ministério da educação universidade federal do rio grande do norte

1
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
EFEITO DE EXTRATOS DA ALGA MARINHA Caulerpa mexicana EM
MODELOS DE INFLAMAÇÃO EM MURINOS
MARIANA ANGÉLICA OLIVEIRA BITENCOURT
Orientadora: Profa. Dra. Janeusa Trindade de Souto
NATAL – RN
2011
2
MARIANA ANGÉLICA OLIVEIRA BITENCOURT
EFEITO DE EXTRATOS DA ALGA MARINHA Caulerpa mexicana EM
MODELOS DE INFLAMAÇÃO EM MURINOS
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da UFRN, como requisito para a obtenção
do
grau
de
Farmacêuticas,
Bioanálises.
NATAL – RN
2011
mestre
área
de
em
Ciências
Concentração
3
“Consulte não a seus medos, mas a suas esperanças
e sonhos. Pense não sobre suas frustrações, mas
sobre seu potencial não usado. Preocupe-se não
com o que você tentou e falhou, mas com aquilo
que ainda é possível a você fazer”.
Papa João XXIII
4
DEDICATÓRIAS
À DEUS,
Princípio e fim de todas as coisas.
Sei que tudo em minha vida tem Seu amor e cuidado.
“Grandes são as obras do senhor; nelas meditam todos os que as apreciam”.
Salmos 111:2
5
DEDICATÓRIAS
Aos meus pais José Maria e Salete
Por terem sido fonte eterna de incentivo, inspiração, amor infinito, paciência.
Por terem sempre colocado minha educação como prioridade,
Pelo carinho, dedicação, por serem meu alicerce, meu existir.
Vocês são minha vida, pois com vocês posso chegar onde eu quiser.
Sem vocês esta dissertação não existiria.
Obrigada por serem o eterno berço onde sei que posso repousar.
ESTA DISSERTAÇÃO É DE VOCÊS, MESTRES EM AMOR E DEDICAÇÃO!
AMO VOCÊS!
À minha Irmã Bárbara.
Realmente você é “BÁRBARA”,
Minha amiga, companheira, filha e assessora em assuntos de informática,
Dedico a você esse trabalho, pois foi fundamental nessa etapa de minha vida.
Por sempre acreditar que eu seria capaz de realizar este trabalho.
TE ADORO!
Ao meu noivo Hélio.
Pelo amor, compreensão, paciência, respeito, incentivo,
Por ser meio companheiro, amigo e parceiro nesta jornada da vida.
Não tenho palavras para agradecer se incentivo e amor.
TE AMO!
6
AGRADECIMENTOS
É importante dizer que não existem palavras para expressar minha gratidão por
estas e por tantas outras pessoas que – por problema de espaço ou de memória – não
foram aqui citadas. A todas elas meu carinho e meu muito obrigada!
À minha orientadora, Profª Drª Janeusa Trindade de Souto, por me
proporcionar orientação e apoio para meu desenvolvimento intelectual e
científico; por acreditar em mim e guiar meus passos nesta caminhada.
Ao programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN,
pelo suporte oferecido no desenvolvimento da pesquisa e a todos os
professores que de uma forma ou de outra contribuíram para a realização
deste trabalho.
Às funcionárias da PPgCF, Fábia e Aureliana, pela disponibilidade em
ajudar sempre que necessário.
À Profª Drª Bárbara Viviana de Oliveira Santos, por ter gentilmente
cedido os extratos da Caulepa mexicana.
Às Profª Drª Regina de Fátima dos Santos Braz e Profª Drª Lucymara
Fassarella Agnez Lima, por terem gentilmente disponibilizado seus laboratórios
para a realização de alguns ensaios.
Aos Profª Drª Carlos Augusto Galvão Barboza e Profª Drª Ericka Janine
Dantas da Silveira, pelas análises histológicas, paciência e atenção.
Às colegas e amigas do laboratório de Imunofarmacologia, por terem
participado de forma tão especial desta dissertação, cuja ajuda foi muito
importante para a realização deste trabalho, meu carinho e agradecimento a
vocês.
Aos colegas de pós-graduação, que compartilhamos juntos momentos
alegres, como também muitas angustias, tenho por vocês um grande respeito e
amizade sincera.
7
Ao seu Raimundo, Dona Ana e Costa, funcionários do biotério, pela
ajuda com os animais.
Aos animais que vítimas solicitadas pela ciência para o benefício da
humanidade, o meu respeito e eterna gratidão.
Às Profª Drª Ana Cláudia Galvão Freire e Profª Drª Edna Marque de
Araújo Silva, que me receberam na disciplina de Parasitologia Clínica com todo
o carinho, agradeço os ensinamentos, palavras de carinho, incentivo e
amizade. Exemplos de docente e de pessoas, generosas, espelho para quem
quer seguir a vida acadêmica.
Ao REUNI, pela bolsa de assistência ao ensino.
Às minhas avós Elpídia e Ana, pelas orações e carinho, vovó Elpidia,
muito obrigada pelas palavras de sabedoria e conselhos tão preciosos, ao vovô
João, que não está mais entre nós, exemplo de sabedoria e honestidade, me
ensinou a lutar pelos meus sonhos, guardarei seu amor para sempre, vocês
são responsáveis por quem sou hoje.
Aos meus familiares de sangue ou de coração, em especial minha tia
Marli, agradeço o apoio, confiança, todas as orações, vocês são companheiros
de todas as horas.
À minha querida “Mainha Mom”, por ter me amado como filha, desde
sempre, tenho o privilégio de ter você como mãe de coração.
À minha amiga, irmã, companheira e cúmplice, Anna Gabriella, que
esteve ao meu lado me apoiando e incentivando, sempre disposta a escutar
meus dilemas e aborrecimentos, meu agradecimento mais do que especial, por
você fazer parte da minha vida desde quando eu nem sabia o que era amizade.
Aos meus queridos Simplício, Wantuilson, Aline e Flavianne, por sempre
apostarem nos meus sonhos, agradeço a torcida e amizade, vocês são os
irmãos que meu coração escollheu.
I
8
RESUMO
A regulação da resposta inflamatória é essencial para manter a
homeostase. Diversos estudos têm sido realizados para a pesquisa de novas
drogas que possam contribuir para evitar ou minimizar um processo
inflamatório excessivo. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de extratos
de algas verde Caulerpa mexicana em modelos de inflamação. Em
camundongos, o modelo de peritonite inflamatória induzida por zimosam o
tratamento prévio de camundongos com extrato aquoso e metanólico de C.
mexicana foi capaz de reduzir a migração celular para a cavidade peritoneal. O
tratamento dos camundongos com os extratos da C. mexicana também
diminuiu o edema de orelha induzido por xilol e exerceu ação inibitória da
migração de leucócitos em inflamação induzido pelo zimosam na bolsa de ar,
sendo tempo-dependente para os extratos testados, no modelo de colite
ulcerativa induzida por DSS 3%, o extrato metanólico, mas não o aquoso da C.
mexicana, reduziu de forma significativa o quadro clínico da colite, como
também a produção de citocinas pró-inflamatórias na cultura do cólon do
camundongo, na análise histológica houve uma leve redução da inflamação na
mucosa intestinal. Concluímos que a administração dos extratos resultou na
redução da migração de células para diferentes modelos experimentais, bem
como reduzir a formação de edema induzida por irritante químico. Este estudo
demonstra pela primeira vez o efeito anti-inflamatório do extrato aquoso e
metanólico da alga verde marinha Caulerpa mexicana.
9
ABSTRACT
The regulation of the inflammatory response is essential to maintain
homeostasis. Several studies have been performed to search new drugs that
can contribute to avoiding or minimizing an excessive inflammatory process.
The aim of this study was to evaluate the effect of extracts of green algae
Caulerpa mexican in models of inflammation. In mice, the model of peritonitis
induced inflammatory zymosan pretreatment of mice with aqueous and
methanol extracts of C. mexican was able to reduce cell migration to the
peritoneal cavity. Treatment of mice with extracts of C. mexican also reduced
the ear edema induced by xylene and exerted inhibitory action on the migration
of leukocytes in inflammation-induced zymosan the air pouch, and timedependent for the extracts tested in the model of ulcerative colitis induced by
DSS 3%, the extract methanol, but not the aqueous C. mexican, significantly
reduced the clinical symptoms of colitis, as well as the production of
proinflammatory cytokines in the culture of mouse colon, in the histological
analysis there was a slight reduction of inflammation in the intestinal mucosa.
We concluded that the administration of the extracts resulted in the reduction of
cell migration to different sites as well as reducing the edema formation induced
by chemical irritant. This study demonstrates for the first time the antiinflammatory effect of aqueous and methanolic extracts from green marine
algae Caulerpa mexican.
II10
LISTA DE ABREVIATURAS
AINES –
Anti-inflamatórios não esteriodal
DAMPS –
Moléculas padrão associados a danos moleculares
DC –
Doença de Crohn
DCs –
Células dendridicas
DSS –
Dextrana Sulfato de Sódio
GAGs –
Glicosaminoglicanos
i.p. –
Intraperitoneal
i.v. –
Intravenoso
IL-1 –
Interleucina 1
IL-10 –
Interleucina 10
IL-17 –
Interleucina 17
IL-4 –
Interleucina 4
IL-5 –
Interleucina 5
IL-6 –
Interleucina 6
IL-8 –
Interleucina 8
IFNγγ –
Interferon γ
NFkB –
Fator de transcrição nuclear kB
PAMPs –
Padrões moleculares associados aos patógeno
PGs –
Prostaglandinas
PMN –
Polimorfonucleares
PRR –
Receptores de reconhecimento padrão
PSGL-1 –
Glicoproteína-P selectina-1
s.c. –
Subcutânea
TGF-β -
Fator de transformação do crescimento beta
TH1 –
Linfócito T help 1
TH17 –
Linfócito T help 17
TH2 –
Linfócito T help 2
TNF –
Fator de necrose tumoral
TNF-α –
Fator de necrose tumoral-α
Treg –
Células T regulatórias
UC –
Colite ulcerativa
11
III
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Ativação da resposta imune
19
FIGURA 2: Processo de captura, rolamento e migração transendotelial de
leucócitos ao longo do vaso sanguíneo
23
FIGURA 3: Caulerpa mexicana
31
FIGURA 4: Avaliação da produção de IL-6 e IL-12 em macrófagos murinos
cultivados com os extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana
45
FIGURA 5: Efeito do extrato aquoso e metanólico de Caulerpa mexicana em
modelo de peritonite induzida por zimosam
49
FIGURA 6: Efeito dos extratos aquoso e metanólico de Caulerpa mexicana na
cinética de migração leucocitária em modelo de peritonite induzida por
zimosam
51
FIGURA 7: Efeito dos extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana
sobre a migração de leucócitos em modelo de bolsa de ar no dorso do
camundongo
57
FIGURA 8: Efeito dos extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana
sobre a cinética de migração de leucócitos na bolsa de ar induzida por
zimosam
59
Figura 9: Efeito dos extratos metanólico e aquoso de C. mexicana na cinética
da migração de monócitos e de neutrófilos para bolsa de ar induzida por
zimosam
60
FIGURA 10: Desenvolvimento do peso corporal em modelo de colite induzida
por DSS 3%
63
12
FIGURA 11: Efeito do extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana no
índice de atividade da colite (IAD) induzida por DSS 3% em camundongos
64
BALB/c
FIGURA 12: Histologia do cólon de camundongos, em modelo de colite
induzida por DSS 3% em camundongos BALB/C, avaliação do efeito dos
extratos metanólico e aquoso de Caulerpa mexicana
67
Figura 13: Efeito da administração do extrato metanólico sobre os níveis de IL6, IL-17 e IFNγ na colite induzida por DSS3% em camundongos BALB/c
69
IV
13
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Distribuição dos grupos em modelo de peritonite induzida por
zimosam (1mg/mL), utilizando o extrato metanólico ou aquoso como droga de
escolha
37
TABELA 2: Distribuição dos grupos na cinética da peritonite induzida por
zimosam (1mg/mL) como a dose de escolha dos extratos em estudo
38
TABELA 3: Distribuição de grupos no modelo de edema de orelha, utilizando o
extrato metanólico ou aquoso como substância a ser testada
39
TABELA 4: Distribuição dos grupos do modelo de bolsa de ar
40
TABELA 5: Distribuição dos grupos na cinética da bolsa de ar induzida por
zimosam (1mg/mL) com a dose de escolha dos extratos em estudo
41
TABELA 6: Distribuição de grupos no modelo colite induzida por dextrana
sulfato de sódio em Balb/c
43
TABELA 8: Efeito da C. mexicana e dexametasona em modelo de edema de
orelha induzido por xilol em camundongos
53
14
SUMÁRIO:
RESUMO
I
LISTA DE ABREVIATURAS
II
LISTA DE FIGURAS
III
LISTA DE TABELAS
IV
1.0 – INTRODUÇÃO
16
2.0 – OBJETIVOS
32
2.1 – OBJETIVO GERAL
32
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS
32
3.0 – MATERIAIS E MÉTODOS
35
3.1 – Aprovação do comitê de ética
35
3.2 – Animais de experimentação
35
3.3 – Extratos aquoso e metanólico da C. mexicana
35
3.4 - Cultura de macrófagos
36
3.5 – Modelo de peritonite induzida pela injeção de zimosam
36
3.6 – Edema de orelha induzido por xilol
38
3.7 – Modelo de bolsa de ar no dorso do camundongo
40
3.8 – Modelo de colite induzida por dextrana (DSS)
41
3.9 – Análises estatísticas
43
4.0 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
44
4.1 – Avaliação da produção de IL-6 e IL-12 em macrófagos murinos
cultivados com os extratos aquoso e metanólico da Caulerpa
mexicana
44
4.2 – Efeito dos extratos aquoso e metanólico de Caulerpa
mexicana em modelo de peritonite induzida pela injeção de
zimosam __
47
4.3 – Avaliação do efeito dos extratos aquoso e metanólico da C.
mexicana em modelo de edema de orelha induzido por xilol
52
15
4.4 – Efeito dos extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana
em modelo de inflamação induzido por zimosam em bolsa de ar
no dorso do camundongo
56
4.5 – Avaliação do efeito dos extratos aquoso metanólico de
Caulerpa mexicana em colite induzida por dextrana sulfato de
sódio 3%
61
5.0 – CONCLUSÕES
74
6.0 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
76
16
1.
INTRODUÇÃO:
A inflamação, denominada phlogosis pelos gregos e inflammatio em
latim, é um dos mecanismos mais primitivos de defesa do organismo animal a
invasão por microorganismos patogênicos. Os sinais cardinais da inflamação
foram descritos na era clássica por Aulus Celsus: rubor (eritema), calor
(temperatura elevada), tumor (edema) e dor. Um quinto sinal, perda da função
foi acrescentado por Rudolf Virchow. No século XVIII, Jonh Hunter verificou a
dilatação dos vasos sanguíneos e Julius Cohnhein associou inflamação à
migração de leucócitos através das paredes da microvasculatura. No final do
século XIX, Eli Metchnikoff enfatizou o papel da fagocitose no processo
inflamatório, enquanto a importância dos mediadores químicos foi descrito
posteriormente por Thomas Lewis em 1927 (MURPHY & WARD, 2006). Para
enfrentar a invasão por um patógeno, nosso organismo recorre a uma
variedade de respostas de defesa, dentre as quais se destaca a reação
inflamatória (MAHAJAN et al., 2005). Por outro lado, o processo inflamatório
que pode ser desencadeado contra outros tipos de lesões causadas por
substâncias químicas, luz ultravioleta, calor, substâncias inócuas externas,
isquemia, interações antígeno-anticorpo ou contra os próprios tecidos do corpo
(distúrbios autoimunes) (CARVAHO & LEMÔNICA, 1998; MAHAJAN et al.,
2005). Cada tipo de estímulo provoca um padrão característico de resposta,
que representa uma variação relativamente pequena do mesmo tema
(CASTELLHEIM et al., 2009).
A resposta inflamatória, portanto, consiste de uma intrincada, altamente
regulada e coordenada ação de várias moléculas e tipos celulares. Dessa
17
forma, um processo inflamatório devidamente regulado protege o hospedeiro
de infecções e permite o remodelamento da estrutura e re-estabelecimento da
função dos tecidos danificados após o processo de injúria (YAN & HASSON,
2007). Portanto, durante uma infecção causada por microorganismos, uma
injúria tecidual ou um trauma cirúrgico ocorre liberação de mediadores
químicos endógenos e exógenos que em geral deflagram os sinais cardinais da
inflamação (SERHAM et al., 2008). Atualmente, sabe-se que estes sinais são
expressões,
na
mesma
sequência,
da
vasodilatação
e
aumentada
permeabilidade da microcirculação possibilitando maior oferta local de
nutrientes e de oxigênio, produção energética, extravasamento de líquido para
o interstício, provocando o intumescimento e o edema, irritação de terminais
nervosos com provocação de dor, sendo consequências da liberação de
mensageiros
fisiológicos
químicos
encontrados
no
local
da
lesão,
particularmente, as citocinas (SOUZA, 2008).
A resposta inflamatória ocorre em três fases distintas, sendo cada uma
aparentemente mediada por diferentes mecanismos: a primeira é uma fase
transitória aguda, caracterizada por vasodilatação local e aumento da
permeabilidade capilar; já na segunda ocorre a fase subaguda tardia,
caracterizada mais proeminentemente pela infiltração de células fagocíticas e
outros leucócitos; e a terceira como sendo uma fase proliferativa crônica, em
que ocorrem degeneração tecidual e fibrose. As duas primeiras fases são
desejáveis e importantes e podem ser consideradas benignas dentro de
padrões em que as atividades celulares e os mediadores permanecem
apropriadamente regulados e podem ser identificados através de alterações
18
locais notáveis por sinais e sintomas (SANTOS JUNIOR, 2003). A capacidade
de desencadear uma resposta inflamatória é essencial para manter a
homeostase do organismo, sendo esse um mecanismo importante da resposta
imune e a força motriz do sistema imune é a necessidade de reconhecimento e
combate a agentes que venham causar danos aos tecidos. Assim, a resposta
inicial contra agentes estranhos é organizada e executada pela imunidade
inata, influenciada pelo sistema neuroendócrino (MEDZHITOV, 2008).
Portanto, num processo infeccioso, a resposta inflamatória começa com
a detecção de perigo pelos receptores de reconhecimento padrão (PRR)
presentes
nas
células
imunológicas
competentes
e
no
endotélio
(CASTELLHEIM et al, 2009; KONO, 2008 ). Dentre essas células se destacam
as células dendríticas (DCs) que estão presentes em todos os tecidos, sendo
células apresentadoras de antígeno profissionais, dotadas de PRR que
reconhecem as características únicas de moléculas microbianas, chamadas de
padrões moleculares associados aos patógeno (PAMPs). Quando os PAMPs
estão presentes, por exemplo, em uma infecção, eles são reconhecidos pelos
receptores presentes nas DCs, que são estimuladas a migrar para tecidos
linfóides e apresentar os antígenos ligados ao MHC e moléculas coestimuladoras para as células T. Alguns estudos sugerem que o evento chave
que controla o início de uma resposta imune não é necessariamente uma
infecção, mas pode ser também a produção de sinais de perigo (DAMPS) de
células estressadas, danificadas e/ou mortas no tecido local. Estes foram
postuladas para agir nas DCs de forma que também os leva a migrar e
apresentar antígenos às células T de forma imunoestimulatória. Tem sido
19
especulado que DAMPS podem ser produzidas em resposta a PAMPs e
realmente ser o mediador final da promoção de respostas imunológicas em
todas as situações, incluindo a infecção. Também é possível que DAMPS e
PAMPs possam alertar o sistema imune de forma independente e talvez até de
forma sinérgica (KONO et al., 2009). A ativação das células imunes é um dos
pré-requisitos para a iniciação da inflamação, através do desencadeamento da
produção de mediadores inflamatórios (figura 1).
Agente
estranho
Célula
dendrítica
Morte
celular
Micróbio
Antígeno
Amadurecimento
Complexo
PRR
MHC-ppt
Linfonodo
Célula T
Coestimulação
Migração
FIGURA 1: Ativação da resposta imune. Fonte: adaptado de KONO et al.,
2009.
Percebido sinais de perigo, através de vias específicas de sinalização,
ocorre ativação do fator de transcrição nuclear kB (NFkB) e outros fatores de
transcrição de genes e sistemas de regulação que autoregulam a expressão de
20
mediadores pró-inflamatórios. Os mediadores pró-inflamatórios produzidos
estimulam ainda mais a produção de biomarcadores que participam da
inflamação (CASTELLHEIM et al, 2009; MEDZHITOV, 2008).
Na fase inicial da inflamação ocorrem eventos vasculares levando a
alterações no fluxo e calibre dos vasos da microcirculação, esse processo tem
início logo após a injúria e desenvolve-se em velocidades variáveis, conforme a
intensidade da lesão. Essas alterações consistem em vasoconstricção
arteriolar inicial, com duração de segundos, seguida por uma vasodilatação e
por aumento da permeabilidade vascular, principalmente venular, a qual é
produzida por diversos mediadores, tais como histamina, serotonina,
bradicinina e prostaglandinas, que mediam a contração das células endoteliais,
abrindo as junções intercelulares (SERHAN, et al., 2008). Em seguida, ocorre
abertura dos esfíncteres pré-capilares, aumentando o fluxo sanguíneo local,
que é causa do calor e eritema. Além disso, há saída de íons e pequenas
moléculas, como água, seguida por moléculas maiores, como albumina e
fibrinogênio. A passagem de proteínas para o meio extravascular associada ao
aumento da pressão hidrostática local permitirá maior influxo de líquido e seu
acúmulo no tecido intersticial, resultando na formação do edema (MURPHY &
WARD, 2006). O exsudato líquido contém uma variedade de substâncias e
mediadores, o qual é drenado pelos vasos linfáticos e transportado até os
linfonodos locais, onde produtos do micro-organismo invasor podem iniciar uma
resposta imune (KONO, 2008).
A inflamação aguda tem vários processos programados, incluindo a
progressão para fibrose tecidual crônica ou o reparo do tecido por completo. O
21
mecanismo usado para debelar o patógeno do tecido injuriado é a infiltração de
células fagocíticas do sistema imune inato, neutrófilos e macrófagos, pelas
vênulas pós-capilares através de diapedese, em que são atraídos pela
detecção de gradientes de concentração de substâncias quimioatraentes.
Estes compostos quimioatraentes são mediadores lipídicos endógenos, tais
como leucotrienos e proteínas mediadoras, como quimiocinas e citocinas, bem
como liberação de quimioatraentes exógenos, por exemplo, produtos
microbianos. A progressão da infiltração de células é liderada por subtipos
específicos de leucócitos, ou seja, fagócitos, sendo os neutrófilos as primeiras
a entrarem no tecido injuriado, seguido por monócitos (SERHAN et al, 2008). O
recrutamento de leucócitos desempenha um papel importante na resposta
imune a agentes infecciosos e durante doenças inflamatórias e autoimunes. O
processo de extravasamento de leucócitos do sangue para o tecido inflamado
requer uma complexa cascata de eventos adesivos entre os leucócitos e o
endotélio (CHAVAKIS et al., 2009; ZARBOCK et al., 2009).
Dessa forma, no decorrer do processo inflamatório, os leucócitos
circulantes no sangue periférico aproximam-se da parede vascular ativada pela
ação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF e IL-1, produzidas por
macrófagos ativados por PAMPs ou DAMPs (DEKKER & SEGAL, 2000). O
recrutamento de leucócitos é crucial no curso de uma infecção, pois
proporciona o direcionamento de células fagocíticas para o sítio de infecção.
No entanto, esse processo de migração celular não é tão benéfico em doenças
inflamatórias, tais como doenças autoimunes, e doenças pulmonares crônicas.
A diapedese compreende várias etapas, incluindo: (i) a inicial que é selectina
22
dependente com captura de leucócitos circulantes, (ii) a ativação de leucócitos
induzida por quimiocinas, (iii) a adesão firme mediada por integrina e (iv) a
migração transendotelial de leucócitos. Finalmente os leucócitos migram na
matriz extracelular (LEY et al., 2007; CHAVAKIS et al., 2009).
O endotélio vascular tem um papel ativo no processo de rolamento de
leucócitos. As células endoteliais expressam E- e P-selectina, sendo moléculas
importantes para capturas das células circulantes (LUSTER et al., 2005). As
interações transitórias e reversíveis de rolamento entre leucócitos e endotélio
são mediadas pela fraca ligação entre as selectinas com seus carboidratos
ligantes, tais como a glicoproteína-P selectina-1 (PSGL-1) (CHAVAKIS et al.,
2009). O PSGL-1 presente nos leucócitos liga-se à E e a P-selectina
endoteliais. A P-selectina é armazenada em corpos de Weibel-Palade, e
estímulos inflamatórios induzem sua rápida exposição sobre a superfície apical
endoteliais, enquanto a E-selectina é sintetizada devido à estimulação próinflamatória (ZARBOCK et al., 2009). Além disso, os leucócitos em rolamento
pelo vaso expressam integrinas em estado de baixa afinidade, que aumenta
após ativação dessas células pelas quimiocinas produzidas pelo endotélio
vascular ativado. As integrinas agora em estado de alta afinidade estabilizam a
ligação mediada pelas selectinas, reduzem a velocidade de rolamento
favorecendo a adesão dos leucócitos ao endotélio vascular, promovendo sua
passagem, por diapedese, do sangue para os tecidos (LUSTER et al., 2005;
LEY et al., 2007; CHAVAKIS et al., 2009). A diapedese envolve desmontagem
transitória de junções endoteliais e penetração através da membrana basal
subjacente. Uma vez no espaço extravascular, a migração de células usa
23
integrinas diferentes para ganhar aderência em fibras de colágeno, tais como
laminina e fibronectina. A migração de células recebe sinalização de conjuntos
distintos de quimioatraentes, esse fenômeno envolve a interação dos agentes
quimiotáticos com seus receptores específicos, presentes na membrana dos
leucócitos resultando na movimentação celular através da matriz extracelular
em direção ao gradiente quimiotático. (LUSTER et al., 2005; ZARBOCK et al.,
2009 ), figura 2.
Figura 2: Processo de captura, rolamento e migração transendotelial de
leucócitos ao longo do vaso sanguíneo. Fonte: crono.icb.usp.br
Os mediadores químicos responsáveis pelos eventos inflamatórios
podem originar-se do plasma, em formas precursoras que devem ser ativadas,
e de células, onde podem estar armazenados nos grânulos intracelulares ou
serem sintetizados originalmente em resposta a estímulos. Além disso, podem
atuar em um ou vários tipos celulares, possuir alvos difusos, ou até mesmo
apresentar efeitos diversos de acordo com os tipos de células e tecidos
24
(MURPHY & WARD, 2006). Os principais mediadores envolvidos na inflamação
incluem histamina, serotonina bradicinina, metabólitos do ácido araquidônico
(AA), neuropetídeos, óxido nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ROS),
citocinas, dentre outros (CASTELLHEIM et al., 2009).
As citocinas são mediadores polipeptídicos liberados por células do
sistema imune como produtos finais da resposta celular a diferentes
mensagens recebidas em sua superfície, que medeiam e regulam reações
imunológicas e inflamatórias. Apresentam ação direta sobre os receptores
celulares, mas também podem induzir a formação de outras citocinas,
constituindo
uma
cascata
de
amplificação
(ZARBOCK
et
al.,
2009;
CASTELLHEIM et al., 2009). Várias citocinas diferentes desempenham um
papel essencial na coordenação do processo inflamatório e ativação das
células que chegam ao foco inflamatório, especialmente a interleucina 1 (IL-1),
IL-6 e o fator de necrose tumoral (TNF). Macrófagos ativados estão entre as
células que mais produzem essas citocinas pró-inflamatórias, juntamente com
a IL-12 que é um potente agente imunoestimulante, ativadora de linfócitos T
auxiliares (Th1) e células natural killer (NK). TNF, IL-1 e IL-6 por sua vez
induzem a expressão de numerosos genes para promover as respostas próinflamatórias, causando ativação do endotélio vascular e produção de proteínas
de fase aguda (LUSTER et al., 2005). Essas citocinas pró-inflamatórias
parecem atuar em conjunto e com fatores de crescimento e outras citocinas,
como a IL-8 e outras quimiocinas, promovendo a infiltração e ativação dos
neutrófilos, que são as primeiras células a chegarem ao foco inflamatório
(LUSTER et al., 2005). Essas citocinas também atuam na indução da enzima
25
ciclooxigenase e lipooxigenase, no aumento da expressão das moléculas de
adesão e ativação das células T, B e NK. Outras ações desses agentes
provavelmente contribuem para a fibrose e a degeneração tecidual da fase
proliferativa
crônica
da
inflamação:
estimulação
da
proliferação
dos
fibroblastos, indução da colagenase e ativação dos osteoblastos (SPRINGER,
1995; CASSATELLA, 1995).
Os processos inflamatórios agudos como a sepse, se não forem
devidamente controlados, podem levar o hospedeiro à morte e inflamações
crônicas, como a asma e doenças autoimunes podem causar danos teciduais
que podem ser irreparáveis com perda da função do tecido ou órgão afetado,
como por exemplo, nas doenças inflamatórias do intestino.
A doença de Crohn e colite ulcerativa são exemplos de doenças
inflamatórias intestinais (DII), e são manifestações de numerosas desordens
imunológicas associadas com resposta imune celular e humoral. Apesar de sua
etiologia e patogênese ainda não serem bem definidas, sabe-se que fatores
genéticos em combinação com fatores ambientais contribuem para a iniciação
dessas doenças (CHEN, et al; 2008), que se caracterizam por sintomas como
perda de peso, diarréia acompanhada de sangue e/ou muco, febre,
desmotilidade gástrica e dor abdominal (KWON, et al, 2007; YOON, et al;
2008).
O desenvolvimento das doenças inflamatórias intestinais como a colite
ulcerativa atinge primariamente a camada superficial da mucosa do cólon, onde
análises histológicas mostraram extenso dano nas criptas e epitélio celular,
26
significante infiltração de granulócitos e células imunes mononucleares, edema
tecidual e muitas vezes franca ulceração (STROBER et al, 2002). Evidências
em modelos animais indicam que a falha nos mecanismos de supressão da
imunidade para antígenos intestinais estranhos ao organismo leva a essa
desordem inflamatória. Por exemplo, ativação de células imunes como
neutrófilos, macrófagos e células T citotóxicas, causa agressão e destruição da
barreira intestinal, quer seja através do contato físico direto ou indiretamente
através da liberação de citocinas como TNF-α, IL-1-β e IL-6 (SARTOR, 2006;
PAPADAKIS & TARGAN, 2008).
Apesar da doença de Crohn e a colite ulcerativa apresentarem
semelhanças na resposta a antígenos na mucosa intestinal, essas duas
doenças apresentam fisiopatologia consideravelmente diferentes. Estudos
mostram que a doença de Crohn está associada a uma resposta mediada por
células Th1 (FICHTNER-FEIGL et al., 2005), promovendo um perfil de citocinas
(IFN-γ, IL-2 e TNF-α) que gera uma forte resposta imune celular, sendo
geralmente observada em casos clínicos de inflamação crônica e tem sido
implicada tanto no desenvolvimento da doença de Crohn como na esclerose
múltipla e artrite (BONDER et al., 2005). Por outro lado, a colite ulcerativa está
provavelmente associada a uma resposta Th2 mediada por células
especializadas, como as células T NK e secreção de IL-13 e IL-4, fato esse
ainda não elucidado (FICHTNER-FEIGL et al., 2005; SHIH & TARGAN, 2008).
Acredita-se que um fator que leva ao desenvolvimento da colite ulcerativa é o
desequilíbrio da resposta imune Th1/Th2, tendo nesse tipo de doença
predominância da resposta Th2 (IHARA et al, 2009), em que a liberação de
27
citocinas, por exemplo, IL-4 e IL-13, esteja associada com a hipercontratilidade
do músculo liso intestinal, porém esse mecanismo ainda não está totalmente
esclarecido (AKIHO et al., 2005; IHARA et al, 2009 ).
Tem sido mostrado que o desequilíbrio da resposta das células T leva a
uma alteração na expressão de citocinas na mucosa e células dendrídicas têm
sido caracterizadas como células produtoras de citocinas (IL-6 e TGF-β) que
induzem um padrão de resposta imune Th17, que atua como participante
dessa reação inflamatória (TAKEDATSU et al, 2008). Afirma-se também que a
composição da microbiota intestinal é regulada pelo balanço entre as células
Th17 e T regulatórias (Treg) na lâmina própria. O desequilíbrio da expressão
dessas células com o consequente aumento das células Th17 leva a
susceptibilidade de um processo inflamatório, podendo assim levar ao
desencadeamento da colite (IVANOV et al, 2009). Células Th17 participam de
respostas inflamatórias e têm funções essenciais na defesa do hospedeiro
contra patógenos,
como bactérias e fungos, particularmente
aqueles
encontrados nas mucosas, e também estão envolvidas no desenvolvimento de
doenças autoimunes, uma vez que essas células produzem citocinas
quimioatraentes de neutrófilos, sabidamente envolvidos na fagocitose dos
citados patógenos e também na patologia de algumas doenças autoimunes,
como a colite ulcerativa (AUJLA et al. 2008).
O tratamento das doenças inflamatórias intestinais (DII) só pode ser
iniciado a partir do diagnóstico do tipo de enfermidade. O diagnóstico assim
como diferenciação entre doença de Crohn e colite ulcerativa pode ser feito de
maneira precisa na maioria dos pacientes, baseado no histórico do paciente,
28
exame físico, ileocolonoscopia, exame por enema de duplo-contraste de bário,
biopsia e análise microbiológica (BOSSUYT, 2006). Dentre as substâncias
mais empregadas em DII, destacam-se os derivados do ácido 5-aminosalicílico,
corticosteróides, imunossupressores e, mais recentemente, as chamadas
terapias biológicas, envolvendo o uso de anticorpos anti-TNF (infliximab,
adalimumab, certolizumab), anticorpos bloqueadores de quimiocinas e
moléculas de adesão (natalizumab), anticorpos monoclonais anti-IL-12/IL-23
p40 (ustekinumab e ABT-874) e anti-IL-6 (tocilizumab), anticorpo anti-CD25 de
células T (basiliximab), proteínas de fusão que bloqueiam moléculas coestimulatórias, como CD80/CD86 (abatacept), IL-10 humana recombinate
(STALLMACH et al., 2010).
O
tratamento
convencional
envolve
uso
de
aminossalicilatos,
corticosteróides e imunossupressores, que demonstram eficácia na maioria das
vezes, mas nem todos os pacientes podem fazer uso desses medicamentos
concomitantemente, sendo uma alternativa o uso da terapia biológica com os
anticorpos (STALLMACH et al., 2010). De maneira geral, estes medicamentos
apresentam diversos efeitos colaterais, são de alto custo, na maioria das vezes
são
ineficazes
quando
empregados
isoladamente
e
a
administração
concomitante pode elevar o número de efeitos colaterais (infecções, tumores),
sem considerar que existe uma alta taxa de reincidência da doença após a
realização do tratamento com tais fármacos (STALLMACH et al., 2010; CAO et
al., 2005).
Tendo em vista esse problema, há interesse em pesquisar a eficácia de
produtos naturais no tratamento e prevenção das DIIs como a doença de Crohn
29
e a colite ulcerativa.
Atualmente existem várias pesquisas comprovando a
eficácia de produtos herbais para o tratamento da inflamação.
Um estudo
realizado por AL-SAGHIR, et al (2009), foi observado que o extrato da planta
Centaurea ainetensis apresentou atividade anti-inflamatória no tratamento da
colite. Este panorama revela um rumo inovador da terapêutica para o
tratamento das DIIs, porém, as plantas medicinais apresentam um atrativo a
mais como objeto de estudo, por representarem uma fonte importante de novos
compostos ativos. Visto isso a indústria farmacêutica tem investido suas
pesquisas em medicamentos fitoterápicos, tendo como base a medicina
popular e a biodiversidade de nossa flora.
As plantas tem sido à base de muitos sistemas tradicionais de
medicamentos como a homeopatia e a fitoterapia no tratamento de várias
doenças. Além disso, as plantas medicinais são amplamente utilizadas na
pesquisa de novas drogas, uma vez que representam uma fonte rica de
compostos
com
atividade
farmacológica.
O
conhecimento
tradicional
medicamento, juntamente com técnicas modernas tem acelerado o processo
de descoberta de drogas derivadas de plantas (ITOKAWA et al. 2008;
SAKLANI & KUTTY, 2008; KOLEWE, 2008). Portanto, há uma necessidade de
estudar as propriedades curativas das plantas. Estudos têm demonstrado que
as drogas derivadas de plantas e preparações de muitas plantas são capazes
de alterar a função do sistema imunológico com uma ampla gama de efeitos
imunomoduladores. Bem como algumas plantas podem afetar a secreção de
citocinas, liberação de histamina, a proliferação de linfócitos e atividade
citotóxica (SAKLANI & KUTTY, 2008; PLAEGER, 2003). Interesse em
30
alternativas para a medicina moderna não tem sido maior do que é agora, e
uma grande parte desse interesse gira em torno do uso de plantas medicinais
como macroalgas marinhas. Vários estudos investigaram como esses
compostos naturais exercem os seus efeitos anti-inflamatórios (AL-SAGHIR et
al, 2009).
A Caulerpa mexicana (Figura 3) é uma alga encontrada no litoral
brasileiro (NETO et al, 2008). A literatura mostra que as macrófitas têm muitos
compostos bioativos, tais como polissacarídeos, terpenos e alcalóides indólicos
extraído a partir deles, que mostram várias atividades farmacológicas, como
atividade antitumoral, antiviral, antioxidante, anticoagulante, controle de lipídios,
a taxa de crescimento corporal e imunidade do corpo (SHEN et al., 2008;
TORRES et al, 2005; ROCHA et al, 2007). Outros estudos mostraram que
algumas espécies de Caulerpa têm atividade biológica nos seus extratos com a
seguinte ação: atividade antibiótica, citotóxicos e antimitóticos (BALLESTEROS
et al, 1992).
31
FIGURA 3: Caulerpa mexicana. Fonte: http://www.sccat.net/#ninebanned-species-in-california-f45a4.
Uma vez que nosso laboratório já vem trabalhando com compostos
purificados da alga marinha Spatoglossum schröederi, que tem mostrado
importantes atividades anti-inflamatórias em diferentes modelos experimentais
de injúria pulmonar aguda e artrite e devido à baixa incidência de estudos
encontrados com a Caulerpa mexicana e ação biológica de outras espécies do
gênero já comprovada, foi então decidido estudar a ação de extratos dessa
alga em modelos de inflamação, sendo os objetivos desse trabalho descritos a
seguir.
32
2.
OBJETIVOS:
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a ação dos extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana
em modelos de inflamação em camundongos.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1. Pesquisar a produção de IL-6 e IL-12, em macrófagos murinos
cultivados com os extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana. A
citocina IL-6 é poderoso agente inflamatório liberado por macrófagos ativados,
sendo um dos mediadores centrais da inflamação juntamente com TNF e IL-1
(COLEMANN, 2001), essa citocina foi recentemente associada, junto com
TGF-β, à diferenciação de células T virgens para o fenótipo Th17, que produz
citocinas envolvidas na migração de neutrófilos para os sítios de inflamação
(LITTMAN e RUDENSKY, 2010). A IL-12 por sua vez, é uma citocina
imunoregulatória, produzida por células dendríticas, macrófagos e células B,
sendo uma potente indutora de resposta imune celular mediada pelos linfócitos
Th1, produtores de IFN-γ, que age sobre macrófagos aumentando suas
funções microbicidas, auxiliando assim na eliminação de microrganismos
(SPELLBERG & EDWARDS, 2001). Portanto, foi avaliado o efeito dos extratos
aquoso e metanólico da C. mexicana em macrófagos de camundongos quanto
à sua capacidade de produzir IL-6 e IL-12.
33
2.2.2. Pesquisar os efeitos de diferentes extratos obtidos da alga
Caulerpa mexicana em modelo de peritonite induzida por zimosam:
Peritonite é uma inflamação grave que muitas vezes leva a falência múltipla de
órgãos e mortalidade (KHAN, 2004). A vantagem desse modelo consiste na
quantificação precisa da migração leucocitária por meio do infiltrado celular no
exsudato peritoneal. Na peritonite induzida por zimosam há uma rápida
resposta inflamatória, apresentando intenso acúmulo de polimorfonucleares
(PMN) e citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1, IL-6 e TNF (CHADZINSKA
et al, 2005). Com isso, foi pesquisado se diferentes extratos da Caulerpa
mexicana apresentam alguma capacidade de inibir a migração de células para
cavidade peritoneal de camundongos inoculados zimosam.
2.2.3. Pesquisar os efeitos de diferentes extratos obtidos da alga
Caulerpa mexicana em modelo de edema de orelha induzido por xilol. Um
dos sinais cardinais da inflamação é a formação de edema e estudos sobre
atividade anti-inflamatória de determinados compostos isolados de plantas
foram realizados utilizando o modelo de edema de orelha induzido por xilol (HU
et al., 2008; PARVEEN et al., 2007). De maneira semelhante, nesse estudo foi
avaliada a atividade dos extratos de C. mexicana na formação do edema de
orelha induzido por xilol, visto que não há na literatura relatos sobre a função
desses extratos em tal modelo de inflamação.
2.2.4. Pesquisar o efeito de diferentes extratos obtidos da alga
Caulerpa mexicana em modelo de bolsa de ar no dorso do camundongo
induzido por zimosam. O zimosam é uma substância potencialmente
inflamatória quando injetada em animais de experimentação, sendo extraído da
34
parede celular do fungo Sacaromyces cerevisiae. Portanto foi avaliado o efeito
de diferentes extratos da Caulerpa mexicana em modelo da bolsa de ar no
dorso de camundongos, um importante modelo para estudar a inflamação
aguda. A administração de zimosam diretamente na bolsa de ar de
camundongos induz uma rápida resposta inflamatória caracterizada pelos altos
níveis de prostaglandinas (PGs) e leucotrienos no exsudado presente como
também a rápida migração de leucócitos para o local da inflamação (ARAICO
et al., 2007; YOON et al., 2006).
2.2.5. Pesquisar o efeito de diferentes extratos obtidos da alga
Caulerpa mexicana em modelo de colite induzida por dextrana sulfato de
sódio (DSS). A colite ulcerativa é uma doença inflamatória crônica da mucosa
intestinal, de etiologia desconhecida, que parece resultar de uma série de
interações complexas entre susceptibilidade genética, meio-ambiente e sistema
imune. Uma das características dessa patologia é um denso infiltrado de
neutrófilos na mucosa intestinal com formação de abscesso nas criptas
(BALAZS & KOVACS, 1989). Além disso, a retirada de neutrófilos do sangue
de pacientes por aférese induz significante melhora em pacientes com colite
ulcerativa, sugerindo a participação dessas células nos danos teciduais
observados nessa doença. Portanto, foi pesquisado o efeito de diferentes
extratos da C. mexicana em modelo colite ulcerativa induzida por DSS.
35
3. MATRIAL E MÉTODOS:
3.1.
Animais de experimentação
Foram utilizados camundongos Swiss machos (25-35 g) de 6 a 8
semanas de idade provenientes do Biotério Setorial do Departamento de
Biofísica e Farmacologia, do Centro de Biociências da UFRN, e camundongos
BALB/c fêmeas e machos de 6 a 8 semanas de idade, provenientes do Biotério
Setorial do Centro de Ciências da Saúde da UFRN. Os animais foram mantidos
em condições de temperatura controlada (22 ± 2 °C), ciclo claro/escuro de 12
horas e com livre acesso a água e ração comercial. Os animais foram mantidos
na sala de experimento durante pelo menos uma hora antes da realização dos
testes, para adaptação. Os experimentos foram realizados de acordo com as
orientações para os cuidados com animais de laboratórios.
3.2.
Aprovação do comitê de ética.
Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética
no Uso de Animais (CEUA) do Centro de Biociências da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte sob o protocolo de número 044/2009.
3.3.
Extratos aquoso e metanólico da Caulerpa mexicana:
A alga Caulerpa mexicana foi coletada no litoral de João Pessoa, PB. Os
extratos em estudos foram obtidos e gentilmente fornecidos pela Prof ª. Drª.
Bárbara
Viviana
de
Oliveira
Santos,
do
Laboratório
de
Farmacêutica (LTF) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB).
Tecnologia
36
3.4. Cultura de macrófagos.
Camundongos BALB/c foram inoculados com 1 mL de tioglicolato de
sódio 3% estéril e após três dias esses animais foram sacrificados e os
macrófagos colhidos da cavidade peritoneal por lavagem com 5 mL de solução
salina 0,9% gelada estéril. A suspensão celular foi centrifugada a 250 x g por
10 minutos a 4°C, o sobrenadante desprezado e o botão celular foi diluído em 1
mL de meio de cultura incompleto RPMI e o número de células determinado em
câmara de Neubauer. Os macrófagos (1 x 106/mL) foram distribuídos em placa
de 24 poços e incubados em estufa de CO2 com 5% de umidade, por 2 horas
para a adesão. Em seguida as células não aderentes foram retiradas por
sucessivas lavagens com 1 mL de meio de cultura e adicionado diferentes
doses dos extratos aquoso e metanólico (50, 10 e 5 µg/mL) da C. mexicana, e
também LPS (100 ng/mL), que sabidamente é um potente indutor ativador de
macrófagos (HEINZELMANN et al., 1998). Após 24 horas de cultura os
sobrenadantes foram colhidos para determinação dos níveis de IL-6 e IL-12 por
ELISA. Foram usados kits da Ebioscience para determinação dos níveis das
citadas citocinas, seguindo o protocolo padrão fornecido pelo fabricante dos
kits.
3.5.
Modelo de peritonite induzido pela injeção de zimosam.
Camundongos Swiss foram injetados com os extratos aquoso e
metanólico da C. mexicana nas doses de 2 mg/kg, 0.4 mg/kg e 0.2 mg/kg pela
via intravenosa e dexametasona a 0,5 mg/kg pela via intraperitoneal. Trinta
minutos (30’) após o tratamento com os extratos e a dexametasona, os animais
37
receberam injeção na cavidade peritoneal de 1mL de zimosam (1mg/mL) e 6
horas após, foram sacrificados para a realização do lavado peritoneal. O lavado
da cavidade peritoneal dos animais foi feito através da injeção de 5 mL de
solução salina 0,9% gelada. A suspensão celular foi centrifugada, o pellet
obtido foi diluído em 1mL de solução salina 0,9% e o número de células
determinado pela contagem em câmera de Neubauer. Foram utilizados como
controles negativos camundongos inoculados apenas com solução salina 0,9%
tanto pela via intraperitoneal, como pela intravenosa e como controles positivos
camundongos inoculados com zimosam pela via intraperitoneal e com solução
salina 0,9% pela via intravenosa. Depois de realizado o experimento doseresposta, uma das doses foi escolhida para fazer o experimento de cinética da
migração celular, sendo escolhida a dose de 2 mg/kg. Nesse passo, os animais
foram tratados como descrito e o exsudato peritoneal colhido em diferentes
tempos (6, 24, 48 horas) após o inóculo com zimosam.
Tabela 1 – Distribuição dos grupos em modelo de peritonite induzida por
zimosam (1mg/mL), utilizando o extrato metanólico ou aquoso como
droga de escolha.
GRUPOS
Tratamento
Intraperitoneal após 30’
Grupo 1
Salina i.v
Salina
Grupo 2
Salina i.v
Zimosam
Grupo 3
Ext. Metanólico ou Aquoso
0.2 mg/kg i.v
Zimosam
Grupo 4
Ext. Metanólico ou Aquoso
0.4 mg/kg i.v
Zimosam
Grupo 5
Ext. Metanólico ou Aquoso
2 mg/kg i.v
Zimosam
Grupo 6
Dexametasona 0,5mg/kg i.p
Zimosam
38
Tabela 2 – Distribuição dos grupos na cinética da peritonite induzida por
zimosam (1mg/mL) com a dose de escolha dos extratos em estudo.
GRUPOS
Tratamento
Intraperitoneal após 30’
Grupo 1
Salina i.v
Salina
Grupo 2
Salina i.v
Zimosam
Grupo 3
Ext. Aquoso 2mg/kg i.v
Zimosam
Grupo 4
Ext. Metanólico 2mg/kg i.v
Zimosam
Grupo 5
Dexametasona 0,5mg/kg i.p
Zimosam
3.6. Edema de orelha induzido por xilol.
Camundongos Swiss foram injetados com 100 µL dos extratos
metanólico ou aquoso da Caulerpa mexicana nas doses de 2 e 0.4 mg/kg pela
via subcutânea e dexametasona (0,5 mg/kg) pela via intraperitoneal. Trinta
minutos (30’) após o tratamento com os extratos e a dexametasona, foram
gotejados e em seguida pincelados 40µL de xilol sobre a superfície anterior e
posterior da orelha direita de cada animal testado, sendo 20µL de xilol em cada
face da orelha. Após quinze minutos os animais foram sacrificados, tendo as
orelhas removidas. Secções com diâmetro de 7mm foram feitas em cada
orelha e pesadas em balança de precisão. O nível de edema foi calculado
através da diferença de peso causado pelo irritante, mensurado por subtração
de peso da secção de orelha esquerda pelo da secção de orelha direita, que
recebeu xilol, para ambos os grupos. Para o controle negativo foi considerada a
orelha esquerda dos animais tratados trinta minutos previamente com 100µL de
solução salina pela via subcutânea. Para o controle positivo foi utilizada a
orelha direita, que recebeu o xilol, em cada animal tratado igualmente com
39
solução salina. A atividade dos extratos metanólico e aquoso da Caulerpa
mexicana foram calculados através do percentual de inibição do edema em
animais tratados em comparação com os camundongos controle.
% Inibição de Edema = 1 - [nDt – nEt] / [nDnt – nEnt] x 100, sendo:
- nDt: média aritmética do peso das secções das orelhas direitas de
animais tratados com extratos metanólico ou aquoso da C. mexicana;
- nEt: média aritmética do peso das secções das orelhas esquerdas de
animais tratados com extratos metanólico ou aquoso da C. mexicana;
- nDnt: média aritmética do peso das secções das orelhas direitas de
animais não tratados;
-
nEnt: média aritmética do peso das secções das orelhas esquerdas de
animais não tratados.
Tabela 3 – Distribuição de grupos no modelo de edema de orelha,
utilizando o extrato metanólico ou aquoso como substância a ser testada.
Tratamento
30' após /
Orelha Direita
Grupo 1
Salina i.v
Xilol
Grupo 2
Ext Metanólico ou
Aquoso 2 mg/kg i.v
Xilol
Grupo 3
Ext Metanólico ou
Aquoso 0,4 mg/kg i.v
Xilol
Grupo 4
Dexametasona
0,5 mg/kg i.p
Xilol
.GRUPOS
Tratamento s.c.
Tratamento i.p.
40
3.7.
Modelo da bolsa de ar no dorso de camundongos.
Esse modelo foi realizado de acordo com Vigil et al. (2008) e Yoon et al.
(2005, 2006). Para isso, camundongos Swiss foram inoculados com 5 mL de ar
estéril no dorso pela via subcutânea, para formação de uma bolsa de ar, após 3
dias os animais receberam no mesmo local nova injeção de ar estéril, desta
vez 2,5 mL. No sexto dia, os animais receberam pela via intravenosa, 2 e 0,4
mg/kg dos extratos em estudo e pela via intraperitoneal dexametasona na
concentração de 0,5 mg/kg. Trinta minutos (30’) após o tratamento com os
extratos e a dexametasona, os animais foram inoculados com 1 mL de
zimosam (1 mg/mL) na bolsa de ar. Os animais foram sacrificados após 24
horas, 1 mL de salina 0,9% gelado foi inoculado na bolha e em seguida o
exsudato aspirado com seringa. Com esse material foi determinado do número
de leucócitos no exsudato. Depois de realizado o experimento dose-resposta,
uma das doses foi escolhida para fazer o experimento de cinética da migração
celular, sendo escolhida a dose de 2 mg/kg. Nesse passo, os animais foram
tratados como descrito e o exsudato da bolsa de ar colhido em diferentes
tempos (6, 24, 48 horas) após o inóculo com zimosam.
Tabela 4: Distribuição dos grupos do modelo de bolsa de ar.
GRUPOS
Tratamento
Após 30’ na bolsa de ar
Grupo 1
Salina i.v
Salina
Grupo 2
Salina i.v
Zimosam
Grupo 3
Ext. Metanólico ou Aquoso
2mg/kg i.v
Zimosam
Grupo 4
Ext. Metanólico ou Aquoso
0,4mg/kg i.v
Zimosam
Grupo 5
Dexametasona 0,5mg/kg i.p
Zimosam
41
Tabela 5 – Distribuição dos grupos na cinética da migração celular bolsa
de ar induzida por zimosam (1mg/mL) como a dose de escolha dos
extratos em estudo.
GRUPOS
Tratamento
Após 30’ na bolsa de ar
Grupo 1
Salina i.v
Salina
Grupo 2
Salina i.v
zimosam
Grupo 3
Ext. Metanólico 2 mg/kg i.v
zimosam
Grupo 4
Ext. Aquoso 2 mg/kg i.v
zimosam
Grupo 5
Dexametasona 0,5 mg/kg i.p
zimosam
3.8.
Modelo de colite induzida por dextrana sulfato de sódio
(DSS):
Nesse modelo foram usados camundongos BALB/c de 6 a 8 semanas
de idade, que são susceptíveis ao desenvolvimento de colite induzida por
dextrana sulfato de sódio (DSS). A colite experimental foi induzida através da
administração de DSS diluída na água de beber dos camundongos na
concentração final de 3% (peso/volume) por 14 dias consecutivos, sendo que
no 15º recebeu apenas água. Os animais foram tratados pela via intravenosa
com a dose de 2 mg/kg dos extratos metanólico ou aquoso da C. mexicana,
uma hora antes da liberação da água contendo dextrana. Os animais foram
divididos em grupos que recebeu salina intravenosa (i.v.) e bebeu água normal,
grupo que recebeu salina i.v. e bebeu água contendo dextrana, e o grupo que
recebeu as doses dos extratos i.v. e receberam água contendo dextrana 3%. O
consumo de líquido foi monitorado diariamente para certificar que cada grupo
estava consumindo quantidades equivalentes de água. Os animais foram
tratados em dias alternados com as doses de 2 mg/kg dos extratos pela via
42
intravenosa. Após esse período os animais foram eutanasiados, fragmentos de
0,5cm do cólon ascendente foram usados para análise histológica, como
também 0,5cm do cólon transverso foi usado para cultura desse tecido e
dosagem de citocinas. A cultura foi realizada lavando exaustivamente os
fragmentos do cólon com meio de cultura RPMI suplementado com 2% de soro
bovino fetal, posteriormente esses tecidos foram depositados em placa de 24
poços contendo meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro bovino
fetal e antibiótico gentamicina. A placa foi incubada em estufa contendo 5% de
CO2 umidificada por 24 horas. Após isso, os sobrenadantes foram colhidos
para determinação dos níveis de IL-6, IFN-γ e IL-17 por ELISA. Foras usados
kits da Ebioscience para determinação dos níveis das citadas citocinas,
seguindo o protocolo padrão fornecido pelo fabricante dos kits. Foi avaliado o
quadro clínico dos animais em experimentação por meio do índice de
desenvolvimento da colite, os níveis de severidade da doença foram
determinados da seguinte maneira: ausência de perda de peso ou sangue nas
fezes = 0, 1-5% de perda de peso = 1, 5-10% de perda de peso = 2, presença
de sangue nas fezes ou em torno do ânus = 2, 10-20% de perda de peso
corporal = 3, acima de 20% de perda de peso corporal = 4, sangramento
intenso = 4. Relativo a consistência das fezes: fezes bem formadas = 0, fezes
amolecidas = 2, diarréia = 4.
43
Tabela 6 – Distribuição de grupos no modelo colite induzida por dextrana
sulfato de sódio em Balb/c.
GRUPOS
Tratamento Intravenoso
Água de beber
Grupo 1
Salina
Água
Grupo 2
Salina
Água + DSS 3%
Grupo 3
Ext. Metanólico 2mg/kg
Água + DSS 5 3%
Grupo 4
Ext. Aquoso 2mg/kg
Água + DSS 5 3%
3.9.
Análise estatística.
Foram usados a análise de variância (ANOVA), o método paramétrico de
Tukey e o test t de studant para determinar as diferenças entre os grupos que
foram estimulados com extrato de C. mexicana e aqueles que não foram
estimulados. Para realização dessa análise será utilizado o programa
estatístico INSTAT, Graph-Pad, San Diego, Califórnia.
44
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
4.1.
Avaliação da produção de IL-6 e IL-12, em macrófagos
murinos cultivados com os extratos aquoso e metanólico da
Caulerpa mexicana:
Primeiramente foi avaliada a capacidade dos extratos aquoso e
metanólico da C. mexicana em induzir a produção de citocinas próinflamatórias e imunoestimuladoras quando cultivadas com macrófagos
murinos. Foi observado que os extratos metanólico e aquoso não foram
capazes de ativar esses macrófagos para produção de citocinas próinflamatórias e imunoestimuladoras como a IL-6 (Figura 4A) e IL-12 (Figura
4B), enquanto que as células na presença de LPS, sabidamente estimulador de
macrófagos, produziram altos níveis dessas citocinas.
Nessa análise o LPS foi usado como controle positivo, pois alguns
aspectos da fisiologia dos macrófagos são influenciados de alguma forma pelo
lipopolissacarídeo (LPS), um produto das bactérias gram-negativas, induz um
aumento no consumo de glicose e oxigênio e então as células adquirem alta
capacidade funcional, como a capacidade de matar microorganismos e células
tumorais. Desse modo, os macrófagos desenvolveram um eficiente mecanismo
para o reconhecimento do LPS, portanto, essa substância está entre os mais
potentes estimuladores de macrófagos (ZWILLING & EISENSTEIN, 1994).
45
400
A
IL-6 (pg/ml)
300
*
200
100
40
30
20
10
0
M
10
5
0,5
Ext Met (µ
µg/ml)
10
5
0,5 LPS
Ext Aq (µ
µg/ml)
200
*
B
IL-12 (pg/ml)
150
100
40
30
20
10
0
M
10
5
0,5
Ext Met (µ
µ g/ml)
10
5
0,5 LPS
Ext Aq (µ
µg/ml)
FIGURA 4: Avaliação da produção de IL-6 (figura 4A) e IL-12 (FIGURA 4B),
em macrófagos murinos cultivados com os extratos aquoso (Ext Aq) e
metanólico (Ext Met) da Caulepa mexicana. Macrófagos murinos cultivados
com diferentes concentrações dos extratos aquoso e metanólico por 24 horas.
*P≤ 0,0001, comparado com meio (M) e os demais grupos.
46
A IL-12 é uma citocina heterodimérica composta pelas cadeias p35
(constitutiva) e p40 (induzível) que se encontram ligadas covalentemente e
exercem um grande número de efeitos pleiotrópicos (KOBAYASHI et al., 1989;
BRUNDA et al., 1994). Ela é produzida por macrófagos e, em menores
proporções, por linfócitos B. A IL-12 atua sobre células NK induzindo a
produção de IFN-γ (D’ANDREA et al., 1992; GAZZINELLI et al., 1993). Além
disso, a IL-12 induz a diferenciação de células CD4 virgens para o fenótipo Th1
e subsequentemente o desenvolvimento da resposta imune celular. Dessa
forma, ela pode constituir uma importante ligação entre os mecanismos da
resistência inata e da imunidade adquirida (TRINCHIERI, 2003). Enquanto que
a IL-6 é uma citocina multifuncional que atua regulando a resposta imune,
hematopoiese, proteínas de fase aguda, entre outras funções indicando que
esta citocina desempenha um papel central nos mecanismos de defesa do
hospedeiro (KISHIMOTO, 1989), pois pode afetar células T, B e macrófagos,
contribuindo para o aumento da inflamação e auxiliando na passagem entre a
resposta inflamatória inata e a adaptativa. Além de desempenhar função
inflamatória
exerce
também
ação
antiapoptótica,
atuando
em
genes
fundamentais para o controle do ciclo celular (LIN & KARIN, 2007; GERMANO
et al., 2008). Visto que os extratos em estudo não induziram a produção dessas
citocinas, pode-se indicar que os extratos aquoso e metanólico da C. mexicana
não apresentaram atividade inflamatória in vitro. Podendo então pesquisar sua
eficácia no tratamento de processos inflamatórios in vivo.
47
4.2.
Avaliação do efeito dos extratos aquoso e metanólico da
Caulerpa mexicana em modelo de peritonite induzido pela injeção de
zimosam:
O modelo experimental de peritonite permite avaliar a migração
leucocitária, por meio da contagem de leucócitos (x106/mL), presentes no
exsudato liberado na cavidade peritoneal após administração do zimosam.
Observou-se que os grupos tratados com as diferentes doses dos extratos
metanólico (Figura 5A) e aquoso (Figura 5B) da alga em estudo apresentaram
inibição da migração celular para a cavidade peritoneal quando comparado
com o grupo que recebeu apenas zimosam. Para uma maior fidedignidade dos
dados foi utilizado uma droga de referência, a dexametasona, que é uma droga
anti-inflamatória esteriodal comercialmente conhecida, e assim inibiu de forma
significativa a migração celular para o peritônio dos animais que receberam
zimosam. Pode ser observado ainda que não houve diferença estatística
significante entre os grupos tratados com os extratos aquoso e metanólico nas
três doses testadas e o grupo tratado com a dexametasona, ou seja, todos
foram capazes, de maneira semelhante, de diminuir significativamente a
migração celular para a cavidade peritoneal daqueles animais que receberam
zimosam. Portanto, quando comparado ao grupo controle positivo, que recebeu
zimosam no peritônio e salina intravenosa, a dexametaxona e extratos da C.
mexicana, apresentam atividade anti-inflamatória, demonstrando assim o
impedimento da migração leucocitária.
Algumas das ações anti-inflamatórias dos corticosteróides podem
resultar dos seus efeitos inibitórios sobre a síntese de prostaglandinas. Esse
48
efeito também é medido pela síntese de proteínas, visto que os corticosteróides
induzem a síntese de transcortina e macrocortina – proteínas que inibem a
síntese de prostaglandinas através da inibição da fosfolipase A2, responsável
pela retirada do ácido araquidônico da membrana celular, para produção de
prostaglandinas e tromboxanos, este medicamento é amplamente utilizado em
casos de doenças auto-imunes como lúpus e psoríase, devido a sua atividade
imunossupressora (LUSTER, et al., 2005), no entanto apresenta sérios efeitos
colaterais para seus usuários. Atualmente vários estudos são dedicados a
pesquisa de produtos naturais em modelos de inflamação, os quais vem
apresentando resultados inovadores demonstrando o potencial anti-inflamatório
de substâncias extraídas de plantas (AL-SAGHIR, et al.,2009; SAKLANI e
KUTTY, 2008; SOUZA et al.,2008, 2009).
Diversas espécies de algas do gênero Caulerpa, como a C. racemosa,
são alvo de estudo de alguns centros de pesquisas, por exemplo, estudos
realizados por SOUZA et al. (2008, 2009) no qual foi comprovado que os
extratos dessa alga como também alcalóides purificados da mesma
apresentaram
atividade
anti-inflamatória
e
analgésica,
no
entanto
polissacarídeos sulfatados extraídos da C. racemosa apresentam comprovada
atividade biológica, dentre elas atividade antiviral (GHOSH et al., 2004). O
processo pelo qual os extratos usados nesse estudo estão inibindo a migração
celular em resposta ao estímulo inflamatório ainda não está elucidado. No
entanto, baseado em estudos com produtos obtidos de algas marinhas
(HEINZELMANN et al., 1998; ROCHA et al., 2001), pode-se supor que esses
extratos possuam substâncias que atuem de forma competitiva ou inibitória
49
A
6
Leucócitos peritoneais (x 10 /ml)
30
*
20
10
0
Salina
0,2
0,4
2
Dexa
Ext. Met. (mg/kg)
Zimosam (mg/mL)
Leucócitos peritoneais (x 106/ml)
25
B
*
20
15
10
5
0
Salina
0,2
0,4
2
Dexa
Ext. Aq. (mg/kg)
Zimosam (mg/mL)
Figura 5: Efeito dos extratos aquoso e metanólico de C. mexicana em modelo de
peritonite induzida por zimosam. Camundongos Swiss foram tratados com os extratos
metanólico e aquoso nas doses de 0.2, 0.4 e 2 mg/kg pela via intravenosa e dexametasona na
dose de 0,5 mg/kg intraperitoneal, 30 minutos depois foram injetados intraperitonealmente com
1 mL de zimosam (1 mg/mL). Após 6 horas foi realizado o lavado peritoneal com solução salina
e o número de células determinado em câmara de Neubauer. *P≤ 0,001, comparado com
salina/salina e os demais grupos tratados. N= 5
50
com o zimosam e seus ligantes por exemplo os receptores do tipo Toll (TLRs)
e/ou inibindo a expressão de selectinas, bloqueando a adesão das células ao
endotélio vascular ou inibindo os mediadores químicos responsáveis pelo
processo edematogênico. Esse(s) mecanismo(s) precisa(m) ser esclarecido(s),
sendo matéria de estudos futuros em nosso laboratório.
Após ser avaliada a dose resposta dos extratos metanólico e aquoso de
C. mexicana sobre a indução da peritonite pelo zimosam, foi avaliada a cinética
da resposta (6, 24 e 48 horas) usando uma dose fixa desses extratos (2
mg/kg). Os resultados da Figura 6 mostram que tanto o extrato metanólico
quanto o aquoso de C. mexicana inibiu de modo significativo a migração celular
para cavidade peritoneal nos três tempos avaliados, inibição essa que não foi
nem dose (Figuras 5) nem tempo dependente. Os dados demonstraram que
quando comparados com a dexametasona os extratos apresentaram perfis de
inibição da migração leucocitária semelhantes à droga de referência. Os
extratos em estudo atuam de maneira semelhante nos três tempos estudados,
período em que há migração de fagócitos, na sua maioria. Portanto, uma vez
que esses extratos apresentam a capacidade de inibir a migração celular nesse
período de tempo, podem ser substâncias alvo importantes a serem testadas
em modelos de doenças crônicas, como asma e doenças autoimunes. No caso
30
SAL
ZIM
Ext Met
Ext Aq
DEXA
6
Leucócitos peritoneais (x 10 /ml)
51
*
*
20
*
10
0
6
24
48
HORAS
Figura 6: Efeito dos extratos aquoso e metanólico de C. mexicana na
cinética de migração leucocitária em modelo de peritonite induzida por
zimosam. Camundongos Swiss foram tratados com os extratos aquoso e
metanólico na dose de 2 mg/kg pela via intravenosa e dexametasona na dose
de
0,5
mg/kg
intraperitoneal,
30
minutos
depois
foram
injetados
intraperitonealmente com 1 mL de zimosam (1 mg/mL). Após 6, 24 e 48 horas,
foi realizado o lavado peritoneal com solução salina e o número de células
determinado em câmara de Neubauer. N= 5
52
de doenças autoimunes, a inibição de migração de neutrófilos já tem sido
mostrada como importante na melhora do quadro desse tipo de doença,
especialmente nas doenças inflamatórias intestinais (CHUNG et al., 2007).
4.3. Avaliação do efeito dos extratos aquoso e metanólico da Caulerpa
mexicana em modelo de edema de orelha induzido por xilol.
Edema é um dos sinais cardinais da inflamação, sendo assim, foi
avaliado o efeito dos extratos de C. mexicana em modelo de edema de orelha
induzido por xilol, pois esse é útil para investigar a atividade anti-inflamatória
das substâncias desse estudo em ensaios da fase aguda da inflamação (HU el
at., 2008). O xilol causa uma irritação instantânea na orelha do camundongo,
levando a formação de edema pela acumulação de líquidos no tecido e a
supressão desta resposta é um indício de um provável efeito antiflogístico
(PARVEEN et al., 2007; ZHANG et al., 2008).
Os resultados obtidos estão demonstrados na tabela 7 e mostram que
os extratos aquoso e metanólico, como também a dexamentasona reduziram
significantemente o edema de orelha induzido por xilol quando comparado com
o grupo tratado com salina, esse efeito foi dose-dependente para o extrato
aquoso, mas não para o metanólico, uma vez que ambas as doses desse
último extrato inibiu de modo similar o edema. Entretanto o extrato aquoso não
obteve o mesmo perfil na atividade anti-inflamatória quando comparado com o
extrato metanólico, pois apresentou na dose de 0,4 mg/kg uma maior inibição
53
Tabela 7: Efeito da Caulerpa mexicana em modelo de edema de orelha
induzido por xilol em camundongos.
Grupos
Dose
(mg/kg)
Peso da
orelha
direita (mg)
Salina
(sc)
Extrato
Metanólico
(sc)
______
Extrato
Aquoso
(sc)
0,4
Diferença
das médias
(mg)
Inibição
(%)
68.43 ±
2.283
41.43 ±
3.686
Peso da
orelha
esquerda
(mg)
35.98 ±
1.465
34.00 ±
1.833
32.45 ±
2.603
7.475 ±
2.809
_______
41.43 ±
3.686
32.98 ±
1.677
8.453 ±
3.500
40.27 ±
4.429
35.33 ±
2.133
4.933 ±
4.916
69.55 ±
4.312
45.10 ±
1.274
24.45 ±
5.212
2
0,4
77,07 %**
73,55%**
2
84,86%***
25%
Dexa
0,5
41.80 ±
32.20 ±
9.600 ±
(ip)
1.200
2.100
2.419
n = 5, ** p < 0,001, *** p<0,0001 comparado com o controle
70,60%**
54
do edema (84,86%) do que a dose de 2 mg/kg (25%). Essa diferença na ação
das doses ainda não é esclarecida, mas pode-se admitir que esse fato seja
ocasionado pelos componentes ativos presentes no extrato aquoso (ainda não
conhecidos), em que, quando aumentada a dose, leve a uma inibição da sua
atividade anti-inflamatória no modelo de edema de orelha, podendo ser
ocasionada por competição entre os compostos bioativos do extrato por
receptores responsáveis pela inibição do edema, que quando aumentada a
dose, um composto (ainda desconhecido) anula a ação anti-inflamatória do
extrato,
mesmo
assim
quando
comparados
com
a
dexametasona
apresentaram resultados satisfatórios, comprovando a sua atividade antiinflamatória. Testes foram realizados usando a administração intravenosa, mas
não obteve resultados satisfatórios. A reação inflamatória aguda tem como
característica
fisiológica
a
vascularização
tecidual,
o
aumento
da
permeabilidade vascular causa o extravasamento de líquido rico em proteínas
plasmáticas, incluindo imunoglobulinas, fatores de coagulação e as células nos
tecidos lesados com subsequente edema no local (OKOLI et al., 2008). A
inflamação induzida pelo xilol desencadeia mecanismos celulares envolvidos
na liberação de substâncias bioativas a partir das terminações periféricas de
neurônios sensoriais, que agem sobre células-alvos periféricas, tais como
mastócitos e outras células do sistema imune, e células da musculatura lisa
vascular,
produzindo
uma
resposta
inflamatória
do
tipo
neurogênica
caracterizada por calor, rubor, edema e hipersensibilidade. Esta inflamação é
iniciada pela ação de mediadores, tais como acetilcolina, bradicinina,
prostaglandinas e capsaicina. Estes mediadores promovem a excitação dos
neurônios, levando à liberação direta dos neuropeptídeos e ativação dos seus
55
receptores, incluindo VR1, B2 e PAR, a qual é promovida, respectivamente, por
influxo de cálcio, ativação da proteína quinase C ou desinibição do fosfatidil
inositol bifosfato (PIP2) (RICHARDSON & VASKO, 2002). A capsaicina é um
mediador cujo mecanismo está relacionado aos canais vanilóides, sendo
responsável pela despolarização e pela liberação direta de neuropeptídeos,
como a substância P e o peptídeo relacionado ao gene calcitonina (CGRP), os
principais iniciadores desse tipo de inflamação.
A dexametasona foi usada como parâmetro de comparação com os
extratos em estudo. Algumas das ações anti-inflamatórias dos corticosteróides
podem resultar dos seus efeitos inibitórios sobre a síntese de prostaglandinas.
Esse efeito também é medido pela síntese de proteínas, visto que os
corticosteróides induzem a síntese de transcortina e macrocortina – proteínas
que inibem a síntese de prostaglandinas através da inibição da fosfolipase A2.
As respostas mediadas por células podem ser inibidas indiretamente pela
inibição da produção de determinadas citocinas, incluindo o factor de necrose
tumoral (TNF) e interleucinas. Embora os extratos usados tenham apresentado
efeito similar e até maior ao da dexametasona, no entando não se pode afirmar
que o mecanismo de ação da C. mexicana é o mesmo dos corticosteróides,
pois seu mecanismo de ação ainda é desconhecido, porém seu efeito
antiflogístico assemelha-se à das drogas de referência.
56
4.3. Avaliação do efeito dos extratos aquoso e metanólico da
Caulerpa mexicana em modelo de inflamação induzido por zimosam em
bolsa de ar no dorso de camundongos.
Zimosam injetado na bolsa de ar no dorso do camundongo causa um
rápido influxo de leucócitos (KWON et al., 2003) levando a uma reação
inflamatória na cavidade dorsal, no entanto dados da literatura demonstram
que a dexametasona apresenta um efeito antimigratório em modelos de
inflamação usando a bolsa de ar, quando o zimosam é utilizado como
inflamógeno (PERRETTI et al., 1996). Tendo como base esses dados foi então
testada o efeito anti-inflamatório dos extratos aquoso e metanólico da C.
mexicana usando como parâmetro de comparação os animais tratados com
salina e dexametasona. Os dados demonstraram que o grupo que foi tratado
com salina e recebeu o zimosam, apresentou uma intensa infiltração
leucocitária para o local da inflamação, enquanto que o grupo que recebeu
apenas salina sem o zimosam obteve um pequeno influxo leucocitário para a
cavidade dorsal do camundongo. Quando comparado os grupos tratados com
os extratos metanólico (figura 7A), aquoso (Figura 7B) e dexametasona com o
grupo que recebeu salina intravenosa e zimosam na bolsa de ar, pode-se
observar que o extrato aquoso apresentou atividade anti-inflamatória nas duas
doses testadas e que o metanólico funcionou bem em inibir a migração celular
apenas na dose de 2 mg/kg.
Após ser avaliada a atividade dos extratos metanólico e aquoso de C.
mexicana em diferentes doses sobre a indução da inflamação na bolsa de ar
pelo zimosam, foi avaliada a cinética da resposta (6, 24 e 48 horas) usando
40
A
6
Número de leucócitosr (x10 /ml)
57
*
30
20
10
0
SAL
2
0.4
Ext Met (mg/kg)
DEXA
40
B
6
Número de leucócitosr (x10 /ml)
Zimosam (1 mg/ml)
*
30
20
10
0
SAL
2
0.4
Ext Aq (mg/kg)
DEXA
Zimosam (1 mg/ml)
Figura 7: Efeito do extrato aquoso e metanólico da C. mexicana sobre a migração de
leucócitos na bolsa de ar induzida por zimosam. Camundongos Swiss foram tratados com
os extratos metanólico e aquoso nas doses de 0.4 e 2 mg/kg pela via intravenosa e
dexametasona na dose de 0,5 mg/kg intraperitoneal, 30 minutos depois foram injetados na
bolsa de ar com 1 mL de zimosam (1 mg/mL). Após 24 horas o exudato inflamatório foi colhido
pela injeção de 1 mL de salina e o número de células determinado em câmara de Neubauer.
Em A: *P ≤ 0,05, comparado com salina (SAL) e os grupos extrato metanólico (Ext Met) 2
mg/kg e dexametasona (DEXA). Em B: *P ≤ 0,001 quando comparado ao grupo SAL e grupos
tratados com extrato aquoso (Ext Aq) e DEXA. N=5
58
uma dose fixa desses extratos (2 mg/kg). Os resultados da Figura 8 mostram
que tanto o extrato aquoso como o metanólico de C. mexicana inibiram de
modo significativo a migração celular para a bolsa de ar nos tempos de 24 e 48
horas, inibição essa que foi tempo dependente, pois esses extratos não
apresentaram atividade anti-inflamatória no período de 6 horas, mas inibiu de
forma significativa a migração leucocitária a partir das 24 horas após a
administração do zimosam. Os dados demonstraram que quando comparados
com a dexametasona os extratos em estudo apresentaram perfis de inibição da
migração leucocitária semelhantes à droga de referência. Através da contagem
diferencial das células (Figura 9) presentes no exsudato coletado da bolsa de
ar em diferentes tempos (6, 24 e 48hs) após o inoculo do zimosam, observouse que todos os grupos que receberam zimosam na bolsa de ar tiveram um
aumento dos monócitos com consequente diminuição do número de neutrófilos
no exsudato, tendo seu pico em 6 horas e diminuição gradativa dessas células
na cavidade dorsal do camundongo.
A resposta inflamatória local induzida por zimosam na bolsa de ar em
camundongos é considerada um modelo semelhante à resposta inflamatória de
um tecido sinovial (YOON et al., 2005), devido a injeção de ar estéril no dorso
do camundongo que forma uma cavidade forrada por células que se
assemelham ao ambiente da articulação (CABRERA et al., 2000; YOON et al.,
2005). Portanto, quando injetado na cavidade o zimosam é fagocitado
induzindo a degranulação e explosão respiratória de neutrófilos, com isso há
formação de diversos mediadores inflamatórios, como mieloperoxidase,
59
6
Número de leucócitos (x10 /ml)
50
SAL
ZIM
Ext Met
Ext Aq
DEXA
40
*
30
20
*
10
0
6
24
Horas após estímulo
48
Figura 8: Efeito do extrato aquoso e metanólico da C. mexicana sobre a
cinética de migração de leucócitos na bolsa de ar induzida por zimosam.
Camundongos Swiss foram tratados com os extratos metanólico e aquoso na
dose de 2 mg/kg pela via intravenosa e dexametasona na dose de 0,5 mg/kg
intraperitoneal, 30 minutos depois foram injetados na bolsa de ar com 1 mL de
zimosam (1 mg/mL). Nos tempos indicados, o exudato inflamatório foi colhido
pela injeção de 1 mL de salina e o número de células determinado em câmara
de Neubauer. *P ≤ 0,05, comparado com salina (SAL) e os grupos extrato
metanólico (Ext Met), extrato aquoso (Ext Aq) e DEXA. N=5
Número de monócitos (x106/mL)
60
12
A
9
ZIM
Ext Met
Ext Aq
DEXA
6
3
0
6
Número de neutrófilos (x106/mL)
*
*
24
Horas após estímulo
50
B
ZIM
Ext. Met
Ext. Aq
DEXA
*
40
30
48
*
20
10
0
6
24
Horas após estímulo
48
Figura 9: Efeito dos extratos metanólico e aquoso de C. mexicana na cinética da
migração de monócitos e de neutrófilos para bolsa de ar induzida por zimosam.
Camundongos Swiss foram tratados com os extratos metanólico (Ext Met) e aquoso (Ext Aq)
na dose de 2 mg/kg pela via intravenosa e dexametasona (DEXA) na dose de 0,5 mg/kg
intraperitoneal, 30 minutos depois foram injetados na bolsa de ar com 1 mL de zimosam (1
mg/mL). Nos tempos indicados, o exudato inflamatório foi colhido e a contagem de neutrófilos e
monócitos realizada em microcópio óptico. Em A: *P ≤ 0,001, comparado com Ex Aq e DEXA.
Em B: *P ≤ 0,05, comparado com Ex Aq, Ext Met e DEXA. N=5
61
eicosanóides, fosfolipase A2 , oxido nítrico, fator de necrose tumoral-α (TNF-α)
e interleucina 1 (IL-1) e IL-6 (CABRERA et al., 2000). Este modelo foi utilizado
no presente estudo para investigar o efeito anti-inflamatório dos extratos
aquoso e metanólico da C. mexicana, medindo o número de leucócitos que
migram para a bolsa de ar. Assim sendo, os extratos em estudo se mostraram
como agentes anti-inflamatórios. O mecanismo utilizado pelos extratos para
promover a inibição da migração celular para bolsa de ar, assim como na
cavidade peritoneal, estimuladas com zimosam, ainda é desconhecido, porém
podemos supor que produtos presentes nesses extratos possam estar ligando
a receptores do endotélio impedindo o rolamento de leucócitos para a cavidade
dorsal, como também inibindo a produção de mediadores responsáveis por
desencadear o processo inflamatório.
4.4. Avaliação do efeito dos extratos aquoso e metanólico da
Caulerpa mexicana em modelo de colite induzida por dextrana sulfato de
sódio (DSS)
O próximo passo foi avaliar o efeito dos extratos metanólico e aquoso na
colite induzida por DSS 3% em camundongos BALB/c. A DSS induz um quadro
no animal de experimentação que mimetiza uma doença inflamatória intestinal.
Para se avaliar o desenvolvimento da doença, os parâmetros observados
foram os sintomas clínicos tais como, perda de peso corporal (Figura 10) e do
índice de atividade da doença (DAI) (Figura 11), causada pela colite duas
semanas após o início da administração oral de DSS 3% na água de beber. O
grupo tratado com o extrato metanólico apresentou desenvolvimento do peso
corporal semelhante ao grupo que recebeu água normal, como também
62
demonstrou baixo índice de desenvolvimento da doença, com ausência de
sangue nas fezes e pouca diarréia, quando comparado ao grupo que recebeu
apenas DSS, podendo afirmar que o grupo tratado com o extrato em estudo
não apresentou um quadro clínico característico da colite. Por outro lado, o
grupo tratado com o extrato aquoso apresentou intensa perda de peso, diarréia
persistente e presença de sangue nas fezes, dados semelhantes ao grupo que
recebeu apenas a DSS 3%, não oferecendo proteção o animal no
desenvolvimento da colite, apresentando sintomatologia característica da colite
ulcerativa.
Para a análise histológica as lâminas foram coradas em hematoxilina e
eosina, posteriormente avaliadas ao microscópio de luz e fotomicrografias
foram obtidas em aumentos de 40x, 100x e 200x. No estudo histológico foram
observados fragmentos de intestino, constituídos por três camadas: mucosa,
submucosa e muscular. Não houve alteração no padrão morfológico da
submucosa e da camada muscular, nos grupos estudados, porém os achados
histológicos mais importantes foram observados da camada mucosa nos
diversos grupos estudados.
63
Peso corporal (g)
40
Salina
DSS 3%
Ext Met
Ext. Aq.
30
20
10
* *
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo em dias
Figura 10: Desenvolvimento do peso corporal em modelo de colite
ulcerativa induzida por DSS 3%. Camundongos BALB/c foram tratados em
dias alternados com os extratos aquoso e metanólico (2 mg/kg) da C. mexicana
com o desenvolvimento do peso corporal avaliado diariamente por 15 dias. * p:
0,0001, comparado com o grupo salina/salina e o grupo tratado com o extrato
metanólico. N=5
64
Índece de ativida de colite
4.5
4.0
*
3.5
*
3.0
2.5
* * * * * * *
*
*
*
2.0
Salina
DSS 3%
Ext. Met.
Ext. Aq.
1.5
1.0
0.5
0.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo em dias
FIGURA 11: Efeito dos extratos metanólico e aquoso de Caulerpa
mexicana no índice de atividade da colite (IAD) induzida por DSS 3% em
camundongos BALB/c. Camundongos BALB/c foram tratados em dias
alternados com os extratos aquoso e metanólico (2 mg/kg) da C. mexicana por
um período de 15 dias. Foi avaliado por meio de score de 1-4, o
desenvolvimento da colite experimental, avaliando porcentagem de perda
corporal, diarréia e sangramento. * p: 0,0001, comparado com o grupo
salina/salina e o grupo tratado com o extrato metanólico. N=5
65
A análise histológica mostrou que os animais que receberam água sem
a dextrana apresentaram cólon normal, como criptas e demais estruturas
morfológicas conservadas (figuras 12 A e B). O exame histológico das secções
do cólon avaliou o estado inflamatório intestinal, microscopicamente, as
amostras do cólon dos camundongos que recebeu DSS mostraram alterações
inflamatórias típicas na arquitetura do cólon, presença de infiltrado inflamatório
difuso, constituído principalmente por mononucleares, em alguns pontos a
inflamação é mais intensa, promovendo pequenos focos de ulceração e
moderada destruição glandular, dilatação das criptas e depleção de células
caliciformes como demonstrado na figura 12 C e D. Quando comparado o
grupo tratado com o extrato metanólico (figuras 12 E e F) com o que recebeu
apenas a dextrana, foi observada uma leve diminuição do quadro inflamatório,
porém apresentou infiltrado inflamatório agudo que foi observado em toda a
extensão da mucosa, sendo mais exuberante em alguns focos, onde promove
destruição glandular e pontos de ulceração. Em algumas áreas há presença de
abscessos, com exsudato sero-fibrino-hermorrágico, sendo que em menor
intensidade e mais focal quando comparado com o grupo que recebeu apenas
DSS. Já o grupo tratado com o extrato aquoso não apresentou proteção contra
o desenvolvimento da colite, sendo seus achados histológicos semelhante ao
do grupo DSS (figuras 12 G e H).
66
Figura 12: Histologia do cólon de camundongos, em modelo de
colite induzida por DSS 3% em camundongos BALB/C, avaliação do efeito
dos extratos metanólico e aquoso de Caulerpa mexicana. A: Histologia do
cólon do grupo controle, administrado apenas água, apresenta parênquima
intestinal normal (H/E, 100x). B: Detalhe do parênquima intestinal do grupo
controle (H/E, 200x). C: Fotomicrografia de intestino em animal que recebeu
dextrana 3% na água de beber exibindo desorganização celular e destruição do
parênquima, com presença de edema e infiltrado inflamatório mononuclear
difuso (H/E,40x). D: Visão aproximada do infiltrado inflamatório mononuclear
(H/E, 200x). E: Fotomicrografia de animal tratado com o extrato metanólico
evidenciando discreta quantidade de muco no lúmen intestinal, diminuição do
infiltrado inflamatório e diminuição das lesões do parênquima. (H/E,40x). F:
Detalhe da área de reparo (H/E, 100x). G: Fotomicrografia do intestino de
animal tratado com o extrato aquoso exibindo desorganização celular e
destruição do parênquima, com presença de edema e infiltrado inflamatório
mononuclear difuso (H/E,40x). H: Visão aproximada do infiltrado inflamatório
mononuclear (H/E, 200x).
67
68
Após a realização do modelo da colite induzida por DSS 3%, foi de
interesse avaliar a presença de citocinas em cultura de cólon dos animas que
receberam apenas água, os que receberam DSS e animais tratados com o
extrato metanólico da C. mexicana. Foi observada uma diminuição significativa
nos níveis das citocinas IL-6 (figura 13 A), IL-17 (figura 13 B) e IFN-γ (figura 13
C) no sobrenadante de cultura de cólons de camundongos BALB/c tratados
com os extratos em estudo, quando comparados com o grupo que recebeu
apenas DSS na água de beber. Dessa forma, o extrato metanólico de C.
mexicana está atuando na regulação negativa de citocinas importantes no
desenvolvimento de colite (PAPADAKIS, 2000)
Quando comparando os resultados do quadro clínico da colite, as
respectivas análises histológicas e produção de citocinas, pode-se afirmar que
o grupo tratado com extrato metanólico apresenta leve diminuição do processo
inflamatório intestinal e apresenta significativa diminuição dos sintomas clínicos
da colite e da produção de citocinas, levando a concluir que esse extrato não
apresentaria eficácia se utilizado sozinho no tratamento de colite ulcerativa,
porém seria uma alternativa viável a ser utilizado com complemento da terapia
tradicionalmente utilizada, pois permitiu ao animal uma maior sobrevida,
redução evidente da diarréia e impediu que o animal perdesse peso durante
todo o decorrer do experimento. Visto isso será necessário em estudos
posteriores o isolamento dos compostos bioativos do extrato metanólico, para a
partir daí entender seu mecanismo de ação no combate a sintomatologia da
colite ulcerativa.
69
250
*
A
IL-6 (pg/ml)
200
150
100
50
0
Salina
60
DSS
Ext. Met
*
B
IL-17 (pg/ml)
50
40
30
20
10
0
35
IFN-γ (pg/ml)
30
Salina
C
DSS
Ext. Met
*
25
20
15
10
5
0
Salina
DSS
Ext. Met
Figura 13: Efeito da administração do extrato metanólico sobre os níveis
de IL-6, IL-17 e IFN-γγ, na colite induzida por DSS 3% em camundongos BALB/c:
Dosagem das citocinas IL-6 (A), IL-17 (B) e IFN-γ (C) por ELISA, em sobrenadante de
fragmentos de cólon cultivados por 24hs em meio RPMI completo, *p: 0,0001,
comparado com o grupo salina/salina e demais grupos tratados.
70
O modelo animal de colite induzida por dextrana sulfato de sódio tem
uma série de vantagens sobre os outros, como simples métodos experimentais,
pois reproduz de forma semelhante nos camundongos a doença inflamatória
intestinal observada em humanos. Portanto, este modelo é confiável para o
estudo da patogênese da colite ulcerativa e para testes de drogas ou de
fitoquímicos para seu tratamento (KWON et al., 2007).
No entanto, o
mecanismo de ação da C. mexicana no tratamento da colite ainda é
desconhecido, porém algumas hipóteses podem ser levantadas para possível
comprovação em ensaios futuros.
O mecanismo de recrutamento de PMN para a mucosa intestinal pode
fornecer dados sobre a compreensão da lesão tecidual na colite ulcerativa. Um
fator importante nos processos de recrutamento é a secreção de citocinas próinflamatórias e quimiocinas pelo epitélio. Há evidências consideráveis de que
as células epiteliais do cólon do camundongo similarmente à dos humanos
produzam alguns tipos de quimiocinas da família CXC, quimioatraente da
polimorfornucleares, durante a colite experimental, incluindo CXCL1 e CXCL5
(OHTSUKA & SANDERSON, 2003). Prova de que esses tipos de quimiocinas
efetivamente desempenham um papel em várias doenças inflamatórias é
derivado de estudos de manipulação dessas quimiocinas em modelos animais.
Por exemplo, oligonucleotídeos feito para bloquear a expressão de CXCL5 nos
camundongos com colite induzida por dextrana sulfato de sódio reduziu a
infiltração de PMN na mucosa, e essa redução foi associada com menor dano
tecidual (KWON ET AL., 2005). Tal constatação demonstra que quimiocinas da
família CXC desempenha um papel fisiopatológico na colite experimental uma
71
vez que sua manipulação leva a redução parcial da infiltração de PMN
(MUHAMMED, et al., 2009). Portanto o extrato metanólico pode atuar com
mecanismo de ação semelhante, pois os resultados demonstraram que os
animais tratados com o extrato metanólico apresentaram leve redução do
infiltrado celular, como também diminuição do edema e lesão da mucosa
intestinal.
Outra hipótese seria a atuação desse extrato na inibição de citocinas ou
no equilíbrio de suas concentrações, em que essas citocinas desempenham
um papel central na modulação do sistema imune intestinal. Níveis de muitas
citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNF, IL-12, IL-6, IL-8) e anti-inflamatórias (IL4, IL-10, IL-1ra, IL-11) estão elevados em pacientes com colite. A relação entre
citocinas pró e anti-inflamatória é diminuída, levando a um desequilíbrio,
ocasionando doenças inflamatórias do intestino (ROGLER, et al., 2008). De
acordo com a figura 13, é clara a ação inibitória do extrato metanólico na
produção de IL-6, IL-17 e IFN-γ. Essas citocinas tem sido descritas por
participarem da patogênese da fase aguda no modelo de colite induzida por
DSS (ALEX et al., 2009).
Na colite ulcerativa, evidências da literatura demonstram que existe um
desbalanço entre citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias (PAPADAKIS,
2004). As citocinas pró-inflamatórias são responsáveis por determinar a
natureza da resposta imune na colite ulcerativa, por estimular a rápida síntese
e secreção de mediadores inflamatórios como as espécies reativas de
oxigênio, do nitrogênio, leucotrienos, fator de agregação plaquetária e
prostaglandinas (NEUMAN, 2007). Na doença inflamatória intestinal, ocorre um
72
aumento dos níveis de IL-1, TNF, IL-6, IL-8, além de outras citocinas próinflamatórias, secretadas por macrófagos, linfócitos e neutrófilos, cuja síntese é
induzida pelo NFκ−B, um fator de transcrição envolvido na regulação de vários
genes associados a inflamação (ROGLER & ANDUS, 1998).
Por mais de 20 anos, foi aceito o paradigma do predomínio da resposta
imune adaptativa de T helper 1 (Th1) na Doença de Crohn. Este conceito está
rapidamente mudando, pela evidência recente de uma nova via efetora
mediadora nessa forma de inflamação intestinal, descrita como células Th17
(linfócitos T que produzem interleucina 17 (IL-17), IL-6, TNF, IL-22). A
diferenciação dessa sub-população de célula T é dependente de IL-6 e TGF-β
e sua manutenção depende da citocina IL-23 (LITTMAN & RUDENSKI, 2010).
Portanto, as células Th17, juntamente com células Th1, tem sido apontada
como uma importante via de sinalização na imunopatogênese da Doença de
Crohn (BAMIAS & COMINELLI, 2007; McGOVERN &POWRIE, 2007).
O IFN-γ e a IL-12 agem nas células estimuladoras de antígenos CD4+ T
para induzir a diferenciação de células tipo T helper (Th1) secretoras de IFN-γ,
enquanto o TGF-β e IL-6 promovem as células Th17 que produzem IL-17 e
expressam o receptor da IL-23 (IL23R). A IL-23 produzida pela ativação das
células dendríticas sustenta a resposta Th17 e também ativa células inatas
incluindo as células mielóides e células natural killer para produzir citocinas
inflamatórias incluindo a IL-6, TNF-α e IL-17 que induz inflamação intestinal. A
IL-17 estimula a produção de citocinas pelos macrófagos ativados e pode
induzir à produção de citocinas e quimiocinas pelas células endoteliais, levando
ao recrutamento de neutrófilos (McGOVERN & POWRIE, 2007).
73
De acordo com os resultados demonstrados anteriormente, pode-se
sugerir que o extrato metanólico da alga marinha Caulerpa mexicana, pode
estar atuando na melhora do quadro da colite induzida por DSS através da
inibição da migração celular, bem como na inibição da produção das citocinas
IL-6, IFN-γ e IL-17. No entanto o mecanismo de ação desses extratos ainda é
desconhecida, mas algumas hipóteses a respeito da atuação desses extratos,
seria que os mesmos inibissem a migração de PMN e linfócitos para a mucosa
intestinal, ou mesmo, inibindo a ativação dessas células que já migraram para
o tecido intestinal, fazendo com que a produção das citocinas anteriormente
citadas fosse inibida, apresentando uma ação anti-inflamatória para o
tratamento da colite ulcerativa, porém se faz necessário estudos posteriores
para que se entenda melhor o mecanismo de ação desses extratos, como
também a identificação dos compostos ativos responsáveis pela atividade antiinflamatória.
74
5. CONCLUSÕES:
Pode-se concluir que:
5.1 – Os extratos metanólico e aquoso da C. mexicana não induziram a
produção de IL-6 e IL-12 em cultura de macrófagos peritoneais murinos
5.2 – Os extratos metanólico e aquoso da C. mexicana, nas três doses
testadas, inibiram a migração celular para a cavidade peritoneal de
camundongos induzida por zimosam, sendo essa inibição observada 6, 24 e 48
horas após o tratamento.
5.3 – Os extratos metanólico e aquoso foram capazes de inibir
significantemente a formação de edema de orelha induzido por xilol, quando
administrado pela via subcutânea.
5.4 – O extrato aquoso nas doses de 2 e 0.4 mg/kg e o metanólico na
dose de 2 mg/kg, reduziram significativamente o influxo de leucócitos para a
cavidade dorsal, em modelo de bolsa de ar em camundongos induzida por
zimosam.
5.5 – No modelo de colite induzida por dextrana sulfato de sódio, o
extrato metanólico, apresentou significativa redução dos sinais clínicos e leve
diminuição das lesões da mucosa do cólon de camundongos.
5.6 – No modelo de colite induzida por dextrana sulfato de sódio, o
extrato metanólico, apresentou significativa diminuição da expressão de
citocinas pró-inflamatórias na cultura do cólon.
75
5.6 – De modo geral, pode-se concluir que de acordo com os resultados
apresentados nos modelos experimentais de inflamação, os extratos aquoso e
metanólico de Caulerpa mexicana, apresentaram significativa ação antiinflamatória, possibilitando estudos futuros para avaliar sua atividade em outros
modelos, como também o entendimento do mecanismo de ação de
componentes bioativos dessa alga.
76
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