Bioquímica

Bioquímica
EBG / EA
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P1. Exercícios de Pipetagem
A grande maioria dos protocolos utilizados na Biologia Molecular faz uso de volumes muito
pequenos de ácidos nucleicos, proteínas e / ou reagentes. Torna-se, portanto, necessário o uso de micropipetas
capazes de medir volumes na ordem do µl (1 µl = 10-6 litros).
1.1. Exercícios de micropipetagem: uso da P20 (1-20 µl)
a) Use uma caneta de acetato para marcar três tubos de microcentrífuga (eppendorf ou equivalente).
b) Use o quadro seguinte para adicionar as várias soluções a cada tubo:
Tubo
A
B
C
sol. I
3µl
4µl
2µl
sol. II
5µl
5µl
3µl
sol. III
2µl
0µl
2µl
sol. IV
0µl
1µl
3µl
c) Prepare a micropipeta para o volume indicado e junte à solução I a cada tubo de reacção.
d) Use uma ponta nova para adicionar o volume apropriado do solvente II aos tubos de reacção A, B, C.
e) Use uma ponta nova para adicionar cada nova solução aos tubos.
f) Agite os tubos de modo a misturar os reagentes convenientemente.
g) Centrifugue na microcentrífuga uns 10 a 20 segundos.
h) Um total de 10 µl de reagentes foi adicionado a cada tubo. Para verificar que as suas medidas estavam
correctas, regule a pipeta para 10 µl e lentamente pipete a solução de cada tubo para a ponta amarela da
pipeta. Verifique que o volume pipetado está correcto; caso contrário, recomece uma nova série de
pipetagens.
1.2. Exercícios de micropipetagem: uso da P200 (20-200µl) e P1000 (200-1000 µl)
a) Use uma caneta de acetato para marcar três tubos de microcentrífuga (eppendorf ou equivalente).
b) Use o quadro seguinte para adicionar as várias soluções a cada tubo:
Tubo
E
F
sol. I
100µl
150µl
sol. II
200µl
250µl
sol. III
150µl
350µl
sol. IV
550µl
250µl
c) Um total de 1000 µl deverá ter sido adicionado a cada tubo. Para verificar que a pipetagem foi correcta,
regule a P1000 para 1000µl e lentamente pipete a solução de cada tubo para a ponta azul da pipeta.
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P2. Electroforese horizontal submersa.
Determinação do tamanho de fragmentos de ADN obtidos por digestão
enzimática
2.1. Introdução
O advento da Biologia Molecular só foi possivel com uma sucessão de descobertas em relação à estrutura e
função de várias biomoléculas que constituiem as células, tecidos e organismos. Entre estas biomoléculas
destaca-se o ácido desoxirribonucleico (ADN), o material genético da esmagadora maioria dos seres vivos, à
excepção de algumas estirpes virais, cujos genes encontram-se codificados por uma forma – por vezes
modificada – de ácido ribonucleico (ARN).
Um evento fundamental que possibilitou a clonagem, amplificação e manipulação de material genético foi a
descoberta de que certas bactérias (Escherichia coli, por exemplo) têm um sistema de “restrição” enzimático
para impedir a “invasão” de material genético estranho, seja ele viral (infecção) ou bacteriano (transformação
/ transdução). Estas “enzimas de restrição” mostravam uma especificidade até então desconhecida – isto é,
endonucleases que só digeriam ADN se determinadas sequencias nucleotídicas estivessem presentes no ácido
nucleico. Simultaneamente, vários grupos de cientistas começaram a estudar pequenas formas de ADN
extracromossómicas com capacidade de auto-replicação, frequentemente denominadas por “plasmídios”.
Esta aula prática tem por objectivo o uso de enzimas de restrição de modo a digerir um plasmídio, contendo
um gene de interesse, e determinar o seu mapa de restrição. Este é um dos primeiros passos para caracterizar o
material genético que se vai estudar.
2.2. AVISOS
Antes de se iniciar esta aula prática, tenham em atenção o seguinte:
1) O brometo de etídio é um composto considerado altamente mutagénico e, por conseguinte,
potencialmente cancerígeno. O uso de luvas é obrigatório no manuseamento de material (por ex., géis
de agarose) que contenham este composto. O despejo de restos de agarose contendo brometo de etídio
no esgoto ou lixo normal deve ser evitada. Em caso de dúvida, perguntem ao responsável pelas aulas
práticas.
2) A luz ultravioleta é perigosa, em particular para os olhos. O uso de óculos de protecção é obrigatória
na visualização do gel após a separação dos fragmentos. Recomenda-se também o uso de uma máscara
em vez dos óculos de protecção.
2.3. Digestão de ADN por enzimas de restricão:
O plasmídio utilizado nestas aulas práticas é o pBSK2-A3LacZ que contém a região promotora de um gene
para a actina que regula a expressão do gene reporter LacZ (Fig. 1). De modo a determinar o mapa de
restrição deste plasmídio, prepare as seguintes amostras:
Tubo
1
2
3
ADN
1µl
1µl
1µl
10 x tampão
1,5µl
1,5µl
1,5µl
PstI
1µl
1µl
2
BamHI
1µl
1µl
H20
11,5µl
11,5µl
10,5µl
Fig 1 - Diagrama esquemático do plasmídio pBSK2-A3LacZ. pA3, região promotora do gene para a actina a
montante do gene reporter LacZ.
2.4. Preparação de um gel de 1% de agarose:
1. Preparar o molde, colocando fita-cola e pente.
2. Adicionar a agarose a um tampão adequado (1 x TAE) num erlenmeyer adequado.
3. Aquecer a suspensão no microondas (controlar o aquecimento de modo a evitar o transvase da solução).
4. Adicionar brometo de etídio para uma concentração final de 0.2 µg ml-1.
5. Quando a temperatura tiver descido de tal modo que permita o contacto da mão com o erlenmeyer, verter
sobre o molde de forma contínua. Eliminar todas as bolhas que eventualmente se tenham formado durante o
enchimento do molde.
6. Deixar gelificar à temperatura ambiente.
7. Retirar o pente, tendo o cuidado de não provocar roturas nos poços.
2.5. Preparação da tina de electroforese:
1. Encher a tina com tampão de electroforese (1 x TAE).
2. Colocar o gel de modo a que fique completamente imerso. Evitar o excesso de tampão, porém, pois quanto
mais tampão tiver acima do nível do gel, mais lentamente decorrerá a separação dos fragmentos de ADN.
2.6. Aplicação das amostras e marcadores:
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1. Para cada amostra misturar:
- 13,5 µl de amostra; a
- 1,5 µl de corante (10x) contendo azul de bromofenol (migra com fragmentos de ADN de cerca de 5 kb) e
cianol de xileno (migra com fragmentos de cerca de 0.5 kb).
2. Amostras a deitar nos poços do gel:
- fago  digerido por HindIII; e
- amostras 1 ( x PstI), 2 ( x BamHI) e 3 ( x PstI x BamHI ).
2.7. Electroforese:
1. Com a fonte de alimentação desligada, estabelecer as ligações correctas. Ligar o cátodo (-) ao terminal
eléctrico mais próximo da extremidade do gel que contém os poços.
2. Utilize uma corrente contínua entre 60-100 mA, dependendo do gel, da tina de electroforese e do tampão
utilizado.
3. Depois da conclusão da electroforese, visualize os resultados sob luz ultravioleta (ler a secção 2.2
AVISOS, s.f.f).
4. Determine o tamanho das bandas no gel e construa o mapa de restrição do plasmídio.
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