PCR
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Mestrado em Microbiologia e Parasitologia Disciplina: Fundamentos de Biologia Molecular Introdução a Biologia Molecular Profa. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia Biologia Molecular consiste principalmente em estudar as interações entre os vários sistemas da célula, partindo da relação entre o DNA, o RNA e a síntese de proteínas, e o modo como essas interações são reguladas. Descoberta do Ácido nucleico Descoberta da existência do ácido nucleico no núcleo celular e a determinação de sua composição química Identificação e aceitação do DNA como material hereditário 1869 Johann Friedrich Miescher: composto de natureza ácida , rico em fósforo e em nitrogênio, desprovido de enxofre e resistente à ação da pepsina nucleína Identificando os componentes químicos do núcleo 1880 Albrecht Kossel Descoberta das bases nitrogenadas 1889 Richard Altmann Purifica a nucleína, comprovando sua natureza ácida. Surge a denominação ácido nucléico 1890 Caracterização das bases nitrogenadas do DNA e da desoxiribose. Descoberta de outro tipo de ácido nucléico contendo uracila e ribose. 1912 Phoebus Levine e Walter Jacobs Descobrem os nucleotídeos Identificação do DNA como material hereditário Experimentos de Frederick Griffith (1928) Cepa rugosa (Rough strain) Pouco virulenta Cepa lisa (Smooth strain) Altamente virulenta com cápsula Identificação do DNA como material hereditário Experimentos de Oswald Avery, McCarty e MacLeod (1944) Princípio transformante DNA Confirmação da natureza genética do DNA 1952: Hershey & Chase DNA injetado por uma partícula de fago em um bactéria, continha todas as informações necessárias para se obter a progênie viral Estrutura do DNA até 1944: acreditava-se que as proteínas eram o material genético. 1953: Watson & Crick estrutura tridimensional do DNA Watson e Crick 1953 Watson & Crick: modelo tridimensional para a estrutura do DNA Molécula de DNA: açúcar (pentose) grupo fosfato base nitrogenada Bases nitrogenadas Purinas DNA RNA Pirimidinas DNA RNA Ligações entre as moléculas O Nucleotídeo entre a base nitrogenada e a pentose: ligação N-glicosídica com a OH ligada ao carbono 1 da pentose entre o grupo fosfato e a pentose: ligação fosfodiester coma OH ligada ao carbono 5 da pentose Posicionamento das bases O grupo fosfato e o açúcar (hidrofílica): localizados na parte externa da molécula - As bases nitrogenadas (hidrofóbica): localizadas na parte interna DNA: 2 cadeias helicoidais enroladas ao longo do mesmo eixo para formar uma dupla hélice Para que o pareamento ocorra, as DUAS FITAS têm que ser ANTIPARALELAS O DNA é uma molécula com polaridade: uma extremidade 5’-OH uma extremidade 3’-OH A seqüência de bases é sempre lida na direção 5’ ---> 3’ As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por PONTES DE HIDROGÊNIO O pareamento G-C tem 3 pontes de H O pareamento A-T tem 2 pontes de H Origem da vida.... Dogma central da biologia DNA armazena a informação RNA transfere a informação Proteína executa a função Algumas descobertas posteriores não coincidiram com este princípio: O RNA pode sofrer replicação em alguns vírus O RNA viral através da enzima transcriptase reversa pode ser transcrito em DNA Walter Gilbert, 1986: Hipótese do “mundo do RNA” (RNA world) Antes das células modernas: RNA material genético RNA catalisava as reações químicas nas células primitivas Existiu um período na evolução que o RNA era ambos o catalisador biológico e material genético Mundo do RNA pareamento complementar dos nucleotídeos o que promove a cópia exata de uma seqüência, pois, por conta da complementaridade das bases, uma seqüência serve de modelo para outra descoberta das ribozimas, moléculas de RNA que possuem atividade catalítica e participam de importantes reações nas células modernas viróides menores e mais simples fitopatógenos conhecidos, consistem em um RNA pequeno (200 nucleotídeos), circular, fita simples, não codificante que, através da maquinaria de transcrição da célula hospedeira, é capaz de se auto-replicar. virusóides agentes sub-virais que, diferentemente dos viróides não se replicam de forma autônoma, a replicação depende da coinfecção de uma célula hospedeira com um vírus auxiliar RNAs satélites circulares Mundo do RNA Sidney Altman,Thomas Cech: Prêmio Nobel de Química em 1989 RNA com capacidade catalítica: poderia agir como enzimas (ribozimas) Propriedade catalítica da ribonuclease P enzima que cliva RNA Envolvida no processamento do tRNA em vírus, em procariotas e em eucariotas. Técnicas de Biologia Molecular: PRINCÍPIO Todo microorganismo tem sequências de ácido nucléico que são específicas e podem ser detectadas por uma reação de hibridização ou de amplificação Estrutura da partícula viral: Vírus não envelopados: genoma (RNA ou DNA) + capsídeo nucleocapsídeo Vírus envelopados: genoma (RNA ou DNA) + capsídeo + envelope com glicoproteínas Em virologia, a detecção do genoma viral é particulamente importante: Para o estudo de vírus que não podem ser isolados em cultura de células, como os papilomavírus e alguns agentes associados a gastrenterites, Para vírus com alta diversidade antigênica, como os enterovírus, o que dificulta a utilização de técnicas sorológicas de detecção de antígeno, A análise do genoma viral diretamente da amostra clínica pode ser vantajosa principalmente para aqueles vírus com genoma RNA, que podem sofrem mutações através de sucessivas passagens in vitro. Purificação do DNA Técnicas de Biologia Molecular: CUIDADOS - Usar sempre luvas e trocá-las constantemente - Nunca usar a mesma ponteira para pipetar soluções diferentes - Usar sempre ponteiras e tubos Eppendorf novos. - Se possível, ter um conjunto de pipetas automáticas só para extração. - Uso de ponteiras contendo algodão para bloquear a produção de aerossóis Técnicas de Biologia Molecular: CUIDADOS - Utilizar sempre água autoclavada e deionisada. - Irradiação UV do material dentro da capela (pipetas, ponteiras, estantes, tubos) - Uso de pequenas alíquotas - Limpeza dos equipamentos e bancada com solução de hipoclorito de sódio a 10% Manipulação dos reagentes dentro de capelas www.starlab- Extração do genoma Método de escolha: depende da amostra clínica tecido, fezes, urina, aspirado de nasofaringe, soro... - Amostra clínica - Controle positivo - Controle negativo Água Amostra + Tampão de lise Tampão: - Proteinase K (tecido) - Sal (hidrocloreto de guanindina) Lisar as células e degradar proteínas DNA na solução salina se liga a matriz (sílica) Lavagem: para retirar contaminantes Elui o DNA da matriz com solução tampão ou água DNA purificado www.qiagen.com Lavagem do DNA: Adiciona tampão Homogeiniza: vortex Spin: centrifuga 10 segundos Coleta o sobrenadante DNA extraído: Como detectar? • Reação de hibridização • Reação de amplificação (PCR) Propriedade Física do DNA As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas. Esse processo é denominado DESNATURAÇÃO. A renaturação ocorre quando se volta às condições físico-químicas iniciais . Melting temperature (Tm): temperatura de dissociação na qual 50% da molécula de DNA está desnaturada A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam Tm: específica para cada molécula de DNA Depende do conteúdo G-C / A-T da molécula Hibridização Baseia-se na propriedade dos ácidos nucleicos de parear suas fitas complementares Utiliza “sondas” para detecção do genoma viral (sequências) Sonda fragmento de ácido nucleico complementar a uma dada sequência do genoma viral, marcado com uma substância reveladora (radioisótopo ou enzima) Hibridização é a formação de duplexes de bases pareadas, seqüência-específicas, a partir de qualquer combinação de fragmentos de ácidos nucleicos, usualmente “in vitro”. Como obter a sonda (probe): Clonagem em plasmídio Quase todos os plasmídeos atualmente utilizados derivam do pBR322 O mapa mostra as posições: gene de resistência a amplicilina (amp R), gene de resistência a tetracilina (tat R), origem de replicação (ori) e sequência de reconhecimento para 7 enzimas de restrição (sítio de clonagem) O marcador de seletividade (genes de resistência a antibióticos) permite a identificação da bactéria que recebeu o plasmídeo. No vetor acima, são genes que codificam proteínas que degradam antibióticos. Origem de replicação: é uma sequëncia específica do plasmídeo que é reconhecida pelo aparato de duplicação do DNA, inicia a síntese de DNA Padrão de restrição: Sítios de reconhecimento para ENZIMAS DE RESTRIÇÃO são curtas sequências de nucletídeos reconhecidas e clivadas por várias endonucleases Algumas endonucleases de restrição e seus sítios de reconhecimento As enzimas são nomeadas com as abreviações das linhagens de bactérias das quais foram isoladas Digestão do DNA com diferentes enzimas de restrição: Stick ends: extremidades coesivas Blunt ends: extremidades rombas Ligação de fragmentos de restrição com extremidades coesivas DNA ligase Agar com tetraciclina Agar com tetraciclina + ampicilina Inserção do DNA no gene de resistência a ampicilina: colônias contendo plasmídio recombinante crescem somente na presença de tetraciclina Como obter a sonda (probe): Amplificação PCR: amplificar o fragmento desejado Produto da amplificação marca com uma substância reveladora Reação colorida Substrato Conjugado: estreptavidina ligada a enzima Sonda marcada com biotina www.invitrogen.com.br Reação de Hibridização in situ Tecido: observação ao microscópio ótico Hibridização Triagem X Tipagem Triagem: sondas genéricas (detecção) sondas para genes conservados Tipagem: sondas específicas Sensibilidade: 100 cópias DNA/célula Relevância clínica Dot blot Uso de sondas marcadas para detecção de genoma em membrana de nitrocelulose. Amostra clínica: soro, fezes, tecido Triagem Sensibilidade: 10-50 cópias DNA/célula Pode ocorrer falso- positivos Dot Blot sonda marcada com P32 sonda marcada com biotina Ensaio de captura de híbrido Detecção e tipagem de HPV Polymerase Chain Reaction: PCR Método para produzir cópias de um segmento de DNA específico PCR Amplifica uma Seqüência Alvo Replicação do DNA in vivo Replicação semi-conservativa Enzimas envolvidas: DNA polimerase (polimerização 5’-3’) Primase Topoisomerase Helicase 3’ 5’ 5’ Helicase 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Helicase 5’ Fita Contínua 3’ 5’ 3’ 5’ DNA Polimerase Primase Fita Descontínua Fragmento de Okasaki 5’ 3’ 5’ 3’ Mimetizando a replicação in vivo Helicase para abertura das fitas Temperatura (92°C) Primase para adição de primers Primers específicos + temperatura ideal Polymerase Chain Reaction: PCR Polimerização de DNA em Cadeia Polimerização é feita por uma DNA polimerase termoestável São utilizados dois “primers”, o que delimitam o segmento amplificado e determinam o crescimento exponencial do número de moléculas de DNA Triagem X Tipagem Sensibilidade : 10 cópias de genoma Protocolo original Invenção do PCR: Kary Mullis (1985) Protocolo original utilizava DNA polimerase de E. coli (termolábil) Henry Erlich em 1988: enzima termoestável • Taq polimerase: é uma DNA polimerase extraída da bactéria Thermus temperatura de 75oC. aquaticus, que vive em água com DNA POLIMERASES POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’ Todas as DNA-POLIMERASES requerem para seu funcionamento: Molécula de DNA - molde “Primer” de oligonucleotídeo Magnésio dNTPs Polymerase Chain Reaction: PCR Reagentes do mix da PCR DNA polimerase Primer Sense Primer Antisense Polymerase Chain Reaction: PCR • Água autoclavada e deionizada: completa o volume final da reação • Tampão 10X concentrado: 10 mM Tris-HCl pH 8,0 , 50mM KCl mantém o pH ótimo para a reação • Solução de dNTP: precursores das novas fitas do DNA específico solução com os quatro deoxinucleotídeos trifosfatos (deoxiadenosina, deoxitimidina, deoxicitidina, deoxiguanosina, na concentração de 20 a 200M de cada dNTP). A concentração dos 4 deoxinucleotídeos tem que ser equivalentes para minimizar erros de incorporação. Esta solução pode ser preparada segundo as especificações do fabricante e estocada a -20oC Polymerase Chain Reaction: PCR • Cloreto de Magnésio (MgCl2): otimiza a atividade da Taq polimerase. Concentração: 0,5 a 2,5 mM. Estocado a –20oC. A concentração de MgCl2 pode afetar: anelamento dos primers, formação de primer-dimer, atividade da enzima • Oligonucleotídeos iniciadores ou primers: sintetizados por fabricante a pedido do pesquisador (liofilizado) e normalmente tem de 18 a 30 nucleotídeos. Concentração de 0,1 a 0,5M. Aliquotado e estocado a -20oC. A especificidade da reação é dada pelos primers Deve-se ter conhecimento prévio do fragmento alvo a ser amplificado para desenhar os primers específicos. Segmento de DNA alvo Segmento de DNA alvo Ex: Fragmento alvo – Gene L1 do HPV (450 pb) Se a concentração do primer for alta, pode promover o acúmulo de produtos não específicos e aumentar a probabilidade de ter artefatos: primer-dimer. Os produtos não específicos e primer-dimer são substratos para a PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs e primers, resultando em uma concentração mais baixa do produto desejado Primer-Dimer Polymerase Chain Reaction: PCR Reagentes do PCR DNA polimerase DNA molde Primer Sense Primer Antisense Extração prévia do DNA PCR: etapas em ambientes separados Sala de extração: (a) 1. Extração de DNA a 2. Sala limpa: partir da amostra clínica Preparo da mistura da reação (Mix) 3. Adição do DNA (b) extraído ao tubos de PCR contendo mix (c) 4. Termociclador (d) 5. Eletroforese em gel de agarose manipular os produtos do PCR Polymerase Chain Reaction: PCR luvas de procedimento conjunto de pipetas com volume variável de 10l, 20l, 200l e 1000l estantes para tubos (refrigeradas) ponteiras com filtro novas e autoclavadas tubos para PCR 0,2ml novos e autoclavados lenço de papel cortado (para abrir os tubos) Polymerase Chain Reaction: PCR Preparo do mix Primer AS Primer S dNTP mix 10x buffer MgCl2 Taq pol Polymerase Chain Reaction: PCR Manipulação dos reagentes dentro de capelas www.starlabfrance.com O material usado na sala limpa não pode ser usado em outra sala Preparo do mix: - Em uma sala limpa Determinar o número total de reações a serem executadas. Incluir ao menos uma reação sem DNA (água no lugar da amostra). - Identificar os tubos da reação (200l). - Em um tubo eppendorf 1,5l: preparar a mistura de reação de acordo com o esquema abaixo: Concentração final 270 L 4,0 L 40 L 1x 5,0 L 50 L 1,5mM 1,5 L 15 L 2,0 L 20 L 0,5 L 05 L 40 L 400 L dNTP MgCl2 50mM Mistura de iniciadores Taq polimerase 5U/L Total 10 Reações 27,0 L H2O 10xbuffer Volume/reação 1U/L - Mistura: vortex - Spin (para retirar gotas da reação das paredes dos tubos) Polymerase Chain Reaction: PCR Preparo do mix: Em uma sala limpa - Aliquotar em 9 tubos com 40 L Polymerase Chain Reaction: PCR Reagentes do PCR DNA polimerase Adição do DNA alvo Primer Sense Primer Antisense Polymerase Chain Reaction: PCR Na sala de extração: - Adiciona 10L de DNA extraído de cada amostra aos tubos contendo 40L de mix - Volume final da reação: 50 L Tubos 0,2 L contendo mix DNA extraído das amostras Polymerase Chain Reaction: PCR Tubos: - amostra clínica - controle positivo - controle negativo PCR: H2O utilizada no preparo do mix - controle negativo da extração: H2O Polymerase Chain Reaction: PCR Na sala do termociclador: - Centrifugar os tubos rapidamente para retirar gotas da reação das paredes dos tubos. - Colocar os tubos no termociclador para a execução da reação de amplificação Polymerase Chain Reaction: PCR Termociclador 1º ciclo 2º ciclo Polymerase Chain Reaction: PCR 3 passos na reação que são repetidos de 30 a 40 vezes ciclos 1 passo: desnaturação: 94oC por 30 seg Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na PCR. Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima. Polymerase Chain Reaction: PCR 2o passo: anelamento dos primers 55oC Temperatura de “annealing”: usualmente 5oC abaixo do Tm real dos “primers” Tempo de “annealing”: 15 a 30 seg Primer sense: se liga a fita antisense Primer Antisense: se liga a fita sense Para calcular Tm de um primer : 2 (A + T) + 4 (G + C) Polymerase Chain Reaction: PCR 3o passo Extensão a 72oC: temperatura ótima para Taq polimerase Incorporação de 35 a 100 nucleotídeos por segundo 1 minuto é suficiente para um amplicon de 1,2 kb Como ambas as fitas são copiadas durante a PCR, há um aumento exponencial do número de cópias do gene. Por exemplo: se há 1 cópia do gene antes da reação iniciar, após o1o cliclo serão 2 cópias, após 2 ciclos serão 4 cópias, 3 ciclos serão 8 cópias e assim por diante. Polymerase Chain Reaction: PCR Polymerase Chain Reaction: PCR www.snv.jussieu.fr Polymerase Chain Reaction: PCR Ciclos iniciais: - Os primers (ou iniciadores) procuram a template de DNA com as sequências que lhes são complementares - Encontrar a sequência complementar não é tão difícil, pois os primers estão em considerável excresso em relação à template Fase intermediária: - O processo de amplificação está ocorrendo, com os primers agindo de modo permitir o acúmulo exponencial do fragmento de DNA. - O pareamento do primer com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos Fase tardia ou fase de platô: - A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes e à competição dos produtos gerados com primers. Polymerase Chain Reaction: PCR ? ? ? ? ? Eletroforese em gel de agarose Preparo do gel de agarose: Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X - pH 8,0 : Agarose 1% em TBE 0,5% - Os géis de agarose são adequados para separar moléculas de DNA entre 200 pb e cerca de 50 kpb - O tamanho dos poros depende da concentração de agarose. A concentração em geral é dada como peso de agarose por volume de água. - A agarose é dissolvida em água fervendo e forma um gel quando esfria. Durante a geleificação há formação de polímeros. Eletroforese em gel de agarose Preparo do gel: Usar luvas no preparo do gel fonte nível espaçadores pente cabos cuba Antes de preparar o gel é necessário nivelar a cuba Eletroforese em gel de agarose Preparo do gel: Dissolver a agarose no tampão. Deixar esfriar. Preparar a cuba: Colocar a placa com espaçadores e pente. Eletroforese em gel de agarose Preparo do gel: Verter a agarose no gel. Cuidado para não formar bolhas Se formar bolhas, empurrá-las para a extremidade com uma ponteira Preparo do gel: Depois de solidificar o gel, retirar os espaçadores Adicione o tampão Retire o pente com cuidado www.stolaf.edu Eletroforese em gel de agarose Para aplicar no gel: Marcador de DNA (ladder) : mistura de fragmentos de DNA de tamanho conhecido, a fim de comparar com os fragmentos obtidos no PCR. Gel loading buffer: Corante 6X : xileno cianol 0,25% azul de bromofenol 0,25% glicerol 30% O gel loading buffer : - Aumenta a densidade da amostra, assegurando que a gota de DNA entre no gel - Dá cor à amostra - contém corantes que no campo elétrico movem para o anodio (bromofenol migra mais rápido que o xileno cianol) Preparo da amostra para aplicar no gel Antes de aplicar os produtos da PCR no gel centrifugar rapidamente : Em um tubo fazer a seguinte mistura TBE 0,5 X corante amostra 10 l 2 l 2 l marcador de PM 3 l 2 l 10 l produto da PCR Abrir os tubos contendo produtos de PCR em uma capela para evitar contaminação do ambiente com amplicons. Irradiar UV na capela após manipulação. Eletroforese em gel de agarose Aplicar as amostras no gel: Aplicar cada mistura em um slot do gel. No 1o slot aplicar o marcador de PM e nos demais o produto da reação de PCR Eletroforese em gel de agarose - Ligar a cuba de eletroforese. As amostras deverão correr na direção do catódio (preto) para o anódio (vermelho). O DNA tem carga negativa e migra para o polo positivo. - A eletroforese é feita a 80 Volts por aproximamente 60 min, até que o corante azul atinja 3/4 do gel. Eletroforese em gel de agarose Visualizarão das bandas no gel: - Transferir o gel para uma solução de brometo de etídio 0,5 g/mL de 10 a 15 min. Lavar 1X com água. - Visualizar o gel em transiluminador sob luz UV e fotografar. transiluminador Máscara de proteção Coloração com brometo de etídio O Brometo de Etídio é um intercalante de DNA Eletroforese em gel de agarose Visualização das bandas no gel: www.marinebiotech.org Eletroforese em gel de agarose 234 194 Marcador de PM Produtos da reação PCR precedida pela transcrição reversa (RT-PCR) - Para vírus de genoma RNA -Realização da reação de transcrição reversa Transcriptase Reversa -Cuidados a tomar durante o preparo do c-DNA - Primers específicos - Primers randômicos PCR precedida pela transcrição reversa (RT-PCR) Multiplex PCR: genotipagem Dois ou mais pares de primers em um único tubo PM A B C Genótipo G1 Genótipo G2 PM = peso molecular Amostra A = G1 Amostra B = G1 + G2 Amostra C = G2 Ex: vírus com muitos genótipos Especificidade do produto da PCR Nested PCR pode ser uma alternativa para melhorar a especificidade e a sensibilidade da PCR 1o PCR: primers externos Produto do 1o PCR : template para o 2º PCR 2o PCR: primers internos Produto do 2º PCR Nested PCR Semi-Nested Nested PCR Primers externos MW 1 2 3 Primers internos 4 MW 5 6 7 8 681 pb 427bp Southern blot: análise do DNA transferido para a membrana Eletroforese em gel de agarose do produto da PCR Revelação: banda onde o probe ligou a sequência específica Transferência dos fragmentos de DNA do gel para a membrana de nitrocelulose Membrana com as bandas de DNA Hibridização com probe específico Padrão de restrição: Sítios de reconhecimento para ENZIMAS DE RESTRIÇÃO são curtas sequências de nucletídeos reconhecidas e clivadas por várias endonucleases Algumas endonucleases de restrição e seus sítios de reconhecimento As enzimas são nomeadas com as abreviações das linhagens de bactérias das quais foram isoladas Eletroforese em gel de agarose após tratamento do DNA com enzima de restrição PM 1 2 3 4 5 1,2 : 1 sítio de restrição (tamanho esperado) 3: 1 sítio de restrição em posição diferente 4,5: 2 sítios de restrição Portanto: amostras 3, 4, 5 variantes SEQÜENCIAMENTO DE DNA Molécula de DNA Informação Seqüência nucleotídica Definição: processo que determina a ordem dos nucleotídeos (A, C, T e G) na seqüência do DNA utilizado como molde. Microarray (Microarranjo) Os microarrays são utilizados na detecção de ácidos nucleicos em amostras clínicas: Hibridização do ácido nucleico extraído da amostra com o DNA fixado no array. A detecção é possível pois os DNAs das amsotras são "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5) Clewley JP. J. Clin. Virol., 29:2-12, 2004. ROTAVÍRUS RV gp A: Classificação binária P (31) G (23) www.Virology.net/Big-Virology/BVRNAreo.html VP4 4 VP7 9 Classificação binária de RV-A VP7 VP4 23 Genótipos (G1-G23) 31 Genótipos (P[1]-P[31]) 672 Combinações possíveis !!!! Humanos: Genótipos usuais: P[8]G1, P[8]G3, P[8]G4, P[4]G2, P[8]G9 Genótipos não-usuais: G5, G8, G10, G12, P[6], P[9] e P[10] Bovinos: P[1]G6, P[5]G6, P[11]G10 Suínos: P[7]G5, P[6]G4, P[7]G11 Khamrin et al., 2007; Martella et al., 2007; Matthijnssens et al., 2008; Albe et a l., 2009 RV gp A Genotipagem: Reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 (a) 4 5 6 7 8 9 (b) Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos de RT-PCR para obtenção dos fragmentos consensuais para os genótipos G (a) e P (b) de RV Linha 1: marcador de peso molecular de 100 pb; Linhas 2,3,4,5,6,7 e 8: fragmento consensual para genótipos G (906 pb) e P (876 pb); Linha 9: controle negativo de extração e amplificação. RV gp A Genotipagem: Reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 11 12 2 3 4 5 P8 345pb G1 158 pb G9 110pb (a) (b) (c) Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos de Nested-PCR para para determinar o genótipo G e P de RV (a) Linha 1: marcador de peso molecular 50 pb; Linhas 2,4,5: G1 (b) Linha 1: marcador de peso molecular 100 pb; Linhas 6,7,8,10,11: G9 (c) Linha 1: marcador de peso molecular 100 pb; Linhas 2,3,4,5: P8 Rotavírus do Grupo A: Diferentes genótipos: • Infecções heterólogas • Rearranjo entre amostras de RV gp A - combinações dos antígenos P e G Novo sistema de classificação dos RV-A Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/6 VERDE/ AZUL Wa-like VERMELHO DS-1-Like LARANJA AU-like AMARELO LILÁS AVIAN PO-13-Like SA-11-like Síndrome respiratória aguda grave (SARS) Detecção do vírus: Isolamento viral: Amostras clínicas: sangue, soro, swab de orofaringe, swab de nasofaringe, tecidos (autópsia) Cultura de células Inoculação em CRN Vero-E6, NCI-H292, HELA, MDCK, HUT-292, LLC-MK2, B95-9 (IC e IP) CPE + Microscopia eletrônica RT-PCR Master seed Imunohistoquímica (propagação) Imunofluorescência ELISA OBS: coleta de soro de fase convalescente dos pacientes Coronavírus Fig 1: Células Vero E6 inoculadas com material de orofaringe de pacientes com SARS Fig 2: Características estruturais do coronavírus associado a SARS propagados em células Vero E6 (a) CPE (b) Reação de imunofluorescência: Células Vero com soro de paciente convalescente T G Ksiazek et al., N. Eng. J. Med., April 10,2003 Comparação do coronavírus associado a SARS com outros Coronavírus de animais e humanos (a) T G Ksiazek et al. N. Eng. J. Med., April 10, 2003 (b) Drosten et al. N. Eng. J. Med., April 10, 2003
