Trabalho - SOVERGS

GENOTIPAGEM DE ISOLADOS DE Toxoplasma gondii OBTIDOS DE Gallus gallus
NATURALMENTE INFECTADOS NO ESTADO DE SANTA CATARINA.
GENOTYPING OF Toxoplasma gondii ISOLATES OBTAINED OF NATURALLY
INFECTED Gallus gallus IN THE STATE OF SANTA CATARINA.
Natascha Trevisani1, Anderson Barbosa de Moura2*, Achilles Vieira Neto3, Amélia Aparecida
Sartor4, Antonio Pereira de Souza4, Valdomiro Bellato4.
Resumo: Com o objetivo de mapear os diferentes genótipos do Toxoplasma gondii em Santa
Catarina, foram obtidas amostras (n=89) de soro de Gallus gallus de cinco mesorregiões do
Estado (27 do Planalto Serrano, 15 do Oeste, 18 do Sul, 16 do Norte e 13 do Vale do Itajaí)
para detecção de anticorpos contra o protozoário (RIFI ≥1:16). Das aves com maiores títulos
[(n=21) 11 do Planalto Serrano, quatro do Sul, três do Oeste e três do Norte], após necropsia,
foram coletados coração e cérebro para bioensaio em camundongos, que foram avaliados
diariamente para observação dos sinais da infecção. Os animais que não manifestaram sinais
da infecção, após oito semanas, foram eutanasiados. Foram colhidos sangue, para RIFI, e
órgãos (cérebro, pulmão, coração, fígado, rim, baço e músculo esquelético) para
histopatologia (HE). Parte do cérebro foi armazenada (-20°C) para extração do DNA e
genotipagem. Fragmentos de cérebro foram avaliados (squash) para a pesquisa de cistos. Três
isolados foram obtidos de aves soropositivas para T. gondii, sendo que um destes foi
altamente virulento para camundongos. Estes resultados demonstram uma possível existência
de variação genotípica, uma vez que diferenças na virulência foram observadas nos isolados
de distintas regiões.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii, Gallus gallus, genotipagem, Santa Catarina.
Summary: With the aim of mapping out the different genotypes of Toxoplasma gondii in
Santa Catarina, Brazil, serum samples (n=89) were collected of Gallus gallus of five
mesoregions in the State (27 of the Planalto Serrano, 15 from the West, 18 of South, 16 North
and 13 of the Itajaí Valley) for the detection of antibodies against the protozoon (IFAT
≥1:16). From fowls with the bigger titles [(n= 21) 11 of the Planalto Serrano, four of the
South, three of the West and three of the North], after necropsy, were collected heart and
brain for bioassay in mice, which were assessed daily for the observation of the infection
signs. The animals that did not show infection signs, after eight weeks, were euthanized.
Blood was collected for IFAT, and organs (brain, lung, heart, liver, kidney, spleen, and
skeletal muscle) for histopathology (HE). Part of the brain was stored (-20°C) for DNA
extraction and genotyping. Fragments of the brain were evaluated (squash) for the research of
cysts. Three isolates were obtained from fowls seropositive for T. gondii, and one of these
was highly virulent in mice. These results show a possible existence of genotypic variation,
since differences in virulence was observed in isolates from different regions.
Key Words: Toxoplasma gondii, Gallus gallus, genotyping, State of Santa Catarina, Brazil.
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1. Médica Veterinária - Mestranda em Ciência Animal CAV/UDESC – [email protected].
2*. Médico Veterinário – DMV - CAV/UDESC. Autor para correspondência: Av. Luís de Camões, 2090 –
Lages, SC – CEP 88520-000 EMAIL: [email protected].
3. Acadêmico do Curso de Medicina Veterinária CAV/UDESC, bolsista de Iniciação Científica do
PROBIC/UDESC.
4. Médico Veterinário - Professor do DMV CAV/UDESC.
Texto
A toxoplasmose é uma doença de caráter zoonótico de distribuição mundial, causada
pelo Toxoplasma gondii, protozoário capaz de parasitar animais homeotérmicos, como
hospedeiros intermediários e somente os membros da família Felidae (domésticos e
selvagens), como hospedeiros definitivos (MARTINS e VIANA, 1998). É um protozoário
intracelular obrigatório, do filo Apicomplexa, da classe Sporozoa, família Sarcocystidae.
Galinhas oriundas de pequenas criações podem conter cistos teciduais de T. gondii,
representando risco de infecção para o ser humano, principalmente quando manipulam carnes
sem muita higiene ou por meio do consumo de carnes cruas ou mal cozidas (LITERAK e
HEJLICEK, 1993), o que ressalta a importância das aves no ciclo biológico do protozoário
por atuarem como hospedeiros intermediários.
Amostras de sangue (n=89) de Gallus gallus, criados extensivamente, foram colhidas
em propriedades de cinco mesorregiões do Estado de Santa Catarina (27 do Planalto Serrano,
15 do Oeste, 18 do Sul, 16 do Norte e 13 do Vale do Itajaí) e encaminhadas para o
Laboratório de Parasitologia e Doenças Parasitárias do Centro de Ciências Agroveterinárias
(CAV) da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), em Lages/SC.
Após centrifugação, os soros obtidos foram transferidos para frascos estéreis,
identificados e armazenados a -20°C até realização da Reação de Imunofluorescência Indireta
(RIFI≥1:16) para detecção de anticorpos contra T. gondii da classe IgG, conforme Camargo
(1964).
Para realização do bioensaio em camundongos utilizaram-se as aves com maiores
títulos [(n=21) 11 do Planalto Serrano, quatro do Sul, três do Oeste e três do Norte] das quais,
após necropsia, foram coletados coração e cérebro que foram submetidos à digestão em
solução ácida de pepsina segundo Dubey (1998) e a suspensão obtida foi inoculada
intraperitonealmente em três camundongos que foram avaliados diariamente para observação
dos sinais da infecção.
Dos camundongos que manifestaram sinais agudos de toxoplasmose, e vieram a óbito,
foi realizado lavado intraperitoneal com solução salina esterilizada para a pesquisa de
taquizoítos do agente. Os animais que não manifestaram sinais de infecção aguda, após oito
semanas, foram eutanasiados e destes foram colhidos sangue, para RIFI, e órgãos (cérebro,
pulmão, coração, fígado, rim, baço e músculo esquelético) para histopatologia (HE). Parte do
cérebro foi armazenada (-20°C) para extração do DNA e genotipagem. Fragmentos de cérebro
foram comprimidos entre lâmina e lamínula (squash) para a pesquisa de cistos. Foram
considerados infectados com T. gondii os camundongos nos quais estágios do parasito foram
encontrados em seus tecidos.
Das 89 amostras de soros de galinha analisadas para pesquisa de anticorpos contra T.
gondii, 60 (67,41%) foram positivas, com títulos variando de 1:16 a 1:1024. Conforme a
mesorregião catarinense avaliada a maior porcentagem de aves positivas foi no Sul onde
88,88% foram soropositivas, seguido do Norte com 81,25%, Planalto Serrano 77,77%, Oeste
53,33% e Vale do Itajaí 15,38%. Três isolados foram obtidos de aves soropositivas para T.
gondii pertencentes às Mesorregiões do Planalto Serrano, Sul e Norte, respectivamente, sendo
que apenas um destes foi altamente virulento para camundongos.
Os camundongos inoculados com material das galinhas do Planalto Serrano
manifestaram sinais agudos da infecção 11 dias pós-inoculação e taquizoítos foram isolados
no lavado intraperitoneal.
Cistos de T. gondii foram observados no cérebro de camundongos inoculados com
material de galinhas das mesorregiões Sul e Norte, indicando infecção crônica. Um
camundongo inoculado com material do Norte apresentou sinais neurológicos (inclinação da
cabeça para o lado [head tilt], andar em círculos e incoordenação motora) e diversos cistos
cerebrais com tamanhos variados foram observados na microscopia.
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Na histopatologia (HE) dos tecidos dos camundongos inoculados com material de aves
do Sul foi observada a presença de cistos em cérebro e músculo esquelético, acompanhados
de infiltrado inflamatório mononuclear perivascular e na meninge (encefalite) de dois animais
e de necrose focal em um animal.
O modelo clássico de avaliação fenotípica da virulência de isolados de T. gondii é por
meio da inoculação em camundongos e avaliação clínica destes. As diferentes cepas são
classificadas em: altamente virulentas, quando um parasita é suficiente para matar o animal;
pouco virulenta, quando promove infecção crônica sem a necessidade de utilização de
tratamento específico; e de virulência intermediária, quando um parasita não é suficiente para
matar o camundongo, mas o tratamento do animal com altas doses de sulfonamidas é
necessário para prevenir a morte (FREYRE et al., 2001).
A possibilidade de que o genótipo do parasita tenha influência sobre a severidade da
doença no ser humano tem suporte nas diferenças de virulência das cepas em modelos
experimentais animais. As cepas do tipo II levam à infecção crônica e produção de cistos
teciduais em camundongos, sendo caracteristicamente de crescimento lento in vitro, enquanto
as cepas do tipo I são extremamente virulentas para camundongos, com alta taxa de
multiplicação in vitro e penetração na lâmina própria e na submucosa (MAUBON et al.,
2008).
Com base nos resultados obtidos, há evidências de uma possível variação genotípica
entre as cepas obtidas, uma vez que diferenças na virulência foram observadas nos isolados
das distintas regiões. A genotipagem, por meio da RFLP e do sequenciamento, determinará os
diferentes genótipos do T. gondii que ocorrem no estado de Santa Catarina.
Referências Bibliográficas
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MARTINS, C.S.; VIANA, J. A. Toxoplasmose – o que todo profissional de saúde deve saber.
Clínica Veterinária, São Paulo, v. 3, n. 15, p. 33-37, 1998.
MAUBON, D.; AJZENBERG, D.; BRENIER-PINCHART, M-P et al. What are the
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