universidade federal fluminense - início

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ANATOMIA PATOLÓGICA
ANGELA CRISTINA GOUVÊA CARVALHO
RESPOSTA LINFÓIDE EM BIOPSIAS GÁSTRICAS DE CRIANÇAS
DO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ANTONIO PEDRO: ASSOCIAÇÃO
COM HELICOBACTER PYLORI E COM VÍRUS EPSTEIN-BARR
Niterói
2006
ANGELA CRISTINA GOUVÊA CARVALHO
RESPOSTA LINFÓIDE EM BIOPSIAS GÁSTRICAS DE CRIANÇAS
DO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ANTONIO PEDRO: ASSOCIAÇÃO
COM HELICOBACTER PYLORI E COM VÍRUS EPSTEIN-BARR
Dissertação apresentada ao Curso de Pós
Graduação em Patologia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Anatomia Patológica
Orientadora: Profª Dra. Vânia Glória Silami Lopes
Co-orientadora: Profª Dra. Eliane Pedra Dias
Niterói
2006
ANGELA CRISTINA GOUVÊA CARVALHO
RESPOSTA LINFÓIDE EM BIOPSIAS GÁSTRICAS DE CRIANÇAS DO HOSPITAL
UNIVERSITÁRIO ANTONIO PEDRO: ASSOCIAÇÃO COM HELICOBACTER
PYLORI E COM VÍRUS EPSTEIN-BARR
Dissertação apresentada ao Curso de Pós
Graduação em Patologia da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para a obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Anatomia Patológica
Aprovado em_____________de 2006.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Profa. Dra. Lélia Paiva e Guedes
Universidade Federal Fluminense
______________________________________________
Prof. Dr. Heleno Pinto de Moraes
Universidade Federal Fluminense
______________________________________________
Prof. Dra. Gesmar Volga H. Herdy
Universidade Federal Fluminense
Antonio, meu amado companheiro e ao
Vitor e a Isabela, sem dúvida minhas
melhores e mais amadas produções.
Tudo aquilo que tem a sua atenção,
ganha sua força e sua ação...
e tende a crescer.
Aldo Novak
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Antonio Paulo e Augusta e minha irmã Ana pelo amor
incondicional e apoio sempre.
Ao Prof. Dr. Antonio Cláudio Lucas da Nóbrega, meu marido, pela
competência, paciência, compreensão, força e amor a toda prova.
A Profª Dra. Vânia Glória Silami Lopes por me aceitar como orientanda e pelo
apoio sempre carinhoso, gentil e pelas palavras sempre doces.
A Profª Dra. Eliane Pedra Dias pelo seu incentivo, amizade e firmeza, sem os
quais não teria chegado até aqui.
Ao Prof. Dr. Heleno Pinto de Moraes, meu mestre de Patologia e da vida, que
os anos de convivência estreita felizmente me proporcionaram, meu mais carinhoso
obrigada.
A Profª Eliene Carvalho da Fonseca pela recepção carinhosa, vontade de
ajudar e ensinar sempre e apoio no laboratório de Imuno-histoquímica.
Às técnicas da Patologia Aline Ferreira Dias e Ana Maria Rodrigues pela
realização prestimosa das lâminas de coloração especial e pelo carinho.
À técnica do laboratório de Imuno-histoquímica Rita de Cássia da Costa
Cunha pelas ―aulas‖ carinhosas, paciência e ajuda inestimáveis.
Aos meus mais que colegas de plantão Mônica Pureza de Almeida e Bruno
de Souza Bianchi Reis pelo apoio, incentivo e companheirismo, sempre carinhosos e
a toda hora.
Às minhas amigas e sócias patologistas Dra.Adelaide Lucas de Souza e Dra.
Ana Luisa Figueira Gouvêa pelo apoio, ajuda, compreensão pela ausência e
principalmente e sobretudo pela amizade.
Ao Prof. Phorphirio José Soares Filho pela boa vontade e gentileza de ensinar
e ajudar, muito obrigada.
Às Dras. Carla de Carli e Fátima Caldoncelli pela ajuda prestimosa na
organização do material.
Ao técnico Wellington Vargas Pavão pela realização rápida e a qualquer hora
das lâminas e vontade de ajudar sempre.
A todos os funcionários do serviço de Patologia pela ajuda.
Às funcionárias do Nucleolab Alessandra Sander, Caroline Malizia, Maria da
Conceição Campos, Maria da Luz e Paula Brasil pela paciência e compreensão,
muito obrigada.
RESUMO
A infecção gástrica pelo Helicobacter pylori (H.pylori) pode estar relacionada ao
aparecimento de carcinomas e de linfomas MALT e a infecção latente pelo vírus
Epstein-Barr (EBV) está associada tanto ao desenvolvimento de neoplasias
malignas epiteliais gástricas usuais, quanto a neoplasias epiteliais com estroma
linfomatoso. O objetivo deste trabalho foi realizar uma análise histopatológica
sistemática e global das biópsias gástricas de crianças submetidas a endoscopia
digestiva alta, com queixas de dor abdominal recorrente, no Hospital Universitário
Antônio Pedro/UFF e estudar a possível associação da resposta linfóide com
Helicobacter pylori e com vírus Epstein-Barr. Foram revistas as biopsias gástricas
(n=142) realizadas entre janeiro de 2002 a dezembro de 2004 de crianças com até
12 anos (n=129; 52% masculino; idade 8±3 anos) e os fragmentos foram submetidos
às colorações de Giemsa e Whartin-Starry para pesquisa de H.pylori, à imunohistoquímica para pesquisa de EBV (anti-LMP1) e pesquisa de linfócitos T CD8+. À
microscopia, 63% apresentaram gastrite crônica e 30% infecção pelo H.pylori.
Dentre as crianças com gastrite crônica, 48% apresentaram resposta linfóide, sendo
que apenas 15 dessas não tinham positividade para H.pylori. Nenhuma das crianças
apresentou positividade para EBV e 83% delas exibiu até 5 linfócitos T CD8+ por
100 células epiteliais superficiais. A idade das crianças positivas para H.pylori foi
maior do que as negativas (9,1±2,8 vs. 7,1±3,3 anos; P<0,001) e a presença de
resposta linfóide foi mais freqüente nas crianças com H.pylori (80% vs. 15%; P
<0,001). Em conclusão, o EBV não está relacionado a resposta linfóide em biopsias
gástricas de crianças, entretanto este afluxo linfóide está associado a positividade do
H. pylori em 48% das crianças com gastrite crônica. De quinze crianças com reposta
linfóide e H.pylori negativo, cinco foram tratadas para erradicação do bacilo,
podendo ser esta resposta uma seqüela pós-tratamento. As dez biopsias restantes
sugerem tratar-se também de resolução/seqüela pós-tratamento para outras
infecções sistêmicas.
Palavras-chave: gastrite crônica, Helicobacter pylori, resposta linfóide, vírus EpsteinBarr
ABSTRACT
The infection by Helicobacter pylori (H.pylori) can be related to the occurrence of
carcinomas and MALT lymphomas, while the latent infection by Epstein-Barr virus
(EBV) is associated both to gastric epithelial malignant neoplasias as to
lymphomatous gastric epithelial neoplasias. The purpose of this study was to perform
a systematic and global histopathological analysis of gastric biopsies from children
submitted to upper digestive endoscopy, with recurrent abdominal pain, in Antonio
Pedro University Hospital/UFF and to study the association between lymphoid
proliferation and H.pylori and EBV. The gastric biopsies (n=142) from children up to
12 years old (n=129; 52% male; age 8±3 years) from January 2002 to December
2004 were reviewed and the slides were stained with Giemsa and Whartin-Starry for
identification of H.pylori and immunostains for EBV (anti-LMP1) and T-lymphocytes
CD8+ were used. Under light microscopy, 63% presented chronic gastritis and 30%
infection by H.pylori. Forty-eight percent of children with chronic gastritis had
lymphoid proliferation, but 15 among these were negative for H.pylori. None of the
children was positive for EBV and 83% of them presented up to five T CD8+
lymphocytes per 100 superficial epithelial cells. H.pylori positive children were older
than the negative ones (9.1±2.8 vs. 7.1±3.3 years; P<0,001) and the presence of
lymphoid response was more frequently found in children with H.pylori (80% vs. 15%;
P <0,001). In conclusion, EBV is not related to lymphoid response in children gastric
biopsies. However, this lymphoid proliferation is associated with H.pylori infection in
48% of children with chronic gastritis. Five out of 15 children with lymphoid
proliferation but negative for H.pylori, had been previously treated for this bacteria,
suggesting that this response could be post-treatment sequelae. The remaining 10
biopsies could represent post-treatment sequelae from other systemic infections.
Key words: chronic gastritis, Helicobacter pylori, lymphoid proliferation, Epstein-Barr
virus
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
8
2
REVISÃO DA LITERATURA
11
2.1
HELICOBACTER PYLORI
11
2.2
VÍRUS EPSTEIN-BARR
16
2.3
GASTRITE E RESPOSTA LINFÓIDE EM CRIANÇAS
18
3
OBJETIVOS
24
4
MATERIAIS E MÉTODOS
25
5
RESULTADOS
30
6
DISCUSSÃO
37
7
CONCLUSÕES
50
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
52
8
1
INTRODUÇÃO
O conhecimento da prevalência e das características dos diferentes achados
histopatológicos é fundamental para o diagnóstico preciso, para a orientação
terapêutica e formulação de novas hipóteses sobre o mecanismo das doenças.
Múltiplos achados histopatológicos já foram descritos em biópsias de crianças com
sintomas dispépticos (DOHIL et al, 1999, SABBI et al, 2005), relacionados ao
Helicobacter pylori (PRIETO et al, 1992) ou ainda ao Vírus Epstein-Barr (EBV)
(JASKIEWICZ & KOBIERSKA, 2000). Diversos estudos já foram realizados em
várias comunidades americanas, européias, japonesas e canadenses (SINHA et al,
2004). Estudos brasileiros também já foram relatados, com resultados diferentes ou
semelhantes a literatura internacional (OLIVEIRA et al, 1994; SOUSA et al, 2001;
MORAES & SILVA, 2003).
A infecção pelo Helicobacter pylori ocorre na primeira infância sendo portanto
de extrema relevância conhecermos o comportamento histopatológico agudo e
crônico desta infecção nesta época da vida. Sabe-se atualmente da relação deste
patógeno com o aparecimento posterior de disfunções dispépticas, gastrites, úlceras
e até ao desenvolvimento de neoplasias epiteliais (carcinomas) e de neoplasias
linfocíticas, linfomas MALT principalmente (COVER & BLASER, 1996).
9
A infecção latente pelo vírus Epstein-Barr em indivíduos jovens é sabida e
esperada, pois 95% da população mundial está infectada por este (ANDERSSON,
2000), estando também associado ao desenvolvimento futuro de neoplasias
malignas tanto epiteliais gástricas (HUNGERMANN et al, 2001), via metaplasia
intestinal, quanto neoplasias epiteliais com estroma linfomatoso (BURKE et al,
1990).
A resposta linfóide nas biopsias gástricas de crianças parece estar
relacionada a infecção pelo H.pylori na maioria dos casos, estando também presente
em casos de mononucleose com acometimento gástrico ou ainda como resultado de
infecções prévias (respostas imuno-mediadas inflamatórias do hospedeiro) com ou
sem tratamentos específicos (antibióticos para outras infecções sistêmicas).
Uma análise histopatológica sistemática e global das biópsias gástricas de
crianças submetidas a endoscopia digestiva alta no Hospital Universitário Antonio
Pedro (HUAP/UFF), ainda não foi relacionada e analisada. É de suma importância
conhecermos, portanto, as características da nossa população pediátrica, da
prevalência das alterações histopatológicas gástricas e da etiologia no nosso
Hospital. Há poucos relatos na literatura referentes a gastrites agudas, presença ou
não de atrofia glandular e de metaplasia intestinal em crianças (RICUARTE et a,l
2005), o que torna este estudo mais interessante e relevante.
A prevalência da infecção pelo H.pylori é muito maior nos países em
desenvolvimento (BOURKE et al, 1996), onde a aglomeração domiciliar e a baixa
condição de higiene, favorecem a transmissão da bactéria. O Hospital Antonio Pedro
é referência de atendimento da população sócio-economicamente carente de Niterói,
10
sendo de se esperar portanto uma alta prevalência de infecção pelo H.pylori nestas
crianças.
Por outro lado também é de se esperar uma participação do EBV na etiologia
dos sintomas e achados histopatológicos gástricos destas mesmas crianças, já que
se trata de uma amostragem infantil e a infecção por este vírus se dá na infância
predominantemente, sabendo-se que 95% da população mundial está infectada por
este vírus (ANDERSSON, 2000).
Tanto o H.pylori, como o EBV compartilham mecanismos imunológicos de
reação do hospedeiro que envolvem os linfócitos T, particularmente os CD8+. É
importante também, estudar a população linfocitária associada tanto ao H.pylori
(MACIORKOWSKA et al 2004), quanto ao EBV (ABBAS et al 1994), pois sabe-se
que a resposta linfocitária em alguns casos, deixa de ser protetora e passa a ser
responsável
por
uma
(JASKIEWICZ et al, 1993).
resposta
imunologicamente
mediada
e
exacerbada
11
2
REVISÃO DA LITERATURA
2.1
HELICOBACTER PYLORI
Desde a primeira cultura do Helicobacter pylori (H.pylori) há vinte e quatro
anos (WARREN,1983; MARSHALL, 1983; MARSHALL & WARREN, 1984), que
valeu aos autores o prêmio Nobel em 2005 (ZETTERSTRÖM, 2006), o diagnóstico e
tratamento das doenças do trato gastrintestinal superior mudou drasticamente.
A doença ulcerosa péptica é considerada atualmente, em 90% dos casos, de
caráter infeccioso (COVER & BLASER, 1996). A eliminação deste agente causal
pode curar o paciente. O papel do H.pylori em cânceres gástricos (carcinomas e
linfomas) já está bem estabelecido, a ponto deste bacilo ser considerado a partir de
1994 pelo IARC, uma afiliada da OMS (Working Group Meeting of the International
Agency for Research on Cancer em Lyon) um carcinógeno tipo1, ou seja, aquele
que é capaz de, independente de outros fatores, causar câncer (LEITE et al, 2005).
O risco (odds ratio) de uma pessoa infectada com H.pylori de desenvolver câncer é
de 1,9 a 3,8 vezes maior quando comparado com os indivíduos sem H.pylori. Caso a
infecção ocorra em indivíduos mais jovens o risco é ainda maior.
12
Enormes progressos vêm sendo obtidos na compreensão da patogênese da
infecção, bem como na terapêutica que está cada vez mais eficaz.
EPIDEMIOLOGIA E TRANSMISSÃO
A infecção com H.pylori ocorre em todo o mundo, estimando-se que 50% da
população mundial esteja infectada. A prevalência varia muito entre os países
(SINHA, 2004) e entre uma população de um mesmo país (OLIVEIRA, 1994;
SOUSA, 2001; MORAES, 2003). A prevalência da infecção está diretamente e
fortemente relacionada às condições sócio-econômicas. Na Alemanha verificou-se
13,4% de prevalência da infecção pelo H.pylori, na Dinamarca 21%, no Canadá
56%. No Brasil também há variações como: em Belo Horizonte foi de 34%, em Porto
Alegre 24,86% e em Pernambuco 32%.
A infecção é adquirida por ingestão da bactéria e é transmitida entre os familiares na
infância mais tenra, havendo relatos de transmissão nas primeiras seis semanas de
vida (SINHA, 2004). A transmissão do H.pylori parece ocorrer predominantemente
através do contato pessoa-pessoa, tanto fecal-oral quanto oral-oral. Este fato parece
ser favorecido pela aglomeração domiciliar. Quanto maior o número de habitantes
por cômodo, maior a probabilidade de contrair a bactéria. Outro fator de risco para
infecção pelo H.pylori em crianças é a história positiva dos pais para doenças
gástricas, independente das condições sócio-econômicas.
13
A infecção nos adultos em geral é crônica. Nas crianças é aguda causando
hipocloridria raramente detectada, sendo relativamente comum a remissão
espontânea (SUERBAUM, 2002), ou cura por ingestão de antibióticos para outras
infecções.
PATOGÊNESE
O Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativa, espiralada, microaerófila,
contendo flagelos, sendo provavelmente o agente da infecção crônica mais comum
em
seres
humanos.
Este
microorganismo
foi
descrito
inicialmente
como
Campilobacter pyloridis (PRADO et al, 1988), tendo sido classificado posteriormente
em um novo gênero, Helicobacter, com base nas características ultraestruturais,
genéticas e de componentes de ácidos graxos, além da produção de urease
característica desta espécie.
O genoma do H.pylori (1.65 milhões de pares de bases) codifica cerca de
1500 proteínas. O genoma muda continuamente durante a colonização da mucosa
do indivíduo. Após ser ingerida, a bactéria penetra a mucosa, embora seu principal
nicho seja o muco superficial. A produção de urease e a motilidade são essenciais
para esta etapa. A urease hidrolisa a uréia em dióxido de carbono e amônia,
permitindo com isto, que ela sobreviva em um meio ácido. O H.pylori pode se ligar
às células epiteliais por múltiplos receptores de superfície.
14
A maioria das cepas de H.pylori expressa uma citotoxina vacuolada, de 95 kD
denominada vacA (vacuolated associated gene), a qual tem papel controverso na
patogenicidade do H.pylori, porém um deles é a indução da apoptose através da
liberação de citocromo C. Outras cepas possuem uma ilha de patogenicidade,
conhecida como cagA (cytotoxin associated gen), um fragmento genômico de 40-Kb
contendo 31 genes. Esta região genômica provavelmente está envolvida com o
maquinário secretório que faz a translocação da proteína cagA para a célula gástrica
epitelial, com associação e liberação de fatores de proliferação celular e
desenvolvimento da doença.
A heterogeneidade genômica dos H.pylori isolados: cagA, vacA influencia a
resposta inflamatória em conjunto com fatores fenotípicos como: variáveis
ambientais (dieta, idade da primeira infecção) e resposta imunológica do hospedeiro.
A infecção pelo H.pylori tem sido reconhecida como a causa mais freqüente
da gastrite e doenças ulcerosas pépticas em crianças (ELITSUR et al, 2002). A
infecção crônica pode gerar, no futuro, as lesões malignas (carcinomas ou linfomas)
nos adultos.
RESPOSTA DO HOSPEDEIRO
O H.pylori causa uma inflamação gástrica contínua em potencialmente todas
as pessoas infectadas por ele. Esta resposta inicialmente consiste no recrutamento
15
de neutrófilos que suscitam o recrutamento de linfócitos T e B, plasmócitos e
macrófagos, com dano epitelial gástrico concomitante. A bactéria raramente invade
a mucosa gástrica e todo este desencadear, dá-se pela adesão desta, na célula
epitelial, através dos complexos maiores de histocompatibilidade de classe II (MHC),
os quais induzem a apoptose, além da secreção de interleucinas.
O H.pylori induz uma vigorosa resposta humoral mucosa e sistêmica, com
produção de auto-anticorpos relacionados a atrofia gástrica da região do corpo
(NEGRINI, 1997).Esta produção de anticorpos não leva a erradicação da infecção,
mas ao dano epitelial gástrico.
Durante a resposta imune específica, diferentes classes de linfócitos T são
recrutadas, que identificam e diferenciam o H.pylori das bactérias comensais. Por
ser preferencialmente um agente infeccioso extra celular, é de se esperar uma
resposta do tipo Th2 com estímulo dos linfócitos B. Paradoxalmente, as células TH.pylori específicas são fenotipicamente Th1 (CD8+), determinando a persistência
da inflamação e do dano epitelial, que também é potencializado pela produção das
interleucinas, pelos produtos secretados por neutrófilos e pela apoptose induzida.
A resposta do hospedeiro e o curso clínico da doença são extremamente
variáveis e influenciados tanto pela bactéria, quanto pela capacidade individual
imunológica ou pela interação de ambos.
O padrão e a distribuição da gastrite se correlacionam diretamente com a
faixa etária (WHITNEY, 2000; ELITSUR et al; 2002), estando também associada ao
16
risco de desenvolvimento de seqüela/reparo (FICHMAN, 2004), úlceras (RAJAN,
1999), carcinomas e linfomas (BEN REJEB, 2000).
2.2
VÍRUS EPSTEIN-BARR
O vírus Epstein-Barr (EBV) está disseminado pelo mundo todo, infectando
mais de 95% da população adulta (ANDERSSON, 2000). Na maioria dos casos a
infecção é assintomática, principalmente em adultos jovens e recebendo por isso,
informalmente, a denominação de ―Every Body’s Virus‖ (ANDERSSON, 2000).
Em 1958, baseado em extensos estudos epidemiológicos, o cirurgião
britânico Dennis Burkitt (BURKITT, 1963), propôs uma hipótese bastante provocativa
de que o linfoma entre as crianças da África tropical, seria causado por um vírus
ligado aos artrópodos. Em 1964 Epstein e Barr (EPSTEIN & BARR & ACHONG,
1964), a partir de células extraídas e cultivadas das biopsias de linfomas destas
crianças africanas e através de observações em microscópio eletrônico, descobriram
partículas semelhantes aos herpesvirus, porém com características antigênicas e
biológicas distintas daquelas conhecidas naquela época. O vírus então, foi
considerado um novo tipo de herpesvirus e nomeado vírus Epstein-Barr por causa
do estudo e da descoberta por estes autores. Em 1968 foi estabelecida a ligação do
EBV com a mononucleose infecciosa (MI) e desde então, novas terapêuticas têm
sido exaustivamente testadas para a MI, entretanto sem o devido sucesso, sendo
usado hoje em dia como paliativo a imunomodulação.
17
O EBV é γ-herpes, pertencente ao grupo dos herpesvírus, sendo um DNA
vírus, consistindo de uma dupla fita de aproximadamente 175 kpb, subfamília
gamaherpesviridae e gênero Linfocriptovírus. Como outros herpesvírus, tem a
capacidade de produzir infecção latente, que periodicamente se reativa, produzindo
três diferentes formas de latência, através da expressão de nove possíveis
proteínas. A importância desta reativação da latência está no fato da maioria destas
infecções serem adquiridas na infância e na hipótese do surgimento no futuro de
cânceres nos adultos.
A associação do EBV com neoplasias malignas humanas é bem conhecida e
foi estabelecida com a descrição do linfoma de Burkitt africano e do carcinoma de
nasofaringe (ZUR HAUSEN et al, 1970). Além disso, tem sido associado a inúmeras
doenças tais como: linfoma B em pacientes imunocomprometidos, linfoma de
Hodgkin (EPSTEIN et al, 1964), carcinoma com estroma linfóide (―linfoepiteliomalike‖) de glândula salivar, linfomas T, retocolite ulcerativa e doença de Crohn
(HUNGERMANN, 2001).
A presença do EBV em carcinomas gástricos com estroma linfomatoso foi
relatada em 1990 (BURKE et al, 1990) e em 1992 foi associado ao adenocarcinoma
gástrico usual (SHIBATA & WEISS, 1992). É provável que o EBV participe da
carcinogênese gástrica através da metaplasia intestinal, já que há relato da
presença do EBV (da proteína latente de membrana 1-LMP1) em epitélios gástricos
não neoplásicos (YANAI, 1997). Entretanto, recentemente, estudos com hibridização
―in situ― com sondas de RNA marcadas radioativamente para EBER1 e EBER2
18
(HUNGERMANN, 2001), contestam as hipóteses da participação do EBV na
etiogênese das alterações adaptativas nas gastrites.
O EBV infecta linfócitos B circulantes e T teciduais (KAIZAKE et al, 1998;
HIRANO et al, 2003). A infecção se dá nos linfócitos B por ligação específica a
receptores de complemento tipo 2 (CD21), seguido de ligação a receptor de
endocitose. Sabe-se do fenômeno de imortalização destes linfócitos, ou seja eles
podem ser propagados em culturas de células in vitro indefinidamente. O controle
destes linfócitos B é feito pela população de linfócitos T do hospedeiro hígido
(ABBAS, 1994).
O mecanismo de ―homing‖ parece ter participação fundamental na escolha do
local onde se assestarão as células infectadas pelo EBV e sendo portanto,
de
extrema relevância conhecermos o comportamento histopatológico ―agudo‖ e
crônico destas infecções nesta época da vida.
2.3
GASTRITE E RESPOSTA LINFÓIDE EM CRIANÇAS
O termo gastrite com frequência é usado erroneamente. Gastrite não é um
diagnóstico clínico, radiológico, ou endoscópico. Gastrite é um diagnóstico
histopatológico. O sufixo ―ite‖ significa inflamação e pressupõe a presença de células
inflamatórias (polimorfonucleares e, ou mononucleares) na lâmina própria (DOHIL et
al , 1999). As outras condições que não apresentem células inflamatórias na lâmina
19
própria, podendo ou não ter dano ou regeneração epitelial, devem ser referidas
como gastropatias.
Existem múltiplas causas de gastrites e gastropatias infantis, listadas a seguir:
gastropatia por stress, gastropatia neonatal, traumática, gastropatias associadas ao
uso de anti-inflamatórios não esteróides, gastropatia hipertensiva congestiva,
urêmica, gastropatia por refluxo biliar, corrosiva, induzida por exercício, induzida por
radiação, gastrite erosiva e, ou hemorrágica, gastrite varioliforme, gastrite linfocítica,
gastrite associada ao Helicobacter pylori , gastrite granulomatosa, gastrite alérgica,
por CMV, gastrite celíaca, gastrite eosinofílica, gastrite auto-imune, gastrite
flegmonosa, gastrites infecciosas e gastrite inespecífica (DOHIL et al , 1999).
A endoscopia gastrointestinal com biopsia é o ―padrão ouro‖ no diagnóstico
das condições clínicas gástricas em crianças, sendo considerado um procedimento
seguro, com uma baixa taxa de complicações (BOURKE et al, 1996; DIETZ et al,
2001). Desde os primeiros exames endoscópicos realizados em crianças, a
incidência da infecção pelo H.pylori aumentou, bem como o diagnóstico de gastrite
relacionada a ele, superando atualmente em freqüência os demais agentes
etiológicos.
A necessidade de uma classificação e graduação mundial para os casos de
gastrites, de etiologia variada, e para que todos os patologistas ―falassem‖ uma só
linguagem, tornou-se imperativa. A realização de um workshop de patologistas e
gastroenterologistas estabeleceram o ―Sistema de Sydney‖ (MISIEWICZ et al, 1990),
com sua posterior revisão e atualização sendo realizada em Houston somente por
20
patologistas (DIXON et al, 1996). Este sistema utiliza dois parâmetros: endoscópicos
e histológicos e está baseado na topografia, morfologia e etiologia da inflamação. A
versão atualizada implementou uma escala visual análoga, que facilitou a graduação
da gastrite (severidade da inflamação), da atividade, da atrofia glandular e da
metaplasia intestinal, bem como a quantificação da infecção pelo H.pylori,
considerado a maior causa de gastrite.
O primeiro passo da utilização do Sistema de Sydney é a topografia, ou seja
de qual região é a biopsia: fúndica, transição ou antral ou uma combinação
estatística de regiões, ou até uma pangastrite.
O segundo passo é a morfologia, detalhada a seguir:

A atividade é considerada a presença de neutrófilos no epitélio
(exocitose) ou no córion, ou ainda no lúmen-microabscessos. A ausência de
atividade atualmente é denominada de gastrite inativa.

A atrofia glandular é definida como ausência de glândulas, total ou
parcial, relacionada ou não ao agente etiológico, ou associada ou não a
metaplasia intestinal.

Metaplasia intestinal é definida como a substituição do epitélio
glandular gástrico ou foveolar, pelo epitélio intestinal com a presença ou não
das células de Paneth.

Todos, pela escala visual análoga do ―Sistema de Sydney‖ (ANEXO),
são quantificados em: ausente (0), leve (1), moderado (2) e acentuado (3);
sendo a metaplasia intestinal classificada em completa (presença das células
de Paneth) ou incompleta.
21
Este sistema foi criado e depois modificado, baseado em estudos com
biopsias gástricas de adultos. Atualmente há vários estudos propondo classificações
para as afecções gástricas pediátricas (DOHIL et al 1999), havendo entretanto
tantos outros que mostram com propriedade, a aplicabilidade do ―Sistema de
Sydney‖ em biopsias gástricas de crianças (COHEN et al, 2000). Este estudo mostra
inclusive que o número requerido de fragmentos pelo ―Sistema de Sydney‖ para
crianças, parece ser excessivo, podendo o fragmento antral ser somente
representativo
para
amostragem na
população
pediátrica.
Outros estudos
substanciam esta afirmação mostrando que a gastrite causada pelo H.pylori tem
uma predileção pelo antro-parede anterior da pequena curvatura da porção mediana
do antro (ELITSUR et al 2002). Eles concluem que se só for possível a obtenção de
poucos fragmentos (por questões éticas ou clínicas), que o local de escolha seja o
antro.
A mucosa gástrica naturalmente não contem tecido linfóide, mas somente
poucos linfócitos T e B: 2 a 5 linfócitos no córion, 2 a 3 em cada fovéola, além de
até 5 linfócitos por 100 células epiteliais superficiais. Normalmente não há
plasmócitos e macrófagos na lâmina própria gástrica (OWEN, 1986; DIXON et al,
1996). Qualquer infiltrado mononuclear com números de células acima destes
mencionados possibilita o diagnóstico de gastrite crônica. A inflamação crônica tem
um papel importante através dos linfócitos T citotóxicos na destruição tissular
(glandular).
22
Os
linfócitos
T
supressoras/citotóxicas,
CD8
ou
também
OKT8.
são
Possuem
conhecidos
receptores
como
que
células
se
T
ligam
especificamente a receptores MHC de classe I e que podem aumentar a afinidade
da interação entre estas células e a célula alvo durante a ativação antígenoespecífica. Esta célula contribui para a iniciação, progressão e regulação de
processos auto-imunes (WALTER & SANTAMARIA, 2005)
A inflamação linfocitária gástrica, seja ela na forma de agregados linfóides
com ou sem a formação de centros germinativos bem definidos, é um achado
característico da gastrite pelo H.pylori e representa uma resposta imune da mucosa
à bactéria, parcialmente como um processo auto-imune (JÁSKIEWICZ &
KOBIERSKA, 2000). O tamanho dos agregados linfóides em gastrites crônicas de
crianças se correlaciona com a presença histológica do H.pylori, mas não
exclusivamente, podendo também estar associado a outros agentes infecciosos
como o EBV, a gastrite linfocítica, linfomas MALT em fase inicial, ou ainda à
persistência
deste
infiltrado
inflamatório
linfocitário
após
terapêutica
para
erradicação do H.pylori. Há estudos que demonstram que o infiltrado linfóide pode
persistir após o tratamento para o bacilo (GENTA et al, 1993) e ser observado em
biopsias gástricas realizadas vários meses e até dois anos após interrupção dos
medicamentos.
O infiltrado inflamatório polimorfonuclear neutrófilo é responsável pelo
conceito de atividade da gastrite crônica (gastrite crônica ativa), que está
preferencialmente relacionada ao H.pylori como o agente etiológico. A densidade de
neutrófilos está diretamente relacionada ao dano mucoso e a intensidade de
23
infecção pelo H.pylori. Neutrófilos são indicadores sensíveis da presença ou
ausência desta bactéria e desaparecem dias após a cura da infecção. Se eles são
observados em biopsia pós-tratamento, procura cuidadosa deve ser feita inclusive
com colorações mais específicas (colorações pela prata), estudos imunohistoquímicos ou até reação da polimerase em cadeia, a qual aumenta em 20% a
positividade da bactéria (ZSIKLA et al, 2006).
24
3
OBJETIVOS
GERAL
Estudar a associação da resposta linfóide com Helicobacter pylori e com vírus
Epstein-Barr em biópsias gástricas de crianças submetidas a endoscopia digestiva
alta no Hospital Universitário Antônio Pedro/ UFF.
ESPECÍFICOS
1. Descrever
as
características
demográficas,
clínicas,
endoscópicas
e
histopatológicas de crianças submetidas à endoscopia digestiva alta no
Hospital Universitário Antônio Pedro/ UFF.
2. Determinar a presença de gastrite crônica segundo os critérios do Sistema de
Sydney, nas crianças definidas no objetivo 1.
3. Observar a prevalência da infecção pelo H.pylori nas biopsias de crianças
definidas no objetivo 1.
4. Verificar a presença da resposta linfóide nas biopsias gástricas de crianças
definidas no objetivo 1 e sua possível associação com H.pylori e EBV.
5. Estudar a presença de linfócitos T através de estudo imuno-histoquímico para
linfócitos T CD8 +.
25
4
MATERIAIS E MÉTODOS
A amostra do presente estudo consta de 142 biopsias procedentes de 129
crianças e foi selecionada retrospectivamente no arquivo do Serviço de Anatomia
Patológica do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP), identificando a totalidade
das biopsias gástricas de crianças de 01(um) a 12 (doze) anos de idade, no período
de janeiro de 2002 a dezembro de 2004. A idade limite de 12 anos foi baseada nos
critérios da Sociedade Brasileira de Pediatria, adotada no HUAP, para início da préadolescência. Foram excluídas as biopsias das crianças com história de ingestão
prévia de substâncias tóxicas (por ex.: soda cáustica e água sanitária). Este estudo
foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da Faculdade de Medicina/ HUAP.
Todas as biopsias foram obtidas através de endoscopia digestiva alta, sob
narcose, realizadas por uma mesma gastroenterologista ou sob sua supervisão
direta, no Serviço de Endoscopia do HUAP. Estas, foram coletadas nos locais de
lesão (na endoscopia) ou quando ―normais‖(na endoscopia), da região fúndica e,ou
antral.
Os dados clínicos mais relevantes foram obtidos a partir dos registros das
solicitações de exames histopatológicos pelos gastroenterologistas e foram
registrados como: idade, sexo, sinais ou sintomas (dor, refluxo, náuseas,
hematêmese e vômitos), relato de tratamento prévio para o Helicobacter pylori, bem
26
como os dados endoscópicos usuais (gastrite enantematosa leve definida como:
edema e congestão leves da mucosa; erosão; hiperplasia nodular linfóide e
endoscopia normal).
As biopsias foram acondicionadas em frascos com formol a 10% e levadas ao
Serviço de Anatomia Patológica do HUAP. Foram descritas macroscopicamente
quanto ao número de fragmentos, cor, consistência e tamanho. Após serem
processadas no auto técnico Jung histokinette 2000- Leica, com banhos
consecutivos de álcool e xilol, foram obtidos blocos de parafina, que a seguir foram
cortados em seções seriadas (mínimo de três) de 4 micra (técnica de processamento
-Anexo I) e coradas pela hematoxilina-eosina (HE)[ANEXO II].
Todas as biopsias coradas pela HE foram revistas pela autora utilizando-se
microscópio óptico (Nykon Alphaphot- Japão) e classificadas pelo ―Sistema Sydney‖
atualizado ( DIXON et al, 1996) e com aplicação pediátrica (COHEN et al, 2000),
valendo-se de uma escala visual análoga semi-quantitativa, com base na topografia,
morfologia e etiologia.
Os achados histopatológicos foram considerados por indivíduo, isto é, caso
houvesse mais de uma biopsia gástrica por criança, acondicionadas em diferentes
recipientes, elas foram analisadas em conjunto considerando o quadro morfológico
de maior gravidade referente a cada variável.
As biopsias foram classificadas como gastrites crônicas quando houve a
presença de linfócitos [mais de 2 a 5 linfócitos no córion ou fovéola, por campo de
27
grande aumento (CGA)-objetiva de 40x ] e,ou plasmócitos no córion (OWEN, 1986;
DIXON et al, 1996) . A gastrite crônica foi quantificada em leve (grau 1), moderada
(grau 2) e acentuada (grau 3), segundo a escala visual análoga, semi-quantitativa
criada pelo Consenso de Sydney (DIXON et al, 1996), na qual se compara o aspecto
morfológico, com padrões de referência (ANEXO). A presença de atrofia glandular
também foi analisada qualitativa e quantitativamente (leve- grau 1, moderada- grau 2
e acentuada- grau 3). A atividade inflamatória (neutrófilos no córion ou exocitose
epitelial) também foi avaliada e se presente, graduada em: leve- grau 1, moderadagrau 2 e acentuada- grau 3. A presença de metaplasia intestinal foi observada na
coloração da hematoxilina-eosina classificada como completa (presença de células
de Paneth) ou incompleta (ausência das células de Paneth) (WALKER, 2003).
Resposta linfóide equivaleu a: agregado linfóide (definido como mais de 50
linfócitos por Campo de Grande Aumento) ou hiperplasia nodular linfóide (definido
como folículos linfóides com centros germinativos bem formados). Foram relatados,
como presentes ou ausentes e analisados como alteração histológica única para
efeitos estatísticos.
Alterações inflamatórias mínimas também foram observadas, a saber: edema
e, ou congestão e, ou hemorragia do córion superficial.
Para a pesquisa do Helicobacter pylori foram realizadas em todas as biopsias
as colorações de Giemsa modificada (ANEXO III), além do Whartin-Starry (ANEXO
IV).
28
A presença ou ausência da bactéria H.pylori foi determinada em cada uma
das biopsias examinando-se a coloração de Giemsa modificada (ANEXO III), no
aumento pela objetiva de 40x, considerada somente a forma bacilar como critério
para positividade (GOLDSTEIN, 2002). A quantificação foi também visual e análoga
em: leve-1, moderada-2 e acentuada-3.
A presença ou ausência (positividade ou negatividade) da bactéria H.pylori
também foi examinada na coloração de Whartin-Starry (impregnação pela prata), no
aumento pela objetiva de 40x, considerada somente a forma bacilar como critério
para positividade.
Para a pesquisa do vírus Epstein-Barr foi realizado em todas as biopsias o
estudo imuno-histoquímico com o anticorpo anti- LMP1 da DAKO, Carpinteria CA,
clones CS1, CS2, CS3 e CS4, com diluição de 1/500 e com recuperação antigênica
com tampão citrato pH 6,0 em banho-maria a 96° C (técnica da imuno-histoquímica
no ANEXO V).
O estudo imuno-histoquímico para EBV utilizando-se o anticorpo anti-LMP1
foi considerado positivo quando houve forte marcação citoplasmática no linfócito,
revelada pelo cromógeno, contra-corado com hematoxilina de Harris.
Para o estudo dos linfócitos T CD8+ (citotóxicos-helper TH1), foi realizado o estudo
imuno-histoquímico com o anticorpo anti-CD8, NovoCastra, clone NCL-CD8, com
diluição de 1/400 e recuperação antigênica com tampão citrato pH 6,0, em banhomaria à 96° C (técnica da imuno-histoquímica em ANEXO).
29
Os linfócitos T CD8+ foram considerados positivos quando houve forte
marcação citoplasmática. Foram quantificados e contados em cada (por) 100(cem)
células epiteliais superficiais e agrupados em: até 5 linfócitos/100 células epiteliais;
até 10 linfócitos/100 células epiteliais; até 15/ linfócitos/100 células epiteliais; até 20/
linfócitos/100 células epiteliais; até 25/ linfócitos/100 células epiteliais.
A análise estatística envolveu métodos descritivos e analíticos. Todos os
dados apresentaram distribuição normal, conforme determinado pelo teste de
Kolmogorov-Smirnov e portanto, foram submetidos a testes paramétricos. O Teste t
de Student foi utlizado para comparação de variáveis contínuas entre dois conjuntos
de dados e o Teste do Qui-quadrado para comparação de proporções. Em todos os
casos, foi considerado estatisticamente significativo quando P foi menor que 0,05.
As fotos foram realizadas com câmara digital Nikon Coolpix 950, EUA, com as
imagens observadas em microscópio Nikon Eclipse E400, Japão. Foram retocadas
quanto ao contraste e brilho no programa CorelDraw 9 e trabalhadas graficamente
no Microsoft Word 2003.
30
5
RESULTADOS
O número de crianças deste estudo totalizou 129, havendo em doze casos,
mais de uma biopsia por paciente, perfazendo um total de 142 biopsias. A idade
mínima foi de 01 ano e a máxima de 12 anos, sendo a média igual a 08 anos
(Tabela 1). A maioria das crianças foi do sexo masculino (52%).
A indicação da endoscopia em 87% dos casos, foi para investigação
diagnóstica, sendo o restante realizado para controle pós-tratamento (total de 15
crianças). Não foi possível determinar quanto tempo após a primeira biopsia foi
realizado este controle pós-tratamento.
As crianças apresentavam como queixa principal a dor epigástrica em 74%
dos casos, vômitos, refluxo (Tabela 1) e em um percentual mínimo, hematêmese e
engasgos (menos de 1%).
Na endoscopia, o achado mais freqüente foi de gastrite enantematosa leve
(61%), seguido de erosão (16%), endoscopia normal (15%) e aspecto nodular da
mucosa, referido pela endoscopista como hiperplasia nodular linfóide (8%).
31
Tabela 1 – Características clínicas, endoscópicas e histopatológicas da
amostra (n=129).
VARIÁVEL
Idade (anos)
8±3
Sexo masc/fem (%)
52/48
Indicação da endoscopia
Investigação diagnóstica
112 (87%)
Controle tratamento
17 (13%)
Clínica
Dor
76 (74%)
Vômito
18 (17%)
Refluxo
9 (9%)
Achados na endoscopia
Normal
22 (15%)
Gastrite enantematosa leve
87 (61%)
Erosão
23 (16%)
Hiperplasia nodular linfóide
11 (8%)
Achados histopatológicos
Normal
2 (1%)
Alteração inflamatória mínima
41 (29%)
Erosão
10 (7%)
Gastrite crônica
89 (63%)
Helicobacter pylori
Negativo
90 (70%)
Positivo
39 (30%)
Obs: Os números e percentuais em cada variável podem ser diferentes, pois
algumas crianças podem apresentar mais de um sintoma e mais de uma biopsia e
podem existir mais de um achado em cada biopsia.
Quanto à análise histopatológica (Tabela 2), a moda em relação ao número
de fragmentos foi igual a 02 (dois), com tamanho médio de 0,4cm na totalidade de
fragmentos por biopsia. O padrão (topografia) mais observado foi o antral (Figura 1),
seguido da região fúndica, além de um percentual de 7% das biopsias que foram
classificadas como não determinado (superficial).
A totalidade das biopsias apresentou diferentes achados histopatológicos que
variaram de gastrite crônica (63%; Figura 2), alterações inflamatórias mínimas edema, congestão, hemorragia - (29%), erosão (7%) e biopsia normal (1%). Estes
32
achados às vezes foram observados em mais de uma biopsia de uma mesma
criança.
A prevalência da infecção pelo H.pylori nestas crianças foi de 30,2% (39
positivas em 129 crianças analisadas; Figura 3). Apenas uma criança com H.pylori
positivo não apresentava gastrite crônica ou aguda, somente alteração inflamatória
mínima.
A análise da gastrite, pelo Sistema Sydney, revelou que entre as 129 crianças
biopsiadas, 83 (64%) delas apresentavam gastrite crônica, com a análise qualitativa
exibida na Tabela 2. Destas 83 crianças, 24% mostravam atividade inflamatória leve,
sendo entretanto a maior parte inativa (55%). A atrofia glandular só foi observada em
20% dos 83 casos, sendo leve nestes e foram sempre observadas nos fragmentos
de origem antral (Figura 4). A metaplasia intestinal foi observada em 5 casos (6%),
sendo completa (com células de Paneth) em 2% (Figura 5).
A resposta linfóide foi agrupada em agregados linfóides (sem centros
germinativos bem formados) e hiperplasia nodular linfóide, tendo sido encontrada
em 48% desta amostra (Figura 6).
33
Tabela 2 – Descrição dos achados histopatológicos segundo o sistema de
Sydney (n=83) em crianças com gastrite crônica.
VARIÁVEL
Topografia (padrão)
Fúndico
Transição
Antral
Não determinado
Intensidade
Leve
Moderada
Acentuada
Atividade
Inativa
Leve
Moderada
Acentuada
Atrofia
Ausente
Leve
Moderada
Acentuada
Metaplasia intestinal
Ausente
Incompleta
Completa
Hiperplasia nodular linfóide/agregado linfóide
Ausente
Presente
Helicobacter pylori
Negativo
Positivo
n (%)
31 (22%)
3 (2%)
98 (69%)
10 (7%)
58 (70%)
19 (23%)
6 (7%)
46 (55%)
20 (24%)
16 (19%)
1 (1%)
66 (80%)
17 (20%)
--78 (94%)
3 (4%)
2 (2%)
43 (52%)
40 (48%)
44 (54%)
38 (46%)
Obs: As variáveis topografia (padrão) e H.pylori referem-se ao total de biopsias
(n=142).
O estudo imuno-histoquímico para linfócitos CD8+ revelou que 12% das
biopsias não apresentavam positividade para estes linfócitos no epitélio superficial
(Figura 7). Oitenta e três por cento das crianças mostravam até cinco linfócitos CD8+
(Figura 7 a) por cem células epiteliais superficiais (CES). Quatro por cento das
crianças tinham até 10 CD8+/100 CES (Figura 7 b) e 1% até 25 CD8+/100 CES.
34
O estudo imuno-histoquímico para pesquisa da proteína latente do EBV com
o anticorpo anti-LMP1 mostrou negatividade na totalidade das 142 biopsias testadas
(Figura 8), tanto nos agregados linfóides, quanto na hiperplasia nodular linfóide e
como também nas células epiteliais, com ou sem metaplasia intestinal.
A pesquisa do Helicobacter pylori foi feita na coloração de Giemsa modificada
em todos as cento e quarenta e duas biopsias bem como a coloração de WhartinStarry. Das biopsias sem gastrite crônica (GC) nenhuma demonstrou positividade
para H.pylori. Daquelas que foram classificadas como GC (n=83) 46% foram
positivas para H.pylori, enquanto 54% foram negativas. Apenas uma biopsia resultou
positiva na coloração Whartin-Starry após ter sido considerada negativa no Giemsa.
Este caso, portanto, foi considerado positivo (Figura 9).
Todos os casos que mostraram atividade inflamatória (Figura 10) mostraramse positivos para H.pylori (100%). Os casos sem atividade inflamatória e H.pylori
positivo foram os casos com erosão, em que a presença dos neutrófilos é marcador
da própria erosão e portanto especificamente não se quantificou a atividade nestes
casos.
Os casos com metaplasia intestinal incompleta (n=3) em que a pesquisa de
H.pylori foi positiva, mostraram também atividade inflamatória concomitante,
enquanto os outros dois casos de metaplasia intestinal completa não demonstraram
esta mesma relação.
35
A média de idade das crianças com pesquisa negativa para H.pylori foi de 7,1
anos, com desvio padrão de ± 3,3 enquanto que a média da idade das crianças com
pesquisa positiva para H.pylori foi de 9,1, com desvio padrão de ± 2,8. O teste T de
Student
mostrou
que
a
idade
das
crianças
positivas
para
H.pylori
foi
significativamente maior do que as que foram negativas para H.pylori (p <0,001).
A média de idade das crianças com pesquisa positiva para H.pylori e que
mostraram a resposta linfóide foi 8,8 com desvio padrão de ± 3,0; enquanto média
de idade das crianças com pesquisa negativa para H.pylori e que exibiram resposta
linfóide foi de 7,6 e com desvio padrão de ± 3,0. O teste T de Student também
mostrou que há diferença significativa na idade mais elevada das crianças que
mostraram-se positivas para H.pylori e com resposta linfóide presente (p <0,001).
O achado da resposta linfóide (agregados linfóides/ hiperplasia nodular
linfóide) foi mais freqüente nas crianças com positividade para H.pylori (p <0,001;
Figura 11).
36
Helicobacter pylori (+)
20%
80%
Resposta linfóide (+)
Resposta linfóide (-)
Helicobacter pylori (-)
15%
85%
Resposta linfóide (+)
Resposta linfóide (-)
Figura 11: Proporção de crianças com resposta linfóide nas biopsias
ástricas naquelas com positividade e negatividade para H. pylori
(P<0,001).
Quinze crianças revelaram resposta linfóide com H.pylori negativo nas
colorações pelos Giemsa e Whartin-Starry, negatividade também para EBV (LMP1)
e quantificação normal de linfócitos T CD8+ (5/100).
37
6
DISCUSSÃO
Este estudo foi elaborado a partir do exame durante a checagem na rotina
com residentes do Serviço de Anatomia Patológica do HUAP em 2003, de uma
biopsia gástrica de uma criança de 03 anos de idade (B03.1595) com gastrite
crônica moderada, resposta linfóide evidente e pesquisa para H. pylori positiva com
grande quantidade de bacilos na coloração pelo Giemsa. Este achado impulsionou
a análise retrospectiva detalhada e sistemática de biopsias gástricas infantis, na
intenção de sabermos o comportamento da população local e investigarmos se
aquele era somente ou não um caso isolado. Outro ponto importante é a escassez
na literatura de dados brasileiros da nossa região (RJ), sobre achados em biopsias
gástricas de crianças, principalmente as de pouca idade. A amostra retrospectiva foi
selecionada no nosso serviço, com revisão dos achados histopatológicos e
investigação do agente causal. Os achados da prevalência da infecção pelo
Helicobacter pylori foram apresentados primeiramente na Semana Científica do
HUAP/UFF em 2004 e mais detalhadamente (prevalência, histopatologia e etiologia)
no Congresso Brasileiro de Patologia em Natal em 2005 (ANEXO).
As crianças apresentaram como queixa principal a dor epigástrica em 74%
dos casos, muitas vezes de caráter recorrente o que está em concordância com a
literatura, como descreve Cover (COVER, 1996). Vômitos, refluxo gastro-esofágico
e, em um percentual mínimo, náuseas, anemia, hematêmese e engasgos (juntos
estes quatro somaram menos de 0,1%), são os outros sintomas relatados. Trinta por
38
cento dos nossos casos apresentaram positividade para H. pylori e a queixa mais
freqüente das crianças foi dor epigástrica. A infecção aguda pelo referido bacilo
pode levar semanas apresentando a clínica de dor e náuseas ou tornar-se crônica
por décadas, assintomática por anos ou até apresentar novamente dor, náuseas e
até sintomas dispépticos ulcerosos (COVER, 1996).
Na endoscopia, o achado mais freqüente no Serviço de Endoscopia do
HUAP/UFF foi de gastrite enantematosa leve (61%), seguido de erosão (16%),
endoscopia normal (15%) e aspecto nodular da mucosa, referido pela endoscopista
como hiperplasia nodular linfóide (8%). Este achado endoscópico correlacionou-se
com os achados histopatológicos de resposta linfóide em 100% dos casos,
novamente em concordância com a literatura (COHEN et al, 2000; RAFFEY, 2004).
A moda em relação ao número de fragmentos foi igual a 02 (dois), com
tamanho médio de 0,4cm na totalidade de fragmentos por biopsia.
O padrão
histológico (topografia) mais observado foi o antral, seguido do padrão fúndico, além
de um percentual de 7% das biopsias que foram classificadas como não
determinado (superficial). O número de dois fragmentos,a maioria proveniente do
antro, embora pequenos, foi suficiente para os diagnósticos aqui apresentados.O
grupo argentino do Dr. Drut relata que um fragmento seria suficiente caso o antral
fosse o de escolha para retirada (COHEN et al, 2000); outro trabalho mostra que o
local de preferência do H. pylori é a região médio-antral (ELITSUR et al, 2002),
portanto nossa amostra está em concordância com a literatura.
39
A totalidade das biopsias apresentou diferentes achados histopatológicos que
variaram de alterações inflamatórias mínimas: edema, congestão, hemorragia (29%),
erosão (7%) a biopsia normal (1%). Estes podem ser observados em crianças com
quadro provavelmente agudo, ou por H. pylori ou outras causas como estresse por
exemplo (DOHIL et al, 1999).
Em 63% dos casos o achado foi de gastrite crônica e a prevalência da
infecção pelo H.pylori nestas crianças foi de 30,2% (39 positivas em 129 crianças
analisadas). A análise da gastrite crônica pelo Sistema Sydney ratificou nos nossos
dados os achados da Dra. Cohen, mostrando também ser aplicável nas crianças
brasileiras. Entre as 129 crianças biopsiadas, 83 (64%) delas apresentavam gastrite
crônica, sendo mais freqüentes nas crianças de maior idade. Destas 83 crianças,
24% mostravam atividade inflamatória leve, sendo entretanto a maior parte inativa
(55%). Todos os casos que mostraram atividade inflamatória mostraram-se positivos
para H.pylori (100%). Os casos sem atividade inflamatória e H.pylori positivo foram
os casos com erosão, em que a presença dos neutrófilos é marcador da própria
erosão e portanto especificamente não se quantificou a atividade nestes casos
(COHEN et al, 2000).
A atrofia glandular foi observada em 20% dos 83 casos, sendo leve nestes e
foram sempre observadas nos fragmentos de origem antral. O trabalho da Dra.
Cohen não observou atrofia nas 15 biopsias examinadas, bem como refere que
desconhece tal achado em crianças. A amostra do nosso estudo (n=142) talvez
tenha permitido achar mais facilmente este parâmetro. O carcinoma gástrico tem
relação direta com a atrofia glandular (RICUARTE et al, 2005). O trabalho deste
40
autor recomenda que em países em desenvolvimento acrescente-se um fragmento
da região da transição na pequena curvatura, local de incidência nestes países dos
adenocarcinomas gástricos.
A metaplasia intestinal foi observada em 5 casos (6%), sendo completa (com
células de Paneth) em 2%. O grupo da Dra. Cohen observou metaplasia intestinal
em 3 das 15 biopsias examinadas, mas também refere que este é um achado pouco
freqüente nas crianças. Sabe-se que o tratamento e acompanhamento posterior
mostra que tal adaptação celular desaparece com o tempo (GENTA et al 1983;
COHEN et al, 2000), o que é benéfico já que a metaplasia intestinal é considerada
um ambiente propício para o desenvolvimento da neoplasia epitelial gástrica (ODZE
et al, 2004).
O agente causal preponderante da inflamação foi o H. pylori, associado a
evidente resposta linfóide. Entretanto um percentual de crianças demonstrou
resposta linfóide com a pesquisa do H. pylori negativa. Nosso estudo foi motivado
pela tentativa de conhecermos a etiologia deste fenômeno, pois sabe-se da relação
do tecido linfóide associado a mucosa (MALT) e a possibilidade de desenvolvimento
de linfomas (BEn REJEB et al, 2000). Para isto realizamos a pesquisa do EBV em
todas as biopsias destas crianças, sabidamente agente causal latente extremamente
freqüente na população mundial (ANDERSSON, 2000) e enfim quantificamos na
mucosa os linfócitos CD8+, implicados em processos de intolerância alimentar e
auto-imunidade e também aumentada na resposta imunológica ao H. pylori (LI et al,
2005).
41
O presente estudo através dos resultados observados nas biopsias gástricas
das crianças submetidas a endoscopia no HUAP/UFF, mostrou uma prevalência de
30,2% de infecção pelo H. pylori. Outros estudos que buscaram determinar a
prevalência do H.pylori, encontraram uma ampla faixa de resultados. Sinha et al
(SINHA et al, 2002) mostrou que a soropositividade na comunidade Wasamagak
(comunidade Canadense) foi de 95% (adultos e crianças) e que entre as crianças de
0 a12 anos a pesquisa de antígeno fecal para H.pylori, desta mesma comunidade foi
de 56%, tendo sido realizado em algumas crianças a análise pelo PCR. No Japão
verificou-se H. pylori positivo em crianças e adolescentes de 0 a 16 anos de idade,
em biopsias gástricas analisadas com colorações pelo Giemsa e pela prata, além de
cultura para H.pylori (KATO et al, 2004). A prevalência de H. pylori neste estudo
japonês variou de 28,8% nos casos com gastrite crônica sem agregado linfóide a
98,5% nos casos de gastrite nodular, ou seja, com agregado linfóide. Além das
diferenças sócio-econômicas entre os países, alguns aspectos metodológicos
dificultam uma comparação direta com os nossos resultados. Por exemplo, o estudo
japonês incluiu crianças com idade até 16 anos, o que pode explicar uma maior
prevalência (BOURKE et al, 1996) que o nosso, já que não incluímos crianças
maiores de 12 anos. Outro aspecto foi a utilização de múltiplos métodos de detecção
da bactéria tanto no estudo de Sinha et al (2002), quanto de Kato et al (2004). O
primeiro utilizou o PCR para identificação da bactéria, o que pode aumentar e muito
a detecção do microorganismo como demonstrou Zsikla et al (2006), enquanto que o
segundo amplificou a possibilidade de detecção pela realização de cultura para
H.pylori. Outro elemento metodológico relevante é o fato de que a análise sorológica
e pesquisa de antígeno nas fezes tem a capacidade de detectar a infecção de
H.pylori na fase aguda, enquanto que o nosso estudo foi realizado em crianças com
42
quadro de dor recorrente, portanto mais provavelmente portadoras de um processo
crônico. Uma outra explicação teórica para a nossa baixa prevalência, apontado
pelos autores japoneses (KATO et al 2004), é o desmame precoce destas crianças e
a introdução de chupetas e mamadeiras naqueles países, aumentando portanto, o
risco de contaminação oral-oral, oral-fecal, sendo a mãe o vetor responsável. No
nosso meio, o aleitamento materno exclusivo é incentivado até os seis meses de
idade, com retardamento da introdução das mamadeiras e chupetas, o que
diminuiria a prevalência da infecção, agindo o leite materno também como fator de
proteção humoral (KATO et al 2004). Outro fato importante é que provavelmente
somente a biopsia gástrica não seja suficiente para excluir a infecção pelo H.pylori,
sendo necessária a associação com outros métodos para aumentar a sensibilidade
diagnóstica, como por exemplo a realização do PCR a partir da biopsia gástrica
(ZSIKLA et al, 2006).
A prevalência no HUAP/UFF de 30,2% de positividade para o H. pylori foi
semelhante a outros estudos realizados no nosso país. Levantamento realizado na
cidade de Porto Alegre (SOUSA et al, 2001) demonstrou que a prevalência de H.
pylori em biopsias gástricas de crianças no Hospital de Clínicas daquela cidade foi
de 24,9%, enquanto na cidade de Belo Horizonte (Oliveira et al, 1994) a
soroprevalência foi de 34,1%. Este último foi realizado em uma comunidade
sabidamente de baixo padrão sócio-econômico. Em Pernambuco, no Hospital Geral
de Pediatria a soroprevalência do H. pylori variou de 28,6% nos pré-escolares a
39,4% nos escolares (MORAES et al, 2003). Estes estudos sugerem que,
populações de baixo nível sócio-econômico, com aglomerações domiciliares,
ausência de saneamento básico, comidas e águas infectadas e devido a alta
43
prevalência de adultos infectados, a contaminação infantil seja facilitada e
consequentemente a prevalência da infecção entre as crianças seja maior.
Uma característica da nossa população infantil estudada é que a maioria,
51% das crianças, não possuíam prontuário do HUAP, eram portadoras de FAE
(ficha de atendimento especial), ou seja eram provenientes de outras clínicas,
hospitais ou municípios (São Gonçalo por exemplo). Portanto, não foi possível
analisar as condições sócio-econômicas e sanitárias, já que tais fichas trazem
informações resumidas. A população atendida no HUAP é proveniente de
comunidades carentes, isto é, de padrão sócio-econômico baixo, por esta razão
esperávamos uma alta prevalência de infecção pelo H. pylori, mas assim como no
estudo de Belo Horizonte, encontramos uma baixa prevalência. Há que se
considerar, porém sem podermos afirmar com certeza, tal como o autor mineiro
Oliveira et al (1994) especulou, que a água e os alimentos consumidos talvez
estejam em melhores condições e com menores índices de coliformes fecais,
justificando desta maneira o índice observado.
De acordo com David A. Owen (OWEN, 1986) a mucosa gástrica
naturalmente não apresenta tecido linfóide, como vemos as placas de Payer no
intestino delgado. Poucos linfócitos T e B são evidenciados na lâmina própria, na
fovéola ou nas células superficiais. O achado morfológico da resposta linfóide em 40
casos (48%), sob a forma de agregados ou hiperplasia nodular linfóide com centros
germinativos bem definidos nas nossas biopsias infantis, estava associada em 80%
dos casos com positividade para H.pylori. Este resultado está de acordo com a
literatura mundial, tanto para adultos (COVER & BLASER, 1996; GENTA et al,
44
1993), quanto para crianças (COHEN, et al, 2000). Quanto maior a idade, maior a
resposta linfóide, provavelmente pela imuno competência adquirida com o
crescimento e amadurecimento do sistema imunológico.
A coloração da impregnação pela prata foi usada nos nossos casos na
intenção de maior detecção de positividade para H.pylori, principalmente nas
biopsias negativas para H.pylori, mas com resposta linfóide presente. Somente uma
biopsia com resposta linfóide foi negativa para H.pylori na coloração de Giemsa
modificada e positivou após a realização da coloração de Whartin-Starry. Vários
estudos demonstraram que não houve diferença significativa entre as colorações
especiais de Giemsa modificada (GRAY et al, 1986) e Whartin-Starry (ORTIZMARTINEZ et al, 2005) para a detecção do bacilo na sua forma espiralada.
Entretanto, há diferença destas se comparadas com a coloração da hematoxilina e
eosina (H.E.) usada na rotina para diagnóstico. Ambas são mais sensíveis que o
H.E. (ORTIZ-MARTINEZ et al, 2005). Nosso estudo mostrou dados concordantes
com a literatura. A coloração de Giemsa revelou-se mais fácil, rápida, barata e de
fácil identificação da bactéria. A coloração de Whartin-Starry é mais cara, demorada
e não se mostrou na prática mais eficiente que o Giemsa na detecção do H.pylori.
Portanto, os resultados deste nosso estudo parecem não justificar, em exames de
rotina, o uso das duas colorações, mas somente a coloração do Giemsa modificada,
pelas vantagens acima expostas. Entretanto, com o advento das técnicas mais
avançadas de diagnóstico, sabe-se que hoje em dia o exame de preferência em
casos duvidosos não são as colorações especiais, mas sim a reação da polimerase
em cadeia (PCR), como relatado por ZSIKLA V.et al em fevereiro de 2006.
45
Quinze crianças apresentaram resposta linfóide na ausência do Helicobacter
pylori. Esta ausência foi detectada no Giemsa e confirmada pela coloração de
Whartin-Starry. Neste momento coube a pergunta: ‖Qual seria a etiologia desta
resposta linfóide‖? De acordo com a revisão de Andersson (2000) sobre EBV 95%
da população mundial está infectada pelo EBV. Portanto pareceu-nos razoável
investigar se a etiologia da resposta linfóide nestes casos era este vírus. É sabido
também que o EBV está implicado na gênese de carcinomas com estroma
linfomatoso e de linfomas do tipo Burkitt (ANDERSSON, 2000). Além disto, há
relatos (HUNGERMANN et al, 2001) do envolvimento do EBV com a Doença de
Crohn, a qual também pode acometer a mucosa gástrica. Por todas estas razões
relevantes realizamos então, em todas as biopsias (n=142) e não somente nas
quinze referidas, estudo imuno-histoquímico para LMP1, já que estaríamos
buscando uma infecção latente, pois nenhuma criança apresentava quadro clínico
compatível com mononucleose, na época em que foi realizada a biopsia. O resultado
revelou negatividade na totalidade da amostra, tanto nos linfócitos, assim como
demonstrou KAIZAKE Y. et al em 1998, quanto nas células metaplásicas relatado
por YANAI H. et al em 1997. Observamos entretanto um aspecto interessante nas
glândulas da região fúndica, particularmente nas células parietais. Estas mostraram
imuno marcação citoplasmática positiva e forte, sem ―reação de fundo‖ associada
(Figura 12). Tal aspecto pode estar relacionado ao fato destas células produzirem
uma glicoproteína chamada ―fator intrínseco‖ responsável pela ligação da vitamina
B12 na superfície ou no lúmen gástrico, formando um complexo que é absorvido no
íleo terminal. Este fato pode explicar uma ligação inespecífica com a biotina (que
pertence a classe do complexo de vitaminas B), utilizada na reação imunohistoquímica (avidina-biotina-peroxidase). Tanto a região fúndica, quanto a transição
46
e o antro exibem células parietais, porém em proporções diferentes. Portanto para
que tal fenômeno não seja detectado nas biopsias gástricas, o ideal seria fazer o
sistema Envision, da DAKO Carpinteria CA, que não utiliza a biotina no processo,
porém de custo bem mais elevado para ser utilizado na rotina. Outro aspecto a ser
considerado é que a LMP1 foi descrita para linfócitos cancerosos e não para
biopsias gástricas de crianças com gastrite crônica, embora esta técnica tenha sido
usada por outros autores, com resultados semelhantes (JASKIEWICZ et al, 2000).
Dentre as quinze crianças com resposta linfóide e pesquisa para H. pylori
negativa, cinco fizeram endoscopia de controle pós-tratamento para H. pylori, o que
explica nestes casos a presença ou melhor, a persistência da resposta linfóide.
Vários autores têm relatado tal aspecto, a começar pelo trabalho mais clássico de
GENTA e colaboradores (GENTA et al, 1983). Neste artigo os autores apresentam a
hipótese da presença dos folículos linfóides relacionados a estimulação antigênica
crônica exercida pelo microorganismo sobre a mucosa gástrica, representando desta
forma
uma resposta imune contra o bacilo. Este fenômeno não é H.pylori-
específico, também acontecendo em outras entidades, porém de forma diversa
como na gastrite auto-imune (JASKIEWICZ et al, 2000). A presença da resposta
linfóide foi observada em adultos como nos estudos citados acima, entretanto
autores como D’Armiento e Prieto mostram achado semelhante em crianças
(PRIETO et al,1992; D’ARMIENTO et al, 1994). O fato é que estes estudos
evidenciam que a resposta linfóide pode demorar para desaparecer de meses até
três anos após o tratamento para erradicação do bacilo, demonstrado pelo grupo
argentino do Prof. Drut (COHEN & DRUT, 2005). Portanto, nestes nossos cinco
casos a presença da resposta linfóide notada, pode estar relacionada ao tratamento
47
prévio, coletado dos dados clínicos, embora não haja referência ao tempo entre a
primeira biopsia e a realizada para controle pós-tratamento.
Entretanto ficou a indagação a cerca da causa para as dez biopsias restantes.
A hipótese do H. pylori como responsável era remota, pois as duas colorações
haviam sido negativas anteriormente, mesmo sabendo que atualmente o exame de
escolha para certeza nestes casos seja o PCR. Há um indicador nestas biopsias que
chama a atenção que é a ausência de atividade inflamatória ou até de erosão. Nos
nossos casos e de acordo com a literatura (COHEN et al, 2000), os neutrófilos são
marcadores da presença do bacilo. Portanto é pouco provável que tal
microorganismo seja o agente etiológico nestes casos. A procura pelo EBV também
foi realizada através da proteína latente da infecção. O método de escolha mais
adequado também é o PCR (ZSIKLA et al, 2006), porém estudos na literatura
(HUNGERMANN et al, 2001) mostram que o estômago não é o local de escolha
para os linfócitos B imortalizados pela infecção pelo EBV, como já foi apontado
anteriormente. A mucosa gástrica não parece possuir o mecanismo de homing
necessário para o assentamento destes linfócitos infectados (ABBAS ET AL, 1994).
Portanto, assim com no estudo de Jaskiewicz (JASKIEWICZ et al, 2000) há que se
considerar outros fatores para a gênese deste processo. Cinqüenta por cento dos
pacientes com agregados ou hiperplasia linfóide na mucosa antral (nossa maior
amostra), está relacionada a clínica
de anemia perniciosa (FONG et al 1991),
tratando-se de gastrite do tipo B, isto é auto-imune. Não há também nestes casos
quadro clínico compatível com anemia. A única criança com clínica de anemia
(ferropriva) era H. pylori positiva.
48
Realizamos através de estudo imuno-histoquímico a análise da presença dos
linfócitos T CD8+. Há evidências recentes que mostram que estes linfócitos regulam,
propagam e iniciam diversas respostas patogênicas auto-imunes (WALTER et al,
2005), matando células alvo diretamente ou através da secreção de citocinas. A
gastrite linfocítica seria outra possibilidade de etilogia nestes casos, estando
diretamente ligada a processos imuno mediados e tendo relação direta com a
intolerância a glúten, ou seja a doença celíaca (ALASAIGH et al, 1996; DRUT &
DRUT, 2004). Desta forma resolvemos estudar não só nestas dez biopsias mas nas
142, o comportamento dos linfócitos CD8+, através da contagem deles por 100
células epiteliais, à semelhança do diagnóstico da gastrite linfocítica ( acima de 25
CD8+/100 células epiteliais), na intenção de confirmar ou descartar a hipótese desta
entidade como responsável ou co-responsável pela resposta linfóide. Nossos
resultados nestas dez biopsias foram de normalidade da presença deles na mucosa,
isto é: até 5 linfócitos CD8+ por cem células epiteliais superficiais, o que está de
acordo com a normalidade citada por David Owen que descreve a histologia normal
do estômago (OWEN et al,1986). Das 142 biopsias das 129 crianças, somente seis
apresentaram contagem de CD8+ acima do normal. Cinco delas mostraram até 10
CD8+/100 CES e uma mostrou 25 CD8+/ 100 CES. Quase todas tinham relação ao
H. pylori, ou eram H. pylori positivas ou haviam feito tratamento prévio para
erradicação do bacilo. Só uma criança era H. pylori negativa, apresentando na
clínica dado interessante de diarréia crônica a esclarecer. Neste caso fica a hipótese
da possibilidade da intolerância alimentar, relacionada a reação imuno-mediada pelo
linfócito CD8+ (NEGRINI et al, 1997), sem no entanto sabermos exatamente qual
seria o fator alimentar associado. Exames clínicos seriam necessários neste caso.
Para os patologistas que encontrassem nas biopsias esta quantidade de linfócitos
49
intra-epiteliais, valeria a pena ressaltar no laudo anotando a possibilidade da
existência de uma intolerância alimentar, na dependência da correlação com os
dados clínicos e laboratoriais.
Nossa resposta a cerca da etiologia para estes dez casos fica na verdade em
aberto, cabendo novas e minuciosas investigações, bem como as possibilidades de
outros agentes infecciosos. Sabemos que crianças tomam antibióticos para outras
infecções bacterianas como por exemplo: amigdalites, faringites, pneumonias,etc.
Uma outra hipótese é a da cura ou resolução do processo infeccioso gástrico pelo
tratamento cruzado, restando no estômago somente a ―seqüela‖ da resposta linfóide
(PRIETO et al, 1992).
50
7
CONCLUSÕES
1. A maioria das crianças submetidas à endoscopia digestiva alta no HUAP/UFF
era do sexo masculino, com queixa principal de dor abdominal recorrente,
com achado endoscópico mais relevante de gastrite enantematosa leve e
alteração histopatológica mais freqüente de gastrite crônica.
2. As biopsias das crianças com gastrite crônica mostraram-se na maioria de
intensidade leve e inativa, sendo o padrão da região antral o mais encontrado.
A atrofia glandular e a metaplasia intestinal foram observadas em um
percentual reduzido das biopsias. Quase a metade dos casos evidenciou
hiperplasia nodular linfóide/agregado linfóide e positividade para Helicobacter
pylori.
3. Embora em um percentual reduzido, a atrofia glandular estava presente,
acontecendo em crianças com infecção pelo H. pylori, podendo ser uma
seqüela no processo de cura.
51
4. A prevalência de infecção pelo Helicobacter pylori nas crianças submetidas a
endoscopia digestiva alta no HUAP/UFF foi de 30,2%, concordante com a
população brasileira.
5. A resposta linfóide esteve presente em 48% das biopsias gástricas de
crianças submetidas à endoscopia no HUAP/UFF e não está associada ao
EBV (LMP1). Entretanto, há associação desta resposta linfóide em 80% dos
casos com positividade para H.pylori.
6. A resposta linfóide pode ser um achado morfológico pós-tratamento para
erradicação do H. pylori, ou ainda após tratamento com antibióticos para
outras infecções sistêmicas; sugerindo que a resposta linfóide seja uma
seqüela do processo de cura/reparo.
7. A resposta linfocitária T CD8+ nas biopsias gástricas de crianças submetidas
à endoscopia no HUAP/UFF, está em concordância com a literatura, sendo
que a grande maioria apresentou menos de 5 linfócitos CD8+/ 100 células
epiteliais (dentro dos limites da normalidade)
52
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ANEXOS
Anexo I
Processamento de biopsias e peças cirúrgicas
SEQUÊNCIA:
1) ÁLCOOL 99% 1 - 20MIN- 75°C
2) ÁLCOOL 99% 2 - 20MIN 75°C
3) ÁLCOOL 99% 3 - 20MIN 75°C
4) ÁLCOOL 99% 4 - 20MIN 75°C
5) XILOL 1 – 20MIN 75°C
6) XILOL 2 – 20MIN 75°C
7) XILOL 3 – 20MIN 75°C
8) PARAFINA 1 – 20MIN 75°C
9) PARAFINA 2 – 20MIN 75°C
10) PARAFINA 3 – 20MIN 75°C
Obs: O último frasco (álcool, xilol e parafina) sempre será o mais novo.
61
Anexo II
COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA
1) DESPARAFINIZAR EM ESTUFA
2) XILOL 1 – 2MIN
3) XILOL 2 – 5 MERGULHOS
4) XILOL 3 – 5 MERGULHOS
5) ÁLCOOL 99% 1 – 5 MERGULHOS
6) ÁLCOOL 99% 2 – 5 MERGULHOS
7) ÁLCOOL 99% 3 – 5 MERGULHOS
8) ÁGUA CORRENTE
9) HEMATOXILINA – 4MIN
10) ÁGUA CORRENTE (LAVAGEM RÁPIDA)
11) SOLUÇÃO ÁLCOOL/ÁCIDO – 3 MERGULHOS
12) ÁGUA CORRENTE
13) ÁLCOOL 99% 1 - 3 MERGULHOS
14) EOSINA – 3 MIN
15) ÁLCOOL 99% 1 – 5 MERGULHOS
16) ÁLCOOL 99% 2 – 5 MERGULHOS
17) ÁLCOOL 99% 3 – 5 MERGULHOS
18) ÁLCOOL 99% 2 – 5 MERGULHOS
19) ÁLCOOL 99% 3 – 5 MERGULHOS
20)XILOL 1 – 5 MERGULHOS
21)XILOL 2 – 5 MERGULHOS
22)XILOL 3 – 5 MERGULHOS
23)XILOL 4 – 5 MERGULHOS
24)MONTAGEM COM BÁLSAMO
Hematoxilina e eosina
Preparo das soluções
HEMATOXILINA:
Hematoxilina...................................5g
Álcool 99%.....................................50ml
Sulfato de Alumínio ou Alúmen de Potássio......100g
Água Destilada...............................1000ml
Óxido de Mercúrio..........................2,5g
Ácido acético...................................3 gotas (optativo)
PROCEDIMENTO:
1) Dissolver a Hematoxilina no álcool + Alúmen na água destilada (fora do
fogo)
62
2) Misturar as duas soluções e levar ao fogo até a ebulição (+- 1 min)
3) Retirar do fogo e juntar o Óxido de Mercúrio Amarelado lentamente aos
pouquinhos com cuidado e misturar bem.
4) Reaquecer até a fervura e contar um
minuto (a solução estará vermelho-escura)
5) Retirar do fogo e mergulhar em uma bacia
com água e gelo imediatamente, até esfriar totalmente.
6) Adicionar 3 gotas (4ml) de Ácido Acético quando o corante estiver
resfriado.
7) Filtrar e colocar em frasco escuro para amadurecer por +- 2 dias.
EOSINA
Eosina amarelada................10g
Água destilada...................300 ml
Álcool 99%.........................700 ml
Ácido acético glacial.........5ml (+- 5 gotas)
PROCEDIMENTO:
Dissolver a EOSINA na água destilada, acrescentar o álcool e ainda 5 ml de Ácido
Acético.
63
Anexo III
WHARTIN-STARRY
Nitrato de Prata a 1%
Nitrato de prata................................................................................1 g
Água destilada..............................................................................100ml
Nitrato de Prata a 2%
Nitrato de Prata...............................................................................2g
Água destilada..............................................................................100ml
Gelatina a 5%
Gelatina............................................................................................5g
Água destilada..............................................................................100ml
Hidroquinona 0,15%
Hidroquinona..................................................................................0,15g
Água destilada..............................................................................100ml
Colocar a prata 2%, gelatina 5% e hidroquinona 0,15% em frascos separados em
banhos-maria a 54°C (na hora que for corar).
Revelação (preparar só na hora)
Hidroquinona 0,15% ........................................................................2,0ml
Gelatina a 5% ................................................................................3,75ml
Nitrato de Prata a 2% .....................................................................1,5ml
Método de coloração:
 Desparafinizarar em xilol ( 5 mergulhos)
 Hidratar em álcool ( 5 mergulhos)
 Lavar em água corrente (retirar excesso)
 Passar na água destilada
 Solução de Nitrato de Prata a 1% em banho-maria a 43°C (30 min)
 Preparar a revelação
 Revelar as lâminas em uma placa térmica, até os cortes ficarem
marrom claro ou amarelados
 Lavar em água morna (retirar excesso)
 Passar na água destilada
 Desidratar em álcool ( 5 mergulhos)
 Clarificar em xilol ( 5 mergulhos)
 Montar
64
Anexo IV
Coloração de GIEMSA modificada
- 600 ml de glicerol
- 10 g de GIEMSA Solução da ALLKIMIA
- 600 ml de metanol P.A.

Aquecer a glicerina e colocar o pó de Giemsa. Acrescentar o metanol e agitar
bastante e só depois filtrar.


As lâminas são imersas nesta solução por 10 a 15 minutos.
Banho rápido na água e cerca de cinco mergulhos rápidos no álcool 99°GL
(desidratar), passando por quatro banhos de xilol ( mergulhos rápidos), para
depois montar a lâmina .


Nota: Pode se usar Giemsa a 2%( água destilada).
NOTA: A coloração acima é baseada no artigo da Dra. Susan Gray (GRAY,
1986)
65
Anexo V
IMUNO-HISTOQUÍMICA
ROTINA DO EXAME IMUNO-HISTOQUÍMICO

Estufa a 60° C por 10min. (desparafinizar)

Colocar em cubas de xilol na estufa a 60° C mais 10 min. (desparafinizar)

Quatro cubas de xilol (temperatura ambiente), após 2 cubas de álcool
absoluto e 2 de álcool 96%.( 5 min. em cada cuba)-desparafinizar

Água destilada por 2 min.

30 min. no citrato pH 6,0 a 96° C por 20min.

Esfriar em temperatura ambiente por mais 20 min.

Câmara úmida: coloca as lâminas após cicladas (marcadas com um círculo
ao redor dos fragmentos, para que as substâncias não escorram do campo)
com a caneta específica para este fim, da DAKO, Carpinteria . Pinga-se o leite
e espera-se 30 minutos.

Após, diluir os anticorpos LMP1- 1/500 e CD8- 1/400, ambos com solução
diluidora da DAKO (antibody diluent with background reducing components).

Coloca-se o anticorpo primário previamente diluído, por 30minutos.

LSAB (linked streptavidin biotin peroxidase)+ system HRP por 30 minutosanticorpo secundário. Primeiro, coloca-se o link por 30 min, depois o
complexo avidina-biotina-peroxidase por mais 30 min. OBS.:Lava-se com TBS
entre um e outro por 5 min.

Após, lavar no TBS (tampão) por 5 min.

DAB (3,3’ diaminobenzidine tetrahydrocloride), substrato cromógeno. A
solução é : DAB-substrate: 2 ml e DAB-cromogen: 1gota.
66

A reação do DAB é interrompida pela água destilada.

Contra corar com Hematoxilina de Harris 30 segundos

Antes de montar,as lâminas são imersas em 2 cubas com água, 1 com
amônia e mais 2 com água, 1 min em cada uma delas.

Por último as lâminas são imersas em cubas respectivamente contendo:
álcool a 90°, álcool absoluto, álcool absoluto, xilol, xilol, xilol, xilol, por 1 min.
em cadauma delas.
Montam-se as lâminas com um meio especial da DAKO que preserva a reação e a
coloração por mais tempo.
Protocolo básico da LMP1 (controle: linfoma de Hodgkin)

Diluição 1/500

Bloqueio da peroxidase endógena por 30 minutos (min.)

Recuperação antigênica- banho maria com citrato ph 6,0 preparado no
laboratório de IHQ por 30 minutos

Leite (desnatado) por 30 minutos

Anticorpo primário monoclonal por 30 minutos

LSAB

DAB por 2 minutos

Hematoxilina de Harris 30 segundos