Aula Teórica

Fenómenos de Transporte
Sedimentação
Sedimentação: para quê?

Sedimentação – movimento de
uma partícula por acção de um
campo centrífugo

Técnica usada para
separar
purificar
analisar
 espécies celulares
(proteínas, ácidos nucleicos,
cromossomas, mitocôndrias)
 polímeros
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2
Sedimentação: num
campo gravitacional
Peso:
Num fluido a força que
promove a queda da
partícula
mg
 m = massa da partícula
sedimentada

Força de impulsão :
 m 
  = densidade do fluido

 m = volume efectivo da
partícula
Peso
Impulsão



Fd  mg  m g  m1    g



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Sedimentação: num
campo gravitacional
F  f  vt
Força de atrito
velocidade terminal
que de atinge quando
dv/dt=0
 A força de atrito contrapõe-se ao movimento
 No equilíbrio as forças igualam-se:



f  vt  m1    g





m1    g

vt  
f
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Sedimentação: numa

ultracentrífuga
São aplicados os mesmos princípios e fórmulas só que a aceleração
da gravidade (g) é substituída pela velocidade angular (w2 r)



m1    w2 r

vt  
f
Vamos ver Porquê
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Sedimentação numa ultracentrífuga
Estado inicial
Alta velocidade
de rotação
Baixa velocidade
de rotação
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Sedimentação: numa ultracentrífuga
Aplicando uma força
centrífuga e causando um
movimento de rotação à
partícula, com uma
frequência angular  , ela é
fortemente acelerada e atinge
rapidamente a velocidade
terminal
A velocidade terminal atinge-se quando as forças envolvidas ficarem balanceadas
Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0
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Sedimentação: numa ultracentrífuga
Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0

Fc- força centrífuga = 2 r m
(onde m reperesenta a massa da partícula e -2r representa a aceleração centrípeta)
Fd- força de fricção (viscosidade) = -f v
(onde f é o coeficiente de fricção e v a velocidade terminal)


Fb- força de impulsão = -2 r m0
(onde m0 é a massa do solvente deslocado pela partícula)
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Sedimentação: numa ultracentrífuga
Relembre:


Então
Rearranjando
Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0
 fv   2 r m0   2 rm  0
 r m  m0   fv  0
2
 m0 = volume específico parcial da partícula densidade

 = Volume específico parcial
 = densidade da solução
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Sedimentação: numa ultracentrífuga
 Substitua na equação anterior o m0 :
 r m  m0   fv  0
2
 Colocar os parâmetros moleculares de um lado e os parâmetros
experimentais do outro
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Sedimentação: Coeficiente
_


M 1   sol 
v

s  2t  
 r
N AV f
de sedimentação
Definição de coeficiente de
sedimentação
M  massa molecular m  N AV 
s
S  Coeficient e de sedimentação
velocidade terminal (vt )
aceleração ( 2 r )
IMPORTANTE
O coeficiente de sedimentação depende da massa molecular (M)
e do coeficiente de fricção (f)
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Coeficiente de sedimentação: significado
O coeficiente de sedimentação é a distância (cm) percorrida pela molécula,
durante 1 segundo, sob efeito de uma força de 10-2 N kg-1, no solvente água, a
293 K.
S depende:
a) Propriedades moleculares da molécula.
 m - massa molecular
  - volume específico parcial
 f – forma da molécula
b) Propriedades da solução.
  - densidade
  - viscosidade (porque f depende de )
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Coeficiente de sedimentação experimental
Unidades
v
cm / s
s

s
2
aceleração cm / s

O coeficiente de sedimentação experimental sofre influência da
temperatura e da viscosidade

Como s depende das propriedades da solução, os valores medidos,
devem ser convertidos para as condições padrão, (temperatura é
20°C e o solvente é a água) (para poderem ser comparáveis para
diferentes moléculas)

S20,w

(Svedberg)
1s= 10-13 segundos
Nota: S20,w é uma propriedade única da partícula e pode ser utilizado
para avaliar mudanças conformacionais
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Relação entre difusão e sedimentação

Segundo Stokes

A equação de Einstein
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Velocidade de sedimentação:
permite calcular
EM RESUMO…….






Coeficiente de sedimentação
Coeficiente de difusão (se os componentes sedimentados são bem
preparados)
Massa efectiva dos componentes do soluto
Formato das partículas (assimetria)
Em condições
Homogeneidade e estados de agregação
experimentais diversas!!!!
Constantes de associação e estequiometria
Sem interferências
externas!!!!
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Relação entre s e M

A velocidade de sedimentação de uma partícula depende da sua M
◦ Quanto maior for M maior o valor de s

O coeficiente de atrito f , reduz o valor de s
◦ Quanto menos globular for uma proteína menor a sua velocidade de
sedimentação

Quanto maior a densidade de uma partícula maior a sua velocidade
de sedimentação
◦ Quanto maior for o valor da componente (1-) maior a velocidade de
sedimentação
M
sRT
_


D1   


Nota: Os itens 2 e 3 são importantes
para o estudo estrutural de proteínas
quando comparadas com proteínas com
a mesma massa
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Determinação do Coeficiente de Sedimentação:
métodos
O valor de S deve ser extrapolado a uma diluição infinita por forma a
obter parâmetros molecularmente significativos

Método da velocidade de sedimentação

Sedimentação de fronteira
◦ Sedimentação de uma macromolécula numa solução homogénea

Sedimentação em gradiente (zonal, ou em faixas ou em bandas)
◦ Sedimentação de uma macromolécula em gradiente de concentração
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Método da velocidade de sedimentação
Fornece informação hidrodinâmica sobre as moléculas em solução
Parâmetros experimentalmente determinados:
 Coeficiente de sedimentação, s, a constante de difusão, D, e
em alguns casos, a massa molecular, M.
 Se a massa molecular é conhecida, o coeficiente de
sedimentação pode ser usado para obter uma estimativa da
forma molecular da molécula em solução
Usado para grandes moléculas que difundem lentamente.
A força de sedimentação deverá ser muito superior à força de
difusão
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Sedimentação de fronteira



Começar com uma solução homogénea de macromolécula
Como a solução é centrifugada na ultracentrífuga, as
macromoléculas movimentam-se por acção desse campo , gerandose uma zona limite de solvente
Seguindo essa faixa limite ao longo do tempo, podemos calcular o
coeficiente de sedimentação
_


M 1   sol 
vt

s 2  
 r
N AV f
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Sedimentação de fronteira
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Sedimentação de fronteira
s
2,303

2
 slope
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Ultracentrifugação analítica: Aparelhagem usada
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Velocidade de sedimentação limite: limitações ao
método
 Dispersão das zonas limite (se a difusão se torna significativa)
-Difusão e sedimentação são duas formas de transporte do
soluto
-A sedimentação gera gradiente, a difusão opõe-se a esse efeito
 Dificuldade de separar componentes em misturas complexas
 Necessita de equipamento caro
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Difusão radial : um fenómeno que contribui para a
limitação
• A difusão radial ocorre em
consequência da forma que têm as
células de sedimentação.
• Todas as moléculas (não importa em que
posição estejam) difundirão na mesma
extensão causando uma redução na
densidade óptica observada. Para um
dado tempo, esta difusão é a mesma em
cada ponto da célula
• A Difusão radial pode ser observada
através da redução do “plateau” nos
sucessivos scans da absorvência
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Efeito da difusão na sedimentação
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Espalhamento de zonas : Difusão versus heterogeneidade
Dificuldade de separar componentes em
misturas complexas
1- Sistema com um componente ( as
bandas espalham-se devido à difusão e dá
um aspecto sigmoidal)
2- Sistema multicomponente ( os
degraus que definem os perfis de cada
componente podem perder definição
quando aumenta a difusão)
3- Sistema multicomponente ou
monocomponente? ( sem análises
posteriores é impossível afirmar se o
limite de espalhamento é devido à
heterogeneidade de S ou se é devido à
difusão)
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Como obviar essas limitações?
Utilize o mesmo método mas em gradiente de concentração
Centrifugação por Zonas
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Centrifugação em zonas ou pelo método da
velocidade de sedimentação



Preparação de um gradiente contínuo de densidade usando
sacarose centrifugando uma solução de sacarose
Aplicar a amostra sobre o gradiente.
Recolher as fracções dos componentes separados
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Velocidade de sedimentação em gradiente de
concentração: vantagens e desvantagens
Limitações:
- não é exacta a medida da massa molecular
Vantagens:
- resolução completa dos componentes de uma mistura
- relativamente barata
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Sucrose Density Centrifugation of
Cellular Membranes from G. violaceus
S é determinado pelo deslocamento
da banda, no tubo de centrífuga,
com o tempo
(A) Schematic of the sucrose density gradients
used for separation; the dark shading at the
bottom represents the area of sample
application in 50% sucrose (w/w).
(B) The gradient after 16 h of centrifugation at
160,000g displays an orange (1.07 g/mL) and a
green (1.16 g/mL) membrane fraction.
(C) A distinct band is formed from the green
fraction in (B) when recentrifuged on the
sucrose density gradient.
(D) A third membrane fraction with an
apparent density of 1.19 g/mL (corresponding
to the outer membrane) is obtained when the
boundary between the 48 and 50% layer is
applied to a second sucrose gradient
centrifugation.
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Exercício
Sedimentação
Exercício prático
Calcular o coeficiente de sedimentação (s) e o coeficiente de fricção (f) para a E.
Coli DNA ligase em soluções diluidas de tampão aquoso (20 mM de fosfato, 10
mM NH4Cl, pH 6,5 e temperatura de 20,6°C. Considere os seguintes dados:
Peso Molecular = 74,000g/mol
Vmolécula= 0,737 cm3/g
tampão= 1,010 g/cm3 a 20,6°C

= 56,050 rpm
T(min)
x1/2
log x1/2
0
5,9110
0,7717
20
6,0217
0,7797
40
6,1141
0,7863
60
6,2068
0,7929
80
6,3040
0,7996
100
6,4047
0,8065
120
6,5133
0,8138
140
6,6141
0,8205
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Exercício Prático
= 56,050 rpm x (2 radianos/revolução) (1 minuto/60 segundos)
=5,87 x103 rad/segundo
 1   2,303d log x1/ 2 
s   2 

dt

  
2,303x3,42 10 min x
s
5,87 10 rad / s x60s min 
4
3
1
1 2
S= 2,31 x 10-11 segundos= 23,1 S
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Exercício Prático
Calcule agora o coeficiente de fricção
  
m1    
vt

f  2  
 x
s
Primeiro calcule o valor de m
74,000 g / mol
19
m

1
,
23

10
g
23
6,023 10 moléculas / mol
e….
1,23 10
f 
g 1  0,737 1,010
5,87 103 rad / seg
19
f  5,57 10 24 g / seg
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Fenómenos de Transporte
MÉTODO DO EQUILÍBRIO DE
SEDIMENTAÇÃO OU
SEDIMENTAÇÃO ISOPÍCNICA
Sedimentação: Equilíbrio de sedimentação

Baixas velocidades de rotação
◦ Balanço entre as forças de
sedimentação e as forças de
difusão (A amostra é
simultaneamente sujeita a
sedimentação e a difusão
produzindo-se um gradiente que
não variará até que o equilíbrio seja
atingido)
◦
Não há transporte efectivo
◦
Não há influência da forma das
partículas
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Fenómenos de transporte: Equilíbrio Sedimentação
Distribuição das moléculas num campo
gravitacional ou centrífugo após atingir o
equilíbrio
O balanço entre a força de sedimentação
numa dada direcção e o efeito aleatório da
difusão
origina
um
gradiente
de
concentração; a concentração no fundo do
tubo é maior.
O gradiente de concentração depende do
peso molecular das moléculas
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Sedimentação: equilíbrio de sedimentação
Informação termodinâmica
Sedimentação  gradiente de concentração  difusão
Equilíbrio de gradiente de concentração: sedimentação é exactamente
balanceada pela difusão (moléculas exponencialmente distribuídas ao
longo da célula)
Equilíbrio: J = 0
J = Jsed + Jdifusão
J sed  vt c
J dif
dc
 D
dx
dc
0
dx



m1    2 x

vt  
f
vt c  D
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Sedimentação: equilíbrio de sedimentação



m1    2 x

D 2 x 



vt 

M 1   
f
RT



D 2 x 
dc

M 1   c  D
RT
dx



1 dc  2 


M 1    x
c dx RT 


1
2 

dc 
M 1    xdx
c
RT 

2

c2 1
x2 


dc

M
1



 xdx
c1 c x1 RT 


 c2   2

 2


ln   
M 1    x2  x12

 c1  2 RT 

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
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Sedimentação: equilíbrio de sedimentação
 Calcular M através do declive
Ln c
Declive =




M 1   
2 RT 

2
x2
Nota: Este método não necessita da determinação de D
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40
Equilíbrio de sedimentação: permite calcular

Massa / peso molecular

Homogeneidade em relação ao peso molecular

Estados de agregação

Estequiometria e constantes de equilíbrio para
processos de associação
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41
Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente
de concentração
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Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente
de concentração
Solução das macromoléculas preparada
em solução de CsCl
Centrifugação até ao equilíbrio  produz
um forte gradiente de CsCl e
consequentemente um gradiente de
densidade através do tubo
Se a concentração de CsCl é
correctamente
escolhida
as
macromoléculas
migram em banda
através do gradiente do solvente até que
(1-molécula )=0
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43
Centrifugação: equilíbrio de sedimentação com gradiente de
concentração
Solução das macromoléculas
preparada em solução de CsCl
Centrifugação até ao equilíbrio 
produz um forte gradiente de
CsCl e consequentemente um
gradiente de densidade através
do tubo
Se a concentração de CsCl é
correctamente escolhida
as
macromoléculas
migram em
banda através do gradiente do
solvente até que (1-molécula )=0
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Em RESUMO…….
M 1  v   s

RT
D
M
2 RT
 2 1  v  

d ln c
dr 2
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Relação entre o coeficiente de sedimentação e o
peso molecular de proteínas
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46
Forma, massa e densidade de proteínas
/coeficiente de sedimentação
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47
CONCLUSÃO
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48
Fenómenos de Transporte
ELECTROFORESE
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Eletroforese:
generalidades
Transporte de partículas num campo eléctrico
Técnica usada para separar e às vezes purificar
macromoléculas que diferem na carga, conformação ou
tamanho
Aplicações:
Separação de compostos com carga (aminoácidos,
péptidos, proteínas, ácidos nucleícos). Carga dependente
do pH do meio. Moléculas negativas e positivas movemse em direcções opostas ao campo eléctrico.
 Determinação da composição das proteínas por
comparação com padrões electroforéticos
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Separando fragmentos de DNA:
Eletroforese em Gel
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Eletroforese de Proteinas Séricas
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Eletroforese: princípios gerais
 Movimento molecular sob acção de um campo eléctrico
Num solvente não condutor:
Força de eléctrica (Coulomb):
F = qE
q= Z e
Força de fricção: Ff = - f v
Z = nº de cargas (sem dimensões)
e = carga eléctrica (1,6022 x10-19 C)
E= campo eléctrico (volt m-1)
f = coeficiente de fricção (Kg s-1)
v= velocidae de migração
No equilíbrio:
V = Fe + Ft = 0
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Como proceder?

Aplica-se uma diferença de potencial e a partícula move-se na
direcção do polo de carga oposta

No início há resistência devido à viscosidade do meio mas a certa
altura atinge-se um equilíbrio quando as forças electrostáticas
atractivas se igualam à resistência ao fluxo. Então a mobilidade
electroforética passa a ser constante
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Recorde…

Mobilidade Electroforética (u) é a velocidade linear (v) por
unidade de gradiente de potencial eléctrico (X)
v

X
ou
v Z
    mV 1s 1
E f


Traduz-se pela razão entre a velocidade da macromolécula (v) e o
potencial eléctrico (E) que promove o movimento , ou
Traduz-se pela razão entre a carga líquida da partícula (Z) e o seu
coeficiente de fricção (f)
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Mobilidade electroforética e carga da partícula

Para uma molécula esférica
f  6r

Então:
Z
u
6r

A mobilidade electroforética serve para medir a carga da partícula
num meio não condutor
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Eletroforese: mobilidade eletroforética
Contudo....
* molécula carregada rodeada por atmosférica iónica (dificulta
a interpretação dos resultados de mobilidade)
* molécula carregada altera o coeficiente de fricção
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Mobilidade electroforética e peso molecular

Pode-se usar a mobilidade electroforética para
determinar o peso molecular ?




Os ácidos nucleicos podem ser separados de acordo com o
peso molecular porque possuem uma carga de fosfato por cada
base (nucleótido)
Para as proteínas o número de cargas depende da composição
dos aminoácidos e do pH do tampão
As cadeias polipetídicas de determinado comprimento podem
adquirir diferentes formas com diferentes coeficientes de fricção
(f ) (é proporcional ao seu comprimento)
Para usar a electroforese para determinar o peso
molecular é necessário:


Desnaturar as proteínas
Introduzir uma carga em cada peptídeo
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Electroforese em gel: determinação do peso
molecular das proteinas
A carga e as propriedades hidrodinâmicas da proteína são função do seu peso
molecular
log M  a  bx
M = peso molecular da
proteína;
X = distância de migração
no gel (proporcional à
mobilidade)
a e b = constantes para
um dado gel e um dado
campo eléctrico
Calibrar com proteínas de peso molecular conhecido
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Em Resumo……
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Nota: desvios a esta relação ocorrem quando as proteínas se ligam a uma
64