Propagação in vitro de Encyclia alboxanthina Fowlie

EMÍLIA MACHADO SHERLOCK
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ENCYCLIA ALBOXANTHINA
FOWLIE (ORCHIDACEAE): ESPÉCIE ENDÊMICA DA
CHAPADA DIAMANTINA-BAHIA
Feira de Santana, BA
2009
EMÍLIA MACHADO SHERLOCK
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ENCYCLIA ALBOXANTHINA
FOWLIE (ORCHIDACEAE): ESPÉCIE ENDÊMICA DA
CHAPADA DIAMANTINA-BAHIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. José Raniere Ferreira de Santana
Co-orientadora: Prof. Dra. Moema Cortizo Bellintani
Feira de Santana, BA
2009
À minha família, em especial, meus pais (Ítalo Sherlock e
Juracy Sherlock) e meu irmão (Tim), que foram sempre
fonte de força, persistência e princípios.
AGRADECIMENTOS
À DEUS, fonte da minha inspiração, força e dedicação, sem ele não posso
existir.
Aos meus pais e irmão, exemplos de vida, dedicação, amor e trabalho.
À meu querido namorado Rodrigo Almeida Bastos, pelo companheirismo,
incentivo e paciência.
Ao Prof. Dr. José Raniere Ferreira de Santana, pela orientação, confiança e
ensinamentos, que foram de grande importância para minha realização
profissional e pessoal.
À Profa. Dra. Moema Cortizo Bellintani, pela co-orientação, disponibilidade e
amizade que contribuíram para a conclusão deste trabalho.
À Profa. Dra. Luciana Veiga Barbosa e demais membros do Laboratório de
Biologia molecular da UFBA, por disponibilizar a estrutura do laboratório e os
equipamentos para a realização de grande parte do trabalho.
Ao Prof. MsC. Lázaro Benedito da Silva, pessoa maravilhosa que conheci em
tão pouco tempo e que me passou alguns de seus conhecimentos,
disponibilizando também a estrutura do laboratório para a realização de parte do
trabalho.
À Flávia Dionísio, pela amizade e apoio mesmo estando distante.
À minha amiga Geisa Moreira da Costa (Geisinha) por ter me aconselhado e me
acolhido nos momentos de angústia, me transmitindo paz e segurança.
À Helton e Alberto, secretários do curso de Biotecnologia e Recursos Genéticos
Vegetais, que estavam sempre de bom humor, dispostos e prestativos em meio
tantas burocracias de rotina.
À Maria Nazaré Guimarães Marchi e Cássia Marques Viana pelo apoio e
colaboração durante todo o trabalho.
Aos membros do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais e demais
laboratórios do Horto Florestal, da UEFS, pela convivência e colaboração:
Alone Lima Brito e Sheila Resende, pela compreensão e colaboração.
Ao Projeto Sempre-Viva Mucugê e à sua equipe, pelo apoio e incentivo,
essencial a realização deste trabalho.
À FAPESB pelo apoio concedido para a realização deste trabalho.
À todos meus Professores da graduação (UCSal), em especial a Profa. Dra.
Luzimar Gonzaga Fernandez, pelo carinho, compreensão e disponibilidade com
que me acolheu no LEMA e confiança com que me indicou para o programa de
pós-graduação.
Aos demais professores do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, pela
contribuição profissional.
À todos meus amigos (as), especialmente a Gisele Dela Justina, Isabela Aguiar
Bastos, que me incentivaram e me acolheram desde o inicio, para a realização
deste trabalho e a Taís Nogueira, por torcer tanto por mim e se mostrar sempre
disposta a me ajudar.
À Carolina Oliveira de Cerqueira Lima e Cimille Gabriele Cardoso Antunes,
pelas boas conversas e risadas, e por terem me acolhido em suas casas com tanto
carinho no inicio do curso de Biotecnologia.
À toda família de Rodrigo Almeida Bastos, pela compreensão e carinho.
À todos que de alguma forma contribuíram para a realização desta etapa
importante da minha vida, deixo aqui relatado meu sincero agradecimento.
Agradecimento especial: A meu Pai Ítalo R.A. Sherlock (in memorian).
Querido Pai, sei que não poderei compartilhar da tua presença nesta etapa tão
importante e difícil que passei e agora estou finalizando, mas quero deixar
relatado aqui, meus sinceros agradecimentos por ter sido o exemplo de vida
mais importante pra mim em todos os momentos, jamais esquecerei de ti e do
que fizestes, lutarei e tentarei ser firme sempre, como tu fostes. Muito obrigada
por tudo, AMO VOCÊ! Fique com Deus.
“A maior recompensa pelo esforço de uma pessoa não é o que ela ganha com isso,
mas o que ela se torna através dele.” (John Ruskinz)
RESUMO
Encyclia alboxanthina Fowlie (Orchidaceae), é endêmica da Chapada Diamantina e apresenta
potencial ornamental. A cultura de tecidos pode contribuir na conservação possibilitando a
germinação e a propagação rápida dessa espécie. Esse trabalho objetivou o desenvolvimento
de um protocolo para a propagação in vitro de E. alboxathina. Foi avaliada a germinação e o
crescimento em diferentes meios de cultura na presença ou ausência de carvão ativado; o
crescimento foi avaliado também em meios submetidos à esterilização física ou química e
suplementados com diferentes concentrações e tipos de açúcar. Avaliou-se ainda o efeito de
diferentes concentrações de BAP e ANA e de diferentes tipos de explantes na indução de
brotações e a aclimatização de mudas cultivadas em diferentes concentrações de sacarose em
tubos fechados com PVC ou algodão. Na aclimatização foram testados dois substratos: fibra
de coco + gravilhão, ou, isopor + gravilhão e a adubação com solução WPM 20% além da
transferência direta para casa de vegetação ou precedida de uma fase em sala de crescimento.
O MS/2 (26,55%) e Knudson C (25,65%) sem carvão proporcionaram maior germinação. No
crescimento, o meio WPM suplementado com 30 gL-1 submetido à esterilização física,
independentemente do carvão ativado, promoveu o melhor desempenho geral. A maior
produção de brotos utilizando plantas como explante ocorreu nos tratamentos com 17,60 µM
de BAP + 0 µM de ANA (3,47); 17,60 µM de BAP + 0,268 µM de ANA (3,44); e 8,8 µM de
BAP + 0,537 µM de ANA (3,33). O único explante procedente de plantas com dois anos de
idade com capacidade de regeneração foi a base caulinar quando tratada com 17,60 µM de
BAP + 0 µM de ANA (1,92 brotos) ou 8,8 µM de BAP + 0,573 µM de ANA (1,87). Após 90
dias da retirada dos tubos de cultura, os maiores percentuais de sobrevivência (83,34%) foram
obtidos com o uso de isopor + gravilhão, sem adubação em plantas transferidas para casa de
vegetação após 30 dias de cultivo em sala de crescimento.
Palavras-chave: Orchidaceae, encyclia alboxanthina, cultura de tecidos vegetais.
ABSTRACT
Encyclia alboxanthina Fowlie (Orchidaceae) is endemic to the Chapada Diamantina and
presents ornamental potential. The tissue culture can contribute for the conservation making
possible the germination and the fast propagation of this species. This work intended the
development of in vitro propagation protocol for E. alboxanthina. The germination and the
growth in different culture media in the presence or absence of activated charcoal was
evaluated; the growth was also evaluated in culture media submitted to physical or chemical
sterilization and supplemented with different concentrations and kinds of sugar. Was
evaluated the effect of different BAP and NAA concentrations and different kinds of
explants in the multiplication and acclimatization of seedings cultivated in different
concentrations of sucrose in closed pipes with PVC or cotton. In the acclimatization two
substrata were tested: coconut fiber + crushed granite or styrofoam + crushed granite and
the fertilization with WPM 20% solution, besides the direct transference to the greenhouse
or preceeded of a phase in growth room. The MS/2 (26.55%) and Knudson C (25.65%)
without charcoal provided greater germination. In the growth, the media WPM
supplemented with 30 gL-1 submitted to the physical sterilization, despite the activated
charcoal, presented the best general performance. The largest production of shoots using
plants as explant occurred in the treatments with 17,60 µM of 0 BAP + 0 µM of NAA
(3,47); 17,60 µM of BAP + 0,268 µM of NAA (3,44); e 8,8 µM of BAP + 0,537 µM of
NAA (3,33). The only explant coming from plants two years old with regeneration capacity
was the pseudobulb when treated with 17,60 µM of BAP + 0 µM of NAA (1,92 shoots) or
8,8 µM of BAP + 0,573 µM of NAA (1,87). After 90 days of the culture pipes withdrawal,
the greater survival percentages (83,34%) were obtained with the styrofoam + crushed
granite, without fertilization, in plants transferred to greenhouse after 30 days of culture in
growth room.
Keywords: Orchidaceae, encyclia alboxanthina, plant tissue culture.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
E. alboxanthina. Aspecto visual de uma planta adulta (A);
4
inflorescência (B e C ). Barra: 1 cm. Fonte: Rosim, 2007.
Figura 2
E. alboxanthina. Aspecto visual de uma capsula (A); sementes
12
imersas em água destilada (B); sementes inoculadas em meio
nutritivo (C); protocormos em formação (D); plantas formadas
(E); plantas com 5 à 10 mm (F). UEFS, Feira de Santana-Ba,
2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
Figura 3
E. alboxanthina. Planta com 24 meses (A); folha (B); base
17
caulinar (C); protocormo com um mês de idade (D). UEFS,
Feira de Santana-Ba, 2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
Figura 4
Substratos utilizados na aclimatização de E. alboxanthina: (A)
19
Pérolas de isopor; (B) gravilhão; (C) fibra de coco; (D)
Recipiente Galvanotek G-70; (E) gravilhão combinado com
fibra de coco; (F) gravilhão combinado com isopor. UEFS,
Feira de Santana-Ba. Barra: 1 cm. Fonte: o autor.
Figura 5
Germinação das sementes de E. alboxanthina em diferentes
meios de cultura na presença (2 gL-1)
23
ou na ausência de
carvão ativado, após 15 e 30 dias da inoculação das sementes.
UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009. Barra: 10 mm. Fonte: o
autor.
Figura 6
Plantas de E. alboxanthina com seis meses de idade, cultivadas
30
em meio submetido à esterilização química (A) ou física (B).
UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009. Barra: 10 mm. Fonte: o
autor.
Figura 7
NB- Números de brotos obtidos a partir de plantas de E.
alboxanthina,
inoculados
em
meio
de
cultura
39
WPM
suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA.
Figura 8
Aspecto da multiplicação in vitro e da comprimento dos brotos
de E. alboxanthina formados a partir de plântulas germinadas
in vitro com 12 meses de idade. (1) Brotos oriundos do meio
WPM com 17,60 µM de BAP com 0,2685 µM de ANA com
39
comprimento de 0,2 mm (1-a) e 0,3 mm (1-b). (2) Brotação
induzida com o uso de 17,60 µM de BAP na ausência de ANA
com comprimento de 0,1 mm (2-a); 0,2 mm (2-b) e 0,4 mm (2c). UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009. Fonte: o autor.
Figura 9
Comprimento médio dos brotos (mm) obtidos a partir de
41
plantas de E. alboxanthina, inoculados em meio de cultura
WPM suplementado com diferentes concentrações de BAP.
UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Figura 10
Percentagem de explantes que formaram brotos de E.
alboxanthina,
inoculados
em
meio
de
cultura
43
WPM
suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA
(µM).
Figura 11
Plantas de E. alboxanthina com 12 meses de idade. Aspecto do
44
meio de cultura durante a multiplicação. Meio sem oxidação
(A); meio com oxidação (B e C). UEFS, Feira de Santana-Ba,
2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
Figura 12
Aspecto da aclimatização de E. alboxanthina após 90 dias de
adaptação em casa de vegetação, de plantas germinadas in
vitro com 30 meses de idade regadas com água. Bandejas vista
de cima (A e B); Bandejas com vista aproximada (C, D, E, F e
G). Barra: 1 cm. Fonte: o autor.
54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Resumo da análise de variância para % de germinação de
20
sementes de E. alboxanthina, em função de diferentes tipos de
meios de cultura e da presença de carvão ativado (2 gL-1).
UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Tabela 2
Valores médios para germinação de sementes de E.
21
alboxanthina (%) em função de diferentes tipos de meios de
cultura e da presença de carvão ativado (2 gL-1). UEFS, Feira
de Santana-Ba, 2009.
Tabela 3
Resumo da análise de variância para MAS- matéria seca da
25
parte aérea (mg), MSR- matéria seca das raízes (mg), NRnúmero de raízes, CF- comprimento da folha (mm), CRcomprimento das raízes (mm) e CC- comprimento do caule
(mm) de plantas de E. alboxanthina em função dos diferentes
tipos de meio de cultura submetidos à esterilização física ou
química. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Tabela 4
Valores médios para matéria seca da parte aérea, matéria seca
27
da raiz, número de raízes, comprimento da folha, comprimento
das raízes e comprimento do caule de plantas de E.
alboxanthina em função de diferentes tipos de meio de cultura
submetidas à esterilização física ou química com NaClO.
UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Tabela 5
Resumo da análise de variância para MAS- matéria seca da
31
parte aérea (mg), MSR- matéria seca das raízes (mg), NRnúmero de raízes, CPA- comprimento da parte aérea (mm),
CR- comprimento das raízes (mm) de plantas de E.
alboxanthina, em função de diferentes fontes de carbono em
duas concentrações 43,82 e 87,64 mM. UEFS, Feira de
Santana-Ba, 2009.
Tabela 6
Valores médios para matéria seca da parte aérea, matéria seca
das raízes, número de raízes, e comprimento da parte aérea e
comprimento das raízes de plantas de E. alboxanthina em
33
função de diferentes concentrações e fontes de carbono. UEFS,
Feira de Santana-Ba, 2009.
Tabela 7
Resumo da análise de variância para MAS- matéria seca da
35
parte aérea (mg), MSR- matéria seca das raízes (mg), NRnúmero de raízes, CPA- comprimento da parte aérea (mm), e
CR- comprimento das raízes (mm) de plantas de E.
alboxanthina, em função das concentrações de carvão ativado
(0 e 2gL-1) no meio de cultura. UEFS, Feira de Santana-Ba,
2009.
Tabela 8
Valores médios para matéria seca da parte aérea, matéria seca
37
das raízes, número de raízes, comprimento da parte aérea,
comprimento das raízes de plantas de E. alboxanthina em
função da presença de carvão ativado na concentração de 2 gL1
Tabela 9
. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Resumo da análise de variância para NB- número de brotos,
CMB- comprimento médio dos brotos (mm), e
38
EFB-
explantes que formaram brotos (%) de E. alboxanthina em
função de diferentes concentrações de BAP e NAA. UEFS,
Feira de Santana-Ba, 2009.
Tabela 10
Resumo da análise de variância para NB- número de brotos,
45
CMB- comprimento médio dos brotos (mm), MSB- matéria
seca dos brotos (mg) e EFB- explantes que formam brotos (%)
de E. alboxanthina em função dos tipos de explantes. UEFS,
Feira de Santana-Ba, 2009.
Tabela 11
Valores médios para número de brotos (NB), comprimento
47
médio dos brotos (AMB), matéria seca dos brotos (MSB) e
explantes que formam brotos (EFB) de E. alboxanthina em
função de diferentes fontes de explantes: planta (PL),
protocormo (PR), base caulinar (BC) e folha (F). UEFS, Feira
de Santana-Ba, 2009.
Tabela 12
Resumo da análise de variância para redução de peso fresco
(%) até 30 minutos, (%) entre 30 e 60 minutos, e (%) redução
total após 60 minutos da exposição às condições ambientais,
50
em função do tipo de vedação (V) e da concentração de
sacarose (S) utilizada. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Tabela 13
Valores médios para redução de peso fresco (%) até 30
51
minutos, (%) entre 30 e 60 minutos, e (%) redução total após
60 minutos da exposição às condições ambientais, em função
do tipo de vedação (V) e concentração de sacarose (0 e 30 gL1
Tabela 14
) utilizada. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Valores percentuais (%) da sobrevivência das mudas de E.
alboxanthina 30, 60 e 90 dias de acordo com o substrato
(gravilhão + fibra de coco ou gravilhão + pérolas de isopor),
adubação com solução WPM 20% e local de aclimatização,
após a pré-aclimatização in vitro. UEFS, Feira de Santana-Ba,
2009.
53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANA- Ácido naftalenoacético
AIA- Ácido indolacético
AIB- Ácido indolbutírico
BAP- Benzilaminopurina
CV- Coficiente de variação
F- Valor da análise de variância
FV- Fonte de variação
GL- Grau de liberdade
IAA- Ácido 3- indol acético
KC- Meio nutritivo Knudson C de Knudson, 1922
M- molaridade
MS- Meio nutritivo de Murashige & Skoog, 1962
MS/2- Meio nutritivo de Murashige & Skoog, 1962 com metade da concentração
dos sais
MS/3- Meio nutritivo de Murashige & Skoog, 1962 com 1/3 da concentração dos
sais
MS/4- Meio nutritivo de Murashige & Skoog, 1962 com 1/4 da concentração dos
sais
MS/Banana- Meio nutritivo de Murashige & Skoog, 1962 acrescido com 50g.L-1
polpa de banana
MN- Meio Knudson C modificado por Novais e Rodrigues, 2004
N- normalidade
N:P:K- adubo com nitrogênio, fósforo e potássio
ns- não significativo à 5% de probabilidade pelo teste F
µL- microlitros
R2- Coeficiente de determinação
TDZ- Thidiazuron
VW- Meio nutritivo Vacin & Went, 1949
WPM- Wood Plant Medium LLOYD & McCOWN, 1980
µM- Micromolaridade
µL- Microlitros
µmol.m-2s-1- Micromol por metro quadrado por segundo
2,4- D- Ácido 2,4 Diclorofenoxiacético
SUMÁRIO
1
2
2.1
2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.5
3.5.1
3.5.2
3.6
3.7
4
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.3
4.3.1
4.3.2
4.4
INTRODUÇÃO
REVISÃO DA LITERATURA
ASPECTOS GERAIS DA FAMÍLIA ORCHIDACEAE
ÁREA DA PESQUISA
CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
Meios de cultura
Pré-aclimatização e aclimatização
MATERIAL E MÉTODOS
CONDIÇÕES GERAIS DO EXPERIMENTO
CONDIÇÃO DE CULTIVO IN VITRO
GERMINAÇÃO ASSIMBIÓTICA IN VITRO DE E.
ALBOXANTHINA
CRESCIMENTO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
Efeito do meio de cultura e da esterilização sobre o crescimento in
vitro de E. alboxanthina
Efeito de diferentes fontes de carbono no crescimento in vitro de
E. alboxanthina
Efeito do carvão ativado no crescimento in vitro de E.
alboxanthina
MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
Efeito de diferentes concentrações de BAP e NAA na
multiplicação de E. alboxanthina
Efeito de diferentes tipos de explante na multiplicação de E.
alboxanthina
EFEITO DA VENTILAÇÃO IN VITRO E DA CONCENTRAÇÃO
DE SACAROSE NA PRÉ-ACLIMATIZAÇÃO E DO SUBSTRATO
E DA ADUBAÇÃO NA ACLIMATIZAÇÃO DE E.
ALBOXANTHINA
ANÁLISE ESTATÍSTICA
RESULTADOS E DISCUSSÃO
GERMINAÇÃO ASSIMBIÓTICA IN VITRO DE E.
ALBOXANTHINA
CRESCIMENTO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
Efeito do meio de cultura e da esterilização sobre o crescimento in
vitro de E. alboxanthina
Efeito de diferentes fontes de carbono no crescimento in vitro de
E. alboxanthina
Efeito do carvão ativado no crescimento in vitro de E.
alboxanthina
MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
Efeito de diferentes concentrações de BAP e NAA na
micropropagação de E. alboxanthina
Efeito de diferentes tipos de explantes na multiplicação in vitro de
E. alboxanthina
EFEITO DA VENTILAÇÃO IN VITRO E DA CONCENTRAÇÃO
DE SACAROSE NA PRÉ-ACLIMATIZAÇÃO E DO SUBSTRATO
E DA ADUBAÇÃO NA ACLIMATIZAÇÃO DE E.
1
2
2
4
5
7
10
11
11
12
13
13
14
14
15
15
15
16
17
19
20
20
24
25
31
35
37
37
45
49
5
ALBOXANTHINA
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS
55
56
1 INTRODUÇÃO
As orquidaceae estão entre as plantas mais exploradas comercialmente, apresentando
potencial ornamental, alimentício, cosmético e medicinal. São consideradas, também,
importantes bioindicadoras do grau de preservação de uma determinada área, o que possibilita
inferir a respeito do estágio sucessional em que um ambiente se encontra apenas observando a
densidade de orquídeas presentes no local (PELÚCIO & SOARES, 2004).
São plantas herbáceas e perenes apresentando variadas forma e cores, sendo
mundialmente procuradas por colecionadores e pela floricultura. A busca incessante por
exemplares inéditos e cada vez mais exóticos, levou muitas espécies nativas à beira da
extinção, além da destruição do ecossistema e consequentemente dos organismos que dele
dependem (SILVA, 2003; GIATTI & LIMA, 2007). Tendo em vista a velocidade da
degradação do meio ambiente e a importância das orquídeas na manutenção da
biodiversidade, a preocupação de conservar esta família têm incentivado a realização de
projetos visando a reintrodução, conservação e manejo de orquídeas na natureza. (PEREIRA
et al., 2003; PELÚCIO & SOARES, 2004).
Em contrapartida, o investimento em pesquisas voltadas à produção de plantas
ornamentais tem apresentado um aumento significativo em inúmeros países como Holanda,
França, Espanha, Japão e, mais recentemente no Brasil (FRANÇA & MAIA, 2008). Técnicas
como a cultura de tecidos vegetais (cultivo in vitro), que permitem um melhor controle dos
fatores de produção, têm possibilitado a obtenção de mudas em larga escala, com alta
qualidade genética e sanitária e a preços mais acessíveis, o que possibilita uma produção
padronizada exigida pelo mercado consumidor, evitando assim, a degradação do meio
ambiente (REDENBAUGH, 1991; TOMBOLATO & COSTA, 1998).
O cultivo in vitro é relevante do ponto de vista ecológico, a depender da metodologia
empregada, pois plantas que estão ameaçadas de extinção podem ser produzidas a partir da
germinação in vitro sendo interessantes para programas de manejo, preservação e
reintrodução no meio ambiente já que estas mantêm sua identidade e variabilidade genética,
bem como, serem produzidas através da multiplicação in vitro, sendo interessantes para a
conservação em laboratório e para comercio de flores (ARAÚJO, 2004).
Algumas espécies de orquídeas têm sido encontradas em diversas listas de prioridade
máxima de conservação por apresentarem baixo sucesso reprodutivo ou habitat restrito, e
ainda, existem espécies não listadas que também encontram-se ameaçadas de extinção
(MENDONÇA & LINS, 2000). Plantas endêmicas sofrem um maior risco de extinção por
estarem retristras apenas a uma região e podem apresentar perdas significativas em seus
exemplares com o processo antrópico ou mesmo ambiental.
Encyclia alboxanthina Fowlie (1990) (Orchidaceae), é uma espécie endêmica da
Chapada Diamantina que apresenta potencial ornamental. Esta espécie, segundo Azevedo
(2004) foi por muito tempo confundida com outras presentes no Parque Nacional da Chapada
Diamantina e em outras localidades demonstrando a importância de uma maior divulgação
desta espécie para programas de conservação.
Afim de possibilitar a preservação da biodiversidade, usufruindo paralelamente da
beleza posta pela natureza, a cultura de tecidos vegetais, se encaixou como alternativa
eficiente para o cultivo assimbiótico de orquídeas (SILVA, 2003). Segundo Giatti & Lima
(2007), grande parte das sementes de orquídeas germinam e as plântulas se desenvolvem
rapidamente quando comparadas com o método natural, as sementes germinam e as mudas
crescem lentamente em associação simbiótica com fungos micorrízicos.
Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para a
propagação in vitro de plantas de E. alboxanthina, espécie endêmica da Chapada DiamantinaBahia.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 ASPECTOS GERAIS DA FAMÍLIA ORCHIDACEAE
A família Orchidaceae está entre uma das maiores e mais diversificadas entre as
angiospermas. São plantas herbáceas e perenes, com espécies epífitas, terrestres, rupícolas,
saprofíticas ou subterrâneas. Embora ainda não se conheça o número exato, estima-se que
existam aproximadamente, entre 17.000 e 35.000 espécies e mais de 160.000 híbridos
distribuídas em cerca de 1.800 gêneros. Estão amplamente distribuídas em todos os
continentes com exceção das regiões polares e de desertos extremamente secos, sendo
abundantes nas regiões quentes e úmidas. A medida que se aproxima da linha do Equador há
uma maior frequência, variabilidade de espécies e exuberância de cores (DRESSLER, 1993;
SILVA, 2003; COZZOLINO & WIDMER, 2005; PEMBERTON & HONG LIU, 2008).
Esta família está bem representada no Brasil com aproximadamente 2.350 espécies,
distribuídas em 200 gêneros, apresentando inúmeros híbridos de variadas formas, tamanhos,
aromas e cores de folhas e flores. Destaca-se como importante planta ornamental, de interesse
econômico, botânico, e inclusive de importância para indústria medicinal, cosméticos e
alimentícia (SILVA, 2003; ARAÚJO, 2004).
Morfologicamente a família Orchidaceae apresenta crescimento monopodial (ereto) ou
simpodial (prostrado), como a espécie E. alboxanthina. São constituídas de raiz, caule
(bulbo/pseudobulbo), folha, inflorescência, flor e fruto do tipo cápsula (DRESSLER, 1993).
A família Orchidaceae é de fundamental importância para manutenção da
biodiversidade, atuando como bioindicadoras ambientais do estado de conservação das
florestas, sendo sensíveis às interferências em matas primárias em virtude da ocupação de
ninchos especializados (MARRARA et al., 2007). Estima-se que 60% das espécies de
orquídeas, sejam polinizadas principalmente por diferentes espécies de himenopteros, mas
também por Lepidópteros, aves, Dípteros e Coleópteros. Algumas espécies se autopolinizam
espontaneamente (autógamas), sendo geralmente aquelas que apresentam flores de cores
pálidas, estruturas secretoras reduzidas ou ausentes, e, frequentemente, há modificações
morfológicas da coluna que facilitam a autopolinização (SINGER, 2004; HUMAÑA et al.,
2007; JERSÁKOVÁ et al., 2008).
O cultivo de orquídeas é realizado frequentemente através da propagação vegetativa de
mudas e estes métodos convencionais de propagação de orquídeas são muito lentos e podem
disseminar patógenos capazes de provocar perdas significativas das inflorescências (ARAÚJO,
2007; ROCHA, 2007; SAIURY, 2006).
Apesar de uma cápsula conter 1.000.000 de sementes ou mais, estas são muito
reduzidas e quase desprovidas de endosperma, necessitando da simbiose com fungos
micorrízicos para iniciarem o processo de germinação na natureza (DRESSLER, 1993).
A espécie E. alboxanthina (Orchidaceae) (Figura 1) foi descrita originalmente do
município de Mucugê-Bahia, mas sua ocorrência foi citada também para Lençóis e CatolésBahia. Esta espécie têm hábito exclusivamente rupícola, apresenta “rizoma inconspícuo,
flores ressupinadas de coloração amarela-esverdeadas com estrias vináceas, muito
perfumadas, pedicelo, incluindo o ovário, labelo branco e linhas purpúreas, de textura lisa,
hastes florais com inflorescências muito longas e grande quantidade de flores. Cresce
diretamente sobre as rochas a pleno sol, com o período de floração entre outubro e fevereiro”
(AZEVEDO, 2004).
B
A
C
Figura 1: E. alboxanthina. Aspecto visual de uma planta adulta (A); inflorescência (B e C ). Barra: 1 cm.
Fonte: Rosim, 2007.
Em decorrência dos problemas ambientais ocasionados pelos contrastes dos fatores
climáticos e físicos e o intenso extrativismo que ocorrem na Chapada Diamantina, alguns
trabalhos que ressaltam a importância de conservação da biodiversidade, têm dedicado
atenção a família Orchidaceae nesta região, objetivando desenvolver novas alternativas de
cultivo, visto que, hoje algumas espécies encontram-se ameaçadas de extinção (COLOMBO
et al., 2004; RIBEIRO et al., 2005).
2.2 ÁREA DA PESQUISA
No nordeste brasileiro onde está concentrada a maior parte da região semiárida, estão
presentes as mais diversas paisagens, tanto em relação a geomorfologia quanto aos tipos de
vegetação. Devido às diferentes fisionomias do relevo, o clima do Nordeste é um dos mais
complexos de todo o País, variando de super-úmido até semiárido, o que torna a
disponibilidade de água um fator determinante para a vegetação (QUEIROZ et al., 2006;
GIULIETTI et al., 2006).
O Estado da Bahia como o Nordeste de uma forma geral, possui uma flora rica,
composta por espécies pertencentes a diversas famílias com grande potencial para exploração
econômica. A Chapada Diamantina está inserida neste Estado como complexo montanhoso
altamente influenciado pela umidade atmosférica, apresentando variadas plantas epífitas
(RIBEIRO et al., 2005).
As orquídeas estão presentes nos tipos vegetacionais da Chapada Diamantina, que é
um importante centro de diversidade da flora brasileira, sendo localizadas principalmente nas
matas e nos Campos Rupestres. Nesta região, a Orchidaceae é uma das principais famílias em
número de espécies, sendo inferior apenas para a Poaceae e Asteraceae (CONCEIÇÃO &
GIULIETTI, 2006).
O Parque Municipal de Mucugê-Bahia (PMM), onde a família Orchidaceae apresenta
grande importância florística, está localizado no município de Mucugê cerca de 4 km da
cidade de Mucugê (AZEVEDO, 2004). Apresenta vegetação predominante de Campo
Rupestre, destacando-se pela presença do grande número de espécies endêmicas (GIULIETTI
& QUEIROZ, 2006).
Segundo Azevedo (2004), no Parque Municipal de Mucugê foram encontradas 35
espécies de orquídeas distribuídas em 22 gêneros. Algumas dessas orquídeas estão
distribuídas amplamente pelo mundo, podendo ser encontradas pelo Brasil e em outros países
e outras são espécies endêmicas da Chapada Diamantina como E. alboxanthina.
2.3 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
A cultura de tecidos vegetais através da micropropagação apresenta-se como uma
alternativa importante e economicamente viável para a multiplicação de orquídeas. É uma
técnica que concilia a comercialização, com a preservação do meio ambiente e a conservação
das espécies usadas. Em vista disso, esta técnica tem se tornado uma boa alternativa para a
produção em larga escala de plantas uniformes em um curto espaço de tempo o que satisfaz as
necessidades do mercado. Vem sendo amplamente utilizada para os estudos de fisiologia
vegetal, nutrição mineral, fitopatologia e limpeza clonal, produção de metabólitos
secundários, criopreservação, propagação in vitro e melhoramento genético (DEBERGH &
ZIMMERMAN, 1991; ARDITTI & ERNST, 1992; TOMBOLATO & COSTA, 1998;
BUFFA et al., 2002; ERIG & SCHUCH, 2005; SOUZA & JUNGHANS, 2006).
Dentre os métodos de propagação in vitro, a germinação assimbiótica de sementes de
orquídeas, que é corriqueiramente usada, foi estabelecido em 1922 pelo Prof. Lewis Knudson
(1884-1958), da Cornell University, em frascos de vidro contendo ágar, nutrientes e sacarose
(Campos, 2000). Knudson, conseguiu germinar as sementes de orquídeas ao incorporar o íon
amônia (NH4+) juntamente com teores de NO3+, o que posteriormente ocasionou inúmeras
pesquisas enfatizando a importância do íons amônia para o crescimento de orquídeas (Pasqual
et al., 1997). Com a descoberta desta técnica, foi possível estabelecer protocolos de
desenvolvimento e multiplicação de diversas espécies ornamentais em um curto período de
tempo, difundindo para centros de pesquisas voltados a conservação, medicina alternativa e
cosmética, além de grandes produtores interessados em produzir mudas com baixo valor
comercial (ARAÚJO, 2004).
Para o cultivo in vitro, George (1993) define algumas etapas: Etapa 0: a seleção da
planta matriz é realizada seja por germinação in vitro ou desinfestação de uma planta retirada
do ambiente natural; Etapa 1-Estabelecimento: o explante é colocado em um meio de cultura
asséptico para se adaptar as condições de cultivo in vitro; Etapa 2-Multiplicação: nesta etapa
pode-se obter o maior número de brotos a partir da planta ou de explantes, a depender da
espécie, por meio de estímulos específicos e subcultivos sucessivos; Etapa 3-Enraizamento: é
feita a indução do enraizamento e Etapa 4-Aclimatização: as plantas são transferidas para casa
de vegetação. Esta última etapa é considerada decisiva para o sucesso da cultura in vitro,
requerendo atenção especial devido a fragilidade das mudas obtidas in vitro e a dificuldade
que pode representar frente as mudança das condições do laboratório para a casa de vegetação
(SOUZA & JUNGHANS, 2006).
Algumas dificuldades também são encontradas para a realização desta técnica.
Normalmente, a escassez de protocolos específicos para determinadas espécies, a etapa de
aclimatização, a limpeza clonal e a introdução de novas variedades, dentre outros, tornam o
trabalho mais laborioso (TOMBOLATO & COSTA, 1998; SOUZA & JUNGHANS, 2006).
2.3.1 Meios de Cultura
O meio de cultura utilizado na otimização de protocolos de micropropagação está
entre um dos principais fatores que influenciam no sucesso do cultivo in vitro. Este meio é
composto por substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos, controlando, em grande
parte, o padrão de desenvolvimento in vitro, através das exigências nutricionais de cada
espécie. Sendo assim, é escolhido de acordo com o trabalho a ser realizado e a espécie em
estudo (PASQUAL et al., 2008; CALDAS et al., 1998). A água, os macro e micronutrientes,
vitaminas, aminoácidos, açúcares, agente gelificante, reguladores vegetais, além de eventuais
suplementos como antibióticos, carvão ativado, polpa de frutas, água de coco, suco de abacaxi
e extrato de folha de fumo, fazem parte do meio nutritivo (ARDITTI & ERNST, 1992;
GEORGE, 1993; SANTOS-SEREJO et al., 2006).
Geralmente o carvão ativado é adicionado ao meio de cultura em concentrações que
variam de 0,2 a 3% promovendo o escurecimento do meio e favorecendo o geotropismo das
raízes. Além disso, pode promover outras alterações no meio de cultura e em algumas
circunstâncias melhorar ou regular o crescimento de plantas in vitro. Em algumas espécies, o
carvão ativado pode beneficiar o enraizamento por meio da remoção dos inibidores da
rizogênese que são liberados por alguns explantes ou por alguns compostos presentes no meio
de cultura. Entretanto o carvão ativado possui efeito não seletivo o que pode induzir
androgenia, alterar o pH, remover nutrientes orgânicos e reguladores vegetais, inibir o
crescimento e a morfogenia (ARDITTI & ERNST, 1992; GEORGE, 1993; PAN & STADEN,
1998; SANTOS-SEREJO et al., 2006).
Arditti & Ernst (1992) citam que para as orquídeas, o carvão ativado pode ser
empregado para adsorção dos compostos fenólicos tóxicos produzidos pelas raízes. No
entanto, esses autores sugerem também comparar os efeitos do carvão ativado com a
polivinilpirrolidona (PVP) e polivinilpolipirrolidona (PVPP), como adsorventes de
substâncias tóxicas, nutrientes, vitaminas e reguladores vegetais a fim de se escolher o mais
apropriado para a espécie em estudo.
Os carboidratos são essenciais aos processos metabólicos e fisiológicos na cultura in
vitro. Plantas que são cultivadas por esta técnica não encontram condições adequadas de
iluminação e concentração de CO2, apresentando por vezes teores baixos de clorofila para a
realização da fotossíntese (GEORGE, 1993; TOMBOLATO & COSTA, 1998; SKRESBSKY
et al.,2004). Em geral, o carboidrato mais utilizado nos meios de cultura é a sacarose mas,
outras fontes de carbono como a glicose, frutose e maltose também podem ser usadas. A
escolha do tipo e da concentração dos carboidratos são importantes para a promoção do
crescimento das plantas, folhas e raízes (GEORGE, 1993; CALDAS, 1998; RIBEIRO et
al.,2007).
As concentrações de sacarose mais utilizadas estão entre 2 a 5%, sendo que para o
meio de cultura MS a concentração de 3% é a mais usada (GEORGE, 1993). O excesso de
sacarose também pode ser prejudicial, podendo inibir a síntese de clorofila e, portanto, reduzir
a capacidade fotossintética das culturas, além de reduzir a água disponível no meio (ZIV,
1991).
Além da sacarose, outros componentes importantes para o controle do crescimento e o
desenvolvimento das plantas, são os fitormônios. Estes, são sintetizados em pequenas
concentrações e em determinadas partes da planta sendo distribuídas posteriormente a
diferentes órgãos nos quais exerce a função de inibir ou estimular processos fisiológicos e/ou
bioquímicos vitais. Os fitormônios podem ser sintetizados em laboratório, e nessa situação,
são denominados de reguladores vegetais ou fitorreguladores. Estes fitorreguladores
apresentam ação similar aos fitormônios, atuando em baixas concentrações em vários
processos do desenvolvimento das plantas (MACHAKOVA et.al., 2008).
Em geral, um dos fatores determinantes no crescimento e no padrão de
desenvolvimento dos sistemas de cultura in vitro é a composição e concentração de
reguladores vegetais adicionados ao meio de cultura. Uma concentração ideal é necessária
para cada espécie e tipo de explante usado (TAGLIACOZZO, 1998; SEREJO-SANTOS et
al., 2006; FERREIRA & PASQUAL, 2008). Dentre os fitorreguladores amplamente usados
na cultura de tecidos vegetais estão as auxinas (AIA-Ácido indolacético; AIB-Ácido
indolbutírico;
Picloran;
ANA-Ácido
naftalenoacético
e
2,4-D-Ácido
2,4
Diclorofenoxiacético) e as citocininas (cinetina, BAP-Benzilaminopurina, Zeatina e TDZThidiazuron), sendo a BAP o menos dispendios para promoção e desenvolvimento da parte
aérea da planta (MACHAKOVA et al.,2008; STADEN et al., 2008).
As auxinas quando colocadas no meio de cultura promovem a acidificação da parede
celular permitindo o alongamento das células (TAIZ & ZEIGER, 2009) e são utilizadas para a
indução de calos em raízes, folhas, gemas axilares ou apicais, embriões, cotilédones e
hipocótilos, sendo responsável também pelo crescimento em altura (dominância apical) e pelo
enraizamento das plantas. Já as citocininas promovem a divisão celular sendo amplamente
utilizadas na regeneração in vitro. Desempenham importante papel na indução de brotações
bem como na quebra da dominância apical, na multiplicação e na indução da formação de
gemas axilares e na etapa de regeneração dos calos (GRATTAPAGLIA & MACHADO,
1990; TAGLIACOZZO, 1998; SANTOS-SEREJO et al., 2006).
As auxinas e citocininas devem ser combinadas por tipo e concentração para promover
a multiplicação e o desenvolvimento in vitro das plantas cultivadas. A combinação ótima
entre os dois tipos de reguladores vai depender da espécie ou dos cultivares dentro de uma
mesma espécie (TAGLIACOZZO, 1998; FERREIRA & PASQUAL, 2008). A alta relação
citocinina/auxina é quase sempre necessária para a indução direta de brotações nos explantes.
No entanto, alguns tecidos são totalmente dependentes da presença dos reguladores para
regenerar e outros são auto-suficientes. Nesse caso, a formação de novos brotos é observada
mesmo na ausência de reguladores exógenos (GEORGE, 1993; SEREJO-SANTOS et al.,
2006).
Os aditivos orgânicos complexos que tem como objetivo, melhorar a resposta no
padrão de crescimento da planta, são preparações obtidas de produtos naturais de composição
indefinida, mas que atendem o propósito de enriquecimento do meio de cultura. O Coco
(endosperma, água, leite), a peptona de carne e a polpa de banana são usados na germinação
de sementes e no crescimento da planta, podendo promover diferentes efeitos durante o
cultivo in vitro, a depender do cultivar e da quantidade de aditivo orgânico utilizada
(TOMBOLATO & COSTA, 1998; SANTOS-SEREJO et al., 2006).
De acordo com a literatura citada, o meio de cultura mais utilizado para o processo de
micropropagação é o MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), entretanto, sua concentração de
nutrientes é alta, necessitando muitas vezes de modificações para suprir as necessidades ideais
de cada espécie (ARDITTI & ERNST, 1992; SANTOS-SEREJO et al., 2006; SOUZA &
JUNGHANS, 2006). A presença de altas concentrações de nitrogênio total ou na forma de
NH4+ no meio MS é muito maior do que na maioria dos outros meios de cultura, fato que
torna este meio inadequado para algumas espécies (MELO et al.,1999).
Hoffmann et al., (1998) relatam que a redução de sais promove o melhor crescimento
de tecidos em orquídeas. Assim os meios de cultura que apresentam menor proporção salina,
Knudson (KNUDSON, 1922), White (WHITE, 1942) ou WPM Wood Plant Medium
(LLOYD & MCCOWN, 1981) podem ser melhores para otimizar o crescimento e a
morfogênese em algumas espécies (PASQUAL et al., 1997 apud ARAUJO, 2004). O meio de
cultura WPM é utilizado para plantas lenhosas sendo quatro vezes menos concentrado que o
meio MS em relação aos macronutrientes. Este meio tem sido frequentemente empregado
para plantas herbáceas, inclusive orquídeas (MELO et al.,1999).
Contudo, ressalta-se a importância da esterilização do meio nutritivo e o controle
ambiental para a realização do cultivo, pois irão proporcionar a obtenção de plantas mais
uniformes e evitar a contaminação (RIBEIRO, 2006).
2.3.2 Pré-aclimatização e Aclimatização
A adaptação das plantas procedentes do cultivo in vitro para o ambiente ex vitro é
denominada aclimatização. Este processo é de extrema importância para o sucesso da cultura
de tecidos vegetais. Em geral, a adaptação ocorre gradativamente e tem como objetivo
minimizar as dificuldades submetidas às plantas durante a transferência para a casa de
vegetação. A temperatura, a luminosidade, a umidade, os substratos e os nutrientes são alguns
dos fatores que podem dificultar o desenvolvimento e sobrevivência das mudas durante esse
processo (DEBERG & ZIMMERMAN, 1991; SOUZA et al., 2007).
Morfologicamente, as plantas cultivadas in vitro podem apresentar diferenças quando
comparadas àquelas que se desenvolvem em ambiente natural. Esse fato pode ser responsável
pela baixa sobrevivência das mudas quando transferidas do cultivo in vitro para a casa de
vegetação. No ambiente ex vitro uma maior taxa de transpiração é exigida às plantas, pois
frequentemente plantas cultivadas in vitro apresentam as estruturas que controlam a perda de
água pouco desenvolvidas (PREECE & SUTTER, 1991; ROCHA, 2007).
Para aumentar o índice de sobrevivência das mudas durante a aclimatização, alguns
autores têm relatado a importância do desenvolvimento de determinadas características
morfológicas ainda durante o crescimento in vitro (CARVALHO et al., 1999; SOUZA et al.,
2007). Modelos de cultivo que possibilitam a ocorrência de trocas gasosas e sistemas de
micropropagação fotoautotróficos que envolvem a exposição das plantas a alta intensidade
luminosa, têm facilitado a fase de aclimatização das mudas, aumentando assim o índice de
sobrevivência no ambiente ex vitro (PEDROTTI & VOLTOLINI, 2001; HAZARIKA, 2003).
Alguns autores sugerem manter a concentração da sacarose em 30 gL-1 ou mesmo
aumentá-la (LEITE et al., 2000; CALVETE, 2002). Outros autores recomendam reduzir a
fonte de carbono durante a pré-aclimatização, afim, de habituar a planta à nutrição autotrófica
(KOZAI, 1991; HAZARIKA, 2003; SKREBSKY et al., 2004).
Outro fator de extrema importância para a aclimatização é o tipo de substrato usado na
preparação das mudas. Conforme suas propriedades físico-quimicas, podem interferir no
crescimento da planta. No caso das orquídeas, plantas epífitas, torna-se necessário a utilização
de substratos de textura relativamente grossa e de drenagem livre que proporcionam às raízes
o livre acesso ao ar e à luz. Com freqüência são utilizados como substrato: a fibra de coco, pó
de coco, esfagno, casca de pinus, piaçava, xaxim, vermiculita, tijolo, carvão vegetal, dentre
outros. Geralmente são usadas misturas de diferentes substratos, pois dificilmente um único
material conseguirá apresentar todas as características adequadas para compor um bom
substrato (LUCENA, 2008).
Fisicamente o substrato deve permitir o crescimento das raízes, reter água
possibilitando paralelamente aeração e suporte do sistema radicular, e principalmente, não
favorecer o crescimento de microorganismos e plantas daninhas. Sendo assim, o sucesso dos
substratos vai depender da espécie, do tipo de ambiente e do local pretende cultivar a planta
(KAMPF, 2000; WEDLING et al., 2002; LUCENA, 2008).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 CONDIÇÕES GERAIS DO EXPERIMENTO
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais na
Unidade Experimental-Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS)
e no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Instituto de Biologia da Universidade
Federal da Bahia (UFBA). As cápsulas da espécie E. alboxanthina (Figura 6-A) foram
coletadas no Projeto Sempre-Viva dentro do Parque Municipal de Mucugê localizado no
município de Mucugê-Bahia. Para a germinação foram usadas sementes retiradas de cápsulas
maduras naturalmente abertas (Figura 2-A, B e C) e para o restante dos experimentos, foram
usadas plantas germinadas previamente in vitro, variando de 5 à 10 mm de comprimento à
depender do experimento (Figura 2-D, E e F).
25 mL
B
A
D
D
D
E
C
F
Figura 2: E. alboxanthina. Aspecto visual de uma capsula (A); sementes imersas em água destilada (B); sementes
inoculadas em meio nutritivo (C); protocormos em formação (D); plantas formadas (E); plantas com 5
à 10 mm (F). UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
3.2 CONDIÇÃO DE CULTIVO IN VITRO
Os meios de cultura utilizados foram suplementados com 30 gL-1 de sacarose,
gelificados com 8 gL-1 de ágar e tiveram o pH ajustado para 6 ± 0,1 utilizando NaOH ou HCl
a 0,1N. Em cada tubo de ensaio (25 x 150 mm) foram vertidos 15 mL de meio de cultura. Os
tubos foram fechados com tampa de plástico e autoclavados a 127 °C e 1,05 kg.cm-2 por 15
minutos. Após a inoculação do material vegetal os tubos de cultura foram vedados com filme
PVC e mantidos em sala de crescimento sob as seguintes condições de cultivo: Temperatura
de 25 ± 2 °C, fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente
ativos de 40 µmol.m-2.s-1.
Os experimentos relacionados aos itens 3.4 e 3.6 apresentam variações nestas
condições de cultivos e as suas metodologias encontram-se descritas nos próprios itens.
3.3 GERMINAÇÃO ASSIMBIÓTICA IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
As sementes foram retiradas das cápsulas e estocadas em envelope de papel na
temperatura de 5 °C. Em 50 mL de água destilada foram colocadas 30 mg de sementes para
agitação manual e decantação. As sementes decantadas foram retiradas e passaram para uma
solução contendo 25 mL da solução de NaClO (2-2,5% de cloro ativo) misturado com 25 mL
de água destilada por 15 minutos para a assepsia, e, posteriormente, lavadas em água destilada
três vezes. Para a inoculação usou-se 15 mL de água destilada autoclavada contendo as
sementes assépticas, sendo inoculados 150 µL da solução em cada tubo, contendo 130
sementes. Para a contagem das sementes, foi colocado em placas de petri, separadamente, a
primeira gota e a penúltima gota, antes da inoculação dos tubos de cultura e a última gota
após a última inoculação nos tubos de cultura. A contagem das três placas contendo as
sementes foi feita em microscópio óptico e ao final tirou-se uma média.
Foram testados seis tipos de meio de cultura: Meio 1. “alternativo” MC-1, composto
por 50 gL-1 de polpa de banana nanica semi madura, 50 gL-1 de polpa de mamão papaya e 50
gL-1 de polpa de tomate semi maduro, 120 mL.L de água de coco verde, 3 mL.L de adubo
NPK (10:10:10) para orquídeas “Orchids”; Meio 2. ágar; Meio 3. KC (KNUDSON, 1922);
Meio 4. MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) com a concentração total de sais e vitaminas;
Meio 5. MS com a metade da concentração total de sais e vitaminas (MS/2) e, Meio 6. MS
com ¼ da concentração total de sais e vitaminas (MS/4). Todos os meios de cultura foram
suplementados com 30 gL-1 de sacarose, exceto o meio KC que foi suplementado com 20 gL-1
de glicose. Em todos os meios de cultura também foi avaliado o efeito da presença (2 gL-1) ou
ausência de carvão ativado.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema
fatorial 6 x 2 (meios de cultura x concentração carvão), com 5 repetições para cada tratamento
contendo 130 sementes em cada tubo.
Após 30 dias da inoculação das sementes avaliou-se o percentual de germinação
contando-se o número de protocormos verdes em relação proporcional ao número total de
sementes inoculadas.
3.4 CRESCIMENTO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
3.4.1 Efeito do meio de cultura e da esterilização sobre o crescimento in vitro de E.
alboxanthina
Foram usados os mesmos meios de cultura descritos no item 3.3, exceto meio 2.
Porém, para esse experimento acrescentou-se o meio de cultura MS completo acrescido com
100 gL-¹ de polpa de banana (MS/banana) e o meio de cultura WPM. Todos os meios de
cultura foram submetidos a duas formas de esterilização: por autoclavagem a 121°C e 1
kg.cm-2 por 15 minutos (esterilização física) e com a utilização de NaClO à 5% de cloro ativo
(esterilização química) segundo a metodologia descrito por Ribeiro (2006). Para a inoculação
foram usadas plântulas com 3 meses de idade, obtidas a partir do experimento anterior.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema
fatorial 7 x 2 (meios de cultura x tipos de esterilização do meio) com 10 repetições contendo
quinze plântulas/parcela.
A avaliação foi efetuada após 90 dias da inoculação. Foram mensurados a MSAmatéria seca da parte aérea (mg), MSR- matéria seca da raiz (mg), NR- número de raízes por
planta, CF- comprimento da folha (mm), CR- comprimento da maior raiz (mm) e CCcomprimento do caule (mm).
3.4.2 Efeito de diferentes fontes de carbono no crescimento in vitro de E. alboxanthina
A partir dos resultados obtidos no experimento anterior, instalou-se este, utilizando o
meio de cultura WPM submetido à esterilização física.
Neste experimento foi avaliado o crescimento das plantas de E. alboxanthina em meio
de cultura WPM suplementado com diferentes fontes de carbono (sacarose, sorbitol, açúcar
comum, glicose, manitol e maltose) em duas diferentes concentrações (43,82 mM e 87,64
mM). Para a inoculação foram usadas plântulas com 6 meses de idade obtidas a partir da
germinação in vitro.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 6 x 2
(fonte de carbono x concentração) com cinco repetições contendo oito plantas/parcela.
A avaliação foi efetuada aos 120 dias da inoculação, quanto a MSA- matéria seca da
parte aérea (mg), MSR- matéria seca da raiz (mg), NR- número de raízes por planta, CPAcomprimento da parte aérea (mm) e CR- comprimento da maior raiz (mm).
3.4.3 Efeito do carvão ativado no crescimento in vitro de E. alboxanthina
A partir dos resultados obtidos no experimento anterior, instalou-se este, utilizando o
meio de cultura WPM submetido à esterilização física, suplementado com 30gL-1 de sacarose.
Foi avaliado o crescimento das plantas de E. alboxanthina em meio de cultura WPM
suplementado com 30 gL-1 de sacarose e carvão ativado (0 ou 2 gL-1). Para a inoculação
foram usadas plântulas com 9 meses de idade obtidas a partir da germinação in vitro.
O delineamento experimental foi
inteiramente casualizado com 20 repetições
contendo cinco plantas/parcela.
A avaliação foi efetuada após 90 dias da inoculação, quanto a MSA- matéria seca da
parte aérea (mg), MSR- matéria seca das raízes (mg), NR- número de raízes por planta, CPAcomprimento da parte aérea (mm) e CR- comprimento da maior raiz (mm).
3.5 MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
3.5.1 Efeito de diferentes concentrações de BAP e ANA na multiplicação de E.
alboxanthina
Neste experimento, utilizou-se plantas com 12 meses de idade medindo cerca de 5 a
10 mm de comprimento procedentes da germinação in vitro que foram inoculadas em meio de
cultura WPM suplementado com diferentes concentrações de BAP (0,0; 2,2; 4,4; 8,8; 17,60
µM) e ANA (0,0; 0,26; 0,57; 1,07 µM).
A avaliação foi efetuada após 90 dias da inoculação, quanto ao NB- número de brotos,
CMB- comprimento médio dos brotos (mm) e EFB- explantes que formaram brotos (%).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 4
(concentrações de BAP x concentrações de ANA) com cinco repetições contendo 12
plantas/parcela.
3.5.2 Efeito de diferentes tipos de explante na multiplicação de E. alboxanthina
Este experimento avaliou-se a capacidade regenerativa de quatro tipos de explantes:
(1) plantas germinadas in vitro com 5 à 10 mm de comprimento possuindo 24 meses de idade,
(2) folha com ± 3 mm de comprimento retiradas de plantas com 24 meses de idade, (3) base
caulinar com ± 3 mm de comprimento sem ápice e sem raízes extraídos de plantas com 24
meses de idade e (4) protocormos com cerca de ± 2 mm de diâmetro com 15 dias de idade
(Figura 7), em três combinações de BAP e ANA (0,0-0,0; 8,8-0,573; 17,60-0,0 µM), que
foram estabelecidas após a avaliação do primeiro experimento de multiplicação.
A avaliação foi efetuada após 90 dias da inoculação, quanto ao NB- número de brotos,
CMB- comprimento médio dos brotos (mm), MSB- matéria seca dos brotos (mg) e EFBexplantes que formaram brotos (%).
Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema
fatorial 4 x 3 (tipos de explante x combinações de BAP e ANA), totalizando cinco repetições
de oito explantes/parcela.
A
Planta
B
2,5 cm
Planta
Folha
B
2,5 cm
Folha
C
Base caulinar
C
2,5 cm
2,5 cm
Base
caulinar
D
Protocormo
GERMINAÇÃO
D
2,5 cm
GERMINAÇÃO
A
E
Protocormo
ProtocormoE
Figura 3: E. alboxanthina. Planta com 24 meses (A); folha (B); base caulinar (C); protocormo com um mês de
idade (D). UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
3.6 EFEITO DA VENTILAÇÃO IN VITRO E DA CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE NA
PRÉ-ACLIMATIZAÇÃO
E
DO
SUBSTRATO
E
DA
ADUBAÇÃO
NA
ACLIMATIZAÇÃO DE E. ALBOXANTHINA
Na fase de pré-aclimatização, plântulas sem raízes germinadas in vitro com 15 a 20
mm de comprimento foram cultivadas no meio de cultura WPM suplementado com 0 e 30 gL1
de sacarose. Os tubos de cultura foram fechados com película de PVC ou com rolha de
algodão e mantidos em sala de crescimento por 60 dias.
Assim para esse experimento o delineamento experimental utilizado foi inteiramente
casualizado em esquema fatorial 2 x 2 (concentração de sacarose x tipo de fechamento dos
tubos) com 10 repetições contendo cinco plântulas/parcela.
Decorridos 30 dias foi determinada a perda de água por transpiração. Para tanto, as
plantas foram pesadas no momento da retirada dos tubos e após 30 e 60 minutos de exposição
às condições ambientais. Foi calculado o percentual de redução de peso relacionando o peso
obtido após 30 e 60 minutos com o peso inicial de cada indivíduo de acordo com a
metodologia proposta por Mills & Tal (2003), modificado por Bellintani (2006).
Para a aclimatização das plantas, realizou-se posteriormente, um experimento que foi
dividido em 2 partes: 1. Diretamente em casa de vegetação com 70% de luminosidade,
durante 90 dias e 2. Em sala de crescimento, com temperatura de 25 ± 2 oC sob radiação
fotossintética ativa de 40 µmol.m-2.s-1 e fotoperíodo de 16 horas durante os primeiros 24 dias,
e, posteriormente, transferido para a casa de vegetação com 70% de luminosidade por mais 66
dias.
As plantas foram colocadas em oito bandejas de plástico “Galvanotek G-70” em dois
tipos de substratos: gravilhão combinado com fibras de coco ou gravilhão combinado com
pérolas de isopor na proporção de 1:1, cada bandeja recebeu 48 plantas (Figura 8), as quais
foram irrigadas diariamente com 25 mL de água de torneira.
Foi avaliada, ainda, a influência da adubação durante a aclimatização, sendo que, a
cada 48 horas parte das plantas foi irrigada com os sais do meio de cultura WPM diluido a
20%.
A percentagem de sobrevivência foi determinada pela contagem do número de plantas
vivas em relação ao total de plantas submetidas à aclimatização.
D
24 cm
38,5 cm
E
A
B
F
C
Figura 4: Substratos utilizados na aclimatização de E. alboxanthina: (A) Pérolas de isopor; (B) gravilhão; (C)
fibra de coco; (D) Recipiente Galvanotek G-70; (E) gravilhão combinado com fibra de coco; (F)
gravilhão combinado com isopor. UEFS, Feira de Santana-Ba. Barra: 1 cm. Fonte: o autor.
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os experimentos foram avaliados estatisticamente mediante a análise de variância,
aplicando-se o teste de Scott-Knott para os dados qualitativos e a análise de regressão para os
dados quantitativos. Os dados foram analisados usando o software SISVAR versão 4.6
(FERREIRA, 2003).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 GERMINAÇÃO ASSIMBIÓTICA IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
Observou-se efeito altamente significativo (p ≤ 0,01) da interação “ meios de cultura x
carvão ativado” para a variável porcentagem de germinação (Tabela 1). Os maiores valores de
germinação, após 30 dias de inoculação, foram obtidos nos meios de cultura KC (25,65%) e
MS/2 (26,55%) na ausência de carvão ativado (Tabela 2 e Figura 5).
Tabela 1: Resumo da análise de variância para % de germinação de sementes de E. alboxanthina, em função
de diferentes tipos de meios de cultura e da presença de carvão ativado (2 gL-1). UEFS, Feira de
Santana-Ba, 2009.
FV
GL
Quadrados Médiosz
% Germinação
Meio de Cultura (MC)
5
548,04**
Carvão Ativado (CA)
1
1319,20**
MC x CA
5
295,75**
Resíduo
48
13,11
CV (%)
z
25,79
Médias transformadas em arco seno.
** Significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F.
Araújo et al. (1999) trabalhando com as espécies Cattleya walkeriana Gard. e
Cytropodium palmifrons Rchb.f., verificaram que a taxa de germinação, aos 30 e 45 dias
variou de 50 a 100% de germinação com o uso dos meios de cultura KC e MS tradicionais ou
combinados com cinetina (0,25; 5 e 10 mgL-1) e IAA (1, 15 e 30 mgL-1).
Tabela 2– Valores médios para germinação de sementes de E. alboxanthina (%) em função de diferentes tipos
de meios de cultura e da presença de carvão ativado (2 gL-1). UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
% Germinação z
Meios de Cultura
Com carvão ativado (2g/L)
Sem carvão ativado
5,13 byAx
0,00 cB
Ágar
0,00 cB
17,63 bA
KC
0,00 cB
25,65 aA
MS
17,00 aB
20,62 bA
MS/2
17,59 aB
26,55 aA
MS/4
16,39 aB
21,93 bA
Alternativo
z
Estatística realizada com médias transformadas em arco seno.
y
– Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de
probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
x
– Médias seguidas pela mesma letra maiúscula em cada linha, não diferem entre si ao nível de 5% de
probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Resultados semelhantes também foram reportados para outras espécies quando se
utilizou meios de cultura com menor concentração salina. Em estudos comparativos com
Phalaenopsis, obteve-se índice de germinação de 87,7 a 100% para o meio de cultura MS/3 e
nenhuma germinação para o meio MS tradicional (FAVETTA et al., 2008). Manrique &
Gutiérrez (2006), trabalhando com Odontoglosum gloriosum Lind & Rchb.f., constataram que
a germinação desta espécie em meio de cultura MS foi inferior (2,57%) ao meio KC
(19,23%). Estes mesmos autores observaram que a adição de 2 gL-1 de carvão ativado no
meio de cultura não influenciou na germinação.
Neste experimento as sementes de E. alboxanthina apresentaram germinação na
maioria dos tratamentos analisados exceto para o meio 2 (ágar) e para o meio 3 (KC)
suplementados com 2 gL-1 de carvão ativado e para o meio alternativo sem a presença de
carvão ativado. A ausência do carvão ativado nos meios de cultura proporcionou uma melhor
germinação em todos os meios analisados exceto no meio de cultura alternativo (Tabela 2 e
Figura 5). Este fato indica que o carvão ativado na concentração em que foi testada (2 gL-1),
não é satisfatório para a obtenção de plântulas através da germinação, e, que talvés, a ausência
ou o uso de concentrações menores que 2 gL-1, podem proporcionar maior percentual de
germinação nas sementes de E. alboxanthina.
Resultados similares foram encontrados por Ventura (2007) no cultivo in vitro de
Cattleya amethystoglossa Lind. & Rchb.f. em meio MN (CHU & HILL, 1988), onde foi
verificado que as diferentes concentrações de carvão ativado (0; 1; 2; 3 e 4 gL-1) mostraram-se
prejudiciais à germinação e retardaram o crescimento dos protocormos independente da
concentração de carvão utilizada. Esse autor sugere, assim, novos estudos para a identificação
de susbstâncias adsorvidas ou liberadas pelo carvão ativado e para entender os mecanismos de
ação deste composto sobre a germinação e o crescimento de plantas.
Esses resultados corroboram observações feitas por Ventura (2007), sobre o uso do
carvão ativado para germinação, crescimento e desenvolvimento de protocormos de
orquídeas. Segundo este autor existe correlação, em alguns casos, entre o tipo do meio de
cultura usado, a espécie da orquídea e a marca do carvão ativado.
O carvão ativado é usado no cultivo in vitro pelo seu eficiente escurecimento e
adsorção de substâncias nocivas do meio. Embora muitas espécies de plantas necessitem deste
suplemento, em orquídeas observa-se uma frequente necrose e subseqüente morte dos
protocormos durante a germinação e crescimento das plantas (PAN & STADEN, 1998;
VENTURA, 2007).
Observou-se que o meio de cultura “alternativo” composto por polpas de frutas
proporcionou uma baixa percentagem (5,13%) ou ausência de germinação quando
suplementado com carvão ativado (2 gL-1) ou na ausência deste, respectivamente, mostrandose inadequado para a germinação e formação de protocormos de E. alboxanthina (Tabela 2 e
Figura 9). Entretanto o interesse na adição desses aditivos no meio de cultura tem se tornado
crescente. Shu-Fung Lo et al. (2004), utilizando o meio de cultura MS suplementado com 8%
de banana, 8% de batata e 8% de água de coco no cultivo de Dendrobium tosaense JJSm &
Comber, obtiveram depois de 2 meses, melhor germinação e maior formação de protocormos
quando comparados aos meios de cultura MS básico, MS/2, KC e VW (VACIN & WENT,
1949). O uso de aditivos orgânicos (polpa de banana, tomate, água de coco, etc.) pode
proporcionar para algumas espécies, bons estímulos à germinação e crescimento, mas como
não há uma padronização da quantidade de sais contidos nestes aditivos, os meios de cultura
que levam estes suplementos podem ter uso restrito (STANCATO et al., 2008).
15 dias
Sem carvão
Com carvão
30 dias
Com carvão
Sem carvão
Alternativo
2,5 cm
Ágar
Knudson C
MS
MS/2
MS/4
Figura 5: Germinação das sementes de E. alboxanthina em diferentes meios de cultura na presença (2 gL-1) ou
na ausência de carvão ativado, após 15 e 30 dias da inoculação das sementes. UEFS, Feira de
Santana-Ba, 2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
Os resultados obtidos para a germinação de E. alboxanthina são inferiores àqueles
reportados para outras espécies de orquídeas, o que pode sinalizar que a espécie em estudo
necessite da simbiose com fungos micorrízicos durante a germinação. Estudos realizados por
Pereira et al. (2005) comparando a germinação assimbiótica in vitro de Oncidium flexuosum
Sims com a germinação in vitro na presença de dez isolados de fungos micorrízicos
mostraram que na ausência dos fungos não houve germinação e que 90% das sementes
inoculadas germinaram na presença de todos os isolados usados. Contudo, apenas um isolado
foi capaz de promover o desenvolvimento completo do protocormo.
Outros fatores podem ter contribuido para a ocorrência da baixa taxa de germinação.
Segundo observações realizadas por Pardo & Ferreira (2006), obter frutos com boa qualidade
fisiológica requer cuidados específicos, tais como: não coletar frutos muito verdes, evitar a
exposição das sementes à altas temperaturas ou colocá-las em sacos plásticos fechados após a
coleta. Estes mesmos autores reportam que o controle da temperatura e do teor de água nas
sementes podem interferir na conservação das sementes de várias espécies de orquídeas.
Neste estudo com E. alboxanthina não foi possível determinar o tempo em que as sementes
ficaram expostas às condições ambientais naturais, pois a abertura das fendas da cápsula
ocorreu antes da expedição de coleta. Aos 30 dias de armazenamento das sementes, na
temperatura de 5 ºC foram observadas sementes desprovidas de embrião ou contendo
embriões murchos, o que pode ter contribuído para a baixa taxa de germinação. Tais fatos
dificutam estabelecer certamente o período e condições de armazenamento necessários à
inviabilidade das sementes, o que sugere a necessidade de estudos sobre o tempo e condições
de armazenamento destas sementes a fim de determinar as condições necessárias para
estocagem e conservação das mesmas.
Por outro lado, ao comparar a germinação obtida neste experimento a que ocorre
normalmente em condição natural (1 a 3%) (SILVA, 2003) pode-se observar uma vantagem
do uso desta técnica para a geminação desta espécie. Levando-se em consideração que em
uma cápsula existam cerca de 1 milhão de sementes, a germinação de 26,55% delas implica
na formação de 265.500 plântulas, quantidade elevada de mudas.
4.2 CRESCIMENTO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
4.2.1 Efeito do meio de cultura e da esterilização sobre o crescimento in vitro de E.
alboxanthina
Observou-se efeito altamente significativo (p ≤ 0,01) da interação “meios de cultura x
tipo de esterilização” para todas as variáveis analisadas, exceto para matéria seca das raízes
(Tabela 3).
Tabela 3: Resumo da análise de variância para MAS- matéria seca da parte aérea (mg), MSR- matéria seca
das raízes (mg), NR- número de raízes, CF- comprimento da folha (mm), CR- comprimento das
raízes (mm) e CC- comprimento do caule (mm) de plantas de E. alboxanthina em função dos
diferentes tipos de meio de cultura submetidos à esterilização física ou química. UEFS, Feira de
Santana-Ba, 2009.
FV
Quadrados Médios
GL
MSA
MSR
NR
CF
CR
CC
Meio de Cultura (MC)
6
0,1404**
0,4208**
3,8679**
0,2212**
2,2757**
0,1249**
Esterilização (E)
1
0,9008**
0,0394 ns
0,2160 ns
0,0004 ns
0,3672ns
0,0435**
MC x E
6
0,1533**
0,0084 ns
0,4209**
0,0702**
0,2120**
0,0816**
Resíduo
126
0,0052
0,0195
0,0852
0,0016
0,0537
0,0009
30,26
76,28
42,17
18,81
57,64
13,93
CV (%)
** ,*, ns. Significativo ao nível de 1% de probabilidade, significativo ao nível de 5% de probabilidade, não
significativo pelo teste F, respectivamente.
Na tabela 4, observa-se que o meio de cultura WPM e o MS/4 promoveram as maiores
médias para todas as variáveis analisadas. Estes resultados estão de acordo com aqueles
observados por Araújo (2007) que também reportou um maior crescimento in vitro com o uso
do meio WPM no cultivo de Cattleya loddigesii Lindl. para todas as variáveis analisadas. Para
a variável matéria seca da parte aérea, o meio de cultura WPM não apresentou diferença
estatística dos meios MS/4 e MS/2, na esterilização química (Tabela 4).
Para o número de raízes, os meios de cultura MS, MS/2 e MS/4 não diferiram
estatisticamente do meio de cultura WPM quando realizou a esterilização física do meio de
cultura (Tabela 4). Foi verificado também que o número de raízes do meio MS, aumentou à
medida que a concentração de sais deste meio foi reduzida. Com estes resultados, pode-se
inferir que a concentração de macronutrientes reduzida em ¼ tem maior importância para a
emissão de raízes em E. alboxanthina do que os micronutrientes, já que o meio WPM em sua
formulação normal promoveu as maiores médias. Estes resultados diferem daqueles
abordados por Silva (2003) para o híbrido Bc. Pastoral x Lc. Amber Glow, que verificou o
aumento do número de raízes em relação proporcional ao aumento de vitaminas do meio MS.
Diferem também daqueles reportados por Muller et al. (2007) para Miltonia flavescens Lindl.,
que observou uma redução dos valores médios na emissão de raízes, na ausência dos sais do
MS.
Nas variáveis matéria seca das raízes (mg), comprimento folha (mm) e comprimento
da raiz (mm), observou-se que os meios WPM e MS/4 promoveram as maiores médias, não
diferindo estatisticamente entre se (Tabela 4). Já o comprimento do caule, além dos meios de
cultura citados anterioremente, o meio MS/2 também não apresentou diferença significativa.
Estes resultados corroboram aqueles reportados por Sorace et al. (2008), para Oncidium
baueri Lindl.. Estes autores verificaram que para o desenvolvimento vegetativo desta espécie,
o meio de cultura MS/2 foi o mais eficiente para o comprimento da parte aérea, número de
raízes, comprimento da maior raíz, massa fresca total e massa seca total da planta. Entretanto,
diferem daqueles encontrados por Muller et al. (2007), para Miltonia flavescens Lindl. em
que os autores verificaram uma redução dos valores médios para número de raízes,
comprimento da maior raíz, número de folhas, comprimento da parte aérea e peso da matéria
fresca, na ausência dos sais do meio MS. Diferem também daqueles verificados por Silva
(2003), para o híbrido Bc Pastoral x Lc Amber Glow em relação ao comprimento das raízes.
Este autor verificou que o meio MS influenciou de maneira positiva no crescimento das raízes
e que o meio KC, que contém menor proporção salina, promoveu efeito inibitório a emissão
destas.
Tabela 4 – Valores médios para matéria seca da parte aérea, matéria seca da raiz, número de raízes, comprimento da folha, comprimento das raízes e comprimento do caule de plantas
de E. alboxanthina em função de diferentes tipos de meio de cultura submetidas à esterilização física ou química com NaClO. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Meio de
cultura
Matéria seca da parte
aérea (mg)
Matéria seca da raiz
Número de raízes
(mg)
Comprimento da
folha (mm)
Comprimento da raiz
(mm)
Comprimento caule
(mm)
Física
Química
Física
Química
Física
Química
Física
Química
Física
Química
Física
Química
0,18 dzAy
0,00 bB
0,00 dA
0,00 cA
0,08 bA
0,00 cB
1,48 cA
0,00 dB
3,50 bA
0,00 cB
2,05 bA
0,00 cB
KC
0,14 dA
0,18 aA
0,15 cA
0,11 bA
0,32 bB
0,81 bA
1,92 bB
2,37 cA
1,53 cB
4,06 bA
2,23 bB
2,66 bA
MS
0,26 cA
0,21 aA
0,19 cA
0,14 bA
0,91 aA
0,90 bA
1,96 bB
2,96 bA
3,51 bA
2,72 cA
2,40 bB
2,79 bA
MS/Banana
0,31 cA
0,00 bB
0,07 dA
0,00 cB
0,28 bA
0,00 cB
1,51 cA
0,00 dB
1,16 cA
0,00 cB
2,33 bA
0,00 cB
MS/2
0,39 bA
0,23 aB
0,23 bA
0,16 bA
0,98 aA
1,02 aA
1,97 bB
3,06 bA
3,94 bB
4,94 bA
2,52 aB
3,08 aA
MS/4
0,43 bA
0,23 aB
0,35 aA
0,35 aA
0,98 Ab
1,18 aA
2,98 aB
3,48 aA
6,78 aB
9,89 aA
2,61 aB
2,95 aA
WPM
0,50 aA
0,24 aB
0,38 aA
0,39 aA
0,99 aB
1,19 aA
3,33 aB
3,53 aA
7,28 aB
10,12 aA
2,78 aB
2,97 aA
Alternativo
z
– Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
y
– Médias seguidas pela mesma letra maiúscula em cada linha, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Os meios de cultura suplementados com frutas (alternativo e MS/banana),
promoveram as menores médias em todas as variáveis analisadas seguidos pelo meio KC
(Tabela 4). Segundo Stancato et al. (2008), os meios de cultura KC e VW possuem baixas
concentrações de macro e micronutrientes principalmente quando comparados ao meio MS e
WPM. Teoricamente, segundo os mesmos autores, esta baixa concentração de sais é exigido
pelas espécies de orquídeas já que estas vivem em ambientes com baixa disponibilidade de
nutrientes. No entanto,
os resultados encontrados neste estudo com E. alboxanthina
mostraram que o meio KC não foi eficiente para o desenvolvimento in vitro desta espécie
(Tabela 4). Todavia, esses resultados discordam daqueles encontrados por Figueiredo et al.
(2008), para híbridos de orquídeas que obtiveram os melhores resultados de crescimento nos
meios de cultura KC na formulação tradicional e KC acrescidos com os suplementos
(vitaminas, glicina e mio-inositol). Araújo (2004), também reportou os melhores resultados
com o uso do meio de cultura KC. Este autor observou que a quantidade de raízes foi
proporcional ao aumento de sais no meio KC até alcançar 96,5% da concentração salina
original deste meio.
Observações sobre aditivos orgânicos foram realizadas por Stancato et al. (2008).
Segundo estes autores, os suplementos orgânicos não possuem uma concentração padronizada
de sais podendo haver a escassez de substâncias importantes ao desenvolvimento da planta. A
presença de possíveis substâncias derivadas dos produtos químicos usadas no cultivo das
frutas podem, também, ocasionar uma inibição no crescimento, ou, até mesmo subsequente
morte dos explantes. Neste caso, os resultados obtidos neste estudo com E. alboxanthina
corroboram observações reportadas por Stancato et al. (2008), já que para todas as variáveis
analisadas, os meios de cultura suplementados com polpas de fruta promoveram as médias
mais baixas de crescimento (Tabela 4). Estes resultados diferem daqueles reportados ainda
pelos mesmos autores para as espécies Laelia longipes Rchb.f., Laelia tenebrosa Rolfe e
Miltonia spectabilis Lindl., onde verificaram que os meios de cultura formulados com 1 gL-1
de adubo N:P:K (10:10:10 e 10:30:20) e meios compostos com polpa de tomate, maçã e
banana (10; 10; 50 gL-1), foram os que proporcionaram maior crescimento in vitro para as
três espécies avaliadas quando comparadas ao meio de cultura MS.
Em relação a esterilização, observou-se uma influência direta deste fator de variação
sobre o desenvolvimento das plantas de E. alboxanthina (Tabela 4). Apenas para a variável
matéria seca das raízes (mg), a esterilização física não diferiu estatisticamente da esterilização
química para todos os meios de cultura testados, exceto para o meio de cultura MS/banana,
para qual a esterilização química não foi eficaz em relação a esterilização física (Tabela 4).
Para os meios de cultura “alternativo” e “MS/Banana” a esterilização química não foi eficaz
para nenhuma das variáveis analisadas, ocasionando a proliferação de fungos e a perda de
todos os frascos de cultura que foram submetidos a este tipo de esterilização, o que explica as
médias “0” apresentadas na Tabela 4. Podemos inferir que a contaminação tenha sido
ocasionada pelos microorganismos presentes em grande quantidade nas polpas de frutas
usadas como suplementos no meio de cultura, e que, a esterilização química na concentração
de 5% de cloro ativo utilizado não foi eficiente. Em estudos realizados por Nascimento et al.
(2006), foram observados 100% de contaminação por fungos e leveduras quando se avaliou as
condições higiênico-sanitárias das polpas de frutas comercializadas. De acordo com os
mesmos autores, a contaminação por bactérias, fungos e leveduras ocorrem principalmente
durante o cultivo, colheita, manipulação, processamento, distribuição e armazenamento dos
produtos.
Os resultados obtidos neste experimento com E. alboxanthina em relação à
esterilização química diferem daqueles reportados por Ribeiro (2006), para as espécies
Ananas comosus Mill. e Sequóia sempreviren Endl.. Este autor observou que é possível obter
a esterilização do meio de cultura em baixas concentrações de NaOCl (3 à 5%) quando
combinada a fusão do meio gelificante no microondas. Além disso, ele observou que a
presença de 3 a 5% de cloro ativo no meio de cultura estimulou a formação de brotações, o
aumento de biomassa fresca e a maior formação de ramos. Neste estudo com E. alboxanthina,
a utilização de NaOCl à 5% não foi favorável apenas para a variável matéria seca da parte
aérea (mg) para todos os meios de cultura testados, exceto para os meios KC e MS no qual a
esterilização química não apresentou diferenças estatísticas da esterilização física (Tabela 4).
No entanto, com o uso da esterilização química (NaClO à 5%) foi observado uma possível
sensibilidade das raízes quando comparado à raízes de plantas cultivadas em meio submetido
a esterilização física (Figura 6).
Figura 6:
9,5 cm
AA
9,5 cm
BB
Plantas de E. alboxanthina com seis meses de idade, cultivadas em meio submetido à esterilização
química (A) ou física (B). UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
Embora a autoclavagem seja um método dispendioso, devido ao elevado consumo de
energia, é a técnica de esterilização mais usada na maioria dos trabalhos com cultura de
tecidos vegetais. No entanto, opções como a esterilização química com hipoclorito de sódio,
dentre outras, podem ser boas opções em substituição à esterilização física, sendo
recomendado uma avaliação prévia da concentração e sensibilidade da planta, bem como, a
composição do meio de cultura a fim de evitar a formação de compostos halogenados,
subsequente morte dos explantes ou contaminação do meio de cultura utilizado.
Ribeiro (2006) relata que o NaOCl é amplamente utilizado por apresentar vasto
espectro de atividade biocida contra bactérias, fungos e vírus, além de ser um produto
relativamente barato. No entanto, é importante conhecer o seu comportamento quando
utilizado na esterilização de meios de cultura. Ainda segundo esse autor, uma das grandes
preocupações decorrentes da utilização do NaOCl durante a esterilização, é a quantidade de
formação de compostos orgânicos halogenados resultantes de seu uso, no qual vai depender
tanto da concentração de NaOCl usada, quanto da quantidade de compostos orgânicos
presentes no meio em que o NaOCl será aplicado.
4.2.2 Efeito de diferentes fontes de carbono no crescimento in vitro de E. alboxanthina
Observou-se efeito altamente significativo (p ≤ 0,01) para as fontes de carbono
utilizadas sobre as variáveis matéria seca da raiz, número de raízes e comprimento das raízes,
e um efeito significativo (p ≤ 0,05) para matéria seca da parte aérea (Tabela 5).
Em relação a concentração da fonte de carbono usada, observou-se efeito altamente
significativo (p ≤ 0,01) apenas para a variável comprimento da raiz, e efeito significativo (p
≤ 0,05) para a variável matéria seca da parte aérea (Tabela 5). A interação fontes de carbono x
concentação de carbono não foi significativo para todas as variáveis analisadas.
Tabela 5: Resumo da análise de variância para MAS- matéria seca da parte aérea (mg), MSR- matéria seca das
raízes (mg), NR- número de raízes, CPA- comprimento da parte aérea (mm), CR- comprimento das
raízes (mm) de plantas de E. alboxanthina, em função de diferentes fontes de carbono em duas
concentrações 43,82 e 87,64 mM. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
FV
GL
Quadrados Médios
MSA
MSR
NR
CPA
CR
Fontes
de
Carbono (FC)
5
175,04*
128,57**
2,40**
0,09ns
1,33**
Concentração de
carbono (CC)
1
399,90*
55,71ns
1,44ns
0,04ns
1,72**
FC x CC
5
51,75ns
8,04ns
0,11ns
0,01ns
0,31ns
Resíduo
48
64,57
17,73
0,44
0,04
0,14
63,89
35,32
22,63
0,44
22,63
CV (%)
ns
** ,*, . Significativo ao nível de 1% de probabilidade, significativo ao nível de 5% de probabilidade, não
significativo pelo teste F, respectivamente.
Na tabela 6, verifica-se que para todas as variáveis analisadas a sacarose promoveu as
maiores médias de crescimento, tanto na menor (43,82 mM) quanto na maior concentração
(87,64 mM). No entanto, apenas para a variável “comprimento da raiz”, as médias obtidas
com a sacarose, na menor concentração testada (43,82 mM), diferiram estatisticamente de
todas as outras fontes de carbono utilizadas. Já na maior concentração de carbono testada
(87,64 mM), apenas para a variável “comprimento da parte aérea” a sacarose não diferiu
estatisticamente das outras fontes de carbono utilizadas. Observou-se também que o aumento
da concentração de sacarose no meio de cultura foi proporcional ao aumento das médias nas
variáveis “matéria seca da parte aérea” e “comprimento da raiz”. Estes resultados diferem
daqueles encontrados por Fráguas et al. (2003) para híbridos de Cattleya labiata Lindl. x
Laelia itambana Pabst., onde verificou-se que o uso de 58,43 mM de sacarose favoreceu um
aumento das médias para o comprimento da parte aérea, número de raízes, e peso da matéria
fresca das plantas.
A maioria dos trabalhos com orquídeas utilizam a comprimento da parte aérea, o
comprimento da maior raiz, o número de raízes e a massa fresca da planta para verificar o
efeito da sacarose no cultivo in vitro. Entretanto, neste estudo com E. alboxanthina foram
avaliados outras variáveis para tornar mais evidente a ação da sacarose durante o crescimento
da planta. Em relação a matéria seca da parte aérea (mg) não foram observadas diferenças
significativas entre os diferentes tipos de fontes de carbono na concentração de 43,82 mM.
Para a maior concentração testada (87,64 mM) a sacarose, a maltose e a glicose promoveram
maior incorporação de matéria seca da parte aérea com as médias 22,58, 21,40 e 17,46 mg
respectivamente (Tabela 6).
Para a variável matéria seca da raiz as médias das diferentes fontes de carbono testadas
para a menor concentração usada (43,82 mM) não apresentaram diferenças significativas. Já
para a maior concentração testada (87,64 mM), a sacarose promoveu a maior média (20,66
mg) não diferindo estatisticamente de todas as outras fontes de carbono utilizadas (Tabela 6).
As médias do número de raízes emitidas de E. alboxanthina não foram
significativamente diferentes em relação à menor concentração usada (43,82 mM) para todas
as fontes de carbono testadas. No entanto, para a maior concentração testada (87,64 mM) a
sacarose (3,95 raízes/planta), a maltose (3,42 raízes/planta) e o açúcar comum (3,22
raízes/planta) promoveram as maiores médias, não apresentando diferenças significativas
entre si (Tabela 6). Resultados superiores aos encontrados neste estudo com E. alboxanthina
foram reportados por Moreira et al. (2007), para híbridos de Laelia purpurata Lindl. var
venosa x Cattleya warneri T. Moore alba, os quais observaram que a maior emissão de raízes
(5,75 raízes/planta) ocorreu com o uso de 58,43 mM de sacarose. Observações feitas por Faria
et al. (2004), para Dendrobium nobile Lindl. diferem dos resultados encontrados neste estudo
com E. alboxanthina para o número de raízes. Estes autores reportam que o acréscimo de
sacarose no meio não influenciou o enraizamento in vitro das plantas.
Tabela 6 – Valores médios para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, número de raízes, e comprimento da parte aérea e comprimento das raízes de plantas de
E. alboxanthina em função de diferentes concentrações e fontes de carbono. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Fontes de
Carbono
Matéria seca da parte
aérea (mg)
Matéria seca das raízes
Número de raízes
(mg)
Comprimento parte
Comprimento raiz (mm)
aérea (mm)
43,82 mM
87,64 mM
43,82 mM
87,64 mM
43,82 mM
87,64 mM
43,82 mM
87,64 mM
43,82 mM
87,64 mM
Sacarose
13,84 a zBy
22,58 aA
16,26 aA
20,66 aA
3,62 aA
3,95 aA
11,86 aA
11,82 aA
20,56 aB
24,96 aA
Sorbitol
9,16 aB
9,66 bA
10,06 aA
10,90 bA
2,57 aA
2,60 bA
9,74 aA
9,18 aA
15,22 bB
14,06 bA
Açúcar
comum
10,44 aB
10,02 bA
8,12 aA
12,14 bA
2,65 aA
3,22 aA
9,48 aA
8,92 aA
12,28 bB
13,46 bA
Glicose
7,84 aB
17,46 aA
11,54 aA
11,88 bA
2,75 aA
2,85 bA
11,40 aA
10,02 aA
13,72 bB
18,08 bA
Manitol
6,08 aB
9,84 bA
7,60 aA
8,38 bA
2,95 aA
2,60 bA
10,94 aA
10,32 aA
12,38 bB
16,04 bA
Maltose
12,62 aB
21,40 aA
12,18 aA
13,36 bA
3,62 aA
3,42 aA
11,02 aA
11,02 aA
15,56 bB
23,48 aA
z
– Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
y
– Médias seguidas pela mesma letra maiúscula em cada linha, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Rego-Oliveira et al. (2003), em estudos comparativos com fontes de carbono na
espécie Oncidium varicosum Lindl., também reportaram resultados superiores aos
encontrados neste estudo com E. alboxanthina para o número de raízes. Estes autores
obtiveram as melhores médias com o uso de 175,28 mM de sacarose (9,10 raízes/planta) e
com 63,16 mM e 94,74 mM de maltose (9,70 raízes/planta e 11,19 raízes/planta,
respectivamente).
Em relação ao comprimento da parte aérea de E. alboxanthina, as maiores médias
(11,86 e 11,82 mm) foram obtidas com 43,82 e 87,64 mM de sacarose, respectivamente, não
sendo estatisticamente diferentes em relação as duas concentrações (43,82 e 87,64 mM) e
diferentes fontes de carbono testadas (Tabela 6). Esses resultados foram inferiores aqueles
reportados por Rego-Oliveira et al. (2003) com Oncidium varicosum Lindl. que as maiores
médias para o comprimento da parte aérea (6,99 cm) com o uso de 175,28 mM de sacarose.
Os resultados encontrados para o crescimento da parte aérea de E. alboxanthina
corroboram os resultados verificados por Faria et al. (2004), os quais observaram que o
crescimento da parte aérea foi proporcional ao aumento da concentração de sacarose no meio
de cultura obtendo o valor de 4,21 ± 0,9 cm com o uso de 175,28 mM de sacarose, quando
avaliaram seis concentrações (0; 14,56; 29,11; 58,43; 87,64 e 175,28 mM). No presente
estudo, os resultados para crescimento da parte aérea foram inferiores aos reportados por
Sorace et al. (2008), para Oncidium baueri Lindl. que observaram que a concentração de
116,85 mM de sacarose foi a mais eficiente para o comprimento da parte aérea atingindo em
média 4,95 cm, enquanto que, com o uso da maior concentração de sacarose (175,28 mM)
ocorreu o menor crescimento da parte aérea (2,94 cm).
Em relação ao comprimento das raízes de E. alboxanthina, para a menor concentração
da fonte de carbono usada (43,82 mM), a maior média observada (20,56 mm), foi obtida com
o uso da sacarose, enquanto que na maior concentração proposta (87,64 mM), além da
sacarose (24,96 mm), a maltose (23,48 mm) promoveu a segunda maior média (Tabela 6).
Moreira et al. (2007), em estudos com híbridos de Laelia purpurata Lindl. var venosa x
Cattleya warneri T. Moore alba, encontraram resultados inferiores aos obtidos no presente
estudo, onde observaram um maior comprimento da raiz (1,51 cm), foi obtido com o uso de
58,43 mM de sacarose quando avaliados a sacarose e frutose em diferentes concentrações
(29,21; 43,82; 58,43; 73,03 mM e 5,26; 10,52; 13,15 mM), respectivamente. Rego-Oliveira et
al. (2003), também reportaram resultados superiores para Oncidium varicosum Lindl.
Segundo os autores as maiores médias observadas para o comprimento das raízes (6,56 cm),
foram obtidos com o uso de 175,28 mM de sacarose.
De modo geral as médias observadas para a sacarose nas duas concentrações não
foram significativamente diferentes quando comparadas à maltose, exceto para a matéria seca
da raiz na maior concentração (87,64 mM) e para o comprimento da raiz na concentração de
43,82 mM, para as quais a sacarose proporcionou um melhor desempenho do que a maltose
(Tabela 6).
4.2.3 Efeito do carvão ativado no crescimento in vitro de E. alboxanthina
A presença do carvão ativado interferiu de forma altamente significativa (p ≤ 0,01) nas
variáveis números de raízes e comprimento da parte aérea (mm). Já para as variáveis matéria
seca da parte aérea (mg), matéria seca das raízes (mg) e o comprimento das raízes (mm) não
foram influenciadas pela presença de carvão ativado (Tabela 7).
Tabela 7: Resumo da análise de variância para MAS- matéria seca da parte aérea (mg), MSR- matéria seca
das raízes (mg), NR- número de raízes, CPA- comprimento da parte aérea (mm), e CRcomprimento das raízes (mm) de plantas de E. alboxanthina, em função das concentrações de
carvão ativado (0 e 2gL-1) no meio de cultura. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
FV
GL
Quadrados Médios
MSA
MSR
NR
CPA
CR
Carvão ativado
1
0,36ns
3,69ns
1,29**
0,75**
0,45 ns
Resíduo
38
0,34
1,59
0,12
0,09
0,12
31,19
32,75
18,79
32,24
15,91
CV (%)
ns
** ,*, . Significativo ao nível de 1% de probabilidade, significativo ao nível de 5% de probabilidade, não
significativo pelo teste F, respectivamente.
Em relação a matéria seca da parte aérea, na presença do carvão ativado (2 gL-1), foi
verificado uma média (1,77 mg), 0,19 mg à menos que o peso obtido para plantas que foram
cultivadas em meio na ausência do carvão ativado (1,96 mg). No entanto, as médias não
foram estatisticamente diferentes entre se (Tabela 8). Para a matéria seca da raiz de E.
alboxanthina, verificou-se maior valor (4,16 mg) na ausência do carvão ativado. Todavia não
diferente estatisticamente do valor observado na presença do carvão ativado (3,55 mg)
(Tabela 8).
Em relação ao número de raízes formadas, a presença do carvão ativado na
concentração de 2 gL-1, reduziu a emissão à 1,68 raízes/planta, valor significativamente
inferior aquele obtido em meio de cultura sem a adição de carvão ativado (2,04 raízes/planta)
(Tabela 8). Esses resultados estão de acordo com aqueles encontrados por Ventura (2007),
para Cattleya amethystoglossa Lindl. & Rchb.f. onde verificaram que a maior emissão de
raízes (2,5 raízes/planta) foi obtida no meio sem carvão ativado quando comparado ao uso do
carvão ativado nas concentrações de 1; 2; 3; e 4 gL-1. Corroboram também com os resultados
obtidos por Muller et al. (2007), para a espécie Miltonia flavescens Lindl., em que segundo os
autores, o carvão ativado não influênciou
na emissão de raízes em qualquer uma das
concentrações testadas. Entretanto, Araújo (2004), trabalhando com Laelia tenebrosa Rolf.
verificou que a emissão de raízes foi proporcional ao aumento da concentração de carvão
ativado (0; 1; 2; 3 e 4 gL-1), o que não foi evidenciado nos resultados aqui obtidos referentes a
E. alboxanthina, no qual a ausência do carvão propiciou maior emissão de raízes por planta.
Para o comprimento da parte aérea, na presença do carvão ativado (2 gL-1) verificou-se
uma média de 8,02 mm, enquanto que na ausência do carvão ativado foi observado valor
significativamente superior de 10,76 mm para esta variável (Tabela 8). Esses resultados
condizem com aqueles encontrados por Ventura (2007), para Cattleya amethystoglossa Lindl.
& Rchb.f. que reportou um maior comprimento da parte aérea (7,8 mm) no meio sem carvão
ativado. Muller et al. (2007), trabalhando com Miltonia flavescens Lindl. verificaram que o
uso de carvão ativado em qualquer uma das concentrações usadas (1,5 ou 3,0 gL-1), não
influênciou no comprimento da parte aérea. Entretanto, os resultados aqui reportados
referentes a E. alboxanthina demonstram que a ação do carvão ativado não é positiva quanto
ao comprimento da parte aérea.
Tabela 8 – Valores médios para matéria seca da parte aérea, matéria seca das raízes, número de raízes,
comprimento da parte aérea, comprimento das raízes de plantas de E. alboxanthina em função da
presença de carvão ativado na concentração de 2 gL-1. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Carvão (gL-1)
Matéria seca da
parte aérea
(mg)
Matéria
seca das
raízes (mg)
Número de
raízes
Comprimento
parte aérea
(mm)
Comprimento
raiz (mm)
0,0
1,96 a z
4,16 a
2,04 a
10,76 a
22,88 a
2,0
1,77 a
3,55 a
1,68 b
8,02 b
20,74 a
z
– Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de
probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Com relação ao comprimento das raízes de E. alboxanthina não foi observado
diferença entre os tratamentos com ou sem carvão ativado (Tabela 8). Estes resultados estão
de acordo com aqueles obtidos por Muller et al. (2007), para a espécie Miltonia flavescens
Lindl. em que verificaram que o carvão ativado na concentração de 1,5 ou 3,0 gL-1 não
influênciou no comprimento das raízes. Entretanto, os resultados obtidos discordam das
observações feitas por Araújo (2004), para Laelia tenebrosa Rolf. no qual reportaram um
efeito estimulante do carvão ativado sob o comprimento das raízes com a utilização de
concentrações superiores a 4 gL-1. No mesmo contexto Ventura (2007), trabalhando com
Cattleya amethystoglossa Lindl. & Rchb.f. observou uma redução do crescimento das raízes
proporcionalmente a adição de carvão ativado no meio de cultura.
Diante dos resultados infere-se que concentrações de carvão ativado menores que 2
-1
gL
podem ser testadas na tentativa de obter-se melhores respostas pela espécie E.
alboxanthina, já que na concentração de carvão usada a espécie não teve desenvolvimento
vegetativo satisfatório.
4.3 MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE E. ALBOXANTHINA
4.3.1 Efeito de diferentes concentrações de BAP e ANA na micropropagação de E.
alboxanthina
Observou-se efeito altamente significativo (p ≤ 0,01) para a interação “ BAP x ANA”
nas variáveis NB- números de brotos e EFB- explantes que formaram brotos (%) e para a
variável CMB- comprimento médio dos brotos (mm) foi observado efeito isolado altamente
significativo (p ≤ 0,01) do BAP (Tabela 9).
Tabela 9: Resumo da análise de variância para NB- número de brotos, CMB- comprimento médio dos brotos
(mm), e EFB- explantes que formaram brotos (%) de E. alboxanthina em função de diferentes
concentrações de BAP e ANA. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
FV
GL
Quadrados Médios
NB
AMB
z
EFB
y
BAP
4
4,95**
0,10**
24,99**
ANA
3
1,62**
0,01ns
8,39*
BAP x ANA
12
3,06**
0,0 ns
15,40**
Resíduo
80
0,30
0,01
2,35
29,13
9,07
39,52
CV (%)
z
Dados transformados em (x+1)0,5 . y Médias transformadas em arco seno.
** ,*, ns. Significativo ao nível de 1% de probabilidade, significativo ao nível de 5% de probabilidade, não
significativo pelo teste F, respectivamente.
A maior regeneração de brotos pela espécie E. alboxanthina foi observada no
tratamento 17,60 µM de BAP combinado com 0,2685 µM de ANA (3,44 brotos/planta)
(Figuras 7 e 8). Os resultados obtidos neste experimento estão de acordo com os reportados
por Araújo (2004), para o híbrido Bc Pastoral x Lc Amber Glow, que verificou a produção de
3,4 brotos/planta utilizando a concentração de 17,60 µM de BAP.
Número de brotos
y= ns
Figura 7:
NB- Números de brotos obtidos a partir de plantas de E. alboxanthina, inoculados em meio de
cultura WPM suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA.
b
1
a
b
a
Figura 8:
2
c
Aspecto da multiplicação in vitro e da comprimento dos brotos de E. alboxanthina formados a partir
de plântulas germinadas in vitro com 12 meses de idade. (1) Brotos oriundos do meio WPM com
17,60 µM de BAP com 0,2685 µM de ANA com comprimento de 0,2 mm (1-a) e 0,3 mm (1-b).
(2) Brotação induzida com o uso de 17,60 µM de BAP na ausência de ANA com comprimento de
0,1 mm (2-a); 0,2 mm (2-b) e 0,4 mm (2-c). UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009. Fonte: o autor.
Na ausência de BAP verificou-se menor produção de brotos em todas as concentrações
de ANA testadas. Resultados diferentes foram reportados para outras espécies de orquídeas,
como o híbrido Bc Pastoral x Lc Amber Glow (SILVA, 2003) e Phaleanopsis amabilis (L.)
(SAIURY, 2006), quando foram verificados a maior produção de brotos com o uso de 0,537 e
26,85 µM de ANA, respectivamente, na ausência de BAP. No entanto, estes autores
verificaram que com o aumento das concentrações de ANA houve um decréscimo na
produção de brotos.
A análise de regressão mostrou que na presença de 0,2685 µM de ANA existe uma
tendência ao aumento no número de brotos formados com a utilização de concentrações de
BAP maiores que 17,60 µM. Observou-se também que quanto menor a concentração de ANA
e maior a concentração de BAP, maior a produção de brotos (Figuras 7 e 8).
O balanço entre as citocininas e auxinas são importantes para desencadear processos
organogênicos em diversas espécies (COSTA, 2009). As citocininas são utilizadas para
quebrar a dominância apical aumentando assim a taxa de multiplicação através do
crescimento de meristemas laterais, enquanto as auxinas, apesar de não promoverem a
proliferação de brotos laterais, podem incrementar o crescimento da cultura (ERIG et al.,
2002). Segundo estes autores uma das possíveis ações da auxina no meio de multiplicação
seria a anulação do efeito supressivo das altas concentrações de citocinina sobre a elongação
das brotações axilares, restaurando o crescimento normal das mesmas.
Em relação ao comprimento médio dos brotos de E. alboxanthina, os dados ajustaramse ao modelo matemático linear, apresentando a maior comprimento (1,26 mm), quando
utilizou-se 17,60 µM de BAP no meio de cultura WPM na ausência de ANA. Já a menor
média alcançada (1,08 mm) ocorreu na concentração de 2,2 µM de BAP sem a presença de
ANA (Figuras 8 e 9). Estes resultados são inferiores aos reportados por Araújo (2004) que
trabalhou com
o híbrido Bc Pastoral x Lc Amber Glow, quando verificou o maior
comprimento médio (4,7 cm) quando se utilizou 17,60 µM de BAP na ausência de ANA.
Assim pode-se sugerir que nas concentrações mais baixas de BAP a diferenciação e
morfogênese da parte aérea é pouco induzida.
Comprimento médio dos brotos (mm)
1,30
1,25
1,20
1,15
1,10
1,05
0
5
10
BAP (µM)
15
20
ANA (0,0 µM) y = 0,0099x + 1,0768 R2 = 91,18% **
Figura 9: Comprimento médio dos brotos (mm) obtidos a partir de plantas de E. alboxanthina, inoculados em
meio de cultura WPM suplementado com diferentes concentrações de BAP. UEFS, Feira de
Santana-Ba, 2009.
Observações realizadas por George (1993), reportam que existe uma relação entre o
número e comprimento dos brotos, e quanto maior for o número de brotos menor será o
comprimento dos mesmos. No entanto, os resultados com E. alboxanthina indeicam que a
comprimento dos brotos é diretamente proporcional ao aumento da concentração de BAP e
que, provavelmente, este crescimento pode continuar com concentrações mais elevadas de
BAP na ausência de ANA já que a linha de tendência mostra-se crescente (Figura 9).
Os resultados encontrados para a comprimento médio dos brotos corroboram
observações feitas por Grattapaglia & Machado (1998), sobre a influência direta das
citocininas no crescimento da planta. No entanto, eles relatam também que um balanço
hormonal poderia produzir uma melhor resposta para o crescimento de plantas, o que não foi
observado neste trabalho para E. alboxanthina.
Torres et al. (1998), relatam que o uso de citocininas estimula o crescimento da parte
aérea, porém o contrário é obtido com a utilização de concentrações mais elevadas. Outros
autores citam que o aumento da concentração de citocininas no meio de cultura pode levar a
diminuição do comprimento dos brotos (GRATTAPLAGIA & MACHADO, 1998; ERIG et
al., 2002; NICIOLI et al., 2008; PASQUAL, 2008).
De acordo com Peres et al. (1997), existem níveis endógenos de citocininas nos
tecidos vegetais e este fato dificulta o estabelecimento de dosagens “ótimas” para crescimento
das plantas cultivadas in vitro, pois estes níveis endógenos não podem ser mensurados durante
a inserção de reguladores vegetais exógenos no meio de cultura.
Com relação ao percentual de explantes que formaram brotos, a análise de regressão
mostra tendência quadrática crescente em função das concentrações de BAP utilizadas,na
presença de 0,26 µM de ANA . Todavia, na presença de 0,53 µM de ANA, observou-se
tendência quadrática decrescente em função das concentrações de BAP utilizadas (Figura 10).
Esses resultados diferem aos reportados por Janarthanam & Seshadri (2008) para Vanilla
planifolia Andr., no qual observaram que o uso de 13,32 µM de BAP combinado com 13,43
µM de ANA levaram 70% dos explantes a formarem brotos.
Os resultados aqui encontrados para porcentagem de explantes que formaram brotos
são diferentes daqueles reportados para Miltonia flavescens Lindl. por Stefanello et al. (2009),
que observaram que 47,94% dos explantes formaram protocormos com o uso de 13,59 µM de
2,4-D e 4,44 µM de BAP após 360 dias. Já Zhao et al. (2008), reportaram resultados
superiores para Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. em relação aos encontrados neste
estudo, quando verificaram que 82% dos explantes de folhas formaram brotos quando se usou
a concentração de 8,8 µM de BAP.
Vários fatores podem influenciar a multiplicação de plantas, tais como, a idade, o tipo
e o tamanho do explante usado, podem ter influência direta sob a capacidade organogênica
das plantas (SOUZA et al., 2006). Neste experimento com E. alboxanthina utilizou-se como
explante plantas com 12 meses de idade, sendo assim, dois fatores podem ser levados em
consideração quanto a capacidade organogênica: a idade e o tipo do explante usado. No
entanto, apesar da possível influência de diversos fatores sob a capacidade organogênica
destes, ao analisar-se as figuras 7, 9 e 10, infere-se que concentrações de BAP mais elevadas
que 17,60 µM combinadas com 0,26 µM de ANA, podem resultar em maiores taxas de
multiplicação para esta espécie.
60,00
Explantes responsivos (%)
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0
2
-10,00
4
6
8
10
12
14
16
18
20
BAP (µM)
ANA (0,0 µm)
ANA (0,2685 µM)
ANA (0,537 µM)
y = 0,1911x2 - 0,9476x + 5,8923
y = -0,34x2 + 7,0803x - 1,0738
R² = 97,42 % **
R² = 70,16 % **
ANA (1,074 µM)
Figura 10: Percentagem de explantes que formaram brotos de E. alboxanthina, inoculados em meio de cultura
WPM suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA (µM).
Observou-se um escurecimento do meio de cultura quando este foi suplementado com
concentrações de BAP superiores a 4,4 µM, independente da presença de ANA. No entanto,
visivelmente, este escurecimento parece não ter afetado a produção de brotos e o índice de
sobrevivência (Figura 11). Também verificou-se necrose nos tecidos do explante, como
geralmente ocorre em cultura com oxidação.
A
B
C
Figura 11:Plantas de E. alboxanthina com 12 meses de idade. Aspecto do meio de cultura durante a
multiplicação. Meio sem oxidação (A); meio com oxidação (B e C). UEFS, Feira de Santana-Ba,
2009. Barra: 10 mm. Fonte: o autor.
Minamiguchi & Machado Neto (2007), trabalhando com Phalaenopsis, observaram
que em concentrações de 8,88 µM de BAP combinadas com zero, 0,1 e 0,2mg L-1 de ANA, a
taxa de fenolização de explantes foi alta e que na concentração de 4,44 µM de BAP na
ausência de ANA foi registrada a menor taxa de fenolização. Esses mesmos autores relatam
que o maior índice de sobrevivência das plantas ocorreu com 4,44 µM de BAP justamente
quando foi observada a menor taxa de fenolização, o que permitiu inferir que a ocorrência da
liberação de fenóis prejudicou a sobrevivência dos explantes. Além disso, eles relatam que os
reguladores vegetais em doses elevadas podem induzir a toxidez, como ocorreu no estudo
com Phalaenopsis, em que apesar dos brotos serem formados, a necrose nos tecidos do
explante decorridas da fenolização causou subsequente morte dos mesmos.
Tendo em vista os resultados obtidos neste experimento, pode-se inferir que a
concentração de 17,76 µM de BAP tanto na ausência quando combinado com 0,2685 µM de
ANA podem ser usados na multiplicação in vitro de plantas de E. alboxanthina. No entanto, é
importante evidenciar que o aumento da concentração de BAP para maior produção de brotos
deve estar associada a concentração de 0,2685 µM de ANA, já que a linha de tendência para
estas concentrações é crescente e o valor do R2 revela uma correlação de quase 100% entre os
valores estimados e os dados reais (Figura 7).
4.3.2 Efeito de diferentes tipos de explantes na multiplicação in vitro de E. alboxanthina
Observou-se efeito altamente significativo (p ≤ 0,01) para a interação “explante x
combinação de BAP e ANA” para todas as variáveis analisadas (Tabela 10).
Tabela 10: Resumo da análise de variância para NB- número de brotos, CMB- comprimento médio dos
brotos (mm), MSB- matéria seca dos brotos (mg) e EFB- explantes que formam brotos (%) de E.
alboxanthina em função dos tipos de explantes. UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
FV
Quadrados Médios z
GL
NB
CMB
MSB
EFB
Explante (E)
2
1,55**
0,25**
25,36**
94,66**
Combinação BAP e ANA (C)
3
0,23**
0,01*
4,58**
6,65**
ExC
6
0,23**
0,01**
4,58**
6,65**
Resíduo
48
0,00
0,00
0,09
0,42
6,89
4,93
18,91
29,00
CV (%)
z
Dados transformados em (x+1)0,5 n.s.
** ,*, ns. Significativo ao nível de 1% de probabilidade, significativo ao nível de 5% de probabilidade, não
significativo pelo teste F, respectivamente.
A base caulinar foi o único explante que promoveu capacidade organogênica para a
formação de brotos nas três combinações de BAP x ANA pré-estabelecidas. Os outros
explantes usados (planta, protocormo e folha) não apresentaram capacidade organogênica
após 90 dias em nenhuma das condições de cultura testadas, indicando que a utilização desses
explantes são inviáveis para a multiplicação desta espécie nessas condições (Tabela 11).
Para o número de brotos obtidos através da base caulinar, a maior média observada
(1,92 brotos) foi quando utilizou-se a combinação de 17,60 µM de BAP com 0,0 µM de
ANA, mas este valor não diferiu significativamente da combinação de 8,8 µM de BAP com
0,573 µM de ANA (1,87 brotos) (Tabela11). Resultados diferentes foram verificados para
outras espécies de orquídeas, como para híbridos de Cattleya mesquitae LC. Menezes,
(RAMOS & CARNEIRO, 2007), e Coelogyne stricta (D. Don) Schltr. (BASKER & BAI,
2006), na multiplicação pela base caulinar, no qual reportaram a maior produção de brotos
(4,3 brotos/planta), com o uso de 2,22 µM de BAP na ausência de ANA e 6,4 brotos/planta
com o uso de 5,37 µM de ANA combinado com 8,88 µM de BAP, respectivamente. Em
estudos com hastes florais de Phalaenopsis, Kosir et al. (2004), verificaram que o uso da
concentração de 8,88 µM de BAP combinado com 2,68 µM de ANA, produziram a maior
brotação (8,35 brotos/planta), quando comparadas ao uso das concentrações 19,58 µM de
BAP com 5,37 µM de ANA e 8,88 µM de BAP na ausência de ANA.
Diferentes efeitos de reguladores vegetais podem ocorrer entre as espécies, inclusive
para os cultivares dentro da mesma espécie (GIATTI & LIMA, 2007). Estes mesmos autores
obtiveram resultados diferentes aos reportados neste estudo, quando verificaram a produção
de 254 brotos depois de 184 dias com o uso de meio líquido suplementado com 1,5 mL de
água de coco, 0,537 µM de ANA e 4,44 µM de BAP, através de gemas laterais para o híbrido
Bc owen HOLMES ponkan x Brassavola digbiana nº 2.
Neste trabalho com E. alboxanthina, os resultados encontrados no item 4.3.1 para a
formação de brotos revelam uma produção de 3,47 brotos/planta quando utilizou-se 17,60
µM de BAP na ausência de ANA (Figura 7). Para este experimento com tipos de explante, a
maior produção de brotos (1,92 brotos/planta) ocorreu na mesma concentração de BAP (17,60
µM), na ausência de ANA usada anteriormente. No entanto, a fonte de explante não
apresentou grande eficiência para a formação de brotos nesta situação (Tabela 11). Estes
resultados foram diferentes aos reportados por Nascimento (2006), que verificaram a
produção de 2,38 brotos/planta para segmentos internodais de híbridos de Brassavola
flagellaris Barb. Rodr. x Cattleya harrisoniana f. alba. Beer com o uso de 17,60 µM de BAP.
Tabela 11 – Valores médios para número de brotos (NB), comprimento médio dos brotos (AMB), matéria seca dos brotos (MSB) e explantes que formam brotos (EFB) de E.
alboxanthina em função de diferentes fontes de explantes: planta (PL), protocormo (PR), base caulinar (BC) e folha (F). UEFS, Feira de Santana-Ba, 2009.
Explantes
BAP 0,0 ANA 0,0 (µM)
NB
BAP 8,88 ANA 0,573 (µM)
BAP 17,60 ANA 0,0 (µM)
AMB
(mm)
MSB
(mg)
EFB (%)
NB
AMB (mm)
MSB (mg)
EFB (%)
NB
AMB
(mm)
MSB (mg)
EFB (%)
PL
0,00 b zA y
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
PR
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
BC
1,14 aB
1,03 aB
1,40 aC
24,48 aC
1,87 aA
1,32 aA
4,43 aB
51,50 aB
1,92 aA
1,31 aA
4,95 aA
55,21 aA
F
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
0,00 bA
z
– Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
y
– Médias seguidas pela mesma letra maiúscula em cada linha, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Deve-se evidenciar que as concentrações utilizadas para este experimento foram
estabelecidas com resultados parciais do item 4.3.1. Provavelmente a base caulinar usada
neste experimento (4.3.2), associado com a concentração de 17,60 µM de BAP combinada
com 0,2685 µM de ANA estabelecida ao final do experimento do item 4.3.1, poderia
apresentar maior número de brotações já que uma linha de tendência crescente foi observado
para tal experimento do item 4.3.1 (Figura 7).
Na organogênese, os tecidos em geral, possuem a capacidade de responder a estímulos
químicos, sendo denominados como competentes. No entanto, pode ocorrer uma falha desse
mecanismo fazendo com que a resposta esperada para determinado tecido em formar órgãos
não aconteça, e mesmo administrando concentrações elevadas de reguladores exógenos não é
possível prover a formação de órgãos (PERES, 2002).
Outro fator que pode ter influenciado durante a multiplicação foi a idade dos
explantes, no 1° experimento do item 4.3.1 as plantas tinham 12 meses já neste experimento
(4.3.2) as plantas tinham 24 meses de idade. Todavia, os protocormos que possuíam 1 mês de
idade não se desenvolveram na presença dos reguladores vegetais. Souza et al. (2007)
relatam que o tamanho do explante pode ser um fator determinante no processo de
desenvolvimento in vitro, pois é ele que vai determinar a possibilidade de sobrevivência e a
capacidade de crescimento e regeneração da planta. Os resultados encontrados neste estudo
indicam que protocormos com cerca de 0,1 a 0,2 cm foram usados como explante e não
promoveram crescimento e/ou brotações nas condições determinadas.
Em relação a comprimento médio dos brotos para E. alboxanthina, o uso de 8,8 µM de
BAP combinado com 0,573 µM de ANA obteve a maior média (1,32 mm). No entanto, para a
concentração mais alta usada (17,60 µM de BAP na ausência de ANA) não foi observada
diferença significativa (Tabela 11).
As maiores médias para a matéria seca dos brotos (4,43 e 4,95 mg), foram observadas
respectivamente, nas combinações de 8,8 µM de BAP com 0,573 µM de ANA e 17,60 µM de
BAP na ausência de ANA. Porém, a maior concentração de BAP testada proporcionou uma
maior incorporação de biomassa, diferindo significativamente das outras combinações (sem
BAP e ANA, e com 8,8 µM de BAP combinado com 0,573 µM de ANA) (Tabela 11).
Em relação ao percentual de explantes que formaram brotos a maior média foi
observada (55,21%) na presença de 17,60 µM de BAP na ausência de ANA, diferindo
significativamente dos outros meios testados, sem o uso do regulador e suplementado com
8,8 µM de BAP combinado com 0,573 µM de ANA (Tabela 11). Esses resultados são
diferentes daqueles reportados por Stefanello et al. (2009), quando trabalharam com ápices
radiculares e segmentos foliares de Miltonia flavescens Lindl. e obtiveram um percentual de
responsividade de 47,94% para ápices radiculares usando as concentrações de 13,59 µM de
2,4-D combinado com 0 ou 4,44 µM de BAP, e, de 24% para segmentos foliares na ausência
dos reguladores ou usando as concentrações de 13,59 µM de 2,4-D combinado com 4,44 ou
13,32 µM de BAP. Giatti & Lima (2007), também reportaram resultados diferentes àqueles
aqui obtidos em relação ao percentual de responsividade na regeneração de gemas laterais do
híbrido Bc owen HOLMES ponkan x Brassavola digbiana nº 2. Estes autores obtiveram com
o uso de 4,44 µM de BAP, 23% de responsividade após 93 dias de cultivo, e ao final dos 153
dias a responsividade aumentou para 37%.
Os resultados encontrados neste estudo com E. alboxanthina foram diferentes dos
reportados por Nascimento (2006), para híbridos de Brassavola flagellaris Barb. Rodr. x
Cattleya harrisoniana f. alba Beer, os quais verificaram a responsividade de 92% para os
segmentos internodais com o uso de 17,60 µM de BAP.
Desse modo, os resultados obtidos neste experimento indicam que é necessário testar
outras fontes de explante, citocininas, ou até mesmo concentrações maiores de BAP para
obter-se melhores resultados quanto à expressividade das respostas organogênicas em E.
alboxanthina.
4.4 EFEITO DA VENTILAÇÃO IN VITRO E DA CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE NA
PRÉ-ACLIMATIZAÇÃO
E
DO
SUBSTRATO
E
DA
ADUBAÇÃO
NA
ACLIMATIZAÇÃO DE E. ALBOXANTHINA
Observou-se efeito altamente significativo (p ≤ 0,01) da interação “vedação x
concentração de sacarose” para a variável redução do peso fresco entre 30 e 60 minutos, e
total (Tabela 12).
Tabela 12 – Resumo da análise de variância para redução de peso fresco (%) até 30 minutos, (%) entre 30 e
60 minutos, e (%) redução total após 60 minutos da exposição às condições ambientais, em
função do tipo de vedação (V) e da concentração de sacarose (S) utilizada. UEFS, Feira de
Santana-Ba, 2009.
FV
Quadrados Médiosz
GL
Até 30 minutos
entre 30 e 60 minutos
total após 60 minutos
V
1
12,05 ns
34,04**
36,63**
S
1
9,6 ns
1,24 ns
10,36 ns
VxS
1
12,90ns
34,78**
48,13**
Resíduo
36
3,22
3,48
2,77
2,53
13,31
2,54
CV (%)
z
Médias originais.
** ,*, ns. Significativo ao nível de 1% de probabilidade, significativo ao nível de 5% de probabilidade, não
significativo pelo teste F, respectivamente.
Após
30 minutos de exposição ao ambiente ocorreu a maior redução de peso fresco em
todos os tratamentos avaliados (Tabela 13). Entre 30 e 60 minutos de exposição às condições
ambientais, foi observado em média uma redução de mais 7,08% em relação ao peso inicial
para plantas provenientes de tubos vedados com PVC, enquanto que para plantas provenientes
de tubos vedados com algodão essa redução foi de 5,78% em relação ao peso inicial (Tabela
13). A avaliação da redução total de peso fresco após 60 minutos de exposição ao ambiente
revelou que plantas provenientes de tubos fechados com algodão (16,47%) perderam apenas
1,09% menos água por transpiração do que plantas provenientes de tubos fechados com PVC
(17,56%) (Tabela 13).
Tabela 13 – Valores médios para redução de peso fresco (%) até 30 minutos, (%) entre 30 e 60 minutos, e (%)
redução total após 60 minutos da exposição às condições ambientais, em função do tipo de
vedação (V) e concentração de sacarose (0 e 30 gL-1) utilizada. UEFS, Feira de Santana-Ba,
2009.
Até 30 minutos z
Conc.
Sacarose
PVC
entre 30 e 60 minutos z
total z após 60 minutos
Algodão
PVC
Algodão
PVC
Algodão
0g
12,71 a yAx
10,35 aB
8,03 aA
4,97 aB
20,74 aA
15,32 aB
30g
10,26 bA
11,03 aA
6,13 bA
6,60 aA
14,38 bA
17,63 aA
11,48 A
10,69 A
7,08 A
5,78 B
17,56 A
16,47 B
Média
z
Médias originais. A estatística foi realizada com médias transformadas em arco seno.
y
– Médias seguidas pela mesma letra minúscula em cada coluna, não diferem entre si ao nível de 5% de
probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
x
– Médias seguidas pela mesma letra maiúscula em cada linha, não diferem entre si ao nível de 5% de
probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Estes resultados são inferiores aos encontrados nas avaliações realizadas por Bellintani
(2006), que trabalhou com Orthophytum mucugense Wand. & Conceição obtendo entre 30 e
60 minutos de exposição às condições ambientais, a redução do peso fresco em relação ao
peso inicial para tubos vedados com PVC de mais 7,2%, enquanto que para os tubos vedados
com algodão essa redução foi de apenas 3,4%. Já para a redução do peso fresco após 60
minutos de exposição ao ambiente, este autor verificou que para tubos vedados com algodão
(10,9%) a redução do peso fresco foi de aproximadamente 50% menor que para os tubos
vedados com PVC (20,2%).
Na ausência de sacarose as plantas cultivadas em tubos tampados com algodão
desenvolveram maior capacidade de resistir à perda de água do que plantas cultivadas em
tubos fechados com PVC. Já na presença de 30 gL-1 de sacarose não foi observado diferença
entre as plantas cultivadas em tubos fechados com PVC e plantas cultivadas em tubos
fechados com algodão (Tabela 13).
Observações feitas por Bellintani (2006), para Orthophytum mucugense Wand. &
Conceição reporta que adaptações na folha contra a perda de água por transpiração foram
desenvolvidas durante a pré-aclimatização in vitro, inferindo que o deficit hídrico diminuiu
durante a fase de aclimatização das mudas em casa de vegetação.
Segundo Ribeiro et al. (2007), a concentração de sacarose influencia diretamente no
desenvolvimento das folhas. Para George e Sherrington (1994), os níveis de sacarose a 30 gL1
podem inibir a síntese de clorofila. Kozai (1991), acreditam que na presença do açúcar as
plantas não desenvolvam a capacidade fotoautotrófica podendo causar crescimento reduzido
in vitro e morte de mudas durante a fase de aclimatização. Skrebsky et al. (2004), relatam que
o pré-condicionamento com altas concentrações de sacarose aumentaria as reservas de
carboidratos armazenados pelas folhas, aumentando assim, a energia disponível para as
plantas durante o processo de aclimatização. Por outro lado, com a concentração zero de
sacarose as plantas seriam obrigadas a realizar fotossíntese proporcionando o cultivo
fotoautotrófico.
É possível inferir que o resultado das duas metodologias usadas ao final da préaclimatização não causaram diferenças significativas em relação a perda de água por em
mudas de E. alboxanthina.
Observações feitas por Grattapaglia & Machado (1998) citam que vários fatores são
limitantes para a sobrevivência das plantas durante a aclimatização. Estes fatores tornam a
passagem da planta de um meio heterotrófico para outro autotrófico, uma fase decisiva para o
sucesso da cultura de tecidos vegetais. Isto sugere avaliar a exigência particular de cada
espécie, afim de encontrar uma metodologia mais adequada a ser aplicada para a espécie em
estudo.
Na aclimatização não foram observadas diferenças na sobrevivência de mudas préaclimatizadas em diferentes concentrações de sacarose e em tubos fechados com algodão ou
PVC. Por isso os resultados foram agrupados considerando apenas os tratamentos realizados
na aclimatização.
As mudas foram transferidas diretamente para casa de vegetação ou passaram por uma
fase de 30 dias em sala de crescimento antes da transferência. As análises realizadas após 60
dias de aclimatização das mudas de E. alboxanthina, possibilitaram observar que a
manutenção das plântulas durante os primeiros 30 dias na sala de crescimento reforçou o
índice de sobrevivência das mudas. Em média 76,57% das plântulas mantidas durante 30 dias
em sala de crescimento sobreviveram na fase de aclimatização, e, somente, 56,25% das
plântulas que foram transferidas diretamente para a casa de vegetação (Tabela 14). Ainda de
maneira geral, os maiores níveis médios de sobrevivência (69,79%) foram alcançados por
plantas cultivadas em gravilhão + isopor sem adubação (Tabela 14 e Figura 12).
Entre todos os tratamentos avaliados, o melhor percentual de sobrevivência (83,34%)
após 90 dias foi observado para as mudas cultivadas em gravilhão + pérolas de isopor, sem
adubação, que passaram por fase intermediária em sala de crescimento.
Os resultados mostram ainda que houve um grande decréscimo na sobrevivência das
mudas entre 30 e 90 dias de aclimatização, o que indica que 60 dias não são suficientes para a
aclimatização das mudas (Tabela 14 e Figura 12).
Tabela 14 – Valores percentuais (%) da sobrevivência das mudas de E. alboxanthina 30, 60 e 90 dias de acordo
com o substrato (gravilhão + fibra de coco ou gravilhão + pérolas de isopor), adubação com
solução WPM 20% e local de aclimatização, após a pré-aclimatização in vitro. UEFS, Feira de
Santana-Ba, 2009.
Local de aclimatização
Gravilhão + coco
S/ adubação
C/ adubação
Gravilhão + isopor
S/ adubação
Média
C/ adubação
30 dias
Casa de vegetação (CV)
91,67
85,42
97,92
81,25
89,07
Sala de crescimento (SC)
97,92
93,75
100,00
100,00
97,92
Média
94,79
89,58
98,96
90,62
93,49
60 dias
CV
58,33
50,00
70,83
45,83
56,25
CV + SC
75,00
72,92
89,60
68,75
76,57
Média
66,66
61,46
80,21
57,29
66,41
90 dias
CV
37,50
27,08
56,25
18,74
34,89
CV + SC
62,50
58,37
83,34
52,08
64,07
Média
50,00
42,72
69,79
35,41
49,48
Todo substrato usado para a aclimatização deve apresentar algumas propriedades, como
capacidade de reter a umidade durante algum tempo sem ficar encharcado, possibilitar a
fixação da planta sem agredir as raízes, ser de fácil uso e de longa duração, proporcionar boa
aeração e apresentar o pH ligeiramente ácido, pois a eficácia da absorção do adubo vai
depender da acidez do substrato (KAMPF, 2007; WEDLING et al., 2002).
C
A
B
E
D
F
G
Figura 12: Aspecto da aclimatização de E. alboxanthina após 90 dias de adaptação em casa de vegetação, de
plantas germinadas in vitro com 30 meses de idade regadas com água. Bandejas vista de cima (A e
B); Bandejas com vista aproximada (C, D, E, F e G). Barra: 1 cm. Fonte: o autor.
O uso do isopor em cultivo de orquídeas vem se tornando freqüente, principalmente
quando combinado com pedra britada ou gravilhão, pois além de deixar os vasos mais leves,
proporciona uma boa aeração, retém pouca umidade o que evita a disseminação de patógenos
nas raízes. Além de ser um material inerte que sofre pouca ou nenhuma variação, possui um
pH levemente ácido o que é favorável ao crescimento das raízes, e por ser poroso ajuda a
manter a disponibilidade dos nutrientes usados na adubação (GRUSZYNSKI, 2002). Em
contrapartida, o gravilhão sofre pouca ou nenhuma alteração no pH podendo manter a planta
por mais tempo em um mesmo ambiente sem que haja a necessidade do estressante
transplantio (RODRIGUES, 2003). É recomendado para o cultivo de Cattleya nobilior
Rchb.f., Rodriguezia sp. Rchb.f., e principalmente, para espécies rupícolas que não precisam
de muita água, como é o caso da E. alboxanthina usada neste estudo (ARAÚJO, 2004).
5 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nas diferentes etapas desse estudo relacionados à germinação,
crescimento e propagação in vitro, bem como, a taxa de sobrevivência em viveiro durante a
aclimatização de plantas de E. alboxanthina Fowlie permitem as seguintes conclusões:
a) A germinação assimbiótica in vitro de E. alboxanthina deve ser realizada em meio de
cultura MS/2 ou KC esterilizado fisicamente sem adição de carvão ativado;
b) O crescimento in vitro de E. alboxanthina deve ser feito em meio de cultura WPM ou
MS/4 suplementado com sacarose (43,82mM), sem adição do carvão ativado e
esterilizado fisicamente;
c) Para a multiplicação in vitro de E. alboxanthina deve ser usado o meio de cultura
WPM suplementado com BAP (17,60µM) na ausência ou combinado com ANA
(0,2685) sem adição de carvão ativado e esterilizado fisicamente utilizando como
fonte de explante a base caulinar;
d) A pré-aclimatização das mudas de E. alboxanthina deve ser realizado na sala de
crescimento e na aclimatização deve-se utilizar como substrato o gravilhão combinado
com pérolas de isopor (1:1), sem necessidade de adubação;
e) Na multiplicação de E. alboxanthina recomenda-se novos estudos para avaliar fontes
de explantes e reguladores de crescimento, bem como, avaliar a concentração de
sacarose e a aeração dos tubos na etapa de pré-aclimatização.
REFERÊNCIAS
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