26 ácidos orgânicos - Ministério da Agricultura

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA
Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA
Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL
Manual de Métodos de Análises de Bebidas e Vinagres
Fermentados Alcoólicos
ÁCIDOS ORGÂNICOS
Método 26
1. MÉTODO
Cromatografico.
2. PRINCÍPIO
Os ácidos orgânicos da amostra podem ser separados e determinados através de cromatografia
líquida de alta eficiência com detector de ultra-violeta.. A determinação desses ácidos é efetuada
por comparação com um padrão externo.
3. MATERIAL
3.1 EQUIPAMENTO
a) Cromatógrafo líquido de alta eficiência equipado com um injetor com válvula de 10
µL; um dispositivo de termoestabilização; um detector espectrofotométrico para
medidas de absorção a 210 nm; um registrador, e eventualmente, um integrador.
3.2 REAGENTES E SOLUÇÕES
a) Reagentes e Soluções
b) Água ultrapura.
c) Metanol destilado
d) Ácido tartárico
e) Ácido málico
f)
Lactato de sódio
g) Acetato de sódio p.a.
h) Ácido succínico
i)
Ácido cítrico
j)
Ácido fumárico.
l)
Ácido chiquímico.
m) Ácido sulfúrico (d20 = 1,84 g/mL)
n) Solução de ácido sulfúrico 0,0125 M
o) Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)
p) Sulfato de amônio
q) Ácido ortofosfórico a 85% ( d20 = 1,71 g/mL).
r)
Solução de referência composta de: ácido tártarico (5 g/L), ácido málico (5 g/L),
lactato de sódio (6,22 g/L), ácido chiquímico (0,05 g/L), acetato de sódio (6,83 g/L),
ácido succínico (5 g/L), ácido fumárico (0,01 g/L), e ácido cítrico (5 g/L).
Nota: Para a determinação dos ácidos tartárico e málico, é preferível utilizar sílica ligada à octila
e, para os ácidos cítrico e lático, a separação por resina de troca iônica.
Outros tipos de colunas podem igualmente permitir uma boa separação. As condições de
operação são aqui descritas a título de exemplo.
3.3 VIDRARIA E OUTROS MATERIAIS
a) Dispositivo de filtração com membrana de celulose (0,45 µm).
b) Cartucho contendo sílica ligada a octadecila (C18), Sep Pak WATER ASS ou similar.
Para o caso da separação dos ácidos cítrico, lático e acético:
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ÁCIDOS ORGÂNICOS
Método 26
Coluna de resina catiônica (H+) (ex: HPX-87 H BIO-RAD, comprimento 300 mm,
diâmetro interno 7,8 mm, partículas de 9 µm),
fase móvel: solução de ácido sulfúrico 0,0125 M,
vazão da fase móvel: 0,6 mL/min.,
temperatura: 60-65 ºC (conforme o lote de resina).
c)
Para a separação dos ácidos tártarico, málico, lático, succínico, fumárico, e
chiquímico.
Duas colunas (250 mm de comprimento e 4 mm de diâmetro interno) dispostas em
série com partículas esféricas de 5 µm de diâmetro, contendo sílica ligada à octila.
fase móvel: solução contendo 70 g/L de dihidrogenofosfato de potássio, 14 g/L em
sulfato de amônio, e ajustada em pH = 2,1, por adição de ácido fosfórico.
vazão da fase móvel: 0,8 mL/min.,
temperatura: 20 °C.
4. PROCEDIMENTO
4.1 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Lavar previamente o cartucho com 10 mL de metanol depois com 10 mL de água. Desgaseificar
a amostra. Filtrar através membrana de celulose (0,45 µm). Tomar 8 mL da amostra filtrada em
uma seringa previamente enxaguada com a amostra e eluir pelo cartucho. Desprezar os três
primeiros mL e recolher os 5 mL restantes (evitar usar o cartucho seco).
4.2 CROMATOGRAFIA
Injetar no cromatógrafo, sucessivamente,10 µL da solução de referência e 10 µL da amostra,
preparada conforme 4.1. Repetir três vezes estas injeções na mesma ordem. Registrar o
cromatograma.
4.3 ANÁLISE QUALITATIVA
Determinar os tempos de retenção respectivos de cada um dos compostos eluídos.
Os ácidos orgânicos da solução de referência são separados na seguinte ordem:
a) Ácidos cítrico, tartárico, málico, succínico + chiquímico, lático, fumárico, acético, pela
técnica que utiliza a resina de troca iônica.
b) Ácidos tartárico, málico, chiquímico, lático, acético, cítrico, succínico e fumárico pela
técnica que utiliza duas colunas de sílica ligada à octila.
5. CÁLCULOS E EXPRESSÃO DO RESULTADO
Medir a área de cada um dos picos e determinar a média das três respostas para a solução de
referência e para a amostra em análise. A concentração dos ácidos orgânicos na amostra é
calculada pela fórmula:
CAA =
Onde:
CAA =
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AA × C
AP
Concentração do ácido orgânico na amostra.
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= Área da amostra.
AA
= Concentração do ácido orgânico na solução de referência.
C
= Área da solução de referência.
AP
As concentrações são expressas em:
Gramas por litro com um decimal para os ácidos tartárico, málico, lático e succínico.
Miligramas por litro para os ácidos cítrico, fumárico e acético.
REFERENCIA
Recueil des méthodes internationales d’analyse des vins et des moûts, OIV (Ed.) , ed. jun.1990,
Paris, 368 p.
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