Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA MAURÍCIO BARCELOS COSTA Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T reguladoras em pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais Goiânia-GO 2014 Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás– UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: [] Dissertação [X] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor(a): Maurício Barcelos Costa CPF: 158.666.371-20 E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não Vínculo EmpreProfessor – 40 horas - Regime Jurídico Único – Faculdade de Medicina - UFG gatício do autor Agência de fomento: Conselho Nacional de Pesquisa Sigla: CNPq País: Brasil UF: Goiás CNPJ: Título: Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T reguladoras em pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais Palavras-chave: Treg, mastócitos, triptase, quimase, hanseníase, dermatoses Título em outra língua: In situ study of the heterogeneity of mast cells and regulatory T cells in patients with leprosy, with and without reactional episodes Palavras-chave em outra língua: treg, mast cell, tryptase, chymase, leprosy, skin diseases Área de concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias Data defesa: (dd/mm/aaaa) 26/02/2014 Programa de Pós-Graduação: EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA Orientador(a): Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani CPF: 260.258.841-53 E-mail: [email protected] Co-orientador(a): CPF: E-mail: 3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ X ] total [ ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Capítulos. Especifique: __________________________________________________ [ ] Outras restrições: _____________________________________________________ Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________________ Assinatura do autor Data: 10 /04 /2014 1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados. ii MAURÍCIO BARCELOS COSTA Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T reguladoras em pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais Tese de Doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Doenças Infecciosas e Paraitárias. Orientadora: Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq – projeto n. 401276/) e da American Leprosy Missions. Goiânia-GO 26-02-2014 iii Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP) GPT/BC/UFG Costa, Maurício Barcelos. xxxx Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T reguladoras em pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais e em outras dermatoses [manuscrito] / Maurício Barcelos Costa. - 2014. xxx f. Orientadora: Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani. Dissertação (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014. Bibliografia. Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas, tabelas e anexos. 1. Hanseníase 2. Matócitos 3. Células T reguladoras. Título. CDU: xxx-xxx.xx iv Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO Aluno: MAURÍCIO B ARCELOS COSTA ____________________________________________________________ Orientadora: PROFA. DRA. MARIANE MARTINS DE ARAÚJO STEFANI __________________________________________________________ Membros: 1. Profa. Dra. Isabela Wastowski – UEG 2. Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira – UFAM 3. Profa. Dra. Mirian Lane C. de O. Rodrigues – UCG 4. Profa. Dra. Sônia Maria Oliani – IBILCE – UNESP 5. Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani – IPTSP - UFG Data: 26/02/2014 v Dedico minha Tese de Doutorado Aos Meus Pais, José (Seu Juquita – 80 anos) e Zany; A Minha Esposa, Eula Maria; e aos Meus Filhos, Fabrício, Mariane e Flávia. “Feliz é aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”. Cora Coralina vi AGRADECIMENTOS Primeiramente à DEUS, por tudo, por permitir a realização dos meus sonhos. A Eula, minha esposa, cúmplice e companheira de todas ashoras, por entenderme sempre que foi preciso, mantendo a harmonia do lar. A Sogra, que não posso esquecer, Dona Ica, pela amizade e que soube cuidar bem da Eula, para que eu pudesse desfrutar deste convívio. Aos meus pais, José (Seu Juquita) e Zany, grandes responsáveis por todas asminhas vitórias e de meus irmãos, por tudo que fizeram por mim e por nós, durante toda a minha vida. Aos meus irmãos, Marcos, Márcio, Maria Márcia, Maristela, Marlúcia, Marcelo e Mônica (“in memoriam”), pela confiança que em mim sempre depositaram epelo apoio em todas as ocasiões. Aos meus filhos, Fabrício, Mariane e Flávia, motivo de orgulho e de grandes alegrias, apesar das preocupações. A Dra. Ana Lúcia Osório Maroccolo de Sousa, minha estimada ex-aluna, colega, mãe e esposa dedicada, por toda abnegação e contribuição na parte clínica do projeto. Sem você este trabalho não seria possível. A enfermeira Maria Divina Silva (Divina Morena), pelo carinho, dedicação e auxílio no recrutamento dos pacientes comhanseníase, peça importante neste quebracabeça. Aos colegas do Laboratório de Imunologia, Mônica Nogueira da Guarda Reis, Yanna Lima, Keila Alcântara, eespecialmente para turma da hansenologia Regiane Morillas de Oliveira, Ludimila Cardoso, Emerith Mayra Hungria, Danielle de Freitas Mizoguti, Aline Freitas e Rodrigo Scalianti Moura, pelas trocas de conhecimentos, experiências, companheirismo, cumplicidade e dedicação. Uma equipe. Aos professores do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), por todos os ensinamentos transmitidos. A todos os professores que tive ao longo de minha jornada de doutorando e todos os demais. A Direção do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública e a Coordenaçãodo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade Federal deGoiás. Aos colegas e funcionários do IPTSP. Na pessoa da Profa. Dra. Marília Dalva Turchi, agradeço a todos! A Direção Geral do Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica e a Secretaria Municipal de Saúde de Goiânia, na pessoa da Enfermeira Ana Cecília Coelho, meus agradecimentos e reconhecimento pelo trabalho dedicado à saúde de nosso povo. Aos pacientes e voluntários que fizeram parte deste estudo, pela permissão quenos deram de estudá-los para a evolução da medicina e ciência. vii Ao Dr. Sebastião Alves Pinto, amigo e colaborador de todas as horas, pelo apoio na imuno-histoquímica e outros. Ao Alexandre Alves Vieira, meu amigo e Histotécnico, que com dedicação e carinho, preparou todas as lâminas para nossos estudos. A Flávia Aparecida Rodrigues, Secretária de todos os momentos, que pacientemente tolerou-me por todos estes anos e fez a revisão nos bancos de dados. Mais recentemente a nova Secretária, Eliete Macedo da Silva, cúmplice das pequenas inverdades juntos aos Médicos e pacientes, quando meu tempo era escasso e necessário à realização desta tese. Andréia Luiza Pereira e Magno Belém Cirqueira, biomédicos, técnicos em Imuno-histoquímica da Patologia do HC-UFG, que gentilmente ajudaram-me nas preparações de lâminas da imuno-histoquímica convencional. Aos Colegas Professores e Médicos Residentes do Departamento de Patologia, Radiologia, Imaginologia e Diagnóstico por Imagem, pelo companheirismo e compreensão pela nossa ausência temporária e parcial. A Profa. Dra. Sônia Maria Oliani do IBILCE da UNESP de São José do Rio Preto, que viabilizou a realização do estudo de heterogeneidade dos mastócitos em seu laboratório de Imunomorfologia. A Kallyne Kioko Oliveira Mimura e Rubens de Paula Júnior, colegas do IBILCE da UNESP de São José do Rio Preto, com quem realizamos a contagem dos mastócitos e imuno-histoquímica e densitometria (quimase e tripatse). Ao Prof. Dr. Fernando Augusto Soares, Professor Titular da USP, Chefe do Departamento de Patologia do Hospital A. C. Camargo – SP, que viabilizou a realização da dupla marcação no laboratório do Centro Internacional de Pesquisa (CIPE). Ao Juliano Jampietro, colega do Hospital A. C. Camargo – SP, orientando de Mestrado do Prof. Dr. Fernando Augusto Soares, que realizou a dupla marcação imunohistoqímica, CD25/Foxp3. A todas as pessoas que direta ou indiretamente me fizeram seguir em frente e que porventura ou desventura esqueci-me de nominar, meus sinceros agradecimentos. Agradecimento especial A Professora Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani, minha orientadora, pela dedicação, pelas oportunidades que tem dado a muitos pós-graduandos, durante vários anos, pela garra e determinação, paciência e incentivo. Pelo muito que tem produzido com o pouco que nos é dado e pela manutenção de um grupo de pesquisa dedicado à Hanseníase. Meus sinceros agradecimentos. Sua orientação foi imprescindível e sem está minha tese não seria possível! viii SUMÁRIO Agradecimentos ............................................................................................................ vii Sumário ........................................................................................................................ ix Tabelas, figuras e anexos .............................................................................................. xii Símbolos, siglas e abreviaturas ...................................................................................... xiv Apresentação ................................................................................................................ xvii Resumo ......................................................................................................................... xxiii Abstract ........................................................................................................................ xxv Organização da tese ................................................................................................xxvii 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1 1.1 Conceito .................................................................................................................. 1 1.2 Agente etiológico, infecção e doença ................................................................ 1 1.3 Aspectos históricos................................................................................................3 1.4 Dados epidemiológicos – retrospectiva e atualidade ................................................ 6 1.5 Manifestações clínicas da Hanseníase – definição de caso ................................ 14 1.5.1 Manifestações cutâneasna Hanseníase .............................................................. 15 1.5.2 Manifestações neuraisna Hanseníase ................................................................ 17 1.5.3 Manifestações otorrinolaringológicas na Hanseníase ................................ 19 1.5.4 Manifestações oftalmológicas na Hanseníase ................................................... 20 1.5.5 Manifestações viscerais e/ou sistêmicas na Hanseníase ................................21 1.6 Imunologia da Hanseníase ....................................................................................... 22 1.6.1 A resposta imune inata contra o M. leprae ....................................................... 22 1.6.2 A resposta imune adaptativa contra o M. leprae ............................................... 26 1.6.3 Hanseníase e Células T reguladoras ................................................................ 33 1.6.4 Hanseníase e Mastócitos .................................................................................. 37 1.7 Hanseníase: classificação de Ridley-Jopling e a classificação operacional– OMS/MS-Brasil ............................................................................................................ 42 1.8 Hanseníase e Genética ............................................................................................. 46 1.8.1 Predisposição genética e resposta imune inata para a hanseníase ...................... 46 1.8.2 Predisposição genética e resposta imune adquirida para a hanseníase .............. 48 1.9 Diagnóstico ............................................................................................................. 51 1.9.1 Baciloscopia ................................................................................................52 ix 1.9.2 Biópsia e exame histopatológico ................................................................ 52 1.9.3 Biologia Molecular .......................................................................................... 53 1.9.4 Estudos sorológicos ........................................................................................ 54 1.9.4.1 Sorologia anti-PGL-I e outras proteínas ou peptídeos do M. leprae ............... 54 1.9.4.2 Avaliação da imunidade celular a peptídeos e proteínas recombinantes do M. leprae...................................................................................... 58 1.9.4.3 Testes cutâneos para avaliação da imunidade celular ao M. leprae ................ 61 1.9.4.4 Outros meios auxiliares de diagnóstico ......................................................... 62 1.10 Diagnósticos Diferenciais ...................................................................................... 62 1.11 Reações Hansênicas .............................................................................................. 64 1.11.1 Reação Tipo 1(RT1 ou Reação Reversa) ........................................................ 65 1.11.2 Reação Tipo 2 (RT2 ou Eritema Nodoso Hansênico ................................ 67 1.11.3 O impacto das reações no manejo clínico da hanseníase ................................ 71 1.12 Tratamento: Multidrogaterapia (Poliquimioterapia) ............................................... 71 1.12.1 Tratamento: Multidrogaterapia nos adultos ..................................................... 72 1.12.2 Tratamento: Multidrogaterapia nas crianças e adultos com até 30 Kg .............. 74 1.12.3 Tratamento: Multidrogaterapia nas reações ..................................................... 75 1.12.3 Tratamento: Métodos profiláticos e vacina ....................................................... 75 2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................79 3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 81 4. APRESENTAÇÃO DOS MANUSCRITOS .............................................................. 82 5. RESULTADOS ................................................................................................ 83 5.1. ARTIGO 1: In situ expression of CD25+ Foxp3+ Regulatory T Cells in human skin diseases: leprosy and leprosy reactions ................................................. 83 Abstrat ................................................................................................................. 83 Introduction ......................................................................................................... 84 Methods ............................................................................................................... 86 Results ................................................................................................................. 89 Discussion ........................................................................................................... 91 References ........................................................................................................... 96 Table 1 ................................................................................................................. 99 Figure 1 ............................................................................................................... 99 Figure 2 ............................................................................................................... 100 x Figure 3 ................................................................................................................. 101 Figure 4 ............................................................................................................... 102 Figure 5 ............................................................................................................... 103 Figure 6 ............................................................................................................... 104 Figure supplementary 1 ........................................................................................ 105 5.2. ARTIGO 2: Mast cell heterogenity in human dermatoses: in situ tryptase and chymase positive cells with emphasis on leprosy and leprosy reactions .................................................................................................................. 106 Abstrat ................................................................................................................. 106 Introduction ......................................................................................................... 107 Methods ............................................................................................................... 108 Results ................................................................................................................. 111 Discussion ........................................................................................................... 113 References ........................................................................................................... 119 Table 1 ................................................................................................................. 123 Figure 1 ............................................................................................................... 124 Figure 2 ............................................................................................................... 125 Figure 3 ................................................................................................................. 126 Figure 4 ............................................................................................................... 127 Figure 5 ............................................................................................................... 128 6. CONCLUSÕES ................................................................................................ 129 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 130 8. ANEXOS .................................................................................................................. 150 xi TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Tabela 1. Casos registrados e estimados de hanseníase no mundo em 1966 .................. 6 Tabela 2. Casos de Hanseníase no período de 1966 a 1987 ........................................... 7 Tabela 3. Casos registrados de hanseníase, casos novos e cobertura pela MDT............. 8 Tabela 4. Casos registrados, prevalência e casos novos de hanseníase em 2012 ............ 9 Tabela 5. Casos de hanseníase no Brasil antes da implementação da MDT ................... 10 Tabela 6. Hanseníase – coeficientes de prevalência e detecção por região em 10 menores e maiores de 15 anos no Brasil 2011 ................................................................ Figura 1. Hanseníase no Brasil - coeficiente de prevalência no período de 1990 11 a 2010 ............................................................................................................................. Figura 2. Hanseníase coeficiente de prevalência e detecção no período de 1990 11 a 2010 ............................................................................................................................. Figura 3. Hanseníase – coeficiente de detecção nas diferentes regiões do 12 Brasil, no período de 1990 a 2010 ................................................................................. Tabela 7. Hanseníase – indicadores epidemiológicos e operacionais – Brasil 12 2001 a 2012 .................................................................................................................. Tabela 8. Hanseníase – tendência de detecção em países com mais de 1000 13 casos em 2012 ................................................................................................................. Figura 4. Hanseníase – coeficiente de detecção geral de casos novos no Brasil 13 e estados em 2010 ......................................................................................................... Figura 5. Hanseníase – coeficientes de prevalência segundo UF - Brasil, em 14 2011 .............................................................................................................................. Figura 6. Espectro clínico e imunopatológico da hanseníase e reações ......................... 15 Tabela 9. Hanseníase – formas clínicas, caracterização e classificação 17 operacional ................................................................................................................... Figura 7. Interação entre a imunidade inata e a imunidade adaptativa na 33 resposta à infecção pelo M. leprae................................................................................. xii Figura 8. Eventos de transdução de sinal na ativação dos mastócitos ............................ 39 Figura 9. Espectro imunopatológico da hanseníase segundo Ridley-Jopling ................. 45 Tabela 10. Apresentação das cartelas para o esquema padrão da OMS ......................... 72 Figura 10. Cartelas com medicamentos dos esquemas padrões da PQT 72 (Poliquimioterapia/OMS) para adultos e crianças, PB e MB ......................................... Tabela 11. Esquema terapêutico utilizado para Paucibacilar: 6 cartelas ........................ 73 Tabela 12. Cartelas com medicamentos dos esquemas padrões da PQT ....................... 74 Tabela 13. Dosagens dos medicamentos no esquema terapêutico utilizado para 75 crianças e adultos com peso inferior a 30 Kg ................................................................ Tabela 14. Avaliação para aplicação do BCG .............................................................. 76 Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa Médica Humana e animal ............... 151 Anexo 2. Parecer da Comissão de Ética em Pesquisa - CONEP ................................ 152 Anexo 3. Ficha de dados clínicos .................................................................................. 153 Anexo 4. Termo de consentimento livre e esclarecido ................................................... 154 Anexo 5. Comprovantes de submissão dos artigos/ aceite para publicação para 155 artigos ainda não publicados/ DOI dos artigos publicados ............................................. xiii SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS AraLAM Lipoarabinomanana com arabinose AT Azul de Toluidina BAAR Bacilo Ácido Álcool Resistente BB Hanseníase Borderline-Borderline BCG Bacilo Calmette-Guerin BL Hanseníase Borderline-Lepromatosa BT Hanseníase Borderline-Tuberculoide CEP/CONEP Comitês de Ética em Pesquisa/Conselho Nacional de Ética em Pesquisa CGRP CRDT “Calcitonin gene-related peptide” (peptídeo relacionados com o gene de calcitonina) Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica, Goiânia, Goiás CXCL Quimiocina com motivo C-X-C DC “Dendritic Cells” (células dendríticas) DE Dermatoses DNA Ácido desoxirribonucléico ELISA “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (Ensaio Imunoenzimático) ENH Eritema Nodoso Hansênico Foxp3 Fator de transcrição de células T reguladoras HLA “Human Leucocyte Antigens” (Antígenos leucocitários humanos) IB Índice baciloscópico IgG Imunoglobulina G IGRAs IL “Interferon-Gamma Release Assays” (ensaios de liberação de interferongama) Interleucina IFN- Interferon Gama IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública LL Hanseníase Lepromatosa LPS Lipopolissacarídeo ManLAM Lipoarabinomanana com manose MB Multibacilar xiv MCT Mastócitos de mucosa MCTC Mastócitos de mucosa MDT Multidrogaterapia MHB Hanseníase Borderline (Moléstia de Hansen Borderline) MHI Hanseníase Indeterminada (Moléstia de Hansen Indeterminada) MHL Hanseníase Lepromatosa (Moléstia de Hansen Lepromatosa) MHT Hanseníase Tuberculoide (Moléstia de Hansen Tuberculoide) M. leprae Mycobacterium leprae MT Mycobacterium tuberculosis NF-κB Fator Nuclear kappa B NRAMP1 Proteína 1 dos macrófagos associada à resistência natural NLRs “NOD-Like-receptors” NOD “Nucleotide-binding Oligomerization Domain” OMS Organização Mundial da Saúde PADL “protein advances diagnostic of Leprosy” (proteína para diagnóstico rápido da hanseníase) “Pathogen-Associated Molecular Patterns” (Padrões Moleculares Associados aos Patógenos) Paucibacilar PAMPs PB PBMC PCR “Peripheral Blood Mononucleated Cell” (Células Mononucleares de sangue periférico) “Polymerase Chain Reaction” (Reação em Cadeia da Polimerase) PGL-I Glicolipídeo Fenólico-I ou fenoglicolipídeo I POC “Point of care” (ponto de atendimento) PRRs RIA “Pattern Recognition Receptors” (receptores de reconhecimento de padrões) Resposta imune adaptativa RII Resposta imune inata RIC Resposta imune celular RNI Reativos Intermediários do Nitrogênio ROI Reativos Intermediários do Oxigênio RT1 Reação Tipo 1 RT2 Reação Tipo 2 xv SNP SP “Single-nucleotide Polymorphism” (Polimorfismo de Nucleotídeos Simples) Substância P TCR “T cell receptor” (receptor para antígeno do linfócito T) TGF-β “Transforming Growth Factor- β” (fator de crescimento transformador-β) TLR “Toll-Like Receptor” TT Hanseníase Tuberculoide TNF- Fator de necrose tumoral Treg Células T reguladoras WBA “whole-blood assays” (ensaio de sangue total) WHO “World Health Organization” xvi APRESENTAÇÃO Nasci em Quintinos, Minas Gerais, segundo filho de uma prole de oito, um dos oitenta netos de meus avós. Destes, os sete vivos de meus pais, e apenas mais uns quatro ou cinco primos, tem curso superior. Graças aos meus pais sou médico, e desde os quatro ou cinco anos falo apenas nesta profissão, como a minha, a que eu sempre desejei. Meus estudos superiores foram na UFG, graduação e especialização. Fui um bom aluno, operava muito bem, ótimo relacionamento médico-paciente, pois gostava e gosto da Medicina. Passei na seleção para residência de cirurgia, e ginecologia e obstetrícia, como segunda opção, a primeira sempre foi a Patologia. Nesta, minha natural predileção inexplicável por pele e pela Hanseníase. A hanseníase tem sido foco de meu interesse nos trinta e poucos anos de atividade docente e profissional. Na minha Residência Médica, especialização em Patologia, quando na área de Dermatopatologia fui orientado pelo Prof. Warteloo João Alves, que faleceu prematuramente em 1983, tive os primeiros contatos com a doença. Após sua morte fui convidado por dois colegas Patologistas, Dr. Antônio Martins de Macedo e Prof. William Machado Sobral, para ocupar o lugar deixando pelo mesmo, em seu laboratório particular. Assumi então a área de Dermatopatologia, ainda muito imaturo e pouco preparado para tanta responsabilidade. Na época estudava no livro de Dermatopatologia da Izamar Malidiu, no “A guide of Dermatopatology” do Pinkus e “Histopathology of the Skin” do Lever, que ainda conservo-os até hoje. Em 1984 fui então para São Paulo, fazer um estágio de Dermatopatologia, na Clínica de Dermatologia da Universidade de São Paulo, na época chefiada pelo Prof. Dr. Sebastião de Almeida Prado Sampaio, que atendeu a uma solicitação do Chefe de Departamento de Medicina Tropical e Dermatologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), o Prof. Paulo Cesar Borges. Permaneci lá por três meses e tive a oportunidade de conhecer grandes nomes da Dermatologia Brasileira, bem como a Dermatopatologista do Serviço, Profa. Dra. Mirian Nacagami Sotto, que tornou minha amiga. Em 1984, aos vinte e oito anos, fui aprovado no concurso de Professor de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Goiás, tendo tomado posse em 02 de janeiro de 1985. Em parte, o responsável pela minha nomeação, foi o xvii Prof. Maurício Sérgio Brasil Leite. Ficou sob minha responsabilidade a assistência e ensino na área de Dermatopatologia. Ingressei na carreira de magistério, FM-UFG, onde atuo na graduação, sempre responsável pelas aulas de patologia das doenças infecciosas, entre elas a hanseníase, a leishmaniose, a tuberculose, a paracoccidioidomicose, entre outras. Hoje tenho por volta de 3.000 ex-alunos, aos quais incubi a responsabilidade de diagnosticar a hanseníase, onde quer que fossem atuar como médicos. Desde então, institui também o ensino sistemático da Dermatopatologia para os Médicos Residentes de Dermatologia e Patologia da Faculdade de Medicina – Hospital das Clínicas da UFG, onde convivi com praticamente todos os Dermatologistas Goianos, entre eles destacam o Prof. Paulo Cesar Borges, o Prof. Anuar Auad, o Prof. Aiçar Chaul, o Prof. Hugo Junqueira, a Profa. Lia Miranda, entre outros. Neste convívio dermatopatológico, tive a oportunidade de participar da formação de quase uma centena de Médicos Residentes. Na Patologia são mais 50 Médicos Residentes que tentei ajudá-los no aprendizado da Dermatopatologia. Em 1987 foi realizado em Goiânia, no prédio do Fórum recém inaugurado, o Congresso Brasileiro de Dermatologia, oportunidade na qual conheci o grande nome da Dermatopatologia Mundial, Dr. Albert Bernard Ackerman (November 22, 1936 – December 5, 2008). Aprendi com ele, no seu livro ou bíblia da Dermatopatologia, “Histologic diagnosis of inflammatory skin diseases”, grande parte da arte do diagnóstico dermatopatológico por silhueta, por padrões. Em 1989, juntamente com o Prof. Roberto Rhuman Daher – IPTSP, fomos convidados pela Profa. Dra. Maria Leide Wand-Del-Rey de Oliveira para participar da edição do manual de Controle da Hanseníase – Uma proposta de integração ensinoserviço – 1989, publicado pelo Ministério da Saúde – Secretaria Nacional de Programas Especiais de Saúde – Divisão Nacional de Dermatologia Sanitária. Pude então aprofundar minhas atividades na área, oportunidade na qual fomos (FM-HC) agraciados com um microscópio Nikon, para emissão de laudos histopatológicos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás, onde tínhamos muitos doentes hansênicos. Depois, pelos idos de 1991/1992, fiz a análise dos mais de 100 biópsias de pele dos casos de hanseníase da tese de mestrado da Dra. Mirian Lane Castilho de Oliveira Rodrigues, sobre proteção da vacina BCG intradérmica contra a hanseníase, artigo referência sobre o assunto e citado em metanálise do tema. Em 1992/1993 fui convidado pela Profa. Celina Maria Turchi Martelli a integrar um grupo de pesquisa na área, sendo que na época a mesma estava interessada em xviii estudar hepatites e hanseníase, assuntos de sua tese de doutorado, publicada em 1995. Para acertamos os ponteiros, fizemos um estudo de campo, duplo cego, onde os exames de pele dos pacientes hansênicos foram vistos por mim e pelo Prof. Dr. Raul Negrão Fleury, grande conhecedor de hanseníase, na época trabalhando no Instituto Lauro de Souza Lima de Baurú – SP (faleceu recentemente, 07-02-2014). O Kappa na época foi em torno de 85%, sendo que considero esta grande concordância pelo fato de ter aprendido com Raul boa parte da histopatologia da doença. Para a tese da Profa. Celina, na oportunidade, examinei em torno de 700 biópsias de casos da doença. Em 1998 a Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli criou um Grupo Multicêntrico para o estudo da Hanseníase, incluindo participantes de Rondônia, a Dra. Kasuê Narahashi Emília Ueda, do Rio de Janeiro/Fiocruz, a Dra. Maria Kátia Gomes, do Amazonas/IDTVAN, a Dra. Paula Frassinetti Bessa Rebello, de Goiânia, Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani e eu. Do trabalho deste grupo foi possível desenvolver teses e alguns artigos publicados em periódicos internacionais. As teses, sempre sobre hanseníase, foram da Dra. Maria Kátia Gomes, Dra. Paula Rebello e a minha. Deste grupo fiquei responsável pela análise histopatológica das biópsias de peles de todos os casos, em torno de 350. A partir de então, passei a participar como Médico Patologista, emitindo os laudos histopatológicos das biópsias de peles, deste grupo de estudo de hanseníase, que se estabeleceu no IPTSP, colaborando indiretamente em várias dissertações e teses: Em 1999, a dissertação de mestrado da Dra. Maria Kátia Gomes, da Fiocruz Rio, orientanda da Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli: características epidemiológicas, clínicas e imunológicas de pacientes de hanseníase paucibacilar (PB) lesão única, tratados com Rifampicina, Ofloxacina e Minociclina em dose única (ROM), em três regiões do Brasil: estudo multicêntrico. UFRJ - RJ. Em 2001, a dissertação de mestrado da Dra. Paula Frassinetti Bessa Rebello, do Instituto de Dermatologia Tropical e Venereologia “Alfredo da Matta” – Fundação FUAM, orientanda da Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli: hanseníase paucibacilar lesão única. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. A dissertação de mestrado da Profa. Dra. Jacqueline Gomes Guerra, orientanda da Profa. Dra. Lia Cândida Miranda de Castro: “reações hansênicas: aspectos clínicos, epidemiológicos e imunológicos”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. Conclusão de minha dissertação de mestrado com o tema: “Caracterização histopatológica de biópsias de pele de pacientes com hanseníase paucibacilar lesão xix única”, orientado pela Profa. Celina Maria Turchi Martelli e co-orientado pelo Prof. Dr. Florêncio Figueiredo Cavalcanti Neto, oportunidade na qual estudei mais de 350 casos da doença. Este mestrado propiciou-me uma ida aos Estados Unidos da América, em Baton Rouge – Louisiana, onde um grupo de pesquisa, em colaboração com o grupo do IPTSP, estudava a doença. Lá conheci grandes nomes da área, como o Dr. David Scollard, Dr. Tomas Gillis, Dr. Krahenbuhl, a técnica do setor Nayoko, e acompanhando a Profa. Mariane, tive minha primeira experiência com a reação da polimerase em cadeia (PCR- polymerase chain reaction). Em 2002, a dissertação de mestrado da Dra. Ana Lúcia Osório Maroccolo Sousa, orientada da Dra. Celina Maria Turchi Martelli: Detecção de DNA de Mycobacterium leprae por reação em cadeia da polimerase em coorte de pacientes paucibacilares com lesão única tratados com esquema terapêutico de dose única. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. Em 2007, a tese de doutorado da Profa. Dra. Jacqueline Gomes Guerra: “Reações hansênicas: aspectos clínicos, epidemiológicos e imunológicos”. UFRJ, Rio de Janeiro – Rio de Janeiro. Em 2008, a dissertação de mestrado de Adriano Badotti Grassi, orientando da Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: Hanseníase, comparação entre testes rápidos com antígeno PGL-I em amostras de sangue total e soro. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. A dissertação de mestrado de Lucas Henrique Ferreira Sampaio, orientando da Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: Diagnóstico da Hanseníase Paucibacilar: Resposta Imune Celular a Proteínas Recombinantes do Mycobacterium leprae. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. Em 2009 a tese de doutorado da Profa. Ana Lúcia Osório Maroccolo Sousa, orientando da Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: “marcadores moleculares, imunológicos e genéticos das reações hansênicas”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. Em 2010 a dissertação de mestrado da Regiane Morillas Oliveira: “pesquisa da reatividade sorológica a proteínas recombinantes do Mycobacterium leprae”. IPTSPUFG, Goiânia – Go. Em 2011 atese de doutorado de Lucas Henrique Ferreira Sampaio, orientando Mariane Martins de Araújo Stefani: “avaliação da resposta imune celular a antígenos recombinantes do Mycobacterium leprae e potencial aplicação para o diagnóstico da hanseníase paucibacilar”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. xx Em 2013 a dissertação de mestrado da Emerith Mayra Hungria Pinto, orientanda da Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: “reatividade sorológica a proteínas recombinantes do Mycobacterium leprae em diferentes grupos populacionais de distintas regiões endêmicas do Brasil”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go. Junto com este grupo, produtos das teses e dissertações, como coordenadora e pesquisadora principal, a Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani, tivemos a oportunidade de participar como autor ou co-autor da publicação de diversos artigos sobre o tema Hanseníase, a saber: Stefani MM, Martelli CM, Morais-Neto OL, Martelli P, Costa MB, de Andrade AL 1998. Assessment of anti-PGL-I as a prognostic marker of leprosy reaction. Int J Lepr Other Mycobact Dis 66: 356-64. Martelli CM, Stefani MM, Gomes MK, Rebello PF, Peninni S, Narahashi K, Maroccolo AL, Costa MB, Silva SA, Sacchetim SC, Nery JA, Salles AM, Gillis TP, Krahenbuhl JL, Andrade AL 2000. Single lesion paucibacillary leprosy: baseline profile of the Brazilian Multicenter Cohort Study. Int J Lepr Other Mycobact Dis 68: 247-57. Guerra JG, Castro LCM, Stefani MM, Martelli CM, Penna GO 2002. Erythema Nodosum Leprosum: clinical and therapeutic up-date. An. bras Dermatol 77: 389-407. Guerra JG, Penna GO, Castro LC, Martelli CM, Stefani MM, Costa MB 2004. Erythema nodosum leprosum case series report: clinical profile, immunological basis and treatment implemented in health services. Rev Soc Bras Med Trop 37: 384-90. Sousa AL, Stefani MM, Pereira GA, Costa MB, Rebello PF, Gomes MK, Narahashi K, Gillis TP, Krahenbuhl JL, Martelli CM 2007. Mycobacterium leprae DNA associated with type 1 reactions in single lesion paucibacillary leprosy treated with single dose rifampin, ofloxacin, and minocycline. Am J Trop Med Hyg 77: 829-33. Stefani MM, Guerra JG, Sousa AL, Costa MB, Oliveira ML, Martelli CT, Scollard DM 2009. Potential plasma markers of Type 1 and Type 2 leprosy reactions: a preliminary report. BMC Infect Dis 9: 75. Sgambatti S, Andrade JG, Sousa ALS, Stefani MMA, Costa MB, Andrade ALSS. 12010. An unusual presentation of leprosy at diagnosis: erythema multiformelike type 2 reaction. Revista de Patologia Tropical Vol. 39 (3): 221-227. Jul.-set. Sampaio LH, Sousa AL, Barcelos MC, Reed SG, Stefani MM, Duthie MS 2011. Evaluation of various cytokines elicited during antigen-specific recall as xxi potential risk indicators for the differential development of leprosy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31: 1443-51. Sousa AL, Fava VM, Sampaio LH, Martelli CM, Costa MB, Mira MT, Stefani MM 2012. Genetic and immunological evidence implicates interleukin 6 as a susceptibility gene for leprosy type 2 reaction. J Infect Dis 205: 1417-24. Hungria EM, de Oliveira RM, de Souza AL, Costa MB, de Souza VN, Silva EA, Moreno FR, Nogueira ME, Costa MR, Silva SM, Bührer-Sékula S, Reed SG, Duthie MS, Stefani MM 2012. Seroreactivity to new Mycobacterium leprae protein antigens in different leprosy-endemic regions in Brazil. Memo Inst Oswaldo Cruz 107 Suppl 1: 104-11. Stefani MM, Grassi AB, Sampaio LH, Sousa ALOM, Costa MB, Scheelbeek P, Neupane K D, Hagge DA, Macdonald M, Cho S, Oskam L, Bührer-Sékula S 2012. Comparison of two rapid tests for anti-phenolic glycolipid-I serology in Brazil and Nepal. Mem Inst Oswaldo Cruz 107 Suppl 1: 124-131. Oliveira R, Hungria E, Freitas A, Sousa A, Costa M, Reed S, Duthie M, Stefani MM. Antigen associations for the diagnosis of paucibacillary leprosy. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 – Immunology - ILC2013-2122. Hungria E, Freitas A, Oliveira R, Cardoso L, Mizoguti D, Costa M, Sousa A, Reed S, Duthie M, Stefani MM. Serologic profile to lid-1 and PGL-I during leprosy reactions. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 ILC 2013 – Immunology - ILC2013-2137. Freitas A, Oliveira R, Hungria E, Cardoso L, Costa M, Sousa A, Reed S, Duthie M, Stefani MM. Differential diagnosis of multibacillary leprosy and other dermatoses: potential application of serology. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 ILC 2013 – Immunology ILC2013-2140. Freitas A, Oliveira R, Hungria E, Cardoso L, Costa M, Sousa A, Reed S, Duthie M, Stefani MM. The impact of multidrug therapy on cell mediated and humoral immune responses to mycobacterium leprae protein antigens. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 ILC 2013 – Immunology - ILC2013-2142. Com este retrospecto de minha vida acadêmica, pesquisando sobre Hanseníase, nada mais justo que minha tese de doutorado fosse sobre o tema. xxii RESUMO Titulo: Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T reguladoras em pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais. Resumo A hanseníase é uma complexa doença dermato-neurológica, crônica, de causa infecciosa que afeta a pele e os nervos periféricos, especialmente durante os episódios imunoinflamatórios agudos conhecidos com reações tipo 1/RT1 e tipo 2/RT2. Não existe modelo experimental para hanseníase e as lesões de pele têm sido extensivamente usadas para desvendar os multifacetados mecanismos imunopatológicos associados com a doença. Este estudo investigou a expressão in situ de duas distintas populações celulares que apresentam importante papel imunorregulatório: células Treg (Treg) e mastócitos (MC) em pele normal e diversas doenças cutâneas com ênfase nas reações hansênicas RT1 e RT2. Para o estudo de Tregs foram utilizadas 154 biópsias cutâneas de 114 participantes de três grupos: 1. Hanseníase (n=74), 56 RT1 (28-biópsias pareadas do mesmo paciente sem reação/durante reação, 28 biópsias únicas de RT1), 18 RT2 (12 biópsias pareadas sem reação/durante reação, 6 biópsias únicas de RT2); 2. Dermatoses: (n=29) doenças cutâneas não infecciosas e infecciosas. Controles Normais: fragmentos de peles obtidos de mamoplastias eletivas em mulheres saudáveis. Imunomarcação dupla CD25+Foxp3 +de células Treg foi realizada em plataforma automatizada. Quantificação das células Treg duplo positivas foram feitas sem conhecimento da condição clínica do paciente (valores expressos em mm2). Para o estudo dos MC 80 biópsias de 3 grupos foram investigadas: 40 pacientes com hanseníase recém diagnosticados não tratados (18 sem reação, 11 RT1, 11 RT2), 29 pacientes com outras dermatoses e 11 biópsias de pele normal. Quantificação de MC intactos e desgranulados corados por azul de toluidina/mm2; imunomarcação streptavidina-biotina-peroxidase foi empregada para detectar MC triptase/try+ e chimase/chy+ e a densidade ótica (mediana da densidade ótica) foi avaliada. Resultados: Estudo das Tregs: Nenhuma célula Treg CD25 +Foxp3 + foi identificada em nenhuma das 11 amostras de pele normal, enquanto um número variável de Tregs foi identificado nas diversas doenças cutâneas (p<0.0001); o número de células Treg duplo positivas foi maior nas doenças infecciosas comparado com as não-infecciosas (p=0.008). Medianas de Treg entre hanseníase e outras doenças infecciosas foram semelhantes (p=0.157). Quantificação de Tregs em lesões reacionais foram maiores do que as sem reação (p<0.02). Nas biópsias pareadas de lesões de xxiii RT1/sem reação ou RT2/sem reação, números maiores de Treg foram vistos durante a RT1 quando comparados com a não reacional do mesmo paciente (p< 0.001). Mediana de Treg em RT1 desenvolvidas durante MDT foi ligeiramente superior comparada a RT1 desenvolvida em pacientes sem de tratamento (p=0.047). Observou-se uma tendência de aumento no número das T regs do polo tuberculoide em direção ao lepromatoso, mais especificamente até a forma borderline-lepromatosa que apresentou a maior mediana da quantificação de Treg, entretanto esta diferença não foi estatisticamente significativa (p>0.8). Estudo dos Mastócitos: lesões cutâneas de origem infecciosa e não infecciosa mostraram números aumentados de mastócitos desgranulados do que intactos tanto na hanseníase como nas outras dermatoses quando comparados com pele normal. Os números de mastócitos (MC) desgranulados foram maiores do que intactos, independente da forma de hanseníase (do polo tuberculoide/TT ao lepromatoso/LL), independente da ocorrência de reações hansênicas (lesão reacional/sem reação) e independente do tipo de reação (RT1/RT2). Número e densidade de mastócito triptase positivo (MC try+) estão aumentados em relação aos quimase positivo (MC chy+) na hanseníase, em pacientes com e sem reação, particularmente na RT2, mas não nas outras dermatoses. Conclusões: aumento nas Treg detectados durante RT1 sugerem papel supressor dessas células em eventos associados à resposta imune celular exacerbada, responsáveis pela RT1. Expressão diferencial das subpopulações de MC try+ e chy+ foi observada na hanseníase em relação a outras doenças cutâneas e pele normal. Entretanto, nem a forma da hanseníase, nem a ocorrência de reação hansênica, estava associada a mudanças nas subpopulações de MC nas lesões sugerindo que o processo infeccioso pelo Mycobacterium leprae per se direciona a expressão de MC nas lesões cutâneas da hanseníase. Palavras chaves: células Treg, mastócitos, triptase, quimase, hanseníase, dermatose. xxiv ABSTRACT Title: In situ study of the heterogeneity of mast cells and regulatory T cells in patients with leprosy, with and without reactional episodes. Abstract Leprosy is a complex, chronic, infectious dermato-neurological disease that affects the skin and peripheral nerves especially during acute immune-inflammatory episodes known as type 1/T1R and type 2/T2R reactions. There is no experimental model for leprosy and leprosy skin lesions have been extensively used to unravel its multifaceted immunopathological mechanisms.This study investigated in situ expression of two distinct cell populations with important immunoregulatory roles: T regulatory (Treg) cells and mast cells (MC) in diverse skin diseases with emphasis on leprosy T1R and T2R. For the Treg cell study, 154 skin biopsies from 114 participants belonging to 3 groups were investigated: 1. Leprosy (n=74), 56 T1R (28-paired biopsies reactionfree/reactional from the same patient, 28 single reactional biopsy), 18 T2R (12 pairedreaction-free/reactional lesions, 6 single reactional biopsy); 2. Dermatoses: (n=29) noninfectious and cutaneous infectious diseases; 3. Normal controls: skin fragment of mammoplasty from healthy females that had cosmetic surgery. Double immunohistochemical detection of Treg cells was performed with automated platform for CD25 and Foxp3 staining. Quantifications of double immunostained Treg cells was performed (values expressed by mm2) blinded to the participants’ clinical status. For the mast cell study 80 skin biopsies from 3 groups were investigated: 40 newly diagnosed untreated leprosy patients (18 reaction-free, 11 T1R, 11 T2R), 29 patients with other dermatoses (the same as for T reg study) and 11 normal skins. Toluidine blue stained intact and degranulated MC counts/mm2; streptavidin-biotin-peroxidase immunostaining was used to detect tryptase/try+ and chymase/chy+ MCs and their density (median optical density) was evaluated. Results: Treg study: Not one CD25 +Foxp3 +Treg cell was seen in any of the 11 normal skin sections while variable numbers were detected in skin diseases (p<0.0001); the number of double stained cells was higher in infectious compared to non-infectious diseases (p=0.008). Treg cell numbers were comparable between leprosy and other infectious dermatoses (p=0.157) Treg cell counts in reactional lesions were higher than in reaction-free leprosy lesions (p<0.002). Paired biopsies of T1R or T2R reactional/reaction-free lesions showed xxv increased numbers of Treg during T1R compared to reaction-free lesions from the same patient (p< 0.001). Treg cell median in T1R developed during MDT was slightly higher compared to T1R developed at diagnosis in naïve patients (p=0.047). There was a trend in increasing Treg cell numbers from the tuberculoid to borderline-lepromatous form, which showed the highest median value of T regs, however this difference was not significant (p>0.8). Mast cell study: Infectious and non-infectious skin lesions showed higher numbers of degranulated than intact MC both for leprosy and other dermatoses, compared to normal skin. The numbers of degranulated MC were higher than intact MC regardless of the leprosy form (from tuberculoid/TT to lepromatous/LL), regardless of the occurrence of leprosy reactions (reactional and reaction-free) and regardless of the type of reaction (T1R/T2R). Try+ MC numbers and density were higher than chy+ MC in leprosy, in reaction-free and reactional lesions, particularly in T2R, but not in other dermatoses. Conclusions: Higher Treg numbers seen in T1R suggest Treg role in suppressing the exacerbated cell-mediated phenomenon that causes T1R. Differential expression/ of try+ and chy+ MC subsets was seen in leprosy compared to other skin diseases and to normal skin. However, neither leprosy form nor leprosy reaction was associated with MC changes in lesions suggesting that the Mycobacterium leprae infectious process per se dictates MC expression in leprosy skin lesions. Key words: treg, mast cell, tryptase, chymase, leprosy, skin diseases. xxvi ORGANIZAÇÃO DA TESE Esta tese de doutorado está apresentada de conformidade com a NORMA – CPGMTSP No. 04/2009, sendo composta por uma introdução, contendo uma abordagem geral acerca da hanseníase, desde a epidemiologia, aspectos clínicos, meios de diagnóstico, moleculares, imunológicos, genéticos, diagnósticos diferenciais, reações e tratamento. Conforme a norma supracitada, a colocação dos métodos é opcional, e não foram colocados por ser redundante, e já estarem no contexto dos artigos. Além da introdução, esta tese inclui dois artigos científicos, ambos em fase de submissão para publicação. O artigo 1 se refere às células T regulatórias (Treg): “In situ expression of CD25+ Foxp3+ Regulatory T Cells in human skin diseases: leprosy and leprosy reactions”, realizado em colaboração com o Hospital A. C. Carmargo, Departamento de Patologia, chefiado pelo Prof. Dr. Fernando Augusto Soares. O artigo 2 se refere aos Mastócitos: “Mast cell heterogenity in human dermatoses: in situ tryptase and chymase positive cells with emphasis on leprosy and leprosy reactions”, realizado em colaboração com o IBILCE, Departamento de Biologia, Laboratório de Imunomorfologia, coordenado pela Profa. Sônia Maria Oliani, UNESP – São José do Rio Preto – São Paulo. xxvii 1. INTRODUÇÃO 1.1- Conceito A hanseníase é uma doença infecciosa, granulomatosa, de evolução crônica, causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae), descrito por Gerhard Amauer Hansen em 1873, dermato-neurológica, complexa, comprometendo principalmente pele e nervos periféricos, podendo levar a incapacidades físicas. Entretanto pode acometer qualquer órgão do corpo humano, como: testículos, fígado, ossos, etc. Apesar da evolução crônica pode apresentar surtos de agudizações, denominados episódios reacionais ou reações tipo 1 (RT1) e tipo 2 (RT2) (Modlin 1987, Talhari et al. 1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Britton & Lockwood 2004, revisado por Scollard et al. 2006, Walker& Lockwood 2006). É uma das primeiras constatações de uma doença microbiana do homem (WHO 1988a). A Organização Mundial da Saúde (OMS/WHO) inclui a hanseníase entre as 17 doenças tropicais negligenciadas (WHO 2012a). 1.2- Agente etiológico, infecção e doença. O M. leprae é uma bactéria intracelular obrigatória, não cultivável em meios de culturas axênicos, que tem tropismo para macrófagos da pele e células de Schwann dos nervos periféricos (Ridley 1955, Jopling 1978, WHO 1988a, Scollard et al. 2006). A taxa de replicação do M. leprae é extremamente lenta, quando comparada a de outras bactérias, apresentando ciclo replicativo de, em média, 12,5 dias (Ridley 1955, Jopling 1978, Jacobson & Krahenbuhl 1999). O M. leprae é um bastonete reto, corado em vermelho pela fucsina e que não é descorado na passagem em álcool e ácidos orgânicos, ou seja, é um bacilo ácido álcool resistente (BAAR). Nos esfregaços de raspado intradérmico (linfa) e nos cortes histopatológicos os bacilos podem ser vistos isoladamente ou em agrupamentos de tamanhos variados (Ridley 1955, Jopling 1983), referidos como globias. Em 2008, foi descrita uma nova bactéria imputada na etiologia da hanseníase, o Mycobacterium lepromatosis sp nov. Os autores descreveram esta nova espécie baseados em diferenças genéticas significativas com oM leprae, incluindo uma divergência de 2,1% do gene 16S RNA ribossomal (rRNA), um marcador altamente conservado da evolução. Análise filogenética dos genes 16S rRNA, rpoB e hsp65 indicou que os organismos são relacionados e evoluíram de um ancestral comum que 1 tinha ramificado de outras micobactérias. Estes resultados e as características únicas clinicopatológicas da Hanseníase Lepromatosa Difusa (Hanseníase bonita, Lepra de Lúcio e Latapi) levaram-os a propor esta nova espécie, que pode contabilizar algumas das variabilidades clínicas e geográficas da hanseníase. Esta descoberta pode ter implicações para a pesquisa e o diagnóstico da hanseníase (Han et al. 2008). O M. leprae e o Mycobacterium tuberculosis (MT) surgiram de um ancestral comum há 36 milhões de anos atrás (Cole et al. 2001, Djelouadji et al. 2011). O Mycobacterium tuberculosis foi descrito em 1883 por Robert Koch e foi a primeira micobactéria a ter seu genoma seqüenciado (Cole et al. 1998), enquanto o M. leprae foi sequenciado a seguir (Cole et al. 2001). Comparando o M. leprae com o MT, o sequenciamento completo do genoma do M. leprae revelou uma extensa redução evolutiva em comparação ao genoma do M. tuberculosis, o que significa redução do número de genes, grande número de pseudogenes e redução do número de proteínas produzidas pelo primeiro. Esse processo evolutivo redutivo pode ter tornado o M. leprae um microrganismo extremamente fastidioso, com longo período de duplicação e impossibilitando seu cultivo in vitro (Cole et al. 2001, revisado por Vissa & Brennan 2001). Apesar do M. leprae ter sido o primeiro patógeno humano a ser descrito no final do século XIX, os mecanismos de transmissão ainda não estão totalmente estabelecidos. Acredita-se que o trato respiratório seja a principal porta de entrada e fonte de transmissão do M. leprae, já que um grande número de bacilos é eliminado pelas vias aerodigestivas de pacientes com formas bacilíferas não tratadas (Ridley 1955, Jopling 1978; Jacobson & Krahenbuhl 1999, revisado por Walker & Lockwood 2007). Outras possíveis fontes de transmissão do bacilo são hansenomas ulcerados, urina, fezes, suor, leite materno, secreções vaginais e esperma (Jopling 1978, Job et al. 1989, Fine et al. 1997), e, mais recentemente, a possibilidade de ser uma doença zoonótica, tendo o tatú como uma possível fonte de infecção para o homem (Truman et al. 2011). Acredita-se que o período de incubação da doença pode variar de 2 até 10 anos e que a maioria das pessoas expostas não é susceptível à infecção, ou seja, há uma resistência natural na ordem de 95% dos indivíduos (Jopling 1978). Populações de diferentes etnias, morando na mesma área endêmica, exibem taxas de prevalência diferentes (WHO 1988a, Fine et al. 1997). Entretanto, a hiperpopulação doméstica e fatores genéticos do hospedeiro parecem predispor a infecção e ao desenvolvimento da 2 doença (Jopling 1978, WHO 1988a, Schurr et al. 1991, Jacobson & Krahenbuhl 1999, Fine et al. 1997, Mira et al. 2004, Goulart et al. 2008, Pereira et al. 2009, Bazin-Furini et al. 2011). A maioria das pessoas que vivem em áreas endêmicas para a hanseníase já esteve exposta ao M. leprae, mas, apenas cerca de 0,1-1,0% desenvolve a doença (Ridley 1955, Fine et al. 1997, Moraes et al. 2006, revisado por Pereira et al 2009). Contatos domiciliares de pacientes com formas bacilíferas de hanseníase apresentam risco aumentado para o adoecimento. Estima-se que contatos intradomiciliares de pacientes com baciloscopia positiva apresentem 4 a 10 vezes mais risco de adoecer que outros indivíduos de uma população endêmica (Ridley 1955, WHO 1988a, Fine et al. 1997, Jacobson & Krahenbuhl 1999, Goulart et al. 2008). Evidências apontam para a ocorrência de transmissão da doença entre domiciliares, inclusive na fase présintomática (Fine et al. 1997). Após um período de incubação variável, os indivíduos susceptíveis que foram infectados podem desenvolver a doença. Esta é bastante pleomórfica, com diferentes formas clínicas, que serão categorizadas a seguir, sendo as lesões predominantemente de pele e de nervos periféricos, mas a doença pode acometer também órgãos internos, tais como: fígado, testículos, olhos, etc (Jopling 1978, Neves & Talhari 1997, Scollard et al. 2006). A evolução é habitualmente crônica, mas pode manifestar-se com episódios agudos denominados de reações ou formas reacionais. 1.3- Aspectos históricos A Hanseníase é tida como uma das doenças mais antigas da humanidade, com muitas citações, mas sem registros precisos e commuitos pontos obscuros, sendo difícil uma abordagem precisa do tema. Segundo relatos, era também confundida com várias outras doenças de pele, muitas das quais descritas sob a mesma denominação de “lepra ou morféia” (revisado por Andrade 1996, revisado por Eidt 2004). A relação do cristianismo com os hansenianos está ligada à vida de Jesus. No Novo Testamento (Mateus 8,1-14; Marcos 1,40-45; Lucas 5,12-16; Lucas 17,11-19) encontram-se relatos sobre a dedicação de Jesus aos hansenianos por meio dos milagres da cura destes doentes. Com as palavras: “Os cegos veem e os coxos andam, os leprosos ficam limpos e os surdos ouvem, os mortos ressuscitam e os pobres são evangelizados” (Mateus 11,56), Cristo quer expressar, além do objetivo da sua missão, a sua piedade e compaixão principalmente para com os doentes e marginalizados, e ambas são características dos hansenianos (Cunha 1997). 3 Na Europa, a Hanseníase alcançou seu ponto máximo de disseminação e contaminação entre os séculos XI e XV, com o pico no século XIII e XIV. Nas Américas e Brasil a doença foi trazida pelos europeus e africanos, já que a doença não existia entre os indígenas. Em 1897, foi realizada a “Conferência sobre a Lepra”, que aconteceu em Berlim. Nesta foram apresentadas as novas descobertas dos cientistas e médicos, como Danielsen, que, em 1847, identificou as formas tuberculosa e anestésica da Hanseníase; Virchow, em 1860 identificou a forma “L” da doença e sua contagiosidade e, ainda Hansen, que em 1873 isolou o bacilo e descobriu a forma de transmissão da doença (revisado por Cunha 1997, revisado por Eidt 2004, Lyon & Lyon 2013). Estudo sobre a diversidade genética e a filogeografia do M. leprae sugere que este bacilo começou a infectar os seres humanos há cerca de 5.000 anos na atual Etiópia (Monot et al. 2009). Apenas quatro padrões de polimorfismo de nucleotídeos simples (“Single-nucleotide Polymorphism”, SNP) foram encontrados em todo o globo. O tipo 1 está presente na maior parte da Ásia Central e leste da África. O tipo 2 foi encontrado na Etiópia, Malawi, Nepal e norte da Índia. O tipo 3 foi encontrado na Europa, norte da África e Américas e o tipo 4 apenas no oeste da África. O trabalho de Monot lançou a hipótese de que os soldados de Alexandre, o Grande (século IV a.C.) foram os prováveis responsáveis pela disseminação do M. leprae pela Ásia e Europa, e que a colonização e tráfico de escravos foram os responsáveis pela vinda do M. leprae para as Américas. O fato da bactéria ser extremamente lenta em sua duplicação, talvez explique a baixíssima quantidade de cepas diferentes em todo o mundo (Monot et al. 2005). Ácido desoxirribonucléico (DNA) do M. leprae foi detectado e amplificado pela reação em cadeia da polymerase (PCR - polymerase chain reaction) utilizando-se primers específicos, em restos de ossos do crânio de um esqueleto encontrado em um cemitério da Escócia, em caso de hanseníase virchowiana, do século 13–14, Orkney - Escócia (Taylor et al. 2000). A Hanseníase era endêmica na Europa até a idade média e sequências de DNA do M. leprae foram amplificadas de esqueletos de cinco casos de hanseníase medieval do Reino Unido, Suécia e Dinamarca. Em um caso, o DNA foi tão bem preservado que a montagem do genoma bacteriano antigo poderia ser alcançada por meio de sequenciamento. Estas sequências antigas do M. leprae, comparadas com as de 11 variedades modernas, representam diversos genótipos e origens geográficas. As comparações revelaram notável conservação genômica durante os últimos 1.000 anos, 4 uma origem européia para hanseníase nas Américas, e a presença do genótipo M. leprae, na Europa medieval, agora comumente associado com o Médio Oriente. A preservação excepcional de biomarcadores de M. leprae, ácidos micólicos tanto de DNA, em esqueletos antigos tem implicações importantes para a palaeomicrobiologia e evolução do patógeno humano (Schuenemann et al. 2013). Alguns dados da história da doença no Brasil merecem ser lembrados. Nos três primeiros séculos da nossa história, poucos médicos aqui se estabeleceram, muitos vinham de Portugal ficavam temporadas depois retornavam. Em 1740, ano em que aconteceu no Rio de Janeiro a 1ª Conferência Médica sobre a Hanseníase no Brasil, cujo objetivo era indicar e uniformizar otratamento a ser dispensado aos hansenianos, o número de doentes nesta capital era estimado em 400 e a doença existia oficialmente desde o ano de 1600. Em 1741, é fundado o primeiro lazareto, hospital especializado em tratar os hansenianos, que proliferaram com o crescente número de casosexistentes. Em Goiás foi construído o primeiro “preventório”, local destinado a abrigar os filhos de hansenianos (revisado por Cunha 1997, Lyon & Lyon 2013). O Brasil teve e tem pesquisadores atuando nesta área há muitos anos, muitos destes com destaque no cenário mundial. A classificação internacional vigente de “formas” ou “grupos” da hanseníase é a redação final da antiga “classificação sulamericana”, nascida no Brasil (Michalany & Michalany 1988). A doença passou a ser de notificação obrigatória em 1904, quando foi também instituída a criação dos leprosários. Em 1920, foi instituído o isolamento compulsório para os doentes, sendo este abolido em 1962 (Eidt 2004, revisado em Lyon & Lyon 2013). O nome Hanseníase em substituição a “lepra” foi sugerido, em 1967, por Abrahão Rotberg, dermatologista brasileiro (Michalany & Michalany 1988). Em 1976, um decreto substitui o termo “lepra” por hanseníase, sendo que em 1995, outro decreto de lei federal proibiu a utilização do termo “lepra”. Em 1941, começa a terapia da doença com a sulfona, sendo que a multidrogaterapia (MDT ou poliquimioterapia/PQT, conforme portaria do Brasil/Ministério Saúde 2010a) foi iniciada na década de 1980, por recomendação da OMS (Eidt 2004, revisado em Lyon &Lyon 2013). No cenário mundial a OMS, a partir de 1982, patrocinou os principais eventos, fases ou períodos, assim distribuídos: 1- de 1982 a 1985 – introdução de MDT em uma base global. 2- de 1986 a 1990 – expansão de MDT em áreas "menos difícil". 5 3- de 1991 a 1999 – estratégia de eliminação da hanseníase como problema de saúde pública, definida como uma prevalência de menos de um caso para cada 10.000 habitantes, meta que deveria ser atingida no ano 2000 (WHO 1991). 4- a partir de 2000 – um quarto período, planejado para os últimos 6 anos, designados para a "estratégia de eliminação intensiva" ou o "empurrão final" (WHO 2004). Hoje, na era pós-MDT e genômica a doença ainda permanece intrigante e com muitas perguntas ainda para serem respondidas, e apesar de todas as mediadas terapêuticas, educacionais e preventivas a incidência, não tem diminuído (Rodrigues & Lockwod 2011). 1.4- Dados epidemiológicos – retrospectiva e atualidade É difícil fazer uma estimativa do número totalde casos de hanseníase no mundo, pois os diagnósticos e suas definições de casos nem sempre são claros ou consistentes. Em 1966 o relatório da OMS aponta para os números da tabela 1 mostrada abaixo (Bechelli & Martinez Dominguez 1966). Tabela 1. Casos registrados e estimados de hanseníase no mundo em 1966. Fonte: Bechelli & Martinez Dominguez 1966. Bull World Health Organ (WHO). A WHO estimou para 1966, 1976 e 1985, 10,8, 10,6 e 12,0 milhões de casos de hanseníase, respectivamente. Nas décadas de 60, 70 e 80, o número de casos registrados sofreu aumento constante, conforme mostra a tabela 2. A introdução da 6 multidrogaterapia reduziu em mais de 80% a prevalência global de hanseníase. (WHO 1988a, WHO 1988b). Ano Casos registrados Aumento no período Prevalência/10.000 habitantes 1966 2.831.775 1976 3.599.949 1985 5.368.202 1987 5.609.283 8,40 89,6% 49,1% 8,80 12,0 Tabela 2. Casos de Hanseníase no período de 1966 a 1987. Fonte: WHO 1988a. “A guide to leprosy control”. Em 1985, o número estimado de casos de hanseníase no mundo era de 12 milhões de pessoas, correspondendo a uma prevalência estimada de 19 casos para 10.000 habitantes. A implementação da MDT começou gradualmente, de forma piloto, durante o período 1982–1985, com cobertura estimada inferior a 1%. Posteriormente foi implementada em muitos países endêmicos e a cobertura geográfica começou a aumentar significativamente, atingindo quase 50% no final de 1992 e 100% dos casos registrados em 1997, tabela 3 (WHO 2004). 7 Tabela 3. Casos registrados de hanseníase, casos novos e cobertura pela MDT. Fonte: WHO 2004. Multidrug therapy against leprosy. Development and implementation over the past 25 years. O boletim de Registro Epidemiológico Semanal da WHO (OMS) informou, que a prevalência global de hanseníase registrada no ano de 2012, em 115 países, foi de 189.018 casos, com 232.857 novos casos detectados. Esses dados mostram que a meta de prevalência global de menos de 1 caso de hanseníase para cada 10.000 habitantes foi atingida, ou seja, a prevalência global foi de 0,33 casos por 10.000 habitantes.Apesar da drástica redução no número de casos registrados nas últimas duas décadas, a incidência da doença tem caído lentamente. O número de casos novos detectados mostra uma incidência de 4,00 casos por 100.000 habitantes, ou seja, permanece alta (WHO 2013), tabela 4. O declínio apresentado na prevalência de hanseníase, com a implementação da MDT, não foi acompanhado de um declínio da incidência, detecção ou casos novos, indicando que a prevalência é um parâmetro inadequado para se avaliar o controle da infecção (Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009, SINAN/SVS/MS 2012). 8 Tabela 4. Casos registrados, prevalência e casos novos de hanseníase em 2012. Fonte: WHO 2013. Global leprosy: update on the 2012 situation. Wkly Epidemiol Rec 35. No Brasil, a doença esteve presente desde a época colonial, trazida pelos europeus e africanos, e foi aumentando paulatinamente até tornar-se endêmica. Além disso, o levantamento de casos feito no Hospital dos Lázaros do Rio de Janeiro, no período de 12 de setembro de 1798 a 27 de janeiro de 1872, demonstrou que um grande número de pacientes hansenianos era de origemafricana: num total de 2.170 assentados, sendo que 751 eram escravos negros africanos procedentes de Moçambique, Congo, Cabinda, Manguella, Angola e outros. Entre 1923 e 1936, foi realizado o primeiro senso de doentes de hanseníase no Brasil, por Sousa-Araújo, totalizando 48.840 doentes distribuídos por todos os estados da federação (revisado por Cunha 1997). Em 1966, o relatório da OMS aponta para o Brasil 104.398 casos registrados (Bechelli & Martinez Dominguez 1966). No período de 1980-1983, na era pré-MDT, o Brasil mostrava uma tendência de crescimento da endemia, com 70% dos casos registrados nos 12 países da América Central e do Sul de maior prevalência da hanseníase, bem como, tinha 80% dos casos novos registrados nestes países (Lombardi 1989). Tabela 5. 9 Tabela 5. Casos de hanseníase no Brasil antes da implementação da MDT. Fonte: Lombardi 1989. Evaluation of leprosy epidemiology in 12 countries of the Americas. Bull Pan Am Health Organ. Após a assinatura do Compromisso para a Eliminação da Hanseníase em 1991, no Brasil houve uma redução de 60% na prevalência, em decorrência das altas por cura, no entanto, houve um aumento na detecção de casos novos (Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009). O Brasil é o segundo país em todo o mundo em número absoluto de casos, ficando atrás apenas da Índia, e há estados com baixa, média, alta, muita alta endemicidade e hiperendêmico. É considerado hiperendêmico quando a detecção é ≥ 40 casos/100.000 habitantes, de muito alta endemicidade entre 20 e 39,99 casos/100.000 habitantes, alta endemicidade entre 10 e 19,99 casos/100.000 habitantes, média de 2 a 9,99 casos/100.000 habitantes e baixa quando há menos de 2 casos/100.000 habitantes (SINAN/SVS/MS 2012). Tabela 6. Tabela 6. Hanseníase – coeficientes de prevalência e detecção por região em menores e maiores de 15 anos no Brasil 2011. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012. 10 O Brasil está entre os 16 países, que entre 2001 e 2009 tiveram um número de casos novos maior do que 1.000, ocupando hoje o segundo lugar no mundo em número de casos novos, sendo sobrepujado apenas pela Índia (WHO 2012b). Em 2012, o Brasil registrou um total de 33.303 casos novos, apresentando uma taxa de detecção de 17,17 casos/100.000 habitantes, portanto, um país com alta endemicidade, e a prevalência de 1,51 casos/10.000 habitantes (SINAN/SVS/MS 2012, WHO 2013). As figuras 1 a 3 e tabelas 7 e 8 mostram uma série histórica, culminando com a atual (Tabela 8). Figura 1. Hanseníase no Brasil - coeficiente de prevalência no período de 1990 a 2010. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012. Figura 2. Hanseníase coeficiente de prevalência e detecção no período de 1990 a 2010. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012. 11 Figura 3. Hanseníase – coeficiente de detecção nas diferentes regiões do Brasil, no período de 1990 a 2010. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012. Tabela 7. Hanseníase – indicadores epidemiológicos e operacionais – Brasil 2001 a 2012. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012. 12 Tabela 8. Hanseníase – tendência de detecção em países com mais de 1000 casos em 2012. Fonte: WHO 2013. No Estado de Goiás em 2012 foram registrados 2.205 casos novos, com coeficiente de detecção muito alto, de 35,82 casos/100.000 habitantes, enquanto aprevalência foi de 3,00 casos/10.000 habitantes, considerada média. O estado foia sétima unidade federativa com maior incidência e prevalência em 2010/2011 (SINAN/SVS/MS 2012). Figuras 4 e 5. Figura 4. Hanseníase – coeficiente de detecção geral de casos novosno Brasil e estados em 2010. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012. 13 Figura 5. Hanseníase – coeficientes de prevalência segundo UF - Brasil, em 2011. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012. Em Goiânia, no ano de 2013, foram registrados 659 casos de hanseníase (SINAN/SVS/MS 2013). 1.5- Manifestações clínicas da hanseníase – definição de caso Hanseníase deve ser suspeitada em pessoas com qualquer um dos seguintes sintomas ou sinais: manchas hipocrômicas ou avermelhadas na pele; perda ou diminuição da sensibilidade nas manchas da pele; dormência ou formigamento das mãos ou pés; fraqueza das mãos, pés ou pálpebras; nervos dolorosos ou sensíveis; inchaço ou nódulos na face ou orelhas; feridas indolores ou queimaduras nas mãos ou pés (WHO 2012c). Definição de caso de hanseníase: é uma pessoa com sinais cardinais (clínicos) da doença e que ainda não tenha sido submetida ao tratamento específico ou que requer tratamento quimioterápico. Os sinais cardinais são: diminuição da sensibilidade em área ou lesão cutânea; espessamento neural periférico e/ou presença de BAAR em pele, baciloscopia positiva (WHO 1988a, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Britton & Lockwood 2004, Brasil/Ministério da Saúde 2010). Nesta tese foi considerado caso de hanseníase o paciente com sinais clínicos da doença, baciloscopia positiva e/ou encontro no exame histopatológico de características da doença, conforme os critérios de Ridley e Jopling (1966). A hanseníase é uma doença espectral, cujas formas clínicas são determinadas pela interação entre o agente e a resposta imunológica do paciente (Ridley & Jopling 14 1966, Modlin & Rea 1987, Jacobson & Krahenbuhl 1999, revisado por Walker & Lockwood 2007). Figura 6. Figura 6: espectro clínico e imunopatológico da hanseníase e reações. Fonte: Leprosy. Walker SL, Lockwood DN 2007. 1.5.1- Manifestações cutâneas na hanseníase A avaliação diagnóstica da hanseníase se baseia no exame dermato-neurológico, mediante identificação de lesões de pele com alteração da sensibilidade térmica, dolorosa e/ou tátil, geralmente ocorrendo nesta ordem. A sensibilidade nas lesões pode estar diminuída (hipoestesia), ausente (anestesia) ou, em menor frequência, aumentada (hiperestesia) (Ridley 1955, Neves &Talhari 1997, Britton & Lockwood 2004, revisado por Scollard 2006, Sampaio & Rivitti 2011, Rodrigues Júnior & Gresta 2013). As lesões cutâneas da hanseníase podem se manifestar como manchas, placas, infiltração difusa, nódulos, tubérculos, alopecia, madarose, triquíase e lesões de mucosa (Ridley & Jopling 1966, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Lyon 2013). Os distúrbios sensitivos nas lesões são devido às neurites, que podem ser causadas tanto pela ação do bacilo nos nervos como pela reação do sistema imune ao bacilo (Ridley 1955, Neves &Talhari 1997, Walker & Lockwood 2006, Sarubi & Shibuya 2013). A manifestação inicial da hanseníase é geralmente a forma indeterminada, com resposta imune do hospedeiro e manifestações clínicas indiferenciadas, não permitindo 15 a classificação clínica nem o prognóstico da doença. A hanseníase indeterminada (MHI) geralmente se manifesta como uma lesão hipocrômica, com alteração de sensibilidade (hipoestesia ou hiperestesia), podendo evoluir para cura espontânea ou para outras formas clínicas da doença (Ridley & Jopling 1966, Guinto et al. 1986, Neves &Talhari 1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013), não sendo incluída no espectro de Ridley e Jopling por seu caráter incipiente e imunologicamente indeterminado (Ridley & Jopling 1966). A Hanseníase Tuberculoide (MHT ou TT) apresenta lesões cutâneas eritematohipocrômicas, eritematosas, eritemato-escamosas, com bordos discretamente elevados ou com microtubérculos, com alteração de sensibilidade, hipoestesia ou mesmo anestesia. O centro da lesão pode estar aparentemente poupado, indene. As lesões podem apresentar alopecia e/ou anidrose. As placas variam de forma, tamanho e número, sendo que a forma clássica habitualmente não tem tendência à disseminação e pode curar espontaneamente (Ridley & Jopling 1966, Guinto et al. 1986, Neves & Talhari 1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013). A Hanseníase Borderline (MHB ou BB, BT ou BL) exibe lesões eritematosas, eritemato-violáceas, ferruginosas, infiltradas, edematosas, brilhantes, escamosas, contornos internos bem definidos e externos mal definidos (lesões pré-foveolares ou foveolares), centro deprimido, aparentemente poupado, hipocrômico ou com cor de pele normal. Seu caráter instável faz-se assemelhar com as lesões bem delimitadas da TT ou com as lesões disseminadas da Hanseníase Lepromatosa (LL) (Ridley & Jopling 1966, Guinto et al. 1986, Neves & Talhari 1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013). A Hanseníase Lepromatosa (MHL ou LL) mostra pele com infiltração difusa, numerosas lesões eritematosas, infiltradas, brilhantes, coalescentes, mal definidas e de distribuição simétrica. Há infiltração difusa da face, regiões malares, supraciliares e pavilhões auriculares, com formação de tubérculos e nódulos, perda de supercílios (madarose), o que confere ao paciente aspecto peculiar, denominado facies leonina. Por vezes mostra nódulos e tubérculos, poucos ou múltiplos, são semelhantes ao quelóide, caracterizando a forma históide (Neves & Talhari 1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Brasil/Ministério da Saúde/SVS 16 2009, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013). São descritas duas variantes da forma LL, a saber: a forma histoide, já referida acima, e a forma de Lúcio e Alvarado (hanseníase difusa ou “lepra bonita”), que pode cursar com o fenômeno de Lúcio, uma forma reacional, com vasculite trombótica, necrose tecidual e ulcerações (Ridley & Jopling 1966, Ridley & Jopling 1966, Guinto et al. 1986, Neves & Talhari 1997, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon-Moura & Pedrosa 2013). A tabela 9 mostra um resumo das características das lesões cutâneas das formas clínicas da hanseníase e a classificação operacional adotada na rede pública de saúde (Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a), sendo o paciente diagnosticado e classificado pelo número de lesões, em paucibacilar (PB) e multibacilar (MB), com até cinco lesões ou mais de cinco lesões, respectivamente. Tabela 9. Hanseníase – formas clínicas, caracterização e classificação operacional. Fonte: Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009. 1.5.2- Manifestações neurais na hanseníase Os nervos são frequentemente acometidos na hanseníase, com neurites (neuropatias periféricas), levando a perdas de sensibilidades (térmica, dolorosa e tátil) e distúrbios motores, como paralisias, atrofias musculares, reabsorções ósseas e outras, provocando sequelas e incapacidades físicas de graus variados (Facer et al. 2000, van Brakel et al. 2008, Jadhav et al. 2011). Estas ocorrem em todas as formas da hanseníase 17 do espectro de Ridley e Jopling e ao diagnóstico da doença já acometem 25% dos hansênicos. Algumas vezes o hansênico apresenta clinicamente apenas sinais de comprometimento neural, sendo estas formas denominadas de neuríticas puras, variando na literatura entre 1 a 16% dos pacientes, e que por vezes são assintomáticas, as neurites silenciosas, sendo o diagnóstico estabelecido pela biópsia neural (Scollard 2008, Sarubi & Shibuya 2013). Os nervos mais frequentemente acometidos são: o cubital (ulnar), o mediano, o radial, o ciático poplíteo, o tibial posterior, o ramo zigomático do facial, o trigêmeo e o auricular. Entre as incapacidades físicas mais frequentes estão a garra cubital (por lesão do nervo cubital), a paralisia cúbito-mediana (por lesão do cubital e mediano, com amiotrofia de músculos interósseos), a mão caída (por lesão do nervo radial), úlceras em mãos e pés (mal perfurante plantar), a mão e o pé reacional, diminuição da sensibilidade corneana (por lesão do ramo do trigêmeo) etc (Neves & Talhari 1997, Sarubi & Shibuya 2013). A neurite pode levar a perda de força muscular, com posterior paralisia, o que pode originar incapacidades e deformidades, como articulações anquilosadas (sem movimento) e em garras, ectrópio e lagoftalmo (eversão e desabamento da pálpebra inferior) (Ridley & Jopling 1966, Neves & Talhari 1997, Sarubi & Shibuya 2013). Outras deformidades também podem se originar de infecção secundária grave devido a traumas em regiões sem sensibilidade, podendo causar necrose, que muitas vezes pode levar a amputação da região ou a osteomielite com um processo de reabsorção das extremidades ósseas, particularmente os dedos dos pés e mãos (Moonot et al. 2005, Warren 1971). O comprometimento dos nervos está ligado à resposta imune do hospedeiro, que ao tentar defender o organismo do M. leprae agride também os componentes neurais. O envolvimento neural é maior nas formas de maior resposta imune celular (RIC), ou seja, no polo tuberculoide, onde os filetes nervosos podem ser completamente destruídos. No polo lepromatoso este comprometimento é menor, geralmente com o infiltrado inflamatório circundando a fibra neural, sem destruí-la (Talhari & Neves 1997, Sarubi & Shibuya 2013). As bases moleculares da neuropatia hansênica ainda não estão bem definidas. Um estudo sobre esta, avaliando anticorpos anti-PGL-I, imunoglobulinas G e M antiLAM (IgG e IgM), anti-ceramida, anti- S100 e anti-fator de necrose tumoral alfa (TNFα), os autores mostraram que a lesão neural é uma dinâmica entre estes e os antígenos do M. leprae, do nervo e de citocinas (Jadhav et al. 2011). Outro estudo demonstrou que 18 a base molecular do tropismo neural do M. leprae é imputada ao domínio G da cadeia de laminina-α2 das células de Schwann (Rambukkana et al. 1997). Em outro estudo Rambukkana demonstra as bases moleculares do dano neural, com o M. leprae invadindo a célula de Schwann e levando a perda motora e sensorial e consequente deformidades e incapacidades. A base molecular deste evento é que a célula de Schwann possui lâmina basal, com moléculas de laminina-α2 com os domínios G e complexos de distroglicans, onde o M. leprae se liga através do PGL-1 (Rambukkana 2001). Em outro estudo, mais recente, focando na lecitina tipo C, CD209, expressa em macrófagos e nas células de Schwann, foi observado que as células positivas se ligam mais ao M. leprae que expressam CD209. Observou-se também que a IL-4 aumentou a expressão de CD209 nas células de Schwann, com posterior ligação ao M. leprae. As citocinas Th1 não induz a expressão de CD209 nas células de Schwann (Teles et al. 2010). Mediadores dos mastócitos também podem estar envolvidos nestas neurites, por exemplo, a triptase mastocitária, uma protease, liga a receptores de proteinase, agindo diretamente sobre os neurônios sensitivos. Além disso, ATP liberado dos mastócitos pode ativar os nervos sensoriais vizinhos e neuropeptídeos lançados de neurites, tais como, o peptídeo relacionado com o gene de calcitonina (CGRP) e a substância P (SP), ligam aos seus receptores nos mastócitos e podem estimular a degranulação (revisado por Silver & Curley 2013). Todos os estudos com base molecular poderão servir de base para futuras terapias moleculares, minimizando assim o dano neural. As sequelas ou incapacidades físicas relacionadas ao comprometimento neural podem ser evitadas ou minoradas com o diagnóstico precoce e tratamento da hanseníase e da neurite, esta comum nas formas reacionais (Neves & Talhari 1997, Walker & Lockwood 2007, Teles et al 2010). 1.5.3- Manifestações otorrinolaringológicas na hanseníase As manifestações otorrinolaringológicas são mais frequentes nas formas MHB e LL com ressecamento da mucosa e obstrução nasal, aumento das secreções, coriza persistente, que inicialmente é mucosa, evoluindo para sanguinolenta ou epistaxe, levando a infecção secundária, formação de crostas, com odor fétido, que tardiamente leva a ulceração, destruição e perfuração do septo nasal. Como sequela ocorre o 19 desabamento do nariz, com aponta caindo e colapso do dorso nasal, conferindo ao hansênico o nariz com aspecto de “tromba de elefante” ou “nariz de anta” e “nariz em sela”, respectivamente. Ao final do processo instala-se a rinite atrófica, lenta e irreversível. As secreções e tecidos nasais são ricos em BAAR e uma das principais vias de contaminação de comunicantes ou contatos. Pode haver também comprometimento da orofaringe, geralmente secundário ao comprometimento da mucosa nasal, palato mole, úvula, laringe, sendo que antigamente o comprometimento desta, por vezes era grave, provocando obstrução e morte do hansênico por asfixia. O comprometimento do pavilhão auricular, com espessamento da borda livre ocorre em 80% dos casos BL e LL (Neves & Talhari 1997, Walker & Lockwood 2007, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon & Oliveira 2013). A boca também é comprometida em muitos casos de hanseníase e, na forma LL, o comprometimento ocorre em 60% dos casos. Lesões aparecem em maior frequência no palato mole, úvula e pilares de fauces, que vão desde eritema até ulcerações, levando a cicatrizes com atrofias e deformidades. Nas formas reacionais, RT2, pode ocorrer necrose de palato. A língua, dentes e tecidos periodontais também podem ser acometidos. As alterações são pouco comuns nas formas paucibacilares, TT e BT (Walker & Lockwood 2007, Sampaio & Rivitti 2011, revisado por Lyon 2013). 1.5.4- Manifestações oftalmológicas na hanseníase As manifestações oftalmológicas na hanseníase são frequentes, variando de 47 a 90% o envolvimento ocular dos pacientes. Nos olhos, as partes mais comprometidas são o aparelho lacrimal, pálpebra, córnea e úvea. Pacientes hansênicos BL e LL apresentam diminuição da produção de lágrima, principalmente os que usam clofazimina. Esta diminuição poderá levar a ressecamento da córnea com sensação de queimor. Paciente com comprometimento da mucosa nasal poderá ter bloqueio do canal nasolacrimal, provocando lacrimejamento e retenção da lácrima no saco lacrimal, o que poderá ocasionar infecção bacteriana secundária, a dacriocistite. As pálpebras podem apresentar problemas nos músculos que as movimentam, devido a uma fraqueza dos mesmos, secundária à lesão neural, o que poderá levar ao fechamento inadequado das pálpebras (lagoftalmo), eversão da pálpebra inferior (ectrópio) com consequente ressecamento da córnea, o que poderá levar até a cegueira. A hanseníase é uma das principais causas de cegueira no mundo, variando de 0,7 a 30% dos pacientes. As 20 alterações palpebrais podem estar associadas com alterações da sensibilidade da córnea, com abolição do reflexo córneopalpebral, expondo o paciente a risco de trauma nos olhos, devidoa abolição de reflexo de defesa, que nos protege de corpos estranhos. O uso de corticoides, tão comum no tratamento das reações, poderá levar à catarata e aumento da pressão intraocular (glaucoma) (Woods 1997, Wlaker & Lockwood 2007, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon & Lyon-Freire 2013). Na córnea, o comprometimento dos ramos oftálmicos dos nervos trigêmeos leva a uma hipoestesia, que com traumas leva a uma ceratite, inflamação da córnea, denominada ceratite neurolítica, com proliferação de vasos e formação do “panos”, tecido que provoca redução da visão e diminuição da sensibilidade da córnea (Woods 1997, Lyon & Lyon-Freire 2013). A úvea, camada média e vascular do olho, é composta por 3 estruturas: íris, corpo ciliar e coroide. Na hanseníase o comprometimento mais importante é o da íris, que é a camada visível e que da cor ao olho, levando a inflamação da mesma, a irite aguda ou crônica, isolada ou em conjunto com a inflamação do corpo ciliar, ou seja, a iridociclite. Estas mostram sintomas variados, como lacrimejamento, ardor e vermelhidão nos olhos, diminuição da visão, fotofobia (dificuldade para ver em ambientes claros, aversão à luz), entre outros. A forma crônica pode ser silenciosa ou assintomática, provocando atrofia progressiva da íris, o que leva a um fechamento da pupila, com redução da entrada da luz, prejudicando a visão do paciente. (Woods 1997, Lyon & Lyon-Freire 2013). 1.5.5- Manifestações Viscerais e/ou Sistêmicas da hanseníase A hanseníase é doença sistêmica, envolvendo mais frequentemente pele e nervos periféricos, mas pode comprometer qualquer órgão interno, como: aparelho respiratório, digestivo, fígado, linfonodos (gânglios linfáticos), medula óssea, testículos, entre outros. Este comprometimento é principalmente nas formas multibacilares (MB) do polo lepromatoso (formas BL e LL) e mais intenso, com reação inflamatória sistêmica, durante as reações tipo II. As alterações viscerais são mais lentas, por aparente dificuldade de proliferação do BAAR e, consequentemente, pouco sintomáticas, regredindo com o tratamento específico, exceto o comprometimento testicular e da laringe. São mais evidentes o comprometimento da laringe com sintomas de rouquidão, mas pode ser grave, com fibrose laríngea e levar a dificuldade de fonação e respiração. Já o comprometimento testicular pode ser intenso, levando a atrofia total dos mesmos, 21 com consequente infertilidade, alterações hormonais secundárias com perda dolibido e impotência sexual, e das características sexuais, como redução e distribuição dos pelos e ginecomastia (Fleury 1997, Magnago 2013). Outra manifestação sistêmica importante é a amiloidose secundária, com produção de amiloide pelos macrófagos ativados durante a inflamação, depositando nos rins e podendo levar a lesões, tipo glomerulonefrites, atrofia dos mesmos e morte por insuficiência renal crônica. O comprometimento renal é mais comum nos surtos de RT2 (Woods 1997, Magnago 2013). Comprometimentos menos importantes, muitas vezes assintomáticos, podem ocorrer no fígado, baço, medula óssea, linfonodos e outros, com a presença de granulomas, mas sem repercussões clínicas. A suprarrenal pode ser acometida em até um terço dos pacientes, com depósitos de amiloide, podendo levar a disfunções no eixo hipotálamo-hipófise-adrenal e consequente distúrbios endócrinos (Magnago 2013). 1.6- Imunologia da hanseníase A hanseníase tem sido explorada como um modelo de doença humana que exibe padrões dinâmicos de resposta imunológica frente à infecção por um patógeno intracelular. Como não existe um modelo experimental ideal, as lesões humanas da hanseníase têm sido extensamente utilizadas para desvendar os mecanismos imunológicos protetores e a sua complexa patogênese (Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010). É um exemplo de doença espectral na qual, diferentes tipos de resposta imune ao M. leprae definem as manifestações clínicas, ilustrado por duas respostas polares, a da hanseníase tuberculóide e lepromatosa (Modlin 1987, Yamamura et al 1991, Modlin 1994, revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Duthie et al. 2008). O organismo humano frente a um patógeno agressor responde de imediato com a resposta imune inata (RII) e, mais tardiamente, com a resposta imune adaptativa (RIA).É intrigante que na hanseníase, tanto as diferentes manifestações clínicas da doença crônica como as manifestações agudas das reações hansênicas estejam diretamente associadas ao tipo de resposta imune do hospedeiro aos antígenos do M. leprae (Britton & Lockwood 2004, Montoya & Modlin 2010). 1.6.1- A resposta imune inata contra o M. leprae 22 A resposta imune inata é inicial e rápida à penetração de agentes agressores, feita mediante mecanismos imunológicos inatos, que sãoinespecíficos e gerais contra patógenos, independente de sua natureza. Esta é constituída por barreiras, ou seja, pele e mucosas íntegras, fatores plasmáticos solúveis, como a lisozima, o complemento, proteínas, citocinas, pela fagocitose (células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e outros), células “natural killer”, etc. (Akira 2003, Costa et al. 2013). A RII desempenha papel crucial na definição do tipo de estratégia a ser usada pela resposta imune adaptativa (Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010). As células do sistema imune inato expressam em suas membranas receptores de reconhecimento de padrões (pattern recognition receptors/PRRs), que interagem e reconhecem moléculas das membranas dos patógenos, os padrões moleculares associados aos patógenos (“pathogen-associated molecular patterns/PAMPs”) (Akira 2003, Scollard et al. 2006, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010).Os PRRs são proteínas, que forma a família dos Toll-like receptores (TLRs, TLR1 a 13), que são expressos nas membranas dos monócitos, macrófagos e células dendríticas(“dendritic cells” – DC), as células apresentadoras de antígeno (APCs) clássicas. Por outro lado, os PAMPs são moléculas das paredes dos patógenos, como por exemplo, o lipopolissacarídeo (LPS) das paredes das bactérias gram negativas, as lipoproteínas di e tri-aciladas das micobactérias, a lipoarabinomanana com manose ou arabinose (ManLAM e AraLAM), etc (Akira 2003, Modlin 2010, Hart & Tapping 2012). A ligação entre um TLR e seu agonista gera uma cascata sinalizadora que culmina com a ativação de genes regulados pelo fator nuclear kappa B (NF-κB), que codificam citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e moléculas co-estimulatórias, que irão ativar as células T etc (Akira 2003). Na hanseníase, o TLR2, dimerizado com outros TLRs (TLR2/6 e TLR2/1), reconhece os PAMPs do M. leprae, representados por lipoproteínas di e tri-aciladas, pelo fenoglicolipídeo ou glicolipídeo fenólico I (PGL-I), pela ManLAM, AraLAM, etc. A ligação entre um TLR e seu agonista ativa a resposta inflamatória via produção de citocinas, a produção de TNF- e da interleucina 12 (IL12), direcionando a RIA para o tipo Th1(Krutzik et al. 2005, Scollard 2006, Bochud et al 2008, Misch et al. 2008, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010). O genoma do M. leprae prevê 31 genes para diferentes lipoproteínas, sugerindo que muitas delas tri-aciladas poderiam sinalizar via TLR2/1, desencadeando atividade imunoestimuladora ou imunossupressora. 23 A defesa e/ou resistência à hanseníase estão relacionadas também à produção de reativos intermediários do oxigênio (ROI) e nitrogênio (RNI), elementos fundamentais para a destruição bacilar dentro do macrófago. A produção de ROI, RNI e IL-12, pelo macrófago, ocorre após o reconhecimento de antígenos do M. leprae via TLR2/1 (Scollard et al. 2006, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010). Polimorfismos de uma única base de nucleotídeo nas regiões codificadoras das moléculas de TLR2 ou TLR1 parecem estar associados a uma maior suscetibilidade a hanseníase (revisado por Scollard et al. 2006, Bochud et al. 2008, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010). Misch e colaboradores concluíram que a deficiência de TLR1 influencia a resposta imune adaptativa durante a infeção pelo M. leprae, provocando manifestações clínicas, tais como, o dano neural e incapacidades (Misch et al. 2008). Outros receptores TLR parecem correlacionar-se com a resistência ou susceptibilidade à doença. O TLR9 reconhece o DNA CpG do M. leprae, por isso SNPs associados ao gene codificador do TLR9 predispõe as formas lepromatosas de hanseníase (Krutzik et al. 2005). Por outro lado, polimorfismos no TLR4, que se liga a HSP-20 (proteína do choque térmico) do M. leprae, estão relacionados às formas tuberculoides (citado por Scollard et al. 2006, Teles et al. 2010). Além dos TLR, existem outros PRRs localizados no citoplasma, os NLRs (receptores semelhantes ao NOD [Nucleotide-binding oligomerization domain]-likereceptors). No M. leprae, NOD1 e NOD 2 reconhecem componentes das paredes das células (ácido d-glutamil-meso-diaminopimélico e o muramil dipeptídeo/MDP, respectivamente). Estimulação dos NLRs ativa um complexo protéico denominado “inflamosoma”, que atua na caspase, levando a clivagem proteolítica e ativação da produção da IL-1β e outras citocinas (Modlin 2010). Em adição aos TLRs e NLRs, existem outros PRRs, os receptores semelhantes ao RIG-I (“RIG-I-Like receptors), receptores de manose e receptores de proteínas do complemento. Os receptores citoplasmáticos do tipo NOD2 parecem ser altamente relevantes na resposta contra hanseníase, já que polimorfismos de uma única base de nucleotídeo (SNPs) de NOD2 estão relacionados com manifestação de formas lepromatosas de hanseníase (Zhang et al. 2009, Kang et al. 2010, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010). Receptores de lectina tipo C (CD209), expressos em macrófagos, reconhecem especificamente estruturas de carboidratos encontradas na parede celular do M. leprae, como a galactana, iniciando a produção de TNF-α e óxido nítrico (revisado por Scollard et al. 2006). Outro receptor de lectinas, o DC-SIGN [DC-Specific Intercelular adhesion 24 molecule (ICAM)-3-Grabbing Nointegrein ou CD209] de células dendríticas e macrófagos, promove imunossupressão, ou seja, é receptor considerado inibitório, expresso mais em células de pacientes multibacilares (Krutzik et al. 2005, citado por Scollard et al. 2006, Montoya et al. 2009, Teles et al. 2010). Os receptores do complemento CR3 podem facilitar a fagocitose do M. leprae por meio de opsoninas do complemento ou fagocitose mediada por lectinas. Pacientes LL/BL expressam menos receptores CR3 (Modlin 2010). Outra proteína receptora que parece ter relação com as diferentes formas de manifestação da hanseníase é o receptor de vitamina D (VDR). Essa proteína, que está relacionada à ativação de macrófagos e produção de catalecidinas e defensinas, parece estar aumentada em pacientes TT/BT em comparação a pacientes LL/BL (Prevedello & Mira 2007, Montoya et al. 2009, Modlin 2010). O polimorfismo de VDR não está associado a fenótipos da hanseníase (Sapkota et al. 2010). A fagocitose é um dos principais mecanismos efetores da imunidade inata e desencadeia uma série de mecanismos microbicidas e digestivos que possibilitam o processamento e apresentação dos antígenos e o início da resposta imune adaptativa. A fagocitose é realizada principalmente pelos macrófagos, que também têm a função de varredores (“scavenger”) para remover material extracelular, em especial lipoproteínas oxidadas de baixa densidade, que contribuem para a formação de células vacuolizadas (células de Virchow). Na hanseníase, os macrófagos desenvolvem diferentes programas funcionais para fagocitose e resposta antimicrobiana que são desencadeados por citocinas da resposta imune inata. Assim, a IL-15 presente nas lesões tuberculóides induz a via antimicrobiana dependente de vitamina D. Já a IL-10, presente nas lesões lepromatosas, induz a via fagocítica com expressão de receptores scavenger e fagocitose de micobactéria e lípides oxidados (Montoya et al. 2009). Para evadir-se da resposta imune do hospedeiro o patógeno usa de vários meios. Na hanseníase, nas lesões lepromatosas, a diferenciação das células dendríticas, APCs, em células maduras, a partir de precursores mieloides, é interrompida resultando em menor diferenciação e função das DCs e da sua capacidade de apresentar antígenos. Agonistas do TLR2/1 (ManLAM e AraLAM) são fatores que contribuem tanto para ativação de macrófagos e destruição bacilar como para imunomodulação das respostas do hospedeiro “desativando” os macrófagos, com o bloqueio da fusão fagosomalisosoma, e estimulando da resposta Th2. Estas moléculas funcionam em grande parte como consumidoras de espécies reativas de oxigênio produzidas durante a explosão 25 oxidativa do fagosoma, o que proporciona condições para que o bacilo fique protegido no citoplasma da célula, multiplicando-se, formando globias e disseminando-se (Modlin 2010, Teles et al. 2010). Nas formas lepromatosas, são encontrados bacilos vivos residentes em vacúolos lipídicos no citoplasma e nas membranas dos macrófagos. O bacilo ainda possui mecanismos para inibir a atividade de reativos do oxigênio no interior dos macrófagos, como a inibição da síntese de superóxido pelo PGL-I e a expressão de superóxidodismutases SodA e SodC que inibem o óxido nítrico (revisado por Scollard et al. 2006). Trabalho recente demonstrou que a apoptose está diminuída em macrófagos infectados com BAAR, mesmo que a carga bacilar seja alta, em comparação com macrófagos infectados com BAAR irradiados ou mortos (Lahiri et al. 2010). O M. leprae possui, ainda, mecanismos para impedir a fusão do fagossoma com o lisossomo. A TACO (tryptophan aspartate-containing coat protein ou CORO1A) é uma proteína, presente na membrana lisossomal de macrófagos infectados pelo M. leprae, que inibe fusão dos fagossoma ao lisossomo do macrófago e é expresso em altas concentrações em lesões de pacientes MB (Suzuki et al. 2006, Tanigawa et al. 2009). 1.6.2- A resposta imune adaptativa contra o M. leprae Após a resposta imune inata inicial, fagocitose e processamento dos patógenos, com as APCs apresentando os antígenos aos linfócitos, dá-se o início da resposta imune adaptativa, representada pela ativação dos linfócitos T e B, que é complementar e agora simultânea com a inata e representa uma segunda linha na defesa do organismo, já que a RII por si só, pode não ser suficiente para eliminar o patógeno (Modlin 1994, Akira 2003, revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Moraes et al. 2006, Abbas et al. 2012c). As células T auxiliares CD4 + (T helper/Th) são fundamentais para o funcionamento do sistema imune e atuam coordenando a expansão e regulação das células T CD8+, facilitando a resposta de células B, recrutando e modulando múltiplos componentes da RIA. O encontro inicial de células T “naïve” (virgens) com o antígeno varia, dependendo do sitio anatômico, do tipo de patógeno e da presença de citocinas e moléculas co-estimulatórias que influenciam a diferenciação de células Th em células efetoras específicas para o antígeno com características funcionais distintas. As células apresentadoras de antígenos, células dendríticas, podem processar e apresentar 26 antígenos protéicos via MHC de classe I e MHC de classe II além de antígenos glicolipídicos via CD1 para linfócitos (Hunger et al. 2004, Abbas et al. 2012a). As células T virgens requerem dois sinais diferentes das APCs para se tornarem ativadas. O sinal 1 se refere à interação entre o receptor para antígeno do linfócito T (T cell receptor/TCR) e o Ag processado/peptídeo associado à molécula de MHC apresentado na superfície da APC. O sinal 2 se refere à expressão na superfície das APCs de moléculas co-estimulatórias e a produção de citocinas (Abbaset al. 2012a). A existência do sinal 1 na ausência do sinal 2 induz anergia de células T, e na ausência de ativação completa de APC, pode ser iniciada uma resposta do tipo Th2. As DCs de pacientes tuberculoides, assim como os macrófagos ativados desses pacientes, podem produzir citocinas pró-inflamatórias, como a IL-12 e TNF-α, que estimularão uma resposta Th1 (revisado por Scollard et al, 2006). Porém as DCs de pacientes lepromatosos, infectadas com M. leprae, passam a expressar PGL-I em sua membrana celular e produzem IL-4 e IL-10. A utilização de anticorpos anti-PGL-I opsoniza essas DCs, que passam a produzir IL-12, que estimularão uma resposta Th2. (Modlin 1994, Krutzik et al. 2005). A resistência à infecção pelo M. leprae está fortemente condicionada às células T do tipo Th1 (fator de transcrição T-bet), que desempenham papel essencial na síntese local das citocinas IL-12, TNF-α, Interferon Gama (IFN-γ), IL-2 e a produção de mediadores de oxidação, como reativos intermediários do oxigênio e do nitrogênio parecem ser essenciais no combate ao bacilo (Yamamura et al. 1991, Modlin 1994, Misra et al. 1995, Stefani et al. 2003, Sampaio & Rivitti 2011). Os pacientes TT desenvolvem resposta imune celular específica do tipo Th1 com produção de citocinas IL-2, IFNγ e TNF-α (Ochs et al. 2009). Nestes os bacilos são escassos ou ausentes, caracterizando a doença paucibacilar, com teste cutâneo (Lepromina ou Reação de Mitsuda), os testes de linfoproliferação e ensaio de sangue total (“whole blood assay/WBA”) positivos. As lesões TT expressam também citocinas da imunidade inata do tipo 1 como linfotoxina α/β, IL12p70, IL-18 e GM-CSF (Yamamura et al. 1991, Modlin 1994, revisado por Scollard et al. 2006, Montoya & Modlin 2010). A IL-2 é produzida pelas células T CD4+ e CD8+ em pacientes TT, mas não por pacientes LL. Esta ativa receptores dos linfócitos Th1, responsáveis pela manutenção da produção de citocinas, e estimula a formação de clones celulares específicos (Modlin 1994, Kim et al. 2001). 27 No outro lado do espectro, os pacientes LL desenvolvem resposta imune do tipo Th2 (fator de transcrição GATA3), com expressão das citocinas IL-4, IL-10 e IL-5, produção de anticorpos, que não protegem contra o bacilo intracelular, clinicamente, mas frequentemente com múltiplas lesões disseminadas, os testes cutâneos, de linfoproliferaçãoe ensaio de sangue total negativos. A anergia apresentada pelos pacientes LL é restrita aos antígenos do M. leprae (Yamamura et al. 1991, Ochs et al. 2009, Scollard et al. 2006, Montoya & Modlin 2010). Em um estudo, os autores encontraram que a IL-9 é capaz de reverter o efeito inibitório da IL-10 e IL-13 na atividade citotóxica induzida pelo M. leprae (Finiasz et al. 2007). A IL-12 é secretada por células dendrítcas e macrófagos em resposta principalmente a antígenos protéicos do M. leprae em pacientes TT, mas não em pacientes LL. Estimula a produção de IFN-γ pelos linfócitos Th1 e linfócitos TCD8+ na lesão. A IL-12 parece, ainda, inibir a secreção de IL-4 por outros macrófagos, células dendríticas e linfócitos (Libraty et al. 1997). Um estudo que avaliou pacientes com hanseníase e IL-12 mostrou que as células T de pacientes tuberculoide, a forma resistente da hanseníase, são sensíveis a IL-12; no entanto, as células T de pacientes virchowiana, forma suscetível de lepra, não respondem a IL-12. Neste a IL-12Rβ2 foi mais altamente expressa nas lesões tuberculoides em comparação com lesões virchowianas. Em contraste, a expressão de IL-12Rβ1 foi semelhante em ambos tuberculoide e lesões virchowianas(Kim et al. 2001). O TNF-α, citocina pró-inflamatória, é secretado por macrófagos e linfócitos T CD4+, em resposta aos antígenos lipídicos e glicídicos, como o PGL-I. O TNF-α é crucial na manutenção da ativação macrófagos e células Th1, sendo a principal citocina responsável pela manutenção da granuloma em pacientes tuberculoides, mas não é encontrado nas lesões de pacientes lepromatosos (Foss 1997, Moraes et al. 2001, Modlin 1994, Sapkota et al. 2010). É encontrado em grandes quantidades em pacientes de hanseníase com osteomielite e reabsorção óssea e, podendo provocar dano neural (Barnes et al. 1992, Sarno et al. 2000). Outro estudo mostra que existe uma relação entre polimorfismo de região promotora de TNF-α e IL-10 com o desenvolvimento de hanseníase PB (Santos et al. 2002). O IFN-γ é produzido por células T CD4+ e CD8+ nas lesões de pacientes TT/BT, sendo importante na manutenção do granuloma e inibe a formação de IL-4 e IL5 por macrófagos e a produção de anticorpos por linfócitos B (Yamamura et al 1991, Modlin 1994). Este estimula a fagocitose pelos macrófagos e os mecanismos de 28 ativação celular, expressão de MHC de classe II, processamento, destruição, digestão e apresentação de antígenos do M. leprae e potencialização da produção de óxido nítrico e intermediários reativos de oxigênio. O IFN-γ promove a inibição da diferenciação de células T “naive” em células Th2 (Modlin 1994). A expressão de IFN-γ apresentou maiores níveis em lesões TT quando comparadas às lesões LL (Yamamura et al. 1991, Modlin 1994, Misra et al. 1995, Libraty et al 1997, Moubasher et al. 1998, Stefani et al. 2003). Esta citocina participa também nos episódios reacionais, quando está elevada (Moraes et al. 2001). Recentemente outro trabalho mostrou a inibição do intereferon tipo II (IFN-γ) pelo tipo I (IFN-α e β), sendo que este, juntamente com a IL-10, expressaram-se mais em pacientes MB (Teles et al. 2013). Quando ocorre a polarização do tipo Th2, há exacerbação da resposta humoral, com vigorosa produção de anticorpos, que é ineficaz para a eliminação dos bacilos intracelulares e causa maior suscetibilidade à hanseníase (Yamamura 1991, Modlin 1994). A subpopulação Th2 produz as citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 que são supressoras da atividade macrofágica, produzindo bloqueio da estimulação de células Th1, com consequente desvio da resposta imunológica (Modlin 1994, Foss 1997). Os antígenos PGL-I e lipoarabinomanana (LAM) apresentam função supressora na ativação dos macrófagos, favorecendo a polarização para resposta do tipo Th2 com a produção de citocinas supressoras como fator de crescimento transformador- β (TGF-β), IL-10 e IL4 (Foss 1997). A IL-4 é uma citocina encontrada principalmente nas lesões de pacientes LL/BL e é produzida tanto por macrófagos quanto por linfócitos T CD8+ e CD4+ (Modlin 1994). Esta estimula a ativação de linfócitos B, que aumenta a secreção de imunoglobulinas, e a ativação de mastócitos locais, que passam a produzir mais IL-4, potencializando a resposta supressora macrofágica (Yamamura et al. 1991, Misra et al. 1995, Teles et al. 2010). A IL-5 é produzida pela subpopulação de células Th2 e mastócitos nas lesões de pacientes células LL/BL e inibe fortemente a produção de TNF-α e IL-12 pelos macrófagos (Ochoa et al. 2010). Apesar da IL-5 estimular o crescimento e a diferenciação dos eosinófilos em outros tipos de infecções, dificilmente são encontrados eosinófilos nas lesões da hanseníase (Modlin 1994). Uma análise de lesões de hanseníase por imuno-histoquímica mostrou que houve cerca de 8% mais células IgM positivas nas lesões LL do que em lesões TT. Além disso, a IL-5 sinergizada in-vitro pelo M. Leprae, aumenta a secreção de IgM total das células mononucleares do sangue 29 periférico. Este estudo in vitro demonstrou o papel da IL-5 na promoção do aumentado do IgM no local da lesão de hanseníase (Ochoa et al. 2010). A IL-10 é uma citocina produzida por macrófagos e células dendríticas em lesões de pacientes LL/BL. Inibe fortemente a produção de substâncias microbicidas como reativos de oxigênio, óxido nítrico e catalecidinas em macrófagos infectados pelo M. leprae (Yamamura et al. 1991, Modlin 1994, Misra et al. 1995, Pereira et al. 2009). A IL-10 inibe ainda a expressão de MHC de classe II, assim como a produção de IL-12 por células dendríticas e macrófagos (Misra et al. 1995). Já referido anteriormente foi demonstrado que polimorfimos da IL-10 favorece o desenvolvimento de hanseníase PB (Santos et al. 2002) e que a IL-10 favorece o desenvolvimento das formas MB (Teles et al. 2013). Em lesões de pacientes com hanseníase há clara diferença na proporção de linfócitos TCD8 + e TCD4 +. Nas lesões de pacientes TT, os linfócitos T encontram-se bem unidos a macrófagos ativados, dentro e nas proximidades de granulomas e são geralmente observados em uma proporção de 1,9:1,0 células TCD4 +/CD8+. As células TCD4+ encontram-se distribuídas por todo granuloma, enquanto as TCD8+ são geralmente encontradas na periferia deste (Modlin et al 1983, Modlin & Rea 1987). Nas lesões TT, tanto as células TCD8+ quanto TCD4 + produzem grandes quantidades de IFN-γ (Modlin et al. 1983, Modlin & Rea 1987, revisado por Foss 1997, revisado por Scollard et al. 2006). Em pacientes tuberculoides, as células TCD8+ produzem grandes quantidades de perforina, granzima e granulisina (Modlin et al. 1988). Em contraste, nas lesões de pacientes LL as células T são encontradas na proporção de 0,6:1,0 TCD4+/TCD8 +, e ambos os fenótipos de linfócitos T estão distribuídos de forma desorganizada dentro do processo inflamatório (Modlin et al. 1983, Modlin et al. 1988). Outra diferença notável nas lesões LL é a grande quantidade de citocinas IL-4 produzidas pelo linfócito TCD4+ e principalmente por TCD8+ (Yamamuraet al. 1991, revisado por Foss 1997). O paradigma Th1 e Th2 foi substituído por um painel de novas subpopulações de células T, que foram adicionadas ao “portfolio” de células Th (Joosten et al. 2007, Ochs et al. 2009, Shevach 2009). Estas novas subpopulações incluem as células Th17, Th22, Th9, Th3, células T auxiliares foliculares (Thf), células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), células T restritas por MHC Ib e subpopulações de células T reguladoras (Treg). Existem evidências de que algumas destas subpopulações de 30 células T participam da resposta imune contra o M. leprae (Massone et al. 2010, Palermo et al. 2012). As células Th17 são pró-inflamatórias, associadas a doenças autoimunes e participam da imunidade antimicrobiana contra bactérias extracelulares e fungos, principalmente nas superfícies mucosas (Nouri-Aria 2009, Ochs et al. 2009). Estas são induzidas a partir de células T “naive”, na presença de IL-6 e TGF-β (“transforming growth factor β”), requerem IL-23 para sua expansão e estabilização, expressando o fator de transcrição RORγT (orphan nuclear receptor). As células Th17 produzem IL17, IL-24, IL-21, IL-22 e CCL-20 (Nouri-Aria 2009). Na hanseníase, as células Th17 parecem participar da patogênese da reação tipo 2 (Martiniuk et al.2012). Na vacinação experimental com Bacilo Calmette-Guerin (BCG) ocorreu ativação de Th17, no entanto, exposições repetidas a M. tuberculosis e a BCG levaram a doença pulmonar e não a proteção. As células Th22, funcionalmente, sobrepõem-se às células Th17, mas não existem evidências que participem da proteção contra a tuberculose em murinos. Estudo recente dos subconjuntos de células T, demonstra Th17e Th22, agem localmente para induzir plasticidade de células T nas lesões LL, manifestando com hiperplasia pseudoepiteliomatosa da epiderme (HPE) e que miR-21 e STAT3 encontram-se aumentadas em lesões LL com HPE, dada sua associação com a hiperproliferação epitelial (Fischer et al. 2012). As células T helper foliculares (Tfh) e Th9 associadas à defesa do hospedeiro contra patógenos extracelulares, ainda não foram estudadas na hanseníase nem na tuberculose. Os estudos não esclarecem exatamente o que constitui uma resposta imune protetora e não dispomos, até o momento, de um marcador ideal de proteção para hanseníase. Além disso, diante da complexidade da resposta imune contra micobactérias, não parece razoável supor que uma única população celular seja responsável pela proteção do hospedeiro. Uma característica intrigante da resposta imune adaptativa é a sua plasticidade, segundo a qual as populações de células T e macrófagos não estão em estágios de diferenciação terminais, mas podem se converter e reverter em fenótipos opostos (Sun et al. 2007, Shevach & Davidson 2010, Wohlfert & Belkaid 2010). Por exemplo, as células Th17 podem se converter em células Th1 ou mesmo as células Th1 podem ser redirecionadas em células Treg. Existem também evidencias de que as células pró- 31 inflamatórias Th17 juntamente com as células Treg devem atuar de forma a manter o equilíbrio do sistema imune do hospedeiro. Tanto células imunomoduladoras Treg como células pró-inflamatórias Th17 são ativadas por M. leprae, sendo que a ação das células Treg se contrapõe à ativação das células Th17, inibindo o recrutamento precoce de células efetoras para o sítio da infecção. Mais recentemente, foi demonstrado que as células Th17 estão em balanço positivo/negativo com células Treg, e existem células T híbridas, que possuem tanto o fator de transcrição de células Th17, RORγ T, como o fator de transcrição de Treg (Foxp3), podendo atuar com função pró-inflamatória ou supressora. Assim, neste novo conceito de plasticidade, populações celulares únicas podem adquirir diferentes funções numa infecção crônica como a hanseníase, dependendo do contexto e da situação em que atuam. A figura 7, esquematicamente, ilustra a intrincada resposta imunológica, inata e adaptativa, frente a uma infecção pelo M. leprae. 32 Reconhecimento - Vias Aéreas Superiores DC Receptor de Manose PAMPs - LIPOPROTEÍNAS - GLICOLIPÌDEOS - TLR2/1 NOD2 Receptor Scanvenger TLR2/6 M. leprae Apresentação do an geno Órgãos Linfóides Secundários Fase Efetora Tecidos periféricos Polo Lepromatoso Polo Tuberculóide I FN Ac IB I FN Ac IB TH17 LB LB LB IL-10 IL-17 IL-4; IL-5IL-13 TNF-; INF-IL-1 A vação de Formação de granuloma espumosos Ausência de granuloma Figura 7. Interação entre a imunidade inata e a imunidade adaptativa na resposta à infecção pelo M. leprae. Fonte: esta figura é parte do capítulo de Imunologia de autoria de Stefani et al., livro de Hanseníase, Talhari et al. Comunicação pessoal. 1.6.3- Hanseníase e Células T Reguladoras O balanço entre imunidade e tolerância é importante para manter a homeostase imune. Muitos mecanismos são utilizados para manter a resposta imune sob controle, como a anergia de linfócitos T, a apoptose e a ignorância imunológica. Um quarto mecanismo de tolerância periférica é a supressão ativa por células reguladoras. As Treg foram descritas primeiramente no início dos anos 70 (Gershon& Kondo 1970), mas como fatores supressores solúveis hipotéticos, que não puderam ser 33 identificados em nível molecular e marcadores celulares apropriados não eram conhecidos, o conceito de célula T supressora permaneceu esquecido por um longo tempo. A descoberta de Sakaguchi e seus colaboradores de que a transferência adotiva de uma população de células T depletadas da molécula CD25+ induzia uma série de doenças autoimunes órgão-específicas em recipientes imunodeficientes, colocou o modelo de células T supressoras de novo no foco de imunologistas (Sakaguchi et al. 1995). As células T CD4+CD25+ reguladoras foram inicialmente descritas como derivadas do timo, entretanto, descobertas recentes indicam que essas células também podem ser geradas na periferia (revisado por Shevach & Davidson 2010). As células Treg são uma subpopulação minoritária das células T, têm papel essencial na regulação da tolerância imunológica, atuam prevenindo o dano tecidual por inflamação e autoimunidade, pois são capazes de suprimir os efeitos deletérios das respostas imunes contra auto ou não auto-antígenos (Hori & Sakaguchi 2004, Beissert et al. 2006, Shevach & Davidson 2010, Kitagawa et al. 2013). Entretanto, para o hospedeiro, a função supressora das células Treg pode ser tanto benéfica, quando atua suprimindo a imunopatologia, ou pode ser maléfica quando suprime a resposta imune protetora (Joosten & Ottenhoff 2008). Muitos tipos de células T têm função imune reguladora, mas os dois subconjuntos de células Treg mais importantes expressam o fator de transcrição Foxp3 e desenvolvem no timo ou podem ser induzidos em locais periféricos, incluindo o tecido linfoide associado à mucosa (MALT). Embora a expressão de Foxp3 seja considerada um marcador útil para essas subpopulações de células em camundongos, a expressão de Foxp3 também pode ser induzida em células T humanas que não possuem a função de células Treg (Shevach e Davidson, 2010). As células Treg humanas naturais são CD4+ e expressam constitutivamente a cadeia α do receptor para IL-2 (IL-2Ra-chain/CD25) e o fator de transcrição Foxp3 (forkhead box P3), apresentando o fenótipo CD4 +CD25+Foxp3 +. Há vários fenótipos de células Treg, mas nem todos expressam atividade supressora. As Treg expressam constitutivamente as moléculas CTLA-4, GITR e Foxp3, as células Th3 produtoras de TGF-β, células Tr1 produtoras de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-βde IL-10 e células T CD8+CD28-. O CTLA-4, uma molécula co-estimulatória capaz de suprimir várias funções de células TCD4 + (Fontenot et al. 2003, Fontenot et al. 2005,Sakaguchi 2005, Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2010, Shevach & Davidson 2010, Pandiyan & Zheng 2011). 34 Células Treg Foxp3+ humanas funcionais ativadas, expressam um padrão único de marcadores de superfície celular que podem facilitar o seu isolamento. Um tipo importante de célula Treg segrega citocina imunossupressora, a interleucina-10 (IL-10), e pode-se desenvolver a partir de células T CD4+ convencionais ativadas na presença de IL-10 ou a partir de T helper 1 (Th1) ou subconjuntos de células Th2. Outras subpopulações de células T, incluindo células T “natural killer” (NK), as células Tγδ e células T CD8+ também podem exercer funções de potentes supressores em determinadas configurações (Shevach e Davidson 2010). O Foxp3 foi identificado como um marcador molecular específico para células Treg e sua expressão é essencial para o desenvolvimento e a função dessa célula. Camundongos deficientes de Foxp3 morrem com 3-4 semanas de vida, devido a uma síndrome linfoproliferativa auto-imune fatal (“Scurfy”) e rápida. Além disso, esses mesmos camundongos são incapazes de gerar Treg (Fontenot et al. 2003). Mutações no gene Foxp3 interferem com o desenvolvimento de células Treg e causam desregulação imune, a rara síndrome ligada ao X de poliendocrinopatia e enteropatia (IPEX). Outros defeitos de gene simples resultando em função de células Treg reduzida incluem CD25, transdutor de sinal e ativador da transcrição 5b, regulador auto-imune e síndrome da proteína de Wiskott-Aldrich (O’Garra & Vieira 2003, Ochs et al. 2009). As células Treg mantêm a tolerância periférica suprimindo a função das células T autorreativas e têm sido alvo de investigações em diferentes doenças cutâneas como lúpus eritematoso, doenças reumáticas, dermatite atópica, dermatite de contato, psoríase, doença de enxerto versus hospedeiro, sarcoidose, leishmaniose, tuberculose e câncer cutâneo (Chen et al. 2007, de Boer et al. 2007, Cruvinel et al. 2008, Chiacchio et al 2009). Em um estudo imuno-histoquímico, em peles normais e dermatoses (Psoríase vulgar, micose fungoide e dermatites eczematosas), foram observados os seguintes resultados: 1) na pele normal, as células epidérmicas e dérmicas Foxp3+ eram raras; 2) na Psoríase vulgar, micose fungoide e nas dermatites eczematosas continham números substanciais de CD3+ e Treg Foxp3+ na epidérmica e dérmica; 3) a epiderme continha um percentual maior de células CD3+ e Treg Foxp3+ do que na derme; 4) a percentagem de células Foxp3+ entre as CD3+ ou CD4+ foi significativamente menor nas dermatites eczematosas do que na Psoríase vulgar e na Micose fungoide; 5) e o número de células Foxp3+ dérmicas foi significativamente menor na Psoríase vulgar do que nas dermatites eczematosas e na Micose fungoide (Fujimora et al. 2008). 35 Na hanseníase, estudos sobre a expressão de Treg são muito poucos e usando desenhos e metodologias distintas (estudos “in situ” com imuno-histoquímica versus estudos de citometria de fluxo em sangue periférico) mostraram resultados conflitantes. A frequência de células Treg circulantes expressando Foxp3 foi avaliada por citometria de fluxo em pacientes com hanseníase TT, BT, BB, BL e LL, em pacientes com reação tipo 2 e em controles saudáveis. Níveis elevados de Treg foram encontrados nos pacientes TT comparados com controles normais sugerindo papel benéfico no controle bacilar na hanseníase. Não houve diferença de Treg entre as diferentes formas de hanseníase e estas estavam aumentadas em pacientes com RT2 comparados com controles normais (Attia et al. 2010). Estudo recente com imuno-histoquímica mostrou a presença de células Foxp3 + no infiltrado granulomatoso sem diferença entre as formas TT, BT, BL e LL, com aumento estatisticamente significativo na RT1, quandocomparada com a RT2 e em pacientes sem reação (Massone et al. 2010). Outro estudo recente avaliou a expressão de células T regulatórias na circulação por citometria de fluxo e em lesões de pacientes com hanseníase, com imunohistoquímica e dupla marcação (CD25 e Foxp3+), bem como contatos domiciliares e controles saudáveis. Uma maior proporção de Treg e IL-10 foi encontrada na circulação de pacientes lepromatosos. Já a produção de IFN-γ e resposta linfoproliferativa foram maiores entre os pacientes com hanseníase tuberculóide. Resultados similares foram obtidos nas lesões de pele, com duas vezes mais células T regulatórias, IL-10 e CTLA-4 nas lesões de pacientes lepromatosos (Palermo et al. 2012). Ainda recente, outro estudo de pacientes hansênicos menores de 15 anos e em contatos foram avaliadas as frequências de células CD4+/CD8+ CD25high Foxp3+ e CD4+/CD8+ CD25high Foxp3high. Células Mononucleares de sangue periférico (“peripheral blood mononucleated cell”/PBMC) dos pacientes e contatos foram cultivadas com anti-CD3 e anti-CD28 (ativadores) ou com ativadores associados com sonicado total de fração do M. leprae. Após a cultura, a frequência de CD4+/CD8+ Treg foi identificada por citometria de fluxo. Células dos pacientes multibacilares estimuladas pelos ativadores e antígenos mostraram frequências de Treg quase duas vezes mais que dos contatos e a intensidade de fluorescência média de Foxp3 nas Treg foi maior em pacientes multibacilares, do que nos contatos (Fernandes et al, 2013). Desta forma, os estudos realizados até o momento trazem resultados conflitantes e não esclareceram em definitivo qual o papel das células Treg na hanseníase. As 36 células Treg podem ter papel benéfico controlando a resposta imune inflamatória que destrói os nervos periféricos ou maléfico, suprimindo a resposta imune celular protetora contra o M. leprae. Nos episódios reacionais, RT1 e RT2, a participação das Treg ainda não foi motivo de estudo com o número significativo de pacientes, nem comparando as Treg no momento do episódio e fora dele, em um mesmo paciente, motivo principal do nosso estudo. 1.6.4- Hanseníase e Mastócitos. Os mastócitos foram relatados primeiramente por Friedrich von Recklinghausen (1833–1910) quando ele descreveu em 1863, a presença de células granuladas em tecidos conjuntivos de várias espécies. Muitos anos depois, os mastócitos foram assim denominados por Paul Ehrlich (1854–1915), em sua tese sobre a teoria e a práxis de coloração histológica, publicada em 1878, onde descreveu as células com granulações em tecidos conectivos que coravam com tinturas de anilina básicas (revisado por Blank et al. 2013). Os mastócitos são componentes fisiológicos da pele e mucosas, e estão presentes no tecido conjuntivo em torno dos vasos sanguíneos, subepiteliais, estruturas linfáticas, anexos da pele e nervos. São caracterizadas pela presença de inúmeros grânulos citoplasmáticos contendo potentes mediadores farmacológicos. Estes originam-sw a partir de células pluripotentes da medula óssea, que expressam CD34 +/CD117+e um receptor tirosina quinase (c-kit) específico para o ligante c-kit, e se diferenciam emcélulas maduras pela influência do fator de células fonte (SCF) e outras citocinas localmente produzidas comointerleucina-3 (IL-3), IL-4, IL-9 e IL-10,expressam o fenótipo final, ou seja, mastócitos detecido conjuntivo (MCTC) ou de mucosa (MCT) (Metcalfe et al. 1997, Metcalfe 2008, Blank et al. 2013, revisado por Silver & Curley 2013).Ao ocorrer essa interação, promove-se o crescimento e a diferenciação dos mastócitos, que migram e maturam na pele e nas mucosas; estes são células heterogêneas quanto à morfologia, bioquímica e função (revisado por Malufet al. 2009, Abbas et al. 2012b, revisado por Silver & Curley 2013). Em humanos, a heterogeneidade dos mastócitos é baseada em dois subtipos, classificados pelas serina proteinases estocadas em seus grânulos citoplasmáticos: mastócitos que contêm triptase/quimase (MCTC), que estão presentes predominantemente na derme, vasos sanguíneos e submucosa intestinal, ou aqueles que contêm somente triptase (MCT) e encontram-se predominantemente em paredes 37 alveolares e na mucosa do intestino delgado (MCCT) (Payne & Kam 2006, Metcalfe et al. 1997, Metcalfe 2008, Abbas et al. 2012b, revisado por Silver & Curley 2013). Osmastócitos contêm potentes mediadores bioativos pré-estocados em seus grânuloscitoplasmáticos, tais como histamina, heparina, triptase e quimase, capazes de potencializara migração e a proliferação celular, induzir a expressão de moléculas de adesão nas célulasendoteliais e, consequentemente, ativar o processo de angiogênese e proliferação celular (Amon et al. 1994, Abbas et al. 2012b, Metcalfe et al. 1997). Os grânulos dos mastócitos coram metacromaticamente em róseo-avermelhado com o Azul de Toluidina (AT), corante básico ou catiônico, devido aos seus componentes pré-formados proteoglicans, heparina e sulfato de condroitina B, que são ácidos e se ligam ao Azul de Toluidina (revisado por Sridharan & Shankar 2012, revisado por Chatura & Sangeetha 2012). A metacromasia depende da polimerização do AT, proporcionado pela presença da heparina, que o atrai por meio das forças de van der Waals. O Azul de Toluidina na sua forma monomérica é ortocromático, azul, enquanto na sua forma polimérica é metacromático, ou seja, vermelho/púrpura (Kumar & Kiernan 2010, Silva et al. 2011, revisado por Sridharan & Shankar 2012). As proteases, triptase e quimase, componentes dos grânulos, são específicas dos mastócitos, são demonstradas por métodos imuno-histoquímicos, por meio de anticorpos específicos (revisado por Magalhães et al. 2008). Os mastócitos participam das complexas respostas imunes cutâneas, inatas e adaptativas, principalmente nas reações de hipersensibilidade imediata, resposta Th2, juntamente com a imunoglobulina E (IgE) e contribuem também nas reações de hipersensibilidade tardia, resposta Th1 (Abbas et al. 2012b, Metcalfe 2008). A ativação dos mastócitos através dos receptores de alta afinidade da IgE, FcεRI, leva a desgranulação parcial, com liberação de produtos pré-formados, como a histamina, proteoglicans (heparina e sulfato de condroitina B), serotoninas e proteases (triptase e quimase), entre outras, e produção de mediadores lipídicos (prostaglandina D2 e leucotrienos), tromboxanas, citocinas e quimiocinas, e outros, com atividade próinflamatórias, que potencializam os efeitos dos já liberados, prolongando sua ação no tecido (Figura 8) (Metcalfe 2008, Abbas et al. 2012b). Os mastócitos são também produtores de substâncias mediadoras anti-inflamatórias, como a anexina, e outras destrutivas e nocivas aos nossos tecidos, com as enzimas proteases, quimase e triptase (Oliani et al. 2000, Oliani & Gil 2006). 38 Figura 8. Eventos de transdução de sinal na ativação dos mastócitos,iniciados pelo Kit e FcεRI levando a respostas específicas do mastócito e a integração destas vias ao reforço sinérgica de liberação dos mediadores do mastócito. Fonte: Metcalfe 2008. Mast cells and mastocytosis. Blood 112. Estudos prévios sobre o papel dos mastócitos na hanseníase e nas reações hansênicas apresentam resultados diversos e contraditórios. A variação em diferentes estudos pode ser devido a diferentes critérios usados para seleção dos casos e diferentes números de casos de cada forma clínica. Vários fatores também influenciam o diagnóstico histopatológico, tais como, as diferenças em tamanho dos espécimes, escolha do sítio da biópsia, idade da lesão, status imunológico e tratamento do paciente no tempo da biópsia (revisado por Chatura & Sangeetha 2012). Estas discrepâncias devem ser explicadas em partepelos métodos de colorações adotados, anticorpo antitriptase ou anti-quimase usados, e pela de quantificação dos mastócitos (manual, automatizada, análise assistida por computador, etc). Magalhães afirma: “em nossa experiência, a imunomarcação histoquímica de mastócitos é a ferramenta mais eficaz para a identificação do que qualquer outro método clássico” (Magalhães et al. 2008). Em estudo de hanseníase tuberculóide reacional, os autores encontraram um número significativamente menor de mastócitos do que nos casos não reacionais, com 39 0,9 mastócitos por campo, ou seja, pelo menos 40% menos que nos não reacionais (média 1,4 mastócitos por campo), sendo a grande maioria eram desgranulados (Chowdhury e Gjosh 1968). Uma estreita associação de BAAR com os mastócitos, os quais acumulam ao redor do BAAR ou onde estão as estruturas da pele, afetadas na hanseníase, isto é, nervos, vasos sanguíneos, músculos, folículos pilosos e elementos glandulares indicam similar distribuição de ambos (Kumar & Vaidya 1982). Outro estudo, os autores não encontram nenhuma diferença na quantidade de mastócitos em pele da borda e na pele não afetada do centro da lesão, sendo que os mastócitos estão mais presentes dentro dos granulomas do que na derme interveniente, sendo comparáveis aos encontrados em torno de anexos. Mastócitos de qualquer área do corpo mostravam o mesmo número de mastócitos, mostrando ser independente do sítio da lesão, ou seja, é sistemicamente determinado (Cree et al. 1990). O predomínio de mastócito no polo LL pode estar ligado ao aumento da vascularização e alterações observadas nas células endoteliais, as quais são mais evidentes na LL. Mas no polo TT, mastócitos não parecem permanecer tanto tempo como na LL (Aroni et al. 1993). Outro estudo, quantidade de mastócitos em número mais elevado foi observado na MHI (p<0,01) e significativamente em menor quantidade no polo TT do que no LL (p<0,01). A LL também mostrou aumento de mastócitos desgranulados e morfologia alterada. Relata ainda que, os mastócitos estão presentes em pequeno número nas biópsias de pele de controles saudáveis (Mysorekar et al. 2001). Estudo avaliando subtipos de mastócitos e neuropeptídeos, nas reações hansênicas, mostrou que o número total de mastócitos e o número relativo de mastócitos triptase-positivos foi signifivativamente maior no interior do infiltrado inflamatório do que na derme normal, não ocupada pelo infiltrado, pois segundo os autores este aumento pode estar relacionado com a deflagração do processo reacional (Antunes et al. 2003) Quantificação de mastócitos usando AT foi normal na MHI e TT e mostrou um aumento da densidade ao longo do espectro imunológico a BT para LL, com valores em LL 32,86/mm2, e em pele normal a densidade média foi de 11,43/mm2 (Bagwan et al. 2004). 40 Em 70 casos de TT corados pelo AT, a densidade média foi de 26,6 mm2 fora do granuloma e 15,1 mm2 dentro do granuloma. A diferença foi estatisticamente significante, com p<0,0001 (Pilli et al. 2005). Outro estudo de mastócitos e colagenização epineural os autores demonstraram que mastócitos, por meio da triptase, induz a fibrogênese, por ser um fator mitogênico para fibroblastos, levando a fibrose epineural e sequelas (Montagna et al. 2005) Em 51 biópsias de peles, de casos de pacientes com hanseníase, na imunohistoquímica, com imunomarcação por Ac anti-triptase, os casos de LL mostraram menores densidades de mastócitos nas dermes. As densidades maiores foram nos casos BT e BB, sendo considerada uma evidência indireta do papel dos mastócitos na ativação da resposta imune para o M. leprae (Magalhães et al. 2008). Estudo onde os autores observaram mastócitos na coloração de Fite-Faraco, no espectro hansênico, encontraram uma densidade baixa de mastócitos no polo TT comparado com o LL, sendo as quantificações mais altas nas formas borderlines. Afirmam que provavelmente uma redução dos mastócitos ocorre quando as lesões evoluem para o polo TT, com mudanças no perfil das citocinas. Extensiva desgranulação por causa do aumento da atividade funcional pode ser a causa de baixos valores em LL. Provavelmente por causa destas duas razões a quantificação de mastócitos diminui, quando move-se de BB para ambos os polos. Os autores referem ainda números de mastócitos em todos os subtipos de hanseníasemenores dos que os citados na literatura, provavelmente em função do método de coloração. A tendência dos mastócitos diminuírem da forma LL para a TT foi observada neste estudo. As formas reacionais RT1, em BT e BL não tinham mastócitos, mas nos casos de BL com RT2 tinha contagem de mastócitos de 6,58/mm2 (Chatura & Sangeetha 2012). Outro estudo de 60 casos de lesões não neoplásicas de biópsias de peles, incluindo casos de hanseníase, coradas pelo AT, foi observado aumento do número de mastócitos quando os casos Indeterminados evoluem para um dos polos, T ou L (Naik etal. 2003). Mastócitos foram encontradas e eram mais numerosos na pele aparentemente normal de pacientes que tinham também lesões da hanseníase, bem como entre o grupo indeterminado. A ausência de mastócitos foi conspícua em LL (16,7%), em BB (41,7%), BT (40,9%) e TT (68,0%), nos casos estudados. Isto sugere que os mastócitos devem ter um papel nos estágios iniciais da doença e proliferação do tecido conjuntivo pós-reacional (Rav et al. 1990). 41 A resposta imune contra infecções deve representar um equilíbrio complexo entre as respostas pró-inflamatórias contra o patógeno e as respostas anti-inflamatórias necessárias para limitar o dano tissular do hospedeiro. A hanseníase é caracterizada por um amplo espectro de lesões distintas, que refletem a resposta imune do paciente contra o M. leprae, e estas lesões podem sofrer alterações durante os episódios reacionais. Vários aspectos da imunopatogênese das reações hansênicas permanecem desconhecidos. Na hanseníase as lesões de pele contem muitos, senão todos os tipos celulares que ocorrem na pele não acometida pela doença, além dos componentes celulares do sangue periférico que migram para lesão granulomatosa. Neste contexto, é necessário investigar mais na hanseníase e nos episódios reacionais duas populações celulares, mastócitos, com características pró-inflamatórias importantes, e as células T regulatórias (Treg), conhecidas pela sua ação imunossupressora. Alguns trabalhos têm mostrado que mastócitos e células Treg podem se juntar para efetuarem uma boa resposta imunológica (Lu et al. 2006). Análise de células Treg in vitro mostrou que estas células produzem grandes quantidades de IL-9, fator de crescimento de mastócitos (Leavy 2006). 1.7- Classificaçãode Ridley-Jopling e a classificação operacional (OMS/MS-Brasil) A classificação clínica, imunológica e histopatológica proposta por Ridley & Jopling (1966) é considerada o método mais completo e criterioso de categorização das diferentes formas de hanseníase. Segundo Ridley e Jopling, a hanseníase pode ser classificada de acordo com suas características clínicas, imunológicas e histopatológicas em um espectro, variando de um polo imunologicamenre mais resistente, a hanseníase tuberculoide (TT), ao polo mais susceptível, a hanseníase lepromatosa (LL), com formas intermediárias: BT (borderline-tuberculoide), BB (borderline-borderline) e BL (borderline-lepromatosa) (Ridley & Jopling 1966, revisado por Scollard et al. 2006). Apesar disto, é utilizada uma classificação operacional simplificada para fins de tratamento dos pacientes nos serviços de rotina, recomendada pela OMS e pelo Ministério da Saúde do Brasil, ficando a classificação de Ridley e Jopling mais aplicada nas pesquisas (WHO 1988b, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Esta classificação operacional, visando definir o esquema detratamento com a MDT, é baseada no número de lesões cutâneas, de acordo com osseguintes critérios: paucibacilar são casos com até cinco lesões de pele e multibacilar casos com mais de cinco lesões de pele. A 42 baciloscopia de pele (raspado intradérmico), sempre que disponível, deve ser utilizadacomo exame complementar para a classificação dos casos como PB ou MB. A baciloscopia positiva classifica o caso como MB, independentemente do número delesões (WHO 1998b, Walker & Lockwood 2006, Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Na classificação de Ridley e Jopling (1966), a caracterização das formas é feita conforme descrito abaixo: Hanseníase Tuberculoide: é a forma mais localizada que se manifesta em pessoas com resposta imune celular exacerbada ao bacilo. Os pacientes com hanseníase TT apresentam uma única lesão ou poucas lesões, habitualmente menores que 10 centímetros, geralmente eritematosas, de limite bem definido. Podem ocorrer alterações nos nervos próximos à lesão causando dor, fraqueza e atrofia muscular. Também podem ser observados distúrbios de sensibilidade. As lesões TT apresentam bordas elevadas, ásperas, sem pelos e demonstram centro com sinais de regressão ou cura. A superfície da lesão é seca devido à deficiência da sudorese. A perda de sensibilidade e bordas bem definidas das lesões são sinais característicos da forma tuberculoide da hanseníase. A baciloscopia é negativa, forma provavelmente não contagiosa. Sob o ponto de vista histopatológico ocorre a formação de granuloma tuberculoide, constituído por um agregado de múltiplas células fagocitárias mononucleares com diferenciação epitelioide bem evidente e participação de células gigantes multinucleadas tipo Langhans no centro da lesão e presença de linfócitos contornando este granuloma. Os granulomas são bem desenvolvidos e compactos e estendem-se desde a derme profunda até a camada papilar, podendo inclusive atingir a camada basal da epiderme (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura & Pedrosa 2013). Hanseníase borderline-tuberculoide: manifesta-se por poucas lesões cutâneas, geralmente até cinco, eritematosas bem definidas e delimitadas. Esta forma geralmente apresenta um número maior de troncos nervosos acometidos e de lesões que a forma TT. A baciloscopia do esfregaço de raspado intradérmico/linga é negativa. Histopatologicamente, a forma BT apresenta lesões com granulomas mais frouxos que podem mostrar raros bacilos e granulomas formados por linfócitos e células epitelioides, geralmente localizadas na derme com presença de células gigantes tipo Langhans (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & 43 Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura & Pedrosa 2013). Hanseníase borderline-borderline: manifestação intermediária entre as formas tuberculoide e lepromatosa. Clinicamente a hanseníase BB pode se manifestar por poucas lesões amplas, sem limites precisos, elevadas e porosas. Em casos mais raros, a forma BB pode se manifestar por múltiplas lesões (mais de 5) bem delimitadas de borda eritematosa elevada e centro hipocrômico. A baciloscopia é positiva. Ao exame histopatológico são observados bacilos, com células epitelioides difusamente espalhadas, assim como granulomas tuberculoides, porém as células gigantes e linfócitos em geral são escassos e pode se observar edema intra e intercelular. Pode ser observada a faixa de Unna, que é uma faixa de fibras colágenas correspondente à derme papilar retificada, livre de células inflamatórias. (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura & Pedrosa 2013). Hanseníase borderline-lepromatosa: o paciente apresenta entre 5 a 10 lesões de pele mal delimitadas. As lesões podem se manifestar como pápulas, tubérculos, nódulos, placas, ulcerações e infiltração. Pacientes com a forma BL apresentam baciloscopia do esfregaço de raspado intradérmico/linfa positiva. Ao exame histopatológico a forma BL apresenta agrupamentos de macrófagos não ativados, que contêm grande número de bacilos em seu interior. Há raros linfócitos nas proximidades dos agrupamentos de macrófagos. Sempre ocorre a observação da faixa de Unna (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura & Pedrosa 2013). Hanseníase lepromatosa (LL): é considerada o polo anérgico da doença, na qual a RIC específica ao M. leprae encontra-se ausente e o bacilo se multiplica levando a um quadro disseminado. Pode haver um polimorfismo de lesões com pápulas, tubérculos, nódulos, placas, ulcerações e infiltração difusa da pele e as lesões têm limites imprecisos. Esta forma pode estar associada à atrofia muscular, inchaço das pernas e lesões na pele. Órgãos internos também podem ser acometidos pela doença. Nesta forma os pacientes apresentam mais de 10 (dez) lesões de pele. Máculas com bordas pouco definidas aparecem numa fase inicial da forma lepromatosa e são geralmente pequenas e numerosas. Lesões infiltradas surgem numa fase mais tardia e o infiltrado 44 inflamatório pode originar nódulos. Os nódulos aparecem geralmente nas orelhas, face, extremidades, articulações e, raramente, nas genitálias. Alguns pacientes não passam pela fase de máculas e os primeiros sinais notórios de hanseníase podem ser os nódulos, mais comuns nas orelhas. Na histopatologia mostra um infiltrado inflamatório celular composto de histiócitos multivacuolados, com o citoplasma carregado de bacilos e grandes quantidades de lipídios, conferindo o aspecto de células espumosas. Há raros ou nenhum linfócito nas proximidades dos grupamentos de macrófagos infectados. O infiltrado inflamatório não atinge a camada basal da epiderme, ficando separado dela pela faixa de Unna (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura & Pedrosa 2013). Um artigo recente descreve achado inusitado com aumento significativo de basófilos nas lesões da forma LL (Otsuka et al. 2012) A figura 9 (Scollard et al. 2006) ilustra as formas as 5 (cinco) formas clínicas, conforme a classificação esepctral de Ridley e Jopling. Figura 9. Espectro imunopatológico da hanseníase segundo Ridley-Jopling. 45 Histopatologia das diferentes formas histopatológicas da hanseníase na classificação de Ridley-Jopling, em secções coradas pela HE (painel superior) e Fite-Faraco (painel inferior). As infiltrações granulomatosas epitelioides bemformadas vistas em lesões polarestuberculoide (TT) tornam-se cada vez mais desorganizadas em direção ao polo lepromatoso (LL), onde são agregados de histiócitos espumosos completamente desorganizados, com apenas ocasionais linfócitos. Fonte: Scollard et al. 2006. The continuing challenges of leprosy. Clin Microbiol Rev. 1.8- Hanseníase e Genética Antes da descoberta do bacilo por Hansen em 1874, a hanseníase foi amplamente considerada como uma doença hereditária (revisado por Scollard et al. 2006).Ao longo das últimas décadas, a hanseníase vem sendo estudada por perspectiva talvez inesperada para uma doença infecciosa: modernos métodos de análise experimental têm sido empregados para evidenciar a importância do componente genético no controle da susceptibilidade do hospedeiro à hanseníase e seus fenótipos. A variabilidade genômica do M. leprae é mínima, e para as diferentes manifestações clínicas e a transmissibilidade tão baixa da doença, só fatores genéticos podem explicar tal diversidade. Esses estudos indicam que constituição genética favorável do hospedeiro, somada a fatores propícios, ambientais e relativos ao agente patogênico, tem alto impacto na definição da susceptibilidade tanto à infecção propriamente dita quanto na evolução clínica da doença. Hoje, diversos genes e regiões genômicas já foram relacionados ao controle da susceptibilidade à hanseníase. Outros estudos estão em andamento, visando ao avanço no entendimento das bases moleculares de controle da susceptibilidade do hospedeiro à doença. O conjunto de resultados desses estudos pode levar a formas mais eficazes de diagnóstico, tratamento e prevenção da hanseníase e outras doenças infecciosas. Todas as doenças comuns, pelo menos em parte, são genéticas. Rotberg, dermatologista brasileiro e estudioso da hanseníase, em 1937 sugeriu a possibilidade de ter um fator genético na susceptibilidade à doença, denominado Fator N, desconhecido (Prevedello & Mira 2007). 1.8.1- Predisposição genética e resposta imune inata para a hanseníase A maioria das pessoas que viveem áreas endêmicas da hanseníase já esteve exposta ao M. leprae, mas, apenas algumas delas desenvolvem a doença (0,1 a 46 1%)(revisado por Moraes et al. 2006). Por isso, a influência de fatores genéticos na resistência ou susceptibilidade à doença vem sendo investigada. Alguns autores sugeriram que pelo menos 2 diferentes genes deveriam controlar a resposta imune à hanseníase, atuando na susceptibilidade e na forma clínica da doença (de Vries et al. 1976, revisado por Scollard et al. 2006). A susceptibilidade à hanseníase é também influenciada por características ambientais, como o estado nutricional do hospedeiro, pelas taxas de exposição ao M. leprae e de vacinação com BCG. As taxas de proteção com a BCG são altamente variáveis entre as diferentes populações (Rodrigues 1992, Lockwood 2001, revisado por Moraes et al. 2006, Setia et al. 2006). Estudos em gemelares na Índia demonstraram que a doença é mais freqüente entre os monozigóticos do que nos dizigóticos tanto para a doença propriamente dita como para suas formas clínicas (revisado Prevedello & Mira 2007). A escolha dos genes candidatos para estudo genético não é tarefa fácil, uma vez que o genoma humano possui cerca de 30 a 40 mil genes. A seleção pode ser ao acaso, partindo de hipóteses (teste de hipótese) por estudos de associação ou caso-controle. Esta escolha geralmente é baseada em três critérios: possível papel do gene/produto na patogênese da doença; localização do gene em região genômica previamente identificada estar envolvida no controle da doença, ou a combinação das duas (revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira, 2007). Um dos mais extraordinários avanços no entendimento da hanseníase foi a identificação por Mira e colegas de um locus dentro do gene PARK2 / PACRG que está associado a susceptibilidade geral das populações humanas aoM. Leprae (Scollard et al. 2006). A análise de desequilíbrio de ligação da região candidata mostrou que 15 dos 17 SNPs associados estavam localizados em um único bloco, cobrindo a região reguladora compartilhada por dois genes: o gene do parkinsonismo juvenil autossômico recessivo (AR-JP), denominado Parquina (PARK2) e o gene PACRG (gene co-regulado com parquina). Uma análise de regressão logística multivariada detectou dois SNPs que capturavam completamente a informação de associação observada na região. Haplótipos definidos por estes dois tag SNPs estavam associados com aumento de até 5,28 vezes do risco de contrair hanseníase (Mira et al. 2003; Mira et al. 2004). A proteína SLC11A1 (solute Carrier family 11, member 1), também conhecida como NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein-1), está localizada na região 2q35 e tem papel no transporte de íons. O NRAMP foi descrito como o gene 47 envolvido na resistência/susceptibilidade a patógenos intracelulares em camundongos. Estudo realizado em famílias relatou ligação entre NRAMP1 e múltiplos casos de hanseníase (revisado por Mira 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira, 2007, revisado por Fava et al. 2012). 1.8.2- Predisposição genética e resposta imuneadquirida para a hanseníase Os principais genes relacionados à resposta imune investigados quanto à susceptibilidade à hanseníase foram os genes do sistema de antígenos leucocitários humanos (“Human Leucocyte Antigens”/HLA) e também genes que codificam importantes citocinas e que estão localizados fora do complexo HLA como TNFα, LTα, IL-10, IL-12/23. O complexo HLA é um conjunto de genes localizado no braço curto do cromossomo 6 região 6p21. Em geral, várias dessesestudos de sorotipagem sugeriram uma associação de HLA-DR2 e HLA-DR3 com hanseníase tuberculóide (paucibacilares) ou como sendo fatores de risco importantes na susceptibilidade a formas da hanseníase. Embora alguns estudos indicaram que uma associação de HLADR2 com hanseníase tuberculoide e virchowiana, nenhuma evidência convincente demonstrou uma associação da resposta virchowiana com qualquer outros loci HLAD(revisado por Mira 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira, 2007, Visentainer et al. 1997). Em estudo genômico entre indianos com predomínio da forma paucibacilar da hanseníase, encontrou-se associação da região cromossômica 10p13 com susceptibilidade à forma paucibacilar da doença (Siddiqui et al. 2001). Esse achado foi replicado através de estudo genômico realizado com população vietnamita. Este mostrou associação da região 6q25-q27 com susceptibilidade à hanseníase (Mira et al. 2003). O transportador associado de processamento do antígeno (TAP) é uma proteína composta de dois polipeptídeos, TAP1 e TAP2. Seus respectivos genes, localizados no cromossomo 6p21, dentro da região MHC classe II, entre HLA-DP e HLA-DQ. Funcionalmente, as proteínas TAP transportam peptídeos para o retículo endoplasmático em células apresentadoras de antígeno, onde eles são unidos ao MHC classe I para apresentação de antígenos. O gene TAP2 tem sido associado com a hanseníase tuberculoide, mas este gene situa-se tão perto de outros genes HLA, que interpretação dos resultados tem sido difícil e a importância deste achado é incerta e 48 espera por estudos mais detalhados (revisado por Mira et al. 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Scollard et al. 2006). Os genes do TNF estão localizados na região cromossômica da classe III do complexo MHC, região 6p21.3. O TNF-α é o gene que codifica o fator de necrose tumoral alfa, uma citocina pró-inflamatória que participa de vários processos biológicos, como a modulação da resposta imune, tanto inata quanto adaptativa. O TNF-α está envolvido na formação do granuloma, com controle da infecção por micobactéria e atua impedindo sua disseminação. Polimorfismo no gene TNF-α está associado tanto com susceptibilidade, quanto à resistência à hanseníase em populações de etnias distintas (revisado por Mira 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Scollard et al. 2006). O gene LTA codifica a linfotoxina alfa, que é uma citocina importante na modulação da resposta inflamatória, está localizado na região III do complexo MHC. Estudos encontraram forte evidência de associação entre alelos do gene LTA e susceptibilidade à hanseníase per se em populações do Vietnã do Sul (revisado por Mira 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira 2007). Estudos recentes mostram a influência de fatores genéticos no desencadeamento de reações hansênicas, quanto a presença de marcadores tipo SNPs no gene TLR1 em pacientes no Nepal, revelou que a presença do alelo 1805G estava associada à proteção contra a reação tipo 1 (revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Fava et al. 2012). Um estudo de polimorfismo tipo microssatélite no gene TLR2 com utilização de metodologia de caso-controle em pacientes na Etiópia, encontrou associação entre a presença de homozigose para a extensão alélica de 280pb e um risco aumentado de reação tipo 1 e o alelo -597T como protetor. Estes dados sugerem um papel significativo para TLR2 na ocorrência da reação de reversão (Bochud et al. 2008). O gene VDR (receptor de vitamina D) está localizado no 12q12-q14 e é responsável pelos efeitos biológicos da vitamina D. A forma ativa da vitamina D induz a diferenciação de monócitos, enquanto a ativação macrofágica através do VDR, em combinação com TNFα e IFNγ, é responsável pela destruição do M. tuberculosis (Montoya et al. 2009). Em estudo feito na população indiana encontrou-se associação entre o gene VDR e a hanseníase e detectou-se a susceptibilidade à forma LL e TT na presença dos genótipos TT e tt respectivamente (revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira, 2007, revisado por Fava et al. 2012). Um estudo casocontrole de gene candidato a susceptibilidade da lepra, com trinta e oito sítios 49 polimórficos de 13 genes foram investigados pelo seu papel na susceptibilidade a hanseníase comparando 270 casos com 452 controles no distrito de Karonga, norte do Malawi. Homozigotos para a variável T→C silenciosa no códon 352 do gene do receptor da vitamina D pareciam ser de alto risco, enquanto os homozigotos para o grupo de sangue b McCoy definindo a variante K1590E no gene exon 29 do receptor do complemento 1 (anteriormente CD35) parecia ser protetor (Fitness et al. 2004). O polimorfismo de VDR não está associado a fenótipos da hanseníase (Sapkota et al. 2010). Estudo por genotipagem de associação de dois estágios de doenças, testou três conjuntos de replicação independente para uma associação entre a presença da hanseníase e 93 polimorfismos de nucleotídeos simples, que foram mais fortemente associados com a doença no estudo de associação e testes de heterogeneidade das associações (ou falta dela), estratificadas de acordo com o subtipo clínico (multibacilar vs paucibacilares). Observou-se uma associação significativa entre SNPs nos genes CCDC122, C13orf31, NOD2, TNFSF15, HLA-DR e RIPK2 e uma tendência para uma associação com um SNP no LRRK2. As associações entre os SNPs em C13orf31, LRRK2, NOD2 e RIPK2 e hanseníase multibacilar foram mais fortes do que as associações entre esses SNPs e hanseníase paucibacilar. Variantes de genes da via de sinalização mediada por NOD2 (que regula a resposta imune inata) estão associadas com susceptibilidade à infecção por M. leprae (Zhang et al. 2009, revisado por Fava et al. 2012) Devido à importância da resposta imune na hanseníase e, sobretudo, no desencadeamento das reações hansênicas, os genes candidatos mais estudados têm sido os genes das citocinas e de outras moléculas marcadoras importantes no contexto imunológico (Moraes et al, 2006). Presença de polimorfismos tipo SNPs em diferentes genes que codificam para citocinas têm sido descritos e associados com doenças. Os episódios reacionais são a principal causa de incapacidade física permanente associada com hanseníase e representam um grande desafio no manejo clínico dos pacientes. Dado o impacto que a etnia tem sobre o risco de desenvolver episódios reacionais, fatores genéticos do hospedeiro que podem contribuir para os episódios reacionaistêm sido descritos. Polimorfismos em sete genes [receptores do tipo Toll (TLR)1, TLR2, domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeos contendo 2 (nucleotide-binding oligomerisation domain containing 2), receptor de vitamina D, proteína 1de macrófagos 50 associada à resistência natural, C4B e interleucina-6] foram associados com episódios reacionais (revisado por Fava et al. 2012). Estudos de uma coorte de 409 pacientes com hanseníase do Brasil central, monitorados para RT1 e RT2, mostraramevidências de associação entre RT2 e IL-6 rs2069832 de polimorfismos de nucleotídeo único tag, rs2069840, e rs2069845, com informações sobre o locus inteiro de IL-6, bem como funcional rs1800795 variante do IL-6. Além disso, os níveis plasmáticos de IL-6, em pacientes com RT2, correlacionaram com genótipos de IL-6. Nenhuma associação foi encontrada entre as variantes de IL-6 e T1R (Sousa et al. 2012, revisado por Fava et al. 2012). 1.9- O diagnóstico da hanseníase O diagnóstico da hanseníase ainda é baseado na identificação de sinais clínicos dermato-neurológicos da doença, mas testes laboratoriais como o exame histopatológico da lesão e a baciloscopia podem auxiliar no diagnóstico da hanseníase (Ridley & Jopling 1966, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). A definição de caso de hanseníase é uma pessoa com sinais cardinais (clínicos) da doença e que não foi submetida ao tratamento específico ou que requer tratamento quimioterápico. Os sinais cardinais são: diminuição da sensibilidade em área ou lesão cutânea; espessamento neural periférico e/ou presença de BAAR em pele, baciloscopia positiva (WHO 1988a, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). A classificação espectral de Ridley e Jopling é importante para o melhor entendimento da doença e para seu tratamento adequado, mas não é utilizada em centros de saúde, que adotam os critérios simplificados da OMS e MS/Brasil, classificando os pacientes em paucibacilares e multibacilares, simplesmente pelo número de lesões. Tal simplificação é inaceitável para os Centros de Referência em assistência, ensino e pesquisa em hanseníase, de modo que é recomendada a padronização pela classificação de Ridley-Jopling. Devido ao potencial dano neural, com risco de incapacidades, e o estigma da hanseníase, a correta classificação histopatológica é mandatória para permitir ao médico uma compreensão do espectro da doença e seu prognóstico, favorecendo assim uma conduta terapêutica adequada e o acompanhamento do paciente (Ridley & Jopling 1966, Costa et al, 2001, Scollard 2004, Pardillo et al. 2007, Teixeira et al. 2008, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Onde estiver disponível é recomendável a complementação diagnóstica com outros métodos, como: a baciloscopia, a biópsia da lesão cutânea com estudo 51 histopatológico, sorologia, entre outros (Teixeira et al. 2008, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). 1.9.1- Baciloscopia A baciloscopia é o exame complementar mais importante e específico na hanseníase para identificar o agente causal, porém, é negativo nas formas paucibacilares e em alguns pacientes multibacilares, necessitando, ainda, para sua execução de infraestrutura laboratorial e de profissionais capacitados, inexistentes na maioria dos serviços de atenção básica (Lyon et al. 2008). É o exame microscópico onde se pesquisa BAAR nos esfregaços de raspados intradérmicos das lesões suspeitas de hanseníase, lóbulos auriculares e/ou cotovelos, corados pela técnica de Ziehl-Neelsen (Ridley 1955, Ridley & Jopling 1966, Leiker & McDougall 1987, Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Brasil/Ministério da Saúde 2010a, Brasil/Ministério da Saúde 2010b). A pesquisa de BAAR em muco nasal foi proscrita pela OMS, pois pode gerar falsos positivos e negativos. A carga bacilar é expressa como um índice baciloscópico (IB) que relata o número de bacilos por campo microscópico em escala logarítmica (revisado por Leiker & McDougall 1987, Ponnighaus et al. 1987, Brasil/Ministério da Saúde, 2010b). A baciloscopia é geralmente negativa nas formas tuberculoides, positiva nas formas borderline e fortemente positiva nas formas lepromatosas, por isso a baciloscopia negativa não afasta o diagnóstico da hanseníase (Ridley & Jopling, 1966, Lyon et al. 2008). Geralmente o material de quatro sítios (lóbulos auriculares, cotovelos e/ou lesão) é analisado e a carga bacilar é expressa pelo IB médio dos quatro sítios analisados (Leiker & McDougall 1987, Brasil/Ministério da Saúde, 2002, Brasil/Ministério da Saúde, 2010b). Independente do número de lesões do paciente, quando a baciloscopia for positiva, o mesmo é classificado com multibacilar (Brasil/Ministério da Saúde, 2010b). 1.9.2- Biópsia e exame Histopatológico O exame histopatológico baseia-se na análise microscópica de preparados histopatológicos das biópsias de lesões cutâneas e nervos, com o estudo dos espécimes para verificar infiltrado inflamatório, presença de granulomas, agressão neural, presença de bacilos álcool-ácido resistentes, vasculite na derme e/ou hipoderme, paniculite, estratificação e espessamento de tecidos. A descrição dos achados histopatlógicos 52 característicos de cada forma clínica do espectro, foi descrita anteriormente, nesta introdução. Entre as formas clínicas do espectro há infinitos pontos entre um polo e outro, o que dificulta a classificação dos pacientes. (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Fleury 2006, Job & Chandi 2001). Tanto a baciloscopia, quanto o exame histopatológico não são exames preconizados pela OMS para o diagnóstico da hanseníase, por isso não são realizados de forma rotineira pelos serviços de saúde pública (WHO 2005, Costa et al, 2001, Fleury 2006), ou seja, na rotina operacional os pacientes são classificados baseados apenas no número de lesões. Estudo realizado na Índia e outros mostram altos índices de diagnósticos falsos positivos (Single-lesion Multicentric Trial Group 1997, Pardillo et al. 2007). Estudo que avaliou a concordância entre o diagnóstico clínico e o da hanseníase, utilizando os resultados de biópsias, a concordância diagnóstica clínico-histopatológica foi de 67,6%. A maior concordância foi obtida para a forma V, e a menor para a forma I. A maior discrepância diagnóstica ocorreu para a forma BB (Teixeira et al. 2008). 1.9.3- Biologia Molecular A identificação do DNA do M. leprae pela reação em cadeia de polimerase (PCR) específica (ML-PCR) pode ser realizada com vários tecidos e fluidos biológicos como: sangue, secreção nasal e linfa, porém, fragmentos de biópsia de pele e de nervos parecem ser os materiais biológicos de maior sensibilidade para a amplificação do DNA do M. leprae (Gillis & Williams 1991, Santos et al. 1993). A técnica de PCR tem mostrado especificidade de 100% e sensibilidade variando de 34-80% em pacientes com forma paucibacilar e taxa de sensibilidade acima de 90% em pacientes com forma multibacilar (revisado por Scollard et al. 2006). Os testes com ML-PCR geralmente apresentam uma positividade em torno de 95% em pacientes multibacilares, mas dificilmente alcança 50% em pacientes paucibacilares (Gillis and Williams 1991, Santos et al. 1993, Stefani et al 2003, Truman et al. 2008). Diferentes genes específicos do M. leprae são utilizados como alvo da amplificação por PCR (Santos et al. 1993), gene LSR/A15 que codifica o antígeno de 15 kDa (Misra et al. 1995), o fragmento de 360 pb do gene que codifica a proteína de 18 kDa (Williams et al. 1990; Scollard et al. 1998; Stefani et al. 2003, revisado por Scollard et al. 2006), entre outros. 53 A ML-PCR não é recomendada como teste diagnóstico da hanseníase (WHO, 2005) e requer para sua realização, equipamentos e infraestrutura de alto custo, por isso continua sendo mais um instrumento de pesquisa (Sousa et al. 2007). 1.9.4- Estudos Sorológicos O desenvolvimento de métodos laboratoriais para auxiliar o diagnóstico ou classificação das diversas formas clínicas da hanseníase é uma das prioridades em pesquisa na área. No campo do sorodiagnóstico, a detecção de anticorpos IgM antiPGL-I, permanece como o melhor padronizado e mais avaliado teste em hanseníase. (revisado por Stefani 2008). O ideal no diagnóstico nos serviços de saúde seriam testes que possam ser realizados com recursos laboratoriais mínimos e sem necessitar de mão de obra especializada, de leitura simples, objetiva e rápida, para serem utilizados no ponto do atendimento (“point of care”, POC), facilitando o diagnóstico e a classificação da hanseníase em PB e MB. 1.9.4.1- Sorologia anti-PGL-I e outras proteínas ou peptídeos do M. leprae A sorologia anti-PGL-Ié um teste altamente específico para hanseníase, e a presença de anticorpos no soro correlaciona-se com o índice bacteriano. Esta baseia-se na detecção de anticorpos IgM anti-PGL-I, e não apresenta reação cruzada com M. tuberculosis (Cho et al. 1983). O PGL-I é um componente de parede celular, exclusivo do M. leprae, que constitui cerca de 2% da massa total bacteriana, cuja estrutura é composta de um mono, di ou trissacarídeo, fenol, fitiocerol e de ácido micoceosídico (Hunter and Brennan 1981, Stefani et al. 1998, revisado por Scollard et al. 2006, Bührer-Sékula et al. 2008). Outros estudos propuseram a produção de análogos sintéticos do PGL-I, da porção mono, di ou trissacarídea associados a carreadores hidrossolúveis (BSA/HSA), ecomo monossacarídeo–octyl–BSA (M-O-BSA), dissacarídeo natural-octyl–BSA (ND– O–BSA), dissacarídeo natural-octyl–HSA (ND-O-HSA), trissacarídeo natural-phenil– BSA (NT-P-BSA) e o trissacarídeo natural-phenil– HSA (NT-P-HSA). Estes antígenos são utilizados atualmente por diversos grupos de pesquisa em hanseníase (BührerSékula et al. 2000). A sorologia anti-PGL-I possui baixa sensibilidade para pacientes paucibacilares, pois forma-se um baixo título desses anticorpos, além de que em áreas endêmicas uma proporção de indivíduos saudáveis pode ser anti-PGL-I positiva (Stefani et al. 1998, 54 revisado por Stefani 2008). A sensibilidade do teste anti-PGL-I é de até 98% em pacientes MB e de cerca de 30% em pacientes PB (Bührer-Sékula et al.2003, BührerSékula et al.2008). Com a morte do M. leprae pelo uso da MDT, a síntese de PGL-I é cessada e o antígeno é eliminado do organismo, consequentemente os níveis de anticorpos declinam (Silva et al. 2008). Por isto, os títulos de IgM correlacionam-se com a forma clínica, carga bacilar e a atividade da doença, e apresentam significante declínio em decorrência do uso da MDT, sendo útil no seguimento do paciente, para controle de cura ou monitorar recidiva, onde há aumentos dos títulos (Bührer-Sékula et al. 2008). Alguns estudiosos defendem ouso do anti-PGL-I em associação com parâmetros clínicos para classificação e monitoramento dos pacientes multibacilares e não como ferramenta diagnóstica única das formas multibacilares de hanseníase. Os resultados da sorologia anti PGL-I podem ser úteis para a classificação/diferenciação de pacientes MB/PB e podem contribuir para decisões terapêuticas adequadas (Bührer-Sékula et al. 2007).A detecção rápida de anticorpos anti-PGL-I pode ser feita por método do fluxo lateral (“MLflow”), que possue especificidade e sensibilidade semelhante ao método de ensaio imunoenzimático(“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” ELISA) anti-PGL-I e apresenta maior facilidade de execução (Bührer-Sékula et al, 2003, Bührer-Sékula et al, 2008, Stefani et al. 2012).O teste dipstick, POC, para detecção de anticorpos antiPGL-I que fornece resultados em 3 horas e apresenta 97.2% de concondância com os resultados do ELISA, e não requer equipamentos sofisticados nem reagentes refrigerados. Já no fluxo lateral o resultado é imediato e feito com sangue total, em qualquer local onde estiver o paciente (Bührer-Sékula et al. 1998). A presença de anticorpos anti PGL-I em contatos domiciliares de pacientes MB é considerada fator de risco para desenvolvimento de hanseníase. Contatos que apresentam anticorpos anti PGL-I tem oito vezes mais risco de desenvolver hanseníase do que contatos soronegativos. Entre os contatos soropositivos para o PGL-I o risco de desenvolver hanseníase do tipo MB é de 34 vezes (revisado por Scollard et al. 2006). O seguimento dos contatos de pacientes MB pode permitir o diagnóstico precoce e a quimioprofilaxia deste grupo de risco poderia prevenir a transmissão da hanseníase. (Oskam & Bührer-Sékula 2003). Num seguimento de 5 (cinco) anos, observou-se que 2% dos contatos de MB desevolveram a hanseníase e apresentaram um risco de 3,8 de desenvolver a doença (Goulart et al. 2008). 55 O genoma do M. leprae (Leproma), cujo sequenciamento foi finalizado em 2001, possui 1605 genes codificadores de proteínas em um total de 3.268.203 pb. Aproximadamente 165 destes genes codificadores de proteínas nãopossuem ortólogo em Mycobacterium tuberculosise mais da metade dos genes do M. tuberculosis está ausente no genoma do M. leprae (Cole et al. 2001). O sequenciamento genômico completo do M. leprae representou um avanço na elucidação da biologia deste bacilo e abriunovas possibilidades de identificação de antígenos que possam ser utilizados como reagentes para diagnóstico ou vacina para a hanseníase (Aseffa et al. 2005). Desde o sequenciamento do genoma do M. leprae, vários laboratórios de pesquisa examinaram cerca de 200 proteínas recombinantes (Geluk et al. 2011), quanto a reatividade humoral e celular e quanto ao potencial uso no desenvolvimento de testes “point of care”. Estes testes poderiam contribuir para a classificação de pacientes com hanseníase (PB/MB), triagem de indivíduos saudáveis e de contactantes de MB com alto risco de adoecimento e permitir o diagnóstico precoce e monitorização do tratamento. Recentemente vários estudos, baseados em sequências genômicas, têm identificado novas proteínas ou peptídeos específicos do M. leprae, que são apropriados para o sorodiagnóstico da hanseníase. Diferentes estudos têm avaliado a imunorreatividade de várias proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com hanseníase e controles. Estas podem ser associadas ao teste com o PGL-1, na tentativa de melhorar a sensibilidade do mesmo para os pacientes PB (revisado por Stefani 2008). Mais recentemente, testes sorológicos (ELISA) para detecção de anticorpos da classe IgG contra proteínas recombinantes do M. leprae tem revelado novos antígenos candidatos ao uso no diagnóstico sorológico da hanseníase, especialmente para pacientes com hanseníase MB (Duthie et al. 2007, Geluk et al. 2009, Corstjens et al. 2011,Duthie et al. 2010). Dentre as proteínas avaliadas, ML0405, ML2331 e ML2055 demonstraram altas taxas de reconhecimento por pacientes LL/BL. Pacientes com tuberculose e controles saudáveis não endêmicos mostraram baixa reatividade sorológica. No polo paucibacilar da doença baixas taxas de reconhecimento foram encontradas, assim como nos contatos de pacientes MB (Geluk et al. 2010, Geluk et al. 2011, Geluk 2013). O diagnóstico precoce da hansneíase reduz a transmissão e sequelas dos pacientes, Apesar da redução da prevalência da hanseníase em todo o mundo, como resultado do uso generalizado de poliquimioterapia, a incidência permanece relativamente estável, mostrando que há transmissão e o diagnóstico é feito tardiamente 56 (Duthie et al. 2010, Geluk et al. 2010, Geluk 2013,Richardus et al. 2013). Com a finalidade de desenvolver uma alternativa diagnóstica eficaz, simples, rápida e barata, foi analisada a resposta sorológica de anticorpos para identificar proteínas de M. leprae, que são reconhecidas pelos pacientes de hanseníase. Uma nova proteína de fusão, baseado em estudos anteriores, foi construída unindo as proteínas ML0405 e ML2331, denominada LID-1 (Leprosy IDRI Diagnostic). Esta foi testada em diferentes populações (Brasil, Filipinas e Japão) para ver a influência da localização geográfica no reconhecimento dos antígenos. A LID-1 manteve a atividade diagnóstica e era capaz de diagnosticar casos de hanseníase com 6 a 8 meses antes do início dos sintomas clínicos.A taxa de reconhecimento de LID-1 foi de 87% entre os MB e 20% entre os PB, indicando grande potencial para o uso de LID-1 para o diagnóstico da hanseníase MB. Entre os controles endêmicos apenas 4% foram sororeativos para esta proteína de fusão. O aumento dos anticorpos anti LID-1 foi maior do que os anticorpos anti PGL-I, indicando que LID-1 poderia fornecer um diagnóstico mais precoce da hanseníase (Duthie et al. 2007). Outro estudo, mais de 100 antígenos recombinantes foram analisados em um formato de matriz de proteína para selecionar aqueles com propriedades discriminatórias para diagnóstico de hanseníase. O estudo foi com a metodologia ELISA e os dados deste indicam que os pacientes multibacilares podem ser distinguidos de pacientes paucibacilares, e ambos estes grupos podem ser separados de grupos de controle endêmico. Foi demonstrado o desempenho destes antígenos em formatos de teste rápido com o objetivo de desenvolver um teste de diagnóstico“point-of-care” (Duthie et al. 2008). Estudo posterior, foi projetada e produzida uma proteína de fusão quimérica com multiepítopos, a proteína para o diagnóstico rápido da hanseníase (“protein advances diagnostic of Leprosy” [PADL]), a partir da fusão dos epítopos reativos de proteínas recombinantes do M. leprae (ML0405, ML2311, ML2055, ML0049, ML0050 ML0091 e ML0411). A proteína foi avaliada em soro de pacientes com hanseníase MB e PB de São Paulo/Brasil e de Cebu/Filipinaspacientes com hanseníase MB e PB e controles endêmicos. Foi demostrado que todas as porções da proteína mantinham sua capacidade de ligação a anticorpos e a proteína oferecia grande acurácia no diagnóstico de pacientes MB. Entre os controles saudáveis endêmicos não foi observada resposta para PADL. Entretanto, outros estudos devem ser realizados para avaliar se PADL pode fornecer o diagnóstico precoce da hanseníase (Duthie et al. 2010). 57 1.9.4.2- Avaliação da imunidade celular a peptídeos e proteínas recombinantes do M. leprae Os testes que avaliam a imunidade humoral têm pouca relevância para o diagnóstico dahanseníase PB, já que esta apresenta resposta de anticorpos fraca ou ausente. Estudos que utilizam a detecção de IFN-γ, como marcador de imunidade celular, após estímulo de células sanguíneas com proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos do M. leprae, têm o objetivo de desenvolver um método diagnóstico para hanseníase PB. A secreção de IFN-γ em resposta a proteínas e peptídeos do M. leprae é observada tipicamente em pacientes TT/BT, contatos domiciliares e controles endêmicos (Duthie et al. 2008a; Geluk et al. 2005; Geluk et al. 2009; Geluk et al. 2010; Sampaio et al. 2011; Geluk et al. 2012; Sampaio et al. 2012, Geluk 2013). Ensaios baseados na liberação de IFN-γ (“Interferon-Gamma Release Assays” IGRAs) foram desenvolvidospara o diagnóstico de TB latente. Estes se baseiam na detecção de IFN-γ após estimulação com os antígenos ESAT-6, CFP-10 e TB7.7, que são expressos especificamente no M. tuberculosis. Existem dois IGRAs no mercado para diagnóstico de tuberculose latente: “QuantiFERON-TB Gold In-Tube assay” e “TSPOT.TB assay”(Cattamanchi et al. 2011).De modo semelhante tem se buscado o desenvolvimento deIGRAs para o diagnóstico da hanseníase PB. Neste sentido os homólogos de ESAT-6 e CFP-10 na tuberculose, a ML0049 e a ML0050 na hanseníase, respectivamente, presentes no M. leprae foram testados e houve reconhecimento destes antígenos por células T de pacientes com tuberculose, limitando o potencial uso destes antígenos em áreas endêmicas para TB (Geluk et al. 2009, Geluk 2013). Pesquisadores avaliaram a imunorreatividade celular a 4 proteínas recombinantes do M. leprae e a 58 peptídeos sintéticos em pacientes com hanseníase e grupos controles do Brasil, a partir da detecção de IFN-γ em sobrenadantes de cultura de células sanguíneas polimorfonucleares de sangue periférico (PBMC). Dos 58 peptídeos testados, 35 induziram respostas com produção de IFN-γ somente nos grupos paucibacilares e contactantes (Spencer et al. 2005). Estudo que avaliou estratégias para aumentar a sensibilidade do ensaio de sangue total com dois peptídeos (p1-15 e 11-25) da proteína ML2531 pela adição de citocinas, adição de anticorpos anti CD49, CD28, CD40, IL-10 ou CD40L e pela manosilação de peptídeos, demonstrou que somente a citocina IL-12 aumentou a 58 produção de IFN-γ em cultura de sangue total em amostras de pacientes com hanseníase BT da Holanda. Diferente do esperado, nenhum dos anticorpos teve impacto no aumento da secreção de IFN- γ pelas células T. A manosilação não aumentou a sensibilidade do ensaio, entretanto permitiu utilizar uma quantidade 100 vezes menor dos peptídeos, diminuindo o custo do teste (Geluk et al. 2010). Estudo do nosso grupo avaliou um painel de proteínas recombinantes de M. leprae para avaliar as respostas de células T, medida pela produção de IFN-γ, entre os pacientes de hanseníase. O estudo foi com ensaios simples de sangue total, que são mais aplicáveis no campo ou situações clínicas. As respostas de células Tno WBA de indivíduos de Goiânia-Brasil demonstraram que vários antígenos de M. leprae (ML0276, ML0840, ML1623, ML2044 e 46f) suscitaram produção de IFN-γ maior que 0,5 UI/ml e estas proteínas foram classificados como imunogênicas e hanseníase específica. Vários destes antígenos individuais foram reconhecidos por células emmais de 60% dos pacientes PB e ML0276, ML0840, ML1623 e 46f complementavam uma a outra, tal que 82% dos pacientes PB tinham respostas fortes (IFN-γ > 1,25 UI/ml) para pelo menos uma destas proteínas. Mas, estas proteínas também foram reconhecidas por parte significativa dos contatos familiares dos pacientes MB, em contraste, com poucas respostas observadas em pacientes com tuberculose ativa ou grupos de controle saudável de áreas de endemicidade. Os resultados indicam vários antígenos são potenciais candidatos que podem ser úteis para o diagnóstico de hanseníase ou vacinação e demonstra a utilidade da hanseníase WBA que pode ser aplicado amplamente em contextos clínicos ou de campo (Duthie et al. 2008). Outro estudo do nosso grupo de pesquisa comparou paralelamente a resposta de anticorpos e de células T, produção de IFN-α, de pacientes com hanseníase MB e PB, contatos domiciliares de pacientes MB, controles saudáveis de área endêmicas e pacientes com TB pulmonar provenientes de Goiânia/Goiás. Um painel de 33 proteínas recombinantes foi avaliado quanto à imunogenicidade e especificidade da resposta por meio de ELISA e ensaio de sangue total. Destas 33 proteínas avaliadas, 16 delas foram imunogênicas e estimularam a produção de IFN-α em pacientes PB e contatos domiciliares ou foram reconhecidas por anticorpos IgG de pacientes com hanseníase MB. As proteínas ML0405, ML2331 e ML2055 foram reconhecidas por anticorpos e por resposta imune celular específica para o M. leprae. As proteínas ML1632, ML1685, ML1556, ML2044, ML0276 e ML0840 foram imunogênicas, entretando somente a resposta de IFN-α foi específica. As proteínas ML2358, ML2346, ML2541, ML2603, 59 ML0022, ML2380 e ML2203 foram imunogênicas, mas houve reconhecimento por anticorpos e produção de IFN-α em todos os grupos testados, ou seja, eram proteínas imunogênicas, mas seu reconhecimento foi inespecífico. As outras 17 proteínas avaliadas foram não imunogênicas, não reagiram no ensaio de sangue total nem no ELISA para detecção de IgG. O número de proteínas capazes de estimular a resposta de IFN-α foi superior ao número de proteínas que foram reconhecidas por anticorpos IgG. A análise paralela da resposta imune celular e humoral a estas proteínas permitiu concluir que somente proteínas que foram capazes de induzir imunidade celular/IFN-α foram também reconhecidas por anticorpos. Além disso, os resultados deste estudo mostraram que as análises in silico não devem ser o único critério para exclusão de antígenos, visto que proteínas com alta homologia com proteínas de outras micobactérias não apresentaram reatividade cruzada. Por exemplo, a proteína ML2331 apresentou mais de 80% de homologia com várias proteínas de outras micobactérias, entretanto quando avaliada não apresentou reatividade cruzada na resposta imune humoral e celular. Por outro lado a proteína ML2346 que não apresentou homólogo em M. tuberculosis nem em outras micobactérias ambientais apresentou reatividade cruzada, estimulando resposta de IFN-α em todos os grupos avaliados (Sampaio et al. 2011). Como a resposta de IFN-α para as proteínas e peptídeos do M. leprae é praticamente idêntica entre os casos TT/BT e contatos domiciliares, outros biomarcadores que sejam capazes de distinguir estes dois grupos tem sido investigados. Em recente estudo nosso grupo de pesquisa analisou 14 biomarcadores (eotaxina, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-15, IL-17A, IL-23, IL-31, CXCL10 (IP10)e TNF-α) em pacientes com hanseníase PB e MB e em contatos de pacientes MB. Neste estudo, nenhum destes biomarcadores foi capaz de distinguir a resposta de pacientes com hanseníase TT/BT da resposta de contatos domiciliares de pacientes MB, confirmando resposta com perfil Th1 em ambos os grupos. Houve produção de IL-4 em ensaio de sangue total de pacientes BL/LL. Entretanto, um contactante de paciente MB apresentou resposta imune do tipo Th2 e ausência de IFN-γ, o que poderia indicar doença MB inicial ou subclínica. A confirmação deste achado é essencial para determinar o valor prognóstico deste imunomarcador (Sampaio et al. 2012). Outro estudo recente de biomarcadores, avaliou a resposta a 17 proteínas recombinantes e 19 biomarcadores (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12p70, IL-13, IL-17A, IFN-γ, CXCL10, FSC-G, FSC-GM, MCP-1, CXCL9, MIP-1β e 60 TNF-α), com o objetivo de encontrar biomarcadores que distinguissem controles endêmicos de pacientes TT/BT. Foram avaliadospacientes com hanseníase PB, contatos domiciliares, pacientes com TB pulmonar e controles endêmicos provenientes do Brasil (Fortaleza), Bangladesh, Coréia do Sul e Etiópia. Apenas, a proteína ML2478 foi capaz de estimular resposta de células T específica em grupos geneticamente diversos (Africano, Asiático e da América do Sul). A citocina IL-1β e as quimiocinas MIP-1β e MCP-1 foram capazes de diferenciar pacientes TT/BT e controles endêmicos. Entretanto, foi observada resposta entre contatos domiciliares e em pacientes com tuberculose (Geluk et al. 2012). Os resultados de vários estudos que pesquisaram a resposta imune celular de pacientes com hanseníase e grupos controles a peptídeos sintéticos e proteínas recombinantes do M. leprae são de extrema importância, pois abrem caminho para a realização de novas pesquisas que buscam testes sensíveis e específicos para serem utilizados no diagnóstico de rotina da hanseníase, além de antígenos candidatos ao desenvolvimento de uma vacina contra a hanseníase(Geluk et al. 2009, Duthie et al. 2008, Duthie et al. 2010, Sampaio et al. 2011, Geluk et al. 2012, Sampaio et al. 2012). 1.9.4.3- Testes cutâneos para avaliação da imunidade celular ao M. leprae O teste cutâneo para avaliação da imunidade celular ao M. lepraemais utilizado em hanseníase foi o da lepromina ou Reação de Mitsuda, que é uma reação de hipersensibilidae tardia aos antígenos M. leprae, e é associado com a capacidade de desenvolver uma resposta imune granulomatosa, envolvendo células apresentadoras de antígeno e participação de linfócitos CD4. A lepromina de Mitsuda consiste de bacilos autoclavados e cada ml da solução de contém 4,0x10 7(40 milhões) de BAAR (WHO 1989a). O teste é feito com injeção intradérmica de 0,1 ml da solução aplicado na face ventral do antebraço, e a leitura da reação é feita 24 a 28 dias após a aplicação. O teste positivo é aquele que mostra induração igual ou maior que 4,0 mm, e o ideal é que também fosse avaliada a resposta por biópsia e exame histopatológico do local do teste (WHO 1989a, revisado por Talhari & Neves 1997, revisado por Scollard et al. 2006). O teste de Mitsuda não serve para ser utilizado no diagnóstico da doença, pois não é específico para a hanseníase devido a forte reatividade cruzada com micobactérias ambientais não patogênicas e a vacinação BCG e pode apresentar respostas positivas em indivíduos que nunca foram expostos ao M. leprae (WHO 1989a, revisado por Talhari & Neves 1997, Geluk et al 2012). Na hanseníase PB, o teste cutâneo é, na maioria das 61 vezes positivo, enquanto que pacientes LL tipicamente não apresentam resposta, ou seja, são negativos ao teste. Embora a resposta à lepromina de Mitsuda não seja específica para a hanseníase, uma resposta negativa é associada a forma MB, sem capacidade para responder ao M. leprae e de eliminar os bacilos (revisado por Scollard et al. 2006, Goulart et al. 2008, revisado por Geluk et al. 2012). Atualmente, o teste de Mitsuda (intradermorreação de Mitsuda) não está mais previsto nas rotinas dos serviços públicos de diagnóstico e tratamento da hanseníase. O Guia de Controle da Hanseníase, de 1993, ainda ensinava a sua execução (Brasil/Ministério da Saúde 1993). 1.9.4.4- Outros meios auxiliares de diagnóstico O comprometimento de nervos periféricos é uma constante nos casos de hanseníase, devendo ser investigado para corroborar os achados clínicos e afastar ou confirmar a doença como causa da mesma. A eletroneuromiografia é um exame complementar e não estabelece o diagnóstico etiológico, mas neuropatia múltipla em área endêmica, até que se prove o contrário pode ser hanseníase. Esta pode ser importante na orientação dos atos cirúrgicos de descompressão neural, localizado o processo e também no estabelecimento de ramos nervosos a serem biopsiados para diagnóstico das formas neurais puras (Coelho 2013). 1.10 – Diagnósticos Diferenciais Os diagnósticos diferenciais em hanseníase são numerosos, tanto no aspecto clínico quanto histopatológico, sendo assunto para livros específicos. Daí também a necessidade de uma classificação acurada, não apenas baseada em critérios clínicos, que levam a inúmeros erros de diagnóstico e terapias intempestivas e incorretas (Ridley & Jopling 1966, Single-lesion Multicentric Trial Group 1997, Scollard 2004, Pardillo et al. 2007, Teixeira et al. 2008, Job & Chandi 2001, Manifold & Marshman 2009). A banalização do diagnóstico é feita com a classificação da OMS e MS/Brasil, baseada no número de lesões. A hanseníase pode ser confundida clinicamente com outras doenças de pele e com outras doençasneurológicas que apresentam sinais e sintomas semelhantes aos seus. Portanto, deve serfeito diagnóstico diferencial em relação a essas doenças. Existem doenças que provocam lesões de pele semelhantes às lesões característicasda hanseníase, e que podem ser confundidas com as mesmas. Afirmação leviana encontra- 62 se no Guia 2002/MS/Brasil: “A principal diferença entre a hanseníase e outras doenças dermatológicas é que as lesõesde pele da hanseníase sempre apresentam alteração de sensibilidade. As demais doençasnão apresentam essa alteração”(Brasil/Ministério da Saúde 2002). Há um alforisma em medicina que diz: “em Medicina e no amor, nem sempre nem nunca”. Alteração de sensibilidade nem sempre está presente na hanseníase, como nas lesões da face, ou mesmo são muitos subjetivas e por vezes de difícil caracterização clínica. As principais doenças de pele que fazem diagnóstico diferencial com hanseníase são: pitiríase versicolor (pano branco), eczemátide, tinha do corpo, vitiligo, esclerose tuberosa, nevo acrômico, eczemas, psoríase, lúpus vulgar, pitiríase rósea, lintomas cutâneos, xantomatose, esclerodermia, granuloma anular, sarcoidose, sífilis, leishmaniose cutânea, neurofibromatose, etc (Guinto et al. 1986, Opromolla& Ura 2002, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Walker & Lockwood 2007, Samapio & Rivitti 2011). O diagnóstico diferencial também deve ser feito em relação a outras doenças neurológicas, como: a síndrome do túnel do carpo, neuralgia parestésica, neuropatia alcoólica, neuropatia diabética e lesões por esforços repetitivos (Brasil/Ministério da Saúde 2002). Do ponto de vista histopatológico, a hanseníase pode ser confundida com várias outras doenças granulomatosas ou não. Job e Chandi tem um livro específico para este fim, onde faz uma interessante abordagem clínico-patológica. Segundo eles doenças que relembram a hanseníase indeterminada: pitiríase versicolor, sífilis secundária, oncocercose, dermatite seborréica, vasculite linfocítica, pitiríase alba, cicatriz pósinflamatória, hipopigmentação nutricional, esclerodermia (morféia), vitiligo e o nevo hipocrômico. As doenças que relembram da hanseníase tuberculóide e borderleine são: lúpus vulgar, tuberculose cutânea verrucosa, tubercúlide, sífilis terciária, pinta, cromomicose, esporotricose, blastomicose, granuloma anular, necrobiose lipoídica, granuloma multiforme, urticária, eritema anular centrífugo, psoríase vulgar, líquen nítico, líquen plano, pitiríase rósea, lúpus eritematoso discoide, erupção polimorfa à luz, e o frinoderma. Já as doenças que relembram a hanseníase lepromatosa são: neurofibromatose, lipomatose múltipla, dermatofibroma, leucemia “cutis”, micose fungoide, sarcoma de Kaposi, queloide, verruga vulgar, molusco contagioso, leishmaniose dérmica pós-calazar, eritema nodoso, síndrome de Weber-Christian, acne vulgar, rosácea, eritema multiforme, actinomicose, hipotireoidismo e a “normal shiny waxy skin” (Job & Chandi 2001). 63 Como fazer o diagnóstico diferencial morfológico entre a plêiade de doenças não será tema abordado nesta tese. 1.11- Reações Hansênicas A evolução clínica crônica da hanseníase pode ser interrompida por fenômenos inflamatórios agudos denominados episódios reacionais, que podem ocorrer nos pacientes virgens de tratamento, antes da MDT, durante ou após a terapia específica. São classificados como reação tipo 1 e tipo 2, sendo condições distintas que ocorrem separadamente mas podem surgir em momentos diferentes no mesmo paciente e ambas podem resultar em perda definitiva da função neural (Ridley & Jopling 1966, Scollard 1994, revisado por Scollard et al. 2006). Alguns autores consideram a neurite como uma forma especial de reação, classificando os episódios reacionais em três tipos (Nery et al. 2006). A neuropatia pode ser silenciosa, termo proposto para descrever a ocorrência do dano neural na ausência de sintomas (Jopling 1965, Britton e Lockwood 2004, Walker e Lockwood 2007, van Brakel &Lockwood 2008). Os episódios reacionais podem incidir em qualquer das formas clínicas, sendo rara sua detecção na hanseníase indeterminada (Scollard 1994, revisado por Foss et al. 2003, Ney et al. 2006). Os episódios reacionais decorrem do processo inflamatório e resposta imunológica mediada por antígenos do M. leprae, e estabelecem relação com a carga bacilar e a resposta imune do hospedeiro. Cerca de 30 a 50% dos pacientes apresentam os episódios reacionais, que se não diagnosticadas e tratadas precocemente, podem deixar sequelas e incapacidades (Lockwood et al. 1993, Scollard et al. 1994, revisado por Foss et al. 2003, Walker & Lockwood 2008, revisado por Nery et al 2006, revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Grossi 2013). Em um estudo epidemiológico prospectivo sobre reações, 45% da coorte desenvolveu reação; 32% dos pacientes considerados em risco desenvolveram reações do tipo 1 e 37% dos pacientes considerados em risco desenvolveram reações de tipo 2. Apesar da predominância de homens entre os pacientes de hanseníase, reações do tipo 1 ocorreram com frequência significativamente maior em mulheres e não parece ser influenciada pela idade de início da lepra. Indivíduos experimentando uma reação do tipo 1 não eram propensos a experimentar uma recorrência, sugerindo que os mecanismos imunológicos desta reação podem ser limitados ou regulados por fatores genéticos ou imunológicas. Reações do tipo 2, por outro lado, ocorreram com igual 64 frequência em homens e mulheres, mas foram altamente associadas com o aparecimento da hanseníase na segunda década de vida. Indivíduos que experimentaram reações tipo 2 muitas vezes tinham uma ou mais recorrência da reação (Scollar et al. 1994). Em uma população de pacientes brasileiros do Rio de Janeiro com baciloscopia positiva, 25% apresentaram reação tipo 1 durante o período de 2 anos de tratamento com MDT (Nery et al. 1998). Em um estudo retrospectivo feito em um centro de referência no Nepal em pacientes com forma borderline 30% desenvolveram reação tipo 1 (van Brakel et al. 1994). Neste estudo, a metade dos indivíduos que teve reação tipo 1 apresentou dano neural. Em uma coorte de pacientes multibacilares recrutados em dois centros de referência na Índia observou-se taxa de 19,8% de reação tipo 1 na primeira avaliação e de 2,0% de reação tipo 2 (van Brakel et al. 2005). Estudo prospectivo do Vietnã detectou taxa de 29,1% de reação tipo 1 (Ranque et al. 2007). 1.11.1- Reação Tipo 1 (RT1 ou Reação Reversa) A RT1 acomete principalmente pacientes tuberculoides e borderlines (BT, BB e BL) e estima-se que cerca de um terçodestes pacientes podem apresentar a reação, principalmente nos primeiros 6 meses de PQT. A RT1 raramente ocorre vários anos após o término do tratamento com PQT e nesta situação pode ser difícil a distinção entre RT1 tardia e recidiva da doença (Scollard et al. 1994, Manandhar et al. 2002, Brito et al 2005, Misch et al 2008).A incidência da RT1 na forma LL é significamente menor do que na forma BL e sua ocorrência pode ser observada na forma TT (revisado por Foss et al. 2003, revisado por Nery et al. 2006). Pacientes com formas polares também podem apresentar reação tipo 1, associada a uma exacerbação da resposta imune celular tipo Th1, com predominância de expressão de citocinas IL-2, IFN-γ e IL-12 (Stefani et al. 2003). A RT1 resulta do aumento na imunidade celular, resposta Th1, aos antígenos do M. leprae, mas a causa desta alteração imunológica e o seu mecanismo são desconhecidos (Scollard 2008). Há aumento das citocinas IFN-γ e IL-12 (Sreenivasan et al. 1998), TNF-α e IL-1 (Sarno et al.1991), IL-2, IL-6 e IL-8 (Moraes et al.1999). Os antígenos do bacilo são encontrados no interior dos macrófagos na pele e dentro das células de Schwann nos nervos periféricos dos pacientes com RT1. Estudos mostraram que o número e a porcentagem de linfócitos T CD4+, que secretam IFN-γ, IL-12 e TNF-α, estão aumentados nas lesões de RT1. Foi demonstrado, em estudo recente, que a expressão do RNA mensageiro (RNA-m) das quimiocinas IL-8, proteína- 65 1 quimiotática de monócitos (MCP-1) e fator regulado por ativação, expresso e secretado por células T normais (RANTES) é maior nas lesões cutâneas durante a RT1. NaRT1 tem sido documentado aumento na expressão dos genes de várias citocinas próinflamatórias (IL-1, IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α) localmente, nas lesões de pele, e sistemicamente, no soro e nas células mononucleares periféricas (Moraes et al 1999). Estudos de imuno-histoquímica mostraram coloração mais intensa para TNF-α na pele e nervos durante a RT1 quando comparado com controles de hanseníase não reacionais. Produção de citocinas pelos linfócitos do sangue periféricoe concentrações de citocinas séricas TNF-α e IL-1β também estão elevadas durante a RT1. Entretanto, os níveis de citocinas circulantes podem não refletir as alterações observadas na pele durante o episódio de RT1. Todas estas evidências apontam para aumento da resposta imune do tipo Th1 durante a reação tipo 1 (Walker & Lockwood 2006). A RT1 manifesta-se clinicamente pelo aparecimento de novas lesões por exacerbação de lesões pré-existentes com eritema, infiltração,calor local, dore edema, edema de pés, mãos e facepode ser característico da RT1. Na maioria das vezes a RT1 apresenta evolução gradual, sendo que seu curso natural pode durar várias semanas. Estes episódios geralmente não cursam com comprometimento sistêmico e nos casos graves podem ocorrer ulceração e necrose acentuada das lesões (Naafs 1992). Apesar de apresentar um quadro clínico, geralmente, bem localizado, a RT1 é extremamente preocupante, pois está frequentemente associada ao envolvimento de um ou mais nervos periféricos, neurites, e consequentemente paralisias e incapacidades (Scollard 1994, van Brakel et al. 1994, Talhari & Neves 1997, Sampaio & Rivitti 1998). Na RT1 não se observam alterações de exames laboratoriais, hematológicas, função hepática e renal, durante o episódio reacional. As características histopatológicas da RT1 são: edema, aumento do número de linfócitos na derme e perda da organização do granuloma. Com o tempo há um aumento do número de células gigantes tipo Langhans (Job 1994). Foss refere aumento do número de células epitelioides, de células gigantes e linfócitos e redução do número de bacilos (Foss et al. 2003). Antígenos de M. leprae foram demonstrados em nervos e pele de pacientes com reação tipo 1 localizados nas células de Schwann e macrófagos (Lockwood et al. 2002). As células de Schwann expressam receptores Toll-like-2 (Oliveira et al. 2003). Segundo Scollard RT1 não é um diagnóstico histopatológico. Dentre os principais fatores de risco citados para a ocorrência da RT1, são: sexo feminino, forma clínica multibacilar (doença difusa, mais de 2 áreas corporais 66 acometidas), maior número de lesões, formas borderlines imunologicamente instáveis da hanseníase (Lienhardt & Fine, 1994); idade mais avançada; índice baciloscópico mais alto, consideradofator de risco para episódios múltiplos (Ranque et al. 2007), grau de incapacidade física 1 ou 2 ao diagnóstico; ocorrência de reação após início da PQT, ou durante o primeiro ano de tratamento (van Brakel et al. 1994), ou durante o puerpério (Lockwood & Sinha 1999); sorologia positiva para os anticorpos anti-PGL-I(Stefani et al. 1998); e uso de infliximab para tratamento de outras doenças (ex: Doença de Crohn, artrite reumatoide e psoríase) (Scollard et al. 2006). Um estudo identificou que indivíduos comidade de 15 anos ou mais ao diagnóstico de hanseníase é fator de risco independente para a ocorrência de RT1(Ranque et al. 2007). Scollard e cols. publicaram relato dos dois primeiros casos de hanseníase que se manifestaram pós-início de terapia biológica para artrite reumatoide com Infliximab, droga que se liga ao TNF-α bloqueando sua ação, sendo que ambos pacientes desenvolveram RT1 após descontinuação desta terapêutica (Scollard et al. 2006). O infliximab é um inibidor de TNF-α, capaz de ativar infecção latente pelo M. leprae ou M. tuberculosis em pacientes que desenvolveram tuberculose pulmonar ou hanseníase. O TNF-α tem papel crítico na granulogenese e no controle da infecção por micobactéria prevenindo a sua disseminação. Pacientes apresentando co-infecção HIVhanseníase, após a introdução de HAART (Highly Active Anti Retroviral Therapy) podem apresentar reação reversa devido à Síndrome de Reconstituição Imune que consiste em uma reorganização da imunidade. Esta síndrome é ocorre da 4ª. à 24ª. semana após a introdução da terapia anti-retroviral devido ao aumento das células CD4+ (Pereira et al. 2004; Ustianowski et al. 2006). Em estudo de pacientes com lesão única de hanseníase tratados com esquema de dose única ROM e acompanhados por 3 anos, o aumento da idade e a positividade ao DNA de M. leprae detectado por PCR em biópsias de pele, estiveram associados à maior chance de ocorrência de reação hansênica tipo 1 (Sousa et al. 2007). 1.11.2- Reação Tipo 2 (RT2 ou Eritema Nodoso Hansênico) A manifestação clínica mais frequente da RT2 é oEritema Nodoso Hansênico (ENH), que são nódulos inflamatórios, eritematosos, de surgimento súbito, dolorosos, disseminados, mais palpáveis do que visíveis, subcutâneos, que na histopatologia mostra uma paniculite. Estes aparecem principalmente nos membros, de etiologia 67 variada, mas se presente nos membros superiores e inferiores a causa mais provável é a hanseníase (Sampaio & Rivitti 2011). Podem aparecer em áreas do corpo, que não haviam sido acometidas previamente, pápulas superficiais ou profundas ou ainda por formas ulceradas, necróticas, pustulares e bolhosase com comprometimento sistêmico, febre, mal-estar, sudorese, caquexia, ataxia, náuseas, vômitos e mialgia (revisado por Guerra et al. 2002, Foss et al. 2003). Na reação tipo 2, pode haver edema periférico, enfartamento ganglionar generalizado, artralgias, mialgias, iridociclite, fotofobia, lacrimejamento, orquite, artrites, epididimite, neurite, edema de mãos, pés e face (Guerra et al. 2002, Talhari & Neves 1997,Sampaio & Rivitti 2011). Nas formas graves, as lesões cutâneas podem ulcerar caracterizando o ENH necrotizante. O curso natural do ENH é de uma a duas semanas, entretanto muitos pacientes apresentam recorrências durante vários meses. Estes episódios acontecem principalmente durante o segundo e o terceiro ano após o início da MDT, e devido à sua gravidade, são importantes causas de internações hospitalares, além de gerarem insegurança quanto à cura da doença e muitas vezes induzir ao re-tratamento, mas podem ocorrer antes, durante e após a MDT (Guerra et al. 2002, Talhari & Neves 1997, Sampaio & Rivitti 2011). O ENH ocorre principalmente em pacientes multibacilares (BL e LL) e é considerado importante causa de morbidade. Caso não seja pronta e adequadamentetratada, a RT2 pode ocasionar em dano neural, paralisias e deformidades. Antes da introdução da MDT mais de 50% das formas LL e 25% dos BL tratados com monoterapia com sulfona desenvolviam RT2 durante a evolução da doença (revisado por Scollard et al 2006, Wlaker e Lockwood 2007). Após a início do uso da MDT, provavelmente devido ao efeito anti-inflamatório da clofazimina, incluída ao esquema terapêutico, observou-se declínio da frequência e gravidade de reação tipo 2. A maioria dos pacientes com eritema nodoso hansênico desenvolve múltiplos episódios durante anos (revisado por Guerra et al. 2002, Scollard et al. 2006). Estudo de coorte desenvolvido durante 11 anos na Índia mostrou que menos de 10% dos pacientes tiveram apenas um único episódio de ENH e 62,5% tiveram eritema nodoso crônico (Pocaterra et al. 2006). O eritema nodoso hansênico pode ser classificado como leve moderado e grave. No ENH leve os pacientes apresentam menos de 10 nódulos por segmento corporal comprometido, localizados mais frequentemente nos membros inferiores, pouco dolorosos à palpação, sinais e sintomas sistêmicos ausentes ou de leve intensidade. No 68 ENH moderado, os pacientes apresentam de 10 a 20 nódulos por segmento corporal comprometido, necessariamente mais de um, dolorosos à palpação, associados à febre de moderada intensidade (<38,4ºC), com discreta sintomatologia sistêmica, podendo haver comprometimento de cadeia de linfonodos local e/ou regional. Na forma grave de ENH estão presentes mais de 20 nódulos por segmento corporal comprometido, dolorosos espontaneamente, podendo haver lesões ulceradas, acometendo geralmente grande área do tegumento, acompanhado de sintomatologia sistêmica exuberante como febre alta (>38,5ºC), artralgias, calafrios, cefaleia, anorexia, fadiga e comprometimento generalizado da cadeia linfonodal (revisado por Guerra et al. 2002). As alterações nos exames laboratoriais mais frequentemente observadas durante o ENH são leucocitose com neutrofilia, aumento de proteínas da fase inflamatória aguda, como a proteína C reativa, aumento de gamaglobulinas (IgM e IgG), aumento das frações C2 e C3 do complemento e proteinúria. No exame histopatológico, biópsias cutâneas na RT2 mostram infiltrado inflamatório na derme e no subcutâneo (paniculite). Em lesões agudas, de até 72 horas de aparecimento, há predomínio de neutrófilos, podendo também estar presentes eosinófilos e mastócitos (Foss et al 2003). A histopatologia de lesão cutânea geralmente mostra infiltrado inflamatório neutrofílico perivascular, compatível com vasculite e numerosos bacilos fragmentados e granulosos (Job & Chandi 2001, Foss et al. 2003). Biópsias mais tardias apresentam poucos neutrófilos e aumento do número de linfócitos, plasmócitos e histiócitos, representando um infiltrado inflamatório crônico. Outras características encontradas no eritema nodoso incluem o edema da derme e subcutâneo, vasculite e paniculite. O infiltrado na forma LL pode conter histiócitos com alteração gordurosa e arranjo difuso de células espumosas. Na forma BL o granuloma pode conter histiócitos e linfócitos (Ridley & Jopling, 1966). Nas formas LL e BL pode ser encontrada uma grande quantidade de bacilos, geralmente de aparência granular, “poeira bacilar” (Michalany e Michalany 1988). Apesar de serem alvo de numerosas investigações clínicas e laboratoriais, a etiologia e imunopatologia do ENH não são completamente conhecidas. Nas lesões agudas do ENH há infiltração neutrofílica sobrepondo padrão inflamatório crônico da hanseníase. Durante muitos anos, acreditou-se que o ENH ocorria em conseqüência de uma reação mediada por deposição de imunecomplexos circulantes. Entretanto, apesar das evidências favoráveis a esta teoria, como a deposição de imunoglobulinas e complemento nas lesões, diminuição do complemento sérico e identificação de alguns 69 constituintes micobacterianos nestes complexos, a presença de imunecomplexos fixos ou circulantes não foi confirmada por outros estudos (revisado por Guerra et al. 2002,). A reação tipo 2 parece se originar de uma forte ativação transitória e repentina da resposta imune Th1, com aumento de IFN-γ, TNF-αe IL-12 circulantes e aumento do RNA-m destas citocinas nas lesões, com inflamação sistêmica e alterações da imunidade humoral (Modlin et al. 1985, Scollard et al. 1994, Scollard 2008). Elevados níveis de TNF-α circulantes têm sido demonstrados em pacientes durante o ENH e células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com ENH secretam elevadas quantidades de TNF-α após estimulação. Entretanto, estudo recente de Haslett e cols. demonstrou baixos níveis de TNF-α circulantes em pacientes com forma leve de ENH. Os autores postulam que quadros de ENH com significativo envolvimento sistêmico podem produzir níveis circulantes de TNF-α elevados e que isto pode não acontecer nas formas mais leves desta afecção.Embora ocorra em pacientes com resposta imune do tipo Th2, vários estudos têm demonstrado altas concentrações das citocinas IFN-γ e TNF-α (Sarno et al. 1991), IL-2, IL-6 (Moraes et al. 1999; Stefani et al. 2008), IP-10 (Stefani et al. 2008) e baixos níveis das citocinas IL-10 e IL-4 (Moraes et al. 1999, Teles et al. 2002). A principal subpopulação de células T nas lesões do eritema nodoso é a célula T CD4+ em contraste com a hanseníase lepromatosa que tem predomínio de células T CD8+ (Modlin et al. 1986). Contrariamente, foram observadas elevações na expressão do RNA-m das IL-6, IL-8 e IL-10e expressão mantida do RNA-m das IL-4 e IL-5 nas lesões de ENH, todas associadas com quimiotaxia de neutrófilos, produção de anticorpos e redução da imunidade mediada por células (revisado por Guerra et al. 2002,). Os principais fatores de risco para a ocorrência do ENH são: hanseníase LL, índice baciloscópico acima de 4 (quatro), idade inferior a 40 (quarenta) anos e sexo feminino (Manandhar et al. 1999, Foss et al. 2003). Outros fatores como a infiltração cutânea difusa, gravidez e lactação, ciclo menstrual e primeiro sintoma da doença durante a adolescência, devido às influências hormonais, também são aventados como fatores de risco. A relação entre fatores hormonais e genéticos e a incidência de eritema nodoso não foi ainda elucidada (revisado por Guerra et al. 2002). Os seguintes fatores desencadeantes para o ENH foram descritos: doenças virais, outras infecções, febre, vacinação e estresse psicológico, mas não há evidências científicas convincentes. As reações tipo 2 aparecem mais frequentemente durante o primeiro ano da PQT e por introdução de drogas como iodetos, brometos, dapsona, 70 rifampicina, claritromicina e ofloxacina (Foss et al 2003, Pocaterra et al. 2006). A gravidez, lactação, ciclo menstrual, infecções intercorrentes, febre, vacinação e estresse psicológico podem precipitar o aparecimento de eritema nodoso (Scollard et al. 1994). 1.11.3- O impacto das reações no manejo clínico da hanseníase As reações hansênicas causam impacto significativo no curso clínico da hanseníase por vários fatores, dentre os quais se destaca: a evolução flutuante e espontânea destas reações que leva à deterioração do quadro clínico dos pacientes e, como ocorre principalmente após o início da MDT, confundem os mesmos, causando dificuldade na adesão ao tratamento. Além disso, a ocorrência frequente das reações hansênicas no período pós-alta do tratamento específico confunde os pacientes, comprometendo a aceitação de cura da doença. Estes episódios reacionais tardios podem ser consequências da persistência bacilar nos tecidos e devem ser diferenciados de quadros de recidiva da hanseníase. Adicionalmente, os episódios reacionais exacerbam a inflamação nos nervos causada pela hanseníase, agravando o dano neural e potencializando o surgimento de sequelas deformantes e incapacitantes, principais responsáveis pela manutenção do estigma associado à doença. Como as reações hansênicas, sobretudo o ENH, apresentam-se frequentemente como emergências médicas, sendo importantes causas de atendimento médico ambulatorial e internações hospitalares, esses eventos levam ao afastamento do trabalho e prejuízo na vida social dos pacientes (Guerra et al. 2002). 1.12- Tratamento: Multidrogaterapia (ou PQT) A terapia da hanseníase evoluiu do óleo de chalmoogra usado desde a antiguidade atéa década de 1940, quando surgiu a sulfonoterapia. O tratamento era por longos tempos, 10, 20 anos, ou até mesmo pela vida inteira e os pacientes eram confinados em colônias. Em 1977 a OMS recomendou o tratamento com 3 drogas para evitar resistência, a MDT. Na década de 1990, para fins operacionais, foi instituído pela OMS, o uso de um sistema declassificação clínica simplificada, baseada na contagem do número de lesões de pele, em serviços de saúde pública para fim terapêutico (WHO 1994a, WHO 1997, WHO 1998, Scollard 2004, Brasil/Ministério da Saúde 2005, Naafs 2006, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Essa classificação subdivide os pacientes em duas categorias: PB até 5 (cinco) lesões e MB mais de 5 lesões ou qualquer caso com bacioloscopia positiva, sendo que o primeiro recebe medicação por 6 (seis) meses ou 71 seis doses e o segundo por 12 (doze) meses ou doze doses. O tratamento é feito com a distribuição de cartelas padronizadas contendo a medicação (Brasil/Ministério da Saúde 2010a, revisado por Castorina-Silva 2013). Tabela 10 e figura 10. Tabela 10. Apresentação das cartelas para o esquema padrão da OMS (Poliquimioterapia/OMS). Brasil/Ministério da Saúde 2009. Cartela PB Cartela MB Cartela MB para criança Cartela PB para criança Figura 10. Cartelas com medicamentos dos esquemas padrões da PQT (Poliquimioterapia/OMS) para adultos e crianças, PB e MB. Brasil/Ministério da Saúde 2009. 1.12.1- Tratamento: Multidrogaterapia nos adultos O tratamento com a MDT para pacientes PB adultos consiste em uma combinação da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administração 72 supervisionada) e dapsona, (uma dose mensal de 100mg supervisionada) e uma dose de 100mg auto-administrada, diariamente. A duração do tratamento para pacientes PB é de seis meses ou tomada de seis doses em 9 (nove) meses (WHO 1994; Brasil/Ministério da Saúde 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Tabela 11. O tratamento com a MDT para pacientes MB baseia-se emuma combinação de rifampicina (uma dose mensal de 600 mg, com administração supervisionada), dapsona (uma dose mensal de 300 mg com administração supervisionada e uma dose diária de 50mg auto-administrada) e de clofazimina (uma dose mensal de 100mg supervisionada e uma dose diária de 100mg auto-administrada).A duração do tratamento para pacientes MB é de um ano ou tomada de doze doses em até 18 (dezoito) meses (WHO 1994; Brasil/Ministério da Saúde 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Tabela 12. Tabela 11. Esquema terapêutico utilizado para Paucibacilar: 6 cartelas 73 Tabela 12 – esquema terapêutico utilizado para Multibacilar: 12 cartelas A alta por cura é dada após a administração do número de doses preconizadas pelo esquema terapêutico, após exame dermato-neurológico para avaliar incapacidades da doença (WHO 1994; Brasil/Ministério da Saúde 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Por ser um esquema terapêutico com associação de drogas poderá algum paciente apresentar efeitos colaterais, intolerância a um medicamento ou mesmo contraindicação. Neste caso, a portaria no. 3.125 de 7 de outubro de 2010, que regulamenta a terapia da hanseníase no Brasil, prevê esquemas terapêuticos substitutivos (Brasil/Ministério da Saúde 2010a). 1.12.2- Tratamento: Multidrogaterapia nas crianças e adultos com até 30 Kg As doses devem ser reajustadas de acordo com o peso para crianças e adultos com peso até 30 Kg. Tabela 13. 74 Tabela 13 – Dosagens dos medicamentos noesquema terapêutico utilizado para crianças e adultos com peso inferior a 30 Kg. 1.12.3- Tratamento: Multidrogaterapia nas reações O manejo adequado das reações interfe na incapacidade física que o paciente poderá vir a ter em função destas. Desde o início, no momento do diagnóstico, o paciente deverá receber orientações adequadas quanto a estas, para evitar a suspensão da terapêutica ou geração de dúvidas quanto aos efeitos da mesma. Orientação quanto às neurites, com imobilização, cuidado com olhos e traumas de extremidades devem ser bem enfatizados, são os autocuidados para evitar sequelas. Pacientes com neurites devem ser bem avaliados e monitorados para avaliação da necessidade de intervenção cirúrgica, em casos de compressão e abscessos neurais (Brasil/Ministério da Saúde 2010a). O tratamento de escolha para RT1 é a corticoterapia, com a prednisona na dose de 1 a 1,5 mg/kg/dia e para RT2 consiste na administração de talidomida na dose de 100 a 400 mg/dia para pacientes do sexo masculino ou para mulheres que não estejam em idade fértil (Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Caso contrário, faz-se o uso de corticosteroides (Talhari & Neves 1997, Guerra et al. 2002, Foss et al. 2003, Sampaio & Rivitti 2011). Nas formas moderadas e graves do eritema nodoso hansênico, associa-se a talidomida à corticoterapia sistêmica. Outras drogas para esquema terapêutico alternativo, com efeito no tratamento da reação tipo 2, são a clofazimina, pentoxifilina, azatioprina, metotrexate, zinco oral e anticorpo monoclonal quimérico anti TNF – “Infliximab” (Talhari et al. 1995, Foss et al. 2003, Scollard et al 2006, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). 1.12.4- Tratamento: Métodos profiláticos e vacina Em vários países do mundo tem sido realizada uma vacinação de rotina com Mycobacterium bovis (BCG) para prevenir a infecção por M. leprae. A vacina BCG 75 confere proteção cruzada contra a hanseníase (Rodrigues 1992, Setia et al. 2006, WHO 2006, revisado por Richardus et al. 2013). Desde 1973 vem sendo utilizada no Brasil a vacina BCG intradérmica, principalmente nos contatos intradomiciliares. A aplicação segue normas da OMS e MS/Brasil, sendo feita em contatos intradomiciliares de PB e MB, sem sinais ou sintomas da hanseníase (WHO, 1988, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Tabela 14 Tabela 14. Avaliação para aplicação do BCG Estudos realizados em várias partes do mundo demonstraram que o BCG tem maior variação na eficácia protetora para a tuberculose (0 a 80%), do que para a hanseníase (20 a 80%).A vacinação BCG tem sido parcialmente eficaz em evitar a hanseníase, porém estudos tem mostrado que o grau de proteção varia significativamente entre os estudos (0-80%) e a proteção conferida pela vacina BCG declina ao longo do tempo (Fine 1996, revisado por Lockwood 2001, revisado por Setia et al 2006). A principal explicação para estas variações são fatores genéticos das populações estudadas. Acredita-se também, que provavelmente esta variação seja atribuída em parte a efeitos imunológicos de exposição a diferentes tipos de micobactérias ambientais. No Brasil, em um estudo realizado em Goiás observou-se que a presença de cicatriz de BCG, estava negativamente associada à hanseníase indicando um risco de 5,3 para aqueles não vacinados e o efeito protetor foi de 81%. A proporção de pacientes paucibacilares que apresentavam cicatriz de BCG foi significativamente superior aos pacientes multibacilares, sugerindo também variação da proteção de acordo com diferentes formas clínicas da hanseníase (Rodrigues et al. 1992). Em outro estudo brasileiro, os autores estimaram um efeito protetor do BCG para a hanseníase em 90% para pacientes memores de 18 anos. Na região metropolitana do Rio de Janeiro, Alvim et al. 1993, em estudo realizado em contatos, cujos casos índices 76 apresentavam as formas clínicas multi e paucibacilares da hanseníase, observou uma proteção global de 59% (Lombardi et al. 1995). Devido ao fato da vacinação BCG ter demonstrado eficácia apenas parcial em evitar a hanseníase, alguns estudos têm pesquisado diferentes regimes de quimioprofilaxia na tentativa de diminuir a transmissão da hanseníase. Um estudo contatos domiciliares de uma ilha tomaram uma dose única de ROM enquanto que os pacientes de outra ilha tomaram comprimidos placebos. Porém, o estudo mostrou, que após cinco anos, que não havia diferença significativa na prevalência de hanseníase entre contatos domiciliares que fizeram quimioprofilaxia com ROM e contatos que não fizeram quimioprofilaxia (Bakker et al. 2006). Alguns outros estudos relatam o uso da quimioprofilaxia com uma ou duas doses de Rifampicina como possível proteção de populações com maior risco de adoecer de hanseníase (Moet et al. 2004). Até o momento, os estudos têm mostrado uma eficácia parcial em evitar o contágio da hanseníase (Bakker et al. 2006). Na nova estratégia global de controle da doença proposta pela OMS para o período 2011-2015 é recomendado que as áreas endêmicas avaliem o uso da quimioprofilaxia, de modo a possibilitar acúmulo de experiência em diferentes contextos (WHO 2006). Em alguns países do Mundo, estão sendo realizados estudos quimioprofiláticos para avaliar a eficácia desta estratégia (Goulart & Goulart 2008, Penna et al. 2011, Richardus et al. 2013). No Brasil oficialmente a quimioprofilaxia não está prevista, segundo a última portaria que regulamenta a terapêutica da hanseníase (Brasil/Ministério da Saúde 2010a). 77 Em conclusão Assim, no momento em que se discute a eliminação da hanseníase, as atenções se voltam principalmente para as reações hansênicas, devido ao significativo impacto social, econômico, no manejo clínico dos doentes e na demanda dos serviços de saúde causado por esses episódios inflamatórios. Apesar dos significativos avanços no conhecimento do genoma do bacilo, na imunopatologia e na quimioterapia da doença, houve pouco impacto na conduta clínica das reações hansênicas. Nos últimos anos temse buscado entender melhor o mecanismo imunopatológico das reações hansênicas. Uma estratégia nova para a identificação de potencias células e seus produtos envolvidos na imunopatologia dos eventos reacionais, com estudo “in situ”, de painéis citocinas produzidos por estas células. Esses conhecimentos podem levar a novos testes laboratoriais ou a novas opções terapêuticas. Assim, a definição de marcadores imunológicos, moleculares ou endócrinos para o desenvolvimento de reações hansênicas ou fatores prognósticos poderão contribuir para o manejo clínico desta doença. A prevenção e o manejo das reações e neuropatias são considerados áreas de pesquisa prioritárias pela Organização Mundial de Saúde na era da eliminação da hanseníase. A hanseníase é uma doença endêmica em nosso país e as reações hansênicas representam sobrecarga nos serviços de saúde, uma vez que constituem em emergências médicas que devem ser prontamente atendidas e tratadas, principalmente pelo risco de acometimento neural e conseqüente desenvolvimento de sequelas incapacitantes irreversíveis. Nesse contexto, a presente tese de doutorado discute aspectos clínicoepidemiológicos, histopatológicos e imunológicos das reações, mediante estudos em pacientes com hanseníase da região metropolitana de Goiânia. 78 2. JUSTIFICATIVA O objetivo do nosso trabalho foi investigar a expressão ‘in situ” de duas populações celulares com importantes funções imunorregulatórias: mastócitos e Tregs, com ênfase na hanseníase e reações hansênicas do tipo 1 e 2, comparando-as com outras dermatoses e controles saudáveis. Uma vez que não existe nenhum modelo experimental para hanseníase e, como o M. leprae nunca foi cultivado “in vitro” em culturas axênicas, as lesões de pele continuam sendo extensivamente investigadas para desvendar os complexos mecanismos e células envolvidos na imunopatogênese da doença. A justificativa da escolha da hanseníase, como modelo, se deve ao fato de ser uma doença dermato-neurológica espectral complexa, na qual o sistema imunológico desempenha papel fundamental determinando a forma clínica. As manifestações clínicas polares tuberculoide e lepromatosa se apresentam com nítida dicotomia da resposta imune Th1/Th2, respectivamente, sendo que formas intermediárias (borderline) imunologicamente instáveis mesclam características imunológicas de ambos os polos. Além da complexidade das manifestações clínicas, o curso crônico da doença pode ser interrompido por manifestações imunoinflamatórias agudas que costumam deixar sequelas neurológicas e motoras irreversíveis, se não forem prontamente diagnosticadas e tratadas. A escolha destas duas populações celulares como tema de estudo, se deve a diversos fatores. Os mastócitos são células amplamente distribuídas no organismo, sobretudo, na pele, e produzem uma ampla gama de substâncias biologicamente ativas. Embora os mastócitos tenham sido descritos e conhecidos por sua participação nas reações alérgicas imediatas, hoje se reconhece que seu papel é bem mais amplo que inicialmente imaginado. Sabe-se que os mastócitos participam de diversos processos cutâneos patológicos inflamatórios e não inflamatórios, como infeções, reparo de lesões traumáticas e neoangiogênese de doenças malignas da pele. Os mastócitos afetam a resposta imune promovendo inflamação ou suprimindo-a. As lesões de pele da hanseníase contem todas as células presentes em pele normal incluindo os mastócitos e diversos estudos mostram resultados conflitantes sobre o possível papel dos mastócitos na hanseníase e nas reações hansênicas. As células Treg representam uma população celular com funções supressoras e quando ativadas, podem ter papel benéfico em doenças autoimunes, rejeição de 79 transplantes e reações alérgicas. Por outro lado, o efeito supressor das células Treg pode ser deletério se este comprometer a imunidade antitumoral ou imunidade contra microorganismos. Alguns estudos descrevem resultados controversos sobre o papel de celulas Treg na hanseníase e nas reações hansênicas. Desta forma, uma melhor compreensão sobre o papel destas duas populações celulares imunorregulatórias em dermatoses humanas, incluindo a hanseníase e, sobretudo, as reações hansênicas, poderão contribuir não só para o melhor entendimento da imunopatogênese como indicar potenciais alvos ou abordagens terapêuticas para estes episódios. 80 3. OBJETIVOS 3.1- Objetivo Geral Investigar a expressão “in situ” dos mastócitos e das células Treg duplo postivas, CD25 e Foxp3, na hanseníase e nas reações hansênicas, comparando-as com diversas outras dermatoses e com peles normais. 3.2- Objetivos específicos 3.2.1- Investigar a presença dos mastócitos na hanseníase e suas formas reacionias, comparando-as com diversas dermatoses com e pele normal; 3.2.2- Quantificar as populações dos mastócitos triptase e quimase positivas em hanseníase, em diversas dermatoses e em pele normal; 3.2.3- Avaliar as proporções dos mastócitos íntegros e desgranulados nas diversas manifestações clínicas da hanseníase; 3.2.4- Comparar as populações de mastócitos triptase e quimase positivos nas diversas manifestações clínicas da hanseníase; 3.2.5- Avaliar os mastócitos nas reações hansênicas tipo 1 e 2; 3.2.6- Estudar populações de mastócitos triptase e quimase positivos nas reações hansênicas tipo 1 e 2; 3.2.7- Investigar a expressão “in situ” de células Treg duplo positivas para CD25 e Foxp3 em lesões da hanseníase e suas formas reacionias, comparando-as com diversas dermatoses com e pele normal; 3.2.8- Estimar a frequência de células Treg nas diversas manifestações clínicas da hanseníase; 3.2.9- Avaliar o impacto das reações hansênicas na expressão das células Treg em amostras pareadas coletadas na vigência e ausência de reações hansênicas tipo 1 e 2. 81 4. APRESENTAÇÃO DOS MANUSCRITOS Este trabalho de conclusão de doutorado esta apresentado em formato de artigos. O primeiro manuscrito se refere às células T regulatórias (Treg): “In situ expression of CD25+ Foxp3+ Regulatory T Cells in human skin diseases: leprosy and leprosy reactions”, realizado em colaboração com o Hospital A. C. Carmargo, Departamento de Patologia, chefiado pelo Prof. Dr. Fernando Augusto Soares. O artigo 2 refere-se aos Mastócitos: “Mast cell heterogenity in human dermatoses: in situ tryptase and chymase positive cells with emphasis on leprosy and leprosy reactions”, realizado em colaboração com o Laboratório de Imunomorfologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas - IBILCE/UNESP de São José Rio Preto – SP – Brasil, chefiado pela Profa. Dra. Sônia Maria Oliani. Ambos os artigos já estão preliminarmente formatos para serem submetidos para publicação. Estamos confiantes de que os resultados são atrativos para aceitação epublicação em periódico indexado com alto fator de impacto. 82 5. RESULTADOS 5.1 Manuscript 1 IN SITU EXPRESSION OF CD25 + Foxp3+ REGULATORY T CELLS IN HUMAN SKIN DISEASES: LEPROSY AND LEPROSY REACTIONS Maurício B. Costa1, Aline A. Freitas1, Emerith M. Hungria1, Ana Lúcia O. M. Sousa1, Juliano Jampietro2, Fernando A. Soares2, Mariane M. A. Stefani1 1 Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil. 2 Hospital A. C. Camargo, CIPE - Centro Internacional de Pesquisa– São Paulo, São Paulo, Brazil. Abstract T regulatory cells (Treg) expressing CD25 and Foxp3 have suppressive activity and have been implicated in the regulation of a wide variety of pathological conditions including antimicrobial immunity.Leprosy is a complex chronic, infectious dermato-neurological disease that affects the skin and peripheral nerves especially during immunoinflammatory episodes known as type 1/T1R and type 2/T2R reactions. Leprosy skin lesions have been used to unravel its immunopathological mechanims. This study investigated in situ expression of double stained CD25 + Foxp3 + Treg cells in 154 skin biopsies from 114 participants with non-infectious and infectious skin diseases, with special emphasis on leprosy type 1/T1R and type 2/T2R reactions. Three study groups were investigated: 1. Leprosy (n=74): 56 T1R (28-paired biopsies reactionfree/reactional, 28 single reactional biopsy), 18 T2R (12 paired-reaction-free/reactional, 6 single reactional biopsy); 2. Dermatoses: (n=29) infectious and non-infectious skin diseases; 3. Normal controls: (n=11) skin fragment of healthy females that had cosmetic mammoplasty.Double immunohistochemical detection of T reg cells was performed with automated platform employing the ultra View Universal DAB detection kit for CD25 staining and the ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit for Foxp3 staining. Not one CD25+Foxp3 + Treg cell was seen in any normal skins while variable numbers were detected in skin diseases; the number of cutaneousTreg cells was higher in infectious diseases compared to non-infectious diseases. Treg cell counts in reactional 83 lesions were higher than counts in lesions of reaction-free leprosy patients. Paired biopsies of reactional T1R or T2R and reaction-free lesions showed that difference in Treg numbers was statistically significant for T1R that expresses higher numbers during reactional episode. There was a trend in increasing T reg cell numbers from the tuberculoid to borderline-lepromatous form which showed the highest median value of Treg, however this difference was not significant. In conclusion higher Treg numbers seen in T1R suggest Treg role in suppressing the exacerbated cell-mediated phenomenon that causes T1R Keywords: human skin diseases, T regulatory cells, CD25 + Foxp3+, leprosy, leprosy reactions. Introduction T regulatory cells, formerly described as T suppressor cells in the late 70’s- early 80’s, returned in the mid to late 90’s as T regulatory cells (Tregs) following the description of CD4+CD25+ T cells with suppressive activity that specifically expressed the transcription factor Foxp3 (Gershon 1975; Sakaguchi 2004).Treg cells have been implicated in the regulation of autoimmunity, transplant rejection, allergic diseases, antimicrobial and anti-tumor immunity(Sakaguchi and Powrie 2007).Upregulation of Treg cell function or increase in the numbers of Treg cells might be beneficial for treating autoimmune diseases and allergies and for preventing allograft rejection. Conversely, inhibiting Treg cell function or decreasing Treg cell numbers might boost immunity against tumors and microorganisms. Tregs play a crucial role in the regulation of the immune response to microbial antigens and may favor the persistence of pathogens causing chronic granulomatous disease such as leishmaniasis and tuberculosis (Campanelli et al. 2006; Guyot-Revol et al. 2006; Silva et al. 2009). Treg cells are characterized by the expression of the transcription factor Foxp3 and the absence of Foxp3 in patients with immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX) syndromeor scurfy mice results in lack of functional Treg cells (Clark et al. 1999; Torgerson and Ochs 2007). The majority of T reg cells express high levels of CD25 (interleukin-2 IL-2 receptor α chain),suggesting a major influence of IL-2 for the long-term maintenance and competitiveness of these cells and STAT5, which is activated by IL-2, has been shown to be required for the maintenance of Foxp3 expression (Sakaguchi et al. 2006). Treg cells also express TGF, IL-10, cytotoxic T 84 lymphocyte–associated antigen (CTLA4), and glucocorticoid-induced TNF receptor (GITR), which may play a role in their function (Burchill et al. 2007; Yao Z et al. 2007). Homing of T reg cells to inflammation sites is required for their suppressive function (Schneider et al. 2007). The importance of cutaneous Treg cells for the maintenance of immune homeostasis in the skin has been demonstrated in transfer experiments using Foxp3-deficient scurfy mice in which reduced Treg cell accumulation in the skin caused severe inflammation without other scurfy-associated symptoms (Dudda et al. 2008). Leprosy is a complex chronic, infectious dermato-neurological disease that affects the skin and peripheral nerves and that can result in significant impairment of nerve function and permanent deformities, which are the hallmark of the disease (Scollard et al. 2006a). Although multidrug therapy (MDT) available since the 80’s has reduced prevalence, incidence remains stable indicating an active transmission chain of its etiologic agent, Mycobacterium leprae. Leprosy still represents an important public health problem in many endemic countries, some of them with growing economies such as India and Brazil (WHO 2013). The disease is characterized by a spectrum of clinical, immunologic, microbiologic and histopathologic manisfestations in which paucibacillary patients present low bacillary load and few lesions, and develop Th1 type cell-mediated immunity (CMI) to M. leprae characterized by INF- production and low antibody production. Multibacillary patients show multiple skin lesions, high bacillary load, low or no specific CMI and vigorous antibody production(Scollard et al. 2006). Some patients can also be immunologically unstable and change to any side of the spectrum (Kumar et al. 2004). One of the major complications in the clinical management of leprosy patients is the development of acute inflammatory episodes during the chronic course of the disease, either before, during or after the specific treatment. Type 1 reaction (T1R) and type 2 reaction (T2R) represent the major cause of permanent physical disabilities and deformities due to irreversible nerve damage they can cause (Scollard et al. 2006a). T1R is associated with alterations in Th1 type CMI while T2R is associated with Th2 type immunity with immune complex deposition and transient CMI activation (Walker and Lockwood 2008). M. leprae has never been cultivated in vitro in axenic cultures and there is no experimental model for leprosy, therefore the best approach to investigate immunologic mechanisms associated with protection and pathology is to use biopsies of human skin 85 lesions. This study aimed to investigate in situ expression of Treg cells in different human skin diseases including non-infectious and infectious conditions with special emphasis on leprosy and type 1 and type 2 reactions. Methods Study groups: Dermatoses, leprosy and normal controls 1. Dermatoses: This group included 29 patients with diverse skin diseases that were recruited at a public health reference center (Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica, CRDT, Goiânia, Goiás State, central West Brazil) and the final diagnosis was based on the clinical and histopathological findings. The dermatoses group comprised: eczema (n=5), pityriasis rosea (n=1), pityriasis alba (n=2), granuloma annulare (n=2), drug induced skin disorder (n=2), lupus erythematosus (n=2), necrobiosis lipoidica (n=1), foreign-body granuloma (n=1) and urticaria (n=1), and individuals with chronic infectious diseases as tinea (n=2), chromomycosis (n=1), cutaneous leishmaniasis (n=5), paracoccidioidomycosis (n=3) and syphilis (n=1). 2. Leprosy: This group comprised 74 leprosy patients that developed a T1R or T2R episode. These patients were selected from a cohort of 239 recently diagnosed, untreated leprosy patients that were followed up during MDT to monitor the occurrence of leprosy reactions. In this cohort, 74 out of 239 leprosy patients (74/239; 30.96%) developed a reactional episode and were selected for this study: 56 cases of T1R and 18 cases of T2R. Most patients (n=61) were diagnosed during a reactional episode and 13 developed reaction during or after conclusion of MDT (2-19 months after diagnosis). Leprosy patients were recruited at a public health reference center (Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica, CRDT, Goiânia, Goiás State, central West Brazil). All patients were submitted to a complete dermato-neurologic examination by one dermatologist with expertise in leprosy diagnosis (ALOMS) and patients had at least one biopsy taken from a typical leprosy skin lesion. Leprosy patients were classified according to Ridley & Jopling criteria taking into account histopathology, bacilloscopic and clinical data. All leprosy patients classified as tuberculoid (TT) had negative bacilloscopy and patients classified as borderline-tuberculoid included individuals with either negative or low bacilloscopic index (BI), while patients classified as borderline lepromatous (BL) and lepromatous individulas (LL) were BI 86 positive. Forty reactional leprosy patients had two paired skin biopsies taken: one was collected during the reactional episode and the other biopsy was collected when the patient was not undergoing a leprosy reaction (T1R n=28, T2R n=12). Additionally, for another 34 reactional leprosy patients (T1R n=28, T2R n=6) only one biopsy, taken during the reactional episode was available. 3. Normal controls: For ethical reasons no biopsies could be taken of normal skin from healthy individuals. Therefore, exceeding fragments of normal skin from 11 healthy females obtained during elective mammoplasty were used for standardizing the double immunostaining reaction and as well as normal controls. The detailed design of Treg study groups is shown in Figure 1. A total of 154 skin biopsies, taken from 114 participants were examined in this study and the main features of participants are shown in Table 1, including the 40 reactional leprosy patients (28T1R and 12 T2R) that had paired skin biopsies collected. Among leprosy patients, male individuals predominated (74/49), while all normal controls were females that underwent elective mammoplasty. The median age of patients with other skin diseases and leprosy patients (unreactional and reactional) was similar (p=0.06). Skin biopsies Biopsies were taken with a standard dermatologic biopsy punch (4mm) of the edges of well-characterized and infiltrated skin lesions and fixation was performed with 10% neutral buffered formalin in 4% formaldehyde for 24 hours. For leprosy patients, 3-4 µm sections of skin biopsies were stained by hematoxilin-eosin (HE) and by FiteFaraco for bacilli detection. Double Immunohistochemical detection of CD25+Foxp3+ Treg cells For the immunohistochemical study, skin biopsies were deparafinized (EZPrep, Roche), treated with Cell Conditioner (Roche) and submitted to heat induced antigen retrieval.Double immunostaining reaction to detect CD25/Foxp3 coexpression was performed using an automated platform (Ventana BenchMark XT, Roche, Manhein, Germany). The ultra View Universal DAB detection kit (Roche, Manhein, Germany) was used for CD25 staining. The primary antibody–HRP labelled antibody complex 87 (anti-human monoclonal antibody, clone 4C9, Ventana, Roche, Tucson, AZ, USA) visualized using DAB resulting in a brown/black target signal. Kit reagents comprise: ultraView Universal HRP Multimer, ultraView Universal DAB Chromogen, ultraView Universal DAB H202 and ultraView Universal DAB Copper. Foxp3 staining employed anti-Foxp3 + antibodies (mice anti-human monoclonal antibodies, clone 236A/E7, Abcam, Cambridge, UK) and the ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (Roche, Manhein, Germany) comprising the following reagents: ultraView Red Alkaline Phosphatase, ultraView Red Enhancer, ultraView Red Naphthol, ultraView Red Fast Red A and ultraView Red Fast Red B. The primary antibody–alkaline phosphatase labelled antibody complex was visualised using Fast Red/Naphthol resulting in a bright red target signal. Both DAB and alkaline phosphatase detection kits are biotin-free multimer-based detection systems that eliminate non-specific staining from endogenous biotin providing a clean background for the sensitive and specific visualization of the targeted antigen being useful for the detection of antigens present in low concentrations. Detection systems were optimized for use on the VENTANA BenchMark XT, the staining procedures were followed according to vendors’ instructions and all reagents were provided in pre-diluted and ready-to-use form. Slides were then washed and Hematoxylin II (Roche, Manhein, Germany) added, incubated, washed and the Bluing Reagent (Roche) was added and washed. Slides were then processed by the automated Tissue-Tek® Prisma®/Film® (Sakura, AJ Alphen aan den Rijn, The Netherlands). Quantification of double immunostained CD25 +Foxp3+ Treg cells was performed using Nikon Eclipse E400 microscope (8 fields in 400X corresponding to 2mm2; values were then divided by 2 to give counts in 1mm2). Quantifications of Treg positive cells were done exclusively by one observer with vast expertise in dermatopathology (MBC.) blinded to the participants’ clinical status (different forms of leprosy, reactional or unreactional leprosy, other dermatoses, normal skin). Immunostained cells were quantified both in areas with and without inflammatory infiltrates and double stained Treg cells were visualized as brown/golden cytoplasm stained by anti CD25 revealed with DAB and violet/magent nuclei stained Foxp3 revealed by alkaline phosphatase. Statistical analyses 88 Exploratory data analysis, including dot plot, box plot, medians were used to analyze the quantifications of Treg cells/mm2 among different study groups. Statistical significance was assessed by Kruskall-Wallis one way analysis of variance for comparison of multiple groups and Mann-Whitney for comparison between two groups. Results were considered statistically significant when p-values <0.05 were obtained. Ethical issues This study was approved by the regional and national review boards (“Comitê de Ética em Pesquisa Humana e Animal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás”, protocol # 119/2005 and “Comissão Nacional de Ética e Pesquisa/CONEP/Brasil”, protocols # 4862, 12962). All patients signed an informed consent form. Results 1. Skin CD25+Foxp3+ Treg cells in skin diseases and normal skin Treg cell numbers were variable in different skin diseases and Tregcell counts in lesions of different skin disorders (infectious and non infectious) versus leprosy were similar (p=0.239) (Figure 2A). Therefore data on Treg cell counts in lesions of leprosy and other dermatoses were grouped and compared to counts in normal skin. The difference in Treg cell counts between skin diseases and normal skin was highly significant (p<0.0001) (Figure 2B) as no CD25+Foxp3+ double stained Treg cell was seen in any section of the 11 normal breast skins obtained from healthy females that underwent elective mammoplasty (Figure 2C). Figure 2D depicts Treg cells in pityriasis rosea lesion (67 Treg cells/mm2) and Figure 2D shows Treg cell in 2 paraccocidioidomycosis lesion (212 T reg cells/mm ). Double stained Treg cells in different skin disorders are illustrated in supplementary figure 1. 2. CD25 +Foxp3 + Treg cells in infectious and non-infectious skin diseases Higher median values of Treg cells were seen in infectious skin diseases (n=86) compared to non-infectious dermatoses (n=17) (Figure 3A) and this difference was statistically significant (p= 0.008). However, when the infectious dermatoses were analysed as two groups: leprosy versus other infectious dermatoses, no difference in median values of Tregs was observed (p=0.157) (Figure 3B). Total Treg cells 89 countsamong infectious diseases were: 40 leprosy patients (mean = 45 Treg cell/mm2) , 2 tinea (mean = 1 Treg cell/mm2), 1 chromomycosis (total = 0Treg cell/mm2), 5 cutaneous leishmaniasis (mean = 102 Treg cell/mm2), 3 paracoccidioidomycosis (mean = 212 Treg cell/mm2), 1 syphilis (total = 71 Treg cell/mm2),Treg cell counts in non-infectious diseases were: 2 granuloma annulare (mean = 3 Treg cell/mm2), 5 eczema (mean = 13Treg cell/mm2), 2 drug induced skin disorders (mean = 14 Treg cell/mm2), 2 lupus erythematosus (mean = 147 T reg cell/mm2), 1 necrobiosis lipoidica (total = 108 Treg cell/mm2), 2 pityriasis alba (mean= 0Treg cell/mm2), 1 urticaria (total = 0 Treg cell/mm2), 1 pityriasis rosea (total = 67Treg cell/mm2) and 1 foreign-body granuloma (total = 30 Treg cell/mm2). Double stained Treg cells in different skin disorders are shown in Figures 3 C-E: 3C) eczema, 3D) cutaneous leishmaniasis and 3E) syphilis skin lesion. 3. CD25 +Foxp3 + Treg cells in different infectious-skin diseases and in leprosy patients with T1R, T2R Considering Treg cell numbers among leprosy patients, higher median value was seen in reactional versus reaction-freelesions (p=0.002)(Figure 4A). When Treg cell counts were stratified according to the type of leprosy reaction (T1R/T2R) and compared to paired unreactional lesion, higher numbers were seen during T1R (p=0.001) versus reaction-free lesions (Figure 4B-C). No impact on Treg cell numbers was seen in paired T2R lesions compared to reaction-free samples (p>0.05) (Figure 4DE). Treg cells in paired biopsies samples from T1R/reaction-free are show in Figure 4FG Figures 4H-I show Treg cells in T2R/reaction-free lesions. 4. Treg numbers developed in naïve patients with reaction at diagnosis or during MDT In many cases, the diagnosis of leprosy occurs at the same time as the diagnosis of a leprosy reaction and leprosy reaction can also occur during MDT or even years after specific treatment. Previous studies have shown that M. leprae specific humoral immune response declines after MDT and the same can occur with T cell responses. To evaluate if MDT influenced Treg cell numbers in patients that developed reaction during treatment, we have analysed Treg numbers in naïve patients for whom the diagnosis of leprosy and of reaction coincided (no impact of MDT on immunity) (Figures 5 A and D for T1R and T2R, respectively) and among patients that developed a leprosy reaction 90 during MDT (Figures 5B and E for T1R and T2R, respectively). These analyses have shown that for T1R, Treg numbers were slightly higher during reaction developed during MDT compared to reaction developed in naïve patients (Figure 5 C, p=0.047). For T2R, Treg numbers were comparable despite treatment status (Figure 5F). 5. Treg cell numbers in different leprosy forms Leprosy is a complex disease with several clinical manifestations associated with bacilloscopic, histopathological and clinical features that were classically classified by Ridley & Jopling. We then investigated if Treg cell expression differs among TT, BT, BB, BL and LL leprosy lesions. In this regard, there was a trend in increasing Treg cell numbers from the paucibacillary to the multibacillary pole, more specifically from the tuberculoid to the borderline-borderline and borderline-lepromatous lesions which showed the highest median values of Treg cells (Figure 6A, D-H). However, the difference of Treg cellsamong leprosy forms was not statistically significant (p=0.80). Since T1R was shown to impact Treg cells increasing cell counts, lesions of different leprosy forms were analysed taking into account both leprosy form and the occurrence of leprosy reaction. The same trend of higher number of Tregs from tuberculoid to borderline-lepromatous form was observed for both reactional and reaction-free lesions, however without reaching statistical significance (Figure 6B). Additionally when Treg cell numbers were analysed among paucibacillary (n=16) and multibacillary leprosy (n=63), similar median values were seen (Figure 6C) (p>0.05). Discussion The current study discloses data on CD25+ Foxp3 + double stained Treg cell expression in 154 skin biopsies from different human dermatoses and normal skin. Our results showed total absence of Tregs cells in normal skin contrasting with variable values, sometimes very high, seen in skin diseases. A previous study on normal skin and inflammatory dermatoses described similar frequencies of CD25+ Foxp3 + cells in normal human skin as in diseased skin but the absolute numbers were significantly lower in normal skin (de Boer et al. 2007). Rare CD25 + Foxp3+ cells were identified in normal skin when compared to other skin diseases as psoriasis and eczematous dermatitis (Fujimura et al. 2008). Tregs exert their suppressive role by suppressive cytokine release requiring cell-cell contact, therefore in cutaneous infection or inflammation Tregs need to be at the site of infection/inflammation to perform their role 91 rather than in the circulation. The preferential location of T regs at the site of infection in various diseases suggest an active role for T regs, probably by limiting local effector immunity and local inflammation. Moreover the rise of Tregs in infection sites such as the skin suggest that Tregs can directly inhibit effector mechanisms used for pathogen killing leading to persistent infection. Another interesting finding from our study was the higher numbers of Treg cells in infectious versus non-infectious lesions suggesting that homing of Treg cells to skin lesions during infection is more pronounced than in non-infectious inflammatory diseases that take place in the absence of a pathogen. Treg cells have been isolated from lesions of different infectious skin diseases such as in leishmaniasis, fungal infections and leprosy (Modlin RL et al. 1986; Campanelli et al. 2006; Cavassani et al. 2006). These data indicate that Treg cells are attracted to sites of inflammation or infection probably to exert their immunosuppressive or immunomodulatory roles. T reg cells are known to protect against tissue injury in infectious diseases. After clearance of pathogens they negatively regulate the immune response protecting against chronic immunopathology related to chronic infections (Sakaguchi 2004; Sakaguchi et al. 2006; Fujio et al. 2010). The mechanisms by which antigen-specific Treg cells achieve suppression of effector cells are unknown. In the 80’s CD4+ and CD8 + Tregs from human lepromatous patients both from peripheral blood and skin lesions were isolated and cloned (Ottenhoff TH et al. 1896; Modlin RL et al. 1986). After the revival of Treg cells, recent studies have investigated Treg cells in leprosy with contradictory results and interpretations. Treg cells have been identified in the circulation and in leprosy skin lesions. One study has used flow cytometry to identify the frequency of CD25 + Foxp3+ Treg circulating in 38 leprosy patients and 38 healthy individuals.Elevated circulating Tregs were seen in TT patients. Patients with LL leprosy and T2R expressed lower frequency of Tregs suggesting a detrimental role for Tregs in leprosy (Attia et al. 2011). In the current study we have investigated 74 leprosy skin biopsies including 28 paired samples from T1R and 12 paired samples from T2R. Although a rising trend of Treg cell medians was seen from paucibacillary tuberculoid lesions towards borderline lepromatous lesions, this difference did not reach statistical significance. One possible explanation for the rising trend in Treg numbers from TT to BL lesions and then a decline seen in multibacillary LL is the requirement of IL-2 for Treg survival. Multibacillary LL forms are characterized by weak or absent cell mediated immunity, therefore limited IL-2 92 production in LL is compatible with our findings. Another immunohistochemistry study in a small group of leprosy cases (1TT, 3BT, 5BL, 5 LL, 1 T1R, 3 T2R) did not find any difference of Foxp3+ cells among leprosy forms(Massone et al. 2010). Astudy including lepromatous and tuberculoid leprosy and healthy M. leprae exposed contacts showed CD4 +CD25+Foxp3 + cells in peripheral blood mononuclear cells stimulated in vitro with M. leprae and CD25+Foxp3+double stained Treg cells were identified by immunohistochemistry in leprosy skin lesions. Tregs were more frequent in situ in lepromatous patients suggesting an association between their increased numbers and a pathogenic role in multibacillary leprosy (Palermo et al. 2012). Recently, circulating CD4+CD8+C25+Foxp3+ cells were investigated in 12 patients under 15 years with multibacillary leprosy and 17 household contacts. Young mutibacillary leprosy patients had greater CD4+ CD8 + Treg frequencies correlating with disseminated clinical disease and suggesting their involvement in multibacillary leprosy (Fernandes et al. 2013). In tuberculosis, Treg populations are mainly associated with active disease, particularly at the site of infection probably contributing to the persistence of the pathogen (Chen et al. 2007; Guyot-Revol et al. 2006). It is possible that the conflicting results of Treg cells seen in leprosy may be at least partially associated with the use of different methodologies and cell markers to detect Treg cells in different compartments (circulation versus skin lesions). Our study provides important information about Treg cell participation in leprosy reactions. The evidence of increased Tregs during T1R is compatible with the immunopathogenic mechanism of T1R which is considered an exacerbation of cell mediated immunity. The same trend of higher Treg in T1R was also seen in one patient with T1R (Massone et al. 2010). However higher Foxp3 expression and lower frequency of Tregs in the circulation was seen in T2R (Attia et al. 2011). The lack of association between Tregs and T2R found in our study is also concordant with T2R immunopathologic mechanism which is based on humoral immunity and lack or only transient cell mediated immunity. Altogether our results suggest that the higher number of Tregs during T1R seems to be beneficial rather than detrimental to the host and may be associated with its immunomodulatory role to limit pathology. This finding raises the possibility to modulate Tregs for T1R therapy. Phenotypic identification of human Tregs is difficult because of the lack of specific markers. Expression of Foxp3 is considered a prerequisite for Treg function, as 93 mutations in Foxp3 gene result in autoimmune diseases due to dysfunctional T regs. However in humans Foxp3 is expressed on natural Tregs and not all Foxp3+ cells are Tregs (Morgan et al. 2005). Also, non Tregs can have transient expression of Foxp3 (Wang et al. 2007). In our study, although we have not included CD4 cell marker, we believe that the double stained CD25+ Foxp 3 + cells identified are indeed CD4 + Tregs. Although CD8+ suppressor cells have been identified in lepromatous leprosy in the 80’s, up to now no report has described CD8 + Tregs in leprosy (Ottenhoff TH et al. 1896; Modlin RL et al. 1986). Tregs can be either natural CD4+ Tregs or inducible CD4 + or CD8 + Tregs (induced by specific pathogen or derived antigens), however descriptions of human CD8+ Tregs are scarce (Joosten and Ottenhoff 2008). We have used the CD25 marker for Tregs which is the interleukin-2 receptor chain that is expressed at high levels on activated T cells and Tregs, and previous study has shown that some CD8 + Treg completely lack CD25 expression (Elrefaei et al. 2007). Moreover, phenotype and effector molecules of CD8 + Tregs are unknown. In this study, we have used an automated platform for the detection of double immunostained CD25 + Foxp3 + Treg cells which provided consistent procedures and results. Another strength of our methodology was the analysis and Treg counts performed by a single professional with vast expertise in dermatopathology, therefore eliminating inter-individual differences. We acknowledge that although we have used Treg counts cell count as an indirect indicator of functional activity, only functional evaluation can assess Treg activity. Another challenge to understand Treg cell function is the recent indication that Treg cells show some degree of plasticity and can lose their suppressive function, especially under autoimmune and inflammatory conditions (Noack and Miossec 2014). Developmental pro-inflammatory Th17 and suppressive Treg cell pathways are reciprocally regulated and can influence the outcome of immune responses in autoimmune and inflammatory conditions (Prakken B et al. 2013). Corroborating the assumption of a differential expression of Tregs upon infection, we have observed that the level of Treg cell expression for infectious skin diseases was similar, regardless of the etiologic pathogen. When leprosy, which is a dermatoneurological disease, caused by M. leprae was compared to other infectious-dermatoses, no difference in median Treg cell values was observed. Chronic infection with Leishmania major has been shown to depend on antigen specific Tregs present on the site of infection (Suffia et al. 2006). In the mouse model Leishmania major infection promoted Treg cell accumulation in the dermis, where they probably regulated the 94 immune response preventing complete eradication of the parasite from the host in part through IL-10 mediated mechanisms (Belkaid et al. 2002). In our study, leishmaniasis skin lesions investigated showed variable number of Treg cells ranging from 70 to 223 cells/mm2. Treg cells have the capacity to shape the infection as shown for human cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania guyanensis. Treg cells with suppressive function accumulated in the early phase of acute lesions, decreased thereafter and increased again in the chronic phase (Bourreau et al. 2009). The different frequency of Tregs seen in leishmanisasis lesions from our study may represent lesions collected at different stages of infection. In Kalazar, human visceral leismanisasis was not associated with expansion or accumulation of CD4+ Foxp3 + cells in the spleen or blood (Maurya et al. 2010) while Foxp3+ correlated with parasite burden in post kalazar dermal leishmaniasis (Katara et al. 2011). The equilibrium established between effector and regulatory T cells in sites of chronic infection probably reflect both parasite and host survival strategies. In conclusion, our study shows differential expression of Tregs in different human skin diseases, contrasting to their absence in normal skin. The role of Treg cells in infectious skin diseases was further substantiated by their higher numbers in infectious compared to non-infectious disease, while among infectious dermatoses, no difference was observed. The increased numbers of Treg cells seen during T1R is compatible with its immunopathological mechanism and favors the hypothesis of a beneficial role controlling exacerbated inflammation and lesion. In human infectious diseases Treg cells may function like as a “double-edged sword” in which both the host and the pathogen may benefit from their function: the pathogen because Tregs reduces effector immunity and leads to disease chronicity and the host because Treg activity limits tissue damage caused by inflammation and infection. Specific upregulation of Tregs during infection may increase effector immunity and lead to pathogen clearance. Vaccine studies for infectious diseases should incorporate knowledge on Treg induction and activity by both the vaccine and the pathogen (Joosten and Ottenhoff 2008). The immunomodulatory role of Tregs on skin infectious diseases is complex and multifaceted and certainly depend on the type of the infection, the pathogen, and the immune response induced. 95 References Attia, EA, Abdallah, M, Saad, AA, et al. (2011). Circulating CD4+ CD25 high FoxP3+ T cells vary in different clinical forms of leprosy. Int J Dermatol 49: 1152–8. Belkaid, Y, Piccirillo, C a, Mendez, S (2002). CD4 1 CD25 1 regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature 420: 633–7. De Boer, OJ, van der Loos, CM, Teeling, P, et al. (2007). Immunohistochemical analysis of regulatory T cell markers FOXP3 and GITR on CD4+CD25+ T cells in normal skin and inflammatory dermatoses. 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Nonredundant roles for Stat5a/b in directly regulating Foxp3. Blood 109: 4368–75. 98 Table 1. Main features of study groups. Study groups Dermatoses (n=29) Normal control (n=11) Leprosy (n=74) PB (n=13) MB (n=61) T1R (n=56) T2R (n=18) Gender (M/F) 15/14 0/11 49/25 06/07 43/18 35/21 14/4 Age Median (years) (range) 51 (6-70) 34 (16-55) 48 (20-75) 41 (20-73) 48 (20-75) 49 (20-75) 42 (20-71) Figure 1. Design for Treg cell study. 99 Figure 2. A) Treg cell counts in skin biopsies of patients with leprosy and other dermatoses. B) Treg cell counts in skin disorders (leprosy + dermatoses) and normal skin. C) Absence of double stained CD25 + Foxp3 + Treg cells in normal skin from a healthy individual submitted to elective mamoplasty. D) Double CD25 + Foxp3 + Treg cells inpityriasis rosea skin lesion; E) Double CD25+ Foxp3 + Treg cells in a paracoccidioidomycosis. Marks= 50 µm. 100 Figure 3. A) Treg cell counts in skin biopsies of patients with infectious dermatoses and in patients with non-infectious dermatoses. B) Treg cell counts in skin lesions of infectious dermatoses and leprosy. C) Double stained CD25 + Foxp3 + Treg cells in eczema lesion; D) Double CD25 + Foxp3 + Treg cells in a cutaneous leishmaniasis; E) Double CD25+ Foxp3+ Treg cells in syphilis skin lesion. Marks= 50 µm. 101 Figure 4. A) Treg cell counts in skin biopsies of paired biopsies reaction free/reactional. B and C) Treg cell counts in biopsies of paired biopsies of patients with T1R and reaction-free. D and E) T reg cell counts in biopsies of paired biopsies with T2R and reaction-free. F) Double stained CD25+ Foxp3+ Treg cells in a reaction-freeborderlinetuberculoid lesion; G) T1R lesion of the same patient depicted in Figure F during a T1R; H) Double CD25+ Foxp3+ Treg cells in a reaction-free borderline-lepromatous patient. I) T2R lesion of the same patient depicted in Figure I paired samples from patients. Marks: 50m. 102 Figure 5. A) T reg cell counts in skin biopsies of paired samples from patients with T1R at diagnosis and post-reactional. B) T reg cell counts in skin biopsies of paired samples from patients with T1R during MDT and reactional-free at diagnosis. C). Treg cell counts among T1R at diagnosis and T1R during MDT. D) Treg cell counts in skin biopsies of paired samples collected during T2R diagnosis and post-reactional lesion. E) Treg cell counts in skin biopsies of paired samples collected during T2R that occurred during MDT and reaction-free at diagnosis. F) Treg cell count among T2R at diagnosis and T2R during MDT. 103 Figure 6. A) Treg cell counts among different leprosy forms: TT, BT, BB, LL. B) Treg cell counts among different leprosy forms: TT, BT, BB, LL during leprosy reactions and in reaction-free lesions. C) Treg cell counts among paucibacillary and multibacillary leprosy. D) CD25+ Foxp3 + Treg cells in tuberculoid leprosy. E) CD25+ Foxp3+ Treg cells in borderline-tuberculoid leprosy. F) CD25 + Foxp3+ Treg cells in borderlinelepromatous leprosy. G) CD25+ Foxp3+ Treg cells in lepromatous leprosy. Marks: 50m. 104 Figure supplementary 1. Double stained CD25+ Foxp3+ Treg cells in different human skin diseases investigated: A) Lupus erythematosus. B) Paracoccidioidomycosis. C) American cutaneous leishmaniasis D) Syphilis. Marks: 50 µm. 105 5.2 Manuscript 2 Mast cell heterogenity in human dermatoses: in situ tryptase and chymase positive cells with emphasis on leprosy and leprosy reactions Maurício B. Costa1, Aline A. Freitas1, Emerith M. Hungria1, Ana Lúcia O. M. Sousa1, Kallyne K. O. Mimura2, Sônia M. Oliani2, Mariane M. A. Stefani1 1 Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil. 2 Department of Biology, Institute of Biosciences, Letters and Exact Sciences, São Paulo State University (UNESP), São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. Abstract Background: Mast cells (MCs) have regained interest due to their immunoregulatory role in several pathophysiological processes including skin inflammation by the production and secretion of a plethora of biologically active molecules. Tryptase (try) and chymase (chy) granule serine proteases are phenotypic markers of MCs and try+chy+ MCs predominate in human skin.This study investigated MCs heterogeneity in human dermatoses with especial emphasis on leprosy and type 1/T1R and type 2 leprosy reactions/T2R. Methods: Eighty skin biopsies from 3 groups were investigated: 40 newly diagnosed untreated leprosy patients (18 reaction-free, 11 T1R, 11 T2R), 29 patients with other dermatoses and 11 normal skin. Toluidine blue stained intact and degranulated MC counts/mm2, streptavidin-biotin-peroxidase immunostaining was used to detect try+and chy+ MCs and their density (median optical density) was evaluated (Axiovision software, Zeiss Axioskop 2, Carl Zeiss, 63X). Statistical significance of medians was assessed by Kruskall-Wallis and Mann-Whitney (p<0.05). Results: Infectious and non-infectious skin lesions showed higher numbers of degranulated than intact MCs in leprosy and other dermatoses, compared to normal skin. The numbers of degranulated MCs were higher than intact MCs regardless of the leprosy form (from tuberculoid/TT to lepromatous/LL), regardless of the occurrence of leprosy reactions (reactional and reaction-free) and regardless of the type of reaction (T1R/T2R). Try+ MCs numbers and density were higher than chy+ MC in normal skin, in leprosy, in reaction-free and reactional leprosy particularly in T2R, but not in other dermatoses. Conclusions: Overall results indicate differential expression/ activation of try+ and 106 chy+MCs subsets in leprosy compared to other skin diseases and to normal skin. However, neither leprosy form nor leprosy reaction was associated with MCs changes in lesions suggesting that the Mycobacterium lepraeinfectious process itself dictates MCs expression in leprosy skin lesions. Key words: mast cell, tryptase, chymase, leprosy, skin diseases Introduction Mast cells (MCs) represent one of the most versatile cells in the body and in the skin due to their ubiquitous distribution and the plethora of biologically active molecules they produce[1]. Although MCs have been classically associated with allergic responses, they have been shown to have a much broader role participating in diverse pathological processes of cutaneous inflammatory and non-inflammatory diseasesandthey can affect the immune system, promoting inflammation or even suppressing it. MCs are typically associated with connective tissues surrounding blood vessels, lymphatic structures, skin appendages and nerves and they are located at the upper dermal skin, respiratory tract and bowel mucosa which are sites where the host is exposed to external antigens, allergens, toxins and microbes[2, 3]. Human tissue MCs can express several neutral granule proteases, which represent the best phenotypic markers of MCs heterogeneity. Based on the protease content of their granules at least two subpopulations of cells can be differentiated: connective tissue mast cells that contain tryptase and chymase (try+chy+ MC), and mucosal mast cells that contain only tryptase (try+ MC) andalso mast cells positive to chymase only have been described (chy+ MC) [4, 5]. Almost all MCs in the human skin belong to the try+chy+ MCpopulation, whereas try+ MC predominate in the lung and bowel mucosa [6]. Pre-formed mediators stored in MCs secretory granules include different proteases, histamine, heparin proteoglycan, chondroitin sulphate E, acidic hydrolases, various cytokines and growth factors. Moreover, after activation, MCs can secrete newly-synthesized mediators, includingprostaglandin D2, leukotriene C4, and several cytokines, chemokines and growth factors. In addition, MCs can express cell membrane receptors and ligands. These molecules can modulate the immune system in the skin, e.g in psoriasis, atopic dermatitis and epithelialcancers and can regulate cutaneous wound healing after traumaand neoangiogenesis of malignancies[7–9]. MCs are known to undergo slow and partial degranulation after activation and other mechanisms such as exosome secretion and selective degranulation-independent 107 mediator secretion have been described [10–13]. Leprosy is a granulomatous, dermato-neurological disease caused by Mycobacterium leprae that represents an important public health problem in many endemic countries, some of them with growing emerging economies as India and Brazil [14].Leprosy shows a wide spectrum of clinical manifestations which depend on the immune response to the pathogen ranging from few localized skin lesions in paucibacillary (PB) diseasewith Th1 type cell mediated immunity (CMI), to disseminated multibacillary (MB) disease characterized by Th2 humoral immunity[15]. During the chronic course of leprosy, before, during or after treatment, some patients can develop acute immune inflammatory episodes known as leprosy type 1 and type 2 reactions (T1R, T2R). Leprosy reactions represent a major challenge for patients management because if not promptly treated, they can lead to irreversible nerve damage and consequent paresthesia, hypoesthesia or paresia[15].Leprosy reactions are characterized by an increase in the immune response with augmented levels of cytokines such as TNF-α, IL-1β, IFN-γ and IL-12 [16–18]. Leprosy skin lesions contain all the cells that are present in normal skin and also cells that migrate from the peripheral blood as a consequence of the granulomatous response, including MCs. The data about MCs in leprosy skin lesions are controversial however the majority of studies indicate increased number in lepromatous lesions [19– 23]. In order to understand the heterogeneity of MCs in human dermatoses, this study investigated tryptase and chymasesubsets of MCs in normal skin and several dermatoses with especial emphasis on leprosy skin lesions and type 1 and type 2 leprosy reactions. Methods 1. Study groups This study investigated the expression of MCs in 80 skin biopsies from three different study groups: leprosy, other skin diseases and normal skin. Forty newly diagnosed, untreated leprosy patients were recruited at the main regional public health center for leprosy diagnosis and treatment (Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica/CRDT in Goiânia, Goiás, Central Western Brazil) in a highly endemic area for leprosy. Patients were submitted to complete dermato-neurological examination by one single physician with expertise in leprosy diagnosis (ALOMS). After signing 108 informed consent, skin biopsies were obtained from the active edges of leprosy skin lesions. Leprosy patients were classified according to Ridley & Jopling criteria as tuberculoid/TT, borderline-tuberculoid/BT, borderline-borderline/BB, borderline lepromatous/BL, lepromatous/LL, taking into account clinical, bacilloscopic index (BI) and histopathologic findings [24]. Leprosy group comprised 14 paucibacillary patients (TT and BT- BI negative) and 26 multibacillary patients (BT, BL and LL- BI positive). Among 40 leprosy patients 18 were reaction-free patients and 22 had leprosy reactions, 11 had type 1 reaction and 11 had type 2 reactions. An additional group of 29 patients with other skin diseases was recruited at the same reference center and were diagnosed according to histopathology findings: eczema (n=5), pityriasis rosea (n=1), pityriasis alba (n=2), granuloma annulare (n=2), drug induced skin disorder (n=2), lupus erythematosus (n=2), necrobiosislipoidica (n=1), foreign-body granuloma (n=1) and urticaria (n=1); individuals with chronic infectious diseases as tinea (n=2) chromomycosis (n=1), cutaneous leishmaniasis (n=5), paracoccidioidomycosis (n=3) and syphilis (n=1). For ethical reasons no biopsies could be taken from normal skin or from healthy individuals. Normal skin by macroscopic and microscopic criteria was includedas control (n=11); these skin biopsies were taken from contralateral skin for histopathologic comparisons of certain skin diseases as scleroderma and vitiligo. Exclusion criteria used in this study were: patients under 18 years old, pregnant patients, co-morbidities as AIDS, tuberculosis and diabetes mellitus. This study was approved by the regional and national review boards (Comitê de Ética em Pesquisa Humana e Animal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás – protocol# 119/2005 and Comissão Nacional de Ética e Pesquisa/CONEP/Brasil – protocols # 4862 e 12962). All patients signed an informed consent form. Main features of study participants (Table 1) indicate that males predominated among leprosy patients and controls but patients with other dermatoses were mainly females. Age of participants (leprosy patients, other dermatoses and controls) was similar (p=0.730). 109 2. Histopathological analysis Skin biopsies were taken with a standard dermatologic biopsy punch (4mm) of the edges of well-characterized and infiltrated skin lesions and fixation was preformed with 4% neutral buffered paraformaldehyde for 24 hours. For leprosy patients, 3-4 µm sections of skin biopsies were stained by hematoxilin-eosin (HE) and by Fite-Faraco for bacilli detection and used for the Ridley& Jopling classification. Histopathologic features of different human skin diseases investigated in this study (lupus erythematosus, american cutaneous leishmaniasis, paracoccidioidomycosis, syphilis and leprosy) are shown in Figure 1 (A-F). Toluidine blue stained sections (0.5% in alcohol) were used for quantitative analysis of intact and degranulated mast cells. Intact mast cells were identified by metachromatic granules in the cytoplasm and degranulated mast cells were identified by the reduction of density in cytoplasmatic granules [25]. MCs were identified using ZEISSAXIOSKOP 2 (ZEISS, Jena, Germany). Photographic digital images of 1.0 mm2 (27 fields/section) were obtained by the Software AXIOVISION using a high power objective (40X, ZEISS,Jena, Germany) and analysed by two independent observers (KKM and MBC) with expertise in MCs morphology/analysis,blinded to the participants clinical status (different forms of leprosy, reactional or reaction-free leprosy, other dermatoses, normal skin) and comparable cell counts were obtained (p=0.63). For each stain, two separate counts were performed. For the intralesional count, the entire area of the skin lesion was scanned, and the immunopositive cells as well as the number of fields were recorded. For the perilesional count, only the fields of view along the interface between the lesion and its neighbourhood were chosen, and then the number of positive cells and fields were recorded. 3. Immunohistochemical analysis All skin biopsies from leprosy patients, other dermatoses and normal controls were submitted to streptavidin-biotin-peroxidaseimmunostaing method to detect tryptase and chymase positive MCs. Briefly, deparafinized, rehydrated skin biopsies were submitted to heat induced antigen retrieval (citrate buffer, pH 6, 96ºC, 20 minutes) endogenous peroxidase was blocked (3% hidrogen peroxidase, 30 minutes). After washes the diluted primary antibodies, mouse monoclonal anti-human tryptase (AA1;1:1000; Dako, Glostrup, Denmark) or mouse monoclonal anti-human chymase 110 (1:100; Abcam, Cambridge, UK) was incubated (16 hours, 4ºC), washed when the biotinilated secondary antibody and the peroxidase-streptavidin complex were added, incubated and revealed by 3,3-diaminobenzidine (DAB). All sections were counterstained with Harris Hematoxiline. For the negative control, the primary antibody was not added, while positive controls consisted of sections of normal small intestine mucosa which are rich in MCs and were used to validate immunostaining techniques. 4. Densitometry analysis The density of expression of tryptase and chymase in theMCs was calculated assessing 20 tryptase/chymase positive cells in each sample/section using Axiovision software (Zeiss Axioskop 2, Carl Zeiss, Jena, Germany, and 63 X)in three different areas/cell and was expressed as value of the mean optical density (MOD) in immunoreactive areas. 5. Data analysis Exploratory data analysis, includingmean, medians and standard deviation (SD) (GrafhPad Prism 6and MS Excel, 2010) was used to analyze the quantifications of degranulated and intact MC and try+ and chy+ positive MC/mm2 among different study groups. Statistical significance was assessed by Kruskall-Wallis one way analysis of variance for comparison of multiple groups and Mann-Whitney for comparison between two groups. Results 1. Mast cells activation Toluidine blue staining counts of total, intact and degranulated MCs in leprosy, skin dermatoses and normal skin sections (Figure 2 A-D) showed statistically significant differences (p=0.001).Higher numbers of total MCs were seen in normal skin compared to skin disorders (dermatoses and leprosy). Quantification of total MCs was diferent between all groups: leprosy vs dermatoses (p=0.007), leprosy vs normal controls (p<0.0001) and dermatoses vs controls (p=0.015). Differences in numbers of intact MCs among groups were statistically significant (p<0.0001) and the highest numbers were observed in normal skin, followed by dermatoses. Leprosy lesions 111 presented the lowest numbers of intact MCs (leprosy vs controls p<0.0001, leprosy vs dermatoses p=0.007 and dermatoses vs controls p=0.017). Higher numbers of degranulated MCs compared to intact cells were seen in dermatoses and in leprosy. The highest numbers of degranulated MCs were observed in leprosy lesions (p<0.0001), followed by dermatoses (p=0.001). In normal skin, no statistically significant difference was found between intact and degranulated MCs. 2. Tryptase and Chymase positive mast cells in leprosy, dermatoses and normal skin Heterogeneity of immunostained try+ and chy+MCs was compared in leprosy, other dermatoses and normal skin (Figure 3 A-H). The numbers of try+ MCs were similar in all groupswhereas counts of chy+ MCsdiffered (p=0.015) (Figure 3A).In leprosy lesions, the numbers of try+ MCs were higher than chy+ MC (p<0.0001) and the same trend was seen in normal skin (p=0.003). In other dermatoses the numbers of try+ and chy+ positive cells were similar. Densitometric analysis of chymase and tryptase positive cells confirmed differences identified by cell counts among groups (p=0.0001) (Figura 3B). Tryptase positive MC differed inleprosy vs dermatoses (p=0.011) and leprosy vs controls (p=0.009). Densitometric analysis of chymase expression was also different among groups (p=0.018) and the only statisticallysignificant difference was detected in leprosy vsnormal controls (p=0.008). Within each group densitometric analyses of tryptase and chymase were different in leprosy lesions (p=0.010) and controls (p=0.007) while no difference was observed in the dermatoses group (Figure 3B). 3. Mast cells in leprosy lesions 3.1 TT, BT, BL, LL leprosy forms Toluidine blue staining in leprosy lesions showed higher numbers of degranulated than intact MCs in TT, BT, BL and LL (Figure 4A); difference of degranulated and intact cells was significant in TT, BT and LL forms. Higher numbers of try+ than chy+ MCs were seen in TT, BT, BL, LL leprosy forms and statistically significant within TT and LL lesions (Figure 4B). Densitometric analysis of tryptase and chymase expression was similar in all leprosy forms, in MB (BT, BL,LL) vs PB (TT,BT) leprosy (data not shown). 112 Within leprosy skin lesions intact mast cells stained by toluidine blue and tryptase and chymase MCs were seen in the interstice, close to blood vessels; more often inside the inflammatory infiltrates and perianexial region. In leprosy granulomas MCs were identified more frequently in the lympho-histiocytic mantle than in the center. 3.2 LeprosyType 1 and Type 2 reactions Within reactional and reaction-free lesions (Figure 5A) the numbers of degranulated MCs were higher than intact cells and in both groups this difference was significant but the numbers of intact MC were higher in reactional than reaction-free patients. This trend of higher numbers of degranulated MCs than intact cells was maintained both in T1R and T2R lesions (p<0.050); intact and degranulated cell counts were similar between T1R and TR2. Try+ MCs numbers were higher than chy+ MCs both in reactional and reaction-free lesions (p<0.05). The same pattern was seen in T1R and T2R with higher numbers of try+ than chy+ MCs (p=0.040 and 0.006 respectively) however the difference was more pronounced in T2R (Figure 5B).Densitometric analysis showed that the expression of tryptase positive and chymase positive MCs in T2R was borderline (p=0.048) (Figure 5C). Discussion This study perfomed among 80 participants from three different study groups (leprosy, dermatoses and normal skin) shows the differential expression of MCs in diverse human skin diseases including leprosy and reactional episodes. MCs have recently regained interest as important immunomodulators in a wide variety of processes, including allergy, infectious and auto-immune diseases, cancers, venom reactions by insect sting and snake bite and in cutaneous wound healing after trauma[26–29]. In this study, emphasis was given to leprosy and MCs due to precedent evidence of cutaneous involvement of MCs in skin protection or pathogenesis in leprosy and other parasitic and bacterial infections [30–32] . Moreover MCs can recruit cells of the immune system,like T cells, neutrophils and eosinophils to the inflammatory site in the skin and they can stimulate maturation of Langerhans cells and dendritic cells and their migration to lymphnodes [1]. Leprosy is a dermato-neurological disease in which the clinical manifestations are closely associtated to the type of immune response 113 developed by the host. Moreover, the chronic course of leprosy can be interrupted by immune-inflammatory episodes known as leprosy reactions, which can lead to irreversible nerve damage[15]. Given the inflammatory properties of MCs and the immune-regulated manifestations of leprosy and of reactional episodes, it is expected that MCs may play an important role in leprosy skin lesions. In fact, results presented in this study indicate an active role for MCs as indicated by the presence of degranulated cells and mast cell proteases identified. MCs exert their physiological and pathological activities by releasing granules containing histamine, cytokines, chemokines, and proteases, including mast cellspecific chymase and tryptase. Degranulation of MCs contents implies not only activation but also functional activity [1]. In the current study, as expected, infectious and non-infectious inflammation in the skin led to higher numbers of degranulated MCs in leprosy and other dermatoses compared to normal skin. Moreover, taking leprosy as our study model, the numbers and the density of degranulated MCs were higher than intact MCs regardless of the leprosy form (from TT to LL), regardless of the occurrence of leprosy reactions (reactional and reaction-free) and regardless of the type of reaction T1R/T2R. Therefore leprosy and markers of MCs activation were seen in all forms of leprosy, paucibacillary (TT,BT) and multibacillary (BT, BL,LL) and no association of bacillary load and mast cell degranulation was found (data not shown). Moreover, although leprosy reactions are characterized by exacerbated inflammation in skin lesions (and nerves), degranulated MCs outnumbered intact cells both in reactional and reaction-free patients. Altogether these data indicate that MCs degranulation and functional activity are increased in skin disorders, particularly leprosy, independently of reactional episodes. Other studies using different methodologies identified higher numbers of MCs in lepromatous compared to tuberculoid lesions [20–22]. Reduced MCs stained by HE were observed in reactional versus reaction-free patients [33]. Several factors may account for differences in results obtained. MCs are difficult to visualize on routine stains, and they can be often confounded with other inflammatory cells. The toluidine blue is considered a classical stain and can differentiate degranulated and intact MCs. Since MCs maturation is based on heparin content, granule and size of the MCs, mature MCs are more easily identified in tissues than immature MCs due to their scarcity of secretory granules [34, 35]. Moreover, different methods of MCs identification and protocols for quantifications of MCs probably concur to controversial results described 114 in leprosy. Additionally some of the studies have investigated a very small number of patients. Serine proteases are the major protein constituents within MC secretory granules and these proteases are subdivided into chymases and tryptases depending on their primary cleavage specificity [5]. Proteases released by skin MCshave a specific function by degrading different proteins and peptides. Therefore, many MCs derived products such as tryptase and chymase can, through their enzymatic action, have detrimental effects on tissue structure/ modeling while MC derived mediators such as cytokines and chemokines can perpetuate inflammation. The role of MCs in skin diseases can be directly related to their granule content and our results revealed changes in the expression of some mast cell-specific proteases as chymase and tryptase in leprosy and reactions indicating that these proteases probably exert their enzymatic function in leprosy lesions. Tryptase is a neutral tetrameric serine protease of 134 kD composed of four monomers of 32 to 34 kD, each with one catalytic site [36]. Tryptase is the most abundant protein component of human MCs, which store it with full enzymatic activity in the secretory granules of all types of human MCs. MCs degranulate upon activation and release both histamine and tryptase together because tryptase is present in secretory granules in a complex with heparin proteoglycan [4]. The half life of tryptase in the circulation is longer than histamine, therefore tryptase has been used as a precise clinical marker of mast cell activation in systemic diseases as anaphylaxis and asthma [37]. Tryptase can have multiple functions stimulating smooth muscle, fibroblasts, and tissue turnover indicating that its enzymatic activity can be a therapeutic target via a putative inhibitor as indicated in a sheep model of human asthma [38]. Recent data indicate that MCs tryptase can have both stimulatory and inhibitory functions in skin inflammation and inhibitory function has been associated with its capacity to cleave eotaxin and RANTES, capacity to cleave neuropeptides and cathelicidin LL-37 (reviewed in 1). In leprosy, the relationship between tryptase MC and nerve fibrosis was investigated and an association between collagen increase and MC density in the epineurium, and not in the endoneurium, was observed [39]. These results suggest that MC contribute to collagenization in leprosy through tryptase secretion. In our study the numbers and the density of try+ MC were higher than chy+ MC in all leprosy forms (from TT to LL) and both in reaction-free and reactional lesions, especially in T2R. These results differed from other dermatoses. A previous double staining study of 115 try+/chy+ MC detected two populations of MC try+/chy+ and try+ chy- in leprosy biopsies [40]. Although in our study double tryptase, chymase immunostaining was not performed in skin biopsies, where try+ MC and chy+ MC predominate, our data show that the higher tryptase count than chymase and density indicates its selective expression in leprosy lesions. Try+ MC were significantly elevated in T2R which can be associated with vasculitis and evidence from cancer biology have revealed that MCs regulate angiogenesis through the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) and release of proangiogenic proteases. A previous study from our groupsearching for plasma markers of T1R and T2R used multiplex approach to measure 27 plasma factors including VEGF. For T2R the difference between reactional cases and reaction-free controls was marginally significant for VEGF (p=0.06) [41]. An increase of try+ MC in reactional biopsies compared to pre-reactional lesions has been previously reported [40]. Our results of higher try+ MC counts and density compared to chy+ MC in all leprosy forms, differ from the lower numbers of MC detected in LL leprosy [30]. In our study the numbers of chy+ MC were higher in dermatoses than in leprosy and normal skin and numbers of chy+ MC were similar in leprosy and normal skin. These results indicate that chy+ MC may have a more relevant participation in other skin diseases compared to leprosy. In fact chy+MC may be involed in skin lesions by different mechanisms. Chymase is protease mainly located in MCs granules and it has previously been demonstrated to be activated in tissue fibrosis, which may be more pronounced in the other dermatoses compared to leprosy [42–44]. Chymase has also been shown to be involved in tissue matrix remodeling due to its ability to activate procollagenase and degrade the extracellular matrix [45, 46]. Leprosy lesions mainly TT and LL show important differences in dermal collagen content, which may be attributed to different MCs subpopulations and products released [47]. Moreover, chymase contributes to the release of anti-inflammatory TGF-β1 from its precursor and it is also able to convert inactive interleukin-1β, a proinflammatory cytokine, to its active form. Human chymases can activate matrix metalloproteinases, produce angiotensin II, and induce endothelial cell and smooth muscle cell apoptosis [48–50]. Besides its proinflammatory capacity, chymase can regulate inflammation by degrading IL-6 and IL-13 and also TNF-α (reviewed in 1). A previous experimental study showed that MCchymase played a role in the normal wound healing process measured by the size of the burn wounds, the density of the capillaries, collagen accumulation and mast cell 116 number and chymase activity [51]. It is possible that MCchymase may also be participating in wound healing processes in both leprosy and other dermatoses. Immunohistochemistry for MC proteases as tryptase and chymase is considered a specific and sensitive approach for assessing mast cells in tissues. However, chymase detected in a subset of MCs only and try+ chy+MCs predominates in human skin. The MC quantifications data in our study has been validated by two independent experts in dermatopathology that have used precise anti-tryptase and anti-chymase immunostaining methods for identification of MC subsets. We acknowledge that we have used only indirect evidence of mast cell activation such as degranulation and protease content and that evaluation of functional activity, which was not performed in this study, may be more important than their overall numbers in skin lesions. Conclusions The present study shows differential mast cell expression and try+ and chy+ subsets in leprosy and dermatoses compared to normal skin. The potential role of MC in these pathologic processes is justified by the multitude of biologically relevant molecules they produce and secrete. Furthermore, we observed that for leprosy, evidence of mast cell activation assessed by degranulation and tryptase expression seems to be triggered by the infectious process and is not influenced by the leprosy form (form TT to LL), nor the occurrence of leprosy type 1 and type 2 reactions. List of abbreviations BB: Borderline-borderline; BL: Borderline-lepromatous; BT: Borderline-tuberculoid; Chy: chymase; DE: other dermatoses; F: Female; HE: hematoxilin-eosin; IB: bacilloscopic index; IFN:interferon gamma; IL: Interleukin; LL: lepromatous; M: Male; MB: multibacillary; MCs: mast cells; mm2: square millimeter; MOD: mean optical density;NC: normal controls; PB: paucibacillary; SD: standard deviation; T1R: type 1 reaction; T2R type 2 reaction; TGF: transforming growth factor; Th1: T helper 1; Th2: T helper 2; TNF:tumor necrosis factor; Try: Tryptase; TT: tuberculoid; VEGF: vascular endothelial growth factor. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. 117 Author’s contributions MBC participated in the design of the study, carried out the histopathological analysis, immunohistochemical analysis, densitometry analysis and drafted the manuscript. AAF and EMH participated in the field work, performed the statistical analysis and drafted the manuscript. ALOMS participated in the field work in the diagnosis of leprosy patients. KKOM carried out the histopathological analysis, immunohistochemical analysis, densitometry analysis and performed the statistical analysis, SMO participated in the design the study, coordinated the field work and analyzed the data. MMAS conceived, designed the study, coordinated the field work, analyzed the data and contributed to write the manuscript. All the authors read and approved the final manuscript. Author’s information 1 Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, 235th Street, Setor Universitário, Goiânia-Goiás, Brazil. 2 Department of Biology, Institute of Biosciences, Letters and Exact Sciences, São Paulo State University (UNESP), São José do Rio Preto- São Paulo, Brazil. Acknowledements This study was supported by American Leprosy Missions. Dr. Mariane M. A. Stefani is a recipient of a fellowship from CNPq (grant # 304869/2008-2), EMH is supported by a fellowship from CNPq (grant# 141554/2013-4) and AAF is supported by a fellowship from CAPES (grant# 1054292). 118 References 1. Harvima IT, Nilsson G: Mast cells as regulators of skin inflammation and immunity.Acta Derm Venereol 2011, 91:644–50. 2. Eady RA, Cowen T, Marshall TF, Plummer V, Greaves MW: Mast cell population density, blood vessel density and histamine content in normal human skin. Br J Dermatol 1979, 100:623–633. 3. Galli SJ, Nakae S, Tsai M: Mast cells in the development of adaptive immune responses.Nat Immunol 2005, 6:135–142. 4. Schwartz LB, Irani AM: Mast cell heterogeneity.Clin Exp allergy 1989, 19:143– 145. 5. Weidner N, Austen KF: Heterogeneity of mast cells at multiple body sites. Fluorescent determination of avidin binding and immunofluorescent determination of chymase, tryptase, and carboxypeptidase content.Pathol Res Pract 1993, 189:156–162. 6. 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PBa patients group: 10 TT and 4 BT; MBb patients group: 6 BT, 15 LL and 5 BL. 123 Figure 1. Histopathologic findings in different human skin diseases investigated: A) Lupus erythematosus (HE) and inset PAS stain demonstrating a thickened and tortuous basement membrane zone; B) American cutaneous leishmaniasis (HE); C) Paracoccidioidomycosis (inset shows fungi stained by Grocott silver); D) Syphilis (HE); E) Borderline-lepromatous leprosy (HE) and inset acid fast bacilli (Fite-Faraco staining); F) Acid fast bacilli in lepromatous leprosy (Fite-Faraco staining). Marks: 100 µm (A-E) and 50 µm (F). 124 Figure 2. Histopatological features of mast cells in: A) Intact and degranulated mast cells by toluidine blue staining in leprosy lesions, other dermatoses and normal skin. Intact MCs are identified by arrowheads and degranulated MC are identified by arrow; B) Borderline lepromatous leprosy; C) other dermatoses (Eczema) and D) normal skin. Marks: 20 µm (B-D). 125 Figure 3. A) Tryptase and chymase positive MCs numbers in leprosy lesions, others dermatoses and normal skin (controls); B) Densitometric analyses of tryptase and chymase in leprosy lesions, others dermatoses and normal skin (controls); C, E, G: Tryptase positive mast cells in borderline lepromatous leprosy (C), others dermatoses (Eczema) (E) and normal skin (G); D,F,H: Chymase positive mast cells in borderline lepromatous leprosy (D), others dermatoses (Eczema) (F) and normal skin (H). Bars: 20 µm (C-H). 126 Figure 4. A) Toulidine blue stained intact and degranulated MCs among leprosy forms according Ridley & Jopling (TT, BT, BL and LL). B) Immunohistochemistry analyses of tryptase and chymase positive MCs among leprosy forms according Ridley & Jopling (TT, BT, BL and LL). 127 Figure 5: A) Toulidine blue stained intact and degranulated MC among reactional and reaction-free leprosy patients and among T1R and T2R; B) Tryptase and chymase positive MC among reactional and reaction-free leprosy patients and among T1R and T2R. C) Densitometric analyses of trypase and chymase positive MCs among reactional and reaction-free leprosy patients and among T1R and T2R. 128 6. CONCLUSÕES Células Tregs em doenças cutâneas As células Treg estão ausentes em pele normal enquanto números variáveis são detectadas em doenças cutâneas, infecciosas e não infecciosas, sendo maior nas infecciosas. Entre asdoenças cutâneas infecciosas de diferentes etiologias, observamos distribuição semelhante das Tregs. As células Tregs estão aumentadas na RT1 mesmo quando o paciente desenvolve reação durante MDT, enquanto nenhuma variação de Treg foi vista na RT2. Na hanseníase não houve associação entre formas de hanseníase e as células Tregs. Concluímos que as células Treg fazem parte do infiltrado inflamatório da hanseníase, não sofrem efeito das variações clínicas, microbiológicas, imunológicas da hanseníase. O aumento das células Tregs, visto na RT1, é compatível com sua imunopatologia e sugere papel benéfico para o hospedeiro, protegendo contra a imunopatologia. Mastócitos em doenças cutâneas Os mastócitos são células identificadas na pele normal. Lesões cutâneas de origem infecciosa e não-infecciosa apresentam números aumentados de mastócitos desgranulados em relação aos intactos, tanto na hanseníase como nas outras dermatoses quando comparados com pele normal. Os números de MC desgranulados superam os intactos independente da forma de hanseníase (do polo tuberculoide/TTao lepromatoso/LL), independe da ocorrência das reações hansênicas (lesão reacional/sem reação) e independente do tipo de reação (RT1/RT2). Números e densidade de MC try+foram maiores que MC chy+ na hanseníase, em pacientes com e sem reação, particularmente na RT2, mas não nas dermatoses estudadas. Estes dados sugerem que o processo infeccioso pelo Mycobacterium leprae, per se direciona a expressão de MC nas lesões cutâneas da hanseníase. 129 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abbas A, Lichtman A, Pillai S. Effector Mechanisms of Cell-Mediated Immunity. Cellular and Molecular Immunology: Elsevier Saunders, 2012 (a). pp. 225-242. Abbas A, Lichtman A, Pillai S. IgE-Dependent Immune Responses and Allergic Disease.In Saunders E, ed. Cellular and Molecular Immunology: Elsevier Saunders, 2012 (b). pp. 425-444. Abbas A, Lichtman A, Pillai S. Innate Immunity. 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