ESTUDO DO PERFIL IMUNOHISTOPATOLÓGICO DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR DIFERENTES CEPAS DE Escherichia coli EM CAMUNDONGOS SWISS. Bruna Santos Marnieri, Telma Saraiva dos Santos, Tácito Graminha Campois, email: [email protected] Instituto Filadélfia de Londrina (UNIFIL) em parceria com a Universidade Estadual de Londrina. Área e subárea do conhecimento: Imunologia Aplicada/Histologia Palavras-chave: histopatológicas. Escherichia coli; infecção intraperitoneal; alterações Resumo A Escherichia coli é uma bactéria que possuem grande importância por englobar uma gama de patógenos isolados em humanos e animais, pois é uma bactéria que está presente em indivíduos sadios como microbiota normal, principalmente colonizando o intestino, porém quando ocorre uma queda da imunidade, ou até mesmo a irrupção da barreira gastrointestinal é capaz de provocar infecções, inclusive por cepas não virulentas. Existem variações de cepas desse tipo de bactéria, algumas síndromes podem acompanhar a infecção por E. coli com características diarreiogênicas ou comprometimento de outros órgãos, sendo evidenciados principalmente a colite hemorrágica e síndrome hemolítica-urêmica (E. coli Enterohemorragica – EHEC), invasão e destruição de células intestinais da mucosa intestinal (E. coli Enteroinvasiva – EIEC). O trabalho teve como objetivo abordar aspectos práticos e teóricos sobre o estudo de infecção intraperitoneal de camundongos fêmeas da espécie SWISS por 3 tipos de cepas diferentes da bactéria Escherichia coli, cepas de ATCC (cepa controle), EHEC e EIEC, em seguida após a infecção dos camundongos realizou o estudo sobre a mudança histopatológica dos tecidos de 4 órgãos escolhidos (baço, rim, intestino delgado e intestino grosso) para realizar o método de emblocamento em parafina, cortes e preparação de lâmina com material fixado e corado, sendo todos esses procedimentos submetidos ao comitê de ética. 1 Introdução A família Enterobacteriaceae é uma das mais importantes pois nela se incluem os principais agentes de infecção hospitalar e organismos responsáveis por causar infecção intestinal em vários países do mundo (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). A Escherichia coli (E. coli) é um importante e abundante membro da microbiota intestinal do ser humano e outros mamíferos, que coloniza a mucosa do cólon e convivem de maneira saudável e com mútuos benefícios durante muitos anos, porém, essas estirpes comensais podem causar doenças em hospedeiros imunodeprimidos ou com barreira gastrointestinal rompida (peritonite por exemplo) (SWEENEY et al., 1996). A EHEC se destaca por causar ampla doença no homem que compreende desde casos assintomáticos, diarreia branda até casos mais graves de colite hemorrágica que pode evoluir para complicações extraintestinais como a síndrome hemolítica urêmica, além de complicações como trombocitopenia trombótica (PTT) e anormalidades neurológica (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). A principal patologia causada por EHEC é a Sindrome Hemolítica Urêmica (SHU) que é um conjunto de três doenças; anemia hemolítica, plaquetopenia ou trombocitopenia e insuficiência renal. (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2010; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). A E. coli enteroinvasora (EIEC) é um importante causador de diarreia no homem, essas bactérias invadem as células do cólon do homem e provoca infecção semelhante a causada por Shigella sp. interagindo principalmente com a mucosa do cólon. EIEC e Shigella sp. podem não ser distinguidas por alguns testes bioquímicos, porém os fatores de virulência presentes são essenciais (KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004; NATARO, 1998; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Assim, mostrando a importância de descobrir quais mudanças estão ocorrendo nos tecidos dos órgãos que são possivelmente acometidos por essa bactéria, sendo então necessário a avaliação imunohistopatologica das lâminas para confirmação de alterações e recrutamento celular no tecido. Materiais e Métodos O estudo foi realizado nas instalações do Centro Universitário FiladélfiaUNIFIL, Londrina-PR, no laboratório de pesquisa do curso de Biomedicina e Laboratório de Anatomia Patológica do Hospital Veterinário do Centro Universitário Filadélfia. Foram utilizados 64 camundongos SWISS fêmeas com idade entre 8 e 10 semanas procedente do biotério da Universidade Estadual de Maringá. O uso dos animais obedecerá às normas estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e o protocolo de experimentação aprovado 2 pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal do Centro Universitário Filadélfia (Parecer número 001/2014). Cada grupo será realizado em quadruplicata, e repetido em dois experimentos independentes. As cepas utilizadas no experimento, EHEC, EIEC e ATCC, vieram do laboratório de microbiologia da Universidade Estadual de Londrina (UEL). As mesmas ficaram mantidas em meio de cultura Ágar Nutriente até serem utilizadas. Ambas as cepas deverão ser ajustadas no padrão de Mcfarland, obtendo o valor de 1x108. Porém para serem utilizadas, essas cepas terão que ser diluídas duas vezes em PBS até chegar ao valor de 1x10 6. Para a diluição foram utilizadas 100uL da bactéria (1x108) em 900uL de PBS, repetindo duas vezes até chegar ao valor desejado. O PBS utilizado para diluição é de 0,1 M (Sambrook et al, 1989). Após a obtenção da bactéria em 1x106, serão utilizados 500uL/ 1mL desta solução, para inoculação nos camundongos. Após essa inoculação a bactéria será diluída novamente, chegando à quantidade desejada 1x10 5. Uma suspensão contendo 1x105 de E. coli (EHEC, EIEC ou ATCC) foi inoculada intraperitonealmente em uma única dose nos grupos determinados (Figura 2). Após os períodos de zero (controle negativo), 30 minutos, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas da inoculação da E. coli, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. Após isso, com o auxílio de uma tesoura e de uma pinça foi realizado a abertura do peritônio dos animais. Com muito cuidado para não perfurar nenhum órgão ou vaso sanguíneo. Assim evitando a perda de algum órgão que foi retirado, os órgãos intraperitoneais retirados foram fígado, baço, rim e intestino será realizada baseada em escore de lesão adaptado de Gerez et al., (2015) no qual são considerados a frequência e severidade de cada alteração histológica, atribuindo valor 0: ausente, 1:discreta, 2:moderada e 3:severa. Após a retirada dos órgãos, cada camundongo obteve 4 frascos: 1 FRASCO: rim / baço / linfonodo; 2 FRASCO: 2 cortes do intestino; 3 FRASCO: 2 cortes do intestino;4 FRASCO: 1 corte do intestino. Assim esses fragmentos de órgão irão passar por serão fixados em solução de formalina 10% por 20 horas e então embebidas em parafina e cortes com 5 µm serão dispostos em lâminas e coradas com hematoxilina e eosina para análise histológica, a fim de estabelecer o tipo de infiltrado inflamatório predominante na lesão, e extensão de acometimento. Resultados e Discussão 3 O projeto está ainda em andamento, foram realizadas as primeiras partes do experimento, sendo estás: infecção dos camundongos por cepas de e.coli (EHEC, EIEC E ATCC), e a eutanásia dos animais e em seguida a retirada por órgãos escolhidos (rim, baço, linfonodo, intestino delgado, intestino grosso). Pois assim o projeto está na parte da confecção das laminas, para posteriormente leitura, avaliação das mudanças e realização das discussões. Conclusões Perante ao estágio que o trabalho está, não será possível realizar uma conclusão como um todo, apenas que os trabalhos realizados anteriormente no mesmo projeto mostraram que o sistema imunológico recruta células e citocinas para desencadear uma reação inflamatória no organismo para combater a bactéria. Por isso a necessidade de avaliar as mudanças imunohistopatologicas dos órgãos desses animais, para uma possível confirmação dos dados encontrados no outro trabalho. Agradecimentos A todos que tornaram esse projeto possível e especial como está sendo. Referências MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Microbiologia médica. 6. Ed. Elsevier, 948 p. 2010. NATARO, J.P., KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. v.11, n° 1, p. 142-201, jan. 1998. NATARO, J.P. Pathogenesis- Thoughts from the Front Line, Microbiology Spectrum. p. 1-7. SWEENEY, N.J; KLEMM, P; McCORMICK, B.A; MOLLER-NIELSEN, E; UTLEY, M; SCHEMBRI, M.A; LAUX, D.C; COHEN, P.S. The Escherichia coli K12 gntP Gene Allows E. coli F-18 To Occupy a Distinct Nutritional Niche in the Streptomycin-Treated Mouse Large Intestine, Infection and Immunity. Estados Unidos, v.64, n° 9, p. 3497-3503, set. 1996. TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5. ed. São Paulo: Atheneu, 760 p. 2008. 4