análise microscópica das células ciliadas externas no uso da

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DISTÚRBIOS DA
COMUNICAÇÃO HUMANA
ANÁLISE MICROSCÓPICA DAS CÉLULAS CILIADAS
EXTERNAS NO USO DA GENTAMICINA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Carla Luiza Baggio
Santa Maria, RS, Brasil
2007
ANÁLISE MICROSCÓPICA DAS CÉLULAS CILIADAS
EXTERNAS NO USO DA GENTAMICINA
por
Carla Luiza Baggio
Dissertação (Modelo Alternativo) apresentada ao Curso de Mestrado do
Programa de Pós-Graduação em Distúrbios da Comunicação Humana, Área de
Concentração em Audiologia Clínica, da Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Distúrbios da Comunicação Humana
Orientador: Prof. Dr. Aron Ferreira da Silveira (UFSM)
Co-orientador: Prof. Dr. Miguel Ângelo Hyppolito (USP – Ribeirão Preto)
Santa Maria, RS, Brasil
2007
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Distúrbios da Comunicação Humana
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
ANÁLISE MICROSCÓPICA DAS CÉLULAS CILIADAS EXTERNAS
NO USO DA GENTAMICINA
elaborada por
Carla Luiza Baggio
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Distúrbios da Comunicação Humana
COMISSÃO EXAMINADORA:
_____________________________
Aron Ferreira da Silveira, Dr. (UFSM)
(Presidente/Orientador)
__________________________________
Lilian Seligman Graciolli, Dra. (UFSM)
___________________________________
Sonia Maria Fighera Bortholuzzi , Dra.
Santa Maria, 20 de dezembro de 2007.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha família, que em todos os
momentos da minha vida, me apoiou e ajudou. A eles que
acreditaram nos meus sonhos e apoiaram cada iniciativa e
conquista, investiram nos meus estudos e contribuíram para que
minhas conquistas pessoais e profissionais fossem realizadas.
Aos que estiveram sempre ao meu lado, amigos, colegas, pela
contribuição e apoio nesses anos de estudo.
AGRADECIMENTOS
A PRFª DRª MÁRCIA KESKE-SOARES, coordenadora do Programa de
Pós-Graduação em Distúrbios da Comunicação Humana pelo exemplo de
confiança, dedicação e ética, não medindo esforços para o sucesso da profissão
de fonoaudióloga.
AO PROF. DR. ARON FERREIRA DA SILVEIRA, pela atenção,
orientação e disponibilidade, apoiando todas as etapas desta pesquisa.
AO PROF. DR. MIGUEL ANGELO HYPPOLITO, por ser uma
pessoa sempre disposta a ajudar. Pequenas oportunidades são geralmente o
início de grandes conquistas. Muito Obrigada.
A DRª LILIAN SELIGMAN GRACIOLLI, pela amizade, colaboração,
participação e cuidado na correção deste trabalho.
A DRª SONIA MARIA FIGHERA BORTHOLUZZI, pela amizade,
confiança, atenção e carinho na correção deste trabalho, e em tantos outros
momentos importantes da minha profissão.
A FLÁVIA SALATA e MARIA ROSSATO, pelo carinho, apoio e
dedicação, contribuindo para que esta pesquisa se realizasse.
AO PROF. DR. LUIS FELIPE DIAS LOPES, pelo tratamento
estatístico dos dados, pelo cuidado, atenção, paciência e competência.
MUITO OBRIGADA!!!!!!
“Aquele que conhece os outros é sábio
Aquele que conhece a si mesmo é iluminado
Aquele que vence os outros é forte
Aquele que vence a si próprio é poderoso
Aquele que conhece a alegria é rico
Aquele que conserva o seu caminho tem vontade”.
“O sábio não se exibe, e por isso brilha
Ele não se faz notar, e por isso é notado
Ele não se elogia, e por isso tem mérito
E, por que não está competindo, ninguém no mundo pode
competir com ele”.
LAO TSE
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fotografia da tela do programa ILO 92, mostrando emissões otoacústicas por
produto de distorção de uma das cobaias tratadas com gentamicina 4 mg/kg/dia por 10 dias –
pré (A) e pós (B) tratamento (no dia do sacrifício). ................................................................. 25
Figura 2: Fotografia da tela do programa ILO 92, onde verificou-se a presença de respostas as
emissões otoacústicas por produto de distorção no grupo 3 (gentamicina 4 mg/Kg/dia por 14
dias) – pré (A) e pós (B) tratamento – no dia do sacrifício. ..................................................... 26
Figura 3: Foto da tela do programa ILO 92, evidenciando as respostas das emissões
otoacústicas por produto de distorção do grupo 4 (gentamicina 5 mg/Kg/dia por 10 dias) pré
(A) e pós tratamento (B) - no dia do sacrifício. ....................................................................... 27
Figura 4: Foto da tela do programa ILO 92 que mostra as emissões otoacústicas por produto
de distorção pré (A) e pós (B) tratamento com gentamicina 5mg/Kg/dia por 14 dias. ............ 28
Figura 5: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 2 (4mg / 10dias).................................. 29
Figura 6: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 3 (4mg / 14dias).................................. 29
Figura 7: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 4 (5mg / 10dias).................................. 30
Figura 8: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 5 (5mg / 14dias).................................. 30
Figura 9: Foto de Microscopia Eletrônica de Varredura com aumento de (500X) da espira
basal da cóclea de uma das cobaias tratadas com Gentamicina 4 mg/Kg/dia por 10 dias – pós
tratamento (no dia do sacrifico) ................................................................................................ 46
Figura 10: Fotografia da tela do programa ILO 92, mostrando as emissões otoacústicas por
produto de distorção de uma das cobaias tratadas com gentamicina 4 mg/Kg/dia por 10 dias,
pré (A) e pós (B) tratamento (no dia do sacrifício). ................................................................. 47
Figura 11: Foto de Microscopia Eletrônica de Varredura da espira basal da cóclea de cobaia
tratada com 4 mg/Kg/dia por 14 dias de gentamicina, com presença de células ciliadas
externas em todas as fileiras (aumento de 350 X). ................................................................... 48
Figura 12: Foto da tela do programa ILO 92 onde verificamos a presença de resposta ás
emissões otoacústicas por produto de distorção no grupo tratado com gentamicina 4
mg/Kg/dia por 14 dias, pré (A) e pós (B) tratamento (no dia do sacrifício). ........................... 49
Figura 13: Microscopia Eletrônica de Varredura da cóclea de uma das cobaias tratadas com
gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas por 10 dias consecutivos. ............................... 50
Figura 14: Foto da tela do programa ILO 92 onde se verificou a presença de respostas as
emissões otoacústicas por produto de distorção no grupo tratado com gentamicina 2,5
mg/Kg/dia por 10 dias, pré (A) e pós) tratamento (no dia do sacrifício). ................................ 51
Figura 15: Foto de Microscopia Eletrônica de Varredura da espira basal da cóclea do grupo
tratado com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas por 14 dias. ............................... 52
Figura 16: Foto da tela do programa ILO 92 indicando a presença das emissões otoacústicas
por produto de distorção pré (A) e pós (B) tratamento com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12
em 12 horas por 14 dias. ........................................................................................................... 53
LISTA DE ANEXOS
Tabela 1 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre
os dois grupos pré tratamento com gentamicina 4 mg/Kg/dia ................................................. 62 Tabela 2 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre
os dois grupos pós tratamento com gentamicina 4 mg/Kg/dia ................................................. 62 Tabela 3 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre
os dois grupos pré tratamento com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas ................ 63 Tabela 4 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre
os dois grupos pós tratamento com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas................ 63 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 10
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 13
Referências Bibliográficas........................................................................................................ 16
Bibliografia Consultada ............................................................................................................ 19
3 ARTIGO DE PESQUISA – COCLEOTOXICIDADE DA GENTAMICINA POR DOSES
HABITUAIS PARA NEONATOS – ESTUDO FUNCIONAL............................................... 20
Resumo ..................................................................................................................................... 20
Abstract..................................................................................................................................... 21
Introdução ................................................................................................................................. 22
Metodologia .............................................................................................................................. 24
Resultados................................................................................................................................. 25
Discussão .................................................................................................................................. 31
Conclusão ................................................................................................................................. 33
Referências Bibliográficas........................................................................................................ 33
4 ARTIGO DE PESQUISA – ESTUDO ANATOMICO DA COCLEOTOXICIDADE DA
GENTAMICINA A DOSES HABITUAIS UTILIZADOS EM RECÉN-NASCIDOS........... 36
Resumo ..................................................................................................................................... 36
Abstract..................................................................................................................................... 37
Introdução ................................................................................................................................. 38
Referencial Literário ................................................................................................................. 40
Metodologia .............................................................................................................................. 43
Resultados................................................................................................................................. 46
Discussão .................................................................................................................................. 53
Conclusão ................................................................................................................................. 56
Referências Bibliográficas........................................................................................................ 57
1 INTRODUÇÃO
O diagnóstico precoce da deficiência auditiva tem sido uma preocupação constante
dos profissionais da saúde, pois estudos já relataram importantes prejuízos causados à criança
devido à perda da audição, muitas vezes irreversíveis, afetando não apenas a linguagem, mas
também o desenvolvimento global da mesma (Uchôa et al, 2003).
A deficiência auditiva pode ser causada por dosagens inadequadas de medicamentos
ototóxicos em recém nascidos internados na UTI neonatal. Neste sentido, faz-se necessário
realizar estudos que possam contribuir com um conhecimento mais aprofundado deste tema,
possibilitando a adoção de procedimentos que busquem a manutenção da integridade auditiva
para uma melhor qualidade de vida.
Tendo em vista alterações auditivas causadas pela utilização de medicamentos como a
gentamicina, é importante a monitorização da audição em pacientes usuários de drogas
ototóxicas, para determinar a progressão da ototoxicidade e quando ela se inicia
(Dishtchekenian et al, 2000).
Este trabalho apresenta um estudo teórico sobre as possíveis lesões causadas às células
ciliadas externas pela ação da gentamicina em dosagens habituais utilizadas na UTI neonatal,
bem como uma pesquisa experimental sobre a funcionalidade das células ciliadas externas
através das emissões otoacústicas por produto de distorção e do estudo anatômico das
mesmas, a partir da análise microscópica.
Conforme HYPPOLITO e OLIVEIRA (2005), medicamentos como a gentamicina
provocam danos como o comprometimento das células ciliadas externas, lesando inicialmente
as células da espira basal da cóclea. Sendo as alterações cocleares irreversíveis e tendo como
seqüelas as perdas auditivas neurossensorias, a forma de impedi-las seria a prevenção. A
incidência de ototoxicidade causada pela gentamicina varia de 6% a 16%.
A toxicidade da gentamicina depende de alguns fatores, tais como: dosagem,
intolerância individual, potenciação de efeitos de outras drogas, idade, alterações renais e
indivíduos que já apresentam problemas auditivos anteriores (Ganança et al, 1997).
A gentamicina é um antibiótico de ação bactericida que atua principalmente nas
infecções causadas por bacilos Gram-negativos. É o primeiro aminoglicosídeo de escolha por
causa do baixo custo e por ser ativo na maioria dos bacilos Gram-negativos resistentes
aeróbicos (Chambers e Sande, 1995).
O efeito colateral mais importante e sério é a ototoxicidade, que ocorre em 2% das
pessoas que recebem gentamicina e pode ser muito grave. Os pacientes em tratamento com
11
gentamicina devem ter as funções auditivas e vestibulares controladas em intervalos
freqüentes (Trabulsi e Soares, 1998).
As ototoxicoses são afecções iatrogênicas provocadas por fármacos que alteram a
orelha interna (labirinto). Essas substâncias podem afetar o sistema coclear, o sistema
vestibular ou ambos, alterando duas funções importantes do organismo: a audição e o
equilíbrio. Ocorre ototoxicose quando há perda auditiva neurossensorial de mais de 25 dB em
uma ou mais freqüências de 250 a 8000 Hz e/ou quando ocorrem manifestações vestibulares
como vertigem ou desequilíbrio. Dos grupos de fármacos ototóxicos, os antibióticos
aminoglicosídeos são os mais estudados (Hyppolito e Oliveira, 2005; Oliveira e Bernal,
2006). Dentre os aminoglicosídeos, a gentamicina é considerada um dos antibióticos mais
potentes do grupo.
Os principais grupos pediátricos que recebem antibióticos aminoglicosídeos são
recém-nascidos com infecções graves na UTI neonatal (Oliveira e Bernal, 2006).
A perda auditiva bilateral apresenta elevada incidência, ocorrendo em cerca de três
para cada 1.000 nascidos vivos, e de dois a quatro para cada 100 recém-nascidos egressos de
unidade de terapia intensiva (UTI) neonatal (Lima et al., 2006).
Nesse sentido é importante a realização de testes que verifiquem a integridade da
audição. O monitoramento auditivo deve ser realizado porque providencia evidências
precoces do limite da dose para perdas auditivas, levando à possibilidade de prevenção ou
redução da severidade da ototoxicidade e, quando instalada a perda auditiva, há possibilidade
de reabilitação auditiva com a adaptação do aparelho de amplificação sonora (Jacob et al.,
2006).
As emissões otoacústicas, detectadas por Kemp (1978) no conduto auditivo externo de
humanos, medem o “feedback” da energia biomecânica na contração das células ciliadas
externas, que amplifica o pico da “onda viajante” na membrana basilar e têm aplicação clínica
na avaliação da integridade auditiva refletindo a funcionalidade das células ciliadas externas,
sendo o único meio não-invasivo de investigação coclear objetiva (Hyppolito, 2003).
Fundamentado na literatura e procurando conhecer os resultados do uso da
gentamicina em dosagens terapêuticas praticadas na UTI neonatal, este estudo teve como
objetivo verificar as células ciliadas externas quanto a ototoxicidade da gentamicina,
avaliando o esquema de dose única de 4 mg/Kg/dia como recomendada por YOUNG e
MANGUM (2006) na NEOFAX (manual de neonatologia usado como referência),
comparando esse esquema com o tradicional de 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas (Agarwal et
12
al, 2002), por meio de um estudo funcional através das emissões otoacústicas por produto de
distorção e um estudo anatômico por microscopia eletrônica de varredura.
13
2 REVISÃO DE LITERATURA
A necessidade do emprego dos antibióticos aminoglicosídeos por períodos
prolongados de tempo para o adequado tratamento da tuberculose propiciou o aparecimento
de efeitos colaterais principalmente relacionados com a nefro e ototoxicidade. A incidência e
intensidade dos fenômenos ototóxicos dependem da via de administração, da dose e da
duração do tratamento (Grellet et al., 1974).
Os antibióticos aminoglicosídeos demonstraram ser altamente eficaz, e seriam mais
utilizados não fosse a sua peculiar capacidade de danificar o rim e o VIII par craniano.
Esta predileção ototóxica dos aminoglicosídeos está relacionada com o modo particular de
concentração e excreção destas substâncias nos líquidos do ouvido interno. Estes antibióticos
permanecem por muito mais tempo em concentração elevada na endolinfa e sua eliminação
ocorre independente da sua excreção em nível plasmático (Cruz et al, 1985).
Segundo SCHWEITZER (1993), o monitoramento audiológico deve fazer parte do
protocolo de atendimento aos indivíduos expostos a agentes ototóxicos, o que poderá
possibilitar uma prevenção ou redução da severidade da ototoxicidade. Outro motivo é que,
quando o tratamento por meio de uma droga ototóxica for indispensável, o paciente, a partir
do monitoramento e detecção precoce de alguma alteração auditiva, poderá fazer o uso de
algum método de reabilitação.
BRICKS et al. (1994) mencionaram que na última década, a sobrevivência de crianças
muito prematuras, com peso de nascimento inferior a 1000 g, tem despertado um maior
interesse sobre o uso terapêutico e a ação de drogas e agentes físicos no período neonatal. Os
fármacos causam diversos graus de dano coclear, mas a lesão típica das células ciliadas
cocleares é comum a todos os agentes ototóxicos. O maior dano ocorre sobre as células
cocleares responsáveis pelos sons de alta freqüência. Sabe-se que para estabelecer um
tratamento adequado, há necessidade de um conhecimento preciso sobre a ação fisiológica e
fisiopatológica das drogas, mas os estudos em seres humanos, especialmente em recémnascidos prematuros de muito baixo peso (RNPT-MBP), são difíceis de se obter e sua
interpretação é extremamente complexa.
MARTINS et al. (2005) referiram que os aminoglicosídeos são antimicrobianos
usados regularmente no tratamento da septicemia neonatal precoce (observada até 72 horas de
vida) e tardia (observada após 72 horas de vida).
14
Segundo CHAMBERS e SANDE (1995), o sulfato de gentamicina é disponível em
várias formas: frascos e seringas, injeção intratecal, pomada e creme, pomada oftálmica. A
dose intramuscular ou intravenosa para adultos é de 2 mg/Kg aumentando a dose para 3 a 5
mg/Kg por dia, sendo 1/3 administrado a cada oito horas. Inúmeras doses foram sugeridas
para lactentes, mas a dosagem de 2 a 2,5 mg/Kg a cada oito horas tem se mostrado segura
para crianças acima de 2 anos; a dose de 5 mg/Kg fracionadas em duas doses em intervalos
iguais tem sido recomendada para neonatos com infecções graves. Uma única dose diária
administrada sozinha em infusão de 30 a 60 minutos também tem sido utilizada.
Conforme MARTINS et al. (2005) a literatura tem sugerido que uma dose única ao dia entre
3,5 e 5mg/kg parece ser igualmente efetiva, quando comparada à dose convencional de 2,5 mg/kg em
intervalos menores .
A descoberta da gentamicina em 1963, por Weinstein, foi um grande marco na história
dos aminoglicosídeos porque, além de sua tolerabilidade razoável, é ativa contra muitas
espécies bacterianas. Todos os aminoglicosídeos são potencialmente tóxicos para os dois
ramos do 8º par craniano. A disfunção auditiva pode manifestar-se gradualmente, com
zumbidos discretos e perda da audição para sons de alta freqüência, mas se tais sintomas
forem negligenciados, poderá instalar-se surdez eventualmente completa. Os efeitos
ototóxicos dos aminoglicosídeos dependem do tamanho da dose, duração da terapêutica,
estado do paciente (função renal, idade, suscetibilidade individual) e características da droga.
(Trabulsi e Soares, 1998).
De acordo com DISHTCHEKENIAN et al. (2000), a deficiência auditiva tem sido
considerada uma doença severamente incapacitante, em virtude do papel da audição na
comunicação humana. Esta pode ser causada por diversos fatores etiológicos, congênitos ou
adquiridos, além de apresentar graus e tipos variados. Uma das causas da deficiência auditiva
adquirida é o uso de drogas ototóxicas. Essas drogas lesam as estruturas sensoriais da orelha
interna, podendo afetar tanto o sistema auditivo quanto o vestibular.
HOPMAN et al. (2002) relataram que a ototoxicidade refere-se ao prejuízo
quimicamente induzido às porções da orelha interna, lesando as células ciliadas do órgão de
Corti e das máculas e cristas do sistema vestibular, resultando em diversos graus de perda
auditiva neurossensorial, vertigem e náusea.
Segundo ZOCOLI et al. (2003), a ototoxicidade é definida como a perda parcial ou
total da função vestibular e/ou coclear em decorrência do uso de drogas, geralmente com
finalidades terapêuticas ou por exposição a substâncias tóxicas e o grau de severidade
depende da predisposição individual, dose, duração do tratamento, via de administração,
15
idade, tendência familiar e/ou de eventual dano prévio à orelha interna. Este estudo corrobora
com Kós e Kós (1998) que referem que a ototoxicidade depende de alguns fatores como a
predisposição individual, e a presença de insuficiência renal, que pode permitir o acúmulo do
medicamento na corrente circulatória.
De acordo com PERÉZ et al. (1998) a ototoxicidade geralmente é irreversível já que
ocorre uma destruição das células vestibulares, ou cocleares, que são altamente sensíveis aos
danos provocados pelos aminoglicosídeos.
ROCHA et al, (2003), referiram que os recém-nascidos internados na unidade de
cuidados intensivos são majoritariamente prematuros (idade gestacional inferior a 31
semanas). As técnicas utilizadas no tratamento destes doentes e os riscos obstétricos inerentes
parecem estar associados com o aumento do risco infeccioso. A gentamicina é freqüentemente
usada no tratamento e prevenção de sépsis destes recém-nascidos.
FAÇANHA et al. (2005) mencionaram que crianças de alto risco para perda auditiva
(nascidas pré-termo) têm intercorrências clínicas pela exposição a drogas ototóxicas, como
aminoglicosídeos e estão mais susceptíveis a episódios de hipóxia, podendo afetar o núcleo
dorsal do nervo acústico, provocando surdez seletiva para sons agudos.
Nossa audição assume papel importante na comunicação humana. A deterioração da
sensibilidade auditiva pode acarretar uma série de alterações psicossociais no indivíduo, uma
vez que a perda da compreensão da fala significa romper uma forma de contato com o mundo
e com as pessoas (Jacob et al., 2005).
Segundo HYPPOLITO et al. (2003), as cobaias albinas são escolhidas pelo fácil
manejo, pela facilidade de dissecção coclear e manipulação, facilidade para vias de infusão
para as drogas anestésicas e drogas em experimentação, pela via intraperitoneal ou
intramuscular, e por serem mais sensíveis à droga estudada.
Conforme OLIVEIRA e BERNAL (2006), dos grupos de fármacos ototóxicos, os
antibióticos aminoglicosídeos são os mais estudados. Na fase aguda, essas substâncias,
combinam-se com os receptores das membranas das células ciliadas externas do órgão de
Corti, da cóclea ou das máculas sacular e utricular e cristas do sistema vestibular. Quando
ocorre lesão coclear, há destruição das células ciliadas do órgão de Corti e a perda auditiva é
irreversível, não havendo tratamento. Nesses casos, dependendo do grau de hipoacusia, o
paciente deverá ser submetido à reabilitação da audição e da linguagem. Sendo assim, a única
possibilidade de defesa contra a seqüela da ototoxicidade por aminoglicosídeos é a prevenção.
De acordo com ALBUQUERQUE (2006), estudos em animais têm papel essencial no
desenvolvimento da ciência. Pesquisas experimentais com animais têm sido importantes para
16
o desenvolvimento de novas drogas, no aprimoramento do conhecimento acerca dos
mecanismos fisiopatológicos de doenças, para empreender ensaios terapêuticos com novos
fármacos, estudar marcadores biológicos e avaliar técnicas com perspectivas de aplicabilidade
na espécie humana.
Existem diferentes métodos experimentais para avaliar a audição em animais. O
primeiro método utilizando o reflexo de Preyer foi descrito em 1882, como uma técnica de
avaliação da audição em cobaias. Esta técnica simples envolve a administração de um
estímulo sonoro alto como bater as palmas ou apresentação de um som metálico, seguida da
observação da reação reflexa do animal, movimentação do pavilhão auricular e piscar dos
olhos. A medida do reflexo de Preyer é um teste de confiança para uma avaliação quantitativa
da audição, desde que seja excluído o alto grau de reverberação que existe na maioria das
salas comuns. Esta observação do reflexo de Preyer é utilizada principalmente para
determinar se a cobaia tem uma resposta auditiva ou não (Jero et al., 2001; Denes e Kocker,
1961 apud Oliveira et al., 1977).
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3 ARTIGO DE PESQUISA
COCLEOTOXICIDADE DA GENTAMICINA POR DOSES HABITUAIS PARA
NEONATOS – ESTUDO FUNCIONAL
COCHLEOTOXICITY OF THE GENTAMICIN FOR HABITUAL DOSES IN NEW BORN
- A FUNCTIONAL STUDY
RESUMO
A identificação precoce das alterações auditivas possibilita a intervenção ainda no
“período crítico” e ideal de estimulação da linguagem e da audição. A ototoxicidade infantil é
um tema bastante controverso. Têm sido relatadas percentagens variáveis de casos de
ototoxicidade em crianças com vários antibióticos aminoglicosídeos. Os principais grupos
pediátricos que recebem antibióticos aminoglicosídeos são recém-nascidos com infecções
graves na UTI neonatal. Objetivos: verificar o aspecto funcional das células ciliadas externas
da cóclea sob esquemas terapêuticos utilizados para o tratamento de infecções no período
neonatal. Forma de Estudo: Experimental. Material e Método: Foram estudadas 26 cobaias
albinas, através das emissões otoacústicas por produto de distorção, prévia e posteriormente a
aplicação de gentamicina. Resultados: Em todas as avaliações, o estado funcional das células
ciliadas externas, estudadas pelas emissões otoacústicas por produto de distorção, mostraramse preservadas. Conclusão: Neste experimento não foram observadas alterações no
funcionamento das células ciliadas externas de cobaias albinas sob tratamento com
gentamicina nas doses de 4 mg/Kg/dia e 2,5 mg/Kg/dia a cada 12 horas, por 10 e 14 dias.
PALAVRAS-CHAVE: audição, toxicidade, gentamicina, neonatos
21
ABSTRACT
The anticipated identification of auditory disturbances makes possible the intervention
in the “risk period” and also ideal to stimulate language and audition. Infant ototoxicity is a
very controversial subject. Several cases of ototoxicity in children using aminoglicosides
antibiotics have been reported. The main pediatric groups that receive aminoglicosides
antibiotics are neonates with serious infections in the neonates’ intensive care unit (UTI).
Goals: to verify the functional alterations to the external ciliary cells of the cochlea to
therapeutical schemas used for the treatment of infections in the neonatal period. Way of
Study: Experimental. Material and Method: 26 albino guinea pigs have been studied
through otoacustic emissions per product of distortion, which are previous and posterior to the
application of gentamicin. Results: The functional condition of all external ciliary cells,
which have been studied by otoacustic emissions per product of distortion were preserved in
all the assessments. Conclusion: In this experiment no changes were observed in the
functions of external ciliary cells of albino guinea-pigs being treated with gentamicin in doses
of 4 mg / kg / day and 2.5 mg / kg / day for every 12 hours in 10 and 14 days.
KEY WORDS: hearing, drug toxicity, gentamicin, newborn
INTRODUÇÃO
Nossa audição assume um papel muito importante na comunicação humana. A
deterioração da sensibilidade auditiva pode acarretar alterações psicossociais no indivíduo,
uma vez que a perda da compreensão da fala significa romper uma forma de contato com o
mundo e com as pessoas (Jacob et al., 2005).
A identificação precoce das alterações auditivas possibilita a intervenção ainda no
“período crítico” e ideal de estimulação da linguagem e da audição. O processo de maturação
do sistema auditivo central ocorre durante os primeiros anos de vida. A experiência auditiva
neste período de maior plasticidade cerebral, onde novas conexões neurais se estabelecem, é
imprescindível para garantir o desenvolvimento da audição e da linguagem (Borges et al.,
2006).
Do ponto de vista fisiológico, a estrutura receptora auditiva é formada por células de
sustentação e células receptoras ciliadas, localizadas no órgão de Corti. As células ciliadas
externas não têm capacidade de receber o estímulo sonoro, mas tem a capacidade de contrairse de forma rápida e lenta devido as suas propriedades biomecânicas (Zorzetto, 1999).
As células ciliadas externas constituem o amplificador coclear, sendo importante no
mecanismo de amplificação do estímulo para determinar o funcionamento das células ciliadas
internas, que são as unidades receptoras e codificadoras cocleares com papel importante na
seletividade freqüencial da cóclea (Figueiredo, 2003).
Quando o estímulo vibratório-mecânico atinge a cóclea estimula as células ciliadas
externas. Esse estímulo vai ser amplificado em direção às células ciliadas internas. Assim,
cria-se um eco (emissão otoacústica) que pode ser medido (Bento, 1998).
As Emissões Otoacústicas (EOA) são energias sonoras de fraca intensidade que são
amplificadas pela contração das células ciliadas externas, na cóclea, podendo ser captadas no
meato acústico externo. Foram descobertas em 1978 pelo professor de biofísica da Audição
da University College, em Londres, Dr. David T Kemp. Podem ser classificadas em:
espontâneas – se captadas no meato acústico externo na ausência de estimulação acústica;
evocadas – quando há liberação da energia captada no meato acústico externo em resposta a
um estímulo acústico. As EOA evocadas classificam-se em transitórias – evocadas por
estímulo acústico breve de espectro amplo que abrange uma gama de freqüências – clique ou
tune burst; produto de distorção – evocadas por dois tons puros simultâneos (F1 e F2) que por
intermodulação produzem como resposta um produto de distorção (2F1-F2); estímulo-
23
freqüência, evocadas por sinal continuo de fraca intensidade na freqüência do estimulo
apresentado: são menos usadas clinicamente (Figueiredo, 2003).
A perda auditiva pode ser congênita ou adquirida, podendo apresentar-se em diferentes
graus e tipos. Dentre as causas adquiridas está o uso de drogas ototóxicas, que são
medicamentos que causam reações tóxicas às estruturas da orelha interna afetando o sistema
auditivo e/ou vestibular.
De acordo com OLIVEIRA e BERNAL (2006) a ototoxicidade infantil é um tema
bastante controverso. Têm sido relatados percentagens variáveis de casos de ototoxicidade em
crianças
com
vários
antibióticos
aminoglicosídeos,
como
a
estreptomicina,
a
diidrostreptomicina, a canamicina, a amicacina e a gentamicina , sendo esta uma importante
droga no tratamento de muitas infecções causadas por bacilos gram-negativos.
Como relata CHAMBERS e SANDE (1995), a gentamicina é o primeiro
aminoglicosídeo de escolha por causa do seu baixo custo e por ser ativo na maioria dos
bacilos gram-negativos aeróbicos resistentes Os principais grupos pediátricos que recebem
antibióticos aminoglicosídeos são recém-nascidos com infecções graves na UTI neonatal
(Oliveira e Bernal, 2006).
Segundo HYPPOLITO e OLIVEIRA (2005), os aminoglicosídeos provocam danos
como o comprometimento das células ciliadas externas, lesando inicialmente as células da
espira basal da cóclea. A incidência de ototoxicidade causada pela gentamicina varia de 6% a
16%.
Conforme ALBUQUERQUE (2006), estudos em animais têm papel essencial no
desenvolvimento da ciência. Pesquisas experimentais com animais têm sido importantes para
o desenvolvimento de novas drogas, no aprimoramento do conhecimento acerca dos
mecanismos fisiopatológicos de doenças, para empreender ensaios terapêuticos com novos
fármacos, estudar marcadores biológicos e avaliar técnicas com perspectivas de aplicabilidade
na espécie humana.
A realização deste trabalho justifica-se pela importância de pesquisas que contribuam
para um conhecimento mais aprofundado deste tema, possibilitando aos profissionais da
saúde a adoção de procedimentos que busquem a manutenção da integridade auditiva para
uma melhor qualidade de vida
Fundamentado na literatura e procurando conhecer os resultados do uso da
gentamicina em dosagens utilizadas na UTI neonatal, este estudo teve como objetivo verificar
o aspecto funcional das células ciliadas externas da cóclea a esquemas terapêuticos utilizados
para o tratamento de infecções no período neonatal.
METODOLOGIA
Neste experimento foram utilizadas 26 cobaias fêmeas, albinas, pesando em torno de
400 a 550 gramas, com reflexo de Preyer normal. No decorrer deste experimento as cobaias
permaneceram no Laboratório de Técnica Cirúrgica Experimental da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). Os animais foram usados de
acordo com as diretrizes desta instituição que está baseado no guia para o cuidado de animais
de laboratório do Institute of Laboratory Animal Resources, Comission on Life Sciences,
National Research council, National Academy Press, Washington, D. C., 1996. Este estudo
foi aprovado pelo Comitê de Ética em experimentação Animal (CETEA) da FMRP-USP sob
o protocolo 073/2007.
A droga utilizada nesta pesquisa foi o antibiótico aminoglicosídeo gentamicina
(geramicin, 60 mg/ml, Laboratório Schering) administrado por via intramuscular. Os animais
foram pesados a cada dois dias para controle da dosagem da droga. As cobaias foram
submetidas à avaliação por emissões otoacústicas por produto de distorção em cabine com
isolamento acústico e sob anestesia com cloridrato de cetamina (Ketamin 50mg/ml,
Laboratório Cristália,) 40 mg/kg e xilazina (Dopaser 20 mg/ml, Laboratório Calier do Brasil,)
10 mg/kg, pré e pós-aplicação da gentamicina. O equipamento utilizado foi o ILO 92 CAE
System Otodynamics LTD.
As cobaias foram divididas em 5 grupos:
grupo 1 – grupo controle (placebo) – constituído de duas cobaias (quatro cócleas) que
receberam soro fisiológico na dosagem de 2,5 mg/kg/dia de 12 em 12 horas, por via
intramuscular, pelo período de 14 dias;
grupo 2: constituído de 6 cobaias (12 cócleas) que receberam gentamicina na dosagem
de 4 mg/kg/dia pelo período de 10 dias;
grupo 3: constituído de 6 cobaias (12 cócleas) que receberam gentamicina na dosagem
de 4 mg/kg/dia pelo período de 14 dias;
grupo 4: constituído de 6 cobaias (12 cócleas) que receberam gentamicina na dosagem
de 2,5 mg/kg/dia de 12 em 12 horas, pelo período de 10 dias;
grupo 5: constituído de 6 cobaias (12 cócleas) que receberam gentamicina na dosagem
de 2,5 mg/kg/dia de 12 em 12 horas pelo período de 14 dias.
Neste estudo foram consideradas para análise às emissões otoacústicas nas freqüências
a partir de 1500 Hz que avaliam o estado funcional das células ciliadas externas na espira
basal da cóclea, verificando a relação sinal/ruído das emissões. Para análise estatística foi
25
utilizado em primeira instância o teste de normalidade (Shapiro Wilk). Com a não
normalidade dos dados optou-se pelos testes não paramétricos: variáveis dependentes
(Wilcoxon) e independentes (Kruskal Wallis). O nível de significância utilizado foi de 5%.
RESULTADOS
Com relação à dose de Gentamicina utilizada, de 4 mg/Kg/dia, por 10 dias de
tratamento consecutivo (grupo 2), não foram observadas alterações nas emissões otoacústicas
por produto de distorção pré e pós tratamento (Figura 1)
Figura 1: Fotografia da tela do programa ILO 92, mostrando emissões
otoacústicas por produto de distorção de uma das cobaias tratadas com
gentamicina 4 mg/kg/dia por 10 dias – pré (A) e pós (B) tratamento (no dia
do sacrifício).
26
Quanto as emissões otoacústicas no grupo 3, tratados com Gentamicina, 4 mg/Kg/dia,
por 14 dias os resultados pré e pós tratamento estão representados na Figura 2.
Figura 2: Fotografia da tela do programa ILO 92, onde verificou-se a
presença de respostas as emissões otoacústicas por produto de distorção no
grupo 3 (gentamicina 4 mg/Kg/dia por 14 dias) – pré (A) e pós (B)
tratamento – no dia do sacrifício.
Consideraram-se as emissões otoacústicas a partir de 1,5 kHz, pois as dimensões do
conduto auditivo externo da cobaia fazem com que haja uma dificuldade de detecção das
emissões otoacústicas abaixo desta freqüência, obtendo respostas que coincidem com as
respostas do ruído.
27
A Figura 3 evidencia os resultados as emissões otoacústicas no grupo 4, tratado com
Gentamicina 5 mg/Kg/dia, por 10 dias – pré e pós tratamento.
Figura 3: Foto da tela do programa ILO 92, evidenciando as respostas das
emissões otoacústicas por produto de distorção do grupo 4 (gentamicina 5
mg/Kg/dia por 10 dias) pré (A) e pós tratamento (B) - no dia do sacrifício.
A foto da tela do programa ILO-92 onde se verificou a presença de respostas as
emissões otoacústicas por produto de distorção no grupo 5 (gentamicina, 2,5 mg/Kg/dia de 12
em 12 hs, via intraperitoneal) por 14 dias pré e pós tratamento, está representada na figura 4.
28
Figura 4: Foto da tela do programa ILO 92 que mostra as emissões
otoacústicas por produto de distorção pré (A) e pós (B) tratamento com
gentamicina 5mg/Kg/dia por 14 dias.
Em todas as avaliações, o estado funcional das células ciliadas externas, estudadas
pelas emissões otoacústicas por produto de distorção, mostraram-se preservadas.
Os gráficos abaixo mostram a relação sinal/ruído x freqüências entre os grupos em
questão.
29
45
40
Diferença (Sinal/Ruído) - 4mg (10 dias)
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
Direita PRÉ
Direita PÓS
Esquerda PRÉ
Esquerda PÓS
-10
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Freqüência
Figura 5: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 2 (4mg / 10dias).
45
Diferença (Sinal/Ruído) - 4mg (14 dias)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Direita PRÉ
Direita PÓS
Esquerda PRÉ
Esquerda PÓS
Freqüência
Figura 6: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 3 (4mg / 14dias).
30
45
Diferença (Sinal/Ruído) - 5mg (10 dias)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Direita PRÉ
Direita PÓS
Esquerda PRÉ
Esquerda PÓS
Freqüência
Figura 7: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 4 (5 mg / 10dias).
45
Diferença (Sinal/Ruído) - 5mg (14 dias)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Direita PRÉ
Direita PÓS
Esquerda PRÉ
Esquerda PÓS
Freqüência
Figura 8: Relação sinal/ruído x Freqüências do grupo 5 (5 mg/ 14dias).
31
Com relação à análise estatística dos dados apresentados, para comparar a relação
sinal/ruído pré e pós tratamento com gentamicina, entre os grupos 2, 3, 4 e 5, foi utilizado o
teste não paramétrico de Kruskal-Wallis.
O resultado do teste foi p > 0,05 não mostrando diferença estatisticamente significante
entre os grupos.
DISCUSSÃO
Após realizar um experimento utilizando emissões otoacústicas por produto de
distorção em cobaias albinas tratadas com gentamicina, com o objetivo de verificar a
funcionalidade das células ciliadas externas, constatamos que os resultados obtidos
corroboram com os estudos já realizados sobre este tema.
Segundo JACOB et al. (2006), não há dúvidas de que o monitoramento auditivo deve
ser utilizado quando há exposição à medicação ototóxica por meio de procedimentos que
apresentem elevada sensibilidade e especificidade. De acordo com a autora, para o
monitoramento auditivo da população pediátrica, é recomendada a utilização das emissões
otoacústicas as quais permitem constatar alterações auditivas antes que as freqüências mais
significativas para a percepção da fala sejam afetadas, o que pode prevenir dificuldades no
desenvolvimento psicossocial e acadêmico dos indivíduos.
As drogas ototóxicas podem potencialmente alterar a biomecânica coclear afetando a
audição (Oliveira et al. 2002). O teste de emissões otoacústicas é importante por avaliar a
função das células ciliadas externas ao longo do órgão de Corti, possibilitando uma
identificação tonotópica da lesão às células ciliadas cocleares. É útil para monitorar os estados
de risco para a audição (Munhoz et al., 2000).
De acordo com AMATUZZI et al. (2005), a incidência de perda auditiva
sensorioneural em recém-nascidos tratados em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) é de 2%
a 4%, cerca de 13 vezes maior que em recém nascidos normais. Os fatores de risco para perda
auditiva, como infecções congênitas, anoxia neonatal, hiperbilirrubinemia e uso de ototóxicos
têm sido estudados por autores como Kountakis et al. (2002) e Hoog et al. (2003).
McCracken (1986) apud Matz (1993) avaliou o potencial ototóxico dos
aminoglicosídeos estreptomicina, kanamicina e gentamicina em sete estudos prospectivos
com mais de 1300 recém-nascidos. Os resultados indicaram que o risco dos recém-nascidos
desenvolverem clinicamente uma significante alteração auditiva após 3 a 7 dias do uso da
gentamicina é muito pequeno. O referido autor concluiu que os aminoglicosídeos têm sido
32
utilizados com um grau elevado de segurança e eficácia em neonatos e crianças por mais de
duas décadas, o que está de acordo com os achados nesse experimento.
No estudo de AGARWAL et al. (2002), conduzido na Unidade de Terapia Intensiva
Neonatal do Cook Country Children’s Hospital IL, Chicago em 1999, foi comparada a
farmacocinética da gentamicina 4 mg/Kg dose diária única com 2,5 mg/Kg a cada 12 horas
em crianças com idade menor a 7 dias. Todas as crianças passaram por uma triagem auditiva
usando o equipamento ALGO Natus. Os resultados foram distribuídos como Passou/Falhou
em cada orelha. A sensibilidade dos resultados é de 98% e a especificidade de 96%. Todas as
crianças passaram por um teste de acuidade auditiva antes da alta hospitalar. Neste estudo os
autores concluíram que uma dose diária de 4 mg/Kg de Gentamicina apresentou um pico de
concentração sérica significativamente maior, seguro e constante em todas as crianças
comparada com o esquema de duas doses diárias de 2,5 mg/Kg de 12 em 12 horas.
Conforme TRAN Ba HUY (1983), a gentamicina ganha os tecidos da orelha interna
após sua administração sistêmica em concentrações que não excedem sua concentração
plasmática, portanto não sendo ativamente acumulada na orelha interna. Sua concentração é
menor na endolinfa que na perilinfa. Em aproximadamente 12 horas a gentamicina
administrada sistemicamente atinge os líquidos da cóclea, levando em torno de 24 dias para a
redução de seus níveis significativamente.
A polaridade positiva do potencial endococlear parece favorecer a entrada de
substâncias catiônicas como a gentamicina na escala média da cóclea. A comunicação entre o
sistema vascular e os fluídos cocleares ocorre dos leitos capilares do ligamento espiral e stria
vascularis da parede lateral da cóclea. As escalas vestibulares e timpânicas comunicam-se
prontamente com os espaços do ligamento espiral, sendo que o espaço endolinfático pode ser
atingido pela passagem indireta de drogas catiônicas das escalas vestibulares e timpânica e
diretamente pela stria vascularis (Salt et al., 1991).
Conforme MARTINS (2005) em seus estudos, quanto a duração do tratamento da
septicemia neonatal, é recomendado um período variável de sete a 14 dias para os esquemas
terapêuticos clínicos. Com as doses propostas neste experimento, não encontramos alterações
significativas na relação sinal/ruído das EOAPD, sem alteração significativa na amplitude das
mesmas, o que está em concordância com o que é mostrado na literatura.
A literatura ainda é insuficiente para explicar completamente os efeitos ototóxicos de
drogas como a gentamicina, principalmente em neonatos. Fatores de risco pré e perinatais
associados ao uso de drogas ototóxicas, alterações do “clearance” renal e associação com
múltiplas outras drogas aumentam o potencial de toxicidade da gentamicina.
33
A pesquisa otológica freqüentemente exige o uso de modelos experimentais,
principalmente cobaias e ratos devido à facilidade de manejo e similaridade com a orelha
humana (Albuquerque, 2006). É importante ressaltar que o resultado deste estudo se reserva à
amostra estudada (cobaias albinas), pois, conforme SALT (2005), a interpretação de estudos
experimentais, muitas vezes é complicada pela diferença entre as dimensões cocleares dos
seres humanos e da maioria dos animais experimentais, o que deve ser considerado.
Uma diversidade de estudos experimentais têm sido propostos para encontrar terapias
menos tóxicas e meios de prevenção eficientes na proteção da cóclea contra agressão por
agentes químicos e físicos (Oliveira et al. 2002). De maneira semelhante no presente
experimento, foram considerados os aspectos de segurança na utilização de antibióticoterapia.
CONCLUSÃO
Neste experimento não foram observadas alterações no funcionamento das células
ciliadas externas de cobaias albinas sob tratamento com gentamicina nas doses de 4
mg/Kg/dia e 2,5 mg/Kg/dia a cada 12 hs, por 10 e 14 dias.
Agradecimentos:
Laboratório de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental do Departamento de
Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Biologia Celular
Molecular e Bioagentes da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.
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4 ARTIGO DE PESQUISA
ESTUDO ANATÔMICO DA COCLEOTOXICIDADE DA GENTAMICINA A DOSES
HABITUIAS UTILIZADAS EM RECÉM-NASCIDOS
MORFOLOGIC STUDY OF COCHLEOTOXICITY TO GENTAMICIN IN NEONATES
USING HABITUAL DOSES
RESUMO
A gentamicina é um antibiótico que atua nas infecções causadas por bacilos Gramnegativos. Seu efeito colateral mais importante é a ototoxicidade. As ototoxicoses são
afecções iatrogênicas provocadas por fármacos que alteram a orelha interna, podendo afetar o
sistema coclear e/ou vestibular, alterando duas funções importantes: a audição e o equilíbrio.
Os principais grupos pediátricos que recebem antibióticos aminoglicosídeos são recémnascidos com infecções graves na UTI neonatal. Objetivos: verificar a ocorrência de lesão às
células ciliadas externas (CCE) pela gentamicina com os esquemas de dose única de 4
mg/Kg/dia e de 2,5 mg/Kg/dia a cada 12 horas, por meio de um estudo anatômico por
microscopia eletrônica de varredura (MEV) e estudo funcional através das emissões
otoacústicas por produto de distorção (OEAPD). Forma de Estudo: Experimental. Material
e Métodos: Foram avaliadas 26 cobaias albinas através das EOAPD pré e pós-tratamento com
gentamicina. Para a avaliação anatômica por MEV, as cobaias foram sacrificadas em tempo
programado após a administração das drogas via intramuscular. Resultados: A avaliação do
estado funcional das CCE mostrou preservação das OEAPD em todas as cobaias. Os
resultados da MEV, depois de fotografados foram analisados através da contagem do número
de CCE da espira basal da cóclea em determinado campo fotográfico. Conclusão: Não foram
observadas lesões ou alterações no funcionamento das células ciliadas externas mediante a
dosagem aplicada em cobaias albinas, de 4 mg/Kg/dia (dose única) e 2,5 mg/Kg/dia a cada 12
horas, utilizadas por 10 e 14 dias.
PALAVRAS-CHAVE: gentamicina, microscopia eletrônica de varredura, toxicidade
37
ABSTRACT
Gentamicin is an antibiotic that acts in Gram-negative bacilli infections. Its most
important side effect is the ototoxicity. Ototoxicity is an iatrogenic disturb provoked by drugs
that modify the internal ear, and they can affect the cochlear and/or vestibular system even
changing two important functions: equilibrium and audition. The main pediatric groups that
receive aminoglicosides antibiotics are new borns with serious infections in Neonate’s
intensive care unit. Goals: to verify the lesion occurrence to the external ciliary cells (CCE)
by gentamicin with the one dose schemas 4 mg/kg/day and 2,5 mg/kg/day in each 12 hours,
through an anatomic study by electronic microscopy (MEV) and function study through
otoacustic emissions distortion product (OEAPD). Way of Study: Experimental. Material
and Method: 26 albino guinea pigs have been studied through OEAPD pre and pos treatment
with gentamicin. The guinea pigs were sacrificed in the programmed time after the
intramuscular administration of the drugs in order to anatomic evaluation by MEV. Results:
the evaluation of the functional state of the CCE had shown presence of the OEAPD in all of
the guinea pigs. The MEV results, after it has been photographed were analyzed through
count of the number of the CCE in cochlear basal turn to a specific photographic field.
Conclusion: It has not been observed injuries or changes on the functions of external ciliary
cells due to the a dose of 4 mg/Kg/day and 2,5 mg/Kg/day for each 12 hours in 10 and 14
days for albino guinea-pigs.
KEY-WORDS: gentamicin, electronic microscopy, drug toxicity
INTRODUÇÃO
A gentamicina é um antibiótico de ação bactericida que atua principalmente nas
infecções causadas por bacilos Gram-negativos. É o primeiro aminoglicosídeo de escolha por
causa do baixo custo e por ser ativo na maioria dos bacilos Gram-negativos aeróbicos
resistentes (Chambers e Sande, 1995).
O efeito colateral mais importante e sério é a ototoxicidade, que ocorre em 2% das
pessoas que recebem gentamicina e que pode ser grave. Os pacientes em tratamento com
gentamicina devem ter as funções auditivas e vestibulares controladas em intervalos
freqüentes (Trabulsi e Soares, 1998).
As ototoxicoses são afecções iatrogênicas provocadas por fármacos que alteram a
orelha interna (labirinto). Essas substâncias podem afetar o sistema coclear, o sistema
vestibular, ou ambos, alterando duas funções importantes do organismo: a audição e o
equilíbrio respectivamente. Ocorre ototoxicose quando há perda auditiva neurossensorial de
mais de 25 dB em uma ou mais freqüências de 250 a 8000 Hz e, ou quando ocorrem
manifestações vestibulares como vertigem, ou desequilíbrio. Dos grupos de fármacos
ototóxicos, os antibióticos aminoglicosídeos são os mais estudados (Hyppolito e Oliveira,
2005; Oliveira e Bernal, 2006). Dentre os aminoglicosídeos, a gentamicina é considerada um
dos antibióticos mais potentes do grupo.
A toxicidade da gentamicina depende de alguns fatores, tais como: dosagem,
intolerância individual, potenciação de efeitos de outras drogas, idade, alterações renais e
indivíduos que já apresentam problemas auditivos anteriores (Ganança et al., 1997).
Os principais grupos pediátricos que recebem antibióticos aminoglicosídeos são
recém-nascidos com infecções graves na UTI neonatal (Oliveira e Bernal, 2006).
A perda auditiva bilateral apresenta elevada incidência, ocorrendo em cerca de três
para cada 1.000 nascidos vivos, e de dois a quatro para cada 100 recém-nascidos egressos de
unidade de terapia intensiva (UTI) neonatal (Lima et al., 2006).
Tendo em vista alterações auditivas causadas pela sua utilização, é importante a
monitorização da audição em pacientes usuários de drogas ototóxicas, para determinar a
progressão da ototoxicidade e quando ela se inicia (Dishtchekenian et al., 2000).
O monitoramento deve ser realizado porque providencia evidências precoces do limite
da dose para perdas auditivas, levando à possibilidade de prevenção ou redução da severidade
da ototoxicidade e, quando instalada a perda auditiva, há possibilidade de reabilitação auditiva
com a adaptação do aparelho de amplificação sonora (Jacob et al., 2006).
39
Conforme HYPPOLITO e OLIVEIRA (2005), os aminoglicosídeos provocam danos
como o comprometimento das células ciliadas externas, lesando inicialmente as células da
espira basal da cóclea. A incidência de ototoxicidade pela gentamicina varia de 6% a 16%.
As emissões otoacústicas, detectadas por Kemp (1978) no conduto auditivo externo de
humanos, medem o “feedback” da energia biomecânica na contração das células ciliadas
externas, que amplifica o pico da “onda viajante” na membrana basilar e têm aplicação clínica
na avaliação da integridade auditiva, refletindo a funcionalidade das células ciliadas externas,
sendo o único meio não-invasivo de investigação coclear objetivo (Hyppolito, 2003).
Sendo as alterações cocleares irreversíveis e tendo como seqüelas as perdas auditivas
neurossensorias, a forma de impedí-las seria a prevenção (Hyppolito e Oliveira, 2005).
A preocupação com o diagnóstico precoce da deficiência auditiva tem sido uma
constante, pois estudos já relataram prejuízos causados por essa deficiência muitas vezes
irreversíveis, afetando não apenas a linguagem, mas também o desenvolvimento global da
criança. [Uchôa et al., (2003); Hoog (2003); Kountakis (2002); Jacob (2006); Lima (2006)]
Neste sentido, a realização deste trabalho justifica-se pela importância de pesquisas
que contribuam para um conhecimento mais aprofundado deste tema, possibilitando aos
profissionais da saúde a adoção de procedimentos que busquem a manutenção da integridade
auditiva para uma melhor qualidade de vida.
Fundamentado na literatura e procurando conhecer os resultados do uso da
gentamicina em dosagens utilizadas na UTI neonatal, este estudo teve como objetivo verificar
a ocorrência de lesão das células ciliadas externas pela gentamicina com os esquemas de dose
única de 4 mg/Kg/dia como recomendada por YOUNG E MANGUM (2006) na NEOFAX
(um manual de neonatologia usado como referência) comparada ao esquema tradicional de
2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas (Agarwal et al., 2002), por meio de estudo funcional através
das emissões otoacústicas por produtos de distorção e um estudo anatômico por microscopia
eletrônica de varredura.
Assume importância efetiva a verificação dos possíveis efeitos ototóxicos realizada no
presente estudo, pois esse procedimento tem sido adotado e pesquisado por outros autores,
como SHA e SCHACHT (1999), OLIVEIRA et al. (2004) e MAUDONNET (2005).
40
REFERENCIAL LITERÁRIO
A necessidade do emprego dos antibióticos aminoglicosídeos por períodos
prolongados de tempo para o adequado tratamento da tuberculose propiciou o aparecimento
de efeitos colaterais principalmente relacionados com a nefro e ototoxicidade. A incidência e
intensidade dos fenômenos ototóxicos dependem da via de administração, da dose e da
duração do tratamento (Grellet et al., 1974).
Os antibióticos aminoglicosídeos demonstraram ser altamente eficaz, e seriam mais
utilizados não fosse a sua peculiar capacidade de danificar o rim e a orelha interna.
Esta predileção ototóxica dos aminoglicosídeos está relacionada com o modo particular de
concentração e excreção destas substâncias nos líquidos da orelha interna. Estes antibióticos
permanecem por muito mais tempo em concentração elevada na endolinfa e sua eliminação
ocorre independente da sua excreção em nível plasmático (Cruz et al., 1985).
Segundo SCHWEITZER (1993), o monitoramento audiológico deve fazer parte do
protocolo de atendimento aos indivíduos expostos a agentes ototóxicos, o que poderá
possibilitar uma prevenção ou redução da severidade da ototoxicidade. Outro motivo é que,
quando o tratamento por meio de uma droga ototóxica for indispensável, o paciente, a partir
do monitoramento e detecção precoce de alguma alteração auditiva, poderá fazer o uso de
algum método de reabilitação.
BRICKS et al. (1994) mencionaram que na última década, a sobrevivência de crianças
muito prematuras, com peso de nascimento inferior a 1000 g, tem despertado um maior
interesse sobre o uso terapêutico e a ação de drogas e agentes físicos no período neonatal. Os
fármacos causam diversos graus de dano coclear, mas a lesão típica das células ciliadas
cocleares é comum a todos os agentes ototóxicos. O maior dano ocorre sobre as células
cocleares responsáveis pelos sons de alta freqüência. Sabe-se que para estabelecer um
tratamento adequado, há necessidade de um conhecimento preciso sobre a ação fisiológica e
fisiopatológica das drogas, mas os estudos em seres humanos, especialmente em recémnascidos prematuros de muito baixo peso (RNPT-MBP), são difíceis de se obter e sua
interpretação é extremamente complexa.
Segundo CHAMBERS e SANDE (1995), o sulfato de gentamicina é disponível em
várias formas: frascos e seringas, injeção intratecal, pomada e creme, pomada oftálmica. A
dose intramuscular ou intravenosa para adultos é de 2 mg/Kg aumentando a dose para 3 a 5
mg/Kg por dia, sendo 1/3 administrado a cada oito horas. Inúmeras doses foram sugeridas
para lactentes, mas a dosagem de 2 a 2,5 mg/Kg a cada oito horas tem se mostrado segura
41
para crianças acima de 2 anos; a dose de 5 mg/Kg fracionadas em duas doses em intervalos
iguais tem sido recomendada para neonatos com infecções graves. Uma única dose diária
administrada sozinha em infusão de 30 a 60 minutos também tem sido utilizada.
A descoberta da gentamicina em 1963, por Weinstein, foi um grande marco na história
dos aminoglicosídeos porque, além de sua tolerabilidade razoável, é ativa contra muitas
espécies bacterianas. Todos os aminoglicosídeos são potencialmente tóxicos para o labirinto
anterior e posterior. A disfunção auditiva pode manifestar-se gradualmente, com zumbidos
discretos e perda da audição para sons de alta freqüência, mas se tais sintomas forem
negligenciados, poderá instalar-se surdez eventualmente completa. Os efeitos ototóxicos dos
aminoglicosídeos dependem da dose, duração da terapêutica, estado do paciente (função
renal, idade, suscetibilidade individual) e características da droga. (Trabulsi e Soares, 1998).
De acordo com DISHTCHEKENIAN et al. (2000), a deficiência auditiva tem sido
considerada uma doença severamente incapacitante, em virtude do papel da audição na
comunicação humana. Esta pode ser causada por diversos fatores etiológicos, congênitos ou
adquiridos, além de apresentar graus e tipos variados. Uma das causas da deficiência auditiva
adquirida é o uso de drogas ototóxicas. Essas drogas lesam as estruturas sensoriais da orelha
interna, podendo afetar tanto o sistema auditivo quanto o vestibular.
Existem diferentes métodos para avaliar a audição em animais experimentais. O
primeiro método, utilizando o reflexo de Preyer, foi descrito em 1882 com uma técnica de
avaliação da audição em cobaias. Esta técnica simples envolve a administração de um
estímulo sonoro alto como bater as palmas ou apresentação de um som metálico, seguida da
observação da reação reflexa do animal, movimentação do pavilhão auricular e piscar dos
olhos. A observação do reflexo de Preyer é usada principalmente para determinar se a cobaia
tem uma resposta auditiva ou não (Jero et al., 2001).
Denes e Kocker em 1961 apud
OLIVEIRA et al. (1977), concluíram em seus estudos que a medida do reflexo de Preyer era
um teste de confiança para uma avaliação quantitativa da audição, desde que fosse excluído o
alto grau de reverberação que existe na maioria das salas comuns.
HOPMAN et al. (2002), relataram que a ototoxicidade refere-se ao prejuízo
quimicamente induzido às porções da orelha interna, lesando as células ciliadas do órgão de
Corti e das máculas e cristas do sistema vestibular, resultando em diversos graus de perda
auditiva neurossensorial e vertigem.
Segundo ZOCOLI et al. (2003), a ototoxicidade é definida como a perda parcial ou
total da função vestibular e/ou coclear em decorrência do uso de drogas, geralmente com
finalidades terapêuticas ou por exposição a substâncias tóxicas e o grau de severidade
42
depende da predisposição individual, dose, duração do tratamento, via de administração,
idade, tendência familiar e/ou de eventual dano prévio à orelha interna. Este estudo corrobora
com KÓS e KÓS (1998) que referem que ototoxicidade depende de alguns fatores como a
predisposição individual, e a presença de insuficiência renal, que pode permitir o acúmulo do
medicamento na corrente circulatória.
ROCHA et al. (2003), referiram que os recém-nascidos internados na unidade de
cuidados intensivos são majoritariamente prematuros (idade gestacional inferior a 31
semanas). As técnicas utilizadas no tratamento destes pacientes e os riscos obstétricos
inerentes parecem estar associados com o aumento do risco infeccioso. A gentamicina é
freqüentemente usada no tratamento e prevenção de sépsis neste grupo de recém-nascidos.
Nossa audição assume papel importante na comunicação humana. A deterioração da
sensibilidade auditiva pode acarretar uma série de alterações psicossociais no indivíduo, uma
vez que a perda da compreensão da fala significa romper uma forma de contato com o mundo
e com as pessoas (Jacob et al. 2005).
A ototoxicidade de algumas drogas pode ser estudada em cobaias Segundo
HYPPOLITO et al. (2003), as cobaias albinas foram escolhidas pelo fácil manejo, pela
facilidade de dissecção coclear e manipulação, facilidade para vias de infusão para as drogas
anestésicas e drogas em experimentação, pela via intraperitoneal ou intramuscular, e por
serem mais sensíveis à droga estudada.
Conforme OLIVEIRA e BERNAL (2006), dos grupos de fármacos ototóxicos, os
antibióticos aminoglicosídeos são os mais estudados. Na fase aguda, essas substâncias,
combinam-se com os receptores das membranas das células ciliadas externas do órgão de
Corti, ou das máculas sacular e utricular e cristas do sistema vestibular. Quando ocorre lesão
coclear, há destruição das células ciliadas do órgão de Corti e a perda auditiva é irreversível,
não havendo tratamento. Nesses casos, dependendo do grau de hipoacusia, o paciente deverá
ser submetido à reabilitação da audição e da linguagem. Sendo assim, a única possibilidade de
defesa contra a seqüela da ototoxicidade por aminoglicosídeos é a prevenção.
De acordo com ALBUQUERQUE (2006), estudos em animais têm papel essencial no
desenvolvimento da ciência. Pesquisas experimentais com animais têm sido importantes para
o desenvolvimento de novas drogas, no aprimoramento do conhecimento acerca dos
mecanismos fisiopatológicos de doenças, para empreender ensaios terapêuticos com novos
fármacos, estudar marcadores biológicos e avaliar técnicas com perspectivas de aplicabilidade
na espécie humana.
43
METODOLOGIA
Neste estudo, foi escolhido como animal experimental cobaias albinas, pelo fácil
manejo, pela facilidade de dissecção coclear e manipulação, facilidade para vias de infusão
para as drogas anestésicas e da droga em experimentação pela via intramuscular.
Com a cobaia pode-se manter adequados cuidados, seguindo as diretrizes baseadas no
guia para os cuidados e uso de animais de laboratório do Institute of Laboratory Animal
Resources, comission on life sciences, National Research Council, National Academy Press,
Washington, DC. (1996). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal (CETEA) da FMRP-USP sob o protocolo 073/2007. Os animais foram mantidos no
biotério da Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – USP.
Para este estudo foram utilizadas 26 cobaias albinas (Cavia porcellus – linhagem
Inglesa) pesando entre 400 e 500 gramas. Os animais foram selecionados do biotério central
da Universidade de São Paulo – Campus Ribeirão Preto, através da pesquisa do reflexo de
Preyer (Jero et al., 2001).
As cobaias foram submetidas a uma triagem auditiva por emissões otoacústicas por
produto de distorção em cabine com isolamento acústico e sob anestesia com Ketamina (65
mg/Kg). Aquelas que apresentaram emissões otoacústicas por produto de distorção presentes
foram consideradas para o experimento.
As cobaias foram divididas em cinco grupos de estudo:
Grupo 1: controle - 2 animais – 4 cócleas - soro fisiológico 2,5 mg/Kg/dia de 12 em
12 horas (via intramuscular) por 14 dias.
Grupo 2: 6 animais – 12 cócleas – gentamicina 4 mg/Kg/dia em dose única (via
intramuscular) por 10 dias.
Grupo 3: 6 animais – 12 cócleas – gentamicina 4 mg/kg/dia em dose única (via
intramuscular) por 14 dias.
Grupo 4: 6 animais – 12 cócleas – gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12/12 horas (via
intramuscular) por 10 dias.
Grupo 5: 6 animais – 12 cócleas – gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12/12 horas (via
intramuscular) por 14 dias.
As emissões otoacústicas foram realizadas no início do tratamento e antes dos animais
serem sacrificados para os estudos em Microscopia Eletrônica.
44
O teste de emissões otoacústicas por produto de distorção foi realizado pré-tratamento
e pós-tratamento, ou seja, momentos antes dos animais serem sacrificados, seguindo a relação
de freqüência 2F1-F2 com relação F1:F2 = 1,22, resolução 2 pontos por oitava. O
equipamento utilizado foi: ILO 92 CAE System Otodynamics LTD.
Foram consideradas as emissões otoacústicas a partir de 1,5 kHz, pois as dimensões do
conduto auditivo externo da cobaia fazem com que haja uma dificuldade de detecção das
emissões otoacústicas abaixo desta freqüência, obtendo respostas que coincidem com as
respostas do ruído.
Assim, foi observado o chamado “DPGRAM”, o audiococleograma, onde se tem um
estímulo que é o som e uma resposta que também é um som e que fornece a função das
células ciliadas externas cocleares responsáveis pelas freqüências analisadas (Lopes Filho, et
al, (1995)).
Neste estudo, consideramos como mais importante as emissões otoacústicas nas
freqüências mais agudas que avaliam o estado funcional das células ciliadas externas na espira
basal da cóclea, no entanto, a avaliação é qualitativa. Foram consideradas as emissões
otoacústicas por produto de distorção como presentes e ausentes.
Para a avaliação anatômica por Microscopia Eletrônica de Varredura, as cobaias foram
sacrificadas em tempo programado após a administração das drogas via intramuscular.
As cobaias foram anestesiadas com cloridrato de cetamina (Ketamin 50mg/ml,
Laboratório Cristália,) 40 mg/kg e xilazina (Dopaser 20 mg/ml, Laboratório Calier do Brasil,)
10 mg/kg e depois sacrificadas pelo método de decapitação.
Seus ossos temporais contendo as bulas timpânicas foram rapidamente removidos e
abertos para a exposição da cóclea.
Os ossos temporais foram abertos com uma tesoura forte de dissecção, que foi
colocada na coluna cervical posteriormente fazendo-se um corte no crânio no sentido
longitudinal mediano estendendo-se posteriormente às orelhas. Depois, usando as mãos, tendo
o conduto auditivo externo como orientação, a bula foi localizada com os polegares e num
movimento de dentro para fora foi separada das outras estruturas e com ela presa entre os
dedos foi sendo torcida num movimento suave para que os tecidos se soltassem e a
liberassem.
A bula foi aberta segurando-a com uma das mãos e com uma pinça hemostática
delicada foi realizada uma abertura no sinus aéreo posterior (mastóide) seguindo pela sua
saliência até a ponta do rochedo. Em seguida, posicionando a pinça no conduto auditivo
45
externo e sinus aéreo anterior, num só movimento foi quebrada e levantada toda parte óssea
da bula expondo a cóclea.
O material foi fixado injetando-se lentamente glutaraldeído 3%, através de uma
abertura feita no ápice da cóclea e da janela redonda e permaneceram em imersão por 4 horas
a 4°C. O material foi lavado várias vezes em solução tampão fosfato 0,1M e submetido à
microdissecção para exposição das espiras cocleares.
Os passos seguintes foram realizados no Laboratório de Microscopia Eletrônica do
Departamento de Morfologia da FMRP-USP.
Após a fixação com glutaraldeído 3% e lavagem com solução tampão 0,1M, as cócleas
foram refixadas em solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato 0,1M por 2 horas
a 4°C, e depois, lavadas seguidamente em tampão fosfato 0,1M e pH de 7,3.
Logo após foi feita a desidratação das estruturas através de banhos de etanol em
concentrações crescentes de 50, 70, 90 e 95%, durante cerca de 10 minutos cada. A seguir
utilizou-se o etanol 100% em três banhos de 20 minutos cada, deixando-se no último banho as
estruturas imersas à temperatura ambiente por 12 horas.
A água ainda presente no material após a desidratação foi removida no processo de
secagem, realizado pelo método do ponto crítico com dióxido de carbono (CO2) líquido. A
amostra contida em um recipiente adequado foi transferida para a câmara de secagem do
aparelho de ponto crítico (BAL-TEC-CPD 030 – Critical Point Dryer) onde, através de
sucessivos banhos com dióxido de carbono líquido a 4°C, o etanol foi eliminado. Depois de
completamente retirado o etanol, o material foi submetido a um aumento da temperatura até
40°C para que o dióxido de carbono passasse do estado líquido para o estado gasoso, o que
acontece a 31°C – ponto crítico.
Com o material seco foi realizada a montagem das cócleas em porta-espécime
cilíndrico (stubs) metálico com pasta condutiva de carbono.
Os materiais biológicos são maus condutores de eletricidade e calor, e não podem ser
observados à microscopia eletrônica de varredura, a menos que transformados em materiais
eletricamente condutivos. Utiliza-se para tal a cobertura destes materiais com uma fina
camada de ouro aplicado com o vaporizador (BAL-TEC SCD 050 – Sputter Coater).
Foi utilizado o Microscópio Eletrônico JEOL SCANNING MICROSCOPE – JSM
5200 para visualização do material.
Os resultados da microscopia eletrônica de varredura, depois de fotografados foram
analisados através da contagem do número de células ciliadas externas da espira basal da
cóclea em determinado campo fotográfico.
46
RESULTADOS
Na análise dos resultados, desconsideramos o ápice para avaliação anatômica por dois
motivos: primeiro por se tratar de uma região da cóclea responsável pelos sons graves,
sabendo-se que a gentamicina compromete os sons agudos e outro, que foi o fator
determinante, é de que o ápice da cóclea mostra um padrão habitual de desarranjo, mesmo em
cobaias normais, que não foram submetidas à lesão por ototóxicos ou trauma acústico.
A avaliação do estado funcional das células ciliadas externas estudadas pelas emissões
otoacústicas por produto de distorção, mostrou preservação da resposta em todas as cobaias
de todos os grupos.
Com relação à dose de gentamicina utilizada, 4 mg/Kg/dia por 10 dias de tratamento
consecutivo (grupo 2), observamos à microscopia eletrônica de superfície a presença de
células ciliadas externas na espira basal, espira 2 (E2), espira 3 (E3) da cóclea, sendo estas
presentes em todas as fileiras (Figura 9). Não foram observadas alterações nas emissões
otoacústicas por produto de distorção pré e pós-tratamento (Figura 10).
Figura 9: Foto de Microscopia Eletrônica de Varredura com aumento de (500X) da espira basal da cóclea de uma
das cobaias tratadas com Gentamicina 4 mg/Kg/dia por 10 dias – pós tratamento (no dia do sacrifico)
47
Figura 10: Fotografia da tela do programa ILO 92, mostrando as emissões
otoacústicas por produto de distorção de uma das cobaias tratadas com
gentamicina 4 mg/Kg/dia por 10 dias, pré (A) e pós (B) tratamento (no dia do
sacrifício).
No grupo tratado com 4 mg/Kg/dia por 14 dias (grupo 3), todas as células ciliadas
externas estavam presentes em todas as fileiras e em todas as espiras. (Figura 11). Na
avaliação da funcionalidade das células ciliadas externas através das emissões otoacústicas,
verifica-se a presença destas pré e pós-tratamento. (Figura 12)
48
Figura 11: Foto de Microscopia Eletrônica de Varredura da espira basal da cóclea de cobaia tratada com 4
mg/Kg/dia por 14 dias de gentamicina, com presença de células ciliadas externas em todas as fileiras (aumento
de 350 X).
49
Figura 12: Foto da tela do programa ILO 92 onde verificamos a presença de
resposta ás emissões otoacústicas por produto de distorção no grupo tratado
com gentamicina 4 mg/Kg/dia por 14 dias, pré (A) e pós (B) tratamento (no
dia do sacrifício).
No grupo tratado com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 hs por 10 dias, notouse a presença de todas as células ciliadas externas na espira basal e sem distorção dos cílios
tanto nas células ciliadas externas quanto nas internas (figura 13). Quanto às emissões
otoacústicas deste grupo, os resultados estão representados na Figura 14. Estas estiveram
presentes em todas as orelhas testadas.
50
Figura 13: Microscopia Eletrônica de Varredura da cóclea de uma das cobaias tratadas com gentamicina 2,5
mg/Kg/dia de 12 em 12 horas por 10 dias consecutivos.
51
Figura 14: Foto da tela do programa ILO 92 onde se verificou a presença de
respostas as emissões otoacústicas por produto de distorção no grupo tratado
com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia por 10 dias, pré (A) e pós) tratamento (no
dia do sacrifício).
O grupo tratado com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas, não apresentou
alteração das células ciliadas externas em nenhuma das espiras após o tratamento por 14 dias
(Figura 15). As emissões otoacústicas mostraram-se presentes neste grupo (Figura 16).
52
Figura 15: Foto de Microscopia Eletrônica de Varredura da espira basal da cóclea do grupo tratado com
gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas por 14 dias.
53
:
Figura 16: Foto da tela do programa ILO 92 indicando a presença das
emissões otoacústicas por produto de distorção pré (A) e pós (B) tratamento
com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas por 14 dias.
DISCUSSÃO
As emissões otoacústicas por produto de distorção foram utilizadas neste estudo, por
ser um método simples e representativo do estado funcional das células ciliadas externas, as
quais, segundo a bibliografia consultada, podem sofrer os possíveis efeitos de ototoxicidade
da gentamicina.
Decidiu-se estudar os efeitos da gentamicina nas células ciliadas externas de cobaias
albinas devido a alguns estudos de autores como TRABULSI e SOARES (1998); OLIVEIRA
54
e BERNAL (2006); ROCHA et al. (2003) que afirmaram que entre os antibióticos
aminoglicosídeos, por suas ações contra muitas espécies de bactérias, a gentamicina é o mais
utilizado em recém nascidos. Autores como GRELLET et al. (1974) e CRUZ et al. (1985),
também referiram-se à eficácia dos antibióticos aminoglicosídeos usados no tratamento contra
bacilos Gram-negativos.
Segundo HARRISON apud OLIVEIRA 2002, a microscopia eletrônica de varredura,
método bastante utilizado em estudos da ototoxicidade, permite um estudo minucioso do
órgão de Corti normal e alterado, ao nível da cóclea. Na nossa pesquisa foi realizado um
estudo experimental com animais para se obter um conhecimento mais abrangente sobre os
possíveis efeitos ototóxicos da gentamicina, pesquisando aspectos específicos vistos em
microscopia eletrônica de varredura sobre as células envolvidas diretamente com a audição, o
que serve de alicerce aos achados clínicos.
Concordamos com JACOB et al. (2005), quando a referida autora enfatiza o papel de
relevância da audição na comunicação humana, embora tenhamos utilizado uma metodologia
diferenciada em nosso trabalho.
Autores como HOPMAN et al. (2002), relataram a ototoxicidade quanto aos prejuízos
induzidos às células ciliadas do órgão de Corti, das máculas e das cristas ampulares. Já
OLIVEIRA e BERNAL (2006), caracterizaram a ototoxicidade em fase aguda sobre as
células citadas pelos autores anteriores, só que chamam a atenção para a ocorrência de lesão
coclear que causa perda auditiva irreversível. Porém no nosso experimento, observamos a
ausência dos efeitos ototóxicos como perda de função coclear, ou vestibular, segundo a
descrição de Zocoli et al., (2003).
A utilização de cobaias albinas demonstrou ser a conduta acertada para o estudo de
ototoxicidade da gentamicina pelo fácil manejo, dissecção coclear acessível, adequação para
aplicação da droga e sensibilidade ao medicamento em verificação, a exemplo do que
utilizaram HYPPOLITO et al. (2003).
No presente estudo considerou-se o uso da gentamicina em dosagens utilizadas na UTI
neonatal e extrapoladas para as cobaias para que tornasse possível avaliar a segurança no
emprego desse antibiótico aminoglicosídeo, alicerçando-se como referencial para os possíveis
efeitos ototóxicos, como também foi a preocupação de BRICKS et al. (1994) sobre o uso
terapêutico e a ação de drogas em seres humanos, principalmente em crianças recém nascidas.
No entanto ao trabalhar-se com animais experimentais, como também o fez
ALBUQUERQUE (2006) para avaliar técnicas com perspectivas de aplicabilidade na espécie
humana, foi possível avançar em achados significativos, principalmente, aqueles
55
microscópicos e não considerando outras variáveis da utilização de diferentes doses
[Chamber’s e Sande (1996); Trabulsi e Soares (1998); Kós e Kós (1998) e Zocoli et al.
(2003)].
Todos os aminoglicosídeos apresentam toxicidade coclear e vestibular, no entanto,
existe uma seletividade tóxica. A estreptomicina e a gentamicina têm uma toxicidade
predominantemente vestibular e a canamicina e amicacina são predominantemente
cocleotóxicas (Oliveira, 1998; Oliveira e Bernal, 2006).
Segundo autores como OLIVEIRA et al. 1977; MATZ, 1993, a associação com outras
drogas potencialmente ototóxicas, principalmente os diuréticos de alça (ácido etacrínico)
potencializam os efeitos ototóxicos dos aminoglicosídeos e dos próprios diuréticos. Acreditase que os aminoglicosídeos atuem nas membranas celulares da orelha interna aumentando a
sua permeabilidade e facilitando a entrada e toxicidade destes diuréticos. Cabe ressaltar que
no nosso experimento não foi realizada a administração de outras drogas associada à
gentamicina.
Para autores como OLIVEIRA e BERNAL (2006), os danos à orelha interna ocorrem
predominantemente na espira basal, seguindo para a apical com comprometimento maior a
primeira fileira de CCE, com posterior extensão para as CCI, estria vascular, ligamento
espiral e membrana de Reissner. No experimento por nós realizado, não foi encontrado
nenhum dano em nenhuma das espiras da orelha interna.
Segundo SCHACHT (1993), os aminoglicosídeos, alterando a permeabilidade da
membrana das CCE, acarretam comprometimento da síntese de proteínas, DNA, RNA,
metabolismo energético mitocondrial, transporte iônico, síntese ou degeneração de
prostaglandinas, mucopolissacarídeos, lipídeos e gangliosídeos Uma vez na cóclea sua
eliminação é lenta, sendo que a lesão celular está relacionada a uma ligação com o Fe+3, o
que leva à formação de espécies reativas de oxigênio com dano mitocondrial oxidativo
(Hutchin e Cortopassi, 1994; Oliveira et al. 2003). No nosso experimento, embora utilizando
aminoglicosídeos, não encontramos nenhuma lesão em nenhuma espira e em nenhuma fileira
das células ciliadas externas pesquisadas.
Para CHAMBERS (2003), o efeito ototóxico geralmente é irreversível, dependendo da
dose e do tempo de exposição. Com o prolongamento de sua utilização a lesão ototóxica
progride da base para o ápice da cóclea, seguindo-se de uma degeneração retrógrada do nervo
coclear. SHA e SCHACHT (1999) utilizando doses elevadas de gentamicina, 120 mg/Kg/dia,
conseguiram reproduzir uma perda auditiva de 10 a 40 dB em 3kHz e de 50 a 70 dB em 18
kHz, realizando sua avaliação após quatro semanas de administração da droga. Em uma
56
análise por microscopia eletrônica de varredura, detectaram perda total de células ciliadas
externas na espira basal da cóclea com preservação das células ciliadas internas.
OLIVEIRA et al. (2004) e MAUDONNET (2005) demonstraram que uma dose baixa
de gentamicina de 10 mg/Kg/dia por trinta dias consecutivos mantém a estrutura anatômica
das CCE e CCI e sua funcionalidade, sem alterar as EOAPD. Em nosso experimento, não foi
observada lesão ototóxica pelo uso da gentamicina no período de 10 e 14 dias nas dosagens de
4mg/kg/dia e 2,5 mg/kg/dia a cada 12h, estando de acordo com os achados científicos
utilizando baixa dosagem.
A verificação da função auditiva em presença de antibioticoterapia, no nosso
experimento, está de acordo com a preocupação demonstrada por SCHWEITZER (1993) e
JACOB (2006), quanto ao monitoramento auditivo como parte integrante do protocolo de
atendimento aos indivíduos expostos a agentes ototóxicos. Corrobora também aos achados de
DISHTCHEKENIAN et al. (2000), que aponta para a deficiência auditiva como doença
severamente incapacitante e que o uso de drogas ototóxicas pode causar injúrias tanto
auditivas como vestibulares e isto vem ao encontro da justificativa que preconizou a
realização do presente estudo, além do que, ao estabelecer o nível de segurança no uso
terapêutico da gentamicina pode ter efeito preventivo quanto as perdas auditivas
neurossensoriais, preocupação análoga descrita por HYPPOLITO e OLIVEIRA (2005).
Nesta pesquisa, a confrontação dos resultados obtidos pela microscopia eletrônica de
varredura com os achados funcionais das emissões otoacústicas nos forneceu dados
conclusivos para a ausência de danos celulares a nível auditivo periférico.
Tais achados podem explicar a ausência de lesão das células ciliadas externas
decorrentes da administração de doses habituais de gentamicina utilizada em UTI neonatal (4
a 5 mg/Kg/dia por 10 a 14 dias consecutivos), desconsiderando-se outros fatores de risco para
a surdez neonatal e sua utilização concomitante a outras drogas potencialmente ototóxicas.
CONCLUSÃO
Não foram observadas lesões ou alterações no funcionamento das células ciliadas
externas mediante a dosagem aplicada em cobaias albinas, de 4 mg/Kg/dia (dose única) e 2,5
mg/Kg/dia a cada 12 horas, utilizadas por 10 e 14 dias.
57
Agradecimentos
Laboratório de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental do Departamento de
Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Biologia Celular
Molecular e Bioagentes da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.
Laboratório de Neurobiologia da audição e Microdissecção do Departamento de
Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto – USP.
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ANEXOS
62
Tabela 1 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre os dois
grupos pré tratamento com gentamicina 4 mg/Kg/dia
Freqüência
Grupos
Média
Desvio Padrão
Valor de p*
Orelha esquerda
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Orelha direita
1500
2000
3000
4000
5000
6000
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
8,00
9,33
14,33
19,16
24,66
28,50
22,66
25,00
27,16
27,00
25,83
28,83
11,66
4,33
21,50
15,66
26,16
22,50
25,00
22,66
25,50
27,16
25,16
26,16
6,66
7,71
5,46
10,41
5,64
4,80
4,92
8,53
9,96
7,15
8,81
7,38
4,71
6,02
7,14
7,96
4,30
5,78
12,86
4,58
13,15
6,21
13,04
4,35
0,52
0,37
0,17
0,33
0,68
0,42
0,03
0,20
0,33
0,14
0,93
0,22
Tabela 2 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre os dois
grupos pós tratamento com gentamicina 4 mg/Kg/dia
Freqüência
Grupos
Média
Desvio Padrão
Valor de p*
Orelha esquerda
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Orelha direita
1500
2000
3000
4000
5000
6000
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
* Teste de Kruskal-Wallis
11,66
16,83
23,50
24,50
29,83
26,66
31,00
21,16
34,16
23,83
29,16
24,00
3,33
9,33
12,00
21,33
21,16
26,50
19,00
22,00
25,33
27,33
25,83
27,66
9,41
4,95
6,94
6,09
5,26
10,07
5,83
11,80
4,02
12,73
6,79
9,57
8,16
8,18
11,31
10,09
4,87
5,78
9,27
8,64
5,35
14,54
1,72
13,75
0,33
0,57
0,93
0,14
0,06
0,03
0,12
0,17
0,06
0,33
0,19
0,05
63
Tabela 3 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre os dois
grupos pré tratamento com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas
Freqüência
Grupos
Média
Desvio Padrão
Valor de p*
Orelha esquerda
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Orelha direita
1500
2000
3000
4000
5000
6000
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
8,50
9,33
18,33
22,50
25,16
32,16
26,50
27,00
33,50
32,33
27,83
27,66
8,33
7,50
10,83
15,16
19,16
25,00
16,66
22,66
23,16
27,16
20,33
24,50
5,46
6,97
2,42
5,31
6,11
2,78
7,26
4,69
4,23
3,98
6,05
10,89
8,35
3,39
8,93
6,01
12,12
4,09
11,60
5,78
12,04
6,85
11,09
8,73
0,93
0,10
0,02
0,74
0,68
0,51
0,62
0,37
0,41
0,37
0,74
0,62
Tabela 4 - Dados estatísticos descritivos da relação sinal/ruído das emissões otoacústicas entre os dois
grupos pós tratamento com gentamicina 2,5 mg/Kg/dia de 12 em 12 horas
Freqüência
Grupos
Média
Desvio Padrão
Valor de p*
Orelha esquerda
1500
2000
3000
4000
5000
6000
Orelha direita
1500
2000
3000
4000
5000
6000
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
10 dias
14 dias
19,83
16,50
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