título do resumo

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ESTUDO DO PERFIL IMUNOHISTOPATOLÓGICO DA INFECÇÃO
EXPERIMENTAL POR DIFERENTES CEPAS DE Escherichia coli EM
CAMUNDONGOS SWISS.
Bruna Santos Marnieri, Telma Saraiva dos Santos, Tácito Graminha Campois,
email: [email protected]
Instituto Filadélfia de Londrina (UNIFIL) em parceria com a Universidade
Estadual de Londrina.
Área e subárea do conhecimento: Imunologia Aplicada/Histologia
Palavras-chave:
histopatológicas.
Escherichia
coli;
infecção
intraperitoneal;
alterações
Resumo
A Escherichia coli é uma bactéria que possuem grande importância por
englobar uma gama de patógenos isolados em humanos e animais, pois é uma
bactéria que está presente em indivíduos sadios como microbiota normal,
principalmente colonizando o intestino, porém quando ocorre uma queda da
imunidade, ou até mesmo a irrupção da barreira gastrointestinal é capaz de
provocar infecções, inclusive por cepas não virulentas. Existem variações de
cepas desse tipo de bactéria, algumas síndromes podem acompanhar a
infecção por E. coli com características diarreiogênicas ou comprometimento
de outros órgãos, sendo evidenciados principalmente a colite hemorrágica e
síndrome hemolítica-urêmica (E. coli Enterohemorragica – EHEC), invasão e
destruição de células intestinais da mucosa intestinal (E. coli Enteroinvasiva –
EIEC). O trabalho teve como objetivo abordar aspectos práticos e teóricos
sobre o estudo de infecção intraperitoneal de camundongos fêmeas da espécie
SWISS por 3 tipos de cepas diferentes da bactéria Escherichia coli, cepas de
ATCC (cepa controle), EHEC e EIEC, em seguida após a infecção dos
camundongos realizou o estudo sobre a mudança histopatológica dos tecidos
de 4 órgãos escolhidos (baço, rim, intestino delgado e intestino grosso) para
realizar o método de emblocamento em parafina, cortes e preparação de
lâmina com material fixado e corado, sendo todos esses procedimentos
submetidos ao comitê de ética.
1
Introdução
A família Enterobacteriaceae é uma das mais importantes pois nela se incluem
os principais agentes de infecção hospitalar e organismos responsáveis por
causar infecção intestinal em vários países do mundo (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008). A Escherichia coli (E. coli) é um importante e abundante
membro da microbiota intestinal do ser humano e outros mamíferos, que
coloniza a mucosa do cólon e convivem de maneira saudável e com mútuos
benefícios durante muitos anos, porém, essas estirpes comensais podem
causar doenças em hospedeiros imunodeprimidos ou com barreira
gastrointestinal rompida (peritonite por exemplo) (SWEENEY et al., 1996).
A EHEC se destaca por causar ampla doença no homem que
compreende desde casos assintomáticos, diarreia branda até casos mais
graves de colite hemorrágica que pode evoluir para complicações extraintestinais como a síndrome hemolítica urêmica, além de complicações como
trombocitopenia trombótica (PTT) e anormalidades neurológica (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008). A principal patologia causada por EHEC é a Sindrome
Hemolítica Urêmica (SHU) que é um conjunto de três doenças; anemia
hemolítica, plaquetopenia ou trombocitopenia e insuficiência renal. (MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2010; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
A E. coli enteroinvasora (EIEC) é um importante causador de diarreia no
homem, essas bactérias invadem as células do cólon do homem e provoca
infecção semelhante a causada por Shigella sp. interagindo principalmente com
a mucosa do cólon. EIEC e Shigella sp. podem não ser distinguidas por alguns
testes bioquímicos, porém os fatores de virulência presentes são essenciais
(KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004; NATARO, 1998; TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008).
Assim, mostrando a importância de descobrir quais mudanças estão
ocorrendo nos tecidos dos órgãos que são possivelmente acometidos por essa
bactéria, sendo então necessário a avaliação imunohistopatologica das lâminas
para confirmação de alterações e recrutamento celular no tecido.
Materiais e Métodos
O estudo foi realizado nas instalações do Centro Universitário FiladélfiaUNIFIL, Londrina-PR, no laboratório de pesquisa do curso de Biomedicina e
Laboratório de Anatomia Patológica do Hospital Veterinário do Centro
Universitário Filadélfia.
Foram utilizados 64 camundongos SWISS fêmeas com idade entre 8 e
10 semanas procedente do biotério da Universidade Estadual de Maringá. O
uso dos animais obedecerá às normas estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA), e o protocolo de experimentação aprovado
2
pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal do Centro Universitário
Filadélfia (Parecer número 001/2014).
Cada grupo será realizado em quadruplicata, e repetido em dois
experimentos independentes.
As cepas utilizadas no experimento, EHEC, EIEC e ATCC, vieram do
laboratório de microbiologia da Universidade Estadual de Londrina (UEL). As
mesmas ficaram mantidas em meio de cultura Ágar Nutriente até serem
utilizadas.
Ambas as cepas deverão ser ajustadas no padrão de Mcfarland,
obtendo o valor de 1x108. Porém para serem utilizadas, essas cepas terão que
ser diluídas duas vezes em PBS até chegar ao valor de 1x10 6. Para a diluição
foram utilizadas 100uL da bactéria (1x108) em 900uL de PBS, repetindo duas
vezes até chegar ao valor desejado.
O PBS utilizado para diluição é de 0,1 M (Sambrook et al, 1989).
Após a obtenção da bactéria em 1x106, serão utilizados 500uL/ 1mL
desta solução, para inoculação nos camundongos. Após essa inoculação a
bactéria será diluída novamente, chegando à quantidade desejada 1x10 5.
Uma suspensão contendo 1x105 de E. coli (EHEC, EIEC ou ATCC) foi
inoculada intraperitonealmente em uma única dose nos grupos determinados
(Figura 2).
Após os períodos de zero (controle negativo), 30 minutos, 3, 6, 12, 24,
48 e 72 horas da inoculação da E. coli, os animais foram eutanasiados por
deslocamento cervical. Após isso, com o auxílio de uma tesoura e de uma
pinça foi realizado a abertura do peritônio dos animais. Com muito cuidado
para não perfurar nenhum órgão ou vaso sanguíneo.
Assim evitando a perda de algum órgão que foi retirado, os órgãos
intraperitoneais retirados foram fígado, baço, rim e intestino será realizada
baseada em escore de lesão adaptado de Gerez et al., (2015) no qual são
considerados a frequência e severidade de cada alteração histológica,
atribuindo valor 0: ausente, 1:discreta, 2:moderada e 3:severa.
Após a retirada dos órgãos, cada camundongo obteve 4 frascos:
1 FRASCO: rim / baço / linfonodo; 2 FRASCO: 2 cortes do intestino; 3
FRASCO: 2 cortes do intestino;4 FRASCO: 1 corte do intestino.
Assim esses fragmentos de órgão irão passar por serão fixados em
solução de formalina 10% por 20 horas e então embebidas em parafina e
cortes com 5 µm serão dispostos em lâminas e coradas com hematoxilina e
eosina para análise histológica, a fim de estabelecer o tipo de infiltrado
inflamatório predominante na lesão, e extensão de acometimento.
Resultados e Discussão
3
O projeto está ainda em andamento, foram realizadas as primeiras partes do
experimento, sendo estás: infecção dos camundongos por cepas de e.coli
(EHEC, EIEC E ATCC), e a eutanásia dos animais e em seguida a retirada por
órgãos escolhidos (rim, baço, linfonodo, intestino delgado, intestino grosso).
Pois assim o projeto está na parte da confecção das laminas, para
posteriormente leitura, avaliação das mudanças e realização das discussões.
Conclusões
Perante ao estágio que o trabalho está, não será possível realizar uma
conclusão como um todo, apenas que os trabalhos realizados anteriormente no
mesmo projeto mostraram que o sistema imunológico recruta células e
citocinas para desencadear uma reação inflamatória no organismo para
combater a bactéria.
Por isso a necessidade de avaliar as mudanças imunohistopatologicas
dos órgãos desses animais, para uma possível confirmação dos dados
encontrados no outro trabalho.
Agradecimentos
A todos que tornaram esse projeto possível e especial como está sendo.
Referências
MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Microbiologia médica. 6.
Ed. Elsevier, 948 p. 2010.
NATARO, J.P., KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol.
Rev. v.11, n° 1, p. 142-201, jan. 1998.
NATARO, J.P. Pathogenesis- Thoughts from the Front Line, Microbiology
Spectrum. p. 1-7.
SWEENEY, N.J; KLEMM, P; McCORMICK, B.A; MOLLER-NIELSEN, E;
UTLEY, M; SCHEMBRI, M.A; LAUX, D.C; COHEN, P.S. The Escherichia coli K12 gntP Gene Allows E. coli F-18 To Occupy a Distinct Nutritional Niche in the
Streptomycin-Treated Mouse Large Intestine, Infection and Immunity.
Estados Unidos, v.64, n° 9, p. 3497-3503, set. 1996.
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5. ed. São Paulo: Atheneu,
760 p. 2008.
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