TGF-β1 PROMOVE O AUMENTO DA EXPRESSÃO DA MOLÉCULA

TGF-β1 PROMOVE O AUMENTO DA EXPRESSÃO DA MOLÉCULA DE
ADESÃO INTERCELULAR ICAM-1 E FAVORECE O PARASITISMO EM
CÉLULAS TROFOBLÁSTICAS HUMANAS (LINHAGEM BEWO)
INFECTADAS POR Toxoplasma gondii
Janice Buiate Lopes Maria1
Laboratório de Histologia e Embriologia
Av. Pará, 1720 – Bloco 2B - Campus Umuarama - 38405-320 - Uberlândia, MG - Brasil
[email protected]
Bellisa de freitas Barbosa2
Laboratório de Histologia e Embriologia
Av. Pará, 1720 – Bloco 2B - Campus Umuarama - 38405-320 - Uberlândia, MG - Brasil
[email protected]
Deise Aparecida de Oliveira Silva2
Laboratório de Imunoparasitologia
Av. Pará, 1720 - Bloco 4C - Campus Umuarama - 38400-902 - Uberlândia, MG - Brasil
José Roberto Mineo2
Laboratório de Imunoparasitologia
Av. Pará, 1720 – Bloco 4C – Campus Umuarama - 38400-902 - Uberlândia, MG - Brasil
Eloisa Amália Vieira Ferro2
Laboratório de Histologia e Embriologia
Av. Pará, 1720 – Bloco 2B - Campus Umuarama - 38405-320 - Uberlândia, MG - Brasil
Resumo: O trabalho verificou a expressão de ICAM-1 e a susceptibilidade de células BeWo e HeLa
a Toxolasma gondii sob influência de IL-10 e TGF-β1. Para isso, 5x104 células BeWo e HeLa
foram cultivadas sobre lamínulas redondas de 13mm em placas de cultura de 24 poços. Após 24hs
a 37°C e 5% de CO2, as células foram tratadas com IL-10 ou TGF-β1 ambas a 50ng/ml. Depois de
mais 24hs, parasitos da cepa RH de T. gondii foram adicionados às placas numa proporção de
cinco parasitos por célula e incubados por 3hs. Em seguida, as células receberam novamente IL-10
ou TGF-β1 e foram incubadas por mais 24hs. Posteriormente, as células foram fixadas com formol
10% para a detecção da expressão de ICAM-1 por imuno-histoquímica ou para determinação do
índice de replicação de T. gondii. A análise estatística foi feita pelo teste Mann-Whitney e
resultados foram significantes quando P≤0,05. Células BeWo não expressaram ICAM-1 na
ausência de infecção e apresentaram baixa positividade para ICAM-1 quando infectadas. Quando
infectadas e tratadas com IL-10 ou TGF-β1, células BeWo mostraram-se altamente susceptíveis a
T. gondii, porém a expressão de ICAM-1 foi significante apenas na presença de TGF-β1. Células
HeLa, quando infectadas por T. gondii, apresentaram maior positividade para ICAM-1 quando
comparadas às não infectadas. Quando infectadas e tratadas com IL-10 ou TGF-β1, células HeLa
não tornaram-se mais susceptíveis a T. gondii e não aumentaram a expressão de ICAM-1.
Portanto, TGF-β1 é uma citocina que aumenta a expressão de ICAM-1 em células BeWo, além de
favorecer a infecção por T. gondii nestas células, demonstrando que ICAM-1 pode facilitar a
invasão deste parasito em células trofoblásticas.
Palavras-chave: BeWo, ICAM-1, Toxoplasma gondii,IL-10, TGF- β1.
1
Acadêmica do curso de Ciências Biológicas
Orientadores do projeto de pesquisa
2
1
1.INTRODUÇÃO
1.1 Toxoplasma gondii e a Resposta Imune
T. gondii é um protozoário parasito de hábito obrigatoriamente intracelular, pertencente ao
filo Apicomplexa e subclasse Coccidia (Montoya e Liesenfeld, 2004). T. gondii possui três formas
infectantes distintas: taquizoíta, na qual o parasito com forma arqueada se multiplica rapidamente
no interior da célula hospedeira até que esta se arrebenta liberando os parasitos, que invadirão novas
células; bradizoíta, que tem a mesma morfologia dos taquizoítas, mas agora se encontram em cistos,
que são formas de resistência contra a defesa imunológica do hospedeiro; e a forma esporozoíta,
que é o resultado da reprodução sexuada do parasito em hospedeiros definitivos, representados
pelos felinos (Montoya e Liesenfeld, 2004).
O parasito é transmitido pela ingestão de cistos teciduais presentes em tecidos de animais
infectados ou ainda, pela ingestão de alimentos ou água contaminados com oocistos, os quais são
liberados nas fezes de gatos jovens infectados (Dubey, 2000). A doença é geralmente assintomática
em indivíduos imunocompetentes, mas o parasito pode causar toxoplasmose grave em indivíduos
imunocomprometidos e em crianças no caso da transmissão materno-fetal (Kim e Weiss, 2004). Em
fetos a toxoplasmose está associada com problemas congênitos severos ou mesmo aborto (Menzies
et al, 2007) quando a mãe se infecta com o parasito no primeiro trimestre da gestação (Remington
et al, 2001). Quando a mãe adquire a infecção anteriormente à gestação, não há risco de transmissão
do parasito ao feto, porém o feto pode adquirir a doença se a infecção materna acontecer pouco
tempo antes da concepção (Chemla et al, 2002; Vogel et al, 1996).
O parasito T. gondii induz diferentes respostas imunes de acordo com o tecido em que está
(Filisetti e Candolfi, 2004). A imunidade celular que ocorre por meio de macrófagos, células
“natural killers” (NK), linfócitos T e leucócitos polimorfonucleares é a forma de defesa
fundamental do hospedeiro imunocompetente contra o parasito (Denkers e Gazzinelli, 1998).
Os macrófagos são células apresentadoras de antígeno (APCs), que secretam citocinas próinflamatórias tais como IL-12 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Abbas e Lichtman, 2003;
Hunter et al, 1995). A ativação do macrófago por IFN-γ é capaz de ativar mecanismos oxidativos
além da indução de uma enzima que degrada triptofano, a indoleamina 2,3 dioxygenase (IDO)
(Ding et al, 1988; Hughes, 1988 e Pfefferkon et al,1986), que são fatores fundamentais para o
controle do parasitismo. Assim sendo, T. gondii induz uma resposta imune do tipo Th1 (Gazzinelli
et al, 1994).
1.2 Imunologia da Gestação e Molécula de Adesão Intercelular 1 (ICAM-1)
A resposta inflamatória provocada por T. gondii é mediada por células e consequente
produção de citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ, TNF-α e IL-1β (Pfaff et al, 2005). Porém, no
período da gestação, a resposta imune predominante é do tipo Th2, que é responsável por produzir
citocinas anti-inflamatórias como IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-β (Saito, 2000). Tais citocinas são
produzidas e liberadas tanto por células maternas quanto por células de origem fetal, como o
trofoblasto. Segundo Saito (2000), esse perfil anti-inflamatório é fundamental para a manutenção da
gestação. Dessa forma, o trofoblasto se mostra essencial para a produção e liberação de mediadores
biológicos que propiciam o sucesso da gestação.
Infecções maternas de origem patológica ou não podem provocar reações inflamatórias na
interface materno-fetal (Juliano et al, 2006), o que induz a produção de citocinas que levam a
expressão de ICAM-1 no sinciciotrofoblasto humano (Pfaff et al, 2005). Com a expressão de
ICAM-1, monócitos podem se ligar a estas moléculas de adesão levando a apoptose do trofoblasto
(Garcia-Lloret et al, 2000; Pfaff et al, 2005 e Xiao et al., 1997), destruindo parcialmente a barreira
placentária e abrindo uma via de contaminação para o embrião em desenvolvimento. No organismo
materno in vivo, considerando que a resposta imune por células e citocinas pró-inflamatórias
induzem a expressão de ICAM-1 na superfície do sinciciotrofoblasto e, consequentemente,
2
promovendo a adesão de monócitos infectados por T. gondii, esta situação favorece a infecção de
tecidos fetais, configurando um quadro de toxoplasmose congênita.
Assim, este trabalho objetivou analisar a influência de ICAM-1 na susceptibilidade de
células trofoblásticas humanas (linhagem BeWo) a T. gondii, usando células epiteliais uterinas
humanas (linhagem HeLa) como controle.
2.MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Manutenção de Células BeWo e HeLa e Infecção
As células de coriocarcinoma humano (linhagem BeWo) e células epiteliais do cérvix
uterino humano (linhagem HeLa) foram adquiridas do American Type Culture Collection (ATCC,
Brasil) e permaneceram em cultura no Laboratório de Cultura Celular do setor de Histologia e
Embriologia da Universidade Federal de Uberlândia.
As linhagens BeWo e HeLa foram mantidas em frascos de cultura distintos, de 25cm 2
(Ciencor Scientific, Brasil) em meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Sigma
Chemical CO., Brasil) complementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Cultilab, Brasil) mais
1% de antibióticos (10,000U/ml de penicilina e 10mg/ml de estreptomicina) (Cultilab, Brasil), Lglutamina, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio e 2β-mercaptoetanol (Sigma Chemical
CO., Brasil) em estufa umidificada a 37ºC a 5% de CO2, de acordo com Oliveira e colaboradores
(2006).
A cepa RH de T. gondii foi mantida a cavidade peritoneal de camundongos Swiss do
Laboratório de Experimentação Animal (LEA) da Universidade Federal de Uberlândia. Os parasitos
foram retirados da cavidade peritoneal dos camundongos por meio de seringa, agulha e meio
cultura. O líquido com os parasitos foi colocado em garrafas de cultura com células BeWo ou HeLa.
Assim, as células BeWo ou HeLa infectadas ou não por T. gondii permaneceram em cultura.
2.2 Verificação da Expressão de ICAM-1 em Células BeWo e Hela Infectadas por T. gondii e
Tratadas com IL-10 e TGF-β1
Células BeWo e HeLa recolhidas dos frascos de cultura utilizando-se “cell scraper” foram
centrifugadas por 5 minutos a 1500 rotações por minuto, e depois ressuspendidas em 1ml de meio
de cultura com soro e colocadas na câmara de Newbauer juntamente com o corante azul de trypan
para realização da contagem. Na câmara, quatro quadrados aleatórios em cada um dos quadrantes
laterais foram escolhidos para contagem (Figura 1 – representados na cor preta). As células coradas
com azul de trypan foram excluídas da contagem por estarem inviáveis.
O ajuste para 5x104 foi feito e as células BeWo e HeLa foram colocadas em placas de
cultura contendo 24 poços, em lamínulas redondas de 13mm, em um volume de 200μl em cada
poço.
Para a contagem de parasitos, foram escolhidos cinco quadrados no quadrante central
(Figura 1 – representados na cor roxa) da placa de Newbauer. O ajuste foi feito de acordo com a
constante de nx105.
Figura 1: Esquema da câmara de Newbauer. Nos quatro quadrantes laterais, estão representados
quatro quadrados (em preto) para a contagem de células. No quadrante central, cinco quadrados (em
roxo) para a contagem de parasitos.
3
Depois de 24 horas de cultivo nas placas de cultura, as células foram estimuladas com
50ng/ml das citocinas humanas IL-10 ou TGF-β1 e deixadas em estufa por mais 24 horas. Então, as
células foram infectadas com a cepa RH de T. gondii em uma proporção de cinco parasitos por
célula. Após três horas, os parasitos que não estavam aderidos foram retirados por lavagem com o
meio de cultura. Na sequência, as células receberam mais uma vez 50ng/ml de IL-10 ou TGF- β1 e
colocadas na estuda por mais 24 horas. Para o controle da reação, células BeWo e HeLa foram
cultivadas em presença ou ausência de parasitos, sem a adição das citocinas. Foram realizados três
experimentos independentes em triplicata.
Após as 24 horas, as células foram lavadas com solução salina tamponada com Tris (TBS);
fixadas em formol a 10% por 24 horas e imersas em TBS até o início do processo de imunohistoquímica para ICAM-1 ou para determinação do índice de replicação de T. gondii. O índice de
replicação foi determinado observando-se o número de parasitos por célula a cada 100 células
infectadas examinadas.
Para o processo de imuno-histoquímica, as lamínulas com as células aderidas foram
incubadas com ácido acético a 5% para o bloqueio da fosfatase endógena e depois, incubação das
células com soro normal de cabra diluído em TBS para bloqueio de sítios inespecíficos.
Acrescentou-se anticorpo policlonal anti-ICAM-1 humano, e posterior incubação com o anticorpo
secundário biotinilado. A revelação da reação foi feita com o complexo avidina-biotina (ABC) com
fast red naphtol e contracoloração com hematoxilina de Meyer.
Para a contagem de células que expressaram ICAM-1, foram escolhidas 100 células
aleatórias visualizadas ao microscópio óptico e, dentre essas 100, a quantidade de células marcadas
positivamente para ICAM-1.
A análise estatística foi feita pelo teste Mann-Whitney (Graph Pad Software, v. 4.0, San
Diego, USA). Os resultados foram considerados significantes quando P≤0,05.
3.RESULTADOS
O gráfico 1 demonstra a porcentagem de células que expressam a molécula de adesão
ICAM-1 em três experimentos realizados em triplicata.
As células HeLa, na presença ou ausência de T. gondii, expressaram ICAM-1. Embora
células HeLa infectadas tenham apresentado maior tendência para expressão de ICAM-1 (média de
25%) quando comparadas a células não infectadas (média de 13%), a diferença não foi considerada
estatisticamente diferente. Em relação ao tratamento com a citocina IL-10, células HeLa
expressaram ICAM-1 (média de 18%), no entanto também não considerado estatisticamente
distinto dos experimentos controle (Gráfico 1). Os dados do tratamento de HeLa com TGF- β1 não
foram disponibilizados devido a necessidade de repeti-los para melhores resultados, já que as
células apresentaram diferenças morfológicas na presença da citocina.
As células BeWo não expressaram ICAM-1 na ausência de infecção, ou uma expressão
muito baixa dessa molécula na presença de T. gondii (média de 1%). Em relação ao estímulo com
IL-10, as células da linhagem BeWo apresentaram aumento da expressão de ICAM-1 (média de
4%) quando comparadas ao experimento controle, mas não houve diferença estatística. Já no
tratamento com TGF- β1, houve aumento significativo da expressão de ICAM-1, chegando a uma
média de 13% (Gráfico1).
Com relação ao índice de replicação, células da linhagem BeWo na presença de IL-10
apresentaram maior taxa de proliferação intracelular do parasito quando comparadas ao controle
(9,6 1,04 parasitos contra 5,3 0,65 parasitos por célula). No tratamento com TGF-β1, a replicação
do parasito aumentou em relação às células sem o tratamento (10,7 1,15 contra 5,3 0,65 parasitos
por célula). Células HeLa tratadas com IL-10 não apresentou diferença estatística quanto a
proliferação intracelular do parasito em relação às células não tratadas com a citocina (7 0,99
contra 8,1 1,01 parasitos por célula). O tratamento com TGF-β1 não resultou em diferença na
replicação do parasito nestas células quando comparadas ao controle (8,5 1,16 contra 8,1 1,01
parasitos por célula).
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30
25
20
*
15
10
5
1
+
ii
B
eW
o
B
+
eW
T.
o
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ii
+
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go
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ii
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+
Porcentagem de células que expressam
ICAM-1
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Gráfico 1: Porcentagem de células BeWo e HeLa que expressam a proteína de adesão ICAM-1 na
presença ou ausência de T. gondii, submetidas ou não ao tratamento com IL-10 e TGF-β1. Três
experimentos independentes foram realizados em triplicata. *P<0,05.
Em seguida, encontram-se fotos de células BeWo (Figuras 2a, b, c, d) e HeLa (Figuras 2e, f)
infectadas e tratadas ou não com as citocinas.
Figuras 2: (a) células BeWo infectadas por T. gondii, mas sem tratamento com citocinas (controleinfectado); (b) células BeWo infectadas por T. gondii e tratadas com IL-10; (c,d) células BeWo
infectadas por T. gondii e tratadas com TGF-β1; (e) células HeLa infectadas por T. gondii, mas sem
tratamento com citocinas (controle-infectado); (f) células HeLa infectadas por T. gondii e tratadas
com IL-10. As setas finas indicam vacúolos parasitóforos no citoplasma das células, e as setas
grossas indicam marcação positiva para ICAM-1. Imuno-histoquímica para ICAM-1,
contracoloração com hematoxilina de Meyer. (a,b,c,e,f): aumento de 100X; (d) aumento de 20X .
5
4.DISCUSSÃO
De acordo com nossos resultados, é possível afirmar que IL-10 não é capaz de induzir maior
expressão da molécula de adesão ICAM-1 em células BeWo e HeLa, mas favorece a invasão e a
proliferação de T. gondii em células BeWo, como já verificado previamente por Barbosa e
colaboradores (2008). A citocina IL-10, quando ativa uma cascata intracelular, pode ativar outras
proteínas que auxiliem o parasitismo nestas linhagens de células. Quando células BeWo receberam
IL-10, provavelmente a citocina tenha se ligado ao seu receptor e ativado uma cascata de
sinalização intracelular nessas células, quando algumas proteínas kinases, como JAK, teriam a
capacidade de fosforilar o fator de transcrição STAT-3 em seus resíduos de tirosina. Essa STAT-3
fosforilada formaria dímeros que, ao migrarem para o núcleo, novamente seriam fosforilados, mas
agora em seus resíduos de serina, o que ativaria a função imunossupressora de IL-10 (Lang et al,
2002 e Shen et al, 2004).
Contrariamente a IL-10, TGF-β1 demonstrou-se importante na indução da expressão de
ICAM-1 em células BeWo, o que pode beneficiar o parasitismo nestas células. Conforme Barragan
e colaboradores (2005), ICAM-1 promove a adesão de T. gondii em tecidos imunologicamente
privilegiados, inclusive os tecidos placentários. Deste modo, diante dos resultados obtidos pode-se
concluir que a expressão de ICAM-1 é induzida em células BeWo na presença de TGF-β1, o que
pode indicar um favorecimento para o parasitismo nestas células (Barbosa et al, 2008). Além disso,
TGF-β1 é capaz de induzir a expressão de outras proteínas a partir do momento que ativa uma
cascata intracelular, o que será verificado em estudos posteriores.
O aumento da replicação de T. gondii sob estímulo de TGF-β já foi antes observado em
células epiteliais pigmentares da retina humana (Nagineni et al, 2002). Este estudo prévio
demonstrou que T. gondii influencia na expressão de RNAm para TGF-β e aumenta a secreção de
TGF-β1 e 2, ao mesmo tempo que torna o meio favorável à proliferação do parasito, mesmo sob a
concentração de 20ng/ml. Similares resultados foram observados, quando a adição de TGF-β1
recombinante em macrófagos peritoniais murinos ou em macrófagos humanos aumentou a
replicação intracelular de Leishmania braziliensis e Trypanosoma cruzi (Barral-Netto et al., 1992;
Silva et al., 1991). Além disso, TGF-β pode estar envolvido na inibição de TNF-α em células
BeWo, uma vez que TNF-α já foi observado no trofoblasto humano normal (Chen et al., 1991;
Haynes et al., 1993; King et al., 1995).
Como demonstrado por este trabalho que TGF-β1 promove o aumento de ICAM-1 em
células BeWo, outros estudos demonstraram que outras citocinas também são capazes de induzir
esta molécula de adesão em alguns tipos celulares. Estudos recentes verificaram que o estímulo com
IFN-γ juntamente com TNF-α é capaz de aumentar a expressão de ICAM-1 em fibroblastos e
monócitos, enquanto que a infecção por T. gondii não induz nenhum efeito em relação à expressão
dessa molécula de adesão (Pfaff et al., 2008).
Além disso, outros estudos recentes observaram que a expressão de ICAM-1 ocorre
principalmente no sinciciotrofoblasto, e pode ser fracamente detectada em tecidos placentários
durante o primeiro trimestre da gestação (Ferro et al, 2008), o que se faz necessário para impedir a
infecção do feto pelo parasito. Ainda de acordo com Ferro e colaboradores (2008), a presença da
citocina MIF (Fator Inibidor de Macrófago) aumenta a expressão de ICAM-1 no sinciciotrofoblasto;
o que induz a uma grande adesão de células THP-1 (monócitos) aos vilos placentários,
representando uma provável via de infecção do trofoblasto humano pelo parasito T. gondii.
5.AGRADECIMENTOS
Agradecemos o apoio financeiro das agências de fomento CNPq e FAPEMIG.
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TGF-β1 promotes the increase of expression of the intercellular adhesion
molecule ICAM-1 and favors the susceptibility of human trophoblast cells
(BeWo lineage) to Toxoplasma gondii
Janice Buiate Lopes Maria1
Laboratory of Histology and Embriology
Av. Pará, 1720 – Bloco 2B - Campus Umuarama - 38405-320 - Uberlândia, MG - Brazil
[email protected]
Bellisa de freitas Barbosa2
Laboratory of Histology and Embriology
Av. Pará, 1720 – Bloco 2B - Campus Umuarama - 38405-320 - Uberlândia, MG - Brazil
[email protected]
Deise Aparecida de Oliveira Silva2
Laboratory of Immunoparasitology
Av. Pará, 1720 - Bloco 4C - Campus Umuarama - 38400-902 - Uberlândia, MG - Brazil
José Roberto Mineo2
Laboratory of Immunoparasitology
Av. Pará, 1720 – Bloco 4C – Campus Umuarama - 38400-902 - Uberlândia, MG - Brazil
Eloisa Amália Vieira Ferro2
Laboratory of Histology and Embriology
Av. Pará, 1720 – Bloco 2B - Campus Umuarama - 38405-320 - Uberlândia, MG - Brazil
Abstract: This work proposed to analyze the expression of the intercellular adhesion molecule
ICAM-1 and the susceptibility of BeWo and HeLa cells to Toxoplasma gondii when treated with IL10 and TGF-β1. Then, 5x104 BeWo cells were cultivated on round coverslips in plates of culture
with 24 wells. After 24hs at 37ºC and 5% of CO2, the cells were treated with human cytokines IL-10
or TGF-β1 both 50ng/ml. After 24hs of incubation, parasites of the RH strain of T. gondii were
added to the plates in a proportion of five parasites per cell and incubated by 3hs. Then, the cells
received IL-10 or TGF-β1 again and were incubated for more 24hs. Subsequently, the cells were
fixed with formaldeyde 10% for the detection of the expression of ICAM-1 by immunohistochemistry
or determination of the index of replication. Statistical analysis was made by Mann-Whitney test
and results were significant when P≤0,05. BeWo cells didn’t express ICAM-1 in the absence of
infection and provided very low positivity to ICAM-1 when infected with T. gondii. When infected
and treated with IL-10 or TGF-β1, BeWo cells showed a high susceptibility to T. gondii, but he
expression of ICAM-1 was only significant when TGF-β1was present. HeLa cells, when infected by
T. gondii, increased the expression of ICAM-1 but without statistic significance. When infected and
treated with IL-10 or TGF-β1, HeLa cells didn’t show a high susceptibility to T. gondii and didn’t
increase the expression of ICAM-1. Therefore, TGF-β1 is a cytokine that promotes the increase of
the expression of ICAM-1 and, at the same time, it favors the replication of T. gondii in BeWo cells,
demonstrating that ICAM-1 can be a route utilized by T. gondii to invade human trophoblast cells.
Keywords: BeWo, ICAM-1, Toxoplasma gondii,IL-10, TGF- β1.
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Student of Biological Science
Teachers of the project
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