Texto Completo - Apresentação

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Programa de Pós-Graduação em Nanociências
JAQUELINE URBAN MOURA
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA
CITOTOXICIDADE DE NANOPARTÍCULAS DE MANGIFERINA
Santa Maria, RS
2014
JAQUELINE URBAN MOURA
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA
CITOTOXICIDADE DE NANOPARTÍCULAS DE MANGIFERINA.
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
em Nanociências do Centro Universitário
Franciscano de Santa Maria como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Nanociências.
Orientadora: Profa. Dra RENATA PLATCHECK RAFFIN
Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia Gomes
Santa Maria RS
2014
M929d
Moura, Jaqueline Urban
Desenvolvimento, caracterização e avaliação preliminar
da citotoxicidade de nanopartículas de mangiferina /
Jaqueline Urban Moura ; orientação Renata Platcheck
Raffin ; coorientação Patrícia Gomes – Santa Maria :
Centro Universitário Franciscano, 2014.
83 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Nanociências) – Centro
Universitário Franciscano, 2014
1. DMSO 2.Liberação 3.Mangiferina 4.Nanocápsulas
5.Validação I.Raffin, Renata Platcheck II.Gomes,
Patrícia III.Título
CDU 547.12
Elaborada pela Bibliotecária Eunice de Olivera CRB10/1491
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que de uma forma ou de outra colaboraram para a realização deste
trabalho, em especial:
Agradeço a Deus, por todos os problemas e lutas que passei, muitas vezes sem
compreender, obrigado Senhor, em tudo te dou graças no bem ou no mal, pois sei que a
recompensa virá no final, e por me ter concedido o privilégio de aprender, convivendo com
pessoas tão especiais.
Aos meus queridos pais, pelo imenso amor, pelo apoio constante, pelos ensinamentos
de grande valor que me presenteiam durante toda a vida. Aos meus irmãos, Simone e Derli,
pelo afeto, amizade e apoio de sempre.
À minha orientadora professora Renata P. Raffin pelo conhecimento transmitido, pelas
oportunidades, desafios, orientações, otimismo, amizade e por me proporcionar esta valiosa
oportunidade de aprendizado.
À Professora Patrícia Gomes, co-orientadora deste trabalho, pelos conhecimentos
prestados durante a realização deste trabalho, amizade e apoio, por toda atenção e força para
comigo, foi uma grande amiga e colaboradora. Sua dedicação, boa vontade e afeto foram
admiráveis. Muito obrigada!
Á Professora Solange Fagan, pelo projeto que me foi concebido e pela oportunidade de
viajar para Cuba, apresentar meu trabalho, assim como viver a experiência do processo de
desenvolvimento de medicamentos de uma indústria farmacêutica cubana, foi incrível, muito
obrigada.
Á Gabriela minha grande amiga, um agradecimento especial pelo auxílio nas minhas
lutas, pelo apoio incondicional, incentivo, não me deixar desistir e por toda dedicação e
paciência, pela força e parceria em Cuba.
Aos amigos e queridos companheiros de pesquisa Gabriela, Bibiana Aldrigui, Ana Paula
Tasqueto, Cayane Genro, Dionei Seibel e a Isabel Roggia, Karine de Bona, Michele Gendelski,
Dionei, Pedro, Fernando, pelo intenso convívio, amizade e auxílio durante o mestrado, pela
atenção e carinho, pelas inúmeras contribuições na realização deste trabalho, sem vocês nada
teria sido possível, em que juntos formamos uma equipe e alcançamos nossos objetivos com
esforço, dedicação e ajuda mútua.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Nanotecnologia pela amizade paciência,
auxílios prestados, discussões científicas e pelos momentos de descontração proporcionados.
Aos Professores do Programa de Pós Graduação da UNIFRA – Mestrado de Nanociências
pelas contribuições na minha formação acadêmica
RESUMO
A mangiferina é um composto natural, mais especificamente uma xantona glicosilada, que foi
originalmente isolada da Mangifera indica L., a mangueira, pertencente à família
Anacardiaceae. Possui uma variedade de atividades farmacológicas já estudadas, incluindo
ação antioxidante, antidiabética, antitumoral, hepatoprotetora antiviral, entre outras. A
mangiferina apresenta baixa solubilidade em água, além de baixa estabilidade química, o que
dificulta a formulação de uma forma farmacêutica adequada para administração oral. Uma
estratégia para preservar a integridade química e aumentar a biodisponibilidade de fármacos
pouco solúveis em água é a nanoencapsulação. Desta forma, suspensões de nanocápsulas de
mangiferina foram preparadas na concentração de 250 µg/mL pela técnica de deposição
interfacial do polímero pré-formado, contendo como polímero o Eudragit® S100 e como um cosolvente o dimetilsolfóxid (DMSO). As suspensões foram caracterizadas através da
determinação do pH, diâmetro de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, taxa de
associação, doseamento do fármaco, perfil de liberação e microscopia eletrônica de transmissão
(MET). Para avaliar o perfil preliminar de citotoxicidade, foram realizados testes de viabilidade
celular e irritabilidade através do teste de 3-4, 5-dimethylthiazolyl-2-2, 5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT) e o Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET CAM), respectivamente
As nanocápsulas de mangiferina apresentaram pH ácido, diâmetro de partícula de 92 nm, índice
de polidispersão menor que 0,2, potencial zeta de -18,3 mV, a eficiência de encapsulação foi
de 71,78% ± 1,54 e o doseamanto foi de 88,17±1,80. A validação do método foi realizada
através de estudos de especificidade, linearidade, limite de detecção, quantificação, robustez,
precisão e exatidão através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando como
fase móvel água e metanol, 70:30 acidificada com ácido acético glacial (pH 3,5),com
determinação em 254 nm. O método apresentou linearidade (r= 0,9996) e precisão (DPR=
1,71%, reprodutibilidade interna e DPR= 1,80%, repetibilidade). A exatidão foi de 94,98%. A
robustez indicou que a temperatura, o fluxo e o pH da fase móvel não interferem na análise. A
MET demostrou que as nanocápsulas de mangiferina apresentaram boas características
morfológicas, estando com tamanho homogêneo e não agregadas. Para o estudo do perfil de
liberação, foi empregada a técnica de diálise, sendo que 54,88% de mangiferina foi liberada
para o meio, em 24 horas. Os resultados do ensaio de MTT mostram que não houve diferença
significativa (p ˂ 0,05) na viabilidade celular das células tratadas com 0,75 µg/mL, 1,5 µg/mL
e 2,5 µg/mL de suspensão de nanocápsulas de mangiferina, quando comparadas com o controle.
Já o teste de HET CAM demonstrou que as nanocápsulas de mangiferina possuem um perfil
levemente irritante, comparadas com o controle negativo, provavelmente devido ao seu pH
ácido, o que não inviabiliza seu uso. Com base nestes resultados, podemos concluir que as
nanocápsulas de mangiferina são uma alternativa promissora de uso terapêutico deste fármaco,
principalmente por via oral. Como perspectivas futuras, são necessários mais estudos in vivo e
in vitro para avaliação de sua farmacocinética e toxicidade.
Palavras-chave: DMSO, liberação, mangiferina, nanocápsulas, validação.
ABSTRACT
Mangiferin is a natural bioactive, more specifically a glycosylated xanthone which was
originally isolated from Mangifera indica L., mango tree, belonging to the family
Anacardiaceae. It has a variety of pharmacological activities already studied, including
antioxidant, anti-diabetic, antitumoral, hepatoprotective, antiviral, among others. Mangiferin
presents very poor water solubility, and low chemical stability, which makes difficult the
formulation of a suitable pharmaceutical drug delivery system. A strategy for preserving the
chemical integrity and enhancing the bioavailability of poorly watersoluble drugs is
nanoencapsulation. In this way, mangiferin nanocapsule suspensions were prepared at the
concentration of 250 µg/mL using interfacial deposition of pre-formed polymer technique
containing as polymer Eudragit® S100 and as a co-solvent dimethylsulfoxide (DMSO). The
suspensions were characterized by determining pH, particle diameter, polydispersity index, zeta
potential, drug content, encapsulation efficiency, release profile and morphology (transmission
electronic microscopy - TEM). In order to assess the initial profile of cytotoxicity, cellular
viability and irritability tests were conducted through diphenyltetrazolium bromide (MTT) test
and Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET CAM), respectively. Mangiferin
nanocapsules showed acid pH, particle diameter of 92 nm, polydispersity index > 0.2, zeta
potential of -18.31 mV, encapsulation efficiency of 71.78 % ± 1.54, and drug loading of 88.17
± 1.80 %. The analytical method validation was performed through studies of specificity,
linearity, limit of detection and quantification, robustness, precision and accuracy of high
performance liquid chromatography (HPLC) method using a mobile phase of water and
methanol(70:30), acidified with acetic acid (pH 3.5), with determination at 254 nm. The method
was linear (r = 0.9996) and precise (RSD = 1.71 % for intra-day and RSD = 1.80 % for interdays
precision). The accuracy was 94.98 %. The robustness indicated that temperature, flow rate and
pH of the mobile phase did not interfere in the analysis. TEM demonstrated that nanocapsules
of mangiferin showed adequate morphological characteristics and were not aggregated,
presenting homogeneous size. In order to study the release profile, dialysis technique was used,
and 54.88% of mangiferin was released to the medium within 24 hours. The results of MTT
assay showed no significant difference (p ˂ 0.0 ) in viability of cells treated with 0.75 mg/mL,
1.5 mg/mL and 2.5 mg/mL suspension of mangiferin nanocapsules , when compared with the
control. HET CAM test showed that nanocapsules had a slightly irritating profile compared to
the negative control, probably due to its acidic pH, which does not impair its use. Based on
these results, we can conclude that mangiferin nanocapsules are a promising alternative for
therapeutic use of this drug, especially for oral administration. As future prerspectives, further
in vivo and in vitro studies are needed to evaluate its pharmacokinetics and toxicity.
Keywords: DMSO, release, mangiferin, nanocapsules, validation.
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA - Análise de variância;
BHE- Barreira hematoencefálica;
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência;
DMSO- Dimetilsulfóxido;
DP - Desvio padrão;
DPR – Desvio padrão relativo;
ED – Eficiência de dissolução;
Mw – Peso molecular;
MET- Microscopia eletrônica de transmissão;
PLGA- Poli(ácido láctico-co-glicólico);
SNC- Sistema nervoso central;
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura molecular da mangiferina (CORREIA et al., 2006)....................18
Figura 2- Fórmula estrutural Eudragit® (ROHM , 2003)...........................................25
Figura 3- Equação para a determinação da taxa de encapsulação..............................33
Figura 4 - Suspensões de nc de mangiferina contendo o polímero PCL, poli (caprolactona), observando-se a precipitação da mangiferina e formação de cristais...37
Figura 5 - Suspensões de nc de mangiferina contendo como polímero o eudragit®
S100, sem precipitação do fármaco..............................................................................38
Figura 6 - Diâmetro médio e índice de polidispersão de suspensão ncb em função da
intensidade de espalhamento de luz dinâmico..............................................................40
Figura 7- Diâmetro médio e índice de polidispersão de suspensão de nc mangiferina
250 µg/mL, em função da intensidade de espalhamento de luz dinâmico...................40
Figura 8 - Determinação do potencial zeta de nanocápsulas sem o fármaco..............41
Figura 9 - Determinação do potencial zeta de nanocápsulas de mangiferina na
concentração de 250 µg/mL.........................................................................................42
Figura 10 - Cromatogramas sobrepostos da mangiferina livre (a), da suspensão de
nanocápsulas de mangiferina na concentração de 10 μg/mL (b) e o cromatograma da
suspensão sem o fármaco (c)........................................................................................45
Figura 11 - Diagrama de cores em 3D, obtido para suspensão de nanocápsulas de
mangiferina na concentração de 10 µg/mL..................................................................45
Figura 12 - Diagrama de cores em 3D, obtido para mangiferina livre na concentração
de 10 µg/mL................................................................................................................ 46
Figura 13 - Microscopia eletrônica de transmissão das nanocápsulas sem o fármaco.
Comprimento da escala: 100 e 300 nm........................................................................50
Figura 14- Microscopia eletrônica de transmissão das nanocápsulas de mangiferina
250 µg/mL. Comprimento da escala: 100 e 300 nm....................................................51
Figura 15 - Gráfico comparativo de liberação de anaocápsulas de mangiferina a
250µg/ml e de mangiferina na forma livre, na mesma concentração...........................52
Figura 16 - Efeito da viabilidade celular, de nanocápsulas de mangiferina, de
nanocápsulas sem o fármaco e mangiferina na forma livre, em linhagem de células
Vero...............................................................................................................................54
Figura 17 - Teste HET CAM: (A) Controle negativo, (B) substância irritante leve
(SDB), (C) substância de irritação severa (NaOH).......................................................55
Figura 18 - Teste HET CAM: (A) suspensão de nanocápsula sem o fármaco, (B, C):
Suspensão de nanocápsulas de mangiferina (250 µg/mL)............................................56
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição das suspensões de nanocápsulas contendo mangiferina, para
um volume final de 25 mL............................................................................................29
Tabela 2 - Características físico-químicas das suspensões de nanocápsulas sem o
fármaco e de nanocápsulas de mangiferina...................................................................39
Tabela 3 - Valores obtidos da reprodutibilidade interna e repetibilidade.....................48
Tabela 4 - Resultados obtidos no ensaio de exatidão (n = 3)......................................49
Tabela 5 - Referências quantitativas para classificação final do produto quanto ao seu
potencial de irritação no HET-CAM............................................................................55
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO................................................................................................................17
2. REFERENCIA TEÓRICO...........................................................................................18
2.1.Mangiferina.................................................................................................................... 18
2.2. Encapsulação de ativos naturais.....................................................................................20
2.3. Sistemas carreadores de fármacos..................................................................................22
2.4. Liberação do fármaco a partir de nanosistemas.............................................................26
3.MATERIAIS.....................................................................................................................28
3.1. Métodos..........................................................................................................................28
3.1.1. Desenvolvimento das suspensões de nanocápsulas contendo mangiferina................29
3.2. Caracterização físico-química das suspensões de nanocápsulas de mangiferina...........30
3.2.1. Determinação do diâmetro de partícula e índice de polidispersão..............................30
3.2.2. Potencial zeta...............................................................................................................30
3.2.3. Determinação do pH....................................................................................................30
3.2.4. Validação de metodologia analítica por CLAE para a quantificação de suspensões de
nanocápsulas..........................................................................................................................31
3.2.5. Concentração de fármaco dissolvido na fase aquosa da suspensão e determinação da
taxa de associação do fármaco..............................................................................................32
3.2.6. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET).........................................................33
3.2.7. Teste de liberação da mangiferina através de diálise..................................................33
3.3. Avaliação da atividade biológica...................................................................................34
3.3.1. Viabilidade celular (MTT)..........................................................................................34
3.3.2. HET CAM (Hen’s egg test chorioallantoic membrane)……………………….........35
3.4. Análise estatística……………………………………………………………....….…..35
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................35
4.1. Preparação das suspensões e análise macroscópica.......................................................35
4.2. Avaliação físico-química das suspensões de nanocápsulas contendo mangiferina.......38
4.2.1. Determinação do diâmetro médio e índice de polidispersão.......................................38
4.2.2. Determinação do potencial zeta..................................................................................40
4.2.3. Determinação do pH das suspensões..........................................................................42
4.2.4. Determinação do teor da mangiferina nas suspensões................................................43
4.3. Validação de metodologia analítica por clae para a quantificação de suspensões de
nanocápsulas contendo mangiferina......................................................................................44
4.3.1. Especificidade.............................................................................................................44
4.3.2. Linearidade..................................................................................................................46
4.3.3. Repetibilidade e precisão intermediária......................................................................47
4.3.4. Exatidão.......................................................................................................................48
4.3.5. Robustez......................................................................................................................49
4.4. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)..............................................................49
4.5. Teste de liberação da mangiferina através de diálise.....................................................51
4.6. Viabilidade celular (MTT).............................................................................................53
4.7. HET CAM (Hen’s egg test chorioallantoic membrane)………………………….....…55
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS……………………………………………………....….58
Interdisciplinaridade..............................................................................................................59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………....…..60
ANEXO 1 : MANUSCRITO................................................................................................69
17
1. INTRODUÇÃO
Novas alternativas terapêuticas têm sido buscadas para o tratamento de doenças que
ainda são problemas de saúde em todo o mundo. Neste sentido, o uso de produtos naturais é
uma das possibilidades para a produção de novas formas farmacêuticas de liberação controlada,
a fim de garantir a uma maior biodisponibilidade e eficácia do fármaco. Cita-se, como uma
possibilidade, a mangiferina que caracteriza-se como é um composto natural que se aplica
exatamente nesta proposta (YUANYUAN et al., 2009).
A mangiferina (1,3,6,7-tetrahidroxi-xantona-C2-b-D-glucosilada) é um bioativo
natural, mais especificamente uma xantona glicosilada que foi originalmente isolada da
Mangifera indica L., a mangueira, pertencente à família Anacardiaceae, (MERWE et al., 2012).
Oriunda da Índia, a mangueira é atualmente cultivada em diversas partes do globo terrestre,
existindo diferentes variedades (PINTO, 2008). A mangiferina é um dos constituintes fenólicos
majoritários da mangueira, que pode ser detectada nas folhas, fruto, raízes e casca do caule
(RICHARDSON, 1983).
Este ativo possui uma variedade de atividades farmacológicas, destaca-se entre elas a
ação protetora de oligodendrócitos e neurônios corticais da excitotoxicidade, que impede a
perda neuronal na região do hipocampo, além de reduzir o déficit neurológico causado pelas
lesões isquêmicas em ratos, devido à sua ação antioxidante (ANDREU et al., 2010). Além disso,
a mangiferina apresenta atividade antidiabética, antitumoral, hepatoprotetora, antiviral e
anticâncer (YUANYUAN et al., 2009).
Um dos obstáculos da mangiferina é sua baixa solubilidade em água, além de baixa
estabilidade química e baixa biodisponibilidade oral, o que dificulta a formulação de uma forma
farmacêutica adequada para administração. Uma estratégia para preservar a integridade do
produto químico e aumentar a biodisponibilidade de ativos pouco solúveis em água é a
nanoencapsulação (SOUZA et al., 2009).
As nanocápsulas destacam-se por serem estruturas coloidais constituídas por vesículas
de um fino invólucro de polímero biodegradável e uma cavidade central com núcleo oleoso, no
qual a substância ativa encontra-se dissolvida ou dispersa, sendo por isso considerada um
sistema reservatório, o qual apresenta diâmetro submicrométrico (VAUTHIERet al.,2009).
Essas nanoestruturas apresentam inúmeros benefícios como redução de efeitos colaterais, maior
18
permeação dos fármacos através das mucosas, que podem proporcionar estabilidade física
máxima, além de proteger o ativo contra a degradação química e permitir um controle preciso
sobre a liberação dos componentes encapsulados durante o processo digestivo, para maximizar
a adsorção do fármaco, dessa forma, prolongando o tempo de ação (SOUZA et al., 2009). Esse
sistema apresenta alta eficiência para a encapsulação de fármacos lipofílicos e com baixo
conteúdo de polímero, o que fazem deles promissores veículos carreadores (BARRAS et al.,
2009).
Considerando as várias ações biológicas da mangiferina, sua aplicação terapêutica é
promissora, sendo importante investigar os seus possíveis efeitos em um sistema
nanoestruturado e também seus possíveis destinos metabólicos, visto que os efeitos da
mangiferina e os mecanismos farmacodinâmicos envolvidos nas suas ações não são conhecidos
com exatidão (POKORSKI et al., 2010). Assim, a elucidação desses mecanismos
farmacológicos é de grande importância para a descoberta e desenvolvimento de novos
fármacos (HUIHUI et al., 2011).
Sendo assim, o objetivo deste trabalho consiste no desenvolvimento e na caracterização
de nanocápsulas contendo mangiferina, tendo em vista ultrapassar as dificuldades associadas a
sua solubilidade, bem como explorar a estratégia para aumentar sua atividade biológica. E
também avaliar, preliminarmente, seu perfil tóxico com teste de viabilidade celular (MTT) e
irritabilidade (HET CAM).
19
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. MANGIFERINA
Na Figura 1, podemos observar a estrutura química da mangiferina (2-C-b-Dglicopiranosil-1,3,6,7-tetrahidroxi-xantona). Essa molécula é uma xantona glicosilada, obtida
de folhas, frutos e do córtex de Mangifera indica L. Na sua estrutura química destacam-se,
vários grupos catecólicos, que cumprem os requisitos para chegar a uma alta biodisponibilidade
oral e uma potente ação antioxidante. A mangiferina por ser uma xantona, também pode
aparecer na forma de aglicona, após a perda do resíduo glicosídico por hidrólise, que pode
ocorrer durante o metabolismo (GARRIDO et al., 2008).
A mangiferina é um pó sólido amarelo com ponto de fusão > 260 °C, que absorve
fortemente a luz ultravioleta, apresenta atividade óptica devido à presença do resíduo de glicose
(GÓMEZZALETA et al., 2006). Em razão da ligação heterosídica que ocorre através de uma
ligação carbono-carbono, sua estrutura mostra-se mais resistente à hidrólise ácida, alcalina e
enzimática do que a dos O-heterosídeos (SANUGUL et al., 2005). Por meio de difração de raioX, Cruz e colaboradores (2008), descobriram que a estrutura cristalina de mangiferina é
constituída por duas moléculas da xantona ligadas a cinco de água, sendo estabilizada pela
formação de pontes de hidrogênio intermoleculares (CANUTO, 2009).
Figura 1 - Estrutura molecular da mangiferina (CORREIA et al., 2006, GARRIDO et al., 2008).
O uso farmacológico da mangiferina está presente comercialmente em Cuba. A Vimang
é uma formulação padronizada de um extrato aquoso obtida a partir da casca de variedades
20
selecionadas de Mangifera indica L. , que está registrado como anti- inflamatório fitoterápico
pelas Autoridades Sanitárias Regulatórios cubanos e disponível como xarope, comprimido e
creme. Esse extrato natural é popularmente usado em Cuba para melhorar a qualidade de vida
dos pacientes que sofrem de vários tipos de câncer.A caracterização química do extracto levou
ao isolamento de sete componentes fenólicos, dos quais a mangiferina é o componente
predominente (GARCÍA-RIVERA et al., 2011; SOUZA et al., 2009).
A mangiferina tem sido relatada como um antioxidante neuroprotetorem estudos in vitro
e em modelos in vivo de isquemia. Esses relatos demonstram que a morte celular causada por
glutamato em culturas neuronais foi diminuída na presença de concentrações de mangiferina e
morina (outro polifenol antioxidante), que, por sua vez, atenua o estresse oxidativo, bem como
a apoptose (GOTTLIEB et al., 2006). Essas substâncias que têm ação antioxidante podem
interferir em processos patológicos neurais, levando à melhoria da qualidade de vida
(GARRIDO et al., 2008). A isquemia cerebral induz a perda neuronal que é causada em parte
pela excitotoxicidade e formação de radicais livres (GOTTLIEB et al., 2006). A mangiferina
protege neurônios, prevenindo ou retardando o surgimento de doenças neurodegenerativas,
processos inflamatórios e até mesmo de neoplasias (CANUTO, 2009).
Em estudos com células neoplásicas de ratos, a mangiferina demonstrou potencial para
o tratamento de doenças, como o Mal de Parkinson, por meio da reversão dos efeitos
neurotóxicos do 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina, uma neurotoxina causadora de
parkinsonismo, capaz de induzir a formação de radicais livres, principalmente radicais hidroxila
e superóxido (AMAZZAL et al., 2007). Em teste de toxicidade induzida por 13-acetato de 12O-tetradecanoilforbol, a mangiferina (50 mg/kg, via oral), administrada uma vez por dia durante
sete dias, ofereceu proteção contra danos a tecidos cerebrais de camundongos, atenuando a
peroxidação lipídica e a fragmentação de DNA (SÁNCHEZ et al., 2000, GOTTLIEB et al.,
2006; PREISSLER et al., 2009; CANUTO, 2009).
O grande interesse na mangiferina é decorrente de sua ampla gama de ações biológicas,
como por exemplo, efeito gastroprotetor, analgésico, antibacteriano, juntamente com atividades
citoprotetoras, relatada acima (FERREIRA et al., 2013). Crescentes evidências confirmam que
esse ativo exibe ações como antialérgico, anti-inflamatório e antioxidante e pode ser usado no
tratamento de uma variedade de condições inflamatórias e imunológicas (PREISSLER et al.,
2009).
21
No entanto, estas atividades farmacológicas não necessariamente conduzem a um efeito
biológico in vivo, o que implica uma fraca biodisponibilidade, devido à sua baixa solubilidade
em água. Outros dados relatam também que o coeficiente de partição (logP) da mangiferina em
óleo-água e em tampão fosfato (pH 6,8) é 0,15, o que indica que esse ativo possui uma má
solubilidade lipídica. De acordo com o sistema de classificação biofarmacêutica (SCB), a
mangiferina pertence à classe IV, assim, a entrega por via oral é parcialmente prejudicada
devido à sua baixa permeabilidade intestinal. Administração de medicamentos por via oral é o
meio mais conveniente de administração ao paciente, mas é, muitas vezes, limitada pela baixa
permeabilidade do fármaco através do epitélio gastrointestinal (WANG X. e ZHANG Q.,
2012; FERREIRA et al., 2013).
Em virtude de todos esses efeitos farmacológicos, estudos toxicológicos experimentais
são essenciais para a determinação dos riscos da administração deste ativo, mas há poucos
dados disponíveis em relação ao potencial toxicológico da mangiferina. Em um estudo
realizado, a DL50 da mangiferina foi superior a 5000 mg/kg em ratos, sob doses orais, alguns
sinais de toxicidade transitórios como dispnéia, indisposição abdominal, piloereção e atividade
locomoção reduzida foram observadas (SOUZA, 2009; RODEIRO et al., 2012).
2.2. ENCAPSULAÇÃO DE ATIVOS NATURAIS
Compostos alimentares naturais com benefícios à saúde oferecem oportunidades de
melhorar a saúde pública. A manga é um desses alimentos que, apesar do vasto consumo da
fruta, possui uso medicinal pouco conhecido pela população, sendo quimicamente rica em
compostos fenólicos, entre eles, como citado, a mangiferina (SOUZA et al., 2009).
Nas últimas décadas, o foco está no desenvolvimento de fármacos de origem natural, os
grandes avanços foram feitos na criação de novos medicamentos com sistemas de entrega
utilizando esses ativos. As formulações poliméricas como nanopartículas, nanocápsulas,
lipossomas, nanoemulsões, microesferas foram relatadas usando bioativos e extratos de plantas
como tendo notáveis vantagens sobre as formulações convencionais, que incluem aumento da
solubilidade, biodisponibilidade, a proteção contra a toxicidade, o aumento da atividade
22
farmacológica, aumento da estabilidade, melhorada na distribuição de macrófagos teciduais,
entrega sustentada e proteção contra degradação física e química (AJAZUDDIN, 2010).
A lipossolubilidade e o tamanho molecular de uma substância são muito importantes,
sendo um dos principais fatores limitantes para o fármaco atravessar as membranas biológicas
e ser absorvido sistematicamente. Vários extratos vegetais e fitomoléculas, apesar de terem
excelente bioatividade in vitro, demonstram menores ou nenhuma atividade in vivo, devido à
sua limitada solubilidade lipídica e/ou tamanho molecular impróprio, que resulta em pouca
absorção e biodisponibilidade. Extratos padronizados de plantas ou fitoconstituintes,
principalmente polares, como os flavonóides, terpenóides, taninos e xantonas quando
administrados através de novos sistemas de entrega de fármacos mostram absorção muito
maior, perfil que lhes permite atravessar as membranas biológicas. Assim, uma maior
concentração de constituinte ativo torna-se presente no local de ação (TEIXEIRA et al., 2005;
AJAZUDDIN, 2010; SOUZA et al., 2009).
A fraca solubilidade aquosa das xantonas, sendo a mangiferina uma delas, é uma grande
desvantagem, não só para a sua utilização terapêutica, mas também para avaliação in vitro de
sua atividade biológica. Uma alternativa para superar a dificuldade de administração de
composto fracamente solúveis em água é a sua incorporação em nanopartículas poliméricas. De
acordo com estudos, isso depende basicamente das condições de processamento, que podem
ser obtidas tanto por sistemas de nanoesferas como por de nanocápsulas preparados com
deslocamento de solvente, técnica descrita por Fessi e colaboradores (1989). Trata-se de um
método que é particularmente útil para o encapsulamento de substâncias lipofílicas (TEIXEIRA
et al., 2005).
Assim como a mangiferina, a curcumina (um princípio ativo natural, encontrado no
açafrão amarelo que possui propriedades antidiabéticas) também possui a desvantagem de ser
fracamente absorvida no trato gastrointestinal, devido à sua baixa solubilidade em água e baixa
estabilidade química. Grama e colaboradores (2013) desenvolveram uma formulação
denominada nanocurcumina, da qual obtiveram 56% de curcumina encapsulada, apresentando
resultados positivos na melhora da biodisponibilidade oral, assim como, diminuindo o
desenvolvimento da progressão da catarata em um modelo experimental de diabetes. Os efeitos
benéficos da nanocurcumina sobre as vias bioquímicas foram nitidamente superior em
comparação com a curcumina convencional.
23
2.3. SISTEMAS CARREADORES DE FÁRMACOS
O desenvolvimento de fármacos nanopartículados como vetores de ativos é atualmente
um dos principais temas em pesquisas farmacêuticas para superar os problemas comuns, como
o de baixa solubilidade de um fármaco. A nanoencapsulação tem o potencial de melhorar a
solubilidade de ativos lipofílicos e proteger as moléculas lábeis do ambiente biológico. Além
disso, as nanocápsulas parecem oferecer numerosos benefícios terapêuticos, uma vez que
possibilitam a entrega do fármaco específicamente no alvo de ação, bem como o transporte
através de superfícies de mucosas após a administração (PREETZ et al., 2008).
As nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de fármacos estáveis e
eficientes, geralmente apresentam de 100-500 nm, e englobam as nanocápsulas e as nanoesferas
(MORA-HUERTAS et al., 2010). As nanocápsulas e as nanoesferas são sistemas poliméricos
que diferem de acordo com sua estrutura, compostas por um invólucro polimérico e um núcleo
oleoso (VAUTHIER, et al.,2009). De acordo com o método de preparação utilizado, pode
transportar a substância ativa em sua superfície, embebida na membrana polimérica e/ou na
cavidade do sistema oleoso (MORA-HUERTAS et al., 2010). Já as nanoesferas são compostas
por uma matriz polimérica e o fármaco à encapsular fica aprisionado dentro da nanopartícula
ou adsorvido em sua superfície (VAUTHIER et al., 2009).
O método mais empregado para obtenção de nanocápsulas é a nanoprecipitação com
deslocamento do solvente ou como também é chamado deposição interfacial de polímero préformado, descrito por Fessi e colaboradores (1988). Esse sistema de síntese de nanocápsulas
necessita de uma fase aquosa e de uma fase oleosa para sua preparação. A fase oleosa consiste
essencialmente de uma solução em um solvente ou em uma mistura de solventes (por exemplo,
etanol, acetona, hexano, metileno ou dioxano) e de uma substância de formação de película tal
como um polímero (sintético, semi-sintético ou um polímero de ocorrência natural), de uma
substância ativa, um óleo e um tensoativo de baixo BHL. Por outro lado, a fase aquosa é
constituída por um não solvente (água) ou uma mistura de não solventes para a substância de
formação de película, suplementado com um ou mais tensoativos que ocorrem naturalmente ou
podem ser sintéticos (MORA-HUERTAS et al., 2010).
Como já descrito acima, as nanocápsulas são compostas de um núcleo oleoso envolto
por uma membrana polimérica com tensoativo na interface. Um estudo sugeriu concentrações
dos constituintes de uma suspensão de nanocápsulas, que podem ser usados para obtenção de
24
nanoestruturas com tamanho de 150-200 nm. Para o tensoativo, podem ser usadas
concentrações de 0,2 a 0,5%, mesma faixa na qual pode ser usada para o polímero. Já para o
óleo, pode-se utilizar uma concentração de 1,0 a 5,0%, sempre levando em consideração
quantidade de solvente empregado no sistema (25 mL de solvente e 50 mL de não solvente).
Os óleos utilizados podem ser vegetais ou minerais, devendo apresentar ausência de toxicidade,
assim como não devem ser capazes de degradar ou solubilizar o polímero e possuir alta
capacidade de dissolver o fármaco em questão (LEGRAND et al.,1999; MORA-HUERTAS et
al., 2010).
Entre as principais vantagens da utilização das nanocápsulas, encontra-se a vetorização
de fármacos, pois a capacidade de liberação controlada e seu tamanho relativamente subcelular
permitem maior liberação intracelular do fármaco, quando comparado a outros sistemas de
partículas. As nanocápsulas melhoram a estabilidade dos fármacos, seja por degradação pelo
pH, seja pela ação da luz, oxigênio ou outros componentes das formulações. Além disso, elas
diminuem a irritação causada por substâncias ativas nos tecidos, pois sua parede polimérica
reduz o contato do fármaco com os tecidos (MORA-HUERTAS et al., 2010;PREETZ et al.,
2008).
É importante ressaltar que as nanocápsulas apresentam-se também como potenciais
vetores para entrega dirigida de fármacos ao sistema nervoso central (SNC), pois facilitam as
circulações dos fármacos através da barreira hematoencefálica (BHE). O mecanismo correto de
como as nanocápsulas aumentam a concentração do fármaco no cérebro não é conhecido com
exatidão, mas diversas hipóteses são relatadas, incluindo aumento da retenção dos fármacos
nos capilares sanguíneos do cérebro associados a sua adsorção nas paredes dos capilares, neste
caso, com o gradiente de concentração mais elevado nas nanocápsulas ocorreria um aumento
na transposição do fármaco através da BHE (ALAM et al., 2010). Também é citado o aumento
da fluidificação da membrana da BHE, acarretando a inibição do sistema de refluxo da
glicoproteína-P e endocitose seletiva, seguido de liberação intracelular do fármaco (ALAM et
al., 2010; INTAKHAB et al., 2010; MISTRYet al., 2009).
Vários estudos demonstram que moléculas de fármacos foram entregues com sucesso
utilizando nanocápsulas, por exemplo, dalargin, loperamida, tubocurarina e doxorrubicina.
Essas moléculas baseadas em peptídios foram entregues ao cérebro, usando nanopartículas de
polibutilcianoacrilato revestidas com polissorbato 80 (tensoativo). Existe a hipótese de que o
revestimento das nanocápsulas poliméricas com polissorbato 80 pode ser fundamental para a
25
vetorização cerebral, pois o polissorbato 80 promoveria seletivamente a adsorção de certas
proteínas plasmáticas, como a apolipoproteína E, na superfície das nanocápsulas (INTAKHAB
et al., 2010).
Freddo (2009) mostrou a viabilidade de nanocápsulas de ácido valpróico, que
promoveram o aumento da penetração cerebral do fármaco e a redução da hepatotoxicidade do
mesmo, indicando um potencial dessa formulação para o desenvolvimento de medicamentos
para o tratamento da epilepsia.
O polímero empregado na preparação destes sistemas carreadores de fármacos deve
apresentar características de inocuidade, biocompatibilidade, estabilidade, facilidade de
processamento, cinética de biodegradação adequada e não se acumular indefinidamente nos
tecidos (LIMA, 1998). Existem três mecanismos gerais pelos quais os fármacos são liberados
do polímero: (1) difusão do fármaco do sistema e através dele; (2) uma reação química ou
enzimática, permitindo a degradação do sistema ou clivagem do fármaco do sistema e (3)
ativação do solvente, através da osmose ou inchaço do sistema. Ainda, uma combinação dos
mecanismos é possível (LANGER, 1998).
Os polímeros mais utilizados são os poliésteres biodegradáveis, especialmente poli-ecaprolactona (PCL), poli (láctido) (PLA) e poli (lactido-co-glicolide) (PLGA). O Eudragit®
também pode ser utilizado, e ainda, os copolímeros do ácido metacrílico e de um éster acrílico
ou metacrílico, podem outros polímeros, tais como poli (alquilcianoacrilato (PACA). Assim
como os polímeros sintéticos têm maior pureza e melhor reprodutibilidade do que polímeros
naturais. Por outro lado, alguns polímeros como o PEG copolimerizado, diminuem o
reconhecimento das nanocápsulas pelo sistema mononuclear fagocitário (SCHAFFAZICK et
al., 2003; MORA-HUERTAS et al., 2010).
26
Figura 2 - Fórmula estrutural do Eudragit® (ROHM, 2003).
Polímeros, como os polimetacrilatos, apresentam-se em diferentes tipos e variadas
características de solubilidade.
Dentre os principais, destacam-se os comercialmente
denominados Eudragit® (figura 2) dos tipos E, L, S, RL, RS e NE30D. Polímeros, como os
polimetacrilatos, são amplamente utilizados na indústria farmacêutica, denominados agentes
formadores de filmes (MOUSTAFINE et al., 2005). Os polimetacrilatos são produtos da
polimerização aniônica do ácido metacrílico e metacrilato de metila, sendo que a proporção do
grupo carboxila livre em relação ao éster é aproximadamente 1:1 no Eudragit® L e 1:2 no
Eudragit® S (ESPOSITO et al., 2002).
O Eudragit® do tipo L100, atualmente, possui muitas aplicações na indústria
farmacêutica e cosmética, principalmente como veículo para entrega de fármacos, em materiais
de revestimento entérico e no desenvolvimento de produtos com características físico-químicas
diferentes (CAPPELLA, BOERIS e PICÓ, 2011).
O Eudragit® dos tipos S e L, poli(ácido metacrílico-co-metacrilato de metila), são
descritos como polímeros do tipo A e B. Eudragit® L100 e Eudragit® S100 são os polímeros
mais comumente utilizados e possuem a propriedade de serem pH dependentes, ou seja, sendo
insolúvel em pH ácido e solúvel em soluções neutras ou alcalinas, liberando o fármaco
lentamente em meios com pH em torno de 6,0, para o Eudragit®L100 e pH 7,0 para o
Eudragit®S100. Além disso, são compostos não tóxicos, tornando-se adequados para diferentes
fins, mas principalmente para fármacos de administração oral (AKHGARY et al., 2005; WANG
X. e ZHANG Q., 2012).
Em um estudo realizado para avaliar o perfil farmacocinético (em modelagem), de
nanopartículas de ciclosporina com Eudragit® S100 liofilizados, verificou-se que a
biodisponibilidade da ciclosporina foi significativamente melhorada. Em função do polímero
27
solúveis entericamente (Eudragit® S100), os perfis de libertação das nanocápsulas de
ciclosporina exibem sensibilidade ao pH, havendo uma libertação brusca da ciclosporina a
partir de nanopartículas na parte específica do trato gastrointestinal, diminuindo o metabolismo
do fármaco por enzimas gastrointestinais e
aumentando a biodisponibilidade oral da
ciclosporina (LIU et al., 2012).
Aqui, salienta-se que o equilíbrio entre os gradientes de concentração, absorção e
estabilidade do fármaco são muito importantes. Por exemplo, para peptídeos, tais como a
clindamicina e TP5, a estabilidade é um importante obstáculo, e o local de absorção principal é
a parte inferior do intestino delgado. O Eudragit® S100 pode melhorar a sua estabilidade de
forma eficaz, embora a possibilidade de absorção na parte inferior do intestino seja limitada.
Por outro lado, para aqueles fármacos estáveis no estômago e no intestino delgado superior, tais
como, rodamina e o fenofibrato, a oportunidade de absorção é um fator chave, e polímeros
adequados, dissolvido em pH baixo deve ser selecionados. Em resumo, as nanopartículas
sensíveis ao pH fornecem uma grande oportunidade para fármacos insolúveis em água ou
peptídeo/proteína, de melhorar sua absorção oral, embora ainda haja muito caminho a ser
percorrido antes deste sistema de entrega de fármacos possa ser utilizado na clínica (WANG
X. e ZHANG Q., 2012).
2.4. LIBERAÇÃO DO FÁRMACO A PARTIR DE NANOSISTEMAS
Nos últimos anos, diferentes sistemas carreadores de fármacos têm sido estudados com
o intuito de controlar a liberação de fármacos em sítios de ação específicos, otimizando a
velocidade de entrega, gerando respostas adequadas por períodos de tempo prolongados,
otimizando a posologia e ainda melhorando o índice terapêutico por aumentar a eficácia e/ou
reduzir a toxicidade de fármacos (SCHAFFAZICK et al., 2003; WANG X. e ZHANG Q.,
2012).
Normalmente, a liberação do fármaco a partir de nanopartículas poliméricas mostra um
padrão bifásico. Inicia-se com uma rápida liberação (efeito burst), devido à dissolução rápida
do fármaco em/ou próximo à superfície e uma liberação exponencial e lenta subsequente,
devido à difusão do fármaco do interior da nanopartícula para o meio. Os sacos de diálise
28
utilizados para ensaios de liberação possuem poros na ordem de 10.000 Da e são produzidos
em acetato de celulose e formam mais uma barreira para a liberação do fármaco neste tipo de
experimento, que também precisa ultrapassar o núcleo e/ou a membrana polimérica da
nanocápsula, para então ser liberado e quantificado no meio de liberação (WANG et al., 2007).
A liberação do fármaco a partir dos nanocarreadores dá-se por difusão do fármaco através
do polímero, pela erosão do polímero (degradação ou solubilização) ou pela combinação destes
dois processos (SCHAFFAZICK et al., 2003). Alguns fatores também podem afetar a liberação
do fármaco e isso pode ocorrer na estrutura da matriz polimérica devido às propriedades físicoquímicas das moléculas envolvidas na formulação de nanocápsulas. O peso molecular do
polímero, distribuição do fármaco, mistura de polímeros, cristalinidade e outros fatores são
importantes nas manipulações de perfis de liberações (FRIBERG e ZHU, 2004).
Em um estudo, pesquisadores desenvolveram um sistema de quitosana com Eudragit® e
incorporaram peptídeos. Como um fármaco modelo, timopentina (TP5, Arg -Lys - Asp - Val Tir) e insulina foram incorporadas. Para TP5, dois tipos de nanopartículas foram preparadas:
nanopartículas contendo apenas quitosana e nanopartículas contendo Eudragit® S100 associado
com quitosana. Com nanopartículas de quitosana, a TP5 mostrou uma libertação brusca de 45%
em 60 min e 100% de libertação do fármaco em 24 horas, quando incubada em 0,1 N HCl.
Enquanto a liberação foi retardada para pH 7,4 (tampão fosfato salino) e pH 5,0, o percentual
de libertação máxima foi de 85,5% e 60,7% em 24 horas, respectivamente. No entanto, o
percentual máximo de liberação de TP5 nanopartículas Eudragit® S100 com quitosana é de
24,6% em HCl 0,1 N, 41,0%, em (tampão fosfato salino) pH 5,0 foi de 81,4 % e em tampão
fosfato de pH 7,0 em 24 horas, respectivamente. Para a insulina, além da quitosana, diferentes
Eudragit® (L100-55, L100 e S100) foram usadas como polímero carregado negativamente. A
liberação de insulina a partir de três tipos de nanopartículas demonstraram óbvia sensibilidade
ao pH (WANG X. e ZHANG Q., 2012).
Os estudos de liberação in vitro de fármacos determinam a fração do fármaco liberado das
estruturas em função do tempo. A caracterização do perfil de liberação do fármaco pode
fornecer informações quanto à estrutura do sistema, o mecanismo envolvido no processo de
liberação e, ainda a interação fármaco-carreador (WASHINGTON, 1990; FREIBERG e ZHU,
2004).
29
3. MATERIAIS
2. Ácido acético glacial;
3. Álcool etílico absoluto P.A– Vetec®;
4. Ácido acético glacial P.A – Fmaia®;
5. Dimetilsulfóxido P.A.;
6. Eudragit® S100,Poli(metil metaacrilato-co-ácido metacrílico), - Röhm Pharma
Polymers;
7. Etanol grau CLAE – Merck®
8. Mangiferina (98% pureza) (Sigma-Aldrich);
9. Membrana de celulose para tubos de diálise (10.000 Da; 25 mm) - Sigma
Aldrich®;
10. Metanol grau CLAE - J.T. Baker®;
11. Monoestearato de sorbitano - Sigma Aldrich®;
12. Polissorbato 80 - Via Farma®;
13. Triglicerídeos de ácido capríco e caprilíco - Via Farma®;
14. Membrana de acetato de celulose (0,45 μm; 25 mm) - Millipore®
15. Todos outros reagentes e solventes utilizados foram de grau P.A. fornecidos pela
Nuclear®, Via Farma®, Merck® e Sigma Aldrich®.
3.1. MÉTODOS
As atividades desenvolvidas durante a pesquisa foram realizadas no Laboratório de
Nanotecnologia e no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos do Centro
Universitário Franciscano.
30
3.1.1. DESENVOLVIMENTO DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS CONTENDO
MANGIFERINA
As suspensões foram preparadas através da técnica de deposição interfacial do polímero
pré-formado descrita por Fessi e colaboradores (1989) e modificada por Venturini e
colaboradores (2011). A composição das fases empregadas no desenvolvimento das suspensões
está descrita na Tabela1. Os componentes da fase oleosa e da fase aquosa das suspensões foram
pesados em balança analítica em béqueres separados. A mangiferina foi solubilizada no DMSO,
para então ser adicionada na fase oleosa. Posteriormente, as fases foram aquecidas (em banhomaria) à temperatura aproximada de 40 ºC ao mesmo tempo em que ocorria agitação magnética
moderada, até completa dissolução dos componentes. Em seguida, a fase oleosa foi vertida com
o auxílio de um funil sobre a fase aquosa, mantendo-se a agitação durante 10 minutos. Após,
evaporou-se o solvente orgânico e o excesso de água a pressão reduzida em evaporador
rotatório. Por fim, as suspensões foram transferidas para um balão volumétrico para um volume
final 25 mL e a concentrações de mangiferina obtida foi de 250 µg/mL.
Tabela 1 - Composição das suspensões de nanocápsulas contendo mangiferina, para um
volume final de 25 mL.
Fase Oleosa
Concentração
Mangiferina
0,00625 g
Eudragit® S100
Monoestearato
0,25 g
de
0,0962 g
Adipato de isopropila
0,395 g
DMSO
200 µL
Etanol
62,5 mL
sorbitano
Fase Aquosa
Concentração
Polissorbato 80
0,385 g
Água
125 ml
31
3.2.
CARACTERIZAÇÃO
FÍSICO-QUÍMICA
DAS
SUSPENSÕES
DE
NANOCÁPSULAS DE MANGIFERINA
3.2.1. DETERMINAÇÃO DO DIÂMETRO DE PARTÍCULA E ÍNDICE DE
POLIDISPERSÃO
As determinações do diâmetro e do índice de polidispersão das nanopartículas foram
realizadas através de espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer® nano-ZS modelo ZEN 3600,
Malvern), após diluição das dispersões em água (500 vezes, v/v). Os resultados estão expressos
em nanômetros (nm) em triplicata de três lotes de suspensões.
3.2.2. POTENCIAL ZETA
O potencial zeta é determinado utilizando técnicas de eletroforese e reflete o potencial
da carga de superfície das partículas, o qual é influenciado pelas mudanças na interface com o
meio dispersante, em razão da dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou
da adsorção de espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão (SCHAFFAZICK et al.,
2003; RAFFIN et al., 2011).
O potencial zeta foi obtido através de eletroforese (Zetasizer® nano-Zs modelo ZEN
3600, Malvern), após diluição das dispersões em solução de NaCl 10 mM (500 vezes v/v). Os
resultados estão expressos em milivolts (mV) a partir de três determinações de suspensões
diferentes.
3.2.3. DETERMINAÇÃO DO pH
O pH das formulações foi determinado utilizando potenciômetro Digimed®, previamente
calibrado (com soluções padrão de pH 4,0 e 7,0), diretamente nas dispersões coloidais. Os
resultados estão expressos a partir da leitura de três suspensões diferentes.
32
3.2.4.
VALIDAÇÃO
DO
MÉTODO
ANALÍTICO
POR
CLAE
PARA
A
QUANTIFICAÇÃO DE MANGIFERINA EM SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS
A validação do método analítico foi realizada segundo os critérios propostos pela
resolução da ANVISA RE n° 899, de 29/5/2003 e pela International Conferenceon
Harmonization (ICH) de 2003 e 2005. Os parâmetros analíticos avaliados para o
desenvolvimento deste trabalho foram: especificidade, linearidade, precisão intermediária,
repetibilidade, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez.
A especificidade do método das nanocápsulas foi avaliada através de análises
comparativas entre as amostras de mangiferina a 98%, nanocápsula brancas e nanocápsulas de
mangiferina, por meio da técnica por CLAE, realizada em todas as amostras durante o período
de desenvolvimento do método.
A linearidade do método foi avaliada a partir da análise de uma curva padrão nas
concentrações de 1, 5, 10, 15, 20, 25 μg/mL de mangiferina. Os limites de detecção (LD) e
quantificação (LQ) foram determinados a partir da inclinação e do desvio padrão do intercepto
da média das três curvas padrões (ANVISA, 2003). Os resultados foram tratados
estatisticamente pela ANOVA seguida do teste de Tukey com auxílio do software
GraphPadPrism versão 5.0 (GraphPad, EUA).
A precisão do método foi avaliada pelo mesmo analista, repetindo o procedimento
necessário para as análises em um período curto de tempo (repetibilidade) e por precisão
intermediária (reprodutibilidade interna), realizada por meio de outro analista em dias
diferentes, porém com os mesmos equipamentos. O ensaio constituiu-se na concentração de 10
μg/mL e os resultados foram analisados por meio do desvio padrão relativo (DPR).
A exatidão do método foi determinada a partir de ensaios de recuperação de três
concentrações conhecidas do padrão: 2,5, 7,5 e 12,5 μg/mL. Adicionou-se para cada
concentração do padrão a amostra na concentração de 2,5 µg/mL. O resultado foi expresso
percentualmente pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a
concentração teórica correspondente a 50, 100 e 150% de mangiferina adicionadas nas
amostras.
33
Para determinar se o método desenvolvido foi robusto, optou-se por utilizar uma faixa
de temperatura entre 30 ºC e 40 ºC, pH (3,0 ; 4,0) e vazão de 0,6 e 1,0 mL/min. Esses resultados
foram tratados estatisticamente pela ANOVA seguida do teste de Tukey com auxílio do
software GraphPadPrism versão 5.0 (GraphPad, EUA).
As condições analíticas cromatográficas utilizadas foram: a vazão de 0,8 mL/min, o
volume de injeção de 20 µl e em um comprimento de onda (λ) de 254 nm. A temperatura da
coluna foi de 35 ºC e a fase móvel foi composta por água e metanol em uma proporção 70:30
(v/v), pH 3,5. As análises da mangiferina foram realizadas em cromatografia líquida de alta
eficiência Prominence (Shimadzu, Japão), coluna C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) Shim-pack CLCODS (Shimadzu, Japão) empacotada com 5 μm Nucleosil C18 (fase estacionária), a pré coluna
do mesmo material - Shim-pack G-ODS (Shimadzu, Japão), equipado com bomba modelo LC20AT, utilizando detector ultravioleta com comprimento de onda variável UV/VIS modelo
SPD-M20A.
3.2.5. DOSEAMENTO DA MANGIFERINA E DETERMINAÇÃO DA TAXA DE
ASSOCIAÇÃO DO FÁRMACO
A determinação da taxa de associação do fármaco à nanopartícula também é importante.
No entanto, essa técnica torna-se difícil, pois deve-se separar a fração de fármaco livre da fração
de fármaco associada à nanopartícula. Uma técnica que possibilita essa separação é a
ultrafiltração-centrifugação, na qual se utiliza uma membrana com poros de 10.000 Da e,
através dela separa-se a parte aquosa dispersante da suspensão coloidal. Ao quantificar o
fármaco na fase aquosa, subtraem-se do total obtendo a taxa de associação do fármaco as
nanopartículas (CRUZ, 2005).
Inicialmente, as concentrações de mangiferina dissolvida na fase aquosa da dispersão
(correspondendo ao fármaco solúvel e não encapsulado) foram determinadas através da técnica
de ultrafiltração-centrifugação das suspensões (membrana Microcon® MC Millipore 10.000
Da) por 15 minutos a 7500 rpm, quantificando o fármaco livre no ultrafiltrado por CLAE
conforme descrito por Guterres e colaboradores (1995).
O conteúdo de mangiferina foi verificado em todas as formulações. Para isso, a
concentração total das suspensões coloidais foram tratadas com metanol e água (pH 3,5), 73:30
34
(v/v) ocasionando a liberação e dissolução do ativo contido no interior das nanocápsulas. As
análises da mangiferina foram realizadas em cromatografia líquida de alta eficiência
Prominence (Shimadzu, Japão), coluna C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) Shim-pack CLC-ODS
(Shimadzu, Japão) empacotada com 5 μm Nucleosil C18 (fase estacionária), a pré coluna do
mesmo material - Shim-pack G-ODS (Shimadzu, Japão), equipado com bomba modelo LC20AT, utilizando detector ultravioleta com comprimento de onda variável UV/VIS modelo
SPD-M20A. As amostras foram realizadas com detecção em 254 nm, fase móvel isocrática de
metanol e água em uma proporção 70:30 (v/v), com pH de 3,5, volume de injeção de20 µLe
fluxo de 0,8 mL/min.
Neste caso, a concentração de fármaco associado às nanopartículas foi calculada
considerando a diferença entre a concentração total (CT) de fármaco na formulação e a
concentração de fármaco dissolvido livre, (CL) na fase aquosa da dispersão sobre a
concentração total, multiplicada por 100 (Equação 1).
Figura 3 - Equação para a determinação da taxa de encapsulação.
3.2.6. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET)
A morfologia das amostras foi analisada em microscópio eletrônico de transmissão JEM
1200EX II (Centro de Microscopia Eletrônica da UFRGS) operando em 120 kV, com um
aumento de 50.000, 100.000 e 300.000 vezes. As suspensões foram diluídas na proporção de
1:10 (v/v) em água e depositadas diretamente nos grids utilizados para a observação das
amostras, utilizando como contraste solução de acetato de uranila (2% m/v).
3.2.7. TESTE DE LIBERAÇÃO DA MANGIFERINA ATRAVÉS DE DIÁLISE
Foram utilizadas membranas de acetato de celulose (10.000 Da; 25 mm, Sigma Aldrich)
como sacos de diálise. Os sacos foram hidratados com água por 24 horas antes do início do
teste de diálise. Após, foram preenchidos com 4 mL de suspensão de nanocápsulas, suspensão
35
branca ou mangiferina na forma livre e imersos em 50 mL de meio de liberação, constituído de
solução tampão fosfato pH 7,4, e conservados a uma temperatura de 37 °C, sendo
constantemente agitados com uma barra magnética. Alíquotas de 2 mL do meio de liberação
foram coletadas em intervalos de tempo pré-determinados (1, 3, 5, 7, 9, 11 e 24 horas). A cada
retirada dessa solução foram recolocados 2 mL de novo meio de liberação no béquer. As
amostras foram filtradas em filtros com poros 0,45 μm (Macherey-Nagel®) e analisadas por
CLAE. As formulações de nanocápsulas com mangiferina, sem mangiferina, e a mangiferina
na forma livre foram analisadas em triplicata.
3.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA
3.3.1. VIABILIDADE CELULAR COM MTT
O teste foi realizado com células VERO em placa de cultura celular com 96 poços.
Alíquotas contendo 2x104 células/mL foram transferidas para cada poço da placa e cultivadas
por 24 horas a 37 ºC em estufa com 5% de CO2. Após a formação da monocamada, as células
foram tratadas com suspensão de nanocápsulas brancas e nanocápsulas com mangiferina e
mangiferina livre nas concentrações de 0,75, 1,5 e 2,5 µg/mL. No controle negativo, foram
utilizadas somente células e meio de cultura RPMI 1640 (Gbico®) suplementado com 10% de
soro fetal bovino (SFB), incubada por 48 horas a 37ºC e em estufa com 5% de CO2. Após esse
período de incubação, foram adicionados 20 µL de MTT (3-(4, 5-dimetiltiazol-2)-2, 5-difenil
brometo tetrazólico) fornecidos pela Invitrogen, na concentração de 5 mg/mL e incubado
novamente por 4horas. O sobrenadante foi retirado e os cristais azuis (fomazan) formados foram
dissolvidos em 150 µL de DMSO. A absorbância foi determinada a partir da leitora de ELISA
espectrofotométrica com comprimento de onda de 570 nm. Os testes foram realizados em
triplicata. Os dados foram avaliados utilizando o método estatístico de Análise de Variância
(ANOVA) e em posterior o teste de Tukey. Para todos os grupos consideraram-se
estatisticamente significativos quando p<0,05 (utilizou-se o software GraphPad Prism versão
5.0 - GraphPad, EUA).
36
3.3.2. HET CAM (Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane)
Os ovos fertilizados (com aproximadamente 50 g) de galinhas Leghorn foram incubadas
durante nove dias. No dia 10, a membrana córion-alantóide foi exposta a 0,3 mL de suspensão
de nanopartículas, mangiferina livre e suspensão de nanocápsulas sem fármaco na concentração
de 250 µg/mL. Após 20 segundos de contato, a membrana foi lavada com 5 mL de NaCl 0,9
%. A membrana foi inspecionada visualmente para a vasoconstrição, hemorragia e coagulação
por 5 minutos e graduada para o efeito irritante, de acordo com a Tabela 5. No grupo controle
positivo, foi utilizado o NaOH 0,01 N (substância irritante severa) e dodecil sulfato de sódio a
5% (substância irritante leve). Para o controle negativo, foi o NaCl a 0,9% (não irritante)
(FELIPPI et al., 2012; LUEPKE, 1986). A graduação dos fenômenos foi realizada em triplicata,
tanto para a quantidade de ovos quanto para a análise visual. A classificação da substância teste
é obtida pelo valor médio de 3 ovos e 3 avaliadores (Tabela 5).
3.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados experimentais foram avaliados estatisticamente através da análise descritiva
de variáveis como média, desvio padrão (DP), coeficiente de variação (DPR) e análise de
variância (ANOVA), considerando os níveis de significância de 5%. Ainda assim, quando
necessário, aplicou-se Tukey para análise complementar dos resultados encontrados. Os
resultados foram analisados utilizando o software GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad, EUA)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES E ANÁLISE MACROSCÓPICA
O mecanismo de formação das nanopartículas empregado neste estudo foi à técnica de
deposição interfacial do polímero pré-formado descrita por Fessi e colaboradores (1989). Nessa
técnica, a formação das nanocápsulas ocorre espontaneamente pela rápida difusão do solvente
e pode ser explicado pela turbulência interfacial durante a difusão, decorrente da miscibilidade
entre os solventes empregados. A modificação proposta por Venturini e colaboradores (2011)
foi o desenvolvimento de nanocápsulas exclusivamente de núcleo lipídico em solução aquosa,
o que alterou a composição quantitativa das nanocápsulas para que não ocorresse formação
concomitante de nanoemulsões e nanodispersões.
37
A mangiferina possui uma estrutura molecular complexa (Figura 1), possui caráter
lipofílico, sendo difícil sua dissolução em solventes orgânicos. Assim foi utilizado nesta
formulação o DMSO, um solvente polar, para dissolver a mangiferina na concentração de 200
µL em 25 mL de suspensão final, correspondendo a 0,8% da suspensão.
O DMSO foi utilizado neste trabalho como um cossolvente com a finalidade de
dissolver a mangiferina. Esse é um subproduto da indústria de madeira que tem sido usado
como um solvente comercial desde 1953. É um composto que age como receptor de prótons
em ligações de hidrogênio, conferindo-lhe sua afinidade com a água. Por isso, é considerado
um solvente bipolar e altamente higroscópico. Possui uma infinidade de efeitos farmacológicos
como: a facilitação da penetração rápida e acentuada de outras substâncias através da
membrana, o que o faz ser diferente da maioria dos solventes penetrantes. Ainda, promove
remoção de radicais livres de oxigênio, proteção isquêmica, analgésica e imunomoduladora,
além de possuir atividade antimicrobiana, citoprotetora, miorrelaxante e diurética (BRAYTON,
1986).
O DMSO é considerado um solvente relativamente seguro (classe 3) e pode ser
considerado como menos tóxico e de baixo risco para a saúde humana. Na medicina, o DMSO
é usado rotineiramente como um crioprotetor para proteger tecidos biológicos dos danos
causados pelo congelamento (WEIDONG et al., 2008).
Segundo Weidong Qi e colaboradores (2008), o tratamento em 24horas com
concentrações de 0,025% de DMSO causou pouco ou nenhum dano para as células ciliadas
cocleares em culturas organotípicas pós-natal. O DMSO é conhecido por ser um necrófago do
radical hidroxila, sendo possível que concentrações baixas de DMSO possam ter função
protetora em culturas cocleares (REPINE et al., 1981). No entanto, concentrações de DMSO
de 0,5% ou superiores são tóxicas para células ciliadas internas e para células ciliadas externas,
ambas em culturas de ratos pós-natais cocleares. Entretanto, não está claro se o DMSO é tóxico
para as células ciliadas adultas in vivo e, por isso, estudos mais aprofundados devem ser
realizados para avaliar com maior clareza a toxicidade do DMSO (Harris et al, 2005; Liu et al,
2006).
O próximo passo a ser seguido é a escolha do polímero para a produção e
desenvolvimento das formulações. Inicialmente, foi utilizado o polímero PCL poli (caprolactona) (Figura 4). Porém, essa formulação apresentou precipitação do fármaco, em
38
poucos dias, com formação de cristais, indicando instabilidade da formulação e foi ultrapassada
a capacidade de carga do polímero. Sendo assim, o polímero foi substituído pelo Eudragit®
S100, que por sua vez, apresentou boas características físico-químicas, podendo ser visualizado
reflexo azulado decorrente do movimento browniano das nanopartículas em suspensão (efeito
Tyndall) característico de suspensões com partículas submicrométricas (RAFFIN et al., 2003)
(Figura 5), descrito também por Schaffazick e Gutteres (2003), indicando aparente
encapsulação e estabilidade da suspensão.
A determinação da solubilidade da mangiferina em óleos também foi testada. Foram
avaliados os seguintes óleos: triglicerídeos dos ácidos cáprico e caprílico, óleo de copaíba, óleo
de amêndoas, óleo de abacate, óleo de oliva, benzoato de benzila, óleo de coco, óleo de linhaça
e adipato de isopropila, sendo esse o componente selecionado para formulação, devido a sua
propriedade de dispersar a mangiferina de maneira mais adequada.
Como um dos parâmetros da escolha do óleo a ser utilizado, Guterres e colaboradores
(2007) propõem uma metodologia para a determinação de inchamento do polímero pelos
componentes do núcleo oleoso, avaliando assim a adequabilidade das matérias-primas
(polímeros e óleos) para a formulação das nanocápsulas. Desta forma, filmes de Eudragit® S100
foram testados frente ao óleo de adipato de isopropila. Observou-se que, após 48h, não ocorreu
dissolução do polímero em contato com o óleo, logo, a integridade do polímero foi mantida.
Com esse resultado, pode-se supor que o adipato de isopropila não dissolve o polímero, sendo
indicado para a formulação destas nanocápsulas.
Figura 4 - Suspensões de nanocápsulas de mangiferina contendo o polímero PCL, poli (caprolactona),observando-se a precipitação da mangiferina e formação de cristais.
39
Figura 5 - Suspensões de nanocápsulas de mangiferina contendo como polímero o Eudragit®
S100, sem precipitação do fármaco.
Portanto, a produção de nanocápsulas preparadas pelo método de deposição
interfacial de polímeros pré-formados, com o uso de cossolvente o DMSO, foi bem sucedida,
apresentando características macroscópicas de acordo com a literatura. A formulação
apresentou-se homogênea, com aspecto opaco e leitoso, e pode-se observar reflexo azulado, o
que ocorre em virtude do efeito Tyndall, característico de suspensões com partículas
submicrométricas (RAFFIN et al., 2003; SCHAFFAZICKet al., 2006).
4.2. AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS
CONTENDO MANGIFERINA
4.2.1. DETERMINAÇÃO DO DIÂMETRO MÉDIO E ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO
Espalhamento de luz é uma técnica importante nas modernas tecnologias de
caracterização de partículas que permite a descrição da distribuição do tamanho e de fenômenos
de desestabilização (VENTURINI et al., 2011).
Um dos fatores que pode influenciar no diâmetro médio das partículas é a natureza do
núcleo oleoso das nanocápsulas, atribuído às diferenças de hidrofobicidade, viscosidade e
tensão interfacial das substâncias utilizadas (FRIEDRICH et al., 2008). Com isso, a
concentração do polímero e do óleo são determinantes para o tamanho da partícula
(QUINTANAR-GUERRERO et al., 1996; VENTURINI et al., 2011).
40
Os resultados apresentados, na Tabela 2, mostram que a técnica utilizada possibilitou a
formação de partículas nanométricas em todas as formulações independentes da presença ou
não do fármaco. Para as nanocápsulas brancas, obtiveram-se partículas de tamanho reduzido
(94,9 ± 0,2 nm) com baixo índice de polidispersão (0,19 ± 0,3) caracterizando, portanto,
sistemas coloidais com estreita distribuição de tamanho de partícula (Figura 6). As
nanocápsulas de mangiferina também exibiram tamanho médio de partícula diminuto e
homogêneo (91,6 ± 0,1 nm), com índice de polidispersão de (0,12 ± 0,01) caracterizando
sistema de nanopartículas monodispersas (Figuras 7).
Deste modo, os valores de diâmetro médio obtidos estão em concordância com os dados
relatados na literatura para nanocápsulas formadas pelo método de deposição interfacial de
polímeros pré-formados, indicando que a técnica utilizada possibilitou a formação de partículas
nanométricas em todas as formulações, independente da presença ou não do fármaco na
formulação (WANG X. & ZHANG Q., 2012).
Tabela 2 - Características físico-químicas das suspensões de nanocápsulas sem o fármaco
nanocápsulas contendo a mangiferina.
Parâmetros
Nanocápsulas Brancas
Nanocápsulas de
Mangiferina
Diâmetro de Partícula (nm) ± DP
94,9 ± 0,2
91,6 ± 0,1
Índice de Polidispersão ± DP
0,19 ± 0,03
0,12 ± 0,01
Potencial Zeta (mV) ±DP
-18,76 ± 0,06
-18,31 ± 2,37
pH ±DP
3,62 ± 0,03
3,49 ± 0,02
Taxa de associação (%) ±DP
-
71,78 ± 1,54
Assim, a partir da avaliação estatística realizada, pode-se inferir que os valores obtidos
para o diâmetro médio de partícula e índice de polidispersão entre todas as formulações
apresentam-se próximos entre si, pois não houve diferença estatística significativa para p < 5%
(ANOVA ).
41
Figura 6 - Diâmetro médio e índice de polidispersão de suspensão de nanocápsulas brancas
em função da intensidade de espalhamento de luz dinâmico.
Figura 7 - Diâmetro médio e índice de polidispersão de suspensão de nanocápsulas de
mangiferina a 250 µg/mL, em função da intensidade de espalhamento de luz dinâmico.
4.2.2. DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL ZETA
O potencial zeta é um importante parâmetro para prever a estabilidade das suspensões.
Considerando que esta medida reflete a carga de superfície das partículas, quanto maior o valor
em módulo do potencial zeta, maior será a repulsão eletrostática entre as partículas, mantendo
42
o sistema sem agregação e precipitação das nanoestruturas. Esse é um parâmetro de
caracterização, estabilidade e mecanismo de associação do fármaco em nanocápsulas
polimérica (SANTOS, 2010).
Os valores do potencial zeta apresentados demonstram que tanto as nanocápsulas
brancas quanto as nanocápsulas de mangiferina (figura 8 e 9) possuem cargas negativas. O
potencial zeta das nanocápsulas brancas foi de (-18,76 ± 0,06 mV) e as nanocápsulas de
mangiferina foi de (-18,31 ± 2,37 mV). No entanto, não houve variação significativa ao
comparar o potencial zeta entre as formulações (p < 5%).
Alguns autores explicam os valores negativos devidos às características estruturais dos
componentes da interface das nanocápsulas, especialmente o polissorbato 80 usado em uma
concentração elevada na formulação. Neste caso, a cadeia hidrocarbônica do tensoativo
interagiria com regiões hidrofóbicas da parede polimérica, que provocaria a exposição dos
radicais da cadeia do polissorbato 80 com a fase aquosa, podendo induzir cargas negativas na
superfície do sistema (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010).
Em um estudo, desenvolveu-se nanopartículas de insulina, para administração oral, o
Eudragit® L100 foi utilizado como polímero e as nanoestruturas também apresentaram um
potencial zeta negativo entre -3,1±0,8 e -2,9±0,8 (ZHANG et al., 2012).
Segundo Paese (2008), esses resultados encontram-se adequados para manter o sistema
estável, ou seja, com menor probabilidade de agregação das partículas e consequentemente
precipitação das nanoestruturas tendo dessa forma uma suspensão mais estável.
Figura 8 - Determinação do potencial zeta de nanocápsulas na ausência de fármaco.
43
Figura 9 - Determinação do potencial zeta das nanocápsulas de mangiferina, na concentração
de 250 µg/mL.
4.2.3. DETERMINAÇÃO DO pH DAS SUSPENSÕES
O monitoramento do valor do pH é uma ferramenta importante para fornecer
informações relevantes sobre a estabilidade das suspensões, visto que uma diminuição desse
valor pode indicar degradação do polímero ou de algum outro componente, ou mesmo
representar a difusão do fármaco para o meio aquoso (SHAFFAZICK et al.,2003).
As formulações de nanocápsulas brancas apresentaram pH (3,62 ± 0,03) e as
nanocápsulas de mangiferina apresentaram pH (3,49 ± 0,02). Ambas as suspensões
apresentaram caráter ácido, como pode ser visualizado na Tabela 2.
O pH constitui parâmetros de caracterização e estabilidade. Um dos motivos da acidez
de uma suspensão é a relaxação da cadeia polimérica, gerando grupos carboxílicos do polímero
na interface da partícula/água. Outro motivo para a redução do pH pode ser decorrente da
hidrólise parcial do polímero com aumento da concentração de grupos carboxila (SANTOS,
2010).
Os valores de pH encontrados estão de acordo com o obtido por Antonow
(2012), que desenvolveu suspensões de nanocápsulas com Eudragit® S100 e desonida. Seus
resultados apresentaram valores de pH ácidos em torno de 3,90 ± 0,08. Esses valores também
44
foram encontrados por Schaffazick e colaboradores (2006), que obtiveram valores igualmente
ácidos de pH para nanocápsulas de Eudragit® S100 contendo melatonina.
4.2.4. DETERMINAÇÃO DO TEOR DA MANGIFERINA NAS SUSPENSÕES E DA
TAXA DE ASSOCIAÇÃO
O teor de mangiferina nas formulações foi de 88, 17 ±1,80 % e a taxa de associação do
fármaco, na suspensão de nanocápsulas de mangiferina foi de 71,78 ±1,54 % (Tabela 2). Esses
valores são considerados positivos, visto que as características adversas da mangiferina, como
baixa solubilidade em água e baixa estabilidade química. Vários fatores podem exercer
influência sobre a taxa de associação, principalmente o óleo utilizado como núcleo oleoso, a
natureza do polímero, o pH do meio, as características físico-químicas do fármaco e a
quantidade do fármaco adicionada à suspensão. De acordo com Legrand e colaboradores
(1999), a porcentagem de encapsulação é geralmente relacionada à solubilidade do fármaco no
núcleo oleoso. Losa e colaboradores (1993) já descreviam o núcleo oleoso como principal
determinante das características físico-químicas das suspensões.
Em um estudo realizado, cujo objetivo foi desenvolver e caracterizar dois nanosistemas
de nanoesferas e nanocápsulas diferentes, contendo xantonas (XAN) e outro a 3- metoxixantona
(3- MeOXAN), a eficiência de incorporação para nanoesferas foi de 33% para XAN e 42% para
o 3- MeOXAN. A presença das xantonas não afetou o tamanho da nanoesferas e nem o potencial
zeta. E para o desenvolvimento de nanocápsulas com xantonas (XAN) e 3- metoxixantona (3MeOXAN), utilizando como polímero PLGA. Os valores das eficiência de incorporação foram
de cerca de 90% para as formulações com XAN, nas concentrações que variaram de 200 a 600
µg/mL. Para concentrações mais elevadas, cristais de XAN foram observados, o que indica que
a capacidade máxima de carga das nanocápsulas foi atingida. Para nanocápsulas de 3MeOXAN, os valores de eficiência de incorporação ficaram perto de 80% para as concentrações
que variam de 1000 a 1400 µg/mL. Em concentrações mais elevadas, cristais de 3–MeOXAN
foram detectados. O percentual de fármaco encapsulado se correlacionou com a solubilidade
do fármaco em óleo. A estratégia adotada pelo autor para aumentar a concentração das xantonas
nas nanocápsulas foi aumentar o volume de Myritol® 318 na concentração final (TEIXEIRA et
al., 2005).
45
Recentemente, foi proposto o modelo supramolecular para um novo tipo de
nanocápsulas preparadas com triacilglicerol, monoestearato de sorbitano (Span® 60), poliéster
e polissorbato 80. Variando as proporções dessas matérias-primas na fase orgânica e com isso,
diferentes tipos de colóides foram obtidos para o desenvolvimento e otimização de
nanocápsulas com núcleo lípidico da formulação. As proporções de matérias-primas (span®
60, polissorbato 80 e polímero) podem ser selecionadas para se obter exclusivamente
nanocápsulas de núcleo lipídico em suspensão. O novo tipo de nanocápsulas tem a vantagem
de dispersar medicamentos lipofílicos no núcleo, com capacidade de carga mais elevada do que
as nanocápsulas obtidas com os núcleos que contêm óleo puro. Esse estudo mostrou um
desenvolvimento de uma plataforma de nanocarreadores de alto desempenho com potencial de
aplicação em nanomedicina (VENTURINI et al., 2011).
4.3. VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA POR CLAE PARA A
QUANTIFICAÇÃO
DE
SUSPENSÕES
DE
NANOCÁPSULAS
CONTENDO
MANGIFERINA
4.3.1. ESPECIFICIDADE
A especificidade avalia o grau de interferência de espécies, como outros ingredientes
ativos, excipientes, impurezas e produtos de degradação. A especificidade garante que o pico
de resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Se essa não for assegurada, a
linearidade, a exatidão e a precisão estarão comprometidas (RIBANI et al., 2004).
A especificidade do método analítico foi avaliada através de análises comparativas entre
a mangiferina na forma livre, a suspensão de nanocápsulas sem o fármaco e a suspensão
contendo o fármaco na concentração de 10 μg/mL (Figura 10). Pode-se observar que o método
analítico foi específico para esse tipo de análise, sem apresentar interferentes para a leitura das
amostras, encontrando-se em concordância com as especificações oficiais.
46
Figura 10 - Cromatogramas sobrepostos da mangiferina livre (A), da suspensão de
nanocápsulas de mangiferina concentração de 10 μg/mL (B) e o cromatograma da suspensão
sem o fármaco (C).
Para fins ilustrativos, evidenciando que os limites encontrados foram considerados
satisfatórios, nas figuras 11 e 12, é possível observar o perfil cromatográfico em 3D das
amostras com picos de intensidade iguais no comprimento de onda de 254 nm, sendo
determinado previamente por UV e confirmado por CLAE, com o tempo de retenção de 4,95
minutos. Não foram identificados picos de impureza pelo equipamento.
Figura 11- Diagrama de cores em 3D, obtido para suspensão de nanocápsulas de mangiferina
na concentração de 10 µg/mL.
47
Figura 12 - Diagrama de cores em 3D, obtido para mangiferina livre na concentração de 10
µg/mL.
Com isso, foi possível verificar que o método analítico foi específico para este tipo de
análise, sem apresentar interferentes para a leitura das amostras, encontrando-se em
concordância com as especificações oficiais (ICH, 2005; ANVISA, 2003).
4.3.2. LINEARIDADE
A linearidade de um método analítico corresponde à capacidade do método em fornecer
resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em análise dentro de uma
determinada variação (ANVISA, 2003).
Para o estudo da linearidade, foi preparada uma solução padrão de mangiferina a partir
dessa foram preparadas uma curva padrão, nas concentrações de 1, 5, 10, 15, 20, 25 µg/mL
analisadas em 3 dias diferentes e com leituras em triplicata.
A análise dos resultados da linearidade por ANOVA p < 0,0001 demonstrou ser
significativa a diferença de leitura entre as concentrações analisadas. A partir da curva padrão
encontrada (y = 98863x -15917), calculou-se o coeficiente de correlação linear de Pearson,
obtendo-se, assim, o valor de 0,9996, estando esse resultado de acordo com a legislação vigente
(ANVISA, 2003), a qual exige um coeficiente mínimo de 0,99.
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados através da divisão
do desvio padrão dos coeficientes lineares das curvas padrão do ensaio de linearidade pela
48
média dos coeficientes angulares destas respectivas curvas, multiplicados por 3 e 10,
respectivamente, conforme sugerido pela ICH (2005). Com base nesses dados, os resultados
encontrados foram 18,65 μg/mL e 62, 17 μg/mL, respectivamente.
A partir dos resultados obtidos, conclui-se que a curva analítica pode ser utilizada para
a quantificação dos valores experimentais da mangiferina, visto que o coeficiente de
determinação foi maior que 0,99, atestando a qualidade da curva analítica obtida (ANVISA,
2003; RIBANI et al., 2004; ICH, 2005).
4.3.3. REPETIBILIDADE E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
A precisão foi verificada através da repetibilidade por doseamento dos ativos na
concentração de trabalho 10 μg/mL (n=6), em um único dia e através da precisão intermediária
na concentração de trabalho 10 μg/mL, em três dias. Os resultados obtidos para repetibilidade
da mangiferina encontram-se descritos na Tabela 3. Enquanto que os resultados obtidos para a
precisão intermediária da mangiferina encontram-se descritos na Tabela 3 respectivamente.
Os resultados dos ensaios de precisão revelaram que o método apresenta boa repetibilidade e
reprodutibilidade interna conforme dados da Tabela 3, estando esses resultados em
concordância com a ANVISA (2003), a qual exige um DPR máximo de 5%.
49
Tabela 3 - Valores obtidos da reprodutibilidade interna e repetibilidade.
Concentração
µg/ml
1º dia1, teor (%)
2º dia1, teor (%)
3ºdia2, teor (%)
10
88,45
87,75
84,55
10
87,86
87,10
86,30
10
87,72
87,39
88,19
10
88,91
87,45
90,11
10
91,82
87,61
89,81
10
88,35
87,97
89,72
Média
88,85
87,54
88,11
epm
0,57
0,11
0,84
DPR
1,71
0,34
2,56
Reprodutibilidade interna
Média (%)
88,17
DPR (%)
1,80
a Analista 1; b Analista 2
4.3.4. EXATIDÃO
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método
em estudo em relação ao valor verdadeiro. É determinada através de cálculos que expressam a
porcentagem de recuperação de quantidade conhecida do analítico adicionado à amostra, ou
como a diferença percentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos
intervalos de confiança. Assim, a exatidão é expressa pela relação entre a concentração média
determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente (ANVISA, 2003).
O ensaio de validação foi realizado como preconizado pela ANVISA, a qual determina
que a exatidão do método deve ser realizada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo
linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de no mínimo 9 (nove)
determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três)
concentrações, baixa, média e alta com 3 (três) réplicas cada (ANVISA, 2003). Deste modo, as
concentrações utilizadas para realizar este ensaio foram de 2,5; 7,5 e 12,5 μg/mL.
50
Como resultado (Tabela 4) do ensaio de exatidão, foi obtido um percentual médio de
recuperação de 94,98% e um DPR de 1,19%. Essa análise está próxima dos valores aceitáveis
com a resolução n° 899 da ANVISA (2003) o qual orienta que o teor do fármaco recuperado
deve estar entre 98 – 102%.
Tabela 4- Resultados obtidos no ensaio de exatidão (n = 3).
Concentração Teórica
Recuperação (%)
DPR (%)
2,5
72,23
1,19
7,5
105,02
1,43
12,5
107,69
0,94
Média
94,98
1,19
(μg/mL)
4.3.5. ROBUSTEZ
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenos
e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Para determinar se o método desenvolvido é
robusto, optou-se por variar a vazão da fase móvel em 0,6 e 1,0 mL/min, o pH da fase móvel
para 3,0 e 4,0 e a temperatura para 30 °C e 40 °C. A análise de robustez demonstrou que a
variação da vazão, do pH da fase móvel e da temperatura não interferiram na análise do mesmo.
Esses resultados foram tratados estatisticamente pela ANOVA com auxílio do software
GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad, EUA).
4.4. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET)
A avaliação morfológica das nanocápsulas de mangiferina e nanocápsulas sem o
fármaco foi realizada através de MET. Na fotomicrografia das nanocápsulas brancas (Figura
13), pode-se observar que há presença de estruturas esféricas nanométricas e similares entre si,
corroborando com o encontrado através da análise por espectroscopia de correlação de fótons
para diâmetro médio e para o índice de polidispersão das suspensões de nanocápsulas (Tabela
51
2). Além disso, essas estruturas apresentam um baixo grau de coalescência, sem agregação
aparente das partículas. Esse resultado demonstrou que o uso de DMSO não influenciou a
formação das nanocápsulas.
Figura 13 - Microscopia eletrônica de transmissão de nanocápsulas sem o fármaco.
Comprimento da escala: 100 e 300 nm.
A Figura 14 mostra a microscopia das nanocápsulas, que pode-se verificar a presença
de estruturas esféricas, nanométricas e semelhantes entre si, demonstrando a sua distribuição
de tamanho homogêneo.
Estes resultados corroboram com o encontrado para o tamanho de partícula e o índice
de polidispersão obtidos para estas suspensões de nanocápsulas, através da técnica de
espalhamento de luz dinâmico. As estruturas esféricas não apresentaram coalescência entre si.
Com isso, houve manutenção da estrutura esférica e nanométrica das partículas. Além disso, a
microscopia das nanocápsulas de mangiferina não demonstrou a existência de cristais relativos
aos fármacos, indicando também que a mangiferina pode estar dispersa molecularmente nas
nanocápsulas.
52
Figura 14 -Microscopia eletrônica de transmissão das nanocápsulas de mangiferina.
Comprimento da escala: 100 e 300 nm.
4.5. TESTE DE LIBERAÇÃO DA MANGIFERINA ATRAVÉS DE DIÁLISE
No presente estudo, observou-se uma liberação lenta das nanocápsulas de mangiferina
seguindo uma liberação de primeira ordem. O perfil de liberação da mangiferina não
encapsulada também seguiu o mesmo modelo. Os valores obtidos para a constante de liberação
foram 0,255 e 0,530 h-1 para as nanocápsulas de mangiferina e para a mangiferina livre,
respectivamente. Os coeficientes de correlação para o modelo foram 0,979 e 0,991 para as
nanocápsulas de mangiferina e para a mangiferina livre, respectivamente. Desta forma, a
liberação da mangiferina das nanocápsulas foi lenta e controlada apresentando t1/2 de 2,71 hora.
Para as nanocápsulas de mangiferina, a metade de ativo foi liberado em 1,30 h. Além disso, a
liberação da quantidade de nanocápsulas foram muito superiores do que a do fármaco livre,
demonstrando uma maior possibilidade de aumentar a biodisponibilidade desse fármaco,
quando administrada clinicamente.
Souza (2009) que desenvolveu microesferas de pectina com cálcio revestidas com
quitosana e carreada com mangiferina, também obteve percentuais baixos de mangiferina no
teste de liberação. O autor descreve, como sendo um dos principais motivos, a baixa
solubilidade da mangiferina em água e no meio de liberação (tampão pH 1,2 e tampão pH 7,4).
Em um estudo feito por Antonow (2012), foi demonstrado que as nanocápsulas de
desonida utilizando o Eudragit® L100 como polímero obtiveram uma liberação mais rápida que
as outras formulações que utilizaram o Eudragit S®100 e a PCL. No entanto, os resultados para
53
liberação das nanocápsulas com Eudragit® S100 e com Eudragit® L100 foram próximas a 100%
nas primeiras 5 horas. Para as nanocápsulas com PCL, a liberação foi menor, estando próxima
a 80% nas primeiras 5 horas. Já a forma livre liberou a desonida na primeira hora.
100
% de mangiferina liberada
90
80
70
60
50
Mangiferin
40
NCM
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
Tempo (h)
Figura 15:Mangiferina liberada a partir de uma solução do fármaco livre e nanocápsulas
(NCM). Marcadores indicam dados experimentais e as linhas indicam os dados de modelos
matemáticos.
Em outro trabalho realizado por Schaffazick e Gutteres (2003), foram avaliadas as
liberações de suspensões de nanocápsulas e de nanoesferas de Eudragit® S90 contendo
etionamida, um tuberculostático. As formulações apresentaram rápida e total liberação do
fármaco, de 80% e de 90%, as nanopartículas foram preparadas por incorporação do fármaco.
Desta forma, os resultados sugeriram que o fármaco estaria majoritariamente adsorvido à
superfície das partículas.
Como a mangiferina é uma xantonaglicosilada natural, está intimamente relacionada
com a família de polifenóis. Estudos sugeriram que a absorção de polifenóis no intestino é
relativamente baixo, devido a uma bactéria encontrada no cólon humano, a Bacteroides sp. Essa
bactéria produz uma enzima que pode clivar a ligação C-glicosil da mangiferina durante a
incubação anaeróbica para dar origem ao noratiriol (1,3,6,7-tetraidroxixantona), a aglicona da
mangiferina. No entanto, é preciso um longo tempo para mangiferina atingir o cólon após
administração oral. Portanto, a baixa absorção no trato gastrointestinal é provavelmente a
54
principal razão para a aplicação clínica restrita da mangiferina, a fim de melhorar a
biodisponibilidade oral da mangiferina e potencializar a sua biodisponibilidade. O estudo de
Wang e Zhang (2012) incluiu tensoativos, sais biliares (desoxicolato de sódio) e um polímero
mucoaderente (Carbopol 974P) que foram investigadas em uma série de expereimentos in vivo.
De acordo com as propriedades físico-químicas da mangiferina (estabilidade química,
solubilidade em água e lipossolubilidade), os fatores potenciais sugeridos que contribuiriam
para a baixa biodisponibilidade desse ativo são a decomposição química em meio alcalino, o
metabolismo de primeira passagem hepática, gastrointestinal, a saturabilidade, a especificidade
local de absorção e a precipitação da solução de mangiferina no trato gastrointestinal, devido à
sua fraca solubilidade em água (WANG X. & ZHANG Q., 2012).
4.6. VIABILIDADE CELULAR (MTT)
Tendo em vista o aumento da utilização de nanopartículas, faz-se necessário o emprego
de um método rápido e eficiente para avaliar o seu impacto no ambiente e na saúde humana.
Mesmo que modelos in vivo sejam eficazes para avaliação da toxicidade biológica de
nanopartículas, os modelos de cultura celular são altamente completos para o uso em estudos
fisiológicos e para avaliar a toxicidade pré-clínicos (CHUEHA et al., 2014). Isso porque as
amostras contendo células vivas e mortas podem fornecer uma estimativa da resposta celular
frente a uma determinada substância (JONES; GRAINGER, 2009). Baseado nisso, este estudo
tem como objetivo avaliar in vitro, os possíveis efeitos causados pelas nanocápsulas de
mangiferina sobre a viabilidade das células Vero.
Os resultados do ensaio do MTT mostram que não houve diferença significativa (p <
5%) na viabilidade celular das células tratadas com 0,75 µg/mL, 1,5 µg/mL e 2,5 µg/mL de
suspensão de nanocápsulas contendo mangiferina, suspensão de nanocápsulas sem o fármaco e
a suspensão de mangiferina na forma livre, quando comparadas com o controle negativo, como
demonstrado na Figura 16. Esse resultado sugere uma baixa toxicidade das formulações.
55
Figura 16 - Efeito da viabilidade celular, de suspensão de nanocápsulas de mangiferina,
suspensão de nanocápsulas sem o fármaco e suspensão de mangiferina na sua forma livre, em
linhagem de células Vero.
Um estudo realizado com nanocápsulas de omeprazol, utilizando o Eudragit® L100-55
como polímero, mostrou in vitro uma boa liberação sensível ao pH e também uma ligeira
citotoxicidade das nanopartículas, utilizando células Caco-2. Além disso, esse estudo mostrou
que as nanopartículas podem ser absorvidas pelas células Caco-2, após 30 minutos de
incubação. Os resultados indicaram que a viabilidade das células decresceu com o aumento da
concentração de nanopartículas (HAOA et al, 2013).
Segundo García-Riviera e colaboradores (2011), um teste realizado com o extrato
Vimang, já mencionado anteriormente, avaliou o efeito da mangiferina e do ácido gálico, (outra
substância encontrada neste extrato), em células MDA-MB23, células metastáticas da mama,
fibrossarcoma HT1080 e células Caco-2. O uso desse extrato pode inibir a proliferação da linha
de células cancerígenas da mama e efeitos citotóxicos similares foram observados para células
Caco-2 e para células cancerosas HT1080 de fibrossarcoma, porém um com potencial inibitório
mais fraco.
56
4.7. HET CAM (Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane)
O protocolo de HET-CAM (ECVAM, Luepke 1985), para análise de irritabilidade
ocular de substâncias testes, consta de dois controles positivos para lise, hemorragia e
coagulação (NaOH e SDS) e um controle negativo (NaCl). A análise dos resultados é realizada
por dois parâmetros: quantitativo (Tabela 5) e qualitativo (observação do aparecimento de lise,
hemorragia e coagulação na membrana CAM).
Tabela 5 - Referências quantitativas para classificação final do produto quanto ao seu potencial
de irritação no HET-CAM.
Classificação
Faixa (Graduação das lesões)
Nenhuma Reação
0
Reação Leve
1
Reação Moderada
2
Reação Severa
3
Figura 17 - Teste HET CAM:(A) controle negativo (NaCl), (B) substância irritante leve (SDB),
(C) substância de irritação severa (NaOH).
57
Figura 18 - Teste HET CAM:(A) suspensão de nanocápsulas sem o fármaco, (B e C) suspensão
de nanocápsulas de mangiferina (250 µg/mL).
O potencial irritante das nanocápsulas de mangiferina foi testado empregando um
método proposto por Luepke (1985), que é aceito hoje pela legislação europeia e indicado pela
ANVISA (Agência de Vigilância Sanitária, Brasil) para avaliação de segurança de produtos
farmacêuticos e cosméticos. Apesar de tratar-se de um método apenas qualitativo para medir o
poder irritante de formulações e com baixa sensibilidade para classificar produtos
moderadamente irritantes (DEBBASCH et al., 2005), esse tipo de ensaio vem sendo bastante
utilizado por ser de simples execução e uma alternativa para substituição de ensaios de irritação
ocular in vivo utilizando coelhos, bastante condenado atualmente pela comunidade científica.
As suspensões de nanocápsulas de mangiferina, bem como a suspensão sem o fármaco
apresentaram-se como um sistema ligeiramente irritante segundo a metodologia proposta, por
não causar nenhum tipo de hemorragia ou coagulação após 5 min de contato com a membrana
corion-alantóide de ovo embrionado de galinha (HET-CAM). A única alteração observada,
após as aplicações das nanocápsulas de mangiferina e das nanocápsulas sem o fármaco, foi uma
hiperemia leve após o contato com a membrana. Supostamente, essa leve hiperemia na
membrana seja devido ao pH ácido das formulações (pH = 3,49), o que, no entanto, não
compromete o seu uso in vivo.
Em um trabalho realizado com dorzolamida carreado por nanocápsulas de quitosana,
para tratamento de glaucoma, o teste de HET-CAM apresentou resultados considerados como
seguros e não irritantes para formulações. Assim, a formulação carreada por nanocápsulas
oferece um tratamento mais intensivo de glaucoma e requer menos aplicações por dia em
comparação com formulações convencionais (KATIYAR et al., 2014).
58
Uma vez que a exposição acidental ou intencional para os olhos pode resultar em ligeiras
reações como vermelhidão ou mesmo reações graves, como a perda de visão, uma avaliação do
potencial de irritação nos olhos é fundamental. Assim, o ensaio HET - CAM foi realizada para
avaliar o potencial de irritação ocular de nanopartículas lipídicas sólidas e para
nanotransportadores de estruturas multi-nucleadas, para opióides tópicos como morfina,
hidromorfona, fentanil e buprenorfina. Os resultados demonstraram que não houve nenhum
efeito agudo tóxico das nanopartículas contendo esses fármacos (WOLF et al., 2009).
59
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente trabalho mostrou a possibilidade de utilização de técnica de deposição de
polímero pré-formado para produzir nanocápsulas de mangiferina. O uso do DMSO como
cossolvente foi, primeiramente descrito neste estudo, sendo que sua adição não afetou a
formação de nanopartículas. As nanopartículas foram obtidas com as características físicoquímicas adequadas para administração oral de fármacos.
O método analítico para quantificação de mangiferina foi validado para cromatografia
líquida de alta eficiência. O perfil de liberação da mangiferina das nanocápsulas apresentou
liberação lenta com o aumento da quantidade do fármaco liberado, indicando a possibilidade
de aumentar a biodisponibilidade in vivo do fármaco.
Os testes para avaliação do perfil inicial de toxicidade dessas nanocápsulas (MTT e
HET –CAM) não apresentaram efeito tóxicos agudos, no entanto, mais testes são necessários
para avaliar o perfil tóxico dessas nanocápsulas.
A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, têm-se como perspectivas futuras
a continuidade dessa pesquisa buscando mais testes tanto de estabilidade, citotoxicidade,
melhorias no perfil de liberação, assim como seus possíveis efeitos farmacológicos in vivo.
60
Interdisciplinaridade
O presente trabalho visou associar conhecimentos químicos, bioquímicos e físicoquímicos para produzir, caracterizar e avaliar a resposta biológica de novos sistemas
poliméricos nanoparticulados acoplados a um peptídeo modelo buscando resultados melhores
do que os sistemas convencionais. Este projeto envolverá técnicas de síntese química,
caracterização físico-química e avaliação em cultura de células de sistemas nanométricos. O
conhecimento já adquirido em síntese orgânica será usado de base para síntese de novos
polímeros. Uma vez sintetizados, será necessário conhecimento de nanotecnologia e físicoquímica para preparação das micelas poliméricas. Após, a união com a área da farmácia é clara
na aplicação dos sistemas produzidos em modelos de cultura celular.
61
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Eudragit
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oral
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delivery:
Preparation,characterization and in vivo evaluation. International Journal of Pharmaceutics
v.436,p. 341– 350, 2012.
71
ANEXO 1
Manuscrito
DEVELOPMENT OF MANGIFERIN-LOADED POLYMERIC NANOCAPSULES
Journal of Nanopharmaceutics and Drug Delivery Editorial Office.
72
DEVELOPMENT OF MANGIFERIN-LOADED POLYMERIC NANOCAPSULES
JAQUELINE URBAN MOURA1,GABRIELA MORAES BARBOSA1, CAYANE GENRO1,
RENE DELGADO HERNÁNDEZ2, SUSLEBYS SALOMON IZQUIERDO2, PATRICIA
GOMES1, SOLANGE BINOTTO FAGAN1,RENATA PLATCHECK RAFFIN1*
1
Programa de Pós Graduação em Nanociências, Centro Universitário Franciscano, Santa
Maria, RS, Brazil
2
Laboratory of Pharmacology, Department of Biomedical Research, Center for Pharmaceutical
Chemistry, Atabey, Playa, Havana City, Cuba
*[email protected]
Abstract
Mangiferin
(1,3,6,7-Tetrahydroxy-2-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-
yl]xanthen-9-one) is a natural bioactive, more specifically a glycosylated xanthone isolated
from Mangifera indical L.. It presents pharmacological activities on different organs and
tissues, and already described effects as anti-inflammatory, antitumoral and antioxidant.
However, one of the problems of mangiferin is its low aqueous solubility and the low chemical
stability. One technological alternative to overcome these limitations is the nanoencapsulation.
Polymeric nanocapsules are small nanometric oil droplets surrounded by a thin layer of
polymer. In this way, the objective of this study was to develop and characterize mangiferinloaded nanocapsules. In order to obtain mangiferin nanocapsules, the deposition of preformed
polymer technique was modified by the addition of a co-solvent, in this case, DMSO. Eudragit
S100 was used as polymer. The results showed nanometric particle size with narrow distribution
around 95 nm and PDI < 0.2), and large zeta potential, indicating stability of the nanosystem.
TEM images showed nanocapsules well formed and with round shape and narrow distribution.
Drug release presented controlled profile with first order release and t1/2 of 2.71 h. The analytical
methodology was fully validated and drug content was around 90 %. Based on the results,
mangiferin nanocapsules are a promising formulation to obtain increased bioavailability of the
drug.
73
Key words: mangiferin, nanocapsules, DMSO, controlled release, Eudragit S100
1. INTRODUCTION
New therapeutic possibilities have been considered for the treatment of diseases in
worldwide. Therefore, the use of natural products appears as a possibility to be considered for
the production of controlled release dosage forms, to ensure a greater bioavailability and
efficacy1.
Mangiferin, a glycosylated xanthone (Figure 1), is an active phytochemical present in
various plants including MangiferaindicaL.2. Its properties in different pathologies have been
demonstrated, as anti-viral, anti-inflammatory, hypoglycemic, analgesic, hepatoprotective,
immunomodulative and antitumoral activities1,3,4.In Cuba, there is a mangiferin enriched
extract named Vimang, produced in industrial scale, mainly used for treating inflammation,
and pain5.
Figure 1. Chemical structure of mangiferin.
The solubility in water of mangiferin is very low: 0.111 mg.mL-1 6. Some efforts were
done in order to increase its solubility and bioavailability, such as embodying within
cyclodextrin derivatives6, preparing inclusion complexes6,or monosodium salt7. One strategy
to preserve the chemical integrity and increase bioavailability for poorly water soluble drugs is
nanoencapsulation7,8. Nanoencapsulation is a technological tool to increase physical stability,
protect ingredients against chemical degradation, and allow for precise control over the release
of encapsulated drug9. Therefore, the aim of this study was development a nanoparticle
(polymeric nanocapsule) in order to increase the solubility and bioavailability of mangiferin.
74
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Materials
Mangiferin and sorbitan stearate were supplied by Sigma-Aldrich. Polisorbate 80 and
capric/caprylic triglycerides were acquired from Via Farma, Brazil. Eudragit® S100 was kindly
donated by RöhmPharma Polymers. All other chemicals were of analytical grade and used as
received.
2.2. Preparation of polymeric nanocapsules
Nanocapsule suspensions were prepared using interfacial deposition of preformed
polymers technique described initially by Fessi et al., (1989)10 and modified by Venturini et al.,
(2011)11. Briefly, 0.00625g of mangiferin were dissolved in 200 µL of DMSO. Then, the
solution was added to the acetone phase described in Table 1. The acetone phase was added
using a funnel to the aqueous phase (Table 1) and the volume was reduced to 25 mL (250µg.mL1
of mangiferin) using a rotary evaporator (NCM). Blank formulations were prepared by the
same procedure without adding mangiferin (NCB).
Table 1 – Composition of mangiferin loaded nanocapsules (NCM) for a final volume of 25 mL.
Component
Amount
Mangiferin
6.25 mg*
Eudragit® S100
250.00 mg
Sorbitan stearate
962.00 mg
Isopropyl adipate
395.00 mg
DMSO
0.20 mL
Ethanol
62.5 mL
Polisorbate 80
385.00 mg
Water
125.00 mL
* Blank nanocapsules (NCB) were prepared by withdrawing mangiferin from the composition.
2.3. Physicochemical characterization of nanocapsules
75
2.3.1. Particle size and zeta potential
Mean particle size and polydispersity index as well as zeta potential were measured
using Zetasizer® nano-ZS model ZEN 3600, Malvern. For particle size, samples were diluted
500x v/v in filtered water. For zeta potential, the sample dilution was used in 10 mM NaCl
(previously filtered in 0.45 µm).
2.3.2 Nanocapsule suspension pH
pH of the nanocapsule suspensions was directly measured using Digimed® DM-20
potentiometer. Results were obtained after 3 measures of three different batches of the
formulations.
2.3.3 Drug loading and validation of LC method for determination of mangiferin in
nanocapsules
The amount of mangiferin in NCM was determined by liquid chromatography using
HPLC Prominence (Shimadzu, Japan), equipped with pump model LC-20AT, detector UV/VIS
model SPD-M20A, column C18 (150 x 4.6 mm, 5 µm) Shim-pack CLC-ODS (Shimadzu,
Japan) I.D. The LC method was validated according to ICH (1995)12 guidance analyzing the
specificity, linearity, precision, accuracy and robustness.
2.3.4. Encapsulation efficiency
The amount of mangiferin encapsulated in the nanocapsules NCM were calculated by
the difference between the drug loading in nanocapsule suspension (item 2.3.3) and the amount
dissolved in water. To determine the concentration of mangiferin dissolved in the water phase,
ultrafiltration/centrifugation technique was applied using Microcon® MC Millipore 10,000 Da
filters. The ultrafiltrated was analyzed by the same method previously described to quantificate
mangiferin.
76
2.3.5 Transmission electron microscopy
Particle morphology of NCM and NCB was assessed by transmission electron microscopy
(JEM 1200EX II) (Centro de Microscopia Eletrônica da UFRGS) at 120 kV, with
magnifications of 50,000, 100,000 e 300,000 x. Suspensions were diluted 10 x in filtered water
and dried in copper grids. 2% (m/v) uranile acetate was used as staining and was applied in the
samples already in the grid for 1 min.
2.3.6 In vitro release studies of mangiferin from nanocapsules
For the release studies, cellulose acetate membranes were used (10,000 Da; 25 mm,
Sigma Aldrich) for the dialysis. The bags were hydrated in water for 24 h. Then, they were
filled with 4 mL nanocapsule suspension with and without mangiferin and mangiferin solution
used as control. The release media was phosphate buffer pH 7.4 (50 mL) kept at 37 °C. Samples
were collected in triplicates for 24 h and analyzed by the validated method in HPLC (section
2.3.3). The release profiles were mathematically modeled using Scientist 2.0 software for zero
order, first order mono and biexponential13.
2.4 Statistical analysis
The experimental data was evaluated using ANOVA at 95% of confidence.
3 RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Physico-chemical characterization of mangiferin nanocapsules
The results are shown in Table II. The modification of the interfacial deposition of
preformed polymers applied in these formulations allowed the formation of small nanometric
particles with narrow particle size distribution. For blank nanocapsules NCB, particle size was
low as (94.88 ± 0.19 nm) as well as the polydispersity index(0.19 ± 0.03). The addition of
mangiferin in the formulations did not affect the particle size distribution (mean size of 91.59
± 0.06 nm), and polydispersity index of 0.12 ± 0.01).particle size is in accordance to previously
reported nanosystems for delivery of drugs, as described for nimesulide-loaded nanoparticles
(90.1 nm)
13
, however smaller then nanocapsules prepared with the same polymer and
melatonin as drug (186 nm)
14.
The reduction of particle size compared to the similar
77
formulation used by Hoffmeister et al. can be due to the modification applied in this study, i.e.,
the addition of DSMO in the nanocapsule suspension. This modification was not reported
previously in literature.
Table 2.Physico-chemical characteristics of NCM and NCB. Results are expressed in mean
values ± standard deviation.
Parameters
NCB
NCM
Mean particle size (nm)
94.88 ± 0.19
91.59 ± 0.06
Polydispersity index
0.19± 0.03
0.12 ± 0.01
Zeta potential (mV)
-18.76 ± 0.06
-18.31 ± 2.37
pH
3.62 ± 0.03
3.49 ± 0.02
Drug loading (%)
-
88.17 ± 1.54
Zeta potential values for both formulations, NCB and NCM, were negative (-18.76 ±
0.06 mV and -18.31 ± 2.37 mV, for NCB and NCM, respectively). There was no statistical
difference between the formulations (p < 0.05), indicating that the addition of the drug did not
affect the external potential of the nanocapsules. These high values indicate greater electric
repulsions among particles and this characteristic leads to improved physical stability of the
nanocapsule suspension15. The variation in the pH of the suspensions can be correlated to
polymer stability, as well as, some microbiological contaminations
16
.The formulations NCB
and NCM presented similar pH values of 3.62 ± 0.03 and 3.49 ± 0.02, respectively. The acid
character is due to the use of Eudragit S 100 polymer. These values are in accordance to the
reposted by Hoffmeister et al., (3.87) and ANTONOW, 2012 (3.90)14,17. The latter research
developed Eudragit S 100 nanocapsules containing desonide. The acid values are due to the
polymer structure that contains a large number of OH groups18.
Drug loading was very high (88.17±1.54 %), and it was considered very satisfactory,
once there is only one other report of a xanthone encapsulated and the values were similar
(between 77 and 89 %) 19.Encapsulation efficiency was 65.5 %, similar to the values reported
78
by Martins et al., 20088 for calcitonin in nanoparticles (between 58 and 85 %, varying the lipids
in the formulations).Mangiferin is soluble only in some specific solvents, which leads to an
increased difficulty in its encapsulation. The addition of DMSO in the organic phase lead
possible the encapsulation, once there was no solvent adequate to nanoprecipitation technique
that solubilized mangiferin. For this technique, only solvents miscible with water can be
applied, as acetone and ethanol. In this way, we added the smallest amount possible of DMSO
to allow the solubilization of the drug. In order to verify the real formation of the nanocapsules,
transmission electron microscopy was used.
3.2 Validation of analytical method
3.2.1. Specificty
The specificity of method was evaluated by comparative analysis of the mangiferin
standard, the suspension of nanocapsules without the drug (NCB) and the suspension containing
the drug at a concentration of10 μg.mL-1(Figure 2).We can observe that the analytical method
was specific for this of analysis without the interference of NCB, therefore this method is in
agreement with the official guidances.
3.2.2. Linearity
The results of linearity by ANOVA showed p<0.0001, showing that the significant
difference in readings between the concentrations analyzed. The standard curve was y
=98,863x-15,917 and the linear correlation coefficient of Pearson was 0.9996. This result is in
accordance with current legislation (ANVISA, 2003)21, which requires a minimum coefficient
of 0.99.We calculated the DL and QL and the results were18.65 μg.mL-1 e 62.17 μg.mL-1,
respectively. The results obtained demonstrate that the standard curve can be used to
determinate of mangiferin since the correlation coefficient was greater than 0.99, showing the
quality of the analytical curve obtained12,21,22.
3.2.3 Precision
The results showed that the accuracy of the method had good repeatability and reproducibility,
presenting RSD of 1.80 %. These results are in accordance with ANVISA (2003)21, which
requires a maximum RSD of 5 %.
79
3.2.4 Accuracy
The accuracy test showed an average percentage recovery of 94.98%, with an RSD of 1.19 %.
This result should be between 98 and 102 %12.
3.2.5 Robustness
The robustness of an analytical method is a measure of its ability to resist small and
deliberate variations of the analytical parameters. To determine whether the developed method
is robust, we chose to vary the flow rate is at 0.6 and 1.0 mL.min-1, pH mobile phase (3.0) and
temperature. The results were statistically analyzed by ANOVA using the GraphPad Prism
software version 5.0 (GraphPad, USA). The method was robust showing that the change of
flow, the pH of the mobile phase and temperature do not affect the analysis.
3.3 Transmission electron microscopy
Particle morphology was assessed by TEM and the photomicrographs are seen in
Figures 2 and 3. Figure 2 shows the lank nanocapsules NCB. It is possible to observe round
particles with narrow particle size and no presence of coalescence. Figure 3 shows NCM
containing mangiferin. No difference was observed between the formulations with and without
drug and no drug crystals were also seen. This indicates that drug is mainly encapsulated in the
particles and that particle size results are in accordance to what was seen in the pictures.
Figure 2.Photomicrographs of blank nanocapsules (NCB).
80
Figure 3.Photomicrographs of mangiferin-loaded nanocapsules (NCM).
3.4 In vitro release studies of mangiferin from nanocapsules
In the present study, it was observed a slow release of mangiferin from nanocapsules
following first order release. Unencapsulated mangiferin release profile also followed the same
model. The values obtained for the release constant were 0.255 and 0.530 h-1 for NCM and pure
mangiferin, respectively. The correlation coefficients for the model were 0.979 and 0.991NCM
and pure mangiferin, respectively. In this way, the release of mangiferin from nanocapsules
was slow and controlled presenting t1/2 of 2.71 h. For unencapsulated mangiferin, release half
live was 1.30 h. furthermore, the amount release from nanocapsules were much higher than
pure drug, demonstrating a greater possibility of increasing bioavailability of this drug, when
administered clinically.
81
Figura4: Mangiferin release from a solution of pure drug and nanocapsules (NCM). Markers
indicate experimental data and lines indicate mathematical models data.
4. CONCLUSION
This study showed the possibility of using deposition of preformed polymer technique to
produce mangiferin nanocapsules. The use of DMSO as co-solvent was firstly described in this
paper and this addition did not affect particle formation. Nanocapsules were obtained with
adequate physic-chemical characteristics. The analytical method for quantification of
mangiferin was fully validated for liquid chromatography. The release profile of mangiferin
from nanocapsules showed a slow release with increased amount released compared to pure
drug, indicating the possibility of increasing bioavailability in vivo of this drug.
ACKNOWLEDGEMENT
Authors thank the financial support of CNPq (chamada MCTI/CNPq Nº 20/2011 –Cooperação
Brasil-Cuba), Capes and Fapergs
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