CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE Toxoplasma gondii ISOLADOS

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE Toxoplasma gondii ISOLADOS DE SUÍNOS NA
BAHIA POR SEQUENCIAMENTO
GENETIC CHARACTERIZATION OF Toxoplasma gondii ISOLATES FROM PIGS
IN BAHIA BY SEQUENCING
Rodrigo Alves Bezerra1, Fábio Santos Carvalho2, Luciana Afonso Guimarães2, Daniele de
Santana Rocha3, Bianca Mendes Maciel4, Amauri Arias Wenceslau4, Carlos Wilson Gomes
Lopes5, George Rêgo Albuquerque4
Resumo
O objetivo do presente estudo foi realizar a caracterização genética de cepas de Toxoplasma
gondii isoladas de suínos naturalmente infectados na Bahia, através do sequenciamento. A
partir de 20 cabeças de suínos adquiridas em açougues que comercializam carne suína in
natura para consumo humano no município de Ilhéus-BA, foi realizado o ensaio biológico
com o cérebro e língua de cada animal, obtendo-se 11 isolados de T. gondii designados
TgPgBr 06-16. Através da técnica de PCR-multilocus-sequenciamento utilizando seis
marcadores genéticos (SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, c22-8 e PK1), mostrou que todos os
onze isolados de T. gondii eram diferentes entre si e diferentes dos genótipos clonais Tipo I,
II, III. O resultado indica que as cepas de T. gondii na Bahia, apresentam alta diversidade
genética e alta estrutura populacional, através da análise do sequenciamento de DNA.
Palavras-chave: Diversidade genética, sequenciamento, toxoplasmose.
Summary
The aim of this study was the genetic characterization of Toxoplasma gondii strains isolated
from naturally infected pigs in Bahia, through the sequencing. From 20 hogs purchased at
butcher shops that sell fresh pork for human consumption in the city of Ilheus, Bahia, the
bioassay was conducted with the brain and tongue of each animal, resulting in 11 isolates of
T. gondii designated TgPgBr 06-16. By PCR-sequencing using multilocus-six genetic
markers (SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, c22-8 and PK1), showed that all eleven strains of T.
gondii were different and different genotypes of the clonal Type I, II, III. The result indicates
that the strains of T. gondii in Bahia, have a high genetic diversity and high population
structure through analysis of DNA sequencing.
Keywords: genetic diversity, sequencing, toxoplasmosis.
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular que pode infectar células de todos os
animais homeotérmicos, incluindo humanos. Apesar da toxoplasmose ser geralmente
assintomática, infecção primária durante a gestação em mulheres e animais podem causar
aborto, anomalias fetais, ou a morte perinatal (GARCIA et al. 2004).
Estudos moleculares em isolados de T. gondii na Europa e América do Norte
classificaram-os em três linhagens genéticas, designadas tipos I, II, III, sendo considerados
clonais e com baixa diversidade genética (AJZENBERG et al., 2002). No entanto, estudo de
isolados da América do Sul, principalmente do Brasil, evidenciaram que T. gondii possui
_______________________
1
Médico Veterinário, MSc. em Ciência Animal, Faculdade de Ilhéus.
Médico Veterinário, MSc., Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC.
3
Discente de Medicina Veterinária, UESC.
4
Médico Veterinário, Doutor, Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais, UESC, Rodovia Ilhéus-Itabuna,
km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA, 45662-000, Brasil, [email protected].
2
5
Médico Veterinário, Doutor, Departamento de Parasitologia Animal, UFRRJ.
uma maior variabilidade genética (DUBEY et al., 2007; PENA et al., 2008). No Brasil, foram
identificados os tipos clonais I e III, genótipos recombinantes e alelos atípicos (DUBEY et al.,
2007; PENA et al., 2008). Recentemente foi isolado o tipo clonal II em aves na Ilha de
Fernando de Noronha e emovinos do estado de São Paulo (DUBEY et al., 2010; DA SILVA
et al., 2011).
Em animais de produção de carne, cistos teciduais de T. gondii são frequentemente
mais observados em tecidos de suínos infectados. Desta forma, do ponto de vista da saúde
pública a espécie suína tem merecido especial atenção por ser um importante reservatório e
fonte de infecção para populações humanas (TENTER et al. 2000). Contudo, no Brasil são
poucos os trabalhos sobre a caracterização genética de isolados de T.gondii proveniente deste
animais e todos foram realizados na região Sul e Sudeste do país (BELFORT-NETO et al.,
2007; FRAZÃO-TEIXEIRA et al., 2011). Faz-se necessário mais estudos em outras regiões,
para a geração de dados que possibilite evidenciar a real importância deste agente etiológico
para a saúde pública.
Desta forma, objetivou-se realizar a caracterização genética de cepas de T. gondii
isoladas de suínos naturalmente infectados oriundos do sul da Bahia, região Nordeste do
Brasil, através do sequenciamento de DNA.
O material estudado foi obtido de 20 cabeças de suínos adquiridas em açougues que
comercializavam carne suína in natura para consumo humano, no mercado municipal de
Ilhéus, Bahia, Brasil. Estas foram acondicionadas individualmente em recipientes refrigerados
e levadas aos Laboratórios de Parasitologia Veterinária – UESC, onde foram retirados os
cérebros e língua. Para a realização do ensaio biológico em camundongos dos suínos
naturalmente infectados foi utilizado a técnica de digestão péptica que baseou-se no protocolo
estabelecido por Dubey (1998). Os camundongos foram observados por 42 dias e sacrificados
ao final deste período, realizando a retirada do cérebro de todos os animais. Inicialmente, os
fragmentos de 100 mg dos cérebros dos camundongos foram devidamente pesados e
macerados em gral e pistilo com nitrogênio líquido. A extração de DNA foi realizada
utilizando-se o kit Easy-DNA® (Invitrogen), de acordo com o protocolo no 3 do fabricante.
Para detectar isolados de T. gondii foi realizada a PCR utilizando-se os primers direto
Tox4
(CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG)
e
reverso
Tox5
(CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT) que foram desenhados por Homan et al. (2000),
que amplificam um fragmento de 529pb do DNA de T. gondii. A partir dos isolados foi
realizado o sequenciamento para seis marcadores genéticos (SAG1, SAG2, SAG3, BTUB,
C22-8 e PK1), utilizando o sequenciador automático ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems). As sequências nucleotídicas determinadas neste estudo foram
montadas utilizando DNA STAR SeqMan application. Todas as sequências foram
comparadas as disponíveis no GeneBank através do programa BLASTn
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Dos 20 suínos analisados, foram obtidos 11 isolados de T. gondii designados como
TgPgBr 06-16. O sequenciamento do DNA das onze amostras de T. gondii (TgPgBr 06-16)
utilizando seis marcadores genéticos (SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, c22-8 e PK1) totalizou
2.791 bases que puderam ser alinhadas com as sequencias dos padrões Tipo I (Tg GT1), II
(Tg ME49) e III (Tg VEG), disponíveis no GenBank. O alinhamento mostrou que as amostras
foram diferentes entre si em 113 posições nucleotídicas (4% sítios de segregação) distribuídas
nos diferentes marcadores genéticos, além de diferirem dos genótipos clonais Tipo I, II e III.
Analisando as sequências de todos os isolados, um total de 734 polimorfismos de DNA
(podendo ser inserção, deleção, transição ou transversão) foram encontrados nos 113 sítios de
segregação.
A caracterização genética de T. gondii proveniente de suínos do estado da Bahia,
nordeste do Brasil, foi realizada para verificar se possuia correlação com os genótipo clonais
2
do Tipo I, II ou III e com outros genótipos brasileiros (PENA et al., 2008; DUBEY et al.,
2008). A técnica de sequenciamento de DNA indicou uma alta diversidade genética do
parasito nos suínos da região. No Brasil, esta alta diversidade também foi observada
anteriormente em isolados provenientes de gatos e de cães (PENA et al., 2008). Nenhum dos
isolados deste estudo foi classificado como genótipo clonal Tipo I, II e III. Também foram
diferentes geneticamente dos genótipos isolados de suínos do Brasil, como descrito por
Frazão-Teixeira (2011).
Desta forma, os suínos provenientes da região sul da Bahia, apresentaram uma alta
diversidade genética de T. gondii, sugerindo que a população do parasito esteja em expansão.
Referências Bibliográficas
AJZENBERG, D.; BANULS, A.L.; TYBAYRENC, M.; DARDE, M.L. Microsatellite
analysis of Toxoplasma gondii shows considerable polymorphism structured into two main
clonal groups. International Journal for Parasitology, v. 32, p. 27-38, 2002.
BELFORT-NETO, R.; NUSSENBLATT, V.; RIZZO, L. et al. High prevalence of unusual
genotypes of Toxoplasma gondii infection in pork meat samples from Erechim, Southern
Brazil. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 79, p. 111-114, 2007.
DA SILVA, R.C.; LANGONI, H.; SUB, C.; DA SILVA, A.V. Genotypic characterization of
Toxoplasma gondii in sheep from Brazilian slaughterhouses: New atypical genotypes and the
clonal type II strain identified. Veterinary Parasitology, v. 175, p. 173-177, 2011.
DUBEY, J.P. Refinement of pepsin digestion method for isolation of Toxoplasma gondii from
infected tissues. Veterinary Parasitology, v. 74, p. 75-77, 1998.
DUBEY, J.P.; GENNARI, S.M.; SUNDAR, N. et al. Diverse and atypical genotypes
identified in Toxoplasma gondii from dogs in São Paulo, Brazil. Journal of Parasitology, v.
93, p. 60-64, 2007a.
DUBEY, J.P.; RAJENDRAN, C.; COSTA, D.G.V. et al. New Toxoplasma gondii genotypes
isolated from free-range chickens from the Fernando de Noronha, Brazil: unexpected findings.
Journal of Parasitology, v. 96, p. 709-712, 2010.
DUBEY, J.P.; VELMURUGAN, G.V.; CHOCKALINGAM, A. et al. Genetic diversity of
Toxoplasma gondii isolates from chickens from Brazil. Veterinary Parasitology, v. 157, p.
299-305, 2008.
FRAZÃO-TEIXEIRA, E.; SUNDAR, N.; DUBEY, J.P. et al. Multi-locus DNA sequencing of
Toxoplasma gondii isolated from Brazilian pigs identifies genetically divergent strains.
Veterinary Parasitology, v. 175, p. 33-39, 2011.
GARCIA, J.L.; GENNARI, S.M.; NAVARRO, I.T. Toxoplasma gondii: isolation of
tachyzoites rhoptries and incorporation into Iscom. Experimental Parasitolology, v. 108, p.
40-46, 2004.
HOMAN, W.L.; VERCAMMEN, M.; DE BRAEKELEER, J. Identification of a 200 to 300
fold repetitive 529 bp DNA fragment in Toxoplasma gondii, and its use for diagnostic and
quantitative PCR. International Journal for Parasitology, v. 30, p. 69-75, 2000.
PENA, H.F.J.; GENNARI, S.M.; DUBEY, J.P.; SU, C. Population structure and mousevirulence of Toxoplasma gondii in Brazil. International Journal for Parasitology, v. 38, p. 561569, 2008.
TENTER, A. M.; HECKEROTH, A. R.; WEISS, L. M. Toxoplasma gondii: from animals to
humans. International Journal for Parasitology, v. 30, p. 1217-1258, 2000.
3