Como Funciona

Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas
Bacharelado em Ciências Biológicas
Eletroforese
Disciplina: Biofísica
Professor: Oleg
Alunos: Cristiana Sette,
Érika Pinho Correia,
Isadora Coelho, Marx
Lima e Sara Jaqueline
Lopes.
Período: Primeiro
Recife, 10 de julho de 2007
Introdução
Chama-se electroforese ao transporte de partículas num campo eléctrico.
O processo é formalmente idêntico á sedimentação, já que em ambos os casos
um campo, que é o gradiente de um potencial, produz o transporte das
moléculas. No transporte electroforético, à força do campo opõe-se a
resistência viscosa do meio, produzindo, quando se igualam, uma velocidade
constante das partículas.
A electroforese aplica-se no campo da bioquímica na separação de compostos
que possuem carga (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleidos) tendo
em conta que a carga destas substâncias depende do pH do meio em que se
encontram. Moléculas negativa e positivamente mover-se-ão em direcções
opostas do campo eléctrico.
A composição das proteínas pode ser determinada pelo processo da
electroforese, comparando-se depois os patrões electroforéticos para as
mesmas proteínas em diferentes espécies.
Toda uma variedade de moléculas pode ser individualizada por meio desta
técnica.
Electroforese
Eletroforese é uma técnica laboratorial de separação de frações (ou
fracionamento) de proteínas, enzimas, DNA e RNA. Foi introduzida
cientificamente em 1939 por A.Tiselius e A.E. Kabat com o objetivo de separar
partículas orgânicas. A técnica é fundamentada na separação de material
orgânico (proteínas, enzimas, DNA, RNA) que apresentam cargas elétricas
definidas por pH específicos. Utiliza-se uma cuba com dois compartimentos
separados por 5 a 10cm. Num compartimento o eletrodo com fio preto
determina o pólo negativo, e no outro compartimento o eletrodo com fio
vermelho é o pólo positivo. Nos dois compartimentos colocam-se a solução
tampão com pH definido, e entre os compartimentos ajusta-se o suporte da
eletroforese (agarose, acetato de celulose, gel de amido, gel de poliacrilamida).
O suporte utilizado deve estar em contato com a solução tampão dos dois
compartimentos. As amostras a serem analisadas são aplicadas no suporte
escolhido (gel de agarose, acetato de celulose, etc.). Para que proteínas,
enzimas, DNA ou RNA se fracionem é necessário passar no suporte uma
corrente elétrica cuja voltagem e miliamperagem variam conforme os tipos de
solução tampão, suporte e amostra a ser fracionada. Após a "corrida"
eletroforética, o suporte é retirado da cuba e corado com corantes específicos
por tempos variáveis, e descorados a seguir. As análises podem ser
qualitativas ou quantitativas – estas últimas por densitometria ou eluição.
A utilização de eletroforese no uso da rotina laboratorial tem sido importante
para determinar hemoglobinopatias e talassemias (figura 1), auxílio diagnóstico
para doenças específicas, por ex.: mieloma múltiplo (figura 2), além de
aplicação em lipidogramas, biologia molecular e enzimopatias.
Técnicas mais sensíveis, como é o caso da focalização isoelétrica permitem a
separação de frações com excelente resolução (figura 3).
Uma técnica eletroforética de uso em pesquisa científica associada ao
fracionamento por peso molecular das amostras e com excelente resolução é
realizada em gel de poliacrilamida.
Para maiores informações o livro "Eletroforese, técnicas e diagnósticos" de
autoria do Prof. Paulo Cesar Naoum e editado (2ª edição) pela livraria Santos,
São Paulo, 1997 apresenta doze capítulos que incluem, entre outros temas as
hemoglobinopatias, lipoproteínas, proteínas plasmáticas, haptoglobinas,
isoenzimas, etc.
Migração diferencial de compostos com carga quando sujeitos a um campo
eléctrico.
A velocidade de migração é constante e depende do equilíbrio de forças e ao
retardamento por atrito entre a amostra e o meio circundante.
A corrente é mantida do circuito pela electrólise que ocorre nos eléctrodos.
A velocidade da partícula num campo eléctrico calcula-se pela fórmula:
Z - nº de cargas de unidade e
ZeE
E - campo eléctrico
f
v - velocidade da partícula
v =
f - coeficiente de atrito
Define-se mobilidade electroforética (u) como a velocidade de migração por
unidade de campo eléctrico, numa mesma solução, partículas com a mesma
carga podem ter mobilidade electroforética distinta pois podem possuir pesos
moleculares diferentes: u=v/E, substituindo v temos que:
U = Ze/f em que o coeficiente de atrito (f) depende de do tamanho e forma da
molécula e da viscosidade do meio.
Diferentes tipos de electroforese
1. Electroforese livre (frente móvel)
Método introduzido por Tiselius em 1937.
As substâncias a separar introduzem-se num tubo em U, dissolvidas num
tampão de pH adequado. Estabelece-se um limite entre a dissolução proteica e
o tampão electroforético. Ao aplicar-se a corrente a frente proteica desloca-se
por acção do campo. O avanço da frente pode seguir-se mediante observação
UV.
2. Electroforese de zona
Na década de 1945-55 deu-se um grande desenvolvimento na metodologia
electroforética com a introdução de suportes inertes no meio, com o objectivo
de evitar correntes de convecção produzidas pelo aquecimento na
electroforese livre. Também o suporte permite a aplicação da amostra em
bandas finas, com o que se consegue separações mais nítidas.
2.1. Electroforese em papel
O papel de filtro foi o primeiro suporte utilizado nos métodos electroforéticos de
zona. O papel empapa-se com a solução tampão e coloca-se de modo
conveniente entre os eléctrodos. A amostra aplica-se no centro ou em qualquer
das extremidades do papel, dependendo das substâncias a separar e do pH do
tampão.
Quando se querem separar substâncias de baixo peso molecular, como
aminoácidos ou peptídeos, a difusão produzida pode evitar-se aumentando a
diferença de potencial entre os eléctrodos reduzindo o tempo de separação.
Este tipo de electroforese chama-se electroforese de alta voltagem.
A electroforese em papel pode também utilizar-se para o cálculo de pontos
isoeléctricos.
O papel apresenta os inconvenientes de uma grande evaporação, maior na
electroforese de alta voltagem, pelo que é necessário refrigerar o dispositivo de
separação. Outro inconveniente é o fluxo electroendosmótico, movimento de
arraste originado pelos iões do tampão de separação.
2.2. Electroforese em acetado de celulose
As películas de acetado de celulose trazem sobre o papel as vantagens de ser
quimicamente mais homogéneo e tornar-se transparente, com o que as
substâncias a separar, uma vez identificadas, podem quantificar-se mediante
densitometria. Utiliza-se hoje com grande relevo nos laboratórios de análises
químicas devido á sua fácil manipulação e rapidez.
2.3. Electroforese em gel
A utilização dos géis de amido e poliacrilamida na electroforese de zona foi um
grande avanço devido a que com estes meios o gel não é um mero suporte que
evita a difusão como também variando as concentrações do monómero, podem
conseguir-se polímeros com crivagens diferentes. Desta forma a separação
não se produz só por diferença de carga mas também por diferença de
tamanho.
Shapiro, Vinuela e Maizel descreveram a electroforese em gel de poliacrilamida
em presença do detergente aniónico dodecil sulfato de sódio (SDS) e indicaram
que neste meio a separação é dependente do peso molecular. As proteínas em
presença de SDS e beta-mercaptoetanol dissociam-se nas suas sub-unidades
de modo que a separação electroforética permite o cálculo do peso molecular
das cadeias polipeptídicas de proteínas oligoméricas. A mobilidade de uma
cadeia polipeptídica pode ser só função do peso molecular se a carga por
unidade de massa for constante ou se as propriedades hidrodinâmicas são
unicamente função do comprimento da cadeia. Os dados que se possuem hoje
sobre a acção do SDS nas proteínas indicam que o número de moléculas de
SDS que se unem a uma cadeia polipeptídica é aproximadamente igual á
metade do número de aminoácidos da cadeia, o que faz com que a carga por
unidade de massa seja aproximadamente constante para todas as cadeias
polipeptídicas. Por outro lado os estudos hidrodinâmicos e ópticos indicam que
os complexos proteína-SDS se comportam como partículas alargadas nas
quais o comprimento da partícula varia unicamente com o peso molecular da
cadeia polipeptídica.
Hoje em dia a electroforese em gel na presença do SDS é um método muito
utilizado para o cálculo dos pesos moleculares das proteínas oligoméricas.
Quando se representa a mobilidade electroforética frente ao logaritmo dos
pesos moleculares conhecidos de diversas cadeias polipeptidicas obtém-se
uma recta que pode utilizar-se como padrão para o cálculo do peso molecular
das sub-unidades da proteína que queremos estudar. Mediante esta técnica
podem determinar-se pesos moleculares com uma precisão de mais ou menos
10 por 100.
Exemplo : Cálculo molecular da desidrogenase láctea u=0,455
Proteína
Peso molecular
Mobilidade
Albumina do soro
68000
0,18
Cataláse
60000
0,22
Glutanato desidrogenáse
53000
0,29
3-P-gliceraldeído
36000
0,40
desidrogenase
Tripsina
23300
0,60
Mioglobina
17200
0,74
2.4. Electroforese de disco
O meio para esta electroforese é a poliacrilamida. O método original de
Ornstein e Davis (1964) estabelece duas descontinuidades de pH e uma
descontinuidade de reticulação do meio electroforético.
A electroforese de disco pode distinguir famílias de proteínas, isómeros de
carga ou isómeros de tamanho. Quando se representa o logaritmo da
mobilidade relativa da proteína (distância percorrida pela proteína dividida pela
distância percorrida por um corante que marque a frente electroforética), os
isómeros de tamanho dão uma série de linhas não paralelas extrapoladas a um
ponto comum próximo da concentração de acrilamida e as proteínas isómeros
de carga dão uma família de linhas paralelas. As proteínas de diferentes cargas
e tamanhos dão linhas não paralelas.
Aplicações práticas da electroforese
1.Engenharia genética
A engenharia genética depende da localização e da análise dos genes nos
cromossomas e, em última instância, da sequenciação do ADN. As primeiras
cartografias dos genes usavam os princípios da genética mendeliana. Assumese que os alelos que são transmitidos em conjunto se localizam lado a lado
num mesmo cromossoma: diz-se que estão ligados ou em linkage. Estes genes
formam um grupo de ligação - grupo de linkage: passam para os mesmos
gâmetas e são normalmente transmitidos em conjunto, de modo que não
apresentam distribuição independente. Crossing-over que ocorra durante a
meiose pode fazer com que estes alelos possam ser trocados entre os
cromossomas de um par homólogo.
Pela análise das frequências de crossovers para muitos alelos diferentes pode
traçar-se um mapa linear de cada cromossoma.
As técnicas modernas, mais do que o mapa dos genes, traçam o mapa do
próprio ADN no interior dos genes: as posições de curtas sequências
"marcadoras" são usadas como marcos de sinalização ao longo dos
cromosssomas. Uma vez que um gene é descoberto, é necessário desvendar a
sua sequência de bases antes de a sua função ser estudada. A sequenciação
tornou-se mais fácil com o desenvolvimento de métodos de clonar o ADN fabricar grandes quantidades de fragmentos idênticos. No método de
sequênciação do ADN mais usado, a cadeia é desnaturada em cadeias
simples. Estas são então utilizadas como moldes para a síntese do ADN, mas
de tal modo que a replicação pára quanto a dupla hélice em crescimento atinge
uma determinada base do molde. Para além de se fornecer polimerase do ADN
e as quatro bases, A - G -C -T, também se usam pequenas quantidades de
didesoxinucleótidos destas bases. Esta incorporam-se, como as bases
normais, na dupla hélice em crescimento, mas impedem a continuação da
cadeia. Os fragmentos são então separados por electroforese em gel e a
sequência de bases do segmento de ADN original pode ser facilmente
deduzida.
Se os fragmentos de ADN forem radioactivamente marcados, as bandas
correspondentes a fragmentos de tamanhos diferentes podem ser detectadas
colocando o gel de electroforese sobre uma película fotográfica. Esta técnica
está a ser usada para sequenciar o genoma humano, que contém centenas de
milhares de pares nucleótidicos. É muito mais rápida que a análise de
proteínas e, por essa razão, as estruturas de muitas proteínas são estudadas a
partir da análise dos fragmentos de ADN que as codificam, deduzindo depois
as sequências de aminoácidos. O genoma de vários organismos "modelo" está
a ser cartografado tendo em vista proporcionar o material de partida para se
estudar a função dos genes.
A engenharia genética também tem um papel a desempenhar na prevenção de
doenças não hereditárias. As vacinas podem passar a ser vírus modificados,
inofensivos, como o vírus Vaccinia, que está a ser modificado para a
preparação de vacinas contra a raiva, o herpes e a gripe. Pode inserir-se um
máximo de vinte cinco genes extra no genoma viral para se obter imunidade
múltipla. Outras vacinas, como a da hepatite B, podem simplesmente ser as
proteínas superficiais do revestimento do vírus em questão. O gene viral é
inserido num microorganismo, que produz depois a vacina.
2. Genética clínica e forense
A dactiloscopia genética é uma técnica utilizada na ciência forense onde se
analisam as diferenças entre segmentos de ADN chamados ADN
minissatélites. Este ADN encontra-se entre os genes e é utilizado na
dactiloscopia porque é extremamente viável. A hipótese de dois indivíduos sem
qualquer relação de parentesco possuírem exactamente as mesmas regiões
minissatélites é muito remota, por isso a dactiloscopia do ADN constitui um
teste viável. A região minissatélite é cortada em fragmentos por meio de
enzimas de restrição. Os fragmentos daí resultantes são separados de acordo
com o tamanho, por uma técnica chamada de electroforese em gel, em que os
fragmentos são impelidos por um campo eléctrico através de um gel.. Isto
produz uma "escada" de ADN, em que cada "degrau" corresponde a um
fragmento de tamanho diferente. As escadas produzidas pelo ADN de
indivíduos diferentes podem ser comparadas ; as diferenças são facilmente
detectadas e as pessoas distinguidas.
As bandas obtidas por dactiloscopia que se encontram representadas estão
marcadas com um M de Mãe, um C de Criança e um F de Pai (em inglês,
father). Ambas as crianças partilham algumas bandas com cada progenitor, o
que prova que o indivíduo de que foram extraídas as amostras são, de facto
aparentados. Uma falta de correspondência indica a ausência de parentesco.
Esta técnica rotineiramente utilizada em casos de paternidade contestada pode
ter também algumas aplicações menos vulgares, em1992 foi utilizada para
confirmar que cinco esqueletos exumados de uma campa nas imediações de
Ekaterinburg eram os do Czar Nicolau II da Rússia, da sua mulher e das três
filhas.
As técnicas sofisticadas da medicina e da prática forense permitem que a
compreensão crescente do ADN seja aplicada com resultados práticos. Por
exemplo, generalizaram-se os testes de ADN para identificar e prever doenças
genéticas. Pelo estudo da árvore genealógica das famílias afectadas é possível
traçar um quadro das relações genéticas e prever quais os indivíduos em risco
que podem depois ser sujeitos a despistagem, em busca de deficiências
genéticas. Uma técnica bastante comum recorre a certas enzimas, chamadas
endonucleases de restrição, para cortar o ADN em determinados pontos. Os
fragmentos são então separados e identificados por sondas de ADN. A este
processo dá-se o nome de análise dos RFLP ( restriction fragment length
polimorfism).
Vários métodos de despistagem podem ser usados para analisar um feto em
desenvolvimento em busca de afecções hereditárias como o sindroma de
Down. A amniocentese, a biópsia das vilosidades coriónicas e a cordocentese
são técnicas pelas quais as células ou as proteínas fetais podem ser obtidas,
postas em cultura e usadas para diagnóstico genético.
A genética forense tem outras aplicações. As "impressões digitais" do ADN
representam uma valiosa ferramenta para a polícia científica. À semelhança do
que acontece com uma impressão digital vulgar, a impressão genética é
exclusiva de cada indivíduo (com excepção dos gémeos verdadeiros). A sua
determinação implica a observação de sequências específicas de ADN, que
pode ser obtido de amostras extremamente pequenas de tecidos, cabelo ou
sangue, eventualmente deixados no local do crime. Apenas cinquenta
microlitros de sangue, cinco microlitros de sémen ou dez raízes de cabelos são
o suficiente, assim como secreções bocais e células do feto. Para além da sua
utilização na captura de criminosos, em especial os violadores, as impressões
genéticas podem ser usadas para estabelecer relações familiares. As pessoas
envolvidas na conservação das espécies usam-nas para terem a certeza de
que a procriação em cativeiro se faz entre indivíduos que não pertencem à
mesma família.
Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a
migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma
diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois
algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.
A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de
DNA e RNA.
Como Funciona
Resultado apresentado no gel de agarose
Cada molécula de proteína se liga a um grande número de moléculas do
detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) carregado negativamente, que
supera a carga intrínseca da proteína e faz com que ela migre em direção ao
eletrodo positivo, quando uma voltagem é aplicada. As proteínas do mesmo
tamanho tendem a migrar através do gel com velocidades similares, pois sua
estrutura nativa será completamente desdobrada pelo SDS, de maneira que
suas formas são as mesmas, e elas se liguem a uma mesma quantidade de
SDS tendo, portanto, a mesma quantidade de cargas negativas. As proteínas
maiores, com mais carga, são submetidas a forças elétricas maiores e também
a um retardamento maior. Livres e solução, os dois efeitos seriam anulados,
mas nas malhas do gel poliacrilamida, que age como uma peneira molecular,
as proteínas maiores são retardadas muito mais do que as menores. Como
resultado, uma mistura complexa de proteínas é fracionada em uma série de
diferentes bandas de proteínas arranjadas de acordo com sua massa
molecular. As proteínas majoritárias são facilmente detectadas corando-se as
proteínas do gel com um corante como o azul Coomassie, e mesmo as
proteínas menos abundantes são visualizadas em géis tratados com coloração
de prata ou ouro (com o qual pequenas quantidades, como 10 ng de proteína,
podem ser detectadas em uma banda).