Desenvolvimento de marcadores moleculares

Desenvolvimento de marcadores
moleculares relacionados a resistência
celular após terapia fotodinâmica em
carcinomas mamários
Joze Barbosa Galioti
Orientadora: Profª Drª Renata A. Canevari
Introdução
• O câncer de mama é uma doença
extremamente complexa e clinicamente
heterogênea, caracterizado por prognósticos
muito diferentes entre as pacientes
• O principal problema clínico dessa
doença é a recorrência/recidiva
observada após a terapia
(quimioterapia e radioterapia)
•
A resistência celular após as diferentes terapias utilizadas é um
fator crítico no tratamento do câncer de mama
• Vários estudos atribuíram que a resistência celular encontrada
nas células neoplásicas surge devido a alterações genéticas
específicas
(PUSZTAI, et al., 2006, DOBBE, et al., 2008, SUN, et al., 2009)
• Recidivas da mama tendem a ocorrer em
aproximadamente 5% a 10% das pacientes,
num intervalo de cinco anos, nos casos em que
foram realizadas cirurgias conservadoras em
qualquer quadrante da mama, com ou sem
tratamento adjuvante
(BIRDWELL, 2003)
• Uma vez retirado o tumor, cirurgicamente, a
recidiva da doença pode ocorrer através de
possível micro metástases ocultas.
• Portanto, a finalidade do tratamento por
meio da quimioterapia adjuvante é erradicar
as micro-metástases, diminuindo a chance
de recidiva e aumentando a sobrevida
(JAO, GARCIA, 2006)
A quimioterapia ou terapia hormonal
reduzem somente em um terço o risco de
recidiva ou metástases
Atualmente.... muitas pacientes ainda sofrem
recidiva e a predição de quais pacientes irão
sofrer recidiva tumoral é ineficaz
(Sun et al., 2007)
Terapia Fotodinâmica (TFD)
y Uma nova opção de tratamento
• Paciente apresenta um determinado tumor
• É administrado um fotossensibilizador por via endovenosa
• Depois de +/- 24 hrs o fotossensibilizador se concentra no
tumor
• O fotossensibilizador é ativado pela luz
• O tumor é seletivamente destruído (morte celular)
(Bagnato, 2002)
Alterações genéticas, resistência celular
e terapia fotodinâmica
• Vários
estudos
foram
realizados
tentando
esclarecer os mecanismos celulares e genéticos
envolvidos
através
das
características
citotóxicas induzidas pela TFD.
Belickova, M., et al., 2000, Verwanger, T., et al., 2002,
Crescenzi, E., et al., 2004, Crescenzi, E., et al., 2009, Wang, H.P.,
et al.,2002.
• Contudo há poucos relatos in vivo tanto em tumores
humanos quanto utilizando um modelo animal.
Alterações genéticas, resistência celular
e terapia fotodinâmica
• Em
um
estudo
com
tumores
de
mama
(adenocarcinoma) em cultura celular foi observado que
após vários ciclos da TFD, ocorreu um aumento da
resistência celular a terapia fotodinâmica acompanhado
com um aumento do volume celular, aumento de
fibroblasto,
diferenças
na
adesão
celular
e
na
capacidade da célula de sofrer metástase
(CASAS, 2006)
• Portanto, pelo fato da TFD induzir altos
níveis de citotoxidade, é esperado que ela
também tenha um significativo impacto no
padrão da expressão gênica.
• Atualmente, pouco é conhecido a respeito da
atividade gênica global, particularmente
quando stress oxidativo torna-se excessivo,
como no caso da TFD.
Análise de Expressão Gênica
• Todas as células em um organismo têm o mesmo
DNA genômico
• Identidades celulares distintas ocorrem por causa de
diferenças na expressão gênica (= transcrição &
tradução)
• A transcrição ou não de um gene é, em geral,
determinada pela presença/ausência de outros
produtos dos genes (especialmente proteínas)
WATSON, et al., 2007
Análise de Expressão Gênica
Célula sanguínea
Gene A
Gene B
Gene C
Célula nervosa
Célula epitelial
Para que estudar a expressão gênica?
• As células e tecidos tem suas funções
normais quando os genes são
expressos de forma regulada.
• A expressão alterada de um gene
altera a homeostase do organismo,
podendo gerar diferentes tipos de
cânceres.
Análise de Expressão Gênica
• Portanto vários estudos de análise de
expressão gênica no câncer de mama
estão sendo realizados com o objetivo de
aumentar o entendimento da interação de
genes e vias envolvidas em sua
progressão.
(Van’t Veer, et al., 2002, Wang, et al., 2005, Liu, et al., 2008)
Análise de Expressão Gênica
Até o presente, as vias metabólicas influenciadas pela TFD não
foram totalmente elucidadas, algumas vias foram comprovadas
estarem envolvidas.
9A apoptose celular foi o principal evento encontrado em todas os
tecidos tumorais tratados pela TFD, sugerindo que a habilidade
desta terapia em induzir rapidamente a morte celular por apoptose
pode explicar em parte a rápida eliminação tumoral que ocorre
após a terapia.
Makowski, M., et al., 2003, Oleinick, N.L. , H.H. Evans, 1998
Análise de Expressão Gênica
9A terapia fotodinâmica também sido demonstrada
regular moléculas de adesão, e provavelmente
desempenham um papel crucial na indução de uma
resposta imune após a TFD .
Runnels, J.M., et al., 1999.
9 TFD mediada por stress oxidativo também pode
agir como um estímulo angiogênico levando a
neovasculariação e recorrência tumoral.
Objetivos Gerais
• Induzir, em modelo animal, tumores de mama
afim de se estabelecer bases para diagnóstico
e terapêutica;
• Pesquisar alterações na expressão de
genes/proteínas críticas pertencentes a vias
metabólicas específicas nos tecidos submetidos
a TFD com intuito de descobrir marcadores
relacionados com recidiva tumoral;
Objetivos Gerais
• Estudar os mecanismos celulares TFD
pela associação das técnicas PCRquantitativo em tempo real, imunohistoquímica e análise morfológica do
tecido.
Objetivos Específicos
• Analisar o padrão de expressão gênica após
TFD em amostras de tumores mamários de
ratas e compará-los com tecidos de mama
normais e tumores mamários não submetidos
a TFD;
• Determinar
os
efeitos
da
TFD
no
transcriptoma de vias metabólicas específicas
selecionadas previamente para o estudo;
Objetivos Específicos
• Comparar a expressão relativa de genes e
proteínas em amostras de tumores de
ratas em que foi observada a redução do
tumor e tumores em que não foi
observado a redução tumoral;
Material e Métodos
• Serão utilizadas 50 ratas da linha SpragueDawley. A neoplasia mamária será induzida em
45 ratas com o 7,12- dimetilbenz(a)antraceno
(DMBA) onde posteriormente será realizado a
Terapia Fotodinâmica.
www.googleimagens.com.br
Análise de Expressão Gênica por Real-Time
PCR array
• Serão utilizados 50 amostras de mama de ratas
sendo:
- G1- animais com mama normal;
- G2- animais com tumor de mama não tratado;
- G3 E G4- animais submetidos a TFD (photogem
e PDZ) morto após 48 horas;
- G5 e G6- animais submetidos a TFD
acompanhados até a eliminação ou recidiva.
Análise de Expressão Gênica por Real-Time
PCR array
• A extração e purificação do RNA utilizando o
protocolo estabelecido para Rneasy Mini Kit
(Qiagen).
• A quantificação e a qualidade do RNA serão
avaliadas utilizando-se o NanoDrop (ND-1000
Spectrophotometer v.3.0.1, Labtrade) e
eletroforese em gel de agarose.
Análise de Expressão Gênica por Real-Time
PCR array
• A detecção de alterações quantitativas da expressão
gênica (qRT – PCR) será realizada no equipamento
ABI Prism 7500 (Applied BioSystems, USA) e na
plataforma Cancer Pathway Finder PCR Array
(Super-Array, USA) .
Análise de Expressão Gênica por Real-Time
PCR array
• Esta plataforma possibilita a análise da expressão de 84
genes representativos de vias biológicas envolvidas na
transformação e tumorigênese.
• Este array inclui genes representativos das seguintes vias
biológicas: adesão celular, angiogênese, apoptose,
controle do ciclo celular, senescência celular, reparo do
DNA, invasão, metástase, moléculas de transdução de
sinal e fatores de transcrição.
Análise de Expressão Gênica por
Real-Time PCR array
qRT PCR
tumor
Coleta do tumor
Pulverização do tecido
(adição de nitrogênio líquido)
Extração do RNA total
Análise de Expressão Gênica por
Real-Time PCR array
M
1
Dnase I
2
DNA genômico
RNAr 28S
RNAr 18S
Verificação da
qualidade do
RNA total (gel de
agarose 2%)
Digestão →
TºC ambiente
- 15 min
Inativação →
70ºC - 10 min.
Digestão do DNA
Tampão
dNTP
Oligo (dt)
PCR em tempo real
DTT
Transcriptase
Reversa
Hibridizar com
caudas poli (A)
Transcriptase
reversa
Degradação do
RNA com Rnase H
Segunda fita de cDNA
usando a DNA polimerase
Estudo da
Expressão Gênica
Análise de Expressão protéica por
imunohistoquímica
• Seleção dos genes diferencialmente
expressos para a realização da validação
por imuno-histoquímica (IHC).
Resultados Esperados
• Espera-se contribuir significativamente para a elucidação
dos mecanismos de resistência tumoral observada nas
neoplasias mamárias após PDT e para a detecção das
alterações moleculares (expressão gênica e protéica
diferencial)
• Contribuir para um maior conhecimento da biologia
tumoral e para o melhor entendimento dos mecanismos
de atuação da TFD potencializando sua efetividade antitumoral em modelo experimental de tumor de mama
Referências Bibliográficas
• INCA, M.d.S.S.d.A.à.S.I.N.d.C., Câncer no Brasil: dados dos
registros de base populacional. Rio de Janeiro: Brasil, 2008.
• PUSZTAI, L., et al., Molecular classification of breast cancer:
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• Bagnato, V.S.J.F.C.K.L.G.M.G.A.C.F.J.C.M., Guia Prático de
Terapia Fotodinâmica para o Tratamento de Tumores. 2002.
• SUN, W., et al., Integrated study of copy number states and
genotype calls using high-density SNP arrays. Nucleic Acids Res,
2009. 37(16): p. 5365-77
• CASAS, A., et al., Tumor cell lines resistant to ALA-mediated
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Int J Oncol, 2006. 29(2): p. 397-405.
• VAN 'T VEER, L.J., et al., Gene expression profiling predicts
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Referências Bibliográficas
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metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer.
Lancet, 2005. 365(9460): p. 671-9.
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profiling data. BMC Med Genomics, 2008. 1: p. 39.
• BIRDWELL RL. Pocket radiologist. Breast top 100 diagnoses. 1st
ed. Salt Lake City: Amirsys; 2003.
• Filho JAO, GARCIA, AHR.,Câncer colorretal: tratamento
quimioterápico adjuvante e na doença metastática. In: Guimarães
JRQ. Manual de Oncologia. 2ª ed. São Paulo (SP): BBS Editora;
2006
• WATSON, D. James, et al., DNA recombinante Genes e
Genomas, 3ª edição, Artmed, São Paulo, 2007.
• www.googlesimagens.com.br
• http://professorarejanebiologia.blogspot.com/2010_02_14_archiv
e.html
PESQUISADORES ENVOLVIDOS
Profa. Dra Juliana Ferreira
LEVB - Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos - SP
Prof. Dr Airton Abrahão Martin
LEVB - Universidade do vale do Paraíba, São José dos Campos - SP
Profa. Dra. Mônica Fernandes Gomes
Universidade Estadual Paulista, UNESP, São José dos Campos - SP
Prof. Dr Leandro José Raniero
LEVB- Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos – SP
Joze Barbosa Galioti
Bolsista treinamento técnico – LEVB / UNIVAP, São José dos Campos - SP
Auxílio Financeiro: