Álvaro Paulo da Silva Souza - Programa de Pós

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DE FÁRMACOS ANTI-HIPERTENSIVOS NA RESPOSTA
VASCULAR DA ANGIOTENSINA-(1-7) EM RATOS SUBMETIDOS À
SOBRECARGA PRESSÓRICA
ÁLVARO PAULO SILVA SOUZA
GOIÂNIA-GO
2014
i
ÁLVARO PAULO SILVA SOUZA
Avaliação de fármacos anti-hipertensivos na resposta vascular da
Angiotensina-(1-7) em ratos submetidos à sobrecarga pressórica
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Biologia do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Goiás para
obtenção do título de Mestre em
Biologia.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Henrique de Castro
Co-orientadora: Profª. Dra. Elizabeth Pereira Mendes
GOIÂNIA-GO
2014
ii
ÁLVARO PAULO SILVA SOUZA
Influência de fármacos anti-hipertensivos na resposta vascular da
Angiotensina-(1-7) em ratos submetidos à sobrecarga pressórica
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof. Dr. Paulo César Ghedini
Universidade Federal de Goiás
_____________________________________________
Prof. Dra. Luiza Antas Rabelo
Universidade Federal de Alagoas
_____________________________________________
Prof. Dra. Elizabeth Pereira Mendes
Co-Orientadora
Universidade Federal de Goiás
_____________________________________________
Prof. Dr. Carlos Henrique de Castro
Orientador
Universidade Federal de Goiás
Aprovada em: ____/____/________
iii
“A cada dia que vivo, mais me convenço de que o desperdício da vida está no amor que não
damos, nas forças que não usamos, na prudência egoísta que nada arrisca, e que,
esquivando-se do sofrimento, perdemos também a felicidade. A dor é inevitável. O
sofrimento é opcional.”
Carlos Drummond de Andrade
“Fácil é sonhar todas as noites. Difícil é lutar por um sonho.”
Carlos Drummond de Andrade
iv
Dedicatória
À Deus,
Por estar sempre ao meu lado, me dando sabedoria e abençoando minhas decisões.
Aos meus pais,
Por terem todo o cuidado e carinho na minha formação pessoal e intelectual. Apesar
de todas as dificuldades que passamos, através do amor, dignidade, humildade e
respeito, conquistamos juntos mais um degrau na minha vida.
Aos meus irmãos,
À minha irmã Ana Paula e meu irmão Adriano, que me acompanharam e me
apoiaram incondicionalmente desde o início da minha graduação. O carinho e
compreensão de vocês foram fundamentais para chegarmos juntos até aqui.
Ao meu tio e à minha tia, Sebastião e Cleide,
Pelo apoio incondicional na minha formação pessoal e profissional. Vocês foram
peças fundamentais pelo que sou hoje.
Aos meus primos,
Em especial quero agradecer a minha prima Dielly pelo apoio pessoal, por sempre
acreditar nos meus sonhos e objetivos, o apoio psicológico foi fundamental nesse
processo.
À minha namorada Márcia,
Apesar de ter acompanhado apenas o final desse processo na minha vida, você
conhece bem toda a história, seu amor, carinho e compreensão foram de grande
importância até aqui.
v
Agradecimentos
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, pela oportunidade de realizar esse
estudo, oferecendo todo suporte necessário.
Ao meu orientador, Professor Dr. Carlos Henrique de Castro, pela brilhante orientação e
ensino que me proporcionou durante estes anos, fundamentais à minha formação
acadêmica e profissional.
A minha co-orientadora, Professora Dra. Elizabeth Pereira Mendes, por sempre estar
disposta a ajudar, obrigada pelos conselhos, aprendizado e suporte na parte experimental.
Ao Professor Dr. Diego Basile Colugnati, pelas orientações paralelas, incentivo e suporte
nos experimentos realizados no Laboratório de Fisiologia de Órgãos Isolados.
Ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, na pessoa do
Professor Cirano José Ulhoa, atual diretor da instituição, por ter possibilitado a realização
deste trabalho.
Ao Professor Dr. Robson Augusto Souza dos Santos, da Universidade Federal de Minas
Gerais, pelo apoio e contribuição designados a este trabalho.
Aos colegas Larissa Matuda Macêdo e Allancer Divino de Carvalho Nunes, pelo auxílio com
os experimentos de registro de Pressão Arterial Média e coração isolado de ratos,
respectivamente.
Aos colegas Deny Bruce, Gisele Maria, Juliana Porto e Jonathas Almeida pela colaboração
e inicio de parte desse estudo.
Aos colegas que também trabalham com vaso isolado de ratos, e zelam pela qualidade de
bons experimentos.
A todos os professores e colegas de laboratório do Núcleo Integrado de Neurociência e
Fisiologia Cardiovascular/UFG, sem os quais não haveria trabalho em equipe e inúmeras
discussões sobre Fisiologia.
vi
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas e Símbolos ......................................................
viii
Lista de Figuras .................................................................................
x
Lista de Tabelas ...............................................................................
xii
Resumo .............................................................................................
xiii
Abstract .............................................................................................
xv
1
INTRODUÇÃO ...................................................................................
17
1.1
Sistema Renina Angiotensina ...........................................................
18
1.2
Angiotensina-(1-7) ............................................................................
20
1.3
Sistema Vascular ..............................................................................
22
1.4
Fármacos anti-hipertensivos .............................................................
27
2
OBJETIVOS .....................................................................................
32
2.1
Geral .................................................................................................
32
2.2
Específicos .......................................................................................
32
3
MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................
33
3.1
Animais .............................................................................................
33
3.2
Coarctação da aorta abdominal ........................................................
33
3.3
Tratamento dos Animais ...................................................................
33
3.4
Registro da Pressão Arterial .............................................................
34
3.5
Reatividade Vascular ........................................................................
34
3.5.1 Protocolo Experimental .....................................................................
36
3.6
Análise Estatística ............................................................................
37
4
RESULTADOS .................................................................................
38
4.1
Avaliação da Pressão Arterial ..........................................................
38
4.2
Avaliação do bloqueio do receptor AT1 nos efeitos da Ang (1-7) em
anéis de aorta isolados de ratos submetidos a sobrecarga
pressórica............................................................................................
39
4.2.1 Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada
de ratos CoA tratados com Losartan in vivo.....................................
4.3
40
Influência do Inibidor da ECA nos efeitos da Ang (1-7) em anéis
de aorta isolados de ratos submetidos a sobrecarga pressórica........
42
vii
4.3.1 Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada
de ratos CoA tratados com Captopril in vivo ....................................
4.4
42
Influência do bloqueador de canal de cálcio, Anlodipino, nos efeitos
da Ang (1-7) em anéis de aorta isolados de ratos submetidos à
sobrecarga pressórica .......................................................................
44
4.4.1 Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada
de ratos CoA tratados com Anlodipino in vivo..................................
4.5
44
Influência do possível ativador da ECA 2, DIZE, nos efeitos da Ang
(1-7) em anéis de aorta isolados de ratos submetidos à sobrecarga
pressórica............................................................................................
47
4.5.1 Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada
de ratos CoA tratados com DIZE in vivo ...........................................
4.6
47
Envolvimento do receptor AT1 in vitro nos efeitos da Ang (1-7) em
anéis de aorta isolados de ratos submetidos à sobrecarga
pressórica ..........................................................................................
4.7
48
Influência do Inibidor da ECA, captopril, in vitro nos efeitos da Ang
(1-7) em anéis de aorta isolados de ratos submetidos à sobrecarga
pressórica .........................................................................................
4.8
50
Influência do bloqueador de canal de cálcio, Anlodipino, nos efeitos
da Ang (1-7) em anéis de aorta isolados de ratos submetidos à
sobrecarga pressórica ......................................................................
51
5
DISCUSSÃO ......................................................................................
52
6
CONCLUSÕES .................................................................................
57
7
REFERÊNCIAS .................................................................................
59
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
A-779, D-Alanine-Ang-(1-7)
ACh, Acetilcolina
AKT ou PKB, Proteína Quinase B
Ang I, Angiotensina I
Ang II, Angiotensina II
Ang III, Angiotensina III
Ang IV, Angiotensina IV
Ang-(2-8), Angiotensina –(2-8)
Ang-(1-7), Angiotensina-(1-7)
Ang-(1-9), Angiotensina-(1-9)
Anlo, Anlodipino
APA, Aminopeptidase
AT1, Receptor de Angiotensina II Tipo 1
AT2, Receptor de Angiotensina II Tipo 2
BCC, Bloqueador de Canal de Cálcio
BH4, Tetrahidrobiopterina
ARA,Antagonista de Receptor de Angiotensina I
Cap, Captopril
CoA, Coarctado
DAG, Diacilglicerol
DAP, Dipeptidil-Aminopeptidase
DIZE, Aceturato de Diminazeno
DVC, Doença Cardiovascular
ECA, Enzima Conversora de Angiotensina
ECA 2, Enzima Conversora de Angiotensina 2
EDCF’s, Endothelium-derived contracting factors
EDFH, Fator Hiperpolarizante derivado do endotélio
EDRF’s, Endothelium-derived relaxing factors
eNOS, Óxido Nítrico Sintase endotelial
ET, Endotelina
GC, Guanilato Ciclase
ix
GMPc, Monofosfato Cíclico de Guanosina
GPCRs, Receptores Acoplados a Proteína G
Hemo, Ferro protoporfirinaIX
iECA, inibidor da Enzima Conversora de Angiotensina
IP3, Trifosfato de Inositol
HAS, Hipertensão Arterial Sistêmica
Los, Losartan
NADPH, Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Reduzida
NEP, Endopeptidase Neutra ou Neprilisina
NPS, Nitroprussiato de sódio
PAM, Pressão Arterial Média
PCP, Prolil-carboxipeptidases
PEP, Proplil-endopeptidase
PGI2, Prostaciclina
Phe, Fenilefrina
PKG, Proteína Quinase G
SRA, Sistema Renina-Angiotensina
TXA2, Tromboxano A2
x
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 -Taxas de mortalidade por DCV e suas diferentes causas no Brasil.
Figura 2 - Ilustração do sistema renina-angiotensina mostrando as vias de formação
das angiotensinas e seus receptores.
Figura 3 -Ilustração mostrando a estrutura da parede arterial.
Figura 4 – Esquema representando a reação catalisada geral e co-fatores de NOS.
Figura 5 -Ilustração representando a via de formação do NO e seus alvos
intracelulares.
Figura 6 -Ilustração do Sistema Renina-Angiotensina mostrando pontos de
regulagem onde há um aumento ou bloqueio de atividade enzimática e bloqueio de
receptores.
Figura 7 - Diagrama esquemático de uma preparação de anel de aorta de ratos em
banho de órgãos isolados.
Figura 8 - Ilustração representativa do protocolo experimental de anéis de aorta de
ratos submetidos ao tratamento crônico ou agudo.
Figura 9 - Efeito do tratamento crônico com losartan 1 mg/kg/dia (A) ou 5 mg/kg/dia
(B) na resposta vasorrelaxante da ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
Figura 10 - Curva concentração-resposta de Ach e NPS em anéis de aorta de ratos.
(A) Efeito vasorrelaxante da ACh no tratamento in vivo 1mg/kg/dia e (B) 5mg/kg/dia
por 21 dias com losartan. Efeito vasorrelaxante do NPS no tratamento in vivo de
1mg/kg/dia (C) e 5mg/kg/dia (D) por 21 dias com losartan.
Figura 11 - Efeitos do Captopril na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7). (A) Efeito
do tratamento crônico com captopril (1 mg/kg/dia) ou (B) (5 mg/kg/dia) na resposta
vasorrelaxante da ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
Figura 12 - Efeitos do Captopril na resposta vasorrelaxante da ACh (A) Efeito do
tratamento in vivo com captopril 1mg/kg/dia ou (B) 5mg/kg/dia em anéis de aorta de
ratos CoA. (C) Efeito vasorrelaxante do NPS em anéis de aorta de ratos CoA
tratados in vivo com captopril 5mg/kg/dia.
Figura 13 - Efeitos do Anlodipino na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7). (A) Efeito
do tratamento crônico com Anlodipino (1 mg/kg/ dia) na resposta vasorrelaxante da
ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA. (B) Efeitos do tratamento com Anlodipino
5mg/kg/dia na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
xi
Figura 14 -Efeitos do Anlodipino na resposta vasorrelaxante da ACh e NPS.(A)
Efeito do tratamento in vivo com anlodipino 1mg/kg/dia (B) 5mg/kg/dia em anéis de
aorta de ratos CoA. (C) Efeito vasorrelaxante do NPS em anéis de aorta de ratos
CoA tratados in vivo com anlodipino 1mg/kg/dia e (D) 5mg/kg/dia.
Figura 15 - Efeitos do DIZE na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7). (A) Efeito do
tratamento crônico com DIZE (1 mg/kg/dia) ou (B) (5 mg/kg/dia) na resposta
vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
Figura 16 - Efeitos do DIZE na resposta vasorrelaxante da ACh. (A) Efeito do
tratamento in vivo com DIZE 5mg/kg/dia em anéis de aorta de ratos CoA. (B) Efeito
vasorrelaxante do NPS em anéis de aorta de ratos CoA tratados in vivo com DIZE
5mg/kg/dia.
Figura 17- Efeitos do pré-tratamento (10 min) com losartan (10 -6 mol / L).(A) sozinho
ou em associação com (B), A-779 (10-6 mol / l) ou (C) com L-NAME (10-6 mol / L) na
resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
Figura 18- Efeitos do captopril na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7). (A) Efeitos
do pré-tratamento (10 min) com captopril (10 -6 mol / L) na resposta vasorrelaxante da
Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
Figura 19- Efeitos do Anlodipino na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7).
(A)
Efeitos do pré-tratamento (10 min) com Anlodipino (10 -6 mol / L) na resposta
vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classes de anti-hipertensivos disponíveis para uso clínico.
Tabela 2 - Composição da solução de Krebs-Hanseleit.
Tabela 3 - Valores de Pressão Arterial Média de animais Sham e CoA tratados com
veículo, losartan, captopril, anlodipino e DIZE 1 e 5 mg/kg/dia.
xiii
RESUMO
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2013), as doenças cardiovasculares
(DCV) são as maiores causas de morte no mundo, sendo a Hipertensão Arterial um
dos principais fatores de risco. O Sistema Renina-Angiotensina (SRA) é um sistema
fundamental
para
a
regulação
das
funções
cardiovasculares.
Dentre
os
componentes do SRA, podemos destacar a Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)]. Sabe-se
que o efeito vasodilatador da Ang-(1-7) é dependente do endotélio. A hipertensão
arterial acarreta conseqüências sobre a estrutura vascular, de forma especial no
endotélio, acarretando a disfunção endotelial, nesta condição o efeito vasodilatador
da Ang-(1-7) fica prejudicado. No entanto, tem sido demonstrado que algumas
classes de anti-hipertensivos (BRA, iECA e BCC) são importantes na melhora da
função endotelial. Porém, ainda não se sabe se estes fármacos podem melhorar o
efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) em condições de sobrecarga pressórica. Como
diversos trabalhos tem apontado a Ang-(1-7)/ Receptor Mas como um potencial
terapêutico para as doenças cardiovasculares, é de grande importância um melhor
conhecimento sobre a influência de fármacos anti-hipertensivos nos efeitos
vasculares da Ang-(1-7). Desta forma, a proposta do trabalho foi avaliar a influência
de fármacos anti-hipertensivos nos efeitos vasculares da Angiotensina-(1-7) em
ratos submetidos à sobrecarga pressórica. Para isto, ratos Wistar foram submetidos
à coarctação da aorta abdominal (CoA). Como controles, foram utilizados animais
onde foi realizado o procedimento cirúrgico fictício (Sham). Decorridos 21 dias da
coarctação, a pressão arterial (PA) foi registrada pela canulação da artéria carótida.
Posteriormente, o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) foi avaliado em anéis de ratos
CoAcom ou sem o pré-tratamento agudo (in vitro) de losartan 1 µmol/L, captopril 1
µmol/L ou anlodipino 1 µmol/L. Para avaliar o efeito do tratamento crônico (in vivo),
os animais receberam os seguintes tratamentos: losartan 1 ou 5 mg/kg/dia, captopril
1 ou 5 mg/kg/dia, anlodipino 1 ou 5 mg/kg/dia ou DIZE 1 ou 5 mg/kg/dia.Ao final do
tratamento, os anéis de aorta de ratos foram isolados para a realização da curva de
Ang-(1-7). Os animais CoA apresentaram aumento da PA e nenhum dos tratamentos
foi capaz de reduzir a pressão arterial. A sobrecarga pressórica diminuiu o
relaxamento induzido por Ang-(1-7) nos anéis de aorta isolados. O pré-tratamento in
vitro com losartan, captopril ou anlodipino restaurou o efeito vasorrelaxante
promovido por Ang-(1-7). Entretanto, em anéis de aorta de ratos CoA pré-tratados “in
xiv
vitro” com losartan e A-779 ou losartan e L-NAME, tiveram o vasorrelaxamento
promovido por Ang-(1-7) abolido. Já o tratamento in vivo nos animais CoA com
losartan 1 mg/kg/dia, captopril 1 mg/kg/dia, anlodipino 1 mg/kg/dia ou DIZE 1 e 5
mg/kg/dia não foram efetivos em melhorar o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7). No
entanto, o tratamento com losartan 5 mg/kg/dia, captopril 5 mg/kg/dia ou anlodipino
5 mg/kg/dia melhorou a resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7) em animais CoA.
Estes resultados demonstram que o tratamento in vitro ou in vivo com alguns antihipertensivos (losartan, captopril ou anlodipino) foi capaz de
melhorar o
vasorrelaxamento promovido por Ang-(1-7) em aorta de animais submetidos à
sobrecarga pressórica por mecanismos independentes da pressão arterial. Portanto,
a utilização de Ang-(1-7) associada a doses sub-pressóricas de fármacos antihipertensivos pode ser uma nova ferramenta terapêutica para o tratamento da
hipertensão arterial.
Palavras-Chave: Hipertensão Arterial, Sistema Renina-Angiotensina, Angiotensina(1-7), Sistema Vascular, Fármacos anti-hipertensivos
xv
ABSTRACT
According to the World Health Organization (2013), cardiovascular diseases (CVD)
are the major causes of death worldwide. High blood pressure is the main risk factors
for these diseases. The Renin-angiotensin System (RAS) is a important regulator of
the cardiovascular functions. Among the components of the RAS, we can highlight
the Angiotensin-(1-7) [Ang (1-7)]. It is known that the vasodilator effect of Ang-(1-7) is
endothelium-dependent. Hypertension cause changes in the vascular structure and
function, especially in the endothelium cells, leading to endothelial dysfunction and,
consequently, impairment in the vasodilator effect of Ang (1-7). However, it has been
shown that some classes of antihypertensive drugs (Angiotensin II receptor blockers,
angiotensin-converting enzyme inhibitors and Calcium channel blocker) improve the
endothelial function. However, it is unknown if these drugs are able to improve the
vasorelaxant effect of Ang-(1-7) in pressure-overload condition. Since several studies
have pointed to Ang-(1-7)/Mas axis as a therapeutic potential for cardiovascular
disease, is very important to understand the influence of the antihypertensive drugs
on the vascular effects of Ang-(1-7). Thus, the purpose of this study was to evaluate
the influence of antihypertensive drugs on the vascular effects of Angiotensin-(1-7) in
pressure-overload rats. Wistar rats were submitted to abdominal aorta coarctation
(ACo). Sham surgery was performed in the controls group. After 21 days of
coarctation, blood pressure (BP) was recorded by carotid artery catheterization.
Subsequently, the vasorelaxant effect of Ang-(1-7) were evaluated in aortic rings with
or without acute pre-treatment (in vitro) of losartan 1 µmol/L, captopril 1 µmol/L or
amlodipine 1 µmol/L. To evaluate the effect of chronic treatment (in vivo), the
ACoanimals received the following treatments after surgery procedure: losartan 1 or
5 mg/kg/day, captopril 1 or 5 mg/kg/day, amlodipine 1 or 5 mg/kg/day, or DIZE 1 or 5
mg/kg/day. At the end of treatment, the aortic rings were isolated and the
vasorrelaxant effect of Ang-(1-7) was evaluated. The increase of the BP was
confirmed in the ACo rats. None of the treatment was able to reduce the blood
pressure in ACo rats. Pressure overload decreased the relaxation induced by Ang
(1-7) in isolated aortic rings. The in vitro pretreatment with losartan, captopril or
amlodipine restored the vasorelaxant effect promoted by Ang-(1-7). A-779 or LNAME blunted the vasorelaxant effect of Ang-(1-7) in aortic rings from CoA rats in
xvi
presence of losartan. The in vivo treatment with losartan 1 mg/kg/day, captopril 1
mg/kg/day, amlodipine 1 mg/kg/day or DIZE 1 and 5 mg/kg/day was not effective in
improving the vasorelaxant effect of Ang (1-7) in CoA aortic rings. However, losartan
5 mg/kg/day, captopril 5 mg/kg/day or amlodipine 5 mg/kg/day improved the
vasorelaxant effect of Ang-(1-7) in aortic rings from CoA rats. These results
demonstrate that treatment in vitro or in vivowith some antihypertensive drugs
(losartan,captopril and amlodipine) was able to improve the vasorelaxation effect of
Ang (1-7) in the aorta from pressure-overloaded animals through mechanisms
independent of blood pressure reduction. Therefore, the use of Ang-(1-7) associated
with sub-pressor doses of antihypertensive agents may be a new therapeutic tool for
the hypertension treatment.
Keywords: Hypertension, Renin-Angiotensin System, Angiotensin- (1-7), Vascular
System, antihypertensive drugs
17
1- INTRODUÇÃO
Segundo
a
Organização
Mundial
de
Saúde
(2013),
as
doenças
cardiovasculares (DCV) são as maiores causas de morte no mundo, sendo
responsáveis por um terço de todas as mortes (W.H.O, 2013). Apesar dos grandes
avanços da medicina nos últimos anos, com novas intervenções cirúrgicas e
farmacológicas estarem reduzindo as taxas de morte por DCV, estas continuam a
ser um importante problema de saúde pública (1). Neste cenário um dos principais
fatores de risco para as DCV é a hipertensão arterial sistêmica (HAS).
A HAS é uma condição clínica multifatorial caracterizada por níveis elevados
e sustentados da pressão arterial. Na maioria dos casos é assintomática, sendo
freqüentemente associada às alterações funcionais e/ou estruturais de órgãos-alvos
(coração, encéfalo, rins e vasos sanguíneos) aumentando assim o risco de eventos
cardiovasculares (2). No Brasil, a prevalência da HAS é acima de 30%, sendo que
em homens chega a aproximadamente 36%, enquanto que em mulheres fica
próximo de 30%. Além disso, a HAS representa 12,8% da taxa de mortalidade de
todas as DCV no Brasil (3) (Figura 1).
O principal objetivo da terapia farmacológica anti-hipertensiva é diminuir os
riscos associados à pressão arterial, sem afetar a qualidade de vida do paciente. A
escolha da terapia é baseada na eficácia da redução da pressão arterial e outros
riscos cardiovasculares. No entanto, uma das dificuldades em se normalizar
rapidamente a pressão arterial é que a monoterapia muitas vezes é insuficiente.
Vários estudos têm mostrado que dois ou mais agentes anti-hipertensivos são
necessários para atingir o objetivo do tratamento em pacientes hipertensos (4,5).
Existem várias classes de fármacos utilizados no tratamento da hipertensão, tais
como os diuréticos, β-bloqueadores, inibidores da enzima conversora de
angiotensina
(iECA),
antagonista
de
receptor
de
angiotensina
II
(ARAII),
bloqueadores de canais para cálcio (BCC), bloqueadores α-adrenérgicos e inibidor
de renina.Dentre estes, destacam-se os moduladores da atividade do Sistema
Renina Angiotensina (SRA).Os inibidores da ECA e ARA II são efetivos, bem
tolerados e utilizados em larga escala para o tratamento da HAS. Além destes
fármacos já amplamente utilizados na clínica,alguns estudos têm mostrado que a
18
ativação
do
eixo
ECA2/Angiotensina-(1-7)/Mas
apresenta
grande
potencial
terapêutico para o tratamento da hipertensão (6–8).
Figura 1. Taxas de mortalidade por DCV e suas diferentes causas no Brasil.AVE - Acidente Vascular
Encefálico; DIC - Doença Isquêmica do Coração; HAS - Hipertensão Arterial Sistêmica. [Fonte: VI
diretriz de hipertensão, 2010 (3)]
1.1 – Sistema Renina Angiotensina
O Sistema Renina Angiotensina (SRA) é um dos principais reguladores
fisiológicos da pressão arterial e equilíbrio hidroeletrolítico (9). Além disso, o
desequilíbrio neste sistema está relacionado a diversas doenças cardiovasculares
(10).
Os primeiros estudos sobre o SRA foram realizados por Robert Tigerstedt e
seu orientando Per Bergman em 1896, onde observaram que extrato de rim de
coelho,administrados
por
via
intravenosa
aumentava
a
pressão
arterial.
Posteriormente, mostrou-se que o efeito pressor do extrato renal foi devido a uma
substância protéica a qual nomearam de Renina (apud, 10). Em 1956 descobriu-se
que o produto da ação da renina era um decapeptídeo.No entanto, estudos
posteriores mostraram que a substância ativa era um octapeptídeo, a angiotensina II
(11,12). Mais tarde, no final dos anos 80,T. Goodfriend e colaboradores descreveram
os receptores para Ang II, AT1 e AT2. Entretanto, as pesquisas sobre os receptores
de Ang II ganharam impacto com o desenvolvimento de antagonistas específicos. O
19
grupo de Timmerman produziu um antagonista específico para o receptor AT1
(Losartan) e o grupo de Parke-Davis produziu um antagonista específico para
receptor AT2 (PD123177 e PD123319)(13).
A ativação do SRA ocorre principalmente pela atividade da enzima
renina.Esta enzima é uma aspartil protease,armazenada e secretada por células
justaglomerulares da arteríola glomerular aferente. A forma ativa da renina é uma
glicoproteina com 340 aminoácidos. A secreção desta enzima é estimulada por
queda da pressão de perfusão renal, diminuição da concentração de sódio nos
túbulos distais do néfron e por excitação do nervo simpático renal via estimulação αadrenérgica nas células justaglomerulares(14). A renina apresenta grande ação
catalítica sobre o Angiotensinogênio, uma α2-globulina com 452 aminoácidos (15),
considerado
o
único
precursor
dos
peptídeos
angiotensinérgicos.
O
Angiotensinogênio é secretado principalmente pelo fígado, embora possa ser
sintetizado e secretado em baixas concentrações por outros tecidos como coração,
vasculatura e rim(14). A clivagem do Angiotensinogênio pela renina produz a Ang I.
A Ang I, por sua vez, é clivada em Ang II pela ECA, uma enzima contendo 1278
aminoácidos em sua estrutura. Esta cliva subunidades dipeptídicas de várias
seqüências protéicas (15,16). Outras enzimas também podem promover a formação
de Ang II a partir da Ang I ou do Angiotensinogênio, como a quimase, a tonina,
catepsina A e a catepsina G(Figura 2) (16–18).
A Ang II, um dos principais peptídeos biologicamente ativos do SRA, exerce
seus efeitos se ligando aos receptores AT 1 e AT2(19,20). Seus principais efeitos são
mediados pelo receptor AT1, incluindo vasoconstrição, aumento do stress oxidativo,
mudança na sensibilização do cálcio citosólico, proliferação celular,síntese e
secreção de Aldosterona e reabsorção tubular de sódio (20). Por outro lado, a
ativação do receptor AT2 promove, dentre outros efeitos, inibição da proliferação
celular, apoptose e vasodilatação (21).Em condições patológicas, a hiper-ativação
do receptor AT1 pode induzir diversos efeitos deletérios no Sistema Cardiovascular,
como a vasoconstrição sistêmica, disfunção endotelial, fibrose e hipertrofia cardíaca
(16,22).Também foram identificadas importantes ações periféricas e centrais
induzidas por peptídeos menores, antes considerados fragmentos inativos como a
Ang III, a Ang IV e principalmente a Ang-(1-7) (23–25).
20
1.2-Angiotensina-(1-7)
A Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], um heptapeptídeo com ausência da
fenilalanina na posição 8 do peptídeo Ang II, é considerada um importante
componente ativo do SRA. Ele pode ser gerado a partir da Ang I por via
independente da ECA (9)ou, principalmente, pela clivagem da Ang II por ação da
enzima conversora da angiotensina 2 (ECA2) (26).
Os primeiros estudos sobre Ang-(1-7) ocorreram na década de 80. Santos et
al. (1988), utilizando homogenato de cérebro de cães, avaliaram a atividade da ECA
e a presença de subprodutos da Angiotensina I. Foi observado que a Ang I
radiomarcada era hidrolisada em Ang-(1-8), Ang-(2-8) e Ang-(1-7) e a hidrólise de
Ang II radiomarcada produzia, principalmente, Ang-(1-7). Além disso, demonstrou-se
um acúmulo rápido do heptapeptídeo, tanto antes quanto após o bloqueio da
atividade da ECA, o que sugeriu a existência de rotas alternativas independentes de
Ang II para produção de Ang-(1-7). Essas rotas alternativas podem incluir
carboxipeptidases e prolyl-endopeptidases.No mesmo ano, Schiavone et al. (1988)
publicaram o primeiro relato de uma ação biológica de Ang-(1-7) in vitro. Um ano
depois, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência extraiu-se angiotensinas do
cérebro, glândula supra-renal e plasma de ratos, registrando pela primeira vez, a
presença da Ang-(1-7) no sistema central e periférico (28).Sugeriu-se, assim, que a
Ang-(1-7) seria um novo membro ativo e não mais um simples metabólito do SRA.
Complementando
esses
estudos,
Campagnole-Santos
et
al.,
(1989)
descreveram a primeira ação in vivo de Ang-(1-7), neste trabalho pioneiro observouse uma queda da pressão arterial quando a Ang-(1-7) foi microinjetada na medula
dorsal e no núcleo do trato solitário (NTS) de ratos anestesiados.
Posteriormente, estudos de Jaiswal et al. (1992) mostraram que a Ang-(1-7)
foi capaz de liberar prostaglandinas de células endoteliais e/ou células do músculo
liso de aorta de porco. Além disso, observou-se que Ang-(1-7) liberava as
prostaglandinas na presença de antagonistas específicos para os receptores AT1 e
AT2, gerando assim, os primeiros indícios de que Ang-(1-7) apresentava um receptor
específico.
21
Figura 2. Ilustração esquemática do Sistema renina-angiotensina mostrando as vias de formação das
angiotensinas e seus receptores.ECAEnzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima
Conversora de Angiotensina 2; NEP, Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PEP,
Prolilendopeptidase, APA, Aminopeptidase A; APN, Aminopeptidase N;AT, Receptor para a
Angiotensina.[Adaptado de FERREIRA et al., 2012 (15), LAUTNER et al., 2013 (17)].
Isto foi confirmado por Santos et al. (2003), que descreveram o proto oncogen
e Mas como sendo o receptor para Ang-(1-7).Utilizando-se aorta de camundongos
deficientes de receptor Mas observou-se que a resposta vasorrelaxante induzida
pela Ang-(1-7) foi ausente. Além disso, utilizando-se Ang-(1-7) radiomarcada em rins
de ratos foi demonstrou-se que a mesma se liga ao receptor Mas, membro da família
de receptores acoplados à proteína G (31).
22
A principal via de formação de Ang-(1-7) foi descrita por dois grupos distintos
no ano de 2000, quando foi identificada a ECA2. Esta apresenta 42% de homologia
com a ECA. Estudos de imuno-histoquímica mostraram que ECA2 é encontrada
predominante no endotélio dos vasos coronários e intra-renal e no epitélio tubular
renal. Esta enzima é capaz de hidrolisar a leucina de Ang I para gerar Ang-(1-9), a
qual é convertida em peptídeos menores incluindo a Ang-(1-7) por ação da ECA
(32,33). Porém, o principal papel da ECA2 está relacionado com a clivagem da Ang
II, pois sua afinidade catalítica é 400 vezes maior do que para Ang I (26,34)
Através de vários estudos, observa-seque o coração e os vasos sanguíneos
são os principais alvos de atuação da Ang-(1-7) (35,36). A Ang-(1-7), via receptor
Mas, promove diversos efeitos opostos aos induzidos pela Ang II, como
vasodilatação, anti-fibrótico e anti-hipertróficos (1,22).
O efeito vasodilatador da Ang-(1-7) já foi descrito em vários leitos vasculares,
incluindo arteríolas aferentes renais de coelhos (37), artérias cerebrais de cães (38),
artérias coronárias de suínos (39), anéis de aorta de ratos (40,41)e camundongos
(42–44).Castro et al., (2005) demonstraram o efeito vasodilatador coronariano da
Ang-(1-7) em corações isolados de camundongos pré-perfundidos com antagonista
do receptor AT1, losartan.Esse efeito foi ausente em camundongos “knockout” para o
receptor Mas.É importante ressaltar que o efeito vasodilatador de Ang-(1-7) é
dependente do endotélio (42).
1.3-Sistema Vascular
A parede arterial é composta por três componentes concêntricos distintos a
partir da luz vascular: a íntima, a média e a adventícia (Figura 3). A íntima é a
camada mais interna do vaso, sendo formada principalmente por células endoteliais
que cobrem a superfície interna da parede formando um leito contínuo em contato
com o sangue. A média contém exclusivamente células do tipo muscular lisa e os
constituintes extracelulares: fibras elásticas, fibrilas de elastina, fibrilas de colágeno e
proteoglicanos. E a adventícia é composta por tecido conjuntivo e fibras colágenas
tipo I. Podem-se distinguir dois tipos de artérias, de acordo com a arquitetura da
média: as elásticas, em que há predomínio de material elástico, como a aorta, o
23
tronco braquiocefálico e a carótida. O outro tipo são as musculares onde se observa
o predomínio de células musculares lisas, tais como braquial, femoral e radial (45).
Dentre estas camadas, o endotélio exerce grande importância nas funções
vasculares. O conhecimento sobre a função endotelial vascular mudou muito a partir
da década de 80, quando Furchgott e Zawadzki,1980 (45),demonstraram que a
célula endotelial modula o tônus vascular. Em seu trabalho foi demonstrado que o
relaxamento de anéis isolados de aorta torácica de coelho e outros vasos
sanguíneos induzido por acetilcolina (ACh)requeria células endoteliais íntegras.
Além disso, observou-se que a ACh, via receptores muscarínicos, estimulava a
liberação de substâncias que provocavam o relaxamento do músculo liso vascular,
sendo este efeito um dos principais mecanismos na vasodilatação induzida por
ACh in vitro (46). Portanto, o endotélio contribui para a regulação do tônus vascular
por liberar vasodilatadores como as prostaciclinas e o fator relaxante derivado do
endotélio (47)
Sendo o endotélio a camada de células que reveste a parede interna dos
vasos sanguíneos, ele ocupa uma localização estratégica entre a circulação e os
tecidos. Assim, as células endoteliais são capazes de perceber mudanças nas forças
hemodinâmicas (pressão de pulso, estresse de estiramento) e responder a
mediadores produzidos localmente ou circulantes (48,49).
O endotélio libera um grande número de substâncias vasodilatadoras
e vasoconstritoras. Dessa forma o tônus vascular é mantido por um equilíbrio entre
essas substâncias. As células endoteliais produzem Fatores Contráteis Derivados do
Endotélio, do inglês “Endothelium-derived Contracting Factors (EDCFs)” como a
Endotelina (ET) e Tromboxano A2 (TXA2) além de mediadores circulantes que
atuam no sistema vascular e promovem o aumento no cálcio intracelular mediando à
contração do músculo liso. O relaxamento dependente do endotélio também ocorre
em resposta a diferentes substâncias, conhecidas como Fatores Relaxantes
Derivados do Endotélio, do inglês “Endothelium-derived Relaxing Factors (EDRFs)”
(50). Dentre estes se destacam o Óxido Nítrico (.NO) (51,52), Prostaciclina (PGI2)
(53) e Fator Hiperpolarizante Derivado do Endotélio (EDFH) (54,55). Estes fatores
relaxantes induzem vasodilatação por diminuição da concentração de cálcio
intracelular nas células do músculo liso vascular.
24
Uma das mais importantes moléculas de sinalização responsável pela
modulação do tônus vascular é o.NO(56).Essa molécula é sintetizada a partir do
aminoácido L-arginina por ação de uma família de enzimas denominadas sintase de
óxido nítrico (NOS) (57,58). A presença de cofatores como tetrahidrobiopterina
(BH4), FAD, FMN e ferro protoporfirina IX (Hemo) são essenciais para atividade das
isoformas da NOS.
Figura 3. Ilustração mostrando a estruturada parede arterial de aorta torácica. A partir da luz do vaso
encontra-se a túnica íntima, túnica média e túnica adventícia respectivamente. (Adaptado de
http://www.s-cool.co.uk/a-level/biology/transport/revise-it/transport-in-mammals)
Três isoformas da enzima NOS foram descobertos e clonados: uma isoforma
constitutiva neuronal ( nNOS ); uma isoforma induzível (iNOS ), presente em várias
células; e uma isoforma endotelial ( eNOS ). A importância das diferentes isoformas
está bem demonstrado em modelos animais e em humanos demonstrando a
importância destas enzimas (59) .
A isoforma eNOS depende de cofatores que catalisam a reação de L-arginina,
NADPH e oxigênio para o radical livre .NO, L-citrulina e NADP+. Os elétrons são
25
doados pelo NADPH para o domínio da redutase da enzima e prosseguem através
do FAD e FMN, então eles interagem com o grupo Hemo e BH4 no local ativo para
catalisar a reação do oxigênio com L-arginina via isoforma do óxido nítrico sintase
endotelial (eNOS), gerando L-citrulina e .NO como produtos (Figura 4)(60). Além
disso, a NOS na presença desses cofatores, promove um aumento rápido de sua
atividade em resposta a ativação de receptores por substâncias vasoativas como a
acetilcolina (ACh). Após a interação dos agonistas a seus receptores acoplados a
proteína G, ocorre ativação da fosfolipase C que degrada o fosfolipídio de
membrana fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2)formando principalmente diacilglicerol
(DAG) e trifosfato de inositol (IP3). Estes têm função de aumentar a concentração
intracelular de Ca2+, favorecendo a interação Ca2+-Calmodulina estimulando a NOS
a produzir.NO(61).
Figura 4. Esquema representando a reação catalisada geral e co-fatores de NOS.Elétrons (e-) são
doados por NADPH para o domínio redutase da enzima e prosseguem via FAD e FMN até o domínio
oxigenase. Lá eles interagem com o ferro heme e BH4 no local ativo para catalisar a reação do
oxigênio com a L-arginina, gerando L-citrulina e NO como produtos [Adaptado de ALDERTON et al.,
2001(57)].
Os efeitos vasodilatadores nitrosos são mediados pelo aumento dos níveis
intracelulares de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) devido a ativação da
Guanilato Ciclase solúvel (GCs) um heterodímero que contém o grupo heme e
sintetiza o GMPc(58). Uma vez sintetizado, o .NO é difundido das células endoteliais
26
para o músculo liso vascular e ativa a GCs. A atividade basal da GC é extremamente
baixa, mas quando o.NO se liga à porção heme, a atividade aumenta acima de 400
vezes (62).
O aumento da concentração intracelular de GMPc aumenta a atividade de
proteínas quinases (PKGs) dependentes de GMPc. PKGs em seguida, promovem a
fosforilação de outras importantes proteínas (fosfolambam, 1,4,5 trifosfato de inositol
(IP3) e canal para K+cálcio-dependente), resultando em uma diminuição da
concentração de Ca2+ intracelular e conseqüentemente vasodilatação (Figura 5)
(63). Além do efeito vasodilatador, .NO também inibe a proliferação de células
musculares lisas, migração e adesão de leucócitos ao endotélio e agregação de
plaquetas (56).
Algumas condições patológicas como lesão vascular, doenças metabólicas,
deficiências de substrato essencial (L -arginina) e cofatores (por exemplo, tetrahidrobiopterina) contribuem para a diminuição da biodisponibilidade da eNOS
levando portanto, a um prejuízo na função do endotélio vascular (64). Além disso,
a hipertensão arterial, juntamente com outros fatores de risco cardiovasculares,
compromete a função endotelial e diminui a liberação de .NO por vários mecanismos
que afetam sua síntese (65).
A disfunçãoendotelial é definida como uma diminuição da resposta
vasodilatadora dependente do endotélio e está relacionadaprincipalmente, com a
diminuição da disponibilidade de .NO, uma vez que, sua liberação ocorre pelas
células endoteliais (10).O endotélio vascular tem uma estreita ligação com o
SRA.Estudos prévios mostraram que esta camada vascular é um dos principais
locais de produção (66)e metabolismo (67) da Ang-(1-7), além de expressar também
a ECA2 e receptor Mas(68,69). Os efeitos vasodilatadores da Ang-(1-7) são
dependentes do endotélio, sendo mediados através da produção de vasodilatadores,
como Prostanóides, .NO e Fator Hiperpolarizante Derivado do Endotélio (31,69,70).
Em curto prazo, a infusão de Ang-(1-7) melhora a função endotelial por um
mecanismo que também envolve a liberação de NO(71). Por outro lado, demonstrouse que a deleção genética do receptor Mas resultou em disfunção endotelial
associada a um desequilíbrio entre o estresse oxidativo e a liberação de
NO(72).Além disso, observou-se que a ativação do receptor Mas pela Ang-(1-7)
estimulou a eNOS em células endoteliais humanas através de uma via dependente
27
da proteína quinase AKT (69). Estes dados mostram um papel essencial do eixo
ECA2/Ang-(1-7)/receptor Mas na modulação das funções vasculares.
Figura 5. Ilustração representando a via de formação do NO e seus alvos intracelulares.O estimulo
da eNOS pela acetilcolina e pelo shear stress gera o aumento na produção de óxido nítrico (NO) em
células endoteliais. O NO se difunde do endotélio para o músculo liso ativando Guanilato Ciclase que
desencadeia o restante da cascata. Por outro lado, a disfunção endotelial acarreta em estimulo direto
da acetilcolina sobre as células do músculo liso vascular, causando vasoconstrição. A vasoconstrição
aumenta o Shear Stress, que é o estímulo fisiológico mais potente para a produção de .NO. No
entanto, uma célula endotelial com sua função prejudicada não vai responder com a produção normal
de NO.[Adaptado de HERRMANN et al., 2010 (60)]
1.4– Fármacos anti-hipertensivos
Estudos clínicos demonstraram que o diagnóstico e tratamento precoce da
HAS são fundamentais para a redução dos eventos cardiovasculares. O principal
objetivo do tratamento da HA é a redução da morbidade e da mortalidade por
28
doenças cardiovasculares. Assim, os anti-hipertensivos devem reduzir a pressão
arterial e também os eventos cardiovasculares. A escolha do medicamento é
variável (tabela 1), pois depende de uma triagem clínica (3). Numerosos estudos
clínicos têm demonstrado a importância na redução da PA, especialmente em
pacientes com alto risco cardiovascular(4,5).
Devido ao seu importante papel no controle cardiovascular, a modulação do
SRA tornou-se uma estratégia terapêutica fundamental no controle da hipertensão
arterial, tanto na monoterapia ou com associações, por sua eficácia na redução
dosefeitos deletérios da hipertensão arterial (19,73).
Inibidores da enzima conversora de Angiotensina (iECA) reduzem a formação
de Ang II inibindo a conversão de Ang I em Ang II por estas enzimas. Os
antagonistas dos receptores da angiotensina (ARA) antagonizam receptores AT1
evitando-se a ligação de Ang II (1). Na última década, iniciou-se o uso do inibidor da
Renina para o controle da HAS (74).
Classes
Diuréticos
Agonistas alfa-2 centrais
Betabloqueadores– bloqueadores β-adrenérgicos
Alfabloqueadores– bloqueadores α-1 adrenérgicos
Vasodilatadores diretos
Bloqueadores dos canais de cálcio
Inibidores da enzima conversora da angiotensina
Bloqueadores do receptor AT1 da angiotensina II
Inibidor direto da renina
Fármacos Representantes
Hidroclorotiazida, Furosemida
Clonidina
Atenolol; Propanolol
Doxazosina
Propatilnitrato
Nifedipino, Anlodipino
Captopril, Enalapril
Losartan, Olmesartan
Alisquereno
Tabela 1 - Classes de anti-hipertensivos disponíveis para uso clínico [Fonte: adaptado de: VI diretriz
de hipertensão, 2010 (3)]
Além disso, novos alvos terapêuticos com capacidade de aumentar a
atividade enzimática da ECA2 têm surgido como uma estratégia para proteção
contra doenças cardiovasculares. A ECA2 diminui os níveis de Ang II circulante
formando mais Ang-(1-7), assim promovendo ações benéficas para o sistema
cardiovascular (Figura 6) (75,76).
Além de fármacos que envolvem o controle do SRA, os bloqueadores de
canais para cálcio (BCC) também são importantes agentes anti-hipertensivos. A
principalação promovida por estes fármacos, principalmente as diidropiridinas, é
29
oefeito vasodilatador em vasos de resistência, resultando na redução da pós-carga
ventricular (77–79). No entanto, vários estudos vêm demonstrando também um
efeito antioxidante de alguns BCC no endotélio vascular (65,80). Observou-se que
BCC reduzem a geração de superóxido nas células endoteliais estimuladas por Ang
II por inibir a formação do ânion superóxido (81).
Já é bem estabelecido que os diferentes tipos de fármacos anti-hipertensivos
são efetivos quando utilizados sozinhos no tratamento da HAS. Porém, combinações
terapêuticas (com doses menores às usadas na monoterapia) têm se mostrado mais
eficazes na redução da PA e melhora nos órgãos alvos (4,65). Em geral, quando se
combina as classes terapêuticas no tratamento da hipertensão, a efetividade
aumenta aproximadamente cinco vezes na redução da PA em relação ao aumento
da dose de um só fármaco (4).
Antagonistas do receptor AT1 quando combinados com BCC além de serem
amplamente utilizados como fármacos hipotensores, promovem vaso-proteção por
diminuir o stress oxidativo. Além disso, a associação destes fármacos demonstra ser
mais efetiva sobre o remodelamento vascular do que a monoterapia (65,80,82). Em
adição, ARA melhoram significativamente o perfil de tolerabilidade do BCC. ARA
neutraliza parcialmente o edema periférico, que é um dos efeitos colaterais que
limita o aumento das doses dos BCCs. Sugeriu-seque o edema seja desencadeado
pela dilatação arteriolar, o que resultaria no aumento do gradiente de pressão
através das membranas de capilares em algumas regiões do corpo. Supõe-se que
BRA neutralize este efeito através da venodilatação(4).
Outro estudo mostra que os primeiros anti-hipertensivos a serem utilizados
em larga escala foram os iECA, por apresentarem efeitos hipotensores relevantes
clinicamente (83). Embora sua eficácia seja bem conhecida quanto monoterapia,
quando associado com BCC tem-se um efeito sinérgico, aumentando os níveis de
.
NO. Por outro lado a combinação entre iECA e diuréticos não altera os níveis de
.
NO (65). Estudos clínicos mostram que a associação de anlodipino e um
antagonista do SRA produzem reduções significativamente maiores na pressão
arterial do que qualquer agente isolado (84,85).
Estudos sugerem que a ativação da ECA2 pode ser uma importante
ferramenta para o tratamento da hipertensão. O Aceturato de Diminazeno DIZE foi
capaz de diminuir a pressão arterial média (PAM) em ratos SHR tratados
30
cronicamente (76). Além disso, o tratamento com DIZE diminuiu a área do infarto no
miocárdio de ratos Sprague Dawley, atenuou o remodelamento do ventrículo
esquerdo pós-infarto agudo no miocárdio e restaurou o equilíbrio normal do Sistema
Renina-Angiotensina cardíaco.(86).
Figura 6. Ilustração do Sistema renina-angiotensina mostrando pontos de regulagem onde há um
aumento ou bloqueio de atividade enzimática e bloqueio de receptores.ECA, Enzima Conversora de
Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; NEP, Endopeptidase Neutra; PCP,
Prolil-carboxipeptidase; PEP, Prolilendopeptidase, AT, Receptor de Angiotensina ( Adaptado de SHI
et al., 2010; DASGUPTA; ZHANG, 2011).
Como descrito anteriormente, sabe-se que o efeito vasodilatador promovido
pela Ang-(1-7) via receptor Mas é endotélio dependente(89,90) e que a hipertensão
acarreta conseqüências na estrutura vascular, especialmente no endotélio,
31
acarretando a disfunção endotelial (91). Dessa forma, diminui a vasodilatação
dependente da Ang-(1-7). Além disso, tem sido demonstrado que algumas classes
de anti-hipertensivos (ARA, iECA e BCC) são importantes na melhora da função
endotelial (82).
No cenário exposto, ainda não se sabe se estes fármacos podem melhorar o
efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) em vasos de animais submetidos à sobrecarga
pressórica. Como diversos trabalhos tem apontado o eixo Ang-(1-7)/ Receptor Mas
com potencial terapêutico para as doenças cardiovasculares (16,22,68), é de grande
importância um melhor conhecimento sobre a influência de fármacos antihipertensivos nos efeitos vasculares da Ang-(1-7).
Desta forma, a proposta do trabalho foi avaliar os efeitos de fármacos antihipertensivos nas ações vasculares da Angiotensina-(1-7) em ratos submetidos à
sobrecarga pressórica.
32
2- OBJETIVOS
2.1- Geral:
Avaliar os efeitos de fármacos anti-hipertensivos nas ações vasculares da
Angiotensina-(1-7) em ratos submetidos à sobrecarga pressórica.
2.2-Específicos:
▪ Avaliar as alterações causadas pela sobrecarga pressórica nos efeitos da Ang-(17) sobre reatividade vascular em anéis isolados de aortas de ratos
▪ Avaliar os efeitos do tratamento crônico e agudo com o antagonista do receptor de
angiotensina 1, losartan, nas ações da Ang-(1-7) em anéis isolados de aorta de
ratos submetidos à sobrecarga pressórica.
▪ Avaliar os efeitos do tratamento crônico e agudo com o inibidor da enzima
conversora de angiotensina,captopril, nas ações da Ang-(1-7) em anéis isolados de
aorta de ratos submetidos à sobrecarga pressórica.
▪ Avaliar os efeitos do tratamento crônico do ativador da Enzima Conversora de
Angiotensina 2, DIZE, nas ações da Ang-(1-7) em anéis isolados de aorta de ratos
submetidos à sobrecarga pressórica.
▪ Avaliar os efeitos do tratamento crônico e agudo do bloqueio dos canais para
cálcio, anlodipino, nas ações da Ang-(1-7) em anéis isolados de aorta de ratos
submetidos à sobrecarga pressórica.
▪ Avaliar a participação do óxido nítrico nas ações da Ang-(1-7) em anéis isolados de
aorta de ratos submetidos à sobrecarga pressórica tratados com o antagonista de
receptor AT1, losartan, in vitro.
33
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1-Animais
Utilizou-se ratos Wistar adultos, pesando entre 200-300 gramas, provenientes
do Biotério Central do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Goiás.
Forneceu-se acesso livre de água e comida aos animais. Estes foram alocados
no Laboratório de Manutenção de Animais para Ensino e Pesquisa do Departamento
de Ciências Fisiológicas/ICB/UFG com temperatura e intensidade de luz controladas
(12 horas claro/12 horas escuro).Todos os protocolos utilizados foram submetidos à
aprovação na Comissão de Ética no Uso de Animais da Pró-Reitoria de Pesquisa e
Pós-Graduação da Universidade Federal de Goiás (CEUA/UFG), sob nº 179/09.
3.2- Coarctação da Aorta Abdominal
A sobrecarga pressórica foi induzida pelo modelo de coarctação de aorta
abdominal (CoA). Os animais foram anestesiados com uma solução de
tribromoetanol 250 mg/kg intraperitoneal (i.p.). A incisão foi realizada na parede
abdominal esquerda, a 1,5 cm da coluna vertebral. Após identificação da aorta, na
porção cranial às duas artérias renais, uma linha cirúrgica foi passada sobre a
mesma, uma agulha 21G foi colocada sobre a aorta e um nó foi dado sobre a agulha
e o vaso. A agulha foi retirada imediatamente deixando a aorta constrita com o seu
diâmetro interno semelhante ao da agulha (0,8 mm). Posteriormente, a parede
abdominal foi suturada e os animais receberam administração do antibiótico
Megacilin plus Super® 350 µL/Kg. No grupo controle (sham), foi realizado um
procedimento cirúrgico semelhante ao anterior, porém sem a constrição da aorta
abdominal. Após o período de 21 dias, os animais foram eutanasiados para a
realização dos experimentos subseqüentes.
3.3-Tratamento dos Animais
Para avaliar o efeito do tratamento crônico com os anti-hipertensivos nas ações
vasculares da Ang-(1-7), os animais coarctados foram submetidos aos seguintes
34
tratamentos: Veículo (água, 1mL); losartan 1 mg/kg/dia ou 5 mg/kg/dia; captopril 1
mg/kg/dia ou 5 mg/kg/dia; anlodipino 1 mg/kg/dia ou 5 mg/kg/dia ou DIZE 1
mg/kg/dia ou 5 mg/kg/dia por 21 dias.
3.4-Registro da Pressão Arterial
No dia anterior à eutanásia, realizou-se a canulação da artéria carótida dos
animais para o registro da pressão arterial. Os animais foram anestesiados com
solução de quetamina (70 mg/kg) e xilazina (6 mg/kg) por via intraperitoneal e uma
incisão na altura da traqueia foi realizada. Após dissecação, a artéria carótida direita
foi cuidadosamente isolada do nervo vago e tecidos adjacentes. O fluxo sanguíneo
da porção distal da artéria carótida foi interrompido com uma ligadura, enquanto o
fluxo na porção proximal foi obstruído temporariamente com o auxílio de uma pinça.
Realizou-se um corte na região medial da carótida e um cateter de polietileno (PE50
estirado)
heparinizado
foi
introduzido
na
artéria
e
devidamente
fixado.
Posteriormente, a pele foi suturada e o cateter foi exteriorizado para acesso pelo
dorso do animal. Após 24 horas, a pressão arterial foi registrada por 30 minutos.
Este
registro
foi
realizado
utilizando-se
um
conversor
analógico
digital
(PowerLab/400,ADInstruments, Austrália) numa freqüência de amostragem de 1000
Hz.
3.5-Reatividade Vascular
A avaliação da reatividade vascular foi realizada utilizando-se a técnica de
Banho de órgãos isolados (Figura 7). Os anéis de aorta torácica descendente
superior à constrição, livre de tecido adiposo e conectivo, foram montados em
solução de Krebs-Henseleit oxigenada (95% O2 + 5% CO2) e mantida a uma
temperatura de 37 ºC. A composição da solução nutridora utilizada para o banho do
anel de aorta isolada (Solução de Krebs-Henseleit) está detalhada na tabela 2.
35
Figura 7- Diagrama esquemático de uma preparação de anel de aorta de ratos em banho de órgãos
isolados. A preparação é mantida em solução de Krebs-Henseleit carbogenada (95% O2, 5% CO2) e
aquecida a ±37ºC, com uma tensão de 1,5g. (adaptado de OGUZHAN YILDIZ, 2013)
COMPOSTO
CONCENTRAÇÃO EM mmol/L
NaCl
118,6
KCl
4,6
KH2PO4
0,9
MgSO4.7H2O
2,4
CaCl2.2H2O
3,3
Dextrose Anidra (Glicose)
11,1
NaHCO3
24,9
Tabela 2. Composição da solução de Krebs-Henseleit.
Para a obtenção dos vasos, os animais foram eutanasiados por decapitação
10 minutos após serem heparinizados (400 UI de heparina). Uma vez exposta a
36
cavidade torácica a aorta torácica descendente foi retirada e dividida em anéis de
4mm. Os anéis de aorta foram mantidos a uma tensão de 1,5 g por um período de 1
hora para estabilização da preparação. A atividade mecânica foi registrada
isometricamente usando um sistema de aquisição de dados (Dataq Instruments,
EUA). Avaliou-se a integridade do endotélio calculando-se a porcentagem de
relaxamento induzido pela acetilcolina (10 µM) nos vasos pré-contraídos com
fenilefrina (0,1 µM). Os anéis foram considerados viáveis para a realização dos
experimentos quando foi alcançado no mínimo 40% de contração e acima de 80%
de relaxamento.Para avaliar a musculatura lisa dos anéis de aorta, o endotélio
vascular foi removido através do atrito mecânico da superfície interna do vaso com
uma haste metálica.
3.5.1-Protocolo experimental
O efeito da Ang-(1-7) foi avaliado em vasos pré-contraídos com fenilefrina(0,1
µM). A Ang-(1-7) foi adicionada em concentrações cumulativas 10-10 a 10-6 mol/l
após o efeito da fenilefrina ter se estabilizado.
Para avaliar a influência do tratamento in vitro dos fármacos anti-hipertensivos
nos efeitos da Ang-(1-7), os anéis de aorta dos ratos coarctados foram préincubados 10 minutos antes da adição da fenilefrina com: (I) losartan 1 µmol/L, (II)
captopril 1 µmol/L ou (III) anlodipino 1 µmol/L. Para avaliar a participação do receptor
Mas e o envolvimento do mesmo nas ações da Ang-(1-7), os vasos do grupo
losartan foram pré-tratados com o antagonista para este receptor, A-779. O possível
envolvimento do .NO foi avaliado incubando-se os vasos do grupo losartan com
inibidor L-NAME (inibidor da enzima óxido nítrico sintase). Curvas de concentraçãoresposta foram realizadas quando necessário (Figura 8).
A figura 8 representa de forma esquemática os protocolos utilizados neste
trabalho.
37
Figura 8. Ilustração representativa do protocolo experimental de anéis de aorta de ratos submetidos
ao tratamento crônico ou agudo.
3.6- Análise Estatística
O software utilizado para a análise dos dados obtidos foi o GraphPadPrism
5.0®. Para a análise da pressão arterial média, foi realizado o teste One way ANOVA
seguido do pós-teste de Newman-Keuls. Para a análise da reatividade vascular, foi
feito o teste Two Way ANOVA seguido do pós-teste LSD de Fisher. Os dados foram
expressos como média ± erro padrão da média (EPM). As diferenças foram
consideradas significativas quando P<0,05.
38
4- RESULTADOS
4.1 – Avaliação da Pressão Arterial Média.
Para confirmar se o modelo experimental de coarctação da aorta abdominal
foi eficaz em promover a sobrecarga pressórica e se os tratamentos alteraram a
pressão arterial, realizou-se o registro da pressão arterial através da canulação da
artéria carótida (Tabela 3).
Resultados prévios do nosso laboratório demonstraram que o tratamento com
losartan 1 mg/kg/dia em animais CoA não alteram a PAM. De forma semelhante, os
tratamentos com losartan 5 mg/kg/dia, captopril 1 e 5 mg/kg/dia, anlodipino 1 e 5
mg/kg/dia e DIZE 1 e 5mg/kg/dia também não foram capazes de diminuir a PAM dos
animais CoA.
Grupos
Pressão Arterial Média
N
Sham
106,70 ± 1,68
15
CoA + Veículo
151,93 ± 6,55 *
19
CoA + Losartan 5 mg/kg/dia
153,40 ± 8,46*
6
CoA + Captopril 1 mg/kg/dia
138,10 ± 11,75*
6
CoA + Captopril 5 mg/kg/dia
139,60 ± 8,82*
6
CoA + Anlodipino 1 mg/kg/dia
149,60 ± 9,84*
7
CoA + Anlodipino 5 mg/kg/dia
151,8 ± 7,33*
5
CoA + DIZE 1 mg/kg/dia
148,40 ± 6,92*
10
CoA + DIZE 5 mg/kg/dia
133,52 ± 10,36*
5
Tabela 3. Valores de Pressão Arterial Média de animais Sham e CoA tratados com veículo, losartan,
captopril, anlodipino e DIZE 1 e 5 mg/kg/dia. Os dados foram expressos em média ± erro padrão da
média e analisados por One Way ANOVA seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls. *p<0,05 quando
comparados aos animais Sham. CoA: coarctação de aorta abdominal
39
4.2 – Avaliação do bloqueio do receptor AT1 nos efeitos da Ang (1-7) em
anéis de aorta isolados de ratos submetidos a sobrecarga pressórica
Inicialmente, observou-se que a Ang-(1-7) induziu relaxamento significativo
nos anéis de aorta de animais Sham. Este efeito foi reduzido em aorta de ratos
CoA(Figura 9A). Para avaliar se o tratamento com losartan era capaz de melhorar a
resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7), primeiramente os animais foram tratados
durante os 21 dias após o procedimento de coarctação com losartan 1 mg/kg/dia.
Observou-se que este tratamento não restaurou o relaxamento da aorta induzida por
Ang-(1-7) (Figura 9A). No entanto, o tratamento com losartan 5 mg/kg/dia melhorou
o relaxamento induzido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA( Figura 9B).
0
0
B
A
5
% Relaxamento
% Relaxamento
5
*#
10
*#
15
*#
20
*#
*# *# *#
*#
Sham, n=10
CoA, n=8
CoA + Los 1mg/kg, n=11
25
30
-10
-9
-8
-7
-6
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
*
10
*
* *
*
*
15
20
* *
*
* *
* *
Sham, n=13
CoA, n=12
CoA + Los 5mg/kg, n=6
25
30
-5
* *
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Figura 9 – Efeito do tratamento crônico com losartan 1 mg/kg/dia (A) ou 5 mg/kg/dia (B) na resposta
vasorrelaxante da ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA. * p<0,05 comparados com CoA,
#
p<0,05 comparados com CoA+Los 1mg/kg/dia.Os dados foram expressos em média ± erro padrão
da média e analisados por Two Way ANOVA seguido pelo pós-teste LSD de Fisher. CoA: coarctação
de aorta abdominal. ACh: acetilcolina. Los: losartan.
40
4.2.1 – Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada
de ratos CoA tratados com Losartan in vivo
Para determinar se os animais submetidos a sobrecarga pressórica
apresentaram disfunção endotelial e/ou disfunção na musculatura lisa da aorta
torácica, realizou-se curva concentração-resposta de ACh e Nitroprussiato de Sódio
(NPS), respectivamente. A resposta vasorrelaxante do NPS foi avaliada em anéis de
aorta de ratos sem a presença do endotélio. Observou-se que o efeito
vasorrelaxante concentração-dependente induzido por ACh ou NPS foi atenuado em
anéis de animais CoA (Figuras 10A, 10C). O tratamento in vivo com losartan
1mg/kg/dia não foi capaz de restaurar a resposta vasorrelaxante de ACh (Figura
10A). Já o tratamento com 5mg/kg/dia melhorou o vasorrelaxamento promovido por
ACh (Figura 10B). O tratamento in vivo com losartan 1 mg/kg/dia (Figura 10C)
melhorou o vasorrelaxamento promovido por NPS em anéis de aorta de animais
CoA. Este efeito não foi observado com losartan 5 mg/kg/dia (Figura 10D).
41
0
0
A
B
#
20
% Relaxamento
% Relaxamento
20
*
40
*+
60
*+
80
-9
-8
-7
-6
#
#
40
60
*
*
Sham, n=12
*
CoA, n=11
CoA + Los 5mg/kg, n=6
100
-5
-9
-4
-8
D
% Relaxamento
% Relaxamento
#
0
20
40
60
+
*
80
120
-6
-5
-4
-20
0
100
-7
*
Log [Ach] (mol/L)
Log [Ach] (mol/L)
C
#
*
80
Sham, n=9
*+ +
CoA, n=9
* +
CoA + Los 1mg/kg, n=7 *
100
#
*
+
+
Sham (-), n=6 *
*
CoA (-),n=6
* *
*
CoA + Los 1mg/kg (-), n=6
-11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
40
*#
60
*#
80
120
-4
#
20
100
Log [Nitroprussiato de Sódio] (mol/L)
#
Sham (-), n=6 *# #
* *# # #
CoA (-), n=4
* *
CoA + Los 5mg/kg (-), n=6
-11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log [Nitroprussiato de Sódio] (mol/L)
Figura 10 –Curva concentração-resposta de Ach e NPS em anéis de aorta de ratos.
(A) Efeito vasorrelaxante da ACh no tratamento in vivo 1mg/kg/dia e (B) 5mg/kg/dia por 21 dias com
losartan. Efeito vasorrelaxante do NPS no tratamento in vivo de 1mg/kg/dia (C) e 5mg/kg/dia (D) por
21 dias com losartan.Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média e analisados por
Two Way ANOVA seguido do pós-teste de LSD de Fisher. * p<0,05 quando comparados aos animais
CoA, + p<0,05 comparados com CoA + Los crônico 1mg/kg, # p< 0,05 comparados com CoA + Los
crônico 5mg/kg/dia. CoA: coarctação de aorta abdominal. Ach: acetilcolina. Los: Losartan. NPS:
Nitroprussiato de Sódio
42
4.3 – Influência do Inibidor da ECA nos efeitos da Ang (1-7) em anéis de aorta
isolados de ratos submetidos à sobrecarga pressórica
Tendo em vista que o antagonismo do receptor AT1 com losartan 5mg/kg/dia
in vivo, melhorou a resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7), avaliou-se se outros
fármacos anti-hipertensivos também poderiam estar envolvidos na melhora da
resposta vascular da Ang-(1-7) em ratos CoA.
A Figura 11A mostra que o tratamento crônico de 1mg/kg/dia de captopril não
melhorou o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7). No entanto, quando animais foram
tratados com 5mg/kg/dia. Deste fármaco, houve uma significativa melhora na
resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7) (Figura 11B).
0
% Relaxamento
5
B
*#
10
*# #
* #
* *# #
* *#
15
20
Sham, n=13
Coa, n=12
Captopril Crônico 1 mg/Kg, n=6
25
30
-10
0
5
*# #
*
% Relaxamento
A
-9
-8
-7
-6
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
-5
#
#
#
#
#
#
#&
10
#
#&
#&
15
#&
#& #&
#
#&
20
Sham, n=13
Coa, n=12
Captopril Crônico 5 mg/Kg, n=7
25
30
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Figura 11 – Efeitos do Captopril na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7).
(A) Efeito do tratamento crônico com captopril (1 mg/kg/dia) e (5 mg/kg/dia) (B) na resposta
vasorrelaxante da ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA. Os dados foram expressos em média ±
erro padrão da média e analisados por Two Way ANOVA seguido pelo pós-teste LSD de Fisher.
#
&
p<0,05 comparados com CoA,* p<0,05 comparados com CoA+Cap crônico 1mg/kg/dia, p<0,05
comparados com CoA+Cap crônico 5mg/kg/diaCoA: coarctação de aorta abdominal. Ang-(1-7):
angiotensina (1-7). Cap: Captopril.
4.3.1 – Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada de
ratos CoA tratados com Captopril in vivo
Como observado na figura 12A o tratamento crônico com captopril 1
mg/kg/dia não melhorou o efeito vasorrelaxante da ACh em anéis de aorta de ratos
43
CoA. Já o tratamento com este iECA 5 mg/kg/dia (figura 12B) melhorou a resposta
vasorrelaxante da ACh nos anéis de aorta destes animais. Além desta ação na
resposta vasorrelaxante pela ACh, o tratamento com captopril 5mg/kg/dia também
melhorou a resposta vasodilatadora ao NPS (figura 12C).
A
0
B
40
*
*+
60
*+
Sham, n=12
*+
CoA, n=11
*+
CoA + Cap. 1 mg/kg, n=6
80
100
-9
-8
-7
-6
#
40
-4
#
*
#
*
60
*
Sham, n=12
*&
CoA, n=11
*&
CoA + Cap. 5 mg/kg, n=7
&
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log [Ach] (mol/L)
-20
*
0
% Relaxamento
#
100
-5
#
#
80
Log [Ach] (mol/L)
C
#
20
% Relaxamento
% Relaxamento
20
0
*
#
20
#
40
#
80
100
120
#
*
*
60
#
#
*
Sham (-), n=6 *
* *
CoA (-), n=4
* *
CoA + Cap. 5 mg/Kg (-), n=5
-11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log [Nitroprussiato de Sódio] (mol/L)
Figura 12- Efeitos do Captopril na resposta vasorrelaxante da ACh.
(A) Efeito do tratamento in vivo com captopril 1mg/kg/dia ou (B) 5mg/kg/dia em anéis de aorta de
ratos CoA. (C) Efeito vasorrelaxante do NPS em anéis de aorta de ratos CoA tratados in vivo com
captopril 5mg/kg/dia.Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média e analisados por
Two Way ANOVA seguido do pós-teste de LSD de Fisher. * p <0,05 comparados com CoA, + p<0,05
comparados com CoA+Cap crônico 1mg/kg, & p<0,05 comparados com CoA+Cap crônico 5mg/kg/dia,
#
p< 0,05 comparados com CoA+Cap crônico 5mg/kg/dia. CoA: coarctação de aorta abdominal. ACh:
acetilcolina. Cap: captopril. NPS: Nitroprussiato de Sódio
44
4.4 – Influência do bloqueador de canal para cálcio, Anlodipino, nos efeitos da
Ang (1-7) em anéis de aorta isolados de ratos submetidos à sobrecarga
pressórica
O tratamento crônico com Anlodipino 1 mg/kg/dia não foi capaz de restaurar o
efeito vasodilatador induzido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA(Figura
13A) . No entanto, tratamento com 5mg/kg/dia melhorou o relaxamento induzido por
Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA( Figura 13B).
0
B
A
5
*# *#
% Relaxamento
% Relaxamento
5
*# #
* #
* #
* *#*#
*#
10
15
20
Sham, n=13
CoA, n=12
CoA + Anlo 1mg/kg, n=4
25
30
-10
0
-9
-8
-7
-6
*
10
* *
*
*
15
*&
* *
* *
*& *&
20
30
-5
*& *& &
*
Sham, n=13
CoA, n=12
CoA + Anlo 5mg/kg, n=6
25
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
*
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Figura 13 – Efeitos do Anlodipino na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7).
(A) Efeito do tratamento crônico com Anlodipino (1 mg/kg/ dia) na resposta vasorrelaxante da ang-(17) em anéis de aorta de ratos CoA. (B) Efeitos do tratamento com Anlodipino 5mg/kg/dia na resposta
vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.Os dados foram expressos em média ±
erro padrão da média e analisados por Two Way ANOVA seguido pelo pós-teste LSD de Fisher.*
p<0,05 comparados com CoA, # p<0,05 comparados com CoA+Anlodipino crônico 1mg/kg/dia,
&
p<0,05 comparados com CoA+Anlo crônico 5mg/kg/dia. CoA: coarctação de aorta abdominal. Ang(1-7): angiotensina (1-7). Anlo: Anlodipino.
4.4.1 – Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada
de ratos CoA tratados com Anlodipino in vivo
Para determinar se o tratamento crônico com Anlodipino 1 mg/kg/dia
melhorou a função endotelial e/ou musculatura lisa de anéis de aorta de ratos
submetidos a sobrecarga pressórica foi feito curva dose-resposta de ACh e NPS. A
figura 14A mostra que o tratamento com anlodipino 1 mg/kg/dia não melhorou o
45
efeito vasorrelaxante induzido por ACh em anéis de aorta de ratos CoA, mas este
efeito foi observado no tratamento com anlodipino 5mg/kg/dia (Figura 14B). Já a
figura 14C mostra que o tratamento com anlodipino 1mg/kg/dia não melhorou o
efeito vasorrelaxante induzido por NPS. Por outro lado, o tratamento com 5mg/kg/dia
promoveu uma melhora do efeito vasorrelaxante promovido por NPS (nas
concentrações menores) em anéis de aorta de ratos coarctados (Figura 14D).
46
A
0
B
&
&
20
40
% Relaxamento
% Relaxamento
20
0
*
*
60
*#
80
*#
Sham, n=12
*#
CoA, n=11
CoA + Anlo 1mg/kg,n=4
100
&
&
&
40
60
*
*
80
Sham, n=12
*
CoA, n=11
*
CoA + Anlo 5mg/kg, n=6
100
-9
-8
-7
-6
-5
&
*
-4
Log [Ach] (mol/L)
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log [Ach] (mol/L)
-20
-20
C
*
*
0
20
% Relaxamento
% Relaxamento
0
D
#
40
*#
60
*#
80
100
120
#
Sham (-), n=6 * #
* *# * # #
CoA (-), n=4
*
CoA + Anlo 1mg/kg (-),n=4
-11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
&
40
*&
60
80
120
-4
*&
20
100
Log [Nitroprussiato de Sódio] (mol/L)
& *&
*
&
Sham (-), n=6 * &
* *& *&
CoA (-), n=4
*
CoA + Anlo 5mg/kg (-), n=6
-11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log [Nitroprussiato de Sódio] (mol/L)
Figura 14- Efeitos do Anlodipino na resposta vasorrelaxante da ACh e NPS.
(A) Efeito do tratamento in vivo com anlodipino 1mg/kg/dia (B) 5mg/kg/dia em anéis de aorta de ratos
CoA. (C) Efeito vasorrelaxante do NPS em anéis de aorta de ratos CoA tratados in vivo com
anlodipino 1mg/kg/dia e (D) 5mg/kg/dia. Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média
e analisados por Two Way ANOVA seguido do pós-teste de LSD de Fisher. * p <0,05 comparados
com CoA, # p< 0,05 comparados com CoA+Anlo crônico 1mg/kg/dia, &p<0,05 comparados com
CoA+Anlo crônico 5mg/kg/dia. CoA: coarctação de aorta abdominal. ACh: acetilcolina. Anlo:
anlodipino. NPS: Nitroprussiato de Sódio
47
4.5 – Influência do possível ativador da ECA 2, DIZE, nos efeitos da Ang (1-7)
em anéis de aorta isolados de ratos submetidos a sobrecarga pressórica
A figura 15A mostra que o tratamento crônico com 1 e 5mg/kg/dia (Figura
15B) de DIZE não foram capazes de melhorar o efeito vasodilatador de Ang-(1-7).
0
B
A
*
10
5
*#
*# #
*
15
20
% Relaxamento
% Relaxamento
5
*# *#
*# *# #
*
Sham, n=13
Coa, n=12
CoA DIZE 1 mg/kg, n=6
25
30
-10
0
-9
-8
-7
*
*&
10
15
*& *& &
* *&
*&
Sham, n=13
Coa, n=12
CoA DIZE 5 mg/kg, n=7
30
-5
*&
20
25
-6
*&
-10
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Figura 15 – Efeitos do DIZE na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7).
(A) Efeito do tratamento crônico com DIZE (1 mg/kg/dia) e (B) (5 mg/kg/dia) na resposta
vasorrelaxante da ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA. Os dados foram expressos em média ±
erro padrão da média e analisados por Two Way ANOVA seguido pelo pós-teste LSD de Fisher.*
p<0,05 comparados com CoA, # P<0,05 comparados com CoA+DIZE crônico 1mg/kg/dia, &p<0,05
comparados com CoA+DIZE crônico 5mg/kg/dia. CoA: coarctação de aorta abdominal. Ang-(1-7):
angiotensina (1-7). DIZE: aceturato de diminazeno
4.5.1 – Análise da reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada de
ratos CoA tratados com DIZE in vivo
Resultados prévios do nosso laboratório demonstraram que o tratamento
com 1 mg/kg/dia de DIZE não foi capaz de melhorar o vasorrelaxamento promovido
pela ACh nos anéis de aorta dos animais coarctados. No entanto, a figura 16A
mostra que o tratamento com 5 mg/kg/dia de DIZE teve uma discreta melhora na
função endotelial desses ratos. Já a figura 16B mostra que o tratamento in vivo com
DIZE não melhorou a resposta vasodilatadora do NPS.
48
A
-20
0
B
*#
0
40
% Relaxamento
% Relaxamento
20
*#
*#
60
*
*
*#
80
*
Sham, n=12
*#
Coa, n=11
* # n=10
CoA + DIZE Crônico 5 mg/kg,
100
-9
-8
-7
-6
Log [Ach] (mol/L)
-5
-4
*# #
20
#
40
*
60
80
100
120
*
Sham (-), n=6
*
CoA (-), n=4
* *
*
CoA + DIZE 5 mg/kg (-),* n=6
-11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log [Nitroprussiato de Sódio] (mol/L)
Figura 16- Efeitos do DIZE na resposta vasorrelaxante da ACh e NPS.
(A) Efeito do tratamento in vivo com DIZE 5mg/kg/dia em anéis de aorta de ratos CoA. (B) Efeito
vasorrelaxante do NPS em anéis de aorta de ratos CoA tratados in vivo com DIZE 5mg/kg/dia. Os
dados foram expressos em média ± erro padrão da média e analisados por Two Way ANOVA seguido
#
do pós-teste de LSD de Fisher. * p <0,05 comparados com CoA,
p<0,05 comparados com
CoA+DIZE crônico 5mg/kg/dia. CoA: coarctação de aorta abdominal. ACh: acetilcolina, NPS:
Nitroprussiato de Sódio
4.6 – Envolvimento do receptor AT1 in vitro nos efeitos da Ang (1-7) em anéis
de aorta isolados de ratos submetidos a sobrecarga pressórica
Como foi observado anteriormente, o tratamento in vivo com losartan 1
mg/kg/dia não melhorou o vasorrelaxamento promovido por Ang-(1-7).Entretanto, o
tratamento com losartan 5mg/kg/dia melhorou o efeito vasorrelaxante promovido por
Ang-(1-7) em anéis de aorta de animais CoA. Portanto, avaliou-se os efeitos do
antagonismo agudo (in vitro) do receptor AT1. A figura 17A mostra que o prétratamento dos anéis com o antagonista do receptor AT1, losartan, restaurou o
relaxamento induzido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA.
Com a finalidade de investigar a participação do receptor Mas na resposta
vasorrelaxante induzida por Ang-(1-7) na presença do losartan, realizou-se curvas
concentração-resposta cumulativas com este peptídeo em anéis de aorta de ratos
CoA na presença do antagonista para receptor Mas, A-779. Como mostrado na
(Figura 17B), o efeito vasorrelaxante induzido por Ang-(1-7) foi ausente na presença
do A-779. Para investigar a participação da eNOS no efeito da Ang-(1-7), os anéis
49
foram pré-incubados com L–NAME. Este inibidor aboliu completamente a resposta
vasodilatadora da Ang-(1-7) (Figura 17C).
0
B
5
*
10
+
*
*
+
15
* *
+
+
20
* * *
+
+
25
-10
-9
-8
-7
-6
$
*$
*$
10
*$
*$
15
20
30
-5
*$
*$
*$ *$
CoA, n=8
CoA + Los agudo, n=5
CoA + Los agudo + A-779,n=10
25
+
Sham, n=10
+
CoA, n=8
CoA + Los agudo, n=5
30
0
5
% Relaxamento
% Relaxamento
A
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
-5
C
% Relaxamento
0
5
*&
*&
*&
10
15
*&
20
*&
*&
*& *&
CoA, n=8
CoA + Los agudo, n=5
CoA + Los agudo + L-NAME, n=14
25
30
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Figura 17- Efeitos do pré-tratamento (10 min) com losartan (10-6 mol / L).
(A) sozinho ou em associação com (B), A-779 (10-6 mol / l) ou (C) com L-NAME (10-6 mol / L) na
resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA. Os dados foram expressos em
média ± erro padrão da média e analisados por Two Way ANOVA seguido pelo pós-teste LSD de
#
+
Fisher. * p<0,05 comparados com CoA, p<0,05 comparados com CoA+Los crônico 1mg/kg/dia,
$
&
p<0,05 comparados com CoA, P< 0,05 comparados com CoA+Los agudo + A-779, p< 0,05
comparados com Los agudo + L-NAME. CoA: coarctação de aorta abdominal. ACh: acetilcolina. Los:
losartan.
50
4.7 – Influência do Inibidor da ECA, captopril, in vitro nos efeitos da Ang (1-7)
em anéis de aorta isolados de ratos submetidos à sobrecarga pressórica
Tendo-se em vista que o bloqueio do receptor AT1 in vitro, restaurou a
resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7), avaliou-se se outros fármacos antihipertensivos também poderiam estar envolvidos na melhora da resposta vascular
da Ang-(1-7) em ratos CoA. Observou-se que o pré-tratamento in vitro com o
captopril restaurou o relaxamento induzido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos
CoA(Figura 18A).
A
0
% Relaxamento
5
#
#
10
#
15
#
#
# #
#
20
Sham, n=13
Coa, n=12
CoA + Cap agudo, n=8
25
30
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Figura 18 – Efeitos do captopril na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7).
-6
(A) Efeitos do pré-tratamento (10 min) com captopril (10 mol / L) na resposta vasorrelaxante da Ang(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA. Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média e
analisados por Two Way ANOVA seguido pelo pós-teste LSD de Fisher. # p<0,05 comparados com
CoA.. CoA: coarctação de aorta abdominal. Ang-(1-7): angiotensina (1-7). Cap: Captopril.
51
4.8 – Influência do bloqueador de canal para cálcio, Anlodipino, nos efeitos da
Ang (1-7) em anéis de aorta isolados de ratos submetidos a sobrecarga
pressórica
O pré-tratamento in vitro com o bloqueador de canal para cálcio, Anlodipino 1
µM, restaurou o relaxamento induzido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos CoA(
Figura 19A).
A
0
% Relaxamento
5
*
*
*
*
10
*
*
* *
*
* *
*
*
*
*
Sham, n=13
*
*
CoA, n=12
*
15
20
25
CoA + Anlo agudo, n=4
30
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [Ang-(1-7)] (mol/L)
Figura 19 – Efeitos do Anlodipino na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7). (A) Efeitos do prétratamento (10 min) com Anlodipino (10-6 mol / L) na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis
de aorta de ratos CoA. Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média e analisados por
Two Way ANOVA seguido pelo pós-teste LSD de Fisher. * p<0,05 comparados com CoA. CoA:
coarctação de aorta abdominal. Ang-(1-7): angiotensina (1-7). Anlo: Anlodipino.
52
5- DISCUSSÃO
Os principais achados deste estudo são que (I) o efeito vasorrelaxante da
Ang-(1-7) foi reduzido em anéis de aorta de animais submetidos a sobrecarga
pressórica; (II) o tratamento in vitro com losartan, captopril ou anlodipino (1 µmol/L)
ou (III) in vivo com losartan, captopril ou anlodipino (5 mg/kg/dia) melhoraram a
resposta vasorrelaxante induzida por Ang-(1-7) em animais CoA.
Como esperado a Ang-(1-7) produziu vasorrelaxamento dos anéis de aorta
torácica dos ratos controle (Sham). O efeito vasorrelaxante/dilatador da Ang-(1-7) já
foi descrito em vários leitos vasculares (37–39), incluindo anéis de aorta de ratos
(40,92). As ações vasodilatadoras em anéis de aorta de ratos promovido pela Ang(1-7) foi primeiramente demonstrado por le Tran & Forster (91) , que também
mostraram que este efeito é dependente do endotélio.
Neste trabalho, observou-se que Ang-(1-7) tem o relaxamento prejudicado em
aortas de animais CoA. Stanek et al. (90) mostraram que a coartação da aorta
abdominal em ratos promove aumento da pressão arterial e consequentemente,
perda da função endotelial. Isto está de acordo com outros trabalhos, que mostram
que a hipertensão arterial causa disfunção endotelial em humanos e modelos
animais. Taddei et al. (91) demonstraram que na hipertensão arterial humana há
redução da biodisponibilidade de .NO através da produção de prostanóides e
radicais livres. Esta alteração foi documentantada tanto na macro quanto na
microcirculação periférica, coronáriana e renal. Além disso, Takai et al. (79)
evidenciaram que ratos espontaneamente hipertensos (SHR) tem disfunção
endotelial. No entanto, observou-se que o tratamento com ARA ou iECA em ratos
SHR diminuem a pressão arterial, além de melhorar o vasorrelaxamento AChdependente em anéis de aorta, demonstrando-se, assim, uma melhora na função
endotelial desses animais (95).
Em nosso modelo experimental, o tratamento crônico com losartan 1
mg/kg/dia (dose subpressórica) não foi capaz de restaurar o efeito vasorrelaxante da
Ang-(1-7). Além disso,este tratamento também não melhorou o vasorrelaxamento
promovido pela ACh, ou seja,a função endotelial permaneceu prejudicada nesses
animais, o que pode explicar , ao menos em parte, a ausência na melhora do efeito
vasorrelaxante da Ang-(1-7). Por outro lado, o tratamento crônico com losartan
53
5mg/kg/dia (dose subpressórica) melhorou o efeito vasorrelaxante promovido pela
Ang-(1-7). Além disso, o tratamento com losartan nessa dosagem promoveu uma
melhora na resposta vasorrelaxante a ACh. Sugere-se, portanto, que há uma
melhora na função endotelial e, em paralelo, uma melhora do vasorrelaxamento
promovido por Ang-(1-7) (69). Le Tran & Forster (39) mostraram que o losartan foi
capaz de melhorar o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos
sem endotélio. Estes resultados corroboram com os dados obtidos em nosso estudo,
onde observou-se que os anéis de aorta de ratos submetidos a sobrecarga
pressórica (CoA) pré-tratados com losartan tiveram o efeito vasorrelaxante
promovido pela Ang-(1-7) restaurado.
É importante ressaltar que na presença do antagonista do receptor Mas, A779, esse efeito foi abolido, o que mostra que o efeito vasorrelaxante é dependente
do receptor Mas. Além disso, a inibição da atividade da eNOS pelo L-NAME aboliu o
efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) na presença do losartan, sugerindo assim a
participação do .NO na resposta da Ang-(1-7). Este resultado também sugere mais
uma vez que o tratamento com losartan está relacionado com a melhora da função
endotelial. Silva el at. (2007) observaram que tanto em anéis de aorta sem endotélio
quanto em anéis de aorta tratados com L-NAME, o efeito vasorrelaxante da Ang-(17) foi abolido.De forma semelhante ao efeito obtido com losartan 5 mg/kg/dia, o prétratamento confirma a melhora obtida com Ang-(1-7) em animais CoA. Esta melhora,
provavelmente, também está relacionada com liberação de NO além da produção de
prostaglandinas vasodilatadoras (39,40,96). Uma possível hipótese para o efeito in
vitro do losartan seria uma possível interação entre receptores angiotensinérgicos.
Diferentes grupos vêm propondo um possível antagonismo funcional, crosstalk e/ou
oligomerização entre estes receptores. Por exemplo, Kostenis et al. (2005)
comprovaram que o receptor Mas pode hetero-oligomerizar com receptor AT 1, e
assim diminuir as ações promovidas pela Ang II.
Visto que houve uma melhora no vasorrelaxamento de anéis de aorta dos
animais CoA pré-tratados com losartan, passamos a avaliar se outros fármacos antihipertensivos teriam efeitos semelhantes. O tratamento in vitro dos anéis de aorta de
animais CoA com captopril 1 µmol/L também foi eficiente em restaurar a resposta
vasorrelaxante de Ang-(1-7). Em contraste, Silva et al. (2007) demonstraram o
inibidor da ECA não alterou o efeito vasorrelaxante de Ang-(1-7) em anéis de aorta
54
de ratos normotensos. Esta diferença para os nossos resultados pode ser decorrente
do modelo animal, uma vez que em nosso trabalho foram utilizados ratos
hipertensos.
O tratamento in vivo com captopril 1 mg/kg/dia por 21 dias também não foi
suficiente para melhorar o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) prejudicado nos
animais CoA. O mesmo foi visto quando avaliou-se a função endotelial, onde nessa
dose também não houve melhora na resposta para ACh. No entanto, quando foi
realizado tratamento com uma dose maior de captopril, 5mg/kg/dia, observou-se
uma melhora na resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7), bem como para ACh e NPS.
Estes dados sugerem que a melhora na função endotélial e no músculo liso vascular
pelo iECA pode estar relacionado à melhora do efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7). O
efeito do iECA pode ser decorrente de três mecanismos: (I) diminuição da razão
angiotensina II/angiotensina I, ou seja, diminuindo Ang II circulante promoveria a
vasoconstrição, (II) a redução da Ang II levaria a um aumento da formação de mais
Ang-(1-7) através de Ang I e (III) a diminuição na degradação de bradicina pela ECA
favoreceria a vasodilatação. Vários trabalhos demonstram que os iECA aumentam
os níveis circulantes de Ang-(1-7) (98,99). Kohara et al. (1993) mostraram que o
tratamento crônico em ratos Wistar e SHR com iECA aumentaram a atividade de
renina e os níveis de Ang I e Ang-(1-7) no plasma, sendo que este heptapeptídeo foi
o peptídeo que mais se elevou. Em outro estudo,
Deddish et al. (1998)
demonstraram que Ang-(1-7) é um substrato seletivo para o domínio N e um inibidor
do domínio C da ECA. Isso faz com que esta enzima se torne uma via importante de
inativação da Ang-(1-7) circulante e possivelmente tecidual. Neste mesmo estudo foi
visto que a Ang-(1-7) potencializa a atividade da bradicinina, porém ela não atua
diretamente em receptores cininérgicos. No entanto, a Ang-(1-7) estimula a liberação
de ácido araquidônio que, por sua vez, ativa receptores B2, estimulando, assim, a
liberação de .NO. Portanto, Ang-(1-7) atua deforma indireta na liberação de NO por
receptores B2.
Avaliou-se também se o bloqueio do canal de cálcio teria alguma influência no
vasorrelaxamento promovido pela Ang-(1-7) em animais submetidos a sobrecarga
pressórica. O pré-tratamento in vitro com anlodipino melhorou o vasorrelaxamento
promovido pela Ang-(1-7) em animais CoA. Os bloqueadores de canais para cálcio
tem como principal ação a diminuição da entrada de cálcio para o meio intracelular,
55
reduzindo-se a atividade contrátil do músculo liso vascular(102). Desta forma, uma
hipótese para a melhora do efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) pelo anlodipino seria
pela diminuição da atividade da via responsável pela contração do músculo liso
vascular favorecendo assim os mecanismos dilatadores da Ang-(1-7). Observou-se
também, que o vasorrelaxamento foi maior nas aortas dos ratos CoA pré-tratadas
com Anlodipino quando comparado aos animais “Sham”. Provavelmente, isto pode
ser decorrente do menor efeito vasoconstritor promovido pela Phe na presença de
Anlodipino, o que influenciou no resultado percentual do relaxamento.
Vários trabalhos vêm mostrando também que anlodipino estimula a geração
de .NO, exercendo portanto, efeitos cardio e vasculoprotetores (103–105). Neste
trabalho, também foi avaliada a influência do tratamento crônico com anlodipino (in
vivo) nas ações da Ang-(1-7). Observou-se que o tratamento com anlodipino
1mg/kg/dia não foi capaz de melhorar o efeito vasorrelaxante de Ang-(1-7). Além
disso, também não foi observado melhora na resposta vasorrelaxante da ACh ou
NPS. No entanto, quando foi realizado tratamento com uma dose maior de
anlodipino (5mg/kg/dia), observou-se uma melhora na resposta vasorrelaxante da
Ang-(1-7), bem como para ACh e NPS, mostrando então que a melhora na função
endotelial e no músculo liso vascular com BCC também favorece o efeito
vasorrelaxante de Ang-(1-7). Os BCC reduzem o estresse oxidativo na vasculatura e
melhoram a vasodilatação endotélio depentente em ratos infundidos com Ang II.
Além disso, BCC exercem efeitos anti-oxidantes que melhoram a formação de .NO
através do aumento da expressão da eNOS (106,107). Alguns trabalhos
demonstraram que BCCs associados aos BRA diminuem o stress oxidativo em
modelos de hipertensão e lesão vascular (80,108,109). Jinno et al. (105) observaram
que o BCC, azeldipino inibiu a lesão vascular provocada por cuff na artéria femoral e
que azeldipino combinado com o BRA, em doses subpressóricas, pode exercer
efeito sinérgico diminuindo o stress oxidativo.Assim, o efeito benéfico do anlodipino
na vasodilatação Ang-(1-7)-dependente pode estar relacionado à atenuação do
estress oxidativo nos animais CoA.
Alguns trabalhos propôem a participação da ECA2 nas funções vasculares
(111,112). Por exemplo, Lovren et al. (108) demonstraram que anéis de aorta de
camundongos knockout para ECA2 tiveram prejuízo no relaxamento dependente de
endotélio quando comparados com camundongos selvagens. No presente estudo,
56
avaliou-se se o tratamento crônico do provável ativador da ECA2 poderia melhor o
relaxamento induzido pela Ang-(1-7). Os tratamentos crônicos com DIZE, 1
mg/kg/dia ou 5 mg/kg/dia, não foram efetivos em melhorar o vasorrelaxamento
promovido por Ang-(1-7) em animais CoA. Resultados prévios do nosso laboratório
mostraram que o tratamento com DIZE 1 mg/kg/dia também não melhora a
disfunção endotelial decorrente da sobrecarga pressórica. Por outro lado, o
tratamento com DIZE 5mg/kg/dia demonstrou uma discreta melhora na função
endotelial de animais submetidos a sobrecarga pressórica, porém essa ação não foi
observada com NPS, que é um vasodilatador independente de endotélio,
observando-se, portanto que, a ação é mediada pelo endotélio. No entanto, Qi et al.
(2013) demonstraram que o tratamento com DIZE 15 mg/kg/dia por 4 semanas em
modelo de ratos infartados aumentou a atividade plasmática da ECA2 e diminuiu a
razão ECA/ECA2. Além disso, houve um aumento na expressão protéica do receptor
Mas e também das células progenitoras endoteliais circulantes e cardiaca. Assim,
sugere-se que a ausência do efeito benéfico do DIZE em nosso trabalho seja pela
dose menor do que as usadas em outros trabalhos.
Sumarizando, nossos resultados mostraram que o pré-tratamento, in vitro, com
losartan, captopril ou anlodipino restauraram o efeito vasorrelaxante promovido por
Ang-(1-7) em anéis de aorta de animais submetidos a sobrecarga pressórica. No
entanto, o tratamento in vivo dos animais CoA com losartan, captopril, ou anlodipino
na dosagem de 1 mg/kg/dia e DIZE , 1 e 5 mg/kg/dia não foram efetivos em melhorar
o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7). Entretanto, doses maiores de losartan, captopril
ou anlodipino (5mg/kg/dia) melhoraram a resposta vasorrelaxante induzida por Ang(1-7) em animais CoA. Nossos dados também demonstram que fármacos antihipertensivos em doses baixas potencializam os efeitos vasodilatadores da ang1-7,
exercendo um papel benéfico no controle das funções cardiovasculares em condição
patológica.
57
6- CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos, conclui-se que:
- Anéis de aorta de ratos submetidos a sobrecarga pressórica tem o efeito
vasorrelaxante promovido por ACh prejudicado
- Anéis de aorta de ratos submetidos a sobrecarga pressórica tem o efeito
vasorrelaxante promovido por Ang-(1-7) prejudicado.
- O tratamento in vivo com 1mg/kg/dia de losartan, captopril ou anlodipino não
melhora o efeito vasorrelaxante promovido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos
submetidos a sobrecarga pressórica.
- O tratamento in vivo com 5mg/kg/dia de losartan, captopril ou anlodipino melhora o
efeito vasorrelaxante promovido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos
submetidos a sobrecarga pressórica.
- O tratamento in vivo com 1 ou 5 mg/kg/dia de DIZE não melhora o efeito
vasorrelaxante promovido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos submetidos a
sobrecarga pressórica.
- A incubaçãoin vitro com losartan, captopril ou anlodipino 1µMol/L restaura o efeito
vasorrelaxante promovido por Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos submetidos a
sobrecarga pressórica.
58
Fármaco
Dose
mg/kg/dia
in vivo
1
-
5
+
1
-
5
+
1
-
5
+
1
-
5
-
Losartan
Captopril
Anlodipino
Dize
Concentração
in vitro
1 µMol/L
+
1 µMol/L
+
1 µMol/L
+
-----
-----
Quadro 1 – Influência de fármacos anti-hipertensivos na resposta vascular da Ang-(1-7) de ratos
submetidos a sobrecarga pressórica. - não melhorou / + melhorou
Estes resultados indicam que fármacos anti-hipertensivos utilizados em doses
subpressóricas são capazes de melhorar as ações vasodilatadoras promovidas pela
Ang-(1-7). Diante disso, sugere-se que a utilização de Ang-(1-7) associada a doses
baixas de fármacos anti-hipertensivos, pode ser uma nova ferramenta terapêutica
para o tratamento da hipertensão arterial.
59
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.
Abramov D, Carson PE. The role of angiotensin receptor blockers in reducing
the risk of cardiovascular disease. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst.
2012;13:317–27.
2.
Ram CVS. The Evolving Definition of Systemic Hypertension. Am J Cardiol.
2007;99:1168–70.
3.
Sociedade Brasileira de Cardiologia / Sociedade Brasileira de Hipertensão /
Sociedade Brasileira deNefrologia. VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão.
Arq Bras Cardiol. 2010;95(1 supl.1–51.
4.
Gradman AH, Basile JN, Carter BL, Bakris GL, Materson BJ, Black HR, et al.
Combination therapy in hypertension. J Am Soc Hypertens. 2010;4:90–8.
5.
Sood N, Reinhart KM, Baker WL. Combination therapy for the management of
hypertension: A review of the evidence. Am J Health Syst Pharm.
2010;67:885–94.
6.
Ferrario CM. Angiotensin-converting enzyme 2 and angiotensin-(1-7): An
evolving story in cardiovascular regulation. Hypertension. 2006. p. 515–21.
7.
Santos RA, Ferreira AJ. Angiotensin-(1-7) and the renin-angiotensin system.
Curr Opin Nephrol Hypertens. 2007;16(2):122–8.
8.
Katovich MJ, Grobe JL, Raizada MK. Angiotensin-(1-7) as an antihypertensive,
antifibrotic target. Current Hypertension Reports. 2008. p. 227–32.
9.
Santos RA, Campagnole-Santos MJ, Andrade SP. Angiotensin-(1-7): an
update. Regul Pept. 2000;91(1-3):45–62.
10.
Peiro C, Vallejo S, Gembardt F, Azcutia V, Heringer-Walther S, RodriguezManas L, et al. Endothelial dysfunction through genetic deletion or inhibition of
the G protein-coupled receptor Mas: a new target to improve endothelial
function. J Hypertens. 2007;25(12):2421–5.
11.
Stephen J Cleland JLR. The renin-angiotensin system and the heart: a
historical review. BMJ Gr. 1996;76:7–12.
12.
SKEGGS LT, KAHN JR, SHUMWAY NP. The preparation and function of the
hypertensin-converting enzyme. J Exp Med. 1956;103:295–9.
13.
Inagami T. A memorial to Robert Tiegerstedt: the centennial of renin discovery.
Hypertension. 1998;32(6):953–7.
14.
Atlas SA. The renin-angiotensin system revisited: classical and nonclassical
pathway of angiotensin formation. Mt Sinai J Med. 1998;65(2):87–96.
60
15.
Vane JR. The history of inhibitors of angiotensin converting enzyme. J Physiol
Pharmacol. 1999 Dec;50(4):489–98.
16.
Ferreira AJ, Murça TM, Fraga-Silva R a, Castro CH, Raizada MK, Santos R a
S. New cardiovascular and pulmonary therapeutic strategies based on the
Angiotensin-converting enzyme 2/angiotensin-(1-7)/mas receptor axis. Int J
Hypertens. 2012;2012:147825.
17.
Belova LA. Angiotensin II-generating enzymes. Biochemistry (Mosc).
2000;65:1337–45.
18.
Lautner RQ, Villela DC, Fraga-Silva RA, Silva N, Verano-Braga T, Costa-Fraga
F, et al. Discovery and characterization of alamandine: a novel component of
the renin-angiotensin system. Circ Res. 2013;112:1104–11.
19.
Kinugawa S, Post H, Kaminski PM, Zhang X, Xu X, Huang H, et al. Coronary
microvascular endothelial stunning after acute pressure overload in the
conscious dog is caused by oxidant processes: the role of angiotensin II type 1
receptor and NAD(P)H oxidase. Circulation. 2003/12/06 ed.
2003;108(23):2934–40.
20.
Kaschina E, Unger T. Angiotensin AT1/AT2 receptors: regulation, signalling
and function. Blood Press. 2003;12:70–88.
21.
Lemarié CA, Schiffrin EL. The angiotensin II type 2 receptor in cardiovascular
disease. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2010;11:19–31.
22.
Santos RA, Ferreira AJ, Pinheiro S V, Sampaio WO, Touyz R, CampagnoleSantos MJ. Angiotensin-(1-7) and its receptor as a potential targets for new
cardiovascular drugs. Expert Opin Investig Drugs. 2005;14(8):1019–31.
23.
Schiavone MT, Santos RA, Brosnihan KB, Khosla MC, Ferrario CM. Release of
vasopressin from the rat hypothalamo-neurohypophysial system by
angiotensin-(1-7) heptapeptide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85(11):4095–
8.
24.
Ferreira AJ, Santos RAS. Cardiovascular actions of angiotensin-(1-7). Braz J
Med Biol Res. 2005 Apr;38(4):499–507.
25.
Fyhrquist F, Saijonmaa O. Renin-angiotensin system revisited. J Intern Med.
2008;264(3):224–36.
26.
Vickers C, Hales P, Kaushik V, Dick L, Gavin J, Tang J, et al. Hydrolysis of
biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related
carboxypeptidase. J Biol Chem. 2002;277(17):14838–43.
27.
Santos RA, Brosnihan KB, Chappell MC, Pesquero J, Chernicky CL, Greene
LJ, et al. Converting enzyme activity and angiotensin metabolism in the dog
brainstem. Hypertension. 1988;11(2 Pt 2):I153–7.
61
28.
Chappell MC, Brosnihan KB, Diz DI, Ferrario CM. Identification of angiotensin(1-7) in rat brain. Evidence for differential processing of angiotensin peptides. J
Biol Chem. 1989;264:16518–23.
29.
Campagnole-Santos MJ, Diz DI, Santos RA, Khosla MC, Brosnihan KB,
Ferrario CM. Cardiovascular effects of angiotensin-(1-7) injected into the dorsal
medulla of rats. Am J Physiol. 1989;257(1 Pt 2):H324–9.
30.
Jaiswal N, Diz DI, Chappell MC, Khosla MC, Ferrario CM. Stimulation of
endothelial cell prostaglandin production by angiotensin peptides.
Characterization of receptors. Hypertension. 1992;19:II49–I55.
31.
Santos RA, Simoes e Silva AC, Maric C, Silva DM, Machado RP, de Buhr I, et
al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled
receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(14):8258–63.
32.
Donoghue M, Hsieh F, Baronas E, Godbout K, Gosselin M, Stagliano N, et al.
A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase (ACE2)
converts angiotensin I to angiotensin 1-9. Circ Res. 2000;87(5):E1–9.
33.
Tipnis SR, Hooper NM, Hyde R, Karran E, Christie G, Turner AJ. A human
homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloning and functional expression
as a captopril-insensitive carboxypeptidase. J Biol Chem. 2000;275(43):33238–
43.
34.
Elased KM, Cunha TS, Gurley SB, Coffman TM, Morris M. New mass
spectrometric assay for angiotensin-converting enzyme 2 activity.
Hypertension. 2006;47:1010–7.
35.
Ferreira AJ, Santos RA, Almeida AP. Angiotensin-(1-7) improves the postischemic function in isolated perfused rat hearts. Braz J Med Biol Res.
2002;35(9):1083–90.
36.
Castro CH, Santos RA, Ferreira AJ, Bader M, Alenina N, Almeida AP.
Evidence for a functional interaction of the angiotensin-(1-7) receptor Mas with
AT1 and AT2 receptors in the mouse heart. Hypertension. 2005;46(4):937–42.
37.
Ren Y, Garvin JL, Carretero OA. Vasodilator action of angiotensin-(1-7) on
isolated rabbit afferent arterioles. Hypertension. 2002;39(3):799–802.
38.
Feterik K, Smith L, Katusic ZS. Angiotensin-(1-7) causes endotheliumdependent relaxation in canine middle cerebral artery. Brain Res.
2000;873(1):75–82.
39.
Porsti I, Bara AT, Busse R, Hecker M. Release of nitric oxide by angiotensin(1-7) from porcine coronary endothelium: implications for a novel angiotensin
receptor. Br J Pharmacol. 1994;111(3):652–4.
62
40.
Le Tran Y, Forster C. Angiotensin-(1-7) and the rat aorta: modulation by the
endothelium. J Cardiovasc Pharmacol. 1997 Nov;30(5):676–82.
41.
Silva DMR, Vianna HR, Cortes SF, Campagnole-Santos MJ, Santos RAS,
Lemos VS. Evidence for a new angiotensin-(1-7) receptor subtype in the aorta
of Sprague-Dawley rats. Peptides. 2007;28:702–7.
42.
Lemos VS, Silva DMR, Walther T, Alenina N, Bader M, Santos RAS. The
endothelium-dependent vasodilator effect of the nonpeptide Ang(1-7) mimic
AVE 0991 is abolished in the aorta of mas-knockout mice. J Cardiovasc
Pharmacol. 2005;46:274–9.
43.
Savergnini SQ, Beiman M, Lautner RQ, de Paula-Carvalho V, Allahdadi K,
Pessoa DC, et al. Vascular relaxation, antihypertensive effect, and
cardioprotection of a novel peptide agonist of the MAS receptor. Hypertension.
2010;56(1):112–20.
44.
Lee RMKW, Bader M, Alenina N, Santos RAS, Gao Y-J, Lu C. Mas receptors
in modulating relaxation induced by perivascular adipose tissue. Life Sci.
2011;89:467–72.
45.
Curi R, Procopio J. Fisiologia Básica. Koogan G, editor. Rio de Janeiro; 2009.
46.
Furchgott RF, Zawadzki J V. The obligatory role of endothelial cells in the
relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 1980;288:373–6.
47.
SALVADOR MONCADA MWRRMJP. IDENTIFICATION AS NITRIC OXIDE
AND ROLE IN THE CONTROL OF VASCULAR TONE AND PLATELET
FUNCTION. Biochem Pharmacol. 1988;Vol. 37:2495401.
48.
Vane Jr., Angard EE BR. Regulatory Functions of the Vascular Endothelium. N
Engl J Med. 1990;323:27–36.
49.
Laughlin MH, McAllister RM, Jasperse JL, Crader SE, Williams DA, Huxley VH.
Endothelium-medicated control of the coronary circulation. Exercise traininginduced vascular adaptations. Sports Med. 1996;22:228–50.
50.
Oguzhan Yildiz MS and HG. Pharmacology of Arterial Grafts for Coronary
Artery Bypass Surgery. Artery Bypass. 2013;
51.
Ignarro LJ. Endothelium-Derived Relaxing Factor Produced and Released from
Artery and Vein is Nitric Oxide. Proceedings of the National Academy of
Sciences. 1987. p. 9265–9.
52.
Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the
biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature.
1987;327:524–6.
63
53.
Mitchell JA, Ali F, Bailey L, Moreno L, Harrington LS. Role of nitric oxide and
prostacyclin as vasoactive hormones released by the endothelium. Exp
Physiol. 2008;93:141–7.
54.
Feletou M, Vanhoutte PM. Endothelium-dependent hyperpolarization of canine
coronary smooth muscle. Br J Pharmacol. 1988;93:515–24.
55.
Chen G, Suzuki H, Weston AH. Acetylcholine releases endothelium-derived
hyperpolarizing factor and EDRF from rat blood vessels. Br J Pharmacol.
1988;95:1165–74.
56.
Harrison DG. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell
dysfunction. J Clin Invest. 1997 Nov 1;100(9):2153–7.
57.
Pearl RG, Rosenthal MH, Murad F, Ashton JP. Aminophylline potentiates
sodium nitroprusside-induced hypotension in the dog. Anesthesiology.
1984;61:712–5.
58.
McGuire JJ, Ding H, Triggle CR. Endothelium-derived relaxing factors: A focus
on endothelium-derived hyperpolarizing factor(s). Canadian Journal of
Physiology and Pharmacology. 2001; p. 443–70.
59.
AL W. Vascular endothelium: the history of a recent revolution in angiology.
Rev Port Cir Cardiotorac Vasc. 2005;Apr-Jun;12:105–10.
60.
Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure,
function and inhibition. Biochem J. 2001;357:593–615.
61.
Da Luz PL, Laurindo FRM, Chagas ACP. Endotélio & doenças
cardiovasculares. 1a edição. Atheneu E, editor. São Paulo; 2005.
62.
Stuehr DJ, Fasehun OA, Kwon NS, Gross SS, Gonzalez JA, Levi R, et al.
Inhibition of macrophage and endothelial cell nitric oxide synthase by
diphenyleneiodonium and its analogs. FASEB J. 1991;5:98–103.
63.
Herrmann J, Lerman L, Lerman A. Simply say yes to NO? Nitric oxide (NO)
sensor-based assessment of coronary endothelial function. Eur Heart J. 2010
Dec;31(23):2834–6.
64.
Kinoshita H, Milstien S, Wambi C, Katusic ZS. Inhibition of tetrahydrobiopterin
biosynthesis impairs endothelium-dependent relaxations in canine basilar
artery. Am J Physiol. 1997;273:H718–H724.
65.
Mizuno Y, Jacob RF, Mason RP. Effects of calcium channel and reninangiotensin system blockade on intravascular and neurohormonal mechanisms
of hypertensive vascular disease. Am J Hypertens. 2008;21:1076–85.
64
66.
Santos RA, Brosnihan KB, Jacobsen DW, DiCorleto PE, Ferrario CM.
Production of angiotensin-(1-7) by human vascular endothelium. Hypertension.
1992;19(2 Suppl):II56–61.
67.
Chappell MC, Pirro NT, Sykes A, Ferrario CM. Metabolism of angiotensin-(1-7)
by angiotensin-converting enzyme. Hypertension. 1998;31(1 Pt 2):362–7.
68.
Burrell LM, Johnston CI, Tikellis C, Cooper ME. ACE2, a new regulator of the
renin-angiotensin system. Trends Endocrinol Metab. 2004/04/28 ed.
2004;15(4):166–9.
69.
Sampaio WO, Souza dos Santos RA, Faria-Silva R, da Mata Machado LT,
Schiffrin EL, Touyz RM. Angiotensin-(1-7) through receptor Mas mediates
endothelial nitric oxide synthase activation via Akt-dependent pathways.
Hypertension. 2007;49(1):185–92.
70.
Muthalif MM, Benter IF, Uddin MR, Harper JL, Malik KU. Signal transduction
mechanisms involved in angiotensin-(1-7)-stimulated arachidonic acid release
and prostanoid synthesis in rabbit aortic smooth muscle cells. J Pharmacol Exp
Ther. 1998;284(1):388–98.
71.
Faria-Silva R, Duarte F V, Santos RA. Short-term angiotensin(1-7) receptor
MAS stimulation improves endothelial function in normotensive rats.
Hypertension. 2005;46(4):948–52.
72.
Xu P, Costa-Goncalves AC, Todiras M, Rabelo LA, Sampaio WO, Moura MM,
et al. Endothelial dysfunction and elevated blood pressure in MAS genedeleted mice. Hypertension. 2008;51(2):574–80.
73.
De la Sierra A. Renin–angiotensin system blockade and reduction of
cardiovascular risk: future perspectives. Expert Review of Cardiovascular
Therapy. 2011. p. 1585–91.
74.
Imanishi T, Tsujioka H, Ikejima H, Kuroi A, Takarada S, Kitabata H, et al. Renin
inhibitor aliskiren improves impaired nitric oxide bioavailability and protects
against atherosclerotic changes. Hypertension. 2008;52:563–72.
75.
Iwai M, Nakaoka H, Senba I, Kanno H, Moritani T, Horiuchi M. Possible
involvement of angiotensin-converting enzyme 2 and Mas activation in
inhibitory effects of angiotensin II Type 1 receptor blockade on vascular
remodeling. Hypertension. 2012;60:137–44.
76.
Gjymishka A, Kulemina L V, Shenoy V, Katovich MJ, Ostrov DA, Raizada MK.
Diminazene Aceturate Is an ACE2 Activator and a Novel Antihypertensive
Drug. FASEB J . 2010 Apr 6;24 (1_MeetingAbstracts ):1032.3.
77.
Van der Vring JAFM, Daniëls MCG, Holwerda NJH, Withagen PJAM, Schelling
A, Cleophas TJ, et al. Combination of calcium channel blockers and βadrenoceptor blockers for patients with exercise-induced angina pectoris: a
65
double-blind parallel-group comparison of different classes of calcium channel
blockers. Br J Clin Pharmacol. 1999;47:493–8.
78.
Elliott WJ, Ram CVS. Calcium channel blockers. J Clin Hypertens (Greenwich).
2011;13:687–9.
79.
Colucci WS, Fifer MA LB. Calcium channel blockers in congestive heart failure:
Theoretic considerations and clinical experience. Am J Med. 1985;78 (suppl .
80.
Li J-M, Iwai M, Cui T-X, Min L-J, Tsuda M, Iwanami J, et al. Effect of
azelnidipine on angiotensin II-mediated growth-promoting signaling in vascular
smooth muscle cells. Mol Pharmacol. 2005;67:1666–73.
81.
Toba H, Shimizu T, Miki S, Inoue R, Yoshimura A, Tsukamoto R, et al. Calcium
[corrected] channel blockers reduce angiotensin II-induced superoxide
generation and inhibit lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1
expression in endothelial cells. Hypertens Res. 2006;29:105–16.
82.
Takai S, Jin D, Aritomi S, Niinuma K, Miyazaki M. Powerful vascular protection
by combining cilnidipine with valsartan in stroke-prone, spontaneously
hypertensive rats. Hypertens Res. 2013;36:342–8.
83.
Van Zwieten PA, De Jonge A, Timmermans PB. Inhibitors of the angiotensin I
converting enzyme as antihypertensive drugs. Pharm Weekbl Sci. 1983;5:197–
204.
84.
Jamerson KA, Nwose O, Jean-Louis L, Schofield L, Purkayastha D, Baron M.
Initial angiotensin-converting enzyme inhibitor/calcium channel blocker
combination therapy achieves superior blood pressure control compared with
calcium channel blocker monotherapy in patients with stage 2 hypertension.
Am J Hypertens. 2004;17(6):495–501.
85.
Philipp T, Smith TR, Glazer R, Wernsing M, Yen J, Jin J, et al. Two multicenter,
8-week, randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-group studies
evaluating the efficacy and tolerability of amlodipine and valsartan in
combination and as monotherapy in adult patients with mild to moderate
essential hyperten. Clinical therapeutics. Excerpta Medica,; 2007. p. 563–80.
86.
Qi Y, Zhang J, Cole-Jeffrey CT, Shenoy V, Espejo A, Hanna M, et al.
Diminazene aceturate enhances angiotensin-converting enzyme 2 activity and
attenuates ischemia-induced cardiac pathophysiology. Hypertension.
2013;62:746–52.
87.
Dasgupta C, Zhang L. Angiotensin II receptors and drug discovery in
cardiovascular disease. Drug Discovery Today. 2011. p. 22–34.
88.
Shi L, Mao C, Xu Z, Zhang L. Angiotensin-converting enzymes and drug
discovery in cardiovascular diseases. Drug Discovery Today. 2010. p. 332–41.
66
89.
Ferrario CM, Chappell MC, Tallant EA, Brosnihan KB, Diz DI.
Counterregulatory actions of angiotensin-(1-7). Hypertension. 1997;30(3 Pt
2):535–41.
90.
Brosnihan KB, Li P, Tallant EA, Ferrario CM. Angiotensin-(1-7): a novel
vasodilator of the coronary circulation. Biol Res. 1998;31(3):227–34.
91.
Vanhoutte PM, Boulanger CM. Endothelium-Dependent Responses in
Hypertension. Hypertens Res. 1995;18(2):87–98.
92.
Silva DM, Vianna HR, Cortes SF, Campagnole-Santos MJ, Santos RA, Lemos
VS. Evidence for a new angiotensin-(1-7) receptor subtype in the aorta of
Sprague-Dawley rats. Peptides. 2007;28(3):702–7.
93.
Stanek KA, Coleman TG, Murphy WR. Overall hemodynamic pattern in
coarctation of the abdominal aorta in conscious rats. Hypertension.
1987;9:611–8.
94.
Taddei S, Virdis A, Ghiadoni L, Salvetti A. The role of endothelium in human
hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 1998;7:203–9.
95.
Rodrigo E, Maeso R, Muñoz-García R, Navarro-Cid J, Ruilope LM, Cachofeiro
V, et al. Endothelial dysfunction in spontaneously hypertensive rats:
consequences of chronic treatment with losartan or captopril. J Hypertens.
1997;15:613–8.
96.
Jaiswal N, Tallant EA, Jaiswal RK, Diz DI, Ferrario CM. Differential regulation
of prostaglandin synthesis by angiotensin peptides in porcine aortic smooth
muscle cells: subtypes of angiotensin receptors involved. J Pharmacol Exp
Ther. 1993;265:664–73.
97.
Kostenis E, Milligan G, Christopoulos A, Sanchez-Ferrer CF, Heringer-Walther
S, Sexton PM, et al. G-protein-coupled receptor Mas is a physiological
antagonist of the angiotensin II type 1 receptor. Circulation. 2005;111:1806–13.
98.
Ferrario CM, Jaiswal N, Yamamoto K, Diz DI, Schiavone MT. Hypertensive
mechanisms and converting enzyme inhibitors. Clin Cardiol. 1991;14:IV56–
V62; discussion IV83–V90.
99.
Iyer SN, Ferrario CM, Chappell MC. Angiotensin-(1-7) contributes to the
antihypertensive effects of blockade of the renin-angiotensin system.
Hypertension. 1998;31(1 Pt 2):356–61.
100. Kohara K, Brosnihan KB, Ferrario CM. Angiotensin(1-7) in the spontaneously
hypertensive rat. Peptides. 1993;14:883–91.
101. Deddish PA, Marcic B, Jackman HL, Wang HZ, Skidgel RA, Erdös EG. Ndomain-specific substrate and C-domain inhibitors of angiotensin-converting
enzyme: angiotensin-(1-7) and keto-ACE. Hypertension. 1998;31:912–7.
67
102. Breemen C van. Cellular mechanisms regulating [Ca2+]i smooth muscle. Ann
rev Physiol. 1989;51:315–29.
103. Burges RA, Gardiner DG, Gwilt M, Higgins AJ, Blackburn KJ, Campbell SF, et
al. Calcium channel blocking properties of amlodipine in vascular smooth
muscle and cardiac muscle in vitro: evidence for voltage modulation of vascular
dihydropyridine receptors. J Cardiovasc Pharmacol. 1987;9:110–9.
104. Batova S, DeWever J, Godfraind T, Balligand JL, Dessy C, Feron O. The
calcium channel blocker amlodipine promotes the unclamping of eNOS from
caveolin in endothelial cells. Cardiovasc Res. 2006;71:478–85.
105. Sharma A, Trane A, Yu C, Jasmin JF, Bernatchez P. Amlodipine increases
endothelial nitric oxide release by modulating binding of native eNOS protein
complex to caveolin-1. Eur J Pharmacol. 2011;659:206–12.
106. Fukutomi M, Hoshide S, Mizuno H, Kario K. Differential effects of
aliskiren/amlodipine combination and high-dose amlodipine monotherapy on
endothelial function in elderly hypertensive patients. Am J Hypertens.
2014;27:14–20.
107. Koh KK, Han SH, Ahn JY, Chung W-J, Lee Y, Shin EK. Amlodipine improves
endothelial function and metabolic parameters in patients with hypertension. Int
J Cardiol. 2009;133:23–31.
108. Inaba S, Iwai M, Tomono Y, Senba I, Furuno M, Kanno H, et al. Prevention of
vascular injury by combination of an AT1 receptor blocker, olmesartan, with
various calcium antagonists. Am J Hypertens. 2009;22:145–50.
109. Yamamoto E, Kataoka K, Dong YF, Koibuchi N, Toyama K, Sueta D, et al.
Calcium channel blockers, more than diuretics, enhance vascular protective
effects of angiotensin receptor blockers in salt-loaded hypertensive rats. PLoS
One. 2012;7.
110. Jinno T, Iwai M, Li Z, Li J-M, Liu H-W, Cui T-X, et al. Calcium channel blocker
azelnidipine enhances vascular protective effects of AT1 receptor blocker
olmesartan. Hypertension. 2004;43:263–9.
111. Rabelo LA, Alenina N, Bader M. ACE2-angiotensin-(1-7)-Mas axis and
oxidative stress in cardiovascular disease. Hypertens Res. 2011;34:154–60.
112. Fraga-Silva RA, Costa-Fraga FP, Murça TM, Moraes PL, Martins Lima A,
Lautner RQ, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 activation improves
endothelial function. Hypertension. 2013;61:1233–8.
113. Lovren F, Pan Y, Quan A, Teoh H, Wang G, Shukla PC, et al. Angiotensin
converting enzyme-2 confers endothelial protection and attenuates
atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008;295:H1377–H1384.
68