AVALIAÇÃO COMPARATIVA ENTRE O

ARS VETERINARIA, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 3, 347-352, 2004.
ISSN 0102-6380
AVALIAÇÃO COMPARATIVA ENTRE O DIAGNÓSTICO
SOROLÓGICO E O ENSAIO DA PCR EM ANIMAIS
INFECTADOS POR Trypanosoma evansi
(EVALUATION OF PCR DETECTION OF Trypanosoma evansi
IN INFECTED ANIMALS: COMPARISON WITH SEROLOGICAL DIAGNOSIS)
(EVALUACIÓN COMPARATIVA ENTRE EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y EL ENSAYO
DE PCR EN ANIMALES INFECTADOS POR Trypanosoma evansi)
L.P.C.T. AQUINO1, K.R. LEMOS1, L.C. MARQUES2, R.Z. MACHADO3
SUMMARY
The aim of this study was to evaluate the efficacy of a polymerase chain reaction (PCR) protocol using oligonucleotide
primers which anneal specifically with a DNA sequence of akinetoplastic T. evansi strains. Sensitivity of PCR was investigated
using serial dilutions of parasited blood from experimentally infected rat. Blood samples containing 5,7x106, 2,85x106, 1,43x106,
7,13x105, 5,7x105, 5,7x104, 2,85x104, 1,43x104, 7,13x103, 5,7x103 and 3,8x103 tripomastigotes/ml were tested. Sera obtained from
dogs and horses from Pantanal of Mato Grosso do Sul were assayed by indirect ELISA-test for presence of anti-T. evansi
antibodies and blood from serologically positive animals were subjected to PCR. The expected 315 bp amplified product
could be detected using rat blood with minimal parasitemia of 3,8 x 103 tripomastigotes/ml, which is equivalent to 760
parasites/reaction. No positive PCR results were obtained in field samples from serologically positive dogs and horses.
Despite the relative low sensitivity of this PCR-based test, it should be useful as a complement to serology in epidemiological
studies of T. evansi infection.
KEY-WORDS: Trypanosoma evansi. PCR. ELISA-test.
RESUMO
O presente estudo objetivou avaliar a eficiência da reação em cadeia da polimerase (PCR) empregando como primers,
oligonucleotídeos que se anelam a uma seqüência de DNA de cepas acinetoplásticas de T. evansi. A sensibilidade do ensaio
de PCR empregado foi investigado, utilizando diluições seriadas de sangue parasitado obtido de rato experimentalmente
infectado com T. evansi; amostras contendo 5,7x106, 2,85x106, 1,43x106, 7,13x105, 5,7x105, 5,7x104, 2,85x104, 1,43x104, 7,13x103,
5,7x103, 3,8x103 e 2,85 x103 tripomastigotas/ml foram testadas. Soros obtidos de cães e eqüinos do Pantanal do Mato Grosso
do Sul foram examinados através do ELISA-teste indireto para a presença de anticorpos anti-T.evansi e o sangue dos
animais sorologicamente positivos foram submetidos ao ensaio de PCR. O produto de amplificação esperado de 315bp pode
ser observado em sangue de rato com parasitemia mínima de 3,8 x 103 tripanossomas/ml, o que equivale à detecção de 760
parasitas por reação. Nenhum resultado positivo foi obtido no ensaio das amostras dos cães e eqüinos sorologicamente
positivos colhidas a campo. Apesar da sensibilidade relativamente baixa da PCR empregada, esta técnica pode ser considerada
útil como método diagnóstico complementar à sorologia em estudos epidemiológicos da infecção por T. evansi.
1
Aluno do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV Unesp, Campus de Jaboticabal - SP
2
Professor Titular, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária - FCAV - Unesp.
3
Professor Titular, Departamento de Patologia Veterinária - FCAV - Unesp. Via Professor Paulo Donato Castellane, km 5 14884-900 - Jaboticabal, SP
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L. P. C. T. AQUINO, K. R. LEMOS, L. C. MARQUES, R. Z. MACHADO. Avaliação comparativa entre o diagnóstico sorológico e o ensaio da PCR em animais infectados por
Trypanosoma evansi./Evaluation of PCR detection of Trypanosoma evansi in infected animals: comparison with serological diagnosis / Evaluación comparativa entre
el diagnóstico serológico y el ensayo de PCR en animales infectados por Trypanosoma evansi. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 3, 347-352, 2004.
PALAVRAS-CHAVES: Trypanosoma evansi. PCR. ELISA-teste.
RESUMEN
Este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficiencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando como
primers oligonucleótidos que se anillan a una secuencia de DNA de cepas acinetoplásticas de T. evansi. La sensibilidad del
ensayo de PCR utilizado fue investigada utilizando diluciones seriadas de sangre parasitada, obtenida de ratones
experimentalmente infectados con T. evansi. Muestras conteniendo 5,7x106; 2,85 x106; 1,43x106; 7,13x105; 5,7x105; 5,7x104;
2,85x104; 1,43x104; 7,13x103; 5,7x103; 3,8x103; 2,85x103 tripomastigotes/ml fueron testadas. Suero obtenido de caninos y
equinos del Pantanal de Mato Grosso do Sul fue examinado por medio de ELISA -teste indirecto- para verificar la presencia
de anticuerpos anti-T. evansi y la sangre de los animales seropositivos fue sometida al ensayo de PCR. El producto de
amplificación esperado de 315 bp puede ser observado en sangre de ratas con parasitemia mínima de 3,8x103 tripanosomas/
mL, lo que equivale a la detección de 760 parásitos por reacción. Ningún resultado positivo fue obtenido en el ensayo de las
muestras de caninos y equinos seropositivos recogidas a campo. A pesar de la sensibilidad relativamente baja de la PCR
usada, esta técnica puede ser considerada útil como método diagnóstico complementario a la sserología en estudios
epidemiológicos de la infección por T. evansi.
PALABRAS CLAVE: Tripanosoma evansi. PCR. Teste de ELISA.
INTRODUÇÃO
Trypanosoma evansi é o tripanossoma patogênico
de maior distribuição geográfica que parasita uma ampla
variedade de hospedeiros. Apesar da suceptibilidade da
maioria das espécies domésticas, o grau de patogenicidade
desse protozoário apresenta grande variação de acordo
com a região e o hospedeiro envolvido. Cepas americanas
de T. evansi são altamente patogênicas para eqüinos e
cães, enquanto quatis e capivaras raramente apresentam
sinais da doença, sendo a infecção assintomática nos
bovinos (FRANKE et al., 1994; MARQUES, 1996; AQUINO
et al., 1999; HERRERA et al., 2001). No Brasil a enfermidade
causada por T. evansi é conhecida como “mal das cadeiras”
e tem caráter endêmico no Pantanal mato-grossense, onde
surtos fatais têm sido relatados em eqüinos (SILVA et al.,
1995). Estima-se que no Pantanal essa tripanosomíase afeta
6462 eqüinos de uma população de 49.000 animais, gerando
gastos da ordem de US$ 2,4 milhões (SEIDL et al., 1998).
Os bovinos e os animais silvestres desempenham papel
importante como reservatórios, mantendo a estabilidade
enzoótica da infecção na região (POCHINI, 2000, HERRERA
et al., 2001).
Métodos específicos e sensíveis para o diagnóstico
de tripanossomíases dos animais são particularmente
importantes para avaliar precisamente a taxa de infecção
em uma dada região e o impacto de futuros programas de
controle. O diagnóstico definitivo de infecção ativa por T.
evansi depende da demonstração do parasita através de
métodos parasitológicos convencionais; entretanto, tais
técnicas mostram baixa sensibilidade e se tornam
inapropriadas, uma vez que a parasitemia apresenta caráter
flutuante e é particularmente baixa em estágios crônicos
da doença. O diagnóstico sorológico baseado na detecção
de anticorpos, como o ELISA-teste, tem-se mostrado
altamente sensível (RAE et al., 1989; PAYNE et al., 1991,
AQUINO et al., 1999), entretanto apresenta limitações
quanto à especificidade pela possibilidade de reatividade
cruzada com outros tripanossomatídeos. Recentemente,
técnicas moleculares baseadas em detecção de DNA têm
sido empregadas no diagnóstico das tripanossomíases. A
reação em cadeia da polimerase (PCR) tem-se mostrado
mais sensível que as técnicas parasitológicas
convencionais no diagnóstico da infecção por T. evansi;
no entanto, tais ensaios não são T. evansi específicos
(WUYTS et al., 1994; HOLLAND et al., 2001) ou não são
capazes de amplificar DNA de cepas acinetoplásticas
(ARTAMA et al., 1992) e, conseqüentemente, não
aplicáveis a isolados brasileiros, comprovadamente
acinetoplásticos (VENTURA et al., 2000). Recentemente
um ensaio de PCR baseado na amplificação do fragmento
Te664 específico para T. evansi e presente em cepas
acinetoplásticas mostrou-se específico e sensível na
detecção do parasita, viabilizando o emprego dessa técnica
em isolados brasileiros (VENTURA, 2001).
O presente estudo avaliou a sensibilidade da
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el diagnóstico serológico y el ensayo de PCR en animales infectados por Trypanosoma evansi. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 3, 347-352, 2004.
técnica de PCR na detecção de T. evansi, realizando ensaios
a partir de amostras congeladas de sangue de rato
experimentalmente infectado em diluições seriadas. O
mesmo ensaio foi empregado também em amostras de
sangue de eqüinos e cães do Pantanal mato-grossense,
sorologicamente positivos para T. evansi.
MATERIAL E MÉTODOS
Ratos Wistar foram inoculados por via
intraperitoneal com aproximadamente 106 tripomastigotas
de T. evansi de uma cepa originalmente isolada de um cão
naturalmente infectado (MOREIRA & MACHADO, 1985)
e mantida em nitrogênio. Após a infecção, os animais foram
diariamente examinados para presença de parasitas em
amostras de sangue periférico colhidas da ponta da cauda.
A parasitemia foi determinada utilizando amostra de 5mL
de sangue, dispersa sob lamínula 22 X 22, e os parasitas
contados em 100 campos microscópicos com objetiva de
40X e ocular de 10X. Os resultados foram obtidos pela
multiplicação do número de parasitas pelo fator de
correção do microscópio, segundo técnica preconizada
por BRENER (1961). Amostra de sangue com parasitemia
igual a 5,7x106 tripomastigotas/mL foi colhida em EDTA
por punção cardíaca e imediatamente diluída 1:2, 1:4, 1:8,
1:10, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1000, 1:1500 e 1:2000 em
tampão tris-salina-glicose (TSG) pH 7,8, obtendo-se
parasitemias iguais a 2,85x106, 1,43x106, 7,13x105, 5,7x105,
5,7x104, 2,85x104, 1,43x104, 7,13x103, 5,7x103, 3,8x103, 2,85
x103 tripomastigotas/mL, respectivamente. As amostras
diluídas foram mantidas a -20°C até serem processadas
no ensaio da PCR.
Um total de 98 amostras de eqüinos e 55 amostras
de cães da sub-região de Nhecolândia no Pantanal matogrossense foram testados pelo ELISA-teste indireto para
detecção de anticorpos anti-T. evansi. Aproximadamente
10 mL de sangue foram obtidos por punção da veia jugular
dos referidos animais, colhendo-se 3 mL com EDTA e
armazenando-o a -20°C até sua utilização na PCR e o
volume restante foi processado para obtenção de soro
empregado no ELISA-teste.
O protocolo de ELISA-teste indireto empregado
foi o mesmo descrito por AQUINO et al (1999). O ensaio
utilizado nos soros de eqüinos sofreu algumas adaptações,
a saber: bloqueio da microplaca com PBS-Tween 80
acrescido de 5% de leite em pó, com tempo de incubação
de 2 horas, diluição dos soros e conjugado com PBSTween 80 acrescido de 5% de leite em pó e lavagens com
PBS-Tween 80.
O preparo das amostras de sangue utilizadas na
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PCR foi realizado segundo protocolo descrito para extração
de DNA de B. equi e B. caballi (BASHIRUDDIN et al.,
1999), com ligeiras modificações. Resumidamente,
alíquotas de 200mL de cada amostra de sangue diluídas
em tampão TE (10mM Tris-HCl, pH7,4, 1mM EDTA) foram
centrifugadas a 14.000g por dois minutos. Os péletes
resultantes foram lavados por mais três vezes em TE e
ressuspendidos em água deionizada estéril acrescida de
1%. SDS, 1%. Sarkosil e 0,1 mg de proteinase K. A solução
foi incubada a 37°C durante 90 minutos. Após a incubação,
foi realizada extração com igual volume de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), com
centrifugação a 14.000g por 5 minutos. À fase aquosa, foi
adicionado isopropanol (v/v), e a mistura mantida a -20°C
por 12 horas. O DNA foi precipitado por centrifugação a
14.000g por 10 minutos, seco a 37°C, dissolvido em 30mL
de água deionizada estéril e mantido a -20°C.
As reações de amplificação foram conduzidas em
um volume total de 50mL, empregando a seguinte mistura:
200mM de cada dNTP, 1mM de cada primer, 2,5 unidades
de Taq DNA polymerase, 3,0mM de MgCl2, 5,0mL de
tampão da enzima e 5mL da amostra de DNA. Foram
utilizados como primers, os oligonucleotídeos Te664a
(5‘AAACCCGTCCTCTTGGAGG 3‘) e Te664b (5‘
ATCCATCTAAGAGTTGT 3‘), que amplificam um
fragmento de 315 pb T. evansi espécie-específico
(VENTURA, 2001). As amplificações foram processadas
em termociclador (Techne Genius) com ciclo inicial de 94°C
por 5 minutos, seguido por 25 ciclos de 94°C por 1
minuto, 56°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto, finalizando
com um ciclo de 72°C por 10 minutos.
Doze microlitros de cada amostra amplificada
acrescidos de 2mL de tampão da amostra (glicerol 50%,
azul de bromofenol 0,4%, xilenocianol 0,4%) foram
aplicados ao gel de agarose a 1,5% corado pelo brometo
de etídio, juntamente com um marcador de peso molecular
de 100bp (GIBCO BRL) e separados por eletroforese
horizontal a uma voltagem constante de 80V por 1,5h. O
gel foi visualizado em transiluminador de luz U.V e
fotografado (Eagle Eye II, Stratagene).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A reação em cadeia da polimerase usada neste
estudo foi capaz de amplificar fragmentos de DNA
detectáveis até a diluição de 3,8 x 103 tripomastigotas/mL
de sangue (Figura 1), o que equivale a detecção mínima
de 760 parasitas, uma vez que o volume inicial de sangue
utilizado na preparação do DNA foi de 200mL. A
sensibilidade conferida pelo protocolo utilizado foi inferior
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el diagnóstico serológico y el ensayo de PCR en animales infectados por Trypanosoma evansi. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 3, 347-352, 2004.
Tabela 1 - Resultados obtidos pelo ELISA-teste indireto e
ensaio da PCR em amostras de cães e eqüinos
do Pantanal mato-grossense
Figura 1 - Detecção de T. evansi em sangue de rato através
do ensaio de PCR, utilizando os primers Te664a
e Te664b. Linha 1, marcador de peso molecular
de 100bp; linha dois, controle negativo; linhas
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13 representam
parasitemias iguais a 5,7x106, 2,85x106, 1,43x106,
7,13x105, 5,7x105, 5,7x104, 2,85x104, 1,43x104,
7,13x103, 5,7x103, 3,8x103 tripomastigotas/ml,
respectivamente. A banda de 315 bp indicada
corresponde ao produto de amplificação da
seqüência T. evansi-específica.
D.O.: densidade óptica
ao PCR relatado por VENTURA (2001) utilizando os
mesmos oligonucleotídeos, que detectou 25 parasitas em
amostras de sangue de camundongo experimentalmente
infectado. No entanto, o presente estudo utilizou diferente
técnica de extração, o que pode ter implicado a redução
da quantidade de DNA disponível para extração. A
sensibilidade do protocolo da PCR empregado foi pouco
superior àquela conferida pelos métodos parasitológicos
tradicionais, considerando-se que o exame de sangue
contendo 105 parasitas/mL requer a observação de pelo
menos 20 campos microscópicos (objetiva 40X) para
detecção de um único tripomastigota (HERBERT &
LUMSDSEN, 1976) e que, utilizando técnicas de
concentração, como a do microhematócrito, é possível a
detecção de apenas um parasita por tubo capilar em
parasitemia estimada de 2,5 x 103 parasitas/mL (HOLLAND
et al., 2001). Entretanto, o ensaio da PCR pode ser
especialmente útil em pesquisa de campo quando se
pretende examinar grande número de animais para testes
posteriores, o que implica intervalo relativamente longo
entre a colheita do sangue e o processamento laboratorial.
Estudos mostram que tripomastigotas de T. evansi se
tornam indetectáveis no prazo de 3 a 4 horas após a
colheita, independentemente da temperatura, e que esse
tempo cai para 30 minutos quando o material colhido é
exposto à luz solar direta. (HOLLAND et al., 2001).
Quando empregada no sangue de eqüinos
soropositivos colhido a campo, a PCR não produziu
produtos de amplificação em nenhuma das amostras
testadas (Tabela 1). Uma possível explicação para esse
resultado é que esses animais apresentavam, na época da
colheita, número muito pequeno de parasitas, abaixo do
limite de detecção do ensaio utilizado. Estudos conduzidos
com T. cruzi mostraram a maior sensibilidade do
diagnóstico sorológico sobre a técnica do PCR e a baixa
parasitemia foi apontada como responsável por resultados
falso-negativos obtidos (WINCKER et al., 1994;
JUNQUEIRA et al., 1996; WINCKER et al., 1997).
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Apesar de não parecer suficientemente sensível para ser
utilizada isoladamente, a PCR, em função de sua
especificidade e das vantagens sobre os outros métodos
de detecção direta, deve ser considerada como importante
técnica complementar à sorologia no diagnóstico da
infecção por T. evansi em pesquisas a campo. Estudos
devem ser conduzidos visando aumentar a sensibilidade
da técnica, seja através de uma segunda reação de
amplificação (Nested PCR), seja utilizando técnicas de
hibridização.
ARTIGO RECEBIDO: Agosto/2002
APROVADO: Julho/2004
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