologia Ambiental e Experimental.
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
________________________________/_/___
Prof.Dr. Mario Mariano
Universidade Paulista – UNIP
________________________________/_/___
Profa.Dra. Maria Anete Lallo
Universidade Paulista - UNIP
_________________________________/_/___
Profa. Dra. Ana Flávia Popi
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP
PAIXÃO,T.M.M.
REANÁLISE DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS B-1 NO FOCO INFLAMATÓRIO
AGUDO
RESUMO
As células B-1 são encontradas predominantemente nas cavidades pleural e
peritoneal de camundongos. Sua origem e função ainda não são completamente
conhecidas. Elas apresentam marcadores de superfície de linhagens mielóide e
linfóide e migram para focos inflamatórios, comportando-se como células fagocíticas.
A reavaliação da migração constituiu o objetivo deste trabalho. Para isso, foram
utilizados camundongos das linhagens BALB/c e BALB/xid. Estes, imunodeficientes
em linfócitos B-1, receberam essas células marcadas com CFSE por transferência
intraperitoneal adotiva. Lamínulas circulares de vidro foram implantadas no tecido
subcutâneo dos animais para a formação de um foco inflamatório agudo
inespecífico. Após diferentes tempos, os camundongos foram sacrificados e os
implantes removidos. As células aderentes nas lamínulas, obtidas por raspagem,
receberam anticorpos para marcação das seguintes moléculas de superfície: CD19,
CD23, CD11b e F4/80. Foram, então, analisadas em citômetro de fluxo. Os
resultados mostram que células B-1(CD19+CD23- CD11b+) migram para o foco
inflamatório induzido e foram detectadas após 6, 24 e 48 horas do implante das
lamínulas em camundongos BALB/c e em 48 horas após, em animais xid com
células transferidas. O aumento da expressão de F4/80 em células CD19+ sugere o
início
de
diferenciação
de
B-1
em
fagócitos
mononucleares.
Os
dados
demonstraram que células B-1 migram da cavidade peritoneal para um foco
inflamatório agudo inespecífico e diferenciam-se neste em células fagocíticas.
Palavras- chaves: Célula B-1. Migração. Diferenciação. Inflamação.
PAIXÃO,T.M.M.
RE-EVALUATION OF THE MIGRATION OF B-1 CELLS IN AN ACUTE
INFLAMMATORY LESION
ABSTRACT
The B-1 cells are found predominantly in the peritoneal and pleural cavities of
mice. Their origin and function are not yet fully known. They exhibit surface markers
of lymphoid and myeloid lineages and migrate to inflammatory foci, behaving as
phagocytic cells. The revaluation of this migration was the objective of this work. For
this, we used mice of BALB/c and BALB/xid. The latter, immunodeficient in B-1
lymphocytes, were labeled with CFSE by intraperitoneal adoptive transference.
Round glass coverslips were implanted in the subcutaneous tissue of animals to
induce a nonspecific acute inflammatory focus. After different times, mice were
sacrificed and the implants removed. Cells adherent on the implanted coverslips
were obtained by scraping with the aid of a rubber policemen, and labeled with
monoclonal antibodies to the following surface molecules: CD19, CD23, CD11b and
F4/80 and analyzed in a flow cytometer. Results show that B-1 cells (CD19+CD23CD11b+) migrate to the inflammatory foci being detected after 6, 24 and 48 hours
after the implantation of the coverslips in BALB/c mice 48 hours. Increased
expression of CD19 F4/80+ cells suggests early differentiation of B-1 cells in
mononuclear phagocytes. Our data demonstrate that B-1 cells migrate from the
peritoneal cavity to a nonspecific acute inflammatory focus and differentiate into
phagocytic
Keywords: Cell B-1. Migration. Differentiation. Inflammation.
cells.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Citometria de Células CFSE+ em lavado peritoneal de camundongos
BALB/xid injetados intraperitonealmente com o sobrenadante de cultura total de
células peritoneais aderentes de camundongos BALB/c, marcadas com 5 μM de
CFSE. Animal não injetado (a), 24 (b) e 48 (c) horas após implante de lamínulas.
Gate de células CFSE+CD19+CD11b+.......................................................................17
Figura 2 - Citometria de células CD19+CD23- recuperadas das lamínulas
implantadas em camundongos BALB/xid injetados intraperitonealmente com o
sobrenadante de cultura total de células peritoneais aderentes de camundongos
BALB/c, marcadas com 5 μM de CFSE. Animal não injetado (a), 24 (b) e 48 horas (c)
após implante de lamínulas........................................................................................18
Figura 3 - Número absoluto x 103 de células B-1 (CD19+ CD23-) recuperadas das
lamínulas implantadas em camundongos BALB/xid injetados com o sobrenadante de
cultura de células peritoneais aderentes de camundongos BALB/c em 24 e 48h após
implante........................................................................................18
Figura 4 - Citometria de células CD19+CD23- recuperadas de lamínulas implantadas
no dorso de camundongos BALB/c e a mediana de intensidade de CD11b+ dessas
células, às 6 (a), 24 (b) e 48 horas (c).......................................................................19
Figura 5 - Número relativo e absoluto (x103) de células CD19+CD23- recuperadas
de lamínulas implantadas em camundongos BALB/c às 6, 24 e 48 horas após
procedimento cirúrgico...............................................................................................20
Figura 6 - Mediana da intensidade de fluorescência da expressão de CD11b de
células CD19+CD23- recuperadas de lamínulas implantadas em camundongos
BALB/c às 6, 24 e 48h ............................................................................................... 20
Figura 7 - Citometria de células CD19+F4/80+ recuperadas de lamínulas implantadas
no dorso de animais BALB/c às 6 (a), 24 (b) e 48 horas (c) após cirurgia................ 21
Figura 8 - Células CD19+F4/80+ recuperadas de lamínulas implantadas em
camundongos BALB/c às 6, 24 e 48h após implante.................................................21
Figura 9- Número absoluto (x103) de células CD19+CD23- recuperadas de lamínulas
implantadas no dorso de camundongos BALB/c e BALB/xid. Comparação entre
BALB/xid, BALB/xid mais sobrenadante de cultura total de células peritoneais
aderentes de BALB/c e BALB/c, às 48 h após procedimento cirúrgico.....................22
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 7
1.1.
Células B-1, migração e diferenciação ......................................................... 10
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 12
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 13
3.1.
Animais ........................................................................................................ 13
3.2.
Implante de corpo estranho .......................................................................... 13
3.3.
Células peritoneais aderentes ...................................................................... 13
3.4.
Marcação com CFSE e injeção intraperitoneal ............................................ 14
3.5.
Recuperação das células aderidas à lamínula e lavagem peritoneal ........... 14
3.6. Imunofenotipagem das células recuperadas das lamínulas e peritônios análise por citometria de fluxo ............................................................................... 14
3.7.
Análise estatística ........................................................................................ 15
3.8.
Delineamento Experimental ......................................................................... 15
4. RESULTADOS ................................................................................................... 16
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 23
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 25
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 26
7
1. INTRODUÇÃO
No início da década de 80, em humanos com leucemia linfocítica crônica de
células B e em alguns linfomas de camundongo, foram observados linfócitos B
expressando a molécula de superfície CD5, chamados, inicialmente, de células B
Ly-1 (MANOHAR et al., 1982).
A presença dessa molécula, em uma população normal de linfócitos B,
também foi observada nas cavidades serosas de roedores (CALIGARIS-CAPPIO et
al., 1982; HAYAKAWA et al., 1984; HAYAKAWA et al., 1986).
Em 1992 (KANTOR), criou-se uma nova classificação de células B, dividindoas em dois subgrupos: B-1 (CD5+ - antes descrito Ly-1) e B-2.
Os linfócitos B-1 se diferem do convencional (B-2) em relação a sua
distribuição tecidual, fenótipo, morfologia e função (HAYAKAWA et al., 1983). São
encontrados
predominantemente
nas
cavidades
pleural
e
peritoneal
de
camundongos (HAYAKAWA et al., 1984; HAYAKAWA et al., 1986), em quantidade
menor no baço e praticamente ausentes em nódulos linfáticos (MARCOS et al.,1989;
FORSTER et al.,1991; KROESE et al., 1992).
Em relação às características fenotípicas, expressam tanto marcadores de
linhagem linfóide – IgD, IgM high,CD 19, B220
low
- quanto de mielóide - CD11b
low
e
não apresentam CD23 como ocorre em células B-2 (KANTOR et al.,1993). São
subdivididos em B-1a com a molécula de superfície CD5 e B-1b que não a
apresentam (KANTOR et al., 1992; STALL et al., 1992).
O quadro abaixo ilustra os marcadores expressos pelos diferentes subtipos de
linfócitos B: B-1a, B-1b e B-2.
Quadro 1: Marcadores de expressão das células B-1a, B-1b e B-2
Células
Marcadores
B-1a
CD19+, CD23-, CD11b+/- , CD5+, B220low, IgMhi, IgDlow
B-1b
CD19+, CD23-, CD11b+/-, CD5-, B220low, IgMhi, IgDlow
B-2
CD19+, CD23+, CD11b-,
CD5-, B220hi, IgMlow, IgDhi
Células que foram denominadas B-1c, presentes na cavidade peritoneal de
camundongos, apresentando os mesmos marcadores dos linfócitos B-1a, com
8
exceção da molécula CD11b (HASTINGS et al., 2006), não parecem ser um novo
subtipo de célula B-1 e sim, estágios menos diferenciados de B-1a e B-1b (GHOSN
et al., 2008).
Como as células em questão possuem características mielóide e linfóide,
abre-se um cenário de discussões a respeito de sua origem. Há duas hipóteses: a
primeira, atribuída a Haughton et al. (1993), diz que todos os subtipos de células B
têm um progenitor comum e a linhagem da célula depende da influência da seleção
de
antígenos.
Demonstraram
que
células
B-2
cultivadas
com
anti
IgM
(imunoglobulina M) e IL-6 (interleucina-6) assumem o fenótipo B-1. Baseado nessas
observações, concluíram que o fenótipo da célula B-1 ocorre quando a célula B-2,
ainda não totalmente diferenciada, expressa IgM em sua superfície e se estimulada
por antígenos timo independentes, pode diferenciar-se em células B-1. A segunda e
mais aceita, por Herzenberg e Kantor (1993), sugere que as células B-1 não provêm
de precursores da medula óssea como as B-2, mas de células que rearranjam seus
genes de imunoglobulinas durante os períodos de vida fetal e neonatal. Em seus
experimentos, células do fígado e do omento fetal foram capazes de reconstituir
preferencialmente linfócitos B-1 em camundongos irradiados. Células da medula
óssea adulta geravam principalmente células B-2.
A hipótese de precursores distintos ganhou evidência, desde que foi
identificado um progenitor na medula óssea que reconstitui principalmente células B1 em camundongos SCID (Imunodeficiência severa e combinada), tanto em fetos
quanto em adultos e é diferente do precursor de células B-2. Nos animais adultos,
porém, o potencial para gerar células B-1 é consideravelmente diminuído
(MONTECINO-RODRIGUEZ et al., 2006; BARBER et al., 2011).
No aspecto morfológico, os três subtipos de linfócitos B (B-2, B-1a e B-1b)
também têm características distintas. As células B-1b possuem projeções da
membrana plasmática, núcleo lobulado com pontes de cromatina e com proporção
núcleo/citoplasma baixa, retículo endoplasmático bem desenvolvido e mitocôndria
menos, diferenciando-se das B convencionais (ABRAHAO et al.,2003). Estas,
descritas como pequenas células redondas possuem densa cromatina e citoplasma
escasso. As células B-1a possuem características morfológicas mais próximas dos
linfócitos B-2 (ABRAHAO et al.,2003).
Referente à produção de imunoglobulinas, as células B-1 possuem a
capacidade de sintetizar e secretar as do tipo M (IgM) (HAYAKAWA et al., 1984) de
9
baixa especificidade e com reatividade a antígenos próprios. Provavelmente, são as
principais fontes de IgM natural sérica, como foi proposto por Herzenberg et al.
(1986), por meio de experimento contra o vírus influenza, em que anticorpos
provenientes de células B-1 garantiram a primeira “linha de defesa” contra infecções,
mas não foram capazes de controlar grandes cargas virais, necessitando da
presença de anticorpos mais específicos como os derivados de células B-2
(BAUMGARTH et al., 2000). Muitos plasmócitos IgA+ (imunoglobulina A) da lâmina
própria intestinal são derivados de precursores de células B-2. As pesquisas
demonstraram que metade desses plasmócitos IgA+ são derivados de células B-1
peritoneais (KROESE & BOS, 1999).
Os linfócitos B-1 mostram suas atividades tanto na imunidade inata quanto na
adaptativa, já que podem além de secretar imunoglobulinas (HERZENBERG et
al.,1986), apresentar antígenos (VIGNA et al., 2002) e oferecer memória imunológica
(LORENZO et al.,2007). Além disso, secretam citocinas pró e anti-inflamatórias,
como
TNF–α
(Fator
de
Necrose
Tumoral-α)
e
IL-10
(interleucina-10),
respectivamente (O´GARRA, 1992). Esta, liberada quando em co-cultivo de
macrófagos e células B-1, regula negativamente a atividade de fagocitose dos
macrófagos, demonstrando um papel imunossupressor (POPI et al., 2004). Também
através da produção de IL-10, a quantidade de células B-1 no camundongo adulto
parece ser auto-renovada (O´GARRA et al., 1992).
Essa auto-renovação de linfócitos B-1 é aparentemente independente de
células progenitoras e de estímulo proliferativo, ao contrário de células B2
(DARNELL et al., 1994). Proliferam-se espontaneamente em culturas estacionárias
de células peritoneais aderentes de camundongos. (ALMEIDA et al.,2001).
Nos processos inflamatórios crônicos específicos, as células B-1 são
essenciais à formação de células gigantes por corpo estranho (BOGSAN et al.,
2005), estão presentes na composição do granuloma (VIGNA et al., 2006) e
aumentam a taxa de crescimento e metastatização de melanomas murinos in vivo
(PÉREZ et al., 2008). Participam do processo de cicatrização (OLIVEIRA, 2009) e
atuam em importantes respostas mediadas por células T, como rejeição de
aloenxertos e reações de hipersensibilidade imediata e tardia (MARTINS, 2009).
O comportamento das células B-1 frente a diversas doenças infecciosas,
também
é
intrigante.
Animais
BALB/xid,
(X-linked
immunodeficiency
–
imunodeficiência ligada ao cromossomo X, que regula a expressão de uma tirosina
10
quinase), que são desprovidos de células B-1, mostram melhor resposta efetora e
evolução clínica contra a infecção por T. cruzi quando comparados aos
camundongos controle, que apresentam essas células (MINOPRIO et al.,1993). Os
camundongos BALB/xid também têm uma sobrevivência maior que os selvagens
quando infectados intratraquealmente por P. brasiliensis (POPI et al., 2008).
1.1. Células B-1, migração e diferenciação
Em 1972, surgiu o conceito de Sistema Mononuclear Fagocítico (VAN FURTH
et al.), em que todos os macrófagos, tanto os residentes em tecidos saudáveis
quanto os presentes no foco de uma resposta inflamatória, são derivados de
monócitos da medula óssea. Através de estímulos quimiotáticos, monócitos migram
para tecidos e se diferenciam em macrófagos (YAMASHIRO et al., 1998). O
desenvolvimento de monócitos e a sua diferenciação em macrófagos dependem do
fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF) (NAITO et al., 1991).
O fato de células B-1 serem obtidas de cultura de células peritoneais
aderentes de camundongos e que se diferenciam espontaneamente em fagócitos
mononucleares, independente de monócitos, interroga o conceito de Sistema
Mononuclear Fagocítico (ALMEIDA et al. ,2001; POPI et al., 2009). Outros
experimentos, como alguns descritos abaixo, também questionam esse conceito.
Camundongos osteopetróticos, em que há mutação na região que codifica o
gene cfms resultando em deficiência na produção de monócitos e completa ausência
de macrófagos, foram utilizados em um experimento, demonstrando que, após
estímulo com lipopolissacarídeo (LPS), fagócitos peritoneais (independentes de MCSF) eram derivados de células B-1. No mesmo estudo, o tratamento de animais
BALB/c com clodronato para a depleção de monócitos e macrófagos, confirmou a
participação de fagócitos derivados de B-1 como componentes da população do
peritônio. Camundongos BALB/xid com transferência adotiva intraperitoneal de
células B-1 CFSE+ (carboxifluoresceína succinimidil diacetato éster) também foram
utilizados e, após estímulo intraperitoneal com LPS, apresentaram fagócitos
CD11b+F4/80+CFSE+ reafirmando a diferenciação dessas células (POPI et al.
(2012).
Os linfócitos B-1a do baço, quando co-cultivados com fibroblastos, podem se
tornar fagócitos (BORRELLO & PHIPPS, 1995; BORRELLO & PHIPPS, 1996), assim
11
como as células B-1b recultivadas. Estas se aderem, espraiam e se diferenciam em
células mononucleares fusiformes, apresentando capacidade fagocítica, tanto via
receptor para a porção Fc de imunoglobulina, como para receptor de manose
(ALMEIDA et al., 2001). Ao se tornarem fagócitos, deixam de expressar marcadores
linfóides, mas mantém os marcadores mielóides. O mesmo fenômeno ocorre com
fatores de transcrição (POPI et al., 2009).
Almeida et al. (2001) demonstraram que as células B-1 são capazes de sair
da cavidade abdominal e migrar para um foco inflamatório agudo. Após a cultura e
crescimento de células B-1 in vitro, estas foram marcadas com timidina triciada e
inoculadas na cavidade peritoneal de camundongos. Depois da remoção de lâminas
de vidro, implantadas previamente no tecido subcutâneo desses animais, foram
feitas análises histoautoradiográficas que provaram a migração das células
marcadas para o corpo estranho.
Em um estudo realizado para analisar a atividade fagocítica dos linfócitos B-1,
em que bactérias foram injetadas intraperitonealmente, Jixin et al. (2012)
revelaram, que a maioria dos fagócitos peritoneais derivados de B-1 que continham
S. aureus eram CD11b+ e CD5- ,
indicando que as células B-1b têm maior
capacidade fagocítica em relação às células B-1a. Os pesquisadores, ao
compararem a quantidade de fagócitos CD11b+ em relação aos CD11b- contendo
bactérias, verificaram que existiam mais linfócitos CD11b- in vivo do que in vitro,
sugerindo que a expressão dessa molécula pode facilitar a migração das células B1.
Considerando as questões acima, que mostram as funções contraditórias dos
linfócitos B-1, ora colaborando na resposta imune efetora - tanto na secreção de
anticorpos quanto na atividade fagocítica, ora imunossuprimindo a atividade de
células do sistema imune, além de seu fenótipo promíscuo, foi proposta uma
investigação mais profunda do papel dessas células, enfocando sua migração e
diferenciação na resposta inflamatória, reproduzindo parcialmente o experimento de
Almeida et al. (2001) analisando as células presentes no foco inflamatório por
citometria de fluxo.
12
2. OBJETIVO
Verificar a migração das células B-1 da cavidade peritoneal para o foco
inflamatório agudo induzido por corpo estranho;
13
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos fêmeos das linhagens BALB/c e BALB/xid
com 8 e 5,5 semanas de idade, respectivamente, provenientes do CEDEME (Centro
de Desenvolvimento de Modelos Experimentais da UNIFESP) e mantidos em micro
isoladores no biotério da Disciplina de Imunologia, com ração e água autoclavados
fornecidos ad libitum.
Os procedimentos, que envolveram animais de experimentação, foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Paulista-UNIP, sob no
154/13.
3.2. Implante de corpo estranho
As lamínulas de vidro, com 13 mm de diâmetro, foram implantadas no tecido
subcutâneo da região dorso-lateral dos animais sob anestesia intramuscular
(quetamina 80 mg/kg e xilazina 15 mg/kg– Vetnil) , conforme descrito por Mariano &
Spector (1974).
3.3. Células peritoneais aderentes
As células peritoneais aderentes foram cultivadas seguindo a descrição de
Almeida et al. (2001) com algumas adaptações. Foram coletadas da cavidade
peritoneal de camundongos BALB/c por meio de lavagem com 8mL de meio de
cultura RPMI 1640 (Sigma, Saint Louis, MO). A suspensão celular foi mantida por 40
minutos, em estufa a 37º C e com atmosfera de 5% de CO 2. Após esse tempo, o
sobrenadante foi desprezado e acrescido RPMI suplementado de 10% de soro fetal
bovino às células aderentes na garrafa de cultura.
Estas foram cultivadas por 5 dias em estufa (5% de CO2 e 37º C). Após esse
período, o sobrenadante, enriquecido em células B-1, foi coletado para
experimentação. As células foram marcadas com CFSE (Molecular Probes).
14
3.4. Marcação com CFSE e injeção intraperitoneal
As células, em RPMI, foram incubadas com CFSE (Molecular Probes) 5μM e
deixadas por 15 minutos a 37oC no escuro. Após esse tempo, foram lavadas duas
vezes com meio completo - acrescido de 10% de soro fetal bovino.
Para serem injetadas, foram ressuspensas em RPMI na concentração de
2,1X106 células marcadas/ ml.
3.5. Recuperação das células aderidas à lamínula e lavagem peritoneal
As lamínulas foram raspadas com cell scraper (BD Falcon) para recuperação
das células aderidas, lavadas em PBS/BSA 1%, filtradas em cell strainer (BD Falcon)
para separar possíveis grumos celulares e incubadas com anti-Fc. Após 20 minutos
no escuro e no gelo, foram lavadas com PBS/BSA1% e acrescidas de anticorpos.
Foram realizadas lavagens com PBS 1% da cavidade peritoneal de
camundongos BALB/xid que receberam, intraperitonealmente, células marcadas
com CFSE por meio de transferência adotiva. Após centrifugação, as células foram
ressuspensas em PBS/BSA 1%, incubadas com anti-Fc e acrescidas dos anticorpos
para análise.
3.6. Imunofenotipagem das células recuperadas das lamínulas e peritônios análise por citometria de fluxo
Após a obtenção das células peritoneais e das lamínulas de animais BALB/xid
como descrito anteriormente, seu fenótipo foi analisado, incubando-as com
anticorpos específicos para cada marcador. Foram utilizados os seguintes
anticorpos (eBioscience): anti-CD19 conjugado a PECY7, anti-CD23- biotinilado
Strepto APC, anti-CD11b conjugado a PERCP .
O painel de anticorpos utilizados para imunofenotipagem das células
recuperadas das lamínulas de animais BALB/c foi: anti-CD19 conjugado a PECY7,
anti-CD23 conjugado a PE, anti-CD11b conjugado a PERCP e anti-F480 conjugado
a APC.
15
As células marcadas foram deixadas no gelo e no escuro por 15 minutos e em
seguida, lavadas e centrifugadas. Foram ressuspensas em PBS 1% e submetidas à
análise por citometria (Attune – Applied Biosystem).
3.7. Análise estatística
Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA, aplicado pelo programa
GraphPad InStat. Foram considerados estatisticamente significantes os dados com
valores de p menores do que 0,01 (p < 0,01) e menores do que 0,05 (p< 0,05).
3.8. Delineamento Experimental
As células marcadas com CFSE (2x106 células por animal) foram injetadas na
cavidade peritoneal de 7 animais BALB/xid e, após 1 hora, os mesmos foram
anestesiados com quetamina e xilazina e sofreram processo cirúrgico para a
implantação de duas lamínulas de vidro circulares, com 13mm de diâmetro, na
região dorso-lateral.
Três animais passaram pelo mesmo processo cirúrgico, porém sem a injeção
intraperitoneal de células para servirem de controle “branco”. Após 24 (4 animais
injetados e um, não) e 48 horas (3 animais injetados e 2, não) da cirurgia, os animais
foram sacrificados na câmara de CO2 . Para recuperação das células que se
aderiram às lamínulas foi utilizado Cell Scraper. O lavado peritoneal desses animais
também foi realizado para se verificar a presença dessas células marcadas. Para a
avaliação da população celular, foi utilizado citômetro de fluxo (Attune – Applied
Biosystem).
Em 6 animais BALB/c, foram implantadas as lamínulas circulares no dorso,
sem nenhuma célula transferida intraperitonealmente e retiradas com 6 ( Pool de 2
animais), 24( 2 animais) e 48 horas ( 2 animais) após cirurgia.
16
4. RESULTADOS
O sobrenadante de cultura total de células peritoneais aderentes (rico em
células B-1) de camundongos BALB/c e marcadas com CFSE foi transferido para o
peritônio de camundongos BALB/xid. Tanto esses animais, como também
camundongos BALB/c, sofreram processo cirúrgico para o implante de lamínulas na
região dorsal.
Os camundongos BALB/xid possuem imunodeficiência ligada ao cromossomo
X, tornando-os desprovidos de células B-1. Logo, o grupo controle (BALB/xid sem
transferência adotiva) não apresentou essas células nos lavados peritoneais nem no
foco inflamatório induzido pelo implante (Figuras 1 e 2).
Células B-1 (CD19+CD23-CD11b+) injetadas nos animais BALB/xid
e
encontradas fisiologicamente no peritônio de animais BALB/c estavam presentes
nas lamínulas, comprovando a migração dessas células da cavidade peritoneal para
o foco inflamatório agudo em questão (Figuras 2 e 4) .
A diferenciação dessas células nos implantes é sugerida graças às
expressões concomitantes de CD19+ , CD11b+ e F4/80+ (Figuras 4 e 7), fenótipo de
pré-fagócito de B-1 (GAMBERO et al., comunicação pessoal).
CFSE
CFSE
CFSE
b) Peritônio BALB/xid
injetado-24h
c) Peritônio BALB/xid
injetado-48h
CD19
a) Peritônio BALB/xid não injetado
controle
SSC
SSC
SSC
17
CD11b
d) Gate CFSE+
Figura -1 Citometria de células CFSE+ em lavado peritoneal de camundongos BALB/xid
injetados intraperitonealmente com o sobrenadante de cultura total de células peritoneais
aderentes de camundongos BALB/c, marcadas com 5 μM de CFSE. Animal não injetado (a), 24
+
+
+
(b) e 48 (c) horas após implante de lamínulas. Gate de células CFSE CD19 CD11b (d)
Os animais BALB/xid com transferência adotiva apresentaram células CD19+
CD11b+ (B-1) CFSE+ no lavado peritoneal, como mostra a Figura 1, em 24 e 48
horas após a cirurgia. Há um aumento de células CFSE+ comparando-se os
períodos analisados. Porém, as células CD19+CD23- (Figura 2), obtidas das
lamínulas implantadas com 48 horas nesses animais, não apresentaram marcação
com CFSE.
Tanto os camundongos controle, quanto os injetados em 24 horas, não
exibiram células B-1 no foco inflamatório (Figuras 2 e 3). Em 48 horas após o
implante, o número dessas células (CD19+ CD23-) têm aumento significativo em
relação aos outros dois grupos avaliados (Figura 3).
CD19
CD19
CD19
18
CD23
a) BALB/xid –controle
CD23
b) BALB/xid injetado- 24h
+
CD23
c) BALB/xid injetado- 48h
-
20
*
*
3
15
10
5
h
8
4
2
ra
n
c
BALB/xid
não injetado
4
o
h
0
b
n ú m e r o a b s o lu t o x 1 0
+
-
C é lu la s C D 1 9 C D 2 3 la m ín u la s B A L B /x id
Figura- 2 Citometria de células CD19 CD23 recuperadas das lamínulas implantadas em
camundongos BALB/xid injetados intraperitonealmente com o sobrenadante de cultura total
de células peritoneais aderentes de camundongos BALB/c, marcadas com 5 μM de CFSE.
Animal não injetado (a), 24 (b) e 48 horas (c) após implante de lamínulas.
Tem po
3
+
-
Figura - 3 Número absoluto x 10 de células B-1 (CD19 CD23 ) recuperadas das lamínulas
implantadas em camundongos BALB/xid injetados com o sobrenadante de cultura de células
peritoneais aderentes de camundongos BALB/c em 24 e 48h após implante. *p<0,05
MFI
CD19
SSC
19
CD23
CD23
CD11b
MFI
CD19
(b) Lamínulas BALB/c – 24h
SSC
CD11b
MFI
CD19
SSC
(a) Lamínulas BALB/c – 6h
CD23
CD11b
(c) Lamínulas BALB/c – 48h
+
-
Figura - 4 Citometria de células CD19 CD23 recuperadas de lamínulas implantadas no dorso
+
de camundongos BALB/c e a mediana de intensidade de CD11b dessas células, às 6 (a), 24
(b) e 48 horas (c)
3
20
10
h
8
4
2
4
h
h
0
6
+
30
N ú m e r o a b s o lu t o x 1 0
C é lu la s C D 1 9 C D 2 3 la m ín u la s B A L B /c
Células CD19+CD23- lamínulas BALB/c
20
Tem po
3
+
-
Células B-1
Figura - 5 Número relativo e absoluto (x10 ) de células CD19 CD23 recuperadas de lamínulas
implantadas em camundongos BALB/c às 6, 24 e 48 horas após procedimento cirúrgico.
Figura- 6 Mediana da intensidade de fluorescência da expressão de CD11b de células
+
CD19 CD23 recuperadas de lamínulas implantadas em camundongos BALB/c às 6, 24 e 48h.
*p<0,05 / **p<0,01
Os animais BALB/c apresentaram aumento de células B-1 (CD19+/CD23-) nas
lamínulas nos tempos analisados (Figura 5). Também foi crescente a expressão de
CD11b nessas células (MFI- Mediana da Intensidade de Fluorescência), com
aumento significativo entre 6 e 48h e 24 e 48h (Figuras 4 e 6).
21
(a) Lamínulas BALB/c – 6h
(b) Lamínulas BALB/c – 24h
Lamínulas BALB/c – 6h
+
+
(c) Lamínulas BALB/c – 48h
h
+
**
25
3
*
N ú m e r o a b s o lu t o x 1 0
20
15
10
5
h
8
4
2
4
h
h
0
6
+
-
C é lu la s C D 1 9 C D 2 3 F 4 /8 0
+
la m ín u la s B A L B /c
Figura- 7 Citometria de células CD19 F4/80 recuperadas de lamínulas implantadas no dorso
de animais BALB/c às 6 (a), 24 (b) e 48 horas (c) após cirurgia
Tem po
+
Figura - 8 Células CD19 F4/80 recuperadas de lamínulas implantadas em camundongos
BALB/c às 6, 24 e 48h após implante. *p<0,05 / **p<0,01
As células B-1, presentes no foco inflamatório agudo induzido em animais
BALB/c, expressam CD19+CD11b+F4/80+ (Figuras 4 e 7). Em 24 e 48 horas, há
aumento significativo de células CD19+F4/80+ em relação ao primeiro tempo
analisado (Figura 8).
22
*
Células CD19+ CD23Número absolutox103
50
48h
40
30
20
10
/c
A
LB
B
st
itu
BALB/xid
íd
o
+ B-1
re
co
n
B
A
LB
/x
id
B
A
LB
/x
id
0
3
+
-
Figura - 9 Número absoluto (x10 ) de células CD19 CD23 recuperadas de lamínulas
implantadas no dorso de camundongos BALB/c e BALB/xid. Comparação entre BALB/xid,
BALB/xid mais sobrenadante de cultura total de células peritoneais aderentes de BALB/c e
BALB/c, às 48 h após procedimento cirúrgico.*p<0,05
A Figura 9 ilustra aumento significativo de células B-1 recuperadas das
lamínulas implantadas entre BALB/xid e BALB/c.
23
5. DISCUSSÃO
Os linfócitos B-1 inoculados em camundongos BALB/xid e os presentes
fisiologicamente no peritônio de camundongos BALB/c migraram para o foco
inflamatório agudo (lamínulas), da mesma forma que Almeida et al. (2001)
demonstraram e, neste experimento, por meio da evidência de células CD19+ CD23nas lamínulas .
O CFSE é um marcador citoplasmático utilizado em estudos de migração e de
divisão celular (in vitro e in vivo) e, a cada divisão, perde metade de sua intensidade
de fluorescência (PARISH, 1999). A ausência da marcação das células nas
lamínulas, antes presente no peritônio, provavelmente é devido à alta proliferação
celular e/ou perda natural de fluorescência. Para possível comprovação da hipótese,
seria necessário um teste com células CFSE+ adicionadas a outro marcador de
proliferação e cultivadas in vitro. Desse modo, poderia ser analisada tanto a
intensidade de fluorescência (MFI) do CFSE quanto do marcador adicionado, após
os períodos de 24 e 48 horas, como os utilizados neste estudo.
Almeida et al. (2001), em seus experimentos, evidenciaram fagócitos de B-1
marcados com timidina triciada nas lamínulas implantadas em 24 e 48 horas em
animais BALB/c e, no segundo tempo analisado, o número dessas células aumentou
em 10-14% em relação ao primeiro. Nestes experimentos, também foram
observadas células B-1 (CD19+ CD23-) nas lamínulas em BALB/c às 6, 24 e 48h, e o
número de células, tanto relativo quanto absoluto, foi crescente entre os períodos
considerados. A mediana de intensidade de fluorescência da expressão de CD11b
teve aumento significativo (p<0,01 6-24h/ p<0,05 24-48h), demonstrando crescente
expressão desse marcador nas células B-1. A expressão dessa molécula pode
indicar maior capacidade migratória dessas células quando comparadas às B-1
CD11b- (JIXIN et al., 2012). Em animais BALB/xid com transferência adotiva, foi
confirmado o fenótipo CD19+CD23- apenas em 48 horas.
Essas células se diferenciam no foco inflamatório, apresentando morfologia
de fagócito e são capazes de fagocitar via Fc e receptores de manose (ALMEIDA et
al.,2001). Popi et al. (2012) confirmaram população de fagócitos derivados de B-1
(CD11b+ F4/80+ CFSE+),após o estímulo com LPS, na cavidade peritoneal de
camundongos BALB/xid, depois da transferência adotiva de células B-1 CFSE+ para
24
o peritônio desses animais, admitindo assim, a diferenciação dessas células em
fagócitos.
Os macrófagos expressam CD11b e F4/80 mas, não CD19. As células B-2
expressam CD19, mas não CD11b nem F4/80. Gambero et al. (comunicação
pessoal) demonstraram que os pré-fagócitos de B-1 apresentam fenótipo
CD19+CD11b+F4/80+. O aumento significativo de células CD19+CD11b+ F4/80+
sugere início de diferenciação de B-1 (pré-fagócitos) no foco inflamatório induzido.
25
6. CONCLUSÃO
Células B-1 migram da cavidade peritoneal para um foco inflamatório agudo
induzido por corpo estranho;
A presença de células CD19+CD11b+ F4/80+ no foco inflamatório sugere que
células B-1 se diferenciam em fagócito mononuclear no modelo estudado;
Células B-1 marcadas com CFSE e injetadas na cavidade peritoneal não
foram visualizadas nas lamínulas implantadas.
26
REFERÊNCIAS
ABRAHAO, T.B.; FREYMULLER, E.; MORTARA, R.A.; LOPES, J.D.; MARIANO, M.
Morphological characterization of mouse B-1 cells. Immunobiology, v.208,p.401411,2003.
ALMEIDA, S.R.; AROEIRA, L.S.; FRYMULLER, E.; DIAS, M.A.; BOGSAN, C.S.;
LOPES, J.D., MARIANO, M. Mouse B-1 cell derived mononuclear phagocyte, a novel
cellular component of acute non-specific inflammatory exudate. Int. Immunol.,v.13,p.
1193-1201,2001.
BARBER C.L.; MONTECINO-RODRIGUEZ, E.; DORSHKIND, E. Reduced
production of B-1–specified common lymphoid progenitors results in diminished
potential of adult marrow to generate B-1 cells. P.N.A.S., v.108,p.13700-13704,2011.
BAUMGART, N.; HERMAN, O.C.; JAGER, G.C.; BROWN, L.E.; HERZENBERG L.A.;
CHEN, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant
components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp.
Med.,v.192,p.271-280,2000.
BOGSAN, C.S.; NOVAES e BRITO R.R.; PALOS, M.C.; MORTARA, R.A.; ALMEIDA,
S.R.; LOPES J.D.; MARIANO, M. B-1 cells are pivotal for in vivo inflammatory giant
cell formation. Int. J. Exp. Pathol.,v. 86,p.257-265, 2005.
BORRELLO, M.A.; PHIPPS, R.P. Fibroblasts support outgrowth of splenocytes
simultaneously expressing B lymphocyte and macrophage characteristics. J.
Immunol., v.155,p.4155-4161,1995.
BORRELLO M.A.; PHIPPS, R.P. The B/macrophage cell : an elusive link between
CD5+ B lymphocytes and macrophages. Immunol. Today,v. 17,p.471-475,1996.
CALIGARIS-CAPPIO, F.; GOBBI, M.; BOFILL, M., JANOSSY, G. Infrequent normal
B lymphocytes Express features of B-chronic lymphocytic leukemia. J. Exp. Med.,
v.155, p.623-628,1982.
DARNELL, J.E.; KERR, I.M.; STARK, G.R. Jak-Stat pathways and transcriptional
activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science, v.
264,p.1415-1421,1994.
FORSTER, I.; GU, H., MULLER, W.; SCHMITT, M.; TARLINTON, D.; RAJEWSKY,
K. CD5 B cells in the mouse. Cur. Top. Microbiol. Immunol.,v.173,p.247-251,1991.
27
GHOSN, E.E.; YANG, Y.; TUNG, J.; HERZENBERG, L.A. CD11b expression
distinguishes sequential stages of peritoneal B-1 development. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA,. V.105,p. 5195-5200,2008.
HASTINGS, W.D.; GURDAK, S.M.; TUMANG, J.R.; ROTHSTEIN, T.L. CD5+/Mac-1peritoneal B cells: a novel B cell subset that exhibits characteristics of B-1 cells.
Immunol. Lett., v.105,p.90-96,2006.
HAUGHTON, G.; ARNOLD, L.W.; WHITMORE, A.C.; CLARKE, S.H. B-1 cells are
made, not born. Immunol. Today, v.14,p.84-87,1993.
HAYAKAWA, K.; HARDY, R.R.; HERZENBERG, L.A. Progenitors for Ly-1B cells are
distinct from progenitors for other B cells. J. Exp. Med.,v. 161,p.1554-1568,1985.
HAYAKAWA, K.; HARDY, R.R.; PARKS, D.R.; HERZENBERG, L.A. The “Ly-1B” cell
subpopulation in normal immunodefective, and autoimmune mice. J. Exp. Med.,
v.157,p.202-218,1983.
HAYAKAWA, K.; HARDY, R.R.; STALL, A.M.; HERZENBERG, L.A. Immunoglobulinbearing B cells reconstitute and maintain the murine Ly-1B cell lineage. Eur. J.
Immunol., v.16,p.1313-1316,1986.
HAYAKAWA, K.; HARDY, R.R.; HERZENBERG, L.A. Peritoneal Ly-1B cells: genetic
control, autoantibody production, increased lambda light chain expression. Eur. J.
Immunol.,v. 16,p.450-456,1986.
HAYAKAWA, K.; HARDY, R.R.; HONDA, M.; HERZENBERG, L.A.; STEINBERG,
A.D.Ly-1 B cells: functionally distinct lymphocytes that secrete IgM autoantibodies.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.81,p.2494-2498,1984.
HERZENBERG, L.A.; KANTOR, A.B. B-cell lineages exist in the mouse. Immunol.
Today, v.14,p.79-83,1993.
HERZENBERG, L.A.; STALL, A.M.; LALOR, P.A.; SIDMAN, C., MOORE, W.A.;
PARKS, D.R. The Ly-1 B cell lineage. Immnunol. Rev., v.93,p.81-102,1986.
JIXIN, G.; XIAOYING, M.; WEIJIE, G.; MENG, F., JINGANG, An.; YING,
X.;TIANWEN, Gao.; WEI , Li.; YUFENG, L. Novel functions of murine B1 cells:
Active phagocytic and microbicidal abilities. Eur. J. Immunol.,v. 42,p.982–992,2012.
KANTOR, A.B.; HERZENBERG, L.A. Origin of murine B cell lineages. Annu. Rev.
Immunol., v.11,p.501-538,1993.
28
KANTOR, A.B.; STALL, A.M.; ADAMS, S.; HERZENBERG, L.A. Differential
development of progenitor activity for three B-cell lineages. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, v.89,p.33203324,1992.
KROESE, F.G.; BOS, N.A. Peritoneal B-1 cells switch in vivo to IgA and theses IgA
antibodies can bind to bactéria of the normal intestinal microflora. Curr. Top.
Microbiol. Immunol., v.246,p.343-349, 1999.
KROESE, F.G.; AMMERLAAN, W.A.; DEENEN, G.J. Location and function of B-cell
lineages. Ann. NY. Acad. Sci., v.651,p.44-58,1992.
LORENZO, B.H.; BRITO, R.R.; GODOY, L.C.; LOPES, J.D.; MARIANO, M.
Tolerogenic property of B1-b cells in a model of allergic reaction. Immunol. Lett.,
v.114,p.110-118, 2007.
MANOHAR, V.; BROWN, E.; LEIRSON, W.M.; CHUSED, T.M. Expression of Lyt-1
by a subset of B lymphocytes. J. Immunol., v.129,p.532-538, 1982.
MARCOS, M.A.; HUETZ, F.; PEREIRA, P.; ANDREU, J.L.; MARTINEZ, A.C.;
COUTINHO, A. Further evidence for coelomic-associated B lymphocytes. Eur.
J.Immunol., v.19,p.2031-2035, 1989.
MARIANO, M.; SPECTOR, W.G. The formation and properties of macrophage
polykaryons (inflammatory giant cells). The Journal of pathology, v.113,p.119,1974.
MARTINS, M.C.F.N. Participação de células B-1 na rejeição de aloenxertos no
camundongo. Tese de doutorado. São Paulo: Universidade Federal de São
Paulo;2009.
MINOPRIO, P.; EL CHEIKH, M.C.; MURPHY, E.; HONTEBEY, M.; COFFMAN, R.;
COUTINHO O’GARRA, A. Xid-associated resistance to experimental Chagas’
disease is IFN-gamma dependent. J. Immunol., v.151,p.4200-4208, 1993.
MONTECINO-RODRIGUEZ, E.; LEATHERS, H.; DORSHKIND, K. Identification of a
B-1 B cell- specific progenitor. Nat. Immunol. ,v. 7(3),p.293-301,2006.
NAITO, M.; HAYASHI, S.; YOSHIDA, H.; NISHIKAWA, S.; SHULTZ, L.D., et al.
Abnormal differentiation of tissue macrophage populations in “osteopetrosis” (op)
mice defective in thje production of macrophage colony-stimulating factor. Am. J.
Pathol., v.139,p.657-667, 1991.
29
O’GARRA, A.; CHANG, R.; GO, N.; HASTINGS, R.; HAUGHTON, G.; HOWARD, M.
Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell-derived interleukin 10. Eur. J.
Immunol.,v. 22,p. 711-717,1992.
OLIVEIRA, H.C.; POPI, A.F.; BACHI, A.L.; NONOGAKI, S.; LOPES, J.D.; MARIANO,
M. B-1 cells modulate the kinetics of wound-healing process in mice.
Immunobiology ,2009.In press.
PARISH, C.R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.
Immunol. Cell Biol., v.77,p.499-508, 1999.
PÉREZ, E.C.; MACHADO, J.Jr.; ALIPERTl, F.; FREYMULLER, E.; MARIANO, M.;
LOPES, J.D. B-1 lymphocytes increase metastatic behavior of melanoma cells
through the extracellular signal-regulated kinase pathway. Cancer Sci., v.99,p.920928,2008.
POPI, A.F.; GODOY, L.C.; XANDER, P.; LOPES, J.D.; MARIANO, M. B-1 cells
facilitate Paracoccidioides brasiliensis infection in mice via IL-10 secretion. Microbes
Infect., v.10,p.817-824,2008.
POPI, A.F.; LOPES, J.D.; MARIANO, M. Interleukin-10 secreted by B-1 cells
modulates the phagocytic activity of murine macrophages in vitro. Immunology,
v.113,p.348-354,2004.
POPI, A.F.; MOTTA, F.L.; MORTARA, R.A.; SCHENKMAN, S.; LOPES, J.D.;
MARIANO, M. Co-ordinated expression of lymphoid and myeloid specific
transcription factors during B-1b cell differentiation into mononuclear phagocytes in
vitro. Immunology, v.126,p.114-122, 2009.
POPI, A.F.; OSUGUI, L.; PEREZ, K. R.; LONGO-MAUGÉRI, I.M.; MARIANO, M.
Could a B-1 Cell Derived Phagocyte “ Be One” of the Peritoneal Macrophages during
LPS-Driven Inflammation?.Journal Plos One. v7(3),e34570, 2012.
STALL, A.M.; ADAMS, S.; HERZENBERG, L.A.; KANTOR, A.B. Characteristics and
development of the murine B-1b (Ly1-B sister) cell population. Annals of the New
York Academy os Sciences, 651: 33-43, 1992.
VAN FURTH, R.; COHN, Z.A.; HIRSCH, J.G.; HUMPHREY, J.H.; SPECTOR,
W.G.,et al. The mononuclear phagocyte system: a new classification of
macrophages, monocytes, and their precursor cells. Bull World Health Organ, v.46,
p.845-852,1972.
30
VIGNA, A.F.; ALMEIDA, S.R.; XANDER, P.; FREYMULLER, E.; MARIANO, M.;
LOPES, J.D. Granuloma formation in vitro requires B-1 cells and is modulated by
Paracoccidioides brasiliensis gp43 antigen. Microbes Infect., v.8,p.589-597,2006.
VIGNA, A.F.; GODOY, L.C.; ROGERIO, D.A.; MARIANO, M.; LOPES, J.D.
Characterization of B-1b cells as antigen presenting cells in the immune response to
gp43 from Paracoccidiodes brasiliensis in vitro. Immunol. Lett., v.83,p.61-66,2002.
YAMASHIRO, S.; TAKEYA, M.; KURATSU, J.; USHIO, Y.; TAKAHASHI K.,et al.
Intradermal injection of monocyte chemoattractant protein -1 induces emigration and
differentiation of blood monocytes in rat skin. Int. Arch. Allergy Immunol.,
v.115,p.15-23, 1998.